CN116676418A

CN116676418A - 同时检测六种瓜类病毒细菌的多重rt-pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN116676418A
Application number: CN202210162131.4A
Authority: CN
Inventors: 张永江; 赵振兴; 向均; 田茜
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2023-09-01

Abstract

本发明公开了同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒可专用于同时检测烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和瓜类果斑病菌，该试剂盒包括多重RT‑PCR特异性引物，反转录酶/DNA聚合酶混合液、DEPC水、RT‑PCR反应缓冲液、阳性及阴性对照品。本发明的检测方法直接以待测样品的RNA为模板，采用所述引物在同一反应体系中对六种病毒细菌的目的片段进行扩增。本发明显著提高了检测效率，节约了检测时间和成本，可以有效用于瓜类六种病毒细菌的快速、准确鉴定，应用前景广泛。

Description

同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于植物检疫技术领域，涉及生物检测技术，具体设计一种用于检测六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测试剂盒以及应用该检测试剂盒鉴定六种瓜类病毒细菌检测或者六种瓜类病毒细菌的植物材料的方法。

背景技术

葫芦科(Cucurbitaceae)作物包括95个属965种，其中瓜类作物主要包括西瓜、甜瓜等水果和黄瓜、南瓜、葫芦等蔬菜，是生产中非常重要的经济作物。我国是葫芦科作物的生产大国，也是消费大国，据联合国粮食与农业组织(FAO)2019年数据显示，我国葫芦科作物总产量约为1.53亿吨，约占世界总产量的64.02％。葫芦科作物种质可携带30余病毒，每种病毒都可造成严重的经济损失。目前，我国已经发现和鉴定的病毒有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus,CGMMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)等，这些病毒对瓜类作物可能造成花叶、植株矮小、叶卷缩、叶脉皱缩变形、叶面凹凸不平、顶叶和茎蔓扭曲等症状，严重时茎蔓节间缩短、簇生小叶、结瓜少且小或畸形甚至不结瓜、瓜面上有瘤状突起或环形斑、萎缩死亡等。

瓜类果斑病菌(嗜酸菌属西瓜种，Acidovorax citrulli，AC)引起的瓜类细菌性果斑病是一种严重的细菌性病害，被美国认为是西瓜上的毁灭性病害；该病害在世界范围内广泛传播，1988年首次在我国报道，在我国超过14个省份的甜瓜、西瓜等瓜类作物上发生，减产46％以上。0.01％污染的种子可引起病害的发生及流行，无症状果实的种子也有可能带菌，一旦感染会对瓜类产量带来巨大经济损失，该病害已成为影响我国葫芦科作物生产的主要病害之一。

目前常见的瓜类病毒和细菌的检测方法主要有两种，一是以ELISA为主的血清学方法，该办法灵敏度低，假阳性率高。且无法进行多种病原物的同步检测；二是基于核酸扩增的常规PCR方法，由于侵染瓜类作物的病毒种类多，逐一检测操作繁琐、耗时较长且成本较高。多重RT-PCR在病原物检测领域已有一些研究，可以调高检测效率。关于同时检测烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒这五种侵染瓜类作物的主要RNA病毒的方法未见报道，更未见专门的同时检测这五种RNA病毒和瓜类果斑病菌的多重RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测引物组合。

本发明的另一目的是提供含有上述引物组合的用于多重RT-PCR检测六种瓜类病毒细菌的试剂盒。

本发明的再一目的是提供六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测方法。

为了实现本发明目的，首先参考Genbank和现有文献中报道的序列，进行比对、筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于五种瓜类病毒和瓜类果斑病菌，可特异地获得在琼脂糖凝胶电泳清晰、明确地区分开的目标片段。

