CN108359745B - 同步检测小麦矮缩病毒和小麦黄条纹病毒的双重rt-pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及同步检测小麦矮缩病毒和小麦黄条纹病毒的双重RT‑PCR方法，采用WDV的特异性引物SEQ ID No.1\2和针对WYSV的特异性引物SEQ ID No.3\4，以含有上述两种病毒的样品RNA为模板，以SEQ ID No.2\4为引物反转录获得病毒cDNA,然后在同一个PCR反应体系加入四条引物,分别得到773bp和332bp产物，本发明同时优化了反应过程中的各种参数。利用本组引物建立的针对WDV与WYSV病毒的双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地在一个体系里同步检测和鉴别介体中的两种病毒，能够起到很好的监测预警，最终达到在病毒病害大流行之前控制病害的目的。

Description

同步检测小麦矮缩病毒和小麦黄条纹病毒的双重RT-PCR方法

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，具体地涉及一种新病毒即小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus，WYSV)，以及在同一PCR体系中同步对介体异沙叶蝉体内携带可侵染小麦的两种病毒–小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)和小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus，WYSV)进行扩增，达到快速区分、高效检测的目的。

背景技术

异沙叶蝉(Psammotettix alienus Linnaeus)是一种农业昆虫，隶属于半翅目叶蝉科(Cicadellidae)角顶叶蝉亚科(Deltocephalinae)隆脊叶蝉族(Paralimnini)的沙叶蝉属(Psammotettix)。它广泛分布于欧洲、非洲北部、北美及亚洲中北部地区，同时也是我国的西北、华北地区干旱、半干旱地区麦田叶蝉的优势种。异沙叶蝉的取食寄主为小麦、大麦、燕麦、黑麦、青稞、糜子、谷子、莜麦、高粱、玉米、水稻等多种禾本科植物。以成、若虫刺吸植株茎、叶的汁液，会造成受害部位出现大量失绿斑点，严重影响植株的光合作用和生长发育，导致叶片干枯、生长滞后。更为重要的是它在取食的同时传播小麦矮缩病、小麦红矮病等病毒病和小麦蓝矮病等类菌原体病原物。因此，异沙叶蝉的大发生同时往往伴随着这些病害大面积流行，造成的危害远大于直接取食，给小麦等粮食作物的生产带来了严重的损失。

由异沙叶蝉以持久性非增殖方式传播的小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)是近年来在我国新发现的一类侵染禾本科作物的双生病毒，为双生病毒科玉米线条病毒属的成员之一，病毒粒体呈孪生颗粒形态，是植物单链环状DNA病毒。全基因组由2739-2750个核苷酸组成，编码包括运动蛋白、外壳蛋白、两个复制相关蛋白在内的四个蛋白，还有长、短两个基因间隔区。目前，小麦矮缩病在全球范围内的危害日益猖獗，已经成为欧洲、非洲和亚洲等大、小麦生产上威胁性很大的病害之一。2007年我国首次报道了小麦矮缩病在山西太原的发生，随后在陕西、甘肃、河北和云南等12个省均有发现。近年来在陕西北部麦区已引起严重减产，正成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病。

小麦矮缩病毒罹病植株典型症状表现为矮化、黄化和分蘖增多等。2016年本发明人在陕西韩城进行病害田间调查时发现了一种新的病害症状，与小麦矮缩病毒病产生的症状不同，受侵染的小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死(图1)。经观察发现发病田块儿主要的农业害虫为异沙叶蝉，将异沙叶蝉捕回饲养到健康小麦植株上，3周后小麦植株出现了与田间相似的病症，初步证明该病毒病是由异沙叶蝉传播的，很可能是一种还未公开的新病毒。因此有必要对该病毒进行鉴定，检测。

植物病毒的检测方法通常有生物学、血清学和分子生物学等手段。但就WDV和与新病毒WYSV而言，由于两种病毒均由异沙叶蝉传播，症状上又有相似之处，生物学鉴定无法完成鉴别；血清学具有快速简便、高通量等优点，但对制备抗体的特异性有较高要求。分子检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点，被广泛应用于细菌、真菌、病毒的快速检测和鉴定，以及病害的早期筛查与诊断中。随着生物技术的发展，基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用，主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术，这些技术可对多个靶标进行同时检测，具有快速、高通量、样品消耗少等特点。多重PCR是一种PCR衍生方法，它的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，可对多个靶标进行同时检测。本发明即利用以上原理针对异沙叶蝉体内携带的WDV和WYSV两种病毒设计特异性引物，优化反应和扩增条件，建立了特异、高效的双重PCR检测体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus,WYSV)，该病毒由异沙叶蝉携带，被侵染小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死。

本发明还提供一种快速又高效的用于同步检测异沙叶蝉体内携带的WDV和WYSV的两种病毒的方法。以常规PCR为基础，根据两种病毒基因组序列设计引物，并对其进行筛选，同时对双重PCR体系及反应、扩增条件进行系列优化，最终获得在同一个反应体系中同步检测两种病毒的方法。

小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus,WYSV)，编码该病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种用于同步检测WDV和WYSV两种异沙叶蝉传播的小麦病毒的双重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下两对特异性引物对，其中扩增WDV病毒的特异性引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5’gta ggc gtt gct tgg ctt gc-3’，

SEQ ID NO.2：5’taa tgt cgc cta tct tgc cgt c-3’；

扩增WYSV病毒的特异性引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5’cac caa tcg gca atg aag cag t-3’，

SEQ ID NO.4：5’act cct gct act tgt tga cct gaa-3’。

所述PCR体系中引物对的摩尔比为WYSV：WDV＝2：3。

所述PCR体系的总体积25μL，其中含有3μLcDNA，2μL浓度为2.5mM的dNTP、0.2μLrTaq以及浓度为10μmol/L WYSV/WDV上下游引物各0.2μL和0.3μL。

所述PCR扩增反应条件为：94℃3min，94℃30s、55℃45s和72℃50s共35个循环，72℃10min。

上述方法在同步检测介体体内同时含有WDV和WYSV两种病毒或者寄主携带有WDV和WYSV两种病毒中的应用。

所述介体为异沙叶蝉，所述寄主为小麦，大麦或燕麦。

2016年本发明人在陕西韩城进行病害田间调查时发现了一种新的病害症状，与小麦矮缩病毒病产生的症状不同，受侵染的小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死(图1)。经观察发现发病田块儿主要的农业害虫为异沙叶蝉，将异沙叶蝉捕回饲养到健康小麦植株上，3周后小麦植株出现了与田间相似的病症，初步证明该病毒病是由异沙叶蝉传播的。

