CN113025750A - 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明通过对夜来香花叶病毒(TeMV)、东亚百香果病毒(EAPV)和烟草花叶病毒(TMV)的引物浓度、退火温度和PCR扩增条件等的优化，提供了一种同时检测百香果三种病原的引物组、试剂盒及方法。本发明实现了对田间复合侵染的百香果样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性强，并缩短了检测时间，有利于研究田间三种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。

Description

一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于农作物病害诊断和分子生物学技术领域，具体涉及一种同时检测百香果三种 病毒的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
百香果(Passiflora edulis)又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，属于西番莲科(Passifloracea) 西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生热带和亚热带水果，因其水果香味而得名。百香果 集食用、药用和观赏价值于一身，具有重要的经济意义。近年来，百香果已成为我国南方的 一种重要水果，种植面积在不断扩大。由于百香果为无性繁殖，加上连年种植，各种植区之 间苗木销售活动频繁，导致病毒病害迅速蔓延，严重影响了百香果的产量和品质。百香果病 毒病害也是巴西、澳大利亚、秘鲁及我国台湾、福建、广西、广东、云南、贵州等地区百香 果生产的制约因子。
目前，已报道能侵染百香果的病毒有20多种。其中，夜来香花叶病毒(Telosmamosaic virus，TeMV)和东亚百香果病毒(East Asian Passiflora virus，EAPV)分别于2017年首次在 福建省部分地区的百香果上检测到，烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)于2020年 首次在广西地区的百香果上检测到。这三种病毒均是近年来在国内首次发现，TeMV和EAPV 随后在其他省份的百香果上也有发现，而TMV尚未在其他地区检测到。百香果病毒病典型 为害症状为花叶、皱缩和斑驳等。在种植园内，百香果通常不止感染一种病毒，常以两种或 两种以上病毒混合侵染，对百香果的品质和产量带来巨大的威胁。特别是近年来福建、广西、 广东、海南、四川、云南、贵州等地大规模引种栽培百香果时，只注意到常见的几种病毒， 而忽视了对这三种病毒的检测及防控工作，致使病毒病再次成为威胁产业发展的技术障碍。
目前，国内多为对百香果黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、TeMV和EAPV 的一种或两种检测方法，尚未发现同时检测TeMV、EAPV和TMV的报道。因此，亟需提供一种检测这三种病毒的多重PCR方法，实现对这三种病毒的同时检测。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种同时检测百香果中夜来香花叶病毒 (Telosma mosaic virus，TeMV)、东亚百香果病毒(East Asian Passifloravirus，EAPV)和烟 草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)三种病毒的引物组、试剂盒及方法，该方法一次PCR反应，能同时检测百香果中TeMV、EAPV和TMV三种RNA病毒，具有成本低、特异 性强的特点，能够准确、高效、灵敏的同时检测多种百香果病毒病样品。
本发明的第一个目的是提供一种同时检测百香果三种病毒的引物组，其包括以下3对引 物：
扩增TeMV的特异性引物：
TeMV-F：：5’-AGTTGGGAGGACACAAGCCAG-3’(SEQ ID NO.1)，
TeMV-R：5’-CAACCTCACTGTGTTCAAGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增EAPV的特异性引物：
EAPV-F：5’-ACAAAGAGAAAGAAGCCGACA-3’(SEQ ID NO.3)，
EAPV-R：5’-GGACTTTATCAAGCGCACCT-3’(SEQ ID NO.4)；
扩增TMV的特异性引物：
TMV-F：5’-GATTCGGAGACTACTGTCGCC-3’(SEQ ID NO.5)，
TMV-R：5’-CCACGTGTGATTACGGACAC-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明的第二个目的是提供一种同时检测百香果三种病毒的RT-PCR试剂盒，其包括所 述的同时检测百香果三种病毒的引物组。