本发明提供用于鉴定六种瓜类病毒细菌的成套引物对，由特异引物对A、特异引物对B、特异引物对C、特异引物对D、特异引物对E、特异引物对F和特异引物对G组成；

所述特异引物对A由引物TMV-F和引物TMV-R组成；

所述特异引物对B由引物ZYMV-F和引物ZYMV-R组成；

所述特异引物对C由引物WMV-F和引物WMV-R组成；

所述特异引物对D由引物CGMMV-F和引物CGMMV-R组成；

所述特异引物对E由引物CMV-F和引物CMV-R组成；

所述特异引物对F由引物AC-F和引物AC-R组成；

所述特异引物对G由引物EF1-α-F和引物EF1-α-R组成。

所述引物TMV-F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物TMV-R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物ZYMV-F为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物ZYMV-R为如下b3)或b4)：

b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；

b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物WMV-F为如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；

c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物WMV-R为如下c3)或c4)：

c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；

c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物CGMMV-F为如下d1)或d2)：

d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；

d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物CGMMV-R为如下d3)或d4)：

d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；

d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物CMV-F为如下e1)或e2)：

e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；

e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物CMV-R为如下e3)或e4)：

e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；

e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物AC-F为如下f1)或f2)：

f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；

f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物AC-R为如下f3)或f4)：

f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；

f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物EF1-α-F为如下g1)或g2)：

g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；

g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物EF1-α-R为如下b3)或b4)：

g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；

g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述六种瓜类病毒细菌为烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或瓜类果斑病菌。

其中，所述引物TMV-F、所述引物TMV-R、所述引物ZYMV-F、所述引物ZYMV-R、所述引物WMV-F、所述引物WMV-R、所述引物CGMMV-F、所述引物CGMMV-R、所述引物CMV-F、所述引物CMV-R、所述引物AC-F、所述引物AC-R、所述引物EF1-α-F和所述引物EF1-α-R的摩尔比为2:2:2:2:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4。

所述的成套引物对在如下h1)-h8)中任一所述的应用也应在本发明的保护范围之内：

h1)制备用于鉴定六种瓜类病毒细菌的产品；

h2)鉴定六种瓜类病毒细菌；

h3)制备用于鉴定待测病原物是否为六种瓜类病毒细菌的产品；

h4)鉴定待测病原物是否为六种瓜类病毒细菌；

h5)制备用于鉴别六种瓜类病毒细菌的产品；

h6)鉴别六种瓜类病毒细菌；

h7)制备用于检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌的产品；

h8)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；

本发明还提供包含所述成套引物对的试剂盒；

所述试剂盒的功能为如下i1)-i4)中任一种：

i1)鉴定六种瓜类病毒细菌中的至少一种；

i2)鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌；

i3)鉴别六种瓜类病毒细菌；

i4)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；

所述试剂盒的制备方法，包括如下(Ⅰ)或(Ⅱ)的步骤：

(Ⅰ)所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；

(Ⅱ)所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。

本发明提供一种鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测病原物的RNA为模板，采用所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为152bp的条带，则所述待测病原物为烟草花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为205bp的条带，则所述待测病原物为小西葫芦黄花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为318bp的条带，则所述待测病原物为西瓜花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为419bp的条带，则所述待测病原物为黄瓜绿斑驳花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为528bp的条带，则所述待测病原物为黄瓜花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为662bp的条带，则所述待测病原物为瓜类果斑病菌；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为821bp的条带，为瓜类内标基因条带，则检测结果有效；

若所述RT-PCR扩增产物中不含有821bp的条带，则检测结果无效；

若所述RT-PCR扩增产物中不含有大小为152bp的条带且不含有大小为205bp的条带且不含有大小为318bp的条带且不含有大小为419bp的条带且不含有大小为528bp的条带且不含有大小为662bp的条带且含有大小为821bp的条带，则所述检测结果有效，待测病原物不为六种瓜类病毒细菌；

本发明提供一种鉴别六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测病毒的RNA为模板，采用所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

本发明提供一种检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测样品的RNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

所述的特异引物对A或所述的特异引物对B或所述的特异引物对C或所述的特异引物对D或所述的特异引物对E或所述的特异引物对F或所述的特异引物对G也应在本发明的保护范围之内。

