CN116356076A - 一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量pcr方法 Download PDF

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CN116356076A CN202210374541.5A CN202210374541A CN116356076A CN 116356076 A CN116356076 A CN 116356076A CN 202210374541 A CN202210374541 A CN 202210374541A CN 116356076 A CN116356076 A CN 116356076A
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苗圃
吴彦辉
宋瑞芳
杨志强
王洁琼
李静静
段宏群
姚健
刘翔文
李成军
张晓丽
王艺绘
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract

一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，它是按以下步骤进行的：（1）TVBMV引物设计与合成；（2）总RNA的提取与RT‑PCR；（3）目的基因片段克隆与鉴定；（4）质粒标准品的制备；（5）荧光定量PCR标准曲线的建立；本发明的有益效果是：本发明的方法快速简单、特异性强，解决了现有检测手段复杂费时、周期长的缺陷；本发明的方法可定量检测烟草脉带花叶病毒，试验重复性良好，试验结果可靠。

Description

一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法
技术领域
本发明属于病毒分子检测领域，具体涉及一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。
背景技术
烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein-banding mosaic virus , TVBMV) 属马铃薯Y 病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，该病毒以蚜虫非持久性传播为主，也可以通过机械传播。由于近几年品种更替、气候变化等原因，烟草脉带花叶病毒病在全国有逐年上升的趋势，但是TVBMV 侵染后的烟草叶片症状与马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y,PVY）症状相似，生产上难以区分导致防控不力。因此，对TVBMV进行准确鉴定就显得尤为重要。目前，检测TVBMV较常见的方法有酶联免疫吸附法和RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）检测法，酶联免疫吸附法常出现假阳性且灵敏度较低，而RT-PCR技术操作步骤较繁琐且只能定性分析病毒是否存在。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative polymerase chainreaction，RT-qPCR）能够定量检测，且快速、特异性强。
本发明采用的技术方案为：
一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，它是按以下步骤进行的：
（1）TVBMV引物设计与合成：根据NCBI数据库中TVBMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因保守序列：AM236820和内参基因HSC70-1：DV161835，利用Primer Premier 5.0软件根据引物设计原则设计荧光定量PCR引物，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；
上游引物TVBMV-F：CCGTATTAAAGGTAAAGAGGTCG；
下游引物TVBMV-R：CCTTCACCCCTGCGTACC；
所述AM236820如SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列；
所述DV161835如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；
（2）总RNA的提取与RT-PCR：总RNA提取参照TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit（9767）说明书进行，以健康烟草叶片为阴性对照，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成并进行PCR反应；
（3）目的基因片段克隆与鉴定：将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，采用TaKaRa胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA经分光光度计测定浓度后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，加入600 µl SOC培养基，37℃220rpm/min振荡培养1h，吸取100 µl培养液涂布于蓝白斑培养皿上；37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，挑选若干白色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；震荡培养的条件是37℃，220r/min，15h；
上述质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13Primers进行PCR鉴定；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，把符合预期大小目的条带的质粒样品15 µl送到生工生物工程有限公司进行测序，余下的质粒样品保存于-20℃；
（4）质粒标准品的制备：质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×1014计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；
其中A代表质粒浓度ng/µl，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/µl；
（5）荧光定量PCR标准曲线的建立：将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，90 µl稀释液+10 µl质粒，获得TVBMV终浓度为8.36×101—8.36×109copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒标准品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行扩增，每个浓度进行三次技术重复，仪器自动生成标准曲线。
本发明的有益效果是：本发明的方法快速简单、特异性强，解决了现有检测手段复杂费时、周期长的缺陷；本发明的方法可定量检测烟草脉带花叶病毒，试验重复性良好，试验结果可靠。
附图说明
图1为本发明的RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为TVBMV标准曲线。
具体实施方式
一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，它是按以下步骤进行的：
（1）TVBMV引物设计与合成：根据NCBI数据库中TVBMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因保守序列（AM236820）和内参基因HSC70-1（DV161835），利用Primer Premier 5.0软件根据引物设计原则设计荧光定量PCR引物，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；