根据寄主加症状的病毒命名规则，将新病毒暂定名为小麦黄条纹病毒(Wheatyellow striate virus,WYSV)。通过对感病小麦样品的转录组测序分析、序列测定及分析揭示：该病毒为负义单链RNA，整个WYSV基因组全长为14,486nt，基因组序列与两个水稻黄矮病毒株系RTYV和RYSV基因组分别具有58.1％和57.7％的核苷酸序列一致性。与水稻黄矮病毒相同，WYSV含有7个的开放阅读框(ORF)，在反义链上以“N-P-P3-M-P6-G-L”顺序依次编码蛋白。另外，WYSV基因组有76nt 3'端前导序列和258nt 5'端尾随序列，ORF由保守的基因间序列分开。WYSV与RTYV的L蛋白之间氨基酸(aa)序列一致性最高，为63.8％，但与P6蛋白一致性最低，仅为29.5％。系统发育分析表明WYSV与植物弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)的成员归为一簇。同时利用透射电镜观察也在感病的小麦叶片组织中发现了大量的子弹状的病毒颗粒。经室内生物学接种还发现，该病害可以由异沙叶蝉传播到大麦及燕麦上。因此，WYSV是一种通过带毒异沙叶蝉侵染到小麦等禾本科作物上的细胞核弹状病毒。另外本发明人还发现异沙叶蝉携带WYSV后，再进行接种WDV，受侵染的小麦群体里WDV检出比率下降，WYSV检出率更高。可能由于这个细胞核弹状病毒在介体异沙叶蝉体内大量复制导致传出的比例较高，推测WYSV这种新病毒流行的风险性很高。因此，建立适合两种病毒的快速检测方法，做到早期发现与预警，对及时有效地控制该病害将起到重要的作用。

本发明提供的上述扩增WDV和WYSV两种病毒的特异性引物对，通过RT-PCR可分别获得773bp和322bp的单一条带，通过对体系中退火温度的设定、dNTP Mix和rTaq的用量进行系列优化，建立了基于单重RT-PCR技术的双重RT-PCR检测方法，从而实现对异沙叶蝉传播的WDV和WYSV两种小麦病毒同步检测技术的突破。具体发明内容涉及到：1)含两种病毒的介体样品的采集与保存；2)小麦黄条纹病毒(WYSV)的鉴定；3)异沙叶蝉总RNA的提取；4)特异性引物的设计；5)WDV和WYSV两种病毒的单一RT-PCR体系；6)WDV和WYSV的双重RT-PCR体系的建立与优化；7)双重RT-PCR产物的回收测序；8)双重RT-PCR体系的灵敏度测定；9)运用双重RT-PCR体系检测田间异沙叶蝉样品。本发明的双重PCR经优化，确定了体系中最佳条件为：退火温度为55℃，2μL dNTP mix(2.5mM each)、0.1μL rTaq以及浓度为10μmol/L WYSV/WDV上下游引物各0.2μL和0.3μL的使用量。双重RT-PCR扩增体系如下：94℃3min，(94℃30s、55℃45s和72℃50s)×35个循环，72℃10min。

以上所述的两对特异性引物可做为组合应用于异沙叶蝉体内WDV和WYSV两种病毒的同步检测和鉴别的应用。

所述的WDV毒源是采自陕西韩城，经PCR和血清学鉴定为阳性的植株，经介体异沙叶蝉活体饲喂保存在感病小麦品种扬麦12号。

所述的WYSV毒源也采自陕西韩城，经高通量测序鉴定和PCR鉴定为阳性的植株，经介体异沙叶蝉活体饲喂保存在感病小麦品种扬麦12号。

所述异沙叶蝉种群采自陕西韩城，常年在小麦幼苗上饲养。

所述的介体饲养和作为饲料的寄主小麦材料均种植在22℃培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。每四周将叶蝉转移到新种的幼苗上，以此方法来保存介体。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次分离得到了新病毒WYSV；

2.提出在异沙叶蝉体内同步检测WDV和WYSV两种病毒；

3.本发明提出的检测引物具有特异性和兼并性，优化了PCR扩增程序，大大地提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度；

4.本发明实施的检测是在同一个PCR体系完成，节约了病毒RNA以及PCR扩增体系各试剂特别是反转录酶、Taq的使用量，大大减低了检测成本。

附图说明

图1.WDV与WYSV两种小麦病毒的症状比较图。

图2.WYSV经人工接种侵染禾本科作物的症状，寄主分别为(A)小麦；(B)大麦；(C)燕麦。

图3.WYSV病毒粒体的透射电镜照片。

图4.WYSV的病毒基因组的分析。(A)病毒的基因组结构示意图；(B)和(C)分别表示小麦和叶蝉虫体经高通量测序得到的读序在病毒基因组RNA上呈现波动性分布。

图5.WYSV的基因组序列特征。(A)基因组3’和5’末端的互补序列；(B)病毒的每个ORF间隔区的保守序列。

图6.依据L蛋白氨基酸序列采用MEGA7.0软件构建的WYSV与其它侵染植物的弹状病毒的系统进化树。图右侧对应每个病毒的传毒介体和间隔区保守序列。

图7.两种病毒的单重PCR检测的引物特异性电泳结果；其中：M代表DL2000 DNAMarker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1～2泳道依次为携带WYSV和WDV病毒的异沙叶蝉样品分别应用相应的特异性引物扩增的结果；3泳道为无毒叶蝉样品对照。

图8.两种病毒特异性引物扩增的兼容性电泳结果；其中：M代表DL2000 DNAMarker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；；1泳道为WYSV和WDV两种病毒样品混合物用混合的两种病毒特异性引物扩增的结果；2～3泳道依次为WYSV和WDV病毒的异沙叶蝉样品分别用相应的特异性引物扩增的结果；4泳道为无毒叶蝉样品对照。

图9.双重PCR体系的优化；其中A:退火温度的优化,从左到右分别为51/53/55/57/59℃；B:dNTP用量的优化,从左到右分别为1/2/3/4/5μL；C:rTaq用量的优化,从左到右分别为0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL；所有图中的M代表DL2000 DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。

图10.双重PCR体系的灵敏度测定；图中的M代表DL2000 DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。1～5泳道依次为病毒样品的cDNA 5个浓度梯度(10⁰～10^-4)的电泳结果。

图11.双重PCR体系应用于异沙叶蝉样品的检测；图中的M代表DL2000 DNAMarker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。1泳道为无毒叶蝉样品(阴性对照)，2泳道为有毒叶蝉样品(阴性对照)，3-9泳道依次为陕西韩城田间叶蝉样品1-7号。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

需特别指出的是，尽管本发明阐述的是针对异沙叶蝉介体体内同步检测WDV和WYSV两种病毒的鉴定技术，但WDV和WYSV病毒是由异沙叶蝉携带病毒侵染小麦、大麦、燕麦等多种麦类种质资源，因此应用本发明对任何引起WDV和WYSV病毒的寄主如小麦、大麦、燕麦等麦类种质资源的检测均也包括在本发明所要求的权利范围之内。

