CN117265184A - 同时检测西番莲三种rna病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT‑PCR引物组，包括三对RT‑PCR检测引物，它们分别针对TeMV、EAPV、CMV三种病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。据此，还对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立了相应多重RT‑PCR检测方法，该法在一个单一反应体系中加入三种病毒的特异引物对，可实现一次PCR反应同时检测三种西番莲病毒。实验表明，该法能够快速、准确又简便和经济地从西番莲组织中同时检测这三种病毒，明确西番莲带毒情况，对尽早采取有效防治措施，控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。为方便应用本发明，还可根据本发明设计组装相应试剂盒，以便在基层普及推广。
Description
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，尤其涉及西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。
背景技术
西番莲(俗称百香果)，西番莲在栽培生产过程中，病毒病的发生日益严重，已成为影响其产量和品质的第二大病害。东亚西番莲病毒(EastAsian Passiflora virus，EAPV)、夜来香花叶病毒(telosma mosaicvirus，TeMV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)是当前危害我国西番莲的主要病毒种类。其中，EAPV、TeMV是近年来我国西番莲上新报道的2种马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒。EAPV侵染西番莲后引起叶片花叶、果实畸形和木质化等症状，能引起西番莲木质化病，造成的危害十分严重，西番莲商品价值几乎完全丧失。TeMV侵染西番莲后能引起一系列症状，包括叶片花叶、卷曲和果实斑驳、小果等，造成西番莲产量和品质大幅度下降。CMV为雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属成员，是国际上最重要的十大植物病毒之一，该病毒侵染西番莲能引起环斑、花叶、皱缩、顶部坏死和果实木质化等症状，严重影响西番莲的生产安全。EAPV、TeMV和CMV引起的西番莲病毒病，至今尚无有效的防治手段，因此建立快速检测和筛查技术，是防控三种病毒为害的关键。
与常规PCR相比，多重PCR技术拥有单个PCR的灵敏和特异性，又更加快捷、经济、增加了检测的通量，已应用于多种植物、动物病原检测中。反转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription–Polymerase chain reaction，RT-PCR)是PCR技术应用的一种，先将RNA转录成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段，广泛应用于RNA病毒的检测中。经查，目前针对西番莲中以上三种病毒还未见建立多重RT-PCR检测方法的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供快速、简便、经济且准确的西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组，包括三对RT-PCR检测引物，它们分别针对TeMV、EAPV和CMV三种病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
含有上述引物组的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
上述同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和引物组。
阳性对照为含有TeMV、EAPV和CMV三种病毒的总核酸标准品，阴性对照为无病毒西番莲总核酸，引物组为预混的包含针对TeMV、EAPV和CMV三种病毒的多重RT-PCR引物组，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
利用上述引物组的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测方法。
RT-PCR的反应体系为：20μl反应体系中，含有2×Rapid Taq Master Mix 10μl，TeMV上游引物和下游引物各1μl，EAPV上游引物和下游引物各1μl，CMV上游引物和下游引物各1.5μl，模板1μl，ddH2O 2μl；
PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
针对三种常见西番莲病毒缺乏快速有效同时检测手段的问题，发明人根据其核苷酸保守区CP(coat protein)序列设计并合成了同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组，包括三对RT-PCR检测引物，它们分别针对TeMV、EAPV和CMV三种病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。据此，发明人还对影响多重RT-PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立了相应多重RT-PCR检测方法，该检测方法在一个单一反应体系中加入三种西番莲病毒的特异性引物对，可实现一次PCR反应同时检测三种西番莲病毒。实验表明，该法能够快速、准确又简便和经济地从西番莲组织中同时检测这三种病毒，明确西番莲带毒情况，对尽早采取有效防治措施，控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。为方便应用本发明，还可根据本发明设计组装相应试剂盒，以便在基层普及推广。