上游引物TVBMV-F：CCGTATTAAAGGTAAAGAGGTCG；
下游引物TVBMV-R：CCTTCACCCCTGCGTACC；
所述AM236820如SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列；
所述DV161835如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；
引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（2）总RNA的提取与RT-PCR：总RNA提取参照TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit（9767）说明书进行，以健康烟草叶片为阴性对照，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成并进行PCR反应；
cDNA第一链的合成反应体系：RNA 2 µl、Random Primer 1 µl、DEPC-ddH2O 7µl，先65℃保育5min，快速置于冰上放置2min以上，后加入以下试剂：5×RT buffer 5µl、RRI0.5 µl、M-MLV 1 µl、dNTPmix 5 µl、DEPC-ddH2O 3.5 µl，反应条件：30℃ 10min，42℃60min，70℃ 15min，所得cDNA置于-20℃保存用于后续试验；
PCR反应体系：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0）10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.5 µL，cDNA 2 µl，ddH2O 7 µl。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性5s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，最后在72℃延伸10min；
（3）目的基因片段克隆与鉴定：将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，采用TaKaRa胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA经分光光度计测定浓度后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，加入600 µl SOC培养基，37℃220rpm/min振荡培养1h，吸取100 µl培养液涂布于蓝白斑培养皿上；37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，挑选若干白色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养（37℃，220r/min，15h），使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；
上述质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13Primers进行PCR鉴定；PCR反应体系为20 µl：Premix Taq™ (TaKaRa Taq™ Version 2.0）10 µl，BcaBEST Sequencing Primers(10 µM)0.5 µl，M13 Primers(10 µM)0.5 µl，质粒模板2 µl，ddH2O 7 µl；PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃后延伸10min；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，把符合预期大小目的条带的质粒样品15 µl送到生工生物工程有限公司进行测序，余下的质粒样品保存于-20℃；
（4）质粒标准品的制备：质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×1014计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；
其中A代表质粒浓度ng/µl，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/µl；
（5）荧光定量PCR标准曲线的建立：将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，90 µl稀释液+10 µl质粒，获得TVBMV终浓度为8.36×101—8.36×109copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒标准品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行扩增，每个浓度进行三次技术重复，仪器自动生成标准曲线。
实时荧光定量PCR反应体系为20 µl：TB Green Premix DimerEraser（2×）10 µl，PCR Forward Primer（10 µM）0.6 µL，PCR Reverse Primer（10 µM）0.6 µL，ROX ReferenceDye II（50×）0.4 µL，质粒模板2 µL，灭菌水6.4 µL。实时荧光定量PCR反应条件：预变性95℃ 30s，PCR反应95℃ 5s、57℃ 15s、72℃ 30s，45个循环。
实验结果：
1. RNA电泳检测结果
选取A260/A280在1.8-2.1的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，如图1所示检测结果表明RNA质量较好，可进行下一步试验。
标准曲线的建立
实时荧光定量PCR标准曲线如图2所示，结果表明，随着阳性质粒模板浓度逐渐降低，Ct值出现递增趋势，TVBMV在质粒标准品浓度101-109copies/µL范围内，Ct值同质粒标准品浓度之间线性关系良好。可根据待检测样品的Ct值参照此标准曲线进行样品含毒量的检测。
TVBMV实时荧光定量PCR，每个质粒梯度浓度均进行三次技术重复，结果如下表所示，三次重复变异系数均小于1%，表明本实验重复性良好，实验结果可靠。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
序列表
<110> 河南省农业科学院烟草研究所
<120> 一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法
<130> 2022.4.9
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 274
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtaccagggc gcaggtggag acatgggtgg tgccatggat gatgagggtc ctgctcctag 60
tggtggtggt gctggtccta agattgagga ggtggactaa gttggtgctc ctctattgtt 120
ttttatttct tgttagagac ttgcaatttt atttcagaga tctgtgtgcc taatgatttt 180
tgcctagtag atggattata ttattttcat tctgcaatca agtaatacct atcttttatt 240
tctcggtttt tattaaaagt tgctcttcct tttg 274
<210> 2
<211> 1624
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggtaacaata gtggccaacc atcaacagtt gttgataaca cactcatggt tatcatcaca 60
atgcactatg ctctaagacg cgcagggatt tcctatgaga atttctcaga gcattgtgct 20
tccgttgcaa atggagatga cctcattatt gcagtggcac cagggagtga acacattctt 180
