CN116064951A - 一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及PCR检测方法。根据侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的外壳蛋白基因和移动蛋白基因的核苷酸序列设计了2对用以检测此病毒的特异性引物，并利用设计的特异性引物对建立检测该病毒的PCR方法。本发明的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物对及PCR检测方法为植物中该病毒的检测提供一种快速、灵敏、特异、准确、高效、成本低的分子检测方法，从而为该病毒病的诊断和防控提供检测方法。

Description

一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及PCR检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种植物病毒检测方法，具体涉及一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及PCR检测方法。

背景技术

当前植物病毒病尚无有效的防治化学药剂，种植无毒种子种苗和抗病品种及阻止病毒传播是植物病毒病防控的主要手段。像目前流行的新冠病毒检测技术的重要性一样，植物病毒有效检测技术是上述防控手段建立的关键。因此，建立有效的病毒检测技术是植物病毒病科学防控的前提条件，对包括作物、花卉和树木等在内的植物的健康生长具有重要意义。目前植物病毒的常见鉴定技术主要包括生物学检测、电子显微镜观察、血清学检测和分子生物学检测等技术，但生物学检测、电子显微镜观察和血清学检测技术在应用中存在较多局限性和缺点，如生物学检测技术耗费时间长、受环境影响大，电子显微镜检测技术因需要昂贵的设备和专业的技术人员而不能广泛应用，血清学技术依赖于抗体的质量，检测灵敏度不高，检测结果假阴性率较高等。病毒的分子生物学检测技术主要包括RT-PCR/PCR、RT-qPCR/qPCR、RT-LAMP/LAMP、高通量RNA-seq、核酸杂交和基因芯片等，其具有非常高的特异性和灵敏度，是目前病毒检测的常用方法。尤其是PCR因能快速简单、特异灵敏和高效准确地检测动植物中的病毒而被广泛应用于已知病毒的分子检测，并为动植物病毒病的防控提供技术和试剂支持。

近年来，利用高通量RNA-seq测序技术结合生物信息学技术鉴定到越来越多的未知新病毒。假龙头花(Physostegia virginiana)又名随意草、芝麻花，是唇形科、假龙头花属多年生宿根草本植物。其花色鲜艳、抗逆性强，是园林中应用广泛的优良宿根花卉。假龙头花的园艺栽培主要是通过分株和扦插繁殖，这种无性繁殖方式极易感染和积累多种病毒，造成其花卉品质大大降低。专利申请人利用高通量RNA-seq测序技术结合生物信息学、PCR、核酸测序和序列blast比对，从叶片皱缩、卷曲的假龙头花植物中鉴定一个新的DNA病毒，该病毒属于花椰菜花叶病毒科花椰菜花叶病毒属，暂时命名为花椰菜花叶病毒属新病毒1。经过全长扩增与测序，该新病毒基因组是一条非共价闭合环状dsDNA，全长7765bp，序列如SEQ ID NO.7所示。利用ORF Finder software预测病毒基因组的开放阅读框(ORF)，结合CDD软件预测蛋白保守域，预测发现该基因组编码6个蛋白，ORF1编码一个大小为36.6kDa的移动蛋白，ORF2编码一个大小为19.8kDa的蚜虫传播因子，ORF3编码一个大小为8.9kDa的DNA结合蛋白，ORF4编码一个大小为56.6kDa的外壳蛋白，ORF5编码一个大小为77.1kDa的DNA聚合酶，ORF6编码一个大小为59.0kDa的内含体蛋白。

侵染假龙头花植物的花椰菜花叶病毒属新病毒1是专利申请人鉴定到的一种感染假龙头花植物的一种新DNA病毒，该病毒可能影响假龙头花植物的生长，目前还未有检测方法和检测引物的报道。本发明根据该病毒的外壳蛋白基因(CP)和移动蛋白(MP)基因的核苷酸序列分别设计了2对用以检测该病毒的特异性引物对，并利用设计的特异性引物对建立检测花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR方法。经过blastn比对，2对引物分别所扩的目的片段都是花椰菜花叶病毒属新病毒1的特异性片段，与NCBI数据库中植物基因没有相似性。本发明的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及PCR检测方法为植物中该病毒的检测提供一种快速、灵敏、特异、准确、高效、成本低的分子检测方法，从而为该病毒的诊断和防控提供检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，解决的技术问题在于提供一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组及PCR检测方法。