下面所用到的生物材料本申请人的实验室都有保存，可以对外公开发放。

实施例1.介体异沙叶蝉以及WDV和WYSV毒源样品的准备

1.1介体异沙叶蝉的来源与保存

异沙叶蝉采集自陕西韩城普通田块，脱毒纯化后在健康小麦上扣罩饲养。饲养条件为：22±1℃,20000lx条件的光照培养箱中。

1.2小麦矮缩病毒的来源与保存

小麦矮缩病毒(WDV)分离物以及传毒介体(条沙叶蝉)均采集自陕西韩城发病田块。经PCR检测和CP基因克隆测序确定为小麦矮缩病毒(WDV)分离物后，在感病小麦品种(‘扬麦12’)上经异沙叶蝉传毒繁殖毒源。毒源在22±1℃,20 000lx条件的光照培养箱中常年繁殖。

1.3小麦黄条纹病毒(WYSV)的来源与保存

2016年4月在陕西韩城进行病害田间调查时发现了一种新的病害症状，与小麦矮缩病毒病产生的症状不同，受侵染的小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死。采集自发病田块的2000头叶蝉并保存至温室的防虫网笼里，经虫子接种到一叶期的扬麦12上，转移至22±1℃,20 000lx条件的光照培养箱中生长。3周后叶片有黄条纹症状的植株做为接种体繁殖毒源，进行下一步验证。

取60头成虫叶蝉饲喂到有症状的植株上，72小时后将虫子接种到一盆健康小麦植株上，4天后，按3头/株转移至新的健株上。72小时接种期过后去除叶蝉，接种植株放置在环境箱中生长。对应的无毒叶蝉做为平行对照。

实施例2.小麦黄条纹病毒(WYSV)的鉴定

2.1生物学鉴定

为了检测病毒的介体传毒特异性，选用无毒的褐飞虱(Nilaparvata lugens)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)和白背飞虱(Sogatella furcifera Horváth)三种飞虱以及麦长管蚜(Sitobion avenae)、麦二叉蚜(Schizaphis gramienum)和禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)做为实验昆虫进行传毒实验。另外还选取了大麦(品种名：龙啤麦3号)和燕麦(品种名：岸黑燕麦)做初步的寄主范围鉴定。以上实验的饲毒和传毒步骤同实施例1.3，所有的检测植株放置在光照培养箱中生长，2-3周后观察发病症状。生物学实验结果表明WYSV能够有效地通过叶蝉传播到大麦和燕麦等禾本科作物上(图2)，接种3周后，大麦品种龙啤麦3号的叶片呈现金黄色，而岸黑燕麦的叶片表现为深红色。介体的特异性实验也表明WYSV仅能通过异沙叶蝉特异性传播，而不能通过褐飞虱、灰飞虱和白背飞虱以及麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜传播，表现出很强的介体病毒特异性。

2.2电镜观察

将具有典型症状的WYSV病株叶片切成小块投至戊二醛固定液里，然后再用1％锇酸进行后固定，经过脱水、置换、浸透系列步骤后，采用环氧树脂CY212(Agar Scientific,Standsted,UK)作为包埋剂，将组织标本包埋在树脂中。将超薄切片用5％W/V醋酸铀和2％W/V柠檬酸铅(PH12)进行双染色，用H-7500型透射电镜(Hitachi High-Technologies,日本)进行观察。经观察发现，病毒聚集于感病植株叶片的维管束组织中，在感病组织的细胞核中发现了大量子弹状的病毒粒体，结构和形态与其他已报道的侵染植物的细胞核弹状病毒属病毒非常类似。WYSV典型的病毒粒体大约为180-210nm×35-40nm,成簇平行地排列在膨大的核周腔中(图3)。

2.3高通量测序获得WYSV病毒基因组近全长序列

用TRIzol法提取具有典型症状的病叶和有毒叶蝉样品的总RNA，分别建立了两套去核糖体的RNA-seq文库，采用Illumina HiSeq X-ten测序平台，测序读长为2×150bp(文库构建和测序均由北京贝瑞和康生物信息技术有限公司执行)。从病叶和有毒叶蝉两个文库中分别获得了103,396,270和61,864,662的2×150bp原始读序(read)，对原始数据进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量读序，获得高质量的序列。进行de nove聚类组装，分别得到了长度为200-19993nt的259,179个重叠群(contigs)和200-28,405nt的466,904个contigs。使用BLASTx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在NCBI数据库中比对发现，感病叶片和带毒叶蝉转录组中分别获到的长度为14512nt和14399nt的两个较长的contig可以匹配到已知的弹状病毒基因组的多个蛋白上，如复制酶基因，但序列一致性低于65％，推测该病毒为一个全新的植物弹状病毒。

2.4 WYSV的基因组结构与特征分析

根据高通量测序获得的两个contig(14512nt和14399nt)设计引物，采用3’和5’RACE试剂盒扩增获得病毒的末端序列，经拼接得到了长度为14486nt的WYSV基因组全长序列(SEQ ID NO.5)，经RT-PCR分段克隆验证表明所得的序列准确无误。Blast分析表明该病毒与水稻黄矮病毒(Rice yellow stunt virus,RYSV)一样，为负义单链RNA病毒，共编码7个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。每个ORF对应编码的蛋白分别为：核衣壳蛋白N(ORF1),磷蛋白P(ORF2),假定蛋白P3(ORF3),基质蛋白M(ORF4),糖蛋白G(ORF5),假定蛋白P6(ORF6)和聚合酶蛋白L(ORF7)七个蛋白，蛋白特性如表1所示。如图4A所示，WYSV基因组假定的各基因排列顺序依次为3'-leader-N-P-P3-M-G-P6-L-trailer-5'。将小麦叶片和叶蝉的高通量测序得到的读序重新比对到WYSV全长基因组上，发现两者在病毒的基因组RNA上呈现出相似的分布，而且每个ORF区域对应的读序都比相邻的非编码区的读序数量多出很多(图4B,4C)。

表1 WYSV基因组编码的蛋白特征

注：nt，核苷酸；aa，氨基酸；kDa，千道尔顿。

病毒的进一步的序列分析发现病毒的RNA两端含有长度为76nt的3’leader(前导序列)和258nt的5′trailer(尾随序列)。5'端的trailer尾随序列的后9个nt(5′-UGGUGGUGU-3′)与3’端前导序列前9个序列(5′-ACACCACCA-3′)完全互补,形成弹状病毒序列中的典型的短锅柄状结构(图5A)，且9个序列与水稻黄矮病毒RYSV完全一致。在3’leader区序列中发现存在一个4核苷酸UGUU基序(第44-47位)，这是负链RNA病毒一个保守的特征。