gacaccctcc aagagtcttt tcatgaattg ggcttaaact atgatttctc cagcaggacc 240
cataacaaag aagaattatg tttcatgtca cattatggag ttcctagaga gaactgtctg 300
ataccaaaac ttgaacagga aagaattgtt tcaatattgg aatgggaccg cgctacagaa 360
cctcagcatc gattagaagc aatctgtgcc gcaatggtgg aagcatgggg ttatgatgaa 420
ttattgtaca acattcgtct cttctatgca tgggttcttg aacaagcacc ctacaacgaa 480
cttgcaagac agggtatggc accatatatt tctgaaaatg cactgaggag attatatctc 540
ggtgaggaag gtgacataag tttgtaccta cagagtctag ttcagaacca atggaaagat 600
gagcaggagg aagttgtgca tcagggtgat aatcagacag ttgatgctgg gaaaaatttg 660
caatcaaacc aaaaacaagg aaatgcgcaa gtggggaatg caagctcagg gggtgtgaaa 720
gataaggtca aagatgttaa tgttggaacc agtggcacat tctcaatacc gaggttgaga 780
gggttatcaa caaaactgaa tctgccccgt attaaaggta aagaggtcgt gaacttacag 840
cacctactcg agtacacacc cgaccaagtg agtctttcga acacaagagc tttaaattca 900
caatttgctt cgtggtacgc aggggtgaag ggcgattatg acctcgatga tgcacaaatg 960
gaaattgttc tgaatggttt gatggtatgg tgcatcgaaa acggaacctc accaaacttg 1020
aacggaatgt gggtcatgat ggatggtgat gaacaggttg aatacccaat taaaccctta 1080
ttggaacatg ccaaaccaac attcaggcaa atcatggcac actttagcaa cttggctgaa 1140
gcatatatag agaagcgtaa tgcagagaaa ccgtatatgc caaggtatgg tttgcagcgc 1200
aatttgactg acatgacact ggcgcgttat gcttttgatt tttacgaaat taattcgaaa 1260
acgccaacca gagcaagaga agcacacatc caaatgaaag cagcagcagt tgctaattca 1320
aagaacaatt tgtttggatt ggatggaaat gtcagcacga aggaggaaaa cacagagcgg 1380
cacactgcaa cagatgtcaa tcgtaacatg caccacctac ttggtgtgag tggtgtgtag 1440
cgtgcccgca ttatatatct atctgcatat atattatagt gtattgttgt tttctgtacc 1500
actagattcc ctgatgctga aagagtggtc ataccacgta aacatcttgc ggatcagtgc 1560
cgagtatcat atgctattct tgtaggtgac gcttggcgtc gttgaatatc atttgatata 1620
aggg 1624
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccgtattaaa ggtaaagagg tcg 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccttcacccc tgcgtacc 18
序列表
<110> 河南省农业科学院烟草研究所
<120> 一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法
<130> 2022.4.9
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 274
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtaccagggc gcaggtggag acatgggtgg tgccatggat gatgagggtc ctgctcctag 60
tggtggtggt gctggtccta agattgagga ggtggactaa gttggtgctc ctctattgtt 120
ttttatttct tgttagagac ttgcaatttt atttcagaga tctgtgtgcc taatgatttt 180
tgcctagtag atggattata ttattttcat tctgcaatca agtaatacct atcttttatt 240
tctcggtttt tattaaaagt tgctcttcct tttg 274
<210> 2
<211> 1624
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggtaacaata gtggccaacc atcaacagtt gttgataaca cactcatggt tatcatcaca 60
atgcactatg ctctaagacg cgcagggatt tcctatgaga atttctcaga gcattgtgct 20
tccgttgcaa atggagatga cctcattatt gcagtggcac cagggagtga acacattctt 180
gacaccctcc aagagtcttt tcatgaattg ggcttaaact atgatttctc cagcaggacc 240
cataacaaag aagaattatg tttcatgtca cattatggag ttcctagaga gaactgtctg 300
ataccaaaac ttgaacagga aagaattgtt tcaatattgg aatgggaccg cgctacagaa 360
cctcagcatc gattagaagc aatctgtgcc gcaatggtgg aagcatgggg ttatgatgaa 420
ttattgtaca acattcgtct cttctatgca tgggttcttg aacaagcacc ctacaacgaa 480
cttgcaagac agggtatggc accatatatt tctgaaaatg cactgaggag attatatctc 540
ggtgaggaag gtgacataag tttgtaccta cagagtctag ttcagaacca atggaaagat 600
gagcaggagg aagttgtgca tcagggtgat aatcagacag ttgatgctgg gaaaaatttg 660
caatcaaacc aaaaacaagg aaatgcgcaa gtggggaatg caagctcagg gggtgtgaaa 720
gataaggtca aagatgttaa tgttggaacc agtggcacat tctcaatacc gaggttgaga 780
gggttatcaa caaaactgaa tctgccccgt attaaaggta aagaggtcgt gaacttacag 840
cacctactcg agtacacacc cgaccaagtg agtctttcga acacaagagc tttaaattca 900
caatttgctt cgtggtacgc aggggtgaag ggcgattatg acctcgatga tgcacaaatg 960