本发明具体采用的技术方案如下：

一种用于侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1检测的引物组，所述引物组包括用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因和移动蛋白基因的2对引物对中至少一对；所述用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段的正向引物CP-F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物CP-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因片段的正向引物MP-F的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物MP-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述的用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段的引物对能扩增出506bp的衣壳蛋白基因片段，序列如SEQ ID NO.5所示。

作为优选，所述的用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因片段的引物对能扩增出517bp的MP基因片段，序列如SEQ ID NO.6所示。

作为优选，所述花椰菜花叶病毒属新病毒1的基因组是一条非共价闭合环状dsDNA，全长7765bp，序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR检测方法，首先根据花椰菜花叶病毒属新病毒1的外壳蛋白基因和移动蛋白基因的核苷酸序列设计合成如权利要求1～4任一所述的引物组，然后利用外壳蛋白或移动基因片段引物对对植物中的花椰菜花叶病毒属新病毒1病毒基因组序列进行PCR扩增，最后将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，明确植物样品中是否存在所述花椰菜花叶病毒属新病毒1。

作为优选，所述PCR检测方法的反应体系、反应参数和反应程序如下：

步骤(1)：按照子步骤1.1)～1.8)，利用试剂盒提取植物DNA：

1.1)取约100mg新鲜植物组织，加入液氮充分研磨成样品粉末，将样品粉末转移至1.5ml离心管中；

1.2)向1.1)中得到的样品粉末中立即加入400μl裂解液和4μl 10mg/ml的RNaseA，涡旋振荡，充分混匀帮助裂解；

1.3)去除蛋白杂质：向1.2)得到的样品中加入130μl Buffer A2，冰上5min，14000rpm离心5-10min，取上清；

1.4)调节上柱环境：向1.3)得到的上清中加入1.5倍上清体积的Buffer A3，立即吹打混匀；

1.5)基因组吸附：将1.4)得到的混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，去除液体部分；

1.6)去除盐离子残留：向1.5)处理后的吸附柱中加600μl洗脱液，12000rpm离心30s，然后去除液体部分后，重复一次洗脱和离心过程，再次去除液体部分后得到空柱；

1.7)去除乙醇残留：对1.6)得到的空柱于12000rpm离心2min；

1.8)基因组洗脱：向1.7)得到的空柱中加入50-100μl预热的Elution Buffer，室温放置2min,12000rpm离心1min对DNA进行洗脱，得到的DNA溶液通过紫外分光光度仪测定浓度后放-20℃冰箱备用；

步骤(2)：按照子步骤2.1)～2.3)，执行以下PCR反应体系、参数以及反应程序：

2.1)利用试剂盒进行PCR反应：于冰上PCR管中配制如下PCR反应体系：12.5μl 2×TB Green Premix Ex Taq II、2μl上述提取的植物DNA、8.5μl灭菌去离子水、10μM的正向引物CP-F和反向引物CP-R各1μl或10μM的正向引物MP-F和反向引物MP-R各1μl，反应体系总体积为25μl；

2.2)设置PCR反应参数和程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，25-35个循环；72℃延伸10min；4℃5min终止反应；

2.3)在PCR仪上进行上述PCR程序；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分析是否有特异性的花椰菜花叶病毒属新病毒1的506bp的衣壳蛋白基因片段条带或517bp的移动蛋白基因片段条带，存在衣壳蛋白基因片段条带或移动蛋白基因片段条带，则说明检测的植物组织感染了花椰菜花叶病毒属新病毒1。

作为优选，所述提取植物DNA所用的试剂盒为Vazyme公司的

Plant DNAIsolation Mini Kit试剂盒。

作为优选，所述进行PCR反应所用的试剂盒为TaKaRa公司的TB Green Premix ExTaq II试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)本发明首次提供侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测技术，技术创新强；2)应用本发明的检测引物对进行PCR反应可以对大田植物或扦插苗中的该花椰菜花叶病毒属新病毒1进行快速简单、灵敏特异、准确高效、成本低检测诊断，优势明显；3)本发明所用的仪器主要是便宜的普通核酸扩增仪(PCR仪)，而不用qPCR方法的昂贵实时定量荧光PCR仪，因此可以节省检测成本。