基因间隔序列在每种病毒的基因之间和植物弹状病毒基因组之间都是高度保守的，WYSV基因组的每个ORF被高度保守的基因间隔序列3′-UAUAAAUUUUUGGGGUUG-5′分隔开(3'/N间隔区例外)，这个序列与其他的植物弹状病毒相似(图5B)。已知的弹状病毒基因间隔区由三部分组成，3'末端的poly(U)尾巴(元件I),一个分割每个基因的短的非转录元件(元件II)和一个位于每个后续基因开始处的保守元件(元件III)。与其他植物弹状病毒相比，WYSV的元件I和元件II的序列比较类似，其中元件II有四个G残基，比RYSV，MMV,TaVcV,PYDV以及EMDV等细胞核弹状病毒多一个G。而元件III的UUG与RYSV,PYDV和SYNV等许多细胞核弹状病毒相一致。

基于L蛋白氨基酸序列对20种侵染植物的弹状病毒(WYSV和19个代表性成员)进行系统发育分析，系统发生树显示：WYSV与细胞核弹状病毒属水稻黄矮病毒的两个株系RTYV和RYSV聚集在一个独立的分支中，拥有一个共同的祖先(图6)。

实施例3.异沙叶蝉总RNA的提取

采用TRIzol(Invitrogen,USA)法分别提取待检测叶蝉样品的总RNA。具体提取过程为：将单头新鲜或冰冻的样品，放入1.5mL离心管中，用带有无线电动机的研杵(北京天根生化科技有限公司)研磨数秒，之后迅速转移入液氮中冷冻，重复直至叶蝉被充分研磨至粉末状，然后加入200μL TRIzol，剧烈摇晃混匀，冰上静置5min；加入40μL氯仿，用力摇15s，冰上静置5min。4℃，12,000rpm离心10min；将上清转入新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；4℃，12,000rpm离心15min，去上清；加入500μL预冷的75％乙醇(灭菌的DEPC水配制)，洗涤沉淀。4℃，12,000rpm离心5min弃上清，重复上述洗涤步骤，以彻底洗干净盐分；用枪头尽量吸出上清。在通风厨中，开口朝上，干燥1-2min后用15μL灭菌的DEPC水溶解。取1μL RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值。合格样品置于-70℃冰箱保存待用。

实施例4.特异性引物的设计

根据Genbank登录的WDV病毒的全基因组序列(Genbank no.JQ836568)和测定的WYSV全基因组序列全长(SEQ ID No.5),应用Primer Premier 6.0软件设计这两种病毒的特异性检测引物，每对引物选择相似的退火温度且不同的PCR产物大小及避免二级结构和引物之间的互作，具体引物如表2，引物由上海生物工程有限公司合成。

表2.WDV和WYSV两种病毒的双重PCR检测体系中所用的特异性引物

实施例5.WDV和WYSV的单一RT-PCR体系

利用随机引物反转录(reverse transcription,RT)合成cDNA。cDNA 合成体系总体积为20μL，其中RNA(大约1μg)3μL，随机引物(10μmol/L)(全式金生物有限公司，中国)1μL,DEPC ddH₂O补足至13μL,混匀后95℃变性2-3min，立即置于冰上2min；然后加入dNTP Mix(2.5mM each)2μL,5×MMLV-buffer 4μL，M-MLV反转录酶(Promega,USA)1μL，RRI(Takara,China)0.5μL。混匀后，37℃孵育1h,70℃10min,-20℃保存。

PCR体系如下：cDNA 3μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus,25mM)2.5μL,dNTP Mix(each2.5mM)2μL,上下游引物各0.5μL,rTaq(Takara,China)0.2μL，用ddH₂O补足至25μL。扩增体系如下：94℃3min，(94℃30s、55℃45s和72℃50s)×35个循环，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳，用EB染色观察结果。电泳结果显示：用相应的特异性引物扩增WDV和WYSV分别获得了773bp和322bp的单一条带(图7)。

实施例6.WDV和WYSV的双重RT-PCR体系的建立与优化

利用实施例4中的方法合成cDNA,分别取携带WDV和WYSV两种病毒的叶蝉RNA各3μL加入0.6μL离心管中，同时加入1μLRandom primer,其他条件与单重RT相同。

双重RT-PCR体系与单重RT-PCR体系的试剂成分相同，但是双重PCR体系是在一个反应体系中检测两种病毒，因此双重PCR体系中的RNA和引物为两种病毒RNA和特异性引物对的混合物，引物对的最佳比例为WDV：WYSV＝3：2。结果表明两对引物有良好的兼容性(图8)。为了优化双重RT-PCR体系，将不同的dNTP Mix，rTaq以及不同的退火温度做为优化的因素，其中：将RT产物作为双重RT-PCR反应模板。实验中Taq DNA聚合酶设0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL 5个处理；dNTP mix浓度设1、2、3、4和5mmol/L 5个处理，退火温度设51℃、53℃、55℃、57℃和59℃5个梯度；结果分别如图9(A-C)。

实施例7.双重RT-PCR产物的回收测序

将实施例4双重RT-PCR体系中的扩增产物通过纯化回收，克隆入pEASY-T5载体(全式金生物有限公司，中国)，导入到感受态细胞Trans-T1(全式金生物有限公司，中国)中实现转化，挑取10个克隆斑，经菌液PCR扩增阳性并送样测序，每个样品送3个克隆。测序结果经比对表明扩增得到的序列与参考序列同源一致性分别达到99.9％和99.5％，证明了本发明建立的双重RT-PCR检测的可靠性。

实施例8.双重RT-PCR的灵敏度测定

为检测双重RT-PCR体系的灵敏度，将cDNA成10倍系列稀释(10⁰-10^-4)，结果表明双重RT-PCR的检测底限是10^-2的cDNA，当稀释100倍时，双重检测体系中WDV的条带比较模糊，而WYSV的条带依然清晰,结果如图10。

实施例9.田间异沙叶蝉样品的检测

用优化好的双重RT-PCR体系对来自陕西韩城的7头叶蝉样品进行检测，发现单头虫体里既有WDV或WYSV一种病毒单独存在的情况，也有这两种病毒同时存在的情况(图11)。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 同步检测小麦矮缩病毒和小麦黄条纹病毒的双重RT-PCR方法