gaaattgttc tgaatggttt gatggtatgg tgcatcgaaa acggaacctc accaaacttg 1020
aacggaatgt gggtcatgat ggatggtgat gaacaggttg aatacccaat taaaccctta 1080
ttggaacatg ccaaaccaac attcaggcaa atcatggcac actttagcaa cttggctgaa 1140
gcatatatag agaagcgtaa tgcagagaaa ccgtatatgc caaggtatgg tttgcagcgc 1200
aatttgactg acatgacact ggcgcgttat gcttttgatt tttacgaaat taattcgaaa 1260
acgccaacca gagcaagaga agcacacatc caaatgaaag cagcagcagt tgctaattca 1320
aagaacaatt tgtttggatt ggatggaaat gtcagcacga aggaggaaaa cacagagcgg 1380
cacactgcaa cagatgtcaa tcgtaacatg caccacctac ttggtgtgag tggtgtgtag 1440
cgtgcccgca ttatatatct atctgcatat atattatagt gtattgttgt tttctgtacc 1500
actagattcc ctgatgctga aagagtggtc ataccacgta aacatcttgc ggatcagtgc 1560
cgagtatcat atgctattct tgtaggtgac gcttggcgtc gttgaatatc atttgatata 1620
aggg 1624
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccgtattaaa ggtaaagagg tcg 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccttcacccc tgcgtacc 18

Claims (5)

1.一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：
（1）TVBMV引物设计与合成：根据NCBI数据库中TVBMV的外壳蛋白基因保守序列：AM236820和内参基因HSC70-1：DV161835，利用Primer Premier 5.0软件根据引物设计原则设计荧光定量PCR引物，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；
上游引物TVBMV-F：CCGTATTAAAGGTAAAGAGGTCG；
下游引物TVBMV-R：CCTTCACCCCTGCGTACC；
所述AM236820如SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列；
所述DV161835如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列；
（2）总RNA的提取与RT-PCR：总RNA提取参照TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit 9767说明书进行，以健康烟草叶片为阴性对照，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应并进行PCR反应；
（3）目的基因片段克隆与鉴定：将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，采用TaKaRa胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后的DNA经分光光度计测定浓度后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，加入600 µl SOC培养基，37℃220rpm/min振荡培养1h，吸取100 µl培养液涂布于蓝白斑培养皿上；37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，挑选若干白色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；
上述质粒用pMD™18-T Vector通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行PCR鉴定；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，把符合预期大小目的条带的质粒样品15 µl送到生工生物工程有限公司进行测序，余下的质粒样品保存于-20℃；
（4）质粒标准品的制备：质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×1014计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；
其中A代表质粒浓度ng/µl，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/µl；
（5）荧光定量PCR标准曲线的建立：将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，90 µl稀释液+10 µl质粒，获得TVBMV终浓度为8.36×101—8.36×109copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒标准品作为模板，利用ABI 7500 fast实时荧光定量PCR仪进行扩增，每个浓度进行三次技术重复，仪器自动生成标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的cDNA第一链的合成反应体系：RNA 2 µl、Random Primer 1 µl、DEPC-ddH2O 7µl，先65℃保育5min，快速置于冰上放置2min以上，后加入以下试剂：5×RTbuffer 5µl、RRI 0.5 µl、M-MLV 1 µl、dNTPmix 5 µl、DEPC-ddH2O 3.5 µl，反应条件：30℃10min，42℃ 60min，70℃ 15min，所得cDNA置于-20℃保存用于后续试验。
3.根据权利要求1所述的一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤（2）中的PCR反应体系：Premix Taq 10 µl，10 µmol/L的上下游引物各0.5µL，cDNA 2 µl，ddH2O 7 µl；反应条件：95℃预变性3min，95℃变性5s，57℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，最后在72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤（3）中PCR鉴定时的PCR反应体系为20 µl：Premix Taq™ 10 µl，BcaBESTSequencing Primers 0.5 µl，M13 Primers 0.5 µl，质粒模板2 µl，ddH2O 7 µl；PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环，72℃后延伸10min。
5.根据权利要求1所述的一种检测烟草脉带花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤（5）中的实时荧光定量PCR进行扩增时的反应体系为20 µl：TB GreenPremix DimerEraser 10 µl，PCR Forward Primer 0.6 µL，PCR Reverse Primer 0.6 µL，ROX Reference Dye II 0.4 µL，质粒模板2 µL，灭菌水6.4 µL；实时荧光定量PCR反应条件：预变性95℃ 30s，PCR反应95℃ 5s、57℃ 15s、72℃ 30s，45个循环。
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