CN114717360B - 百合病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了百合病毒的多重RT‑PCR检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒中包括序列如SEQ ID NO:1～18所示的能特异性检测九种百合病毒的引物对中的至少四对，所述九种百合病毒为CMV、LSV、PlAMV、LMoV、LCrV‑1、LAV‑1、LRoV‑1、LCaV‑1和LCaV‑2，配合优化后的检测条件，能实现9种病毒的同时检测，不仅准确率高、重复性好，而且耗时短、检测费用低廉。
Description
技术领域
本发明涉及百合病毒检测技术领域，具体涉及一种百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
百合不仅因为体态优美，花朵颜色艳丽，寓意美好，而且在食用和药用等方面都具有较高价值，是国际上重要的观赏花卉之一。我国栽培的百合种球主要依赖于进口，长期的无性繁殖导致百合种球带毒严重。目前，已报道的百合上常见病毒病有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、车前草花叶病毒（Plantago asiatica mosaic virus，PlAMV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）、百合斑驳病毒（Lily mottlevirus，LMoV），它们常表现为复合侵染，造成植株的茎、叶或花出现斑驳或畸形，严重的导致植株矮小甚至死亡，随着病毒的传播，导致百合大面积感病，严重影响了百合切花的产量和质量。
指示植物法、电镜检测法、血清学方法和分子生物学技术是国内常用的病毒检测方法，分子生物学技术包括双链RNA电泳、核酸斑点杂交( NASH) 和PCR技术。相比较来说，指示植物法虽然简单，但是检测周期长，灵敏度低。电镜检测在百合病毒的检测中也有较广泛的应用，但是电镜检测对样品要求较高，所需样品量多，而且使用的仪器昂贵，检测技术难以掌握，不适合作为常用的检测方法。分子生物学技术中RT-PCR方法用于百合病毒检测在便捷性、灵敏度、特异性等方面均优于上述几种方法。
近年来在云南各地田间调查发现，百合在整个生长期，病毒病发生危害普遍且严重影响了经济发展，经系统检测鉴定，这一时期主要病原为黄瓜花叶病毒、车前草花叶病毒、百合无症病毒、百合斑驳病毒，但对组培苗、田间植株难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施。在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供用于同时检测多种百合病毒的检测试剂盒和检测方法，可以实现多达九种百合病毒的同时检测，为百合病毒病的有效防治提供技术支持。
本发明的技术方案具体如下：
一种百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括以下九对引物中的至少两对：
用于扩增CMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；
用于扩增LSV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；
用于扩增LMoV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:5～6所示；
用于扩增PlAMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；
用于扩增LAV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:9～10所示；
用于扩增LRoV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:11～12所示；
用于扩增LCaV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:13～14所示；
用于扩增LCaV-2的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:15～16所示；
用于扩增LCrV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:17～18所示。
可以理解的是，该检测试剂盒可以包括9对引物中的任意4个、5个、6个、7个或8个引物对，也可以包含全部的9对引物，且引物对可以独立包装也可以按比例混装。
优选地，由于LCrV-1、LAV-1、LRoV-1、LCaV-1、LCaV-2为本发明首次发现的能侵染百合的病毒新成员，故上述多重RT-PCR检测试剂盒包括用于扩增LCrV-1、LAV-1、LRoV-1、LCaV-1或LCaV-2的引物对中的至少一个。
优选地，在上述多重RT-PCR检测试剂盒中，九对引物的最佳摩尔比为：CMV∶LSV∶LMoV∶PlAMV∶LAV-1∶LRoV-1∶LCaV-1∶LCaV-2∶LCrV-1=7∶4∶6∶4∶5∶6∶5∶4∶5。可以理解的是，若是试剂盒中只包含该9对引物中的部分引物对，不影响相应各引物间的最佳比例关系。
本发明还提供了使用上述检测试剂盒进行百合病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
S1、提取百合样品的总RNA；
S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；
S3、使用上述检测试剂盒中的引物对步骤S2所得样品进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