<130> PP18011-ZWB

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtaggcgttg cttggcttgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

taatgtcgcc tatcttgccg tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

caccaatcgg caatgaagca gt 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

actcctgcta cttgttgacc tgaa 24

<210> 5

<211> 14486

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

acaccaccag acaacaactg cacataggat ccagtattta gaatgtttgt cggcagatga 60

gcaaatactg ggaactatgg acacgtcatt gtctgggtcc caaaagtacc tgggcccacg 120

caagcgtcgt cacattccta atcatggaaa aaacatcact cacaggcaag gggcatcatg 180

ttcctctatt tctcatttta aaaaccccaa caacaacttc actggcacca tggctcagaa 240

ccccaatgtt gctaactatg ctaatgctgc accactcccc aggtttgaag gtctaggcga 300

cagagagaac cttgcaccaa tcggcaatga agcagtcgag ataccgtacc agaaagaagc 360

ctatctcgcc tggatcaacg aaggaagagt attccaggtc aatcagctta ctgatgagca 420

aatgattcaa atgtgggaaa ccgtcaagac atccatgcaa ggcaacacat tcagcgagca 480

gcacatgcgc gacattgtcc aaatggcctg caacctaaag ggcgtggacc cagccacaaa 540

gcccctctac aggcaatacg agatgccaga aaacggacgc tgggcagacg ctccctctca 600

ggatcccatc ttttcaggtc aacaagtagc aggagttata gtaccacttc aagaagcaca 660

gcccctagtt gaggatgtat ccgggaaagc tagagcaatt ggtttcatat gcggatttct 720

gttgaggttc atagtaaaga ctgaggagca tctgaataat tccttggcaa acttgaagct 780

ccaattcagt aggatatatg gtgtgcagtc tgcaaccata aatcaatgga acccaactac 840

cacatgggcc tctaggatca agcttgcatt tgacacctat ctgaccctgc gagcaaccgt 900

tgccttgcat gtggctcttg ctgatggaaa cctcaatgca gataatgtga acttcggtct 960

atgcagaatg ttggtgtttc aacacctaga gctgagtgga ttacagctgt ataaaatgac 1020

aatgactctg atatctcacc tcaatttgat atctcctgca aagtttctat cttgggtgta 1080

tgaccctctg gctgaaaaac cgatcacaca gatctacacc atagcaacaa cacatgacac 1140

cagagacaga caagaccaga aacactggaa atatgcaaag ttagccagag gacagtattg 1200

gctagacacg accgtcaaaa ggaaccaatt ctttgcatat gtcctggccg atctggaggt 1260

aagatatggt ttgggtggca agaccgagta ttcaaatcct aagaggatga aagctttgga 1320

cggaacacct gtcgagacaa gaaacgatgc tgagtcggtg gcagcagcct tccaacagat 1380

gtacagagtt attgaagatg agaagagaag agaggccgga gccgccttcc gtctggccag 1440

aggcatgcct cctcctccca atcctcctcc agcagcagga gggcagggag gtggtgttgg 1500

agcccaagga cttggcaatg tccaagctcc cccaggtgca ggaggtcaag tgatacctcc 1560

cggaaatctt ccacctccac cagcagcccc gcctgcaggc gcagccggac aggcgccagg 1620

ccaacaggac cagcagatca accctcctgg acaggtgccc atggatctgg accaaagggc 1680

aagagatgct gctgctctgg gacttgttta acgccagaac tagagcacaa tgctaatatt 1740

tatgttacct caatgtgatg gttgtgtgcc tttaaaatgg gttttatgtt gtgatatatt 1800

tatgtctagt ccgatatacc tctatatttt aagaagggta atgtatcagt attaacaatg 1860

tggtatgatt tatgttgact aagcatttaa ataaacttat gtatacgtgt tgtacctggt 1920

attgcagtat cttgagaata tatttggtga tatttaaaaa ccccaacaca atatttgatc 1980

actcttgcta gatcattaat tgcaagacag catcaaagat cagacaaatc atccaggcac 2040

tgacagcaac gcaacaagta gattgtccaa actatgtttt agtatggctg atagtttgga 2100

cacagacagg ggcagaacta caaggtcagg atcaaagtta aaagctcaga caacacatag 2160

ggtggggaca tcctctggat cagttcgagg cggaaaacca tacgagaaag acttcaaagc 2220

cgtagaagca aggtttcaca actttgatcc aattagtgca agcataatcc gaggggatca 2280

ggaaggaacc aaagcagacc taataatgag tgactcctca gtaacgaaag ccacagcacc 2340

ggctgaagcc gcggcgcccc cacccccgcc gcagccggcc gcagtccccc tcacaccacc 2400

agcaagtgca accacccagg ggcagaagag accaggagat ccagaaactt tggaggaggg 2460

gaatgctgct aaaagagttc aacgggcaaa caaggtgaac aacttattaa cgacacaagg 2520

aataggcgag ccttccaaat cagctatatc ccaatatgtg gttgctaggc tgaatgcaaa 2580

taatgtggag catgatgatg ctatggtggc tgaatgtgca aatatggcag tttacgggtg 2640

gaaagaaggg aagaaatttg tgtctacgca aatattgaac caggccacca cggtgatacc 2700

agatctaata acctccatgg taacgaatgc aaacctcatc accaatgctg caaatgcctt 2760

gaacagcatc ccggacaaag tcgcaggggc tatacgtacc aacatagaac atgtcgcatt 2820

tcagactgga tcaaaggcca caaagagaga cacattagta aggacggcag agagcattta 2880

tcaaaatgca gctgctgaat cgaaggtgga ctttatcaac aatttcataa tatcagcagg 2940

gatcaatata caagaagtta aaagaaatgt tgcaaattat aggacaattg caaatgcgat 3000

aataaagaga aacactgtat tgaacataat caatgagaca acggagcatc aggctctgct 3060

tacacaggtc cagggcaaca aagatgatat caggaacatt gcacgaggac tctcagcttc 3120

atatgttatc tagaggtacc tacgaataat aaaagttgtc gctgtatgct cagcagacta 3180

ctggtgagat gcagtgtcaa ccatctatgg tcggttgttt tgtaatctgt cttaatataa 3240

ttgtatccat ctttgtgttt catatagcct accgggcact tgtctcattt gggtcagaca 3300

tagcatgccc ctaaatttaa tattgactaa aggggaggtt gttacacatg tattctaaat 3360

tcacatatgt atccttgtta tatttaaaaa ccccaacaga gatatacagc ttgcacagca 3420

ggcagccaaa cagcgaggag cgcccgaaag acagaaagac aaccagcatg gcaagcgaag 3480

caaagaattc tcagaagttt tccttcagga acactgaaga ggaggttgat ctatcaattt 3540

ccaagtttgc cttgttcaag ctgaagctca aacagtctcg tgttgttaca atgttcggca 3600