优选，所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于，每个反应体系包括：2×1step buffer10.0μl， 权利要求1所述的引物TeMV-F和TeMV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物 EAPV-F和EAPV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物TMV-F和TMV-R的终浓 度0.5μmol/L，5U/μL的PrimeScript 1step Enzyme Mix 2.5U，RNA模板1.0μL，体系共20μL，余量为水。
本发明的第三个目的是提供一种同时检测百香果三种病毒的方法，其包括以下步骤：
a.提取待检测百香果样品总RNA；
b.以步骤a提取的总RNA为模板，以所述的同时检测百香果三种病毒的引物组为引物， 一步法RT-PCR扩增，得到PCR产物；
c.将PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带大小判断待检测样品中含有病毒的情况。
优选，所述的步骤b的一步法RT-PCR扩增，每个反应体系包括：2×1step buffer10.0μl， 权利要求1所述的引物TeMV-F和TeMV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物 EAPV-F和EAPV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物TMV-F和TMV-R的终浓 度0.5μmol/L，5U/μL的PrimeScript 1step Enzyme Mix 2.5U，RNA模板1.0μL，体系共20μL，余量为水。
所述的一步法RT-PCR扩增是采用TaKaRa公司的One Step RT-PCR Kit，参照说明书的 方法进行的。
优选，所述的步骤b的一步法RT-PCR扩增，其反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min， 降温至10℃结束反应。
优选，所述的步骤c中，判断待检测样品中含有病毒的情况的具体依据是：如扩增到834 bp大小条带，判断样品中含有夜来香花叶病毒(TeMV)；如扩增到201bp大小条带，判断样 品中含有东亚百香果病毒(EAPV)；如扩增到572bp大小条带，判断样品中含有烟草花叶病 毒(TMV)。
相比于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次提出在百香果上同步检测TeMV、EAPV和TMV三种病毒；
(2)本发明设计的检测引物对具有特异性和兼容性，可以扩增同一样品中的三种病毒；
(3)本发明优化了PCR扩增的反应体系和条件，在保证检测结果可靠的前提下，极大 地缩短了检测时间，提高了检测效率；本发明反应体系灵敏性好；
(4)本发明的检测是在同一个PCR体系中经过一次扩增反应完成，节约了病毒RNA和 PCR扩增体系种的各种试剂，最大程度的降低了检测成本，也节约了人力。
本发明实现了对田间复合侵染的百香果样品的快速检测，检测结果可靠、准确、特异性 强，并缩短了检测时间，有利于研究田间三种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指 导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。
附图说明
图1为不同退火温度对单重PCR检测结果的影响；其中，M为Marker；1-8分别对应从低到高的退火温度52℃，52.7℃，53.9℃，55.8℃，58.1℃，60℃，61.2℃，62.0℃；9为阴性对照；A为TeMV；B为EAPV；C为TMV。
图2为质粒模板不同稀释倍数对单重PCR检测结果的影响；其中，M为Marker；1-12分别对应从低到高的稀释倍数100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,1010,1011；13为阴性 对照；A为TeMV；B为EAPV；C为TMV。
图3为不同引物浓度对多重PCR检测结果的影响；其中，M为Marker；1-10分别对应表1中的引物浓度组合；11为阴性对照。
图4为质粒模板不同稀释倍数对多重PCR检测结果的影响；其中，M为Marker；1-12分别对应复合模板从低到高的稀释倍数100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,1010,1011；13为阴性对照。
图5为多重PCR特异性和稳定性试验；其中，M为Marker；1-3分别为单一病毒模板，4-6分别为两种病毒随机组合的复合模板，7为三种病毒随机组合的复合模板，8为阴性对照。
图6为随机采取的田间样品进行多重PCR检测及单重PCR验证；其中，M为Marker；1-14为采集的14个百香果感病样品，15为阳性对照，16为阴性对照。A为多重PCR检测， B-D分别为TeMV、EAPV和TMV单重PCR验证。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1.百香果叶组织总RNA的提取