当出现210bp大小的条带时，说明百合样品中含有CMV；当出现330bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV-2；当出现418bp大小的条带时，说明百合样品中含有LSV；当出现496bp大小的条带时，说明百合样品中含有PlAMV；当出现588bp大小的条带时，说明百合样品中含有LMoV；当出现656bp大小的条带时，说明百合样品中含有LAV-1；当出现710bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV-1；当出现814bp大小的条带时，说明百合样品中含有LRoV-1；当出现884bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCrV-1。
优选地，步骤S1具体为：将百合叶片研磨后与Trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解，即为样品总RNA。
优选地，步骤S2具体为：取步骤S1制备的总RNA，加入随机引物pd(N)6和DEPC水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。
更加优选地，所述反转录混合液包括：4µL 5×M-MLV反应缓冲液、1µL 2.5mMdNTPs、0.5µL 40U/µL RNA酶抑制剂、0.5µL 200U/µL M-MLV和4µL DEPC水，按总体积10µL计。
优选地，步骤S3所述PCR扩增的体系为：共25µL，12.5µL 2×Taq Master Mix，0.15µL～0.40µL引物，1.5µL DNA/cDNA，ddH2O余量。
优选地，步骤S3所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50～62℃退火30s，72℃延伸15～60s，35个循环；72℃完全延伸10min。当扩增体系中同时包含9对引物时，最佳退火温度为50℃。
优选地，所述产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测。
本发明的有益效果为：本发明针对4种常见病毒CMV、PlAMV、LSV、LMoV，以及5种通过对百合叶片样品高通量测序发现的能侵染百合的病毒新品种LCrV-1、LAV-1、LRoV-1、LCaV-1、LCaV-2基因组序列进行了引物设计，筛选得到了9对特异性引物。更重要的是，九对特异性引物之间的兼容性好，能够在同一反应体系中得到较强的扩增，且谱带清晰、容易区分。采用本发明建立的检测体系对田间百合样品进行病毒检测时，准确度高。
本发明中对于DNA病毒的检测，与RNA病毒检测方法相同，通过改进的Trizol法对样品基因组RNA提取，不经过DNA消化后逆转录得到的cDNA便可检测到DNA病毒，省去了提取DNA的过程，节省时间并且极大的减少检测费用支出。
附图说明
图1为实施例1中LAV-1病毒的系统进化树，其中，A图为基于ORF1编码的假定蛋白（p44）的氨基酸序列系统进化树分析，B图为基于RdRp的氨基酸序列系统进化树分析；
图2为实施例1中LCrV-1基于RdRp（RNA依赖的RNA蛋白酶）的氨基酸序列系统进化树；
图3为实施例1中LRoV-1基于CP（外壳蛋白）的氨基酸序列系统进化树分析；
图4为实施例1中LCaV-1基于编码的VI的部分氨基酸序列的系统进化树分析；
图5为实施例1中LCaV-2基于逆转录酶（reverse transcriptase，RT）的部分氨基酸序列系统进化树分析；
图6为实施例2中不同引物浓度的多重PT-PCR检测凝胶电泳图；
图7为实施例2中不同退火温度的多重PT-PCR检测凝胶电泳图；
图8为实施例3中田间复合侵染的百合样品的多重PT-PCR检测凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例采集了4份百合叶片样品，通过高通量测序的方法得到了5种能侵染百合的病毒新成员，并通过对9种病毒的分析，得到能够兼容检测的9对引物。其过程具体为：
（1）样品采集。①YN1：采自云南省昆明市的4株百合（编号为HJJ-3，KKD-3，KEKW-3，ZBY-3）叶片混合样品。②SETL：采自云南省昆明市的1株东方百合，该植株茎间粗短，植株矮小。③YN2：采自云南省昆明市的1株东方百合，该植株叶片整株黄化褪绿。④Hzau1：采自湖北省武汉市的6株百合（编号XBLY-10，XBLY-13，SEB，MM-10，MM-9，MM-1）的叶片混合样品，其中包括2株“西伯利亚”品种百合、1株“前水”百合、三株“木门”百合，其中XBLY10，XBLY13和SEB叶片样品无明显症状，MM10，MM9叶片样品有明显褪绿条斑，MM1叶脉有轻微褪绿症状。
（2）高通量测序分析。所有样品经过液氮快速冷冻后送至上海派森诺公司进行高通量测序。经拼接得到的contig逐一在NCBI数据库进行BlastX和BlastN比对，从上述4个样品中鉴定到的植物病毒除已报道的常见病毒外，尚未报道的能侵染百合的病毒有5种。
两种dsRNA病毒，一种Amalgaviridae科Amalgavirus属的病毒（其系统进化树如图1所示），暂命名Lily amalgavirus 1 (LAV-1)；一种双分体病毒科（Partitiviridae）丁型双分病毒属（Deltapartitivirus）病毒（其系统进化树如图2所示），暂命名Lily crypticvirus 1 (LCrV-1)。
三种DNA病毒，一种花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）玫瑰黄脉病毒属（Rosadnavirus）的新病毒（其系统进化树如图3所示），暂命名Lily Rosadnaviru-1（LRoV-1）；两种花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus）新成员（其系统进化树如图4、5所示），暂命名Lily Caulimovirus-1 (LCaV-1)和Lily Caulimovirus-2 (LCaV-2)。