附图说明
图1是单一RT-PCR和多重RT-PCR检测TeMV，EAPV和CMV的结果图，图中：M：DL2000plus DNA maker；1：TeMV；2：EAPV；3：CMV；4：TeMV+EAPV；5：EAP V+CMV；6：TeMV+CMV；7：TeMV+EAPV+CMV。
图2是三种病毒引物浓度优化结果图，图中：1-8：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0；9-16：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0；17-24：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0。数字代表检测体系中加入的引物总体积，例：0.5代表上游引物(0.25μL)+下游引物(0.25μL)＝0.5μL(10μmol/L)。
图3是多重RT-PCR退火温度的优化结果图，图中：M：DL2000 plus DNA maker；1-8：温度依次为49.0℃，50.8℃，52.4℃，53.8℃，54.9℃，56.2℃，58.0℃，60.0℃。
图4是多重RT-PCR循环次数优化结果图，图中：M：DL2000 plus DNA maker；1-6：循环数依次为15，20，25，30，35，40。
图5是多重RT-PCR的灵敏度结果图，图中：M：DL2000 plus DNA maker；1-12：拷贝数依次为1011，1010，109，108，107，106，105，104，103，102，101，100(copies/μL)；A、B、C分别为TeMV、EAPV、CMV单一RT-PCR；D为TeMV、EAPV、CMV三种病毒的多重RT-PCR。
图6是多重RT-PCR的应用结果图，图中：M：DL2000 DNA maker；1-22：田间采集的22份样品；23：阴性对照；24：阳性对照。
具体实施方式
一、材料与方法
1病叶采集
采集百香果种植区疑似病毒感染症状的幼嫩叶片，带回实验室液氮速冻后-80℃冰箱低温保存备用。
2RNA提取及反转录
在匀浆管中加入1mL的RNA提取液，置冰上预冷，取100mg叶片样品，加入到匀浆管中，冷冻研磨仪充分研磨至无可见组织块，12000rpm离心10min取上清，加入400μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min，4℃下12000rpm离心10min，将400μL上清液转移到一新的离心管中，加入550μL的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min，4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA，吸除液体，加入75％乙醇1.5mL洗涤沉淀，4℃下12000rpm离心5min，将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min，加入15μL Water Nuclease-Free溶解RNA。使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μL待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μL。
反转录体系：4μL 5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR、1μL gDNARemover、10μL Total RNA，RNase free water补足至20μL，后经在PCR仪反应程序：25℃5min，42℃30min，85℃5s完成反转录。
3引物设计
根据登录在Gen Bank上的夜来香花叶病毒(TeMV)、东亚西番莲病毒(EAPV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白基因保守序列，利用Primer Premier 6.0软件设计病毒检测引物，从中选出三种扩增产物有差异，易通过琼脂糖凝胶电泳分离的检测引物。
表1三重RT-PCR检测引物
4单一RT-PCR体系引物用量优化
应用表1各自病毒检测引物建立单一RT-PCR体系，20μL扩增体系中上下游引物(10μmol/L)用量8个浓度梯度设置：0.25μL/0.25μL；0.5μL/0.5μL；0.75μL/0.75μL；1.0μL/1.0μL；1.25μL/1.25μL；1.5μL/1.5μL；1.75μL/1.75μL；2.0μL/2.0μL。
5多重RT-PCR条件优化
应用表1三种病毒检测引物建立多重RT-PCR体系，20μL反应体系中，对退火温度(49.0℃，50.8℃，52.4℃，53.8℃，54.9℃，56.2℃，58.0℃，60.0℃)、扩增循环数(15×，20×，25×，30×，35×，40×)等因素进行优化实验，单一因素优化时，其他因素保持不变。
6多重RT-PCR产物的克隆与序列测定
扩增出的产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收片段，连接到pCE3平末端载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆PCR验证成功后，提取质粒送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行序列分析。测序结果在NCBI网站利用Blast进行序列比对。
7灵敏度检测
用公式计算拷贝数：拷贝数＝(质粒浓度ng/μL×6.02×1023copies/mol)/(重组质粒碱基数×660g/mol×109)，载体长度为1798bp，插入的片段长度分别为：TeMV(496bp)，EAPV(280bp)，CMV(157bp)。根据公式将含三种质粒混合液依次稀释成1.0×1011、1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100(copies/μL)，以ddH2O为空白对照，分别以单重和三重RT-PCR检测，比较灵敏度。