附图说明

图1PCR方法检测植物中花椰菜花叶病毒属新病毒1的结果。跑道M是DNA分子量标准；跑道1和2分别是利用衣壳蛋白基因片段引物对的PCR方法检测感染花椰菜花叶病毒属新病毒1植物和未感染植物的结果；跑道3和4分别是利用移动蛋白基因片段引物对的PCR方法检测感染花椰菜花叶病毒属新病毒1植物和未感染植物的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述和说明。

本发明中提供了一种用于侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1检测的引物组，该花椰菜花叶病毒属新病毒1的基因组是一条非共价闭合环状dsDNA，全长7765bp，序列如SEQ ID NO.7所示。检测该病毒的引物组包括用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段和移动蛋白基因片段的2对引物中的至少一对。

其中，上述用于扩增侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段的引物对中，正向引物CP-F的序列为5’-TAAGAATGACACTTTGTGATATCTGTG-3’，如SEQ IDNO.1所示，反向引物CP-R的序列为5’-TTCTTCGCTGCAAATCCAACATCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示。上述用于扩增侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因片段的引物对中，正向引物MP-F的序列为5’-GCTTAACTCAGGATTAGTACAATCTAT-3’，如SEQ ID NO.3所示，反向引物MP-R的序列为5’-GTGATGACTATTGCTTAAGGCAT-3’，如SEQ ID NO.4所示。

在实际检测过程中，上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，以及SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对，可以择一使用。

上述用于扩增侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因的引物对可以扩增出506bp衣壳蛋白基因片段，如SEQ ID NO.5所示。上述用于扩增侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因的引物对可以扩增出517bp的移动蛋白基因片段，如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR检测方法，该方法的具体实现方式为：首先根据该花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因或移动蛋白基因的核苷酸序列设计合成前述花椰菜花叶病毒属新病毒1检测所需的引物对，然后利用衣壳蛋白或移动蛋白基因片段引物对对植物中的该花椰菜花叶病毒属新病毒1进行PCR反应，最后将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，明确检测植物样品中花椰菜花叶病毒属新病毒1的有无。

本发明中上述侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR检测方法所用的反应体系、反应参数和反应程序如下:

步骤(1)：按照子步骤1.1)～1.8)，利用Vazyme公司的

Plant DNAIsolation Mini Kit试剂盒提取植物DNA：

1.1)取约100mg新鲜植物组织，加入液氮充分研磨成样品粉末，将样品粉末转移至1.5ml离心管中；

1.2)向1.1)中得到的样品粉末中立即加入400μl裂解液和4μl 10mg/ml的RNaseA，涡旋振荡，充分混匀帮助裂解；

1.3)去除蛋白杂质：向1.2)得到的样品中加入130μl Buffer A2，冰上5min后，14000rpm离心5-10min，取上清；

1.4)调节上柱环境：向1.3)得到的上清中加入1.5倍上清体积的Buffer A3，立即吹打混匀；

1.5)基因组吸附：将1.4)得到的混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，去除液体部分；

1.6)去除盐离子残留：向1.5)处理后的吸附柱中加600μl洗脱液，12000rpm离心30s，然后去除液体部分后，重复一次洗脱和离心过程，再次去除液体部分后得到空柱；

1.7)去除乙醇残留：对1.6)得到的空柱于12000rpm离心2min；

1.8)基因组洗脱：向1.7)得到的空柱中加入50-100μl预热的Elution Buffer，室温放置2min,12000rpm离心1min对DNA进行洗脱，得到的DNA溶液通过紫外分光光度仪测定浓度后放-20℃冰箱备用；

步骤(2)：按照子步骤2.1)～2.3)，执行以下PCR反应体系、参数以及反应程序：

2.1)利用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行PCR反应：于冰上PCR管中配制如下PCR反应体系：12.5μl 2×TB Green Premix Ex Taq II、2μl上述提取的植物DNA、8.5μl灭菌去离子水、10μM的正向引物CP-F和反向引物CP-R各1μl或10μM的正向引物MP-F和反向引物MP-R各1μl，反应体系总体积为25μl；

2.2)设置PCR反应参数和程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，25-35个循环；72℃延伸10min；4℃5min终止反应；