剪取病害症状明显的百香果叶片0.1g，液氮研磨后加入1mL Trizol和400μL的氯仿： 异戊醇(24:1)后转入2.0mL离心管涡旋混匀；4℃下12000rpm离心15min，取上清液于新的 1.5mL离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于-20℃下20min；然后4℃下12000rpm离心10min，弃上清；加入75％的预冷的乙醇(DEPC处理)，4℃下7500rpm离心5min，室温晾干沉淀后加入50μL无核糖核酸酶的水溶解；取1μL RNA溶液，用 NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值，合格的样品置于-80℃冰箱 保存备用或继续下游实验。同时以健康百香果叶片总RNA为阴性对照，提取方法同上。
实施例2.三种百香果病毒的特异性引物设计
根据NCBI公布的TeMV、EAPV和TMV三种病毒的核苷酸序列，然后对下载的序列进行同源比对，以TeMV 6K2-VPg、EAPV P1和TMV MP为模板，采用Vector NTI软件分别设 计每种病毒的特异性引物对，利用BLAST在线软件检测特异引物，每对引物退火温度相似， 具有一定的保守性，扩增产物不形成二级机构，GC含量在40％-60％之间，三种引物之间碱 基不互补，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计并优化后的三种病毒的引 物具体如下：
扩增TeMV的特异性引物的核苷酸序列为：
TeMV-F：：5’-AGTTGGGAGGACACAAGCCAG-3’(SEQ ID NO.1)，
TeMV-R：5’-CAACCTCACTGTGTTCAAGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增EAPV的特异性引物的核苷酸序列为：
EAPV-F：5’-ACAAAGAGAAAGAAGCCGACA-3’(SEQ ID NO.3)，
EAPV-R：5’-GGACTTTATCAAGCGCACCT-3’(SEQ ID NO.4)；
扩增TMV的特异性引物的核苷酸序列为：
TMV-F：5’-GATTCGGAGACTACTGTCGCC-3’(SEQ ID NO.5)，
TMV-R：5’-CCACGTGTGATTACGGACAC-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例3.三种百香果病毒的RT-PCR体系
按照One Step RT-PCR Kit(TaKaRa公司)说明书，PCR反应体系为：2×1stepbuffer 10.0 μl，TeMV、EAPV和TMV上下游引物的终浓度为0.5μmol/L，PrimeScript 1stepEnzyme Mix (5U/μL)2.5U，退火温度为58℃，(实施例1方法制备得到的)RNA模板为1.0μL，最后补 水至20μL。
PCR反应参数为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃30s，58℃30s， 72℃1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。
PCR产物电泳检测：取6μL PCR产物与1μL 6×上样缓冲液相混合，室温下进行1.2％ 琼脂糖凝胶(已加入Goldview核酸染料)电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结 束后于凝胶成像系统观察电泳结果。
实施例4.单重PCR反应体系
PCR产物克隆：按实施例3中的RT-PCR体系分别扩增三个病毒的相应片段，把目的片 段通过TA克隆到pMD19质粒上，转化到大肠杆菌中，抽提重组质粒，得到各重组质粒pMD19-TeMV-834(6K2-VPg)，pMD19-EAPV-201(P1)，pMD19-TMV-572(MP)，质粒浓度分 别为70.7ng/μL，47.4ng/μL，50.8ng/μL，换算为拷贝数(copies)，分别为1.83×1010copies，1.49×1010copies，1.42×1010copies。
以克隆的重组质粒为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM10μL、上下游引物终浓度0.50μmol/L，质粒DNA模板1μL，ddH2O补足20μL。PCR反应参 数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52～62℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环； 最后72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。
其他条件不变，筛选退火温度，设置8个处理：52℃，52.7℃，53.9℃，55.8℃，58.1℃， 60℃，61.2℃，62.0℃。
PCR产物电泳检测：取6μL PCR产物与1μL 6×上样缓冲液相混合，室温下进行1.2％ 琼脂糖凝胶(已加入Goldview核酸染料)电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结 束后于凝胶成像系统观察电泳结果。