atgatgacaa ggttgaccct gcaaactgtt acataaatat gaccagtata aagatagtca 3660

ctagcagtgt acttccagag agtgacccga gatttatggt gtgggagatg tcatataaga 3720

cagatgaaga gaatcataag ttagggcagc tggcctggaa agcatcatac aatggatcat 3780

ttgtcatcaa atccacctat gcaatgatgg tagtaaatgg tgatctatac accccgtata 3840

ctgccagcat aactacatca gatggtagcg aaatcaaagg tgttaaggta aacgtgatac 3900

ttaactggac accatcagat gtaaggccat caaatgctaa gatgggaggg ttcatgagcg 3960

acatatattg caacaacccc tcaaatggga agacacagat acctcctatg gtggcatggt 4020

atatggggaa ggacgagcag agatattgca agataatcaa taagttggca acagaattga 4080

gcagcgagaa catttatccc atgatggagc tcatatcaag cccacaaact tctctgaacc 4140

caatactgaa taggctgatc tcaagttccc tcgagaaggg tgatagagac agaatcagcc 4200

agatgaccaa agctgtcgga gggggcatgt cactgaacaa ggcagacata tcatatctca 4260

aagggattat tgagaaaaaa tcatcttctg ctttagtgac atttcttatg agagccagca 4320

cagagctggg tgtagaagtg tatattgatg gttgaacaaa gggagagata tattggagca 4380

ttattatctt ccctgacaac ttatatggta atagtaacac ccgcataagc acccactata 4440

ctatcgtcca ccaaaagccc aaacatcaca atatccgcag tgtgttgtac tattattatt 4500

ataatattta aaaaccccaa ctatactgaa tcaacaatca cacatcacac aaacagagta 4560

ccatggccca cagcaagata cgtataacgg gagctgggct agatggggtt tcttatttgg 4620

agagaatacg gaaatctcta tctctcaacc cagccgatta tcatgatgac agtgccgttc 4680

gtatctctct gagcttctat atcaagatat ccttccatga tgtatcagat tatgacgtat 4740

ttatcagaga aggtgttaca accacagagt tgtttgatgc tctgaagaca agctggaaac 4800

ggaacccaga gaatgtcaga tacatagatg ggatgaccca cacagatgat gaaatagata 4860

ccacaatatt actatgtgag ctcgttacta tcttgaaaga tctatctcta cacagaagtg 4920

atgagagaac tcattatagt ttaatgagca catccttgac actgggtttc ggagatcaaa 4980

taacacagcc acatgacaat gctgtaatcc ccatagtcac aacaaaggtg attccaagat 5040

acatgcacac tgttatacaa tatgagtatc caagagtatc aggcggtata gcggcctccg 5100

tgtgtgcagg gatatgtatc aggtcacctc ctatagggaa gtgtccgccg ataatgaaaa 5160

cagtcaatgt ggaagtgcta gcattccatt atggactaga tgccggccaa ggaccgcagc 5220

tggaggagac aaatgccact ccaaaggaag aagaactgaa gaagattaat ggattcaaac 5280

gaatgactac actgaacaag tcatcacggg ttatcaagaa gccaagcaag gagggagttg 5340

gagcagcatt gagcagaatg ctctcttgga agtgatgtca tattcacaag tagacggttt 5400

ataatgttat cctggtatat taatgttatg tgtaatgctg tagttttcta aatataccaa 5460

ataaagttat aaagataata taagacttat atttaaaaac cccaaccact atcttaacat 5520

cacaagtcca tcgtgaaggt cagaagatca caaagcagtc ctcaatcagg gaaagggaaa 5580

atgaggacca caaccagaat gttgactata atcatctgca tgttgtttgg actatacatg 5640

atcatgttag gggagaacat gatactagca ttcggccctg tggacggtga tgatgactcg 5700

caggagaatc ggcccttcac actacatcct gctcacggag cgattccggt tttaccttcc 5760

agtcagccca gccagaaagt cagtcctgat gacaccaact cattaataag attgacgaca 5820

tcggaacagt tatggcacaa tcaccctcaa gatataggtc caaaagatgt cccagcagac 5880

atgtatccga tctattcctg tcctaatcta tcaaatgctt acttgttgcc gatatggtat 5940

ggaagttgcc ttgatgcatg ccagataaca acccccaaac atacagtgaa tgtgaagctc 6000

tggactatca acagctcagt aacagatgtt gacgggtatc agatagatgt gtattatgac 6060

acaaagttca gtcatgtcgg gccatttggt gggtgctcag tgtcgctttc tgagtcagtg 6120

acaaaagagc cgaagcagga ggatattatg atctggaaat caagactagt tagtaagccg 6180

gtgaacgatg tagaaagttg gatcatgtat gatgagccta gttgcaacta cttctctgat 6240

gagtactctt cagggttcag acttgtaatc acgagaacaa aattgaagct gatgatagac 6300

tcggttggaa atctttatat agcagatctg aggccagggt catatgatac atataaaacg 6360

ggatatgcaa tacatggttc tacagcctgg atatgggaca cagatgacag catgaaccat 6420

ggaatgtgtt acttcaagca gacagatgat acctattgcg attatgataa taacactaaa 6480

tatatgttct gcaagatgtc aggggtatca ttcgacacaa ctgtgcagca aagaatcacc 6540

tcaagttgtg ctggggattt gaacatatct acagatggag taatatatca aataggggac 6600

agtggtgata cggcctcgac acagcagaga ctatcagaca tattgcacca gaatgtcgag 6660

ctaggaatgc aatctctggt atccttgatc aatgatgtct ttataaacat tgaatcttca 6720

tactgtaccg gtgtttgcga tataatggag gtgattgtga gcaactaccc tacagcaaca 6780

actgttttag aaacaccgat aggaccatgg ctgcccataa catcagatgg acacaccatc 6840

atgactcctt gcatggctga tgttaattgg atcatacaga cacctatcgt ttattgcttc 6900

agcaaggaga tgataaaagt catcaacaaa gacacaagaa aggaagcctg gtggaggata 6960

gtgaactcgt acatcatatt gaatgagaca tgttcagata caaattcaac agccttggag 7020

atccttagag atcggatgtc taagaggaga gacattgtct acagcttttg gagaggggac 7080

ttgatagtgt cttatccata taacaaatca aggtggataa catataaaga cgagaagatc 7140

cagagaagct ccaaatggtt tgataaattg gtggacttga aatacaagca tcctataaca 7200

ctggataata tcacgagtca gcttgtgaac catacagctg acctatatga atggcatatg 7260

ggggacaaga atggaacagc aggtcagaca acattctcag atctcctggg aagagttgaa 7320

aaagcaggga caaacgtgat caagggatgt gtgaaaatga cggggaacct attgatatgg 7380

ataacgtccc atattgagat gattggtgat atgctaatta taatagtgtg tttgatcgga 7440

ggctattatg ttcttattat cccttatgga tttctgagga gagggagagg cccgggcact 7500