8三重RT-PCR应用分析
从南宁市田间采集22个有明显病毒症状的西番莲叶片样品，应用本发明多重RT-PCR检测后与单一RT-PCR检测结果比对，测试其准确率。
二、结果与分析
1单一RT-PCR检测
以含三种病毒的cDNA为模板，由设计的三对引物分别检测，经PCR扩增琼脂糖凝胶电泳后得到大小为496bp、280bp、157bp的三条条带(见图1)，跟预期大小相符合，条带单一，无杂带，产物大小易于区分，适用于后续三重RT-PCR体系的构建。
2双重和三重RT-PCR
以含有两种或三种病毒的混合cDNA为模板，将三种病毒进行两两组合和三重组合。结果证明任意两个引物对都能扩增出大小相符的条带，任意非配对引物未扩增出杂带，即不产生非特异性扩增(见图1)。
3多重RT-PCR产物的克隆及测序
分别对三重RT-PCR扩增得到的三条特异性条带进行克隆及测序。序列结果表明，片段大小分别是TeMV(496bp)、EAPV(280bp)、CMV(157bp)，符合预期。序列分别与登录在GenBank上的江西赣州西番莲上的分离物TeMV YD(ON932196)核苷酸一致性达100％，与台湾西番莲上的分离物EAPV-IB-dpd(KT724930)核苷酸一致性达98.21％，与湖南辣椒上的分离物CMV-H1(KP744988.1)核苷酸一致性达100％。说明三重RT-PCR扩增出的特异性片段确实来自于这三种病毒。
4单一RT-PCR体系对三种病毒引物浓度优化
如图2所示，根据单一RT-PCR引物用量优化结果表明，TeMV上下游引物用量(10μmol/L)各1μL，EAPV上下游引物用量(10μmol/L)各1μL，CMV上下游引物用量(10μmol/L)各1.5μL，条带亮度接近，扩增效率较高，因此选择引物最佳用量组合为：上下游引物分别为TeMV(10μmol/L)各1μL，EAPV(10μmol/L)各1μL，CMV(10μmol/L)各1.5μL。
5三重RT-PCR体系条件优化
如图3所示，退火温度为49.0℃、50.8℃、52.4℃、53.8℃、54.9℃、56.2℃、58.0℃、60.0℃，体系都能够扩增出目的条带。综合考虑，选择55℃为体系退火温度。如图4所示，体系循环次数为15、20、25、30、35、40时，三种病毒的条带亮度不断增加，循环次数为35和40时条带亮度相当，综合考虑选择最佳循环次数为35。
综上研究结果，建立同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测方法，其中：
RT-PCR的反应体系为：20μL反应体系中，含有2×Rapid Taq Master Mix 10μL，TeMV上游引物和下游引物各1μL，EAPV上游引物和下游引物各1μL，CMV上游引物和下游引物各1.5μL，核酸模板1μL，ddH2O 2μL；PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
6多重RT-PCR灵敏度
如图5所示，将含三种病毒基因的质粒标准品依次稀释不同拷贝数的模板，做单一RT-PCR和三重RT-PCR实验验证其灵敏度。实验结果表明，单一RT-PCR实验中，TeMV、EAPV、CMV的检测灵敏度分别103、103、105(copies/μL)，多重RT-PCR实验中，TeMV、EAPV、CMV的检测灵敏度分别103、103、104(copies/μL)，总体上，单一RT-PCR与三重RT-PCR检测灵敏度相当。该体系可实现对三种病毒104(copies/μL)水平的检测。
7多重RT-PCR应用分析
如图6所示，利用优化好的检测体系检测田间样品，TeMV、EAPV、CMV的检出率分别为77.3％(17/22)，45.5％(10/22)，13.6％(3/22)，TeMV和EAPV的复合侵染率为36.4％(8/22)，TeMV、EAPV、CMV的复合侵染率为4.5％(1/22)。建立并优化后的检测体系与单一RT-PCR检测结果相同，准确度高，能检测含不同病毒的样品，扩增出的病毒条带易于区分，该体系具有很好的准确性和实用性。
Claims (6)
1.同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组，其特征在于包括三对RT-PCR检测引物，它们分别针对TeMV、EAPV和CMV三种病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
2.含有权利要求1所述引物组的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和引物组。
4.根据权利要求3所述的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有TeMV、EAPV和CMV三种病毒的总核酸标准品，阴性对照为无病毒西番莲总核酸，引物组为预混的包含针对TeMV、EAPV和CMV三种病毒的多重RT-PCR引物组，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6的碱基序列。
5.利用权利要求1所述引物组的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测方法。
6.根据权利要求5所述的同时检测西番莲三种RNA病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：
RT-PCR的反应体系为：20μL反应体系中，含有2×Rapid Taq Master Mix 10μL，TeMV上游引物和下游引物各1μL，EAPV上游引物和下游引物各1μL，CMV上游引物和下游引物各1.5μL，模板1μL，ddH2O 2μL；
PCR反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
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