电泳结果见图1。电泳结果分析：分别得到TeMV、EAPV和TMV的扩增条带，依次约 为834bp、201bp和572bp，其大小与理论值相符。以上所有退火温度均可得到单一明亮条 带，后续实验验证挑选退火温度56℃。
其他条件不变，筛选反应体系的灵敏度，将TA克隆质粒模板依次10倍梯度稀释，设置 12个处理：100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,1010,1011。TeMV和TEV最低在稀释107倍时能检测出，而EAPV最低在稀释106倍时还能检出。即TeMV、EAPV和TMV单重 PCR灵敏度检测，最低能检测到的copies分别为1.83×103、1.49×104和1.42×103。电泳结 果见图2。
实施例5.三种病毒的多重PCR体系的建立
在单重PCR的基础上，对引物浓度进行优化，建立同时检测三种病毒的多重PCR体系。 挑选稀释倍数103的质粒模板进行三种病毒混合质粒多重PCR验证。其他条件不变，设置10 个组合，组合情况见表1。通过比较电泳条带明亮程度，引物组合4为最适引物配比浓度。 即TeMV、EAPV和TMV引物终浓度分别为0.25μmol/L、0.25μmol/L和0.50μmol/L。电泳 结果见图3。
表1 TeMV、EAPV和TMV三种病毒的多重PCR检测体系中的引物浓度组合(μmol/L)
Figure BDA0002945804590000061
实施例6.多重PCR体系的灵敏度测定
将实施例4中的三种病毒重组质粒模板等体积混合在一起作为复合模板，其他条件不变， 筛选多重PCR反应体系的灵敏度，测其含量后作10倍梯度稀释，设置12个处理：100,101,102, 103,104,105,106,107,108,109,1010,1011。结果同实施例4中单重PCR体系的灵敏度一致，进 行多重PCR扩增以检测其敏感性，电泳结果见图4。复合模板在稀释107倍时能检测出TeMV 和TMV，在稀释106倍时能检测出三种病毒。即TeMV、EAPV和TMV多重PCR灵敏度检 测，最低稀释的倍数为106。
实施例7.多重PCR体系的特异性和稳定性
根据上述优化结果，多重PCR最佳反应体系为：Premix Ex TaqTM 10μL、TeMV、EAPV和TMV引物终浓度分别为0.25μmol/L、0.25μmol/L和0.50μmol/L，质粒DNA模板1μL， ddH2O补足20μL。PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃ 延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。
具体地，取多份TeMV、EAPV和TMV三种病毒的重组质粒模板，按照单一病毒模板(3种)、两种病毒随机组合的复合模板(3种)以及三种病毒随机组合的复合模板(1种)的方 式配制成7种(2个重复)不同的检测样品，健康百香果作为阴性对照，采用上述优化的条 件，对其进行检测并重复实验。结果显示本发明的多重PCR体系特异性强、稳定性好。电泳 结果见图5。
实施例8.多重PCR体系的应用
应用建立的多重PCR体系对采集自广西、广东和福建等地区的14个百香果感病样品进 行了检测。
具体步骤如下：
(1)提取各百香果感病样品总RNA；
(2)以步骤(1)提取的总RNA为模板，以所述的同时检测百香果三种病毒的引物组为 引物，一步法RT-PCR扩增，得到PCR产物；其中每个反应体系包括：2×1step buffer10.0μl， 所述的引物TeMV-F和TeMV-R的终浓度0.25μmol/L、所述的引物EAPV-F和EAPV-R的终 浓度0.25μmol/L、所述的引物TMV-F和TMV-R的终浓度0.5μmol/L，PrimeScript 1stepEnzyme Mix(5U/μL)2.5U，RNA模板为1.0μL，最后补水至20μL。反应程序为：50℃反转 录30min，94℃预变性2min；然后94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后 在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。
(3)将PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带大小判断待检测样品中含有病毒的情况。 具体依据是：如扩增到834bp大小条带，判断样品中含有夜来香花叶病毒(TeMV)；如扩增 到201bp大小条带，判断样品中含有东亚百香果病毒(EAPV)；如扩增到572bp大小条带，判断样品中含有烟草花叶病毒(TMV)。
图6结果显示：样品1和10仅检测出EAPV，样品5、6、8仅检测出TeMV，样品11 和14仅检测出TMV，样品9检测出EAPV和TMV两种病毒，样品2、3、4、7、12和13 检测出TeMV和EAPV两种病毒。同时对这14个样品进行了单重PCR检测，多重检测结果 与单重检测检测结果一致。对多重PCR产物进行单克隆测序，结果与参考序列的一致性均在 99％以上，说明本发明建立的多重RT-PCR检测体系可用于田间样品的检测，且结果可靠。