2.3)在PCR仪上进行上述PCR程序；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分析是否有特异性的花椰菜花叶病毒属新病毒1的506bp的衣壳蛋白基因片段条带或517bp的移动蛋白基因片段条带，存在衣壳蛋白基因片段条带或移动蛋白基因片段条带，则说明检测的植物组织感染了花椰菜花叶病毒属新病毒1。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但下述实施例并不限制本发明的范围。

实施例1、侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1检测引物组的设计和合成：

根据如SEQ ID NO.7所示的花椰菜花叶病毒属新病毒1的基因组序列，利用NCBI网站中的Conserved Domain Database(CDD)寻找花椰菜花叶病毒属新病毒1的外壳蛋白基因和移动蛋白基因的保守核苷酸序列，利用Snapgene软件设计合成相应引物，最终获得2对检测引物对组，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。具体的，将依据侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白(CP)基因序列设计的一对正反向引物分别命名为CP-F和CP-R。依据侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白(MP)基因序列设计的一对正反向引物分别命名为MP-F和MP-R。上述引物均由北京擎科生物科技有限公司等生物公司合成。

实施例2、侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR检测方法

基于实施例1合成的引物，该PCR检测方法包括植物DNA提取和PCR反应两个步骤，分别如下

步骤(1)、按照子步骤1.1)～1.8)，利用Vazyme公司的

Plant DNAIsolation Mini Kit试剂盒提取植物DNA，做法如下：

1.1)取约100mg新鲜植物组织，加入液氮充分研磨成样品粉末，将样品粉末转移至1.5ml离心管中。

1.2)向1.1)中研磨好的样品粉末中立即加入400μl裂解液和4μl RNase A(10mg/ml)，涡旋振荡，充分混匀帮助裂解。

1.3)去除蛋白等杂质：向1.2)得到的样品中加入130μl Buffer A2，冰上5min，14000rpm离心5-10min，取上清。

1.4)调节上柱环境：向1.3)得到的上清中加入1.5倍上清体积的Buffer A3，立即吹打混匀。

1.5)基因组吸附：将1.4)得到的混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s。

1.6)去除盐离子残留：向1.5)处理后的吸附柱中加600μl洗脱液，12000rpm离心30s，然后去除液体部分后，重复一次本步骤中的洗脱和离心过程，再次去除液体部分后得到含有DNA的空柱。

1.7)去除乙醇残留：对1.6)得到的空柱于12000rpm离心2min。

1.8)基因组洗脱：向1.7)得到的空柱中加入50-100μl预热的Elution Buffer，室温2min,12000rpm离心1min对DNA进行洗脱，得到的DNA溶液通过紫外分光光度仪测定浓度后放-20℃冰箱备用。

步骤(2)、按照子步骤2.1)～2.3)，执行以下PCR反应体系、参数以及反应程序：

2.1)利用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行PCR反应：于冰上PCR管中配制如下PCR反应体系：12.5μl 2×TB Green Premix Ex Taq II、2μl上述DNA、8.5μl灭菌去离子水、10μM的正向引物CP-F和10μM的反向引物CP-R各1μl(或10μM的正向引物MP-F和10μM的反向引物MP-R各1μl)，反应体系总体积为25μl；

2.2)设置PCR反应参数和程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，25-35个循环；72℃延伸10min；4℃5min终止反应；