（3）引物设计
多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个基因位点的特异性扩增，故引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，会导致靶标带无法扩增；引物的浓度搭配不合理也会使反应繁盛非特异性条带，也可导致一些靶标带无法扩增。故引物对的筛选、引物浓度以及退火温度等直接影响检测结果。
本实施例先根据GenBank中黄瓜花叶病毒、车前草花叶病毒、百合无症病毒、百合斑驳病毒4种病毒全基因组核苷酸序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物。
然后对5种尚未报道的能侵染百合的病毒新品种的序列进行分析，筛选确定靶序列和引物。其中，LAV-1的靶序列（cDNA）如SEQ ID NO:19所示，LCrV-1的靶序列（cDNA）如SEQID NO:20所示，LRoV-1的靶序列如SEQ ID NO:21所示，LCaV-1的靶序列如SEQ ID NO:22所示，LCaV-2的靶序列如SEQ ID NO:23所示。
通过引物对的筛选，摸索出合适的引物组合，具体如表1所示：
表1
实施例2
使用实施例1提供的引物，对PCR体系进行优化，主要对其PCR体系中的引物浓度以及PCR扩增程序中退火的温度进行研究。优化的基本原则是：获得清晰稳定的目标条带；成本低；耗时短等。
（1）阳性质粒的构件
以各个病毒的阳性cDNA或DNA样品为模板，用九对引物对CMV、PlAMV、LSV、LMoV、LCrV-1、LAV-1、LCaV-1、LCaV-2九种病毒扩增，得到的PCR产物与pMD18-T载体连接，大肠杆菌转化后，将阳性鉴定后并测序正确的菌液进行质粒提取，得到的九种病毒的重组质粒在紫外分光光度计下测定其浓度，并将RNA病毒的重组质粒浓度稀释为20ng/μL，将三种DNA病毒的重组质粒浓度稀释为5ng/μL。
（2）九对引物浓度的优化
针对九种病毒的RT-PCR体系的引物浓度优化了11个体系，如表2所示。检测结果入图6所示，其中体系11能同时扩增出210bp、330bp、418bp、496bp、588bp、656bp、710bp、814bp和884bp的九条核酸条带，且谱带清晰。说明通过本发明可以实现CMV、LCaV-2、LSV、PlAMV、LMoV、LAV-1、LRoV-1、LCaV-1、LCrV-1九种病毒的同步检测。
表2
（3）退火温度的优化
根据所设计的九对引物的Tm值，对退火温度设计了如下8个梯度处理：50℃，51℃，54℃，55℃，56℃，58℃，60℃，62℃。检测结果如图7所示，其中50℃为最适退火温度。
实施例3
采取田间百合样本进行检测，具体过程如下：
（1）提取RNA：采用改进的Trizol法提取百合叶片样品中的总RNA，具体步骤如下：取0.1g百合叶片，液氮研磨后迅速加入管中，加入800µL Trizol，上下颠倒混匀；12000rpm4℃离心15min；小心吸取上清，加入等体积氯仿抽提两次，剧烈震荡后，冰上静置5min后，12000rpm 4℃离心15min；小心吸取上清，加入等体积提前预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，-20℃沉降30min；12000rpm 4℃离心15min；弃上清，加入75%乙醇，上下颠倒，洗涤沉淀2-3次，12000rpm 4℃离心1min；12000rpm 4℃空离1min；用枪头吸干残余乙醇，超净工作台中晾干沉淀约5min，加入25µL DEPC水，轻轻吸打，直至沉淀完全溶解，即为样品总RNA，于-80℃保存备用。
采用改进的Trizol法，通过氯仿对提取过程中的大分子蛋白质2-3次抽提后得到高纯度、高质量以及完整度较好的RNA。
（2）cDNA的合成：取6-8µL约(1µg)的总RNA或者dsRNA，加入1µL随机引物pd(N)6（80nmol），DEPC H2O补足10µL，加入到无酶的0.5mL离心管中；沸水浴10min，置于冰上迅速冷却4min；加入10µL配好的反转录混合溶液（包含4µL 5×M-MLV反应缓冲液、1µL dNTPs（2.5mM）、0.5µL RNA酶抑制剂（RRI）（40U/µL）、0.5µL M-MLV（200U/µL）和4µL DEPC H2O），吸打混匀、瞬离，37℃水浴1h，85℃沸水浴5min；迅速置于冰上，瞬离，-20℃保存备用。
（3）以步骤（2）制备的模板进行PCR扩增。
PCR反应体系（25µL）为：12.5µL 2×Taq Master Mix，0.35µL上下游引物（引物浓度按照实施例3体系11设置），1.5µL DNA/cDNA，ddH2O补足25µL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，50～60℃退火（根据引物退火温度调整）30s，72℃延伸15~60s（根据扩增片段大小调整），35个循环，72℃完全延伸10min。
PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，置于0.5µg/mL的溴化乙锭（EB）中染色，在凝胶成像系统中观察。
结果如图8所示，在复合感染了LCaV-2、LSV、LAV-1、LCaV-1、LRoV-1、LCrV-1的百合中检测到了330bp、418bp、656bp、710bp、814bp和884bp六条核酸条带，在复合感染了LCaV-2、LSV、PlAMV、LMoV、LAV-1、LCaV-1、LYVV和LCrV-1的百合中检测到了330bp、418bp、496bp、588bp、656bp、710bp、814bp和884bp八条核酸条带，以及其他三个样品（不再一一列举），其多重检测结果均与单一RT-PCR检测结果一致，且在阴性对照中未检测到任何条带说明检测结果无污染。