利用本发明的方法可以大量检测百香果样品，建立了能够从百香果样品中同时检测 TeMV、EAPV和TMV三种病毒复合侵染的多重PCR检测方法，本发明的同时检测百香果三种病毒的多重PCR检测方法能有效的检测百香果3种病毒，快速准确，稳定性好，特异性强，避免了PCR的重复检测，减少了工作量，实现了百香果多种病毒的高效快速检测，有利于研究田间3种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围 的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可 以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广东省科学院生物工程研究所
<120> 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttgggagg acacaagcca g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacctcact gtgttcaaga c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaaagagaa agaagccgac a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggactttatc aagcgcacct 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattcggaga ctactgtcgc c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccacgtgtga ttacggacac 20

Claims (7)

1.一种同时检测百香果三种病毒的引物组，其特征在于，包括以下3对引物：
扩增TeMV的特异性引物：
TeMV-F：：5’-AGTTGGGAGGACACAAGCCAG-3’，
TeMV-R：5’-CAACCTCACTGTGTTCAAGAC-3’；
扩增EAPV的特异性引物：
EAPV-F：5’-ACAAAGAGAAAGAAGCCGACA-3’，
EAPV-R：5’-GGACTTTATCAAGCGCACCT-3’；
扩增TMV的特异性引物：
TMV-F：5’-GATTCGGAGACTACTGTCGCC-3’，
TMV-R：5’-CCACGTGTGATTACGGACAC-3’。
2.一种同时检测百香果三种病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的同时检测百香果三种病毒的引物组。
3.根据权利要求2所述的同时检测百香果三种病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，每个反应体系包括：2×1step buffer 10.0μl，权利要求1所述的引物TeMV-F和TeMV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物EAPV-F和EAPV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物TMV-F和TMV-R的终浓度0.5μmol/L，5U/μL的PrimeScript 1step Enzyme Mix 2.5U，RNA模板1.0μL，体系共20μL，余量为水。
4.一种同时检测百香果三种病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.提取待检测百香果样品总RNA；
b.以步骤a提取的总RNA为模板，以所述的同时检测百香果三种病毒的引物组为引物，一步法RT-PCR扩增，得到PCR产物；
c.将PCR产物进行电泳检测，根据电泳条带大小判断待检测样品中含有病毒的情况。
5.根据权利要求4所述的同时检测百香果三种病毒的方法，其特征在于，所述的步骤b的一步法RT-PCR扩增，每个反应体系包括：2×1step buffer 10.0μl，权利要求1所述的引物TeMV-F和TeMV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物EAPV-F和EAPV-R的终浓度0.25μmol/L、权利要求1所述的引物TMV-F和TMV-R的终浓度0.5μmol/L，5U/μL的PrimeScript 1step Enzyme Mix 2.5U，RNA模板1.0μL，体系共20μL，余量为水。
6.根据权利要求4所述的同时检测百香果三种病毒的方法，其特征在于，所述的步骤b的一步法RT-PCR扩增，其反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃30s，56℃30s，72℃1min，共35个循环；最后在72℃延伸10min，降温至10℃结束反应。
7.根据权利要求4所述的同时检测百香果三种病毒的方法，其特征在于，所述的步骤c中，判断待检测样品中含有病毒的情况的具体依据是：如扩增到834bp大小条带，判断样品中含有夜来香花叶病毒；如扩增到201bp大小条带，判断样品中含有东亚百香果病毒；如扩增到572bp大小条带，判断样品中含有烟草花叶病毒。
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