gtcacagaag ttcagcagtc gaacagtcag ttcagatctc ccttaatacc taggacatat 7560

ctgtgagaag gggacactaa aaagtatatg gactagccta agtggtgcat aatgcatctg 7620

actatcatat ttatagtaaa tgttcctgag ccggataagg gatacatttt tatatcttgt 7680

gcattatcca catatacttt actattatta atagattcat tatagtaaat tgtatttaca 7740

aaaaccccaa cgaagaacat ggacaagagc ctagacaaca agcaaggaga ccttctcaag 7800

atgtcaaaac ccaccgcaga cacaggcagc ccagacacgc cacaccccga gccagcacac 7860

accccagagg gggacacaac ccaaaaagaa gacacgaagg gaaacacagg caaggaagaa 7920

gcagcccaga gccccgaagc ggagcaagag gatgacaccc agccagaatg gtgctgcgag 7980

atagaagagc tcgatgttga gtcagactgg gaattttgct atcgagagga agatttcgac 8040

tgttactttg ataatgtatg ggtatatgag ttaattgatg aatgcaatgg atggagggaa 8100

taaatagtgc atgaacgatc catcagtgat atccacgtcg caacttaaag gaatctggct 8160

ccaggggagt taatataaag tttctttaaa taatcagaat caatagattc aatgagtgtt 8220

gtgtgatgtt gggttgctgg atatcaagac tgattatgta tcattatgtt gtgtgtatat 8280

ttaaaaaccc caacgaatga ttcatcattc acagagtaga gatccaaggt atggatgttg 8340

aagaaccaac atattgggca cacgatgaag acgatgacta ctggtgggat gcagatgagt 8400

acttgggtga agaagaagaa gatgaaatct atgaagatac agaggatgaa ttggtggagg 8460

ggggagactt tcatctaaaa tctgcgctaa gaggggaaga agacatgttg cagaatccta 8520

tttacaagaa agagcgggac agtatggttg aggagctagg gagtctaggc acattgatga 8580

accatataga tgttgtatcc atgctgaatt tgattggaac tagggttgca caggacaaac 8640

ggccgagtgg aggacatact ttcctacatg aaggggggtt caatataata cctttgcagg 8700

aaaatgtaaa gctgataaag gctgagctca tgtctgtgtt accagagatg gctgggatga 8760

atattgacca agtgttgtca gggtcatatc atctgttcat ggcagatcac ccgtatgtca 8820

cctgtacaat aagcactgtc ctgttcatac tctctgtgtt gaacaatgta aaaaacatca 8880

gacaaggtat cgaggttggc accctgatag gaaggattct atacaggaaa ggaaatcttg 8940

tatgtttaag cttagctgca gcaacattgt gttatctatc aactgatata ctggtttttg 9000

atgttgatgg ctcacgacat tacatgccga agacctattt cctcaacggg tgtgacaaag 9060

ttcaagaaag attcaatatc atgttgtatt catacatggc tgagtcattg ggagtaccgg 9120

gctcatgccc atctcagata gtgaaaagaa caatatcatg gggagacaat gtgttggcta 9180

acatggggaa tgaaggatac aatgtcattg gactatatga agctatactg gtggggatga 9240

tattagatag agatgatgaa gcattatctc ctacacctcg atcagagtcg tttctgtcaa 9300

atatattaac aggactgtca tcagaggaac aaggatacgc aaagcggtta atcaccacat 9360

tgcaagacat gagtccggct caattagctg atttacacgg tctatatagg atatggggtc 9420

atcctataat agatattgac ggcggggttc gaaagctaca gagagttacc agagaagaga 9480

aaggtgatat aaatgcaaag ccagagagca gagaaacagt gcgttcattc aggaggctct 9540

ttaccacaga atacttcaag aaacactcca tttatccccc aatggagata acatctaagt 9600

tcaatactta cttgggcaac tgcatccgaa caggaaaaga aattgatgaa aaacatataa 9660

attaccagtt ctctgattgg gactacattg aattgcagga aacattctcc attccatact 9720

catggaatgt gctgcatctt gcaaaggaca aagcaatatc tccaacaaga aatgagatat 9780

acaacatgct cctaagcaaa ggcaggatat tcaacgcaga gttgcggaga ggcgttctta 9840

aactgatgac aacaacactt atcccgttga gggatttttt gaagaaggtg gcatcagatg 9900

ggttagacat agatgattgt atcatcggtc tatttcctaa agaacgagag ttgaagatac 9960

ttgccaggtt ctttgccttg ctgtccttca atatgaggtt gtatttcacc tcaacagagg 10020

aactattagg aagtaaactt ctgaaatact ttccacagat aactatgagc tctaatttgt 10080

tggaaatgca ggaaaagatg gcttctatgt cgaaagaact aagaactcag aacaggtctg 10140

tgacatatgt gataaacatg gattttgtaa aatggaacca acaaatgaga gaatcaacat 10200

gccgaggggt cttcactgaa ctggataagt tatttggatt gaaaggcttg tatacgagat 10260

ctcatcaaat attcaaagat agtgtcttgt atatagcaga tggaacacgc agaatcttgc 10320

ctgacccaat atctggcgta atgatagatg acaatgcatg ctggacggac gacggagcag 10380

gcaaagaggg tatacggcag aaagcctgga ccataatgac cgtgtgtgac attgctgctg 10440

tggccaggca tcaccctggg aaattccacc ttgtgggagg aggagataat caagttctaa 10500

caataactta tcacacaaac caagtagata cgcagggggt cataactgag gcagggaaac 10560

aaaaaataaa aagcaaggta aagagattct tgacagatct agagaaacac ttttcagaaa 10620

gggggctccc attgaagact acagaaacat ggtgcagtac atctcttttc atgtataaca 10680

aatacatgta ttatcaaggt tctccacttc gttcaccact gaagcaggta tctaggcttt 10740

ttccgttctc gaacaacacc tctatgacct tacagtccat ggcacagtgt ttgggaacag 10800

gtctgagatc agttgcacag aaagaattat cacatatacc agcattaatg atgagaaata 10860

tctggggttc catcctaaca tggattgtca ctgtctgtca tcccatgttg ttaagcatct 10920

ctaaccaaga cagcttgaaa ggagacggta tcataactag ggggaaaaag gaaataaaaa 10980

tgaaagtgga atccgtggag tcggctccgc tagccttgaa gataatttat ctgccaggac 11040

attttggagg gcctggattg gttaatttgt tacaaatgac aatgagaggg ttcccagacc 11100

caattacaga aggaatttat ttcttgatgg ctatgaagaa aaatactgcg cgattgggat 11160

cagcatacac atctttattc cagagaatgg ccggagtatc attttcgagg agcaggaatt 11220

atgagcctct agttgaagat gtgtgttcac tgaacacaga cgctccaaga tccggaacga 11280

gtgaacagag ggaggtggcc aggaagatac tgttaaaatc aaaattagga gggaatgaaa 11340

atctaagaga cttattaaga ataatggaag gagacaatga gaagaatttc tacaaagccc 11400