综上所述，本发明提供的九对特异性引物兼容性好，能够在同一反应体系中同时得到较强的扩增，且谱带清晰、容易区分，实现了九种百合病毒的同时检测，为百合种植、及百合病毒研究提供了强有力的支持。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下九对引物：
用于扩增CMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；
用于扩增LSV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；
用于扩增LMoV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:5～6所示；
用于扩增PlAMV的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；
用于扩增LAV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:9～10所示；
用于扩增LRoV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:11～12所示；
用于扩增LCaV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:13～14所示；
用于扩增LCaV-2的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:15～16所示；
用于扩增LCrV-1的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO:17～18所示。
2.根据权利要求1所述百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述九对引物的摩尔比为：CMV∶LSV∶LMoV∶PlAMV∶LAV-1∶LRoV-1∶LCaV-1∶LCaV-2∶LCrV-1=7∶4∶6∶4∶5∶6∶5∶4∶5。
3.一种检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取百合样品的总RNA；
S2、取总RNA通过逆转录酶合成cDNA；
S3、使用权利要求1所述检测试剂盒中序列如SEQ ID NO:1～18所示的引物对步骤S2所得样品进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
当出现210bp大小的条带时，说明百合样品中含有CMV；当出现330bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV-2；当出现418bp大小的条带时，说明百合样品中含有LSV；当出现496bp大小的条带时，说明百合样品中含有PlAMV；当出现588bp大小的条带时，说明百合样品中含有LMoV；当出现656bp大小的条带时，说明百合样品中含有LAV-1；当出现710bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCaV-1；当出现814bp大小的条带时，说明百合样品中含有LRoV-1；当出现884bp大小的条带时，说明百合样品中含有LCrV-1。
4.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤S1具体为：将百合叶片研磨后与Trizol混匀，离心取上清，加入氯仿抽提；离心取上清，加入异丙醇混匀，沉降后离心弃上清；采用乙醇洗涤沉淀，再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解，即为样品总RNA。
5.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤S2具体为：取步骤S1制备的总RNA，加入随机引物pd(N)6和DEPC水，先沸水浴再迅速冷却后，加入反转录混合液，吸打混匀、瞬离；37℃水浴1～1.5h后，先沸水浴再迅速冷却，瞬离即得。
6.根据权利要求5所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述反转录混合液包括：4µL 5×M-MLV反应缓冲液、1µL 2.5mM dNTPs、0.5µL 40U/µL RNA酶抑制剂、0.5µL200U/µL M-MLV和4µL DEPC水，按总体积10µL计。
7.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤S3所述PCR扩增的体系为：共25µL，12.5µL 2×Taq Master Mix，0.15µL～0.40µL引物，1.5µL DNA/cDNA，ddH2O余量。
8.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤S3所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50～62℃退火30s，72℃延伸15～60s，35个循环；72℃完全延伸10min。
9.根据权利要求8所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述退火的温度为50℃。
10.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测。
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