2.3)在PCR仪上进行上述PCR程序；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分析是否有特异性的花椰菜花叶病毒属新病毒1的506bp的衣壳蛋白基因片段条带或517bp的移动蛋白基因片段条带。如果用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因的引物对扩增出506bp的特异性衣壳蛋白基因片段，说明检测植物样品感染该花椰菜花叶病毒属新病毒1病毒；如果用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因的引物对扩增出517bp的特异性移动蛋白基因片段，说明检测植物样品感染该花椰菜花叶病毒属新病毒1；如果没有上述特异性扩增产物，则检测样品没有感染该花椰菜花叶病毒属新病毒1。本实施例中的检测结果参见图1，其中跑道M是DNA分子量标准；跑道1和2分别是利用衣壳蛋白基因片段引物对的PCR方法检测感染花椰菜花叶病毒属新病毒1植物和未感染植物的结果；跑道3和4分别是利用移动蛋白基因片段引物对的PCR方法检测感染花椰菜花叶病毒属新病毒1植物和未感染植物的结果。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组，其特征在于：所述引物组包括用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因和移动蛋白基因的引物对中至少一对；所述用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段的正向引物CP-F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物CP-R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因片段的正向引物MP-F的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物MP-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1中所述的一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组，其特征在于：所述的用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的衣壳蛋白基因片段的引物对能扩增出506bp的衣壳蛋白基因片段，序列如SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1中所述的一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组，其特征在于：所述的用于扩增花椰菜花叶病毒属新病毒1的移动蛋白基因片段的引物对能扩增出517bp的MP基因片段，序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求1所述的侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的检测引物组，其特征在于：所述花椰菜花叶病毒属新病毒1的基因组是一条非共价闭合环状dsDNA，全长7765bp，序列如SEQ ID NO.7所示。

5.一种侵染假龙头花的花椰菜花叶病毒属新病毒1的PCR检测方法，其特征在于：根据花椰菜花叶病毒属新病毒1的外壳蛋白基因和移动蛋白基因的核苷酸序列设计合成如权利要求1～4任一所述的引物组，然后利用外壳蛋白或移动基因片段引物对对植物中的花椰菜花叶病毒属新病毒1病毒基因组序列进行PCR扩增，最后将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，明确植物样品中是否存在所述花椰菜花叶病毒属新病毒1。

6.如权利要求5所述的PCR检测方法，其特征在于：所述PCR检测方法的反应体系、反应参数和反应程序如下：

步骤(1)：按照子步骤1.1)～1.8)，利用试剂盒提取植物DNA：

1.1)取约100mg新鲜植物组织，加入液氮充分研磨成样品粉末，将样品粉末转移至1.5ml离心管中；

1.2)向1.1)中得到的样品粉末中立即加入400μl裂解液和4μl 10mg/ml的RNase A，涡旋振荡，充分混匀帮助裂解；

1.3)去除蛋白杂质：向1.2)得到的样品中加入130μl Buffer A2，冰上5min，14000rpm离心5-10min，取上清；

1.4)调节上柱环境：向1.3)得到的上清中加入1.5倍上清体积的Buffer A3，立即吹打混匀；

1.5)基因组吸附：将1.4)得到的混合液转移至吸附柱中，12000rpm离心30-60s，去除液体部分；

1.6)去除盐离子残留：向1.5)处理后的吸附柱中加600μl洗脱液，12000rpm离心30s，然后去除液体部分后，重复一次洗脱和离心过程，再次去除液体部分后得到空柱；

1.7)去除乙醇残留：对1.6)得到的空柱于12000rpm离心2min；

1.8)基因组洗脱：向1.7)得到的空柱中加入50-100μl预热的Elution Buffer，室温放置2min,12000rpm离心1min对DNA进行洗脱，得到的DNA溶液通过紫外分光光度仪测定浓度后放-20℃冰箱备用；

步骤(2)：按照子步骤2.1)～2.3)，执行以下PCR反应体系、参数以及反应程序：

2.1)利用试剂盒进行PCR反应：于冰上PCR管中配制如下PCR反应体系：12.5μl 2×TBGreen Premix Ex Taq II、2μl上述提取的植物DNA、8.5μl灭菌去离子水、10μM的正向引物CP-F和反向引物CP-R各1μl或10μM的正向引物MP-F和反向引物MP-R各1μl，反应体系总体积为25μl；

2.2)设置PCR反应参数和程序如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，25-35个循环；72℃延伸10min；4℃ 5min终止反应；

2.3)在PCR仪上进行上述PCR程序；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分析是否有特异性的花椰菜花叶病毒属新病毒1的506bp的衣壳蛋白基因片段条带或517bp的移动蛋白基因片段条带，存在衣壳蛋白基因片段条带或移动蛋白基因片段条带，则说明检测的植物组织感染了花椰菜花叶病毒属新病毒1。

7.如权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：所述提取植物DNA所用的试剂盒为Vazyme公司的

Plant DNA Isolation Mini Kit试剂盒。

8.如权利要求6所述的PCR检测方法，其特征在于：所述进行PCR反应所用的试剂盒为TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒。

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