tcactgcatc aagagttctg gatatcagag tgttacatga aatagcaagt gcaacactgt 11460

atgcaataac aaatacattc acctcaagag ttgatcgtac tgccactcta aaaagactca 11520

cattgagata ttccatgata aagagcctag cggagtcaga gaggaaattc ctgaggtacc 11580

tactggtgag ggatttgaag cagcatgaca tcatgtttga aaaatgcagt agagttacag 11640

cagatgagtg cagaacactg ggatggggta aacagatcat aggggtcacc gtggctacac 11700

ctttcgagta tttgagtgtg tctctgcgag agaaacatgt ctgtgacgga aataatatca 11760

ttgtaagact atcatcctcc gggaacaaaa aacaattggg tgaggtatta ggtccttgca 11820

agccttatct cgggacgtat accaaagaaa aattcaagat gacagaggtt gccgcagctt 11880

atggggatga agatgtatta accaaagcac tgagaattat gaagataata aattggaggt 11940

ttcctgaggg ctcaacaatg agcgagattc tgaaagcacc tttcagggct gttacagata 12000

tagatcctca aaggatgata caagagtcat ctgtgacaaa aggagattat gatcacagac 12060

gtaaaatgga ctcaagggtt catgggggta ttccaaattt tgtaatcaca ccactgtccc 12120

atatgagcat ctgcactagc acatggtaca agcatgctag aggggggaag aacgaaaata 12180

tccatttcca agcatgcatt atacagacta tgtataaaat cgtaatgctc cttatgaaca 12240

acggaaaatg tgatgaaatt atccacgctc atgaatcctg ctcaacatgc atatgtgaga 12300

taacagagcc ggttctggac ttagtaacac ccatgatgga tctgatattc cctcaattgc 12360

agaataactc actagtgtac ataccggaac aggccatatc atttgaccac tcaaggatga 12420

aagaagtgga ctatgcaaga agagtaggga tgctggactg ccacagggac acagattata 12480

cttggcttga cacgtacagt tctctatcat ggttgataat gtgcgatgtt ataggttgga 12540

caagaatgcc tcattcattc tactttatga tccagaatga tgtcgatcat tatctgttat 12600

cgatgtatct tatatgctta tggaaagtga tgaggaagga gtttgaattg ataaacacac 12660

agttggactg ggaacctatg atcaaggtgt actctacaca agaagggata acagtcttga 12720

gcaaccagat gggtttagta gtggggggct cattggaggg gggattggaa gtggacatga 12780

aagatatatg ctcagctttc aacacgctca ccatcacaca aatacctccg ttctcagtca 12840

accttgcatt gccaaagatc cacaaacagg ttgcagcatg gtggatgctt atggatgaca 12900

acacgctcct ctgcatagat tgtcataata acctgaacgg gtattgggat ggaacatcaa 12960

taaacaggag ggttgacaat gacctaagat gctacataca tgcagatgga gatgtgtccc 13020

cgagaataat aaatgcacac ataagcaatt tgtcgcaagg gctgatacgt ctgacaccgg 13080

ggggaacatc ccagagccat ccaataatta ttggaggaga taagctgaac aacctagaga 13140

cagtgccttc agttgaggat gaatggcctg atgtagagtc catcactttg ttgaaccaga 13200

taggggagac caatgatatt gatgggagat tgagattcat tattgagtca atgtcagtaa 13260

tcatgcctga tatagtagtt gtgagacctg atatgttgga tatcacactt gtaaaaacag 13320

ctagggagct gttaaaatgt gatgatggct caaaactcat aatatacata cttgtggaag 13380

aaccatcata cctagagagt gggacaatat atgagatgga gagggccttc ccaaatagtg 13440

aaacagtgga tgttcaattt gattacagga aggcaccggg aggactgcac aagctgtgga 13500

tcaatccaag ggaggaatct atacaaaggg ttgaagtggg agattggata tgcatatctt 13560

tcacggattt gatcaaacat catgacagta tcctggcaga tacagtattg acaatgaaag 13620

aaaggaggtt aggtagacaa ttcttggtga acaagggagt tggaagcttc aaaccgggag 13680

atttgggaaa gtatatattc tcatctgaat tgaatatgag ttacaagcag tcccgtcagg 13740

tggattatga gatcaacaag gtgatgatcc agaatcccac attggggggt aaatttatga 13800

tattgaagag aagatgttcc tgggcattgt tttcatcaag gtacgagatg ctaagagcag 13860

ttgaaagaat aaaaaagaac atgacagttg agggaaggtc aacaaaaacc aaggaatgga 13920

gcaagacaca tcaagatgat gttctgatac tgattatatc tatgctgatg agggctgatg 13980

aaaaagatga aagtgagata ttcacattgg ggtatgtaaa ctgtgatgtt gagaacttgg 14040

tcatgtaccc gaagtttagc agcacacagg tagtatctct gagatatttg gactactttt 14100

ggtttttcaa gagaatgtat gagtatcaag agaaaacatt tgctattcca tatactgaga 14160

tcagaacatc tctgaacatc ggctcgccca agagatcagg atacaacacc atcaacagct 14220

ccgaatgatc ggcatgtcaa accaccagag aggcggcagc cgcccggagg caagcgacga 14280

gccgcagacc ccccaaccaa ccacaactgc ccccttttat aaaaacccca atctctctct 14340

gtcaagatag agggccctta agggaagagg ccaagagagg aaagggatgc gccctgcccg 14400

tgtggctgtg gttttcttgt tgggtcttgg gataatgacc ccatatccat acaagaaaca 14460

agtttcggtt ttggatatgg tggtgt 14486

Claims (6)

1.一种用于同步检测WDV和WYSV两种病毒的双重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下两对特异性引物对，其中扩增WDV病毒的特异性引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5’gta ggc gtt gct tgg ctt gc-3’，

SEQ ID NO.2：5’taa tgt cgc cta tct tgc cgt c-3’；

扩增WYSV病毒的特异性引物对的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5’cac caa tcg gca atg aag cag t-3’，

SEQ ID NO.4：5’act cct gct act tgt tga cct gaa-3’；

编码小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus,WYSV)基因的全长核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的双重RT-PCR方法，所述PCR体系中引物对的摩尔比为WYSV：WDV＝2：3。

3.根据权利要求2所述的双重RT-PCR方法，所述PCR体系的总体积25μL，其中含有3μLcDNA，2μL浓度为2.5mM的dNTP、0.2μL rTaq以及浓度为10μmol/L WYSV/WDV上下游引物各0.2μL和0.3μL。

4.根据权利要求3所述的双重RT-PCR方法，所述PCR扩增反应条件为：94℃3min，94℃30s、55℃45s和72℃50s共35个循环，72℃10min。

5.权利要求1－4任一所述的双重RT-PCR方法在同步检测介体体内同时含有WDV和WYSV两种病毒或者寄主携带有WDV和WYSV两种病毒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述介体为异沙叶蝉，所述寄主为小麦，大麦或燕麦。

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