如下n1)-n21)任一所述的应用也应在本发明的保护范围之内：

n1)中所述的特异引物对A在制备用于检测烟草花叶病毒的产品中的应用；

n2)所述的特异引物对A在鉴定烟草花叶病毒中的应用；

n3)所述的特异引物对A在鉴定待测病毒是否为烟草花叶病毒中的应用；

n4)所述的特异引物对B在制备用于检测小西葫芦黄花叶病毒的产品中的应用；

n5)所述的特异引物对B在鉴定小西葫芦黄花叶病毒中的应用；

n6)所述的特异引物对B在鉴定待测病毒是否为小西葫芦黄花叶病毒中的应用。

n7)所述的特异引物对C在制备用于检测西瓜花叶病毒的产品中的应用；

n8)所述的特异引物对C在鉴定西瓜花叶病毒中的应用；

n9)所述的特异引物对C在鉴定待测病毒是否为西瓜花叶病毒中的应用；

n10)所述的特异引物对D在制备用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的产品中的应用；

n11)所述的特异引物对D在鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用；

n12)所述的特异引物对D在鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用；

n13)所述的特异引物对E在制备用于检测黄瓜花叶病毒的产品中的应用；

n14)所述的特异引物对E在鉴定黄瓜花叶病毒中的应用；

n15)所述的特异引物对E在鉴定待测病毒是否为黄瓜花叶病毒中的应用；

n16)所述的特异引物对F在制备用于检测瓜类果斑病菌的产品中的应用；

n17)所述的特异引物对F在鉴定瓜类果斑病菌中的应用；

n18)所述的特异引物对F在鉴定待测细菌是否为瓜类果斑病菌中的应用；

n19)所述的特异引物对G在制备用于检测瓜类内参基因的产品中的应用；

n20)所述的特异引物对G在检测瓜类内参基因中的应用；

n21)所述的特异引物对G在鉴定待测基因是否为瓜类内参基因中的应用。

本发明进一步提供瓜类五种病毒和瓜类果斑病菌的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取瓜类样品中的总RNA；

2)以步骤1)中获得的总RNA为模板，利用上述引物组合进行特异性RT-PCR扩增反应；

3)琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为152bp的条带，则所述待测病毒为烟草花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为205bp的条带，则所述待测病毒为小西葫芦黄花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为318bp的条带，则所述待测病毒为西瓜花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为419bp的条带，则所述待测病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为529bp的条带，则所述待测病毒为黄瓜花叶病毒；

若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为662bp的条带，则所述待测细菌为瓜类果斑病菌；

前述的方法，步骤2)中进行PCR扩增使用的RT-PCR反应体系以20μL计为：

RNA模板 4μL

10μM TMV-F 0.2μL

10μM TMV-R 0.2μL

10μM ZYMV-F 0.2μL

10μM ZYMV-R 0.2μL

10μM WMV-F 0.1μL

10μM WMV-R 0.1μL

10μM CGMMV-F 0.4μL

10μM CGMMV-R 0.4μL

10μM CMV-F 0.2μL

10μM CMV-R 0.2μL

10μM AC-F 0.2μL

10μM AC-R 0.2μL

10μM EF1-α-F 0.4μL

10μM EF1-α-R 0.4μL

RT-PCR酶混合液 0.4μL

2×RT-PCR反应缓冲液 10μL

ddH₂O 2.2μL

PCR反应条件为：50℃30分钟；94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。

为使所建立的多重RT-PCR技术有更广泛的适用性，根据病毒和细菌在瓜类植株内的分布特点，确定种子、叶片、茎秆、花、果实与根系均可以作为取样部位。所有取样部位均可以直接研磨提取植物总RNA。

本发明针对在我国已发现和鉴定的五种RNA病毒和瓜类果斑病菌，瓜类果斑病菌的常用分子检测方法多针对其DNA，导致通常检测RNA病毒和瓜类果斑病菌须分开进行，本发明针对瓜类果斑病菌的RNA，既满足了检测需求，又减少了检测的工作量。首先根据文献和Genbank中已报道的序列筛选和设计多重RT-PCR引物，通过实验筛选、优化、最终确定最优的引物组合，使得各病原物的条带易于区分；为了减少假阳性的产生，加入了更加特异的EF1-α作为内标基因。

本发明提供了基于逆转录和交叉引物恒温扩增技术建立的黄瓜绿斑驳花叶病毒的核酸试纸条检测法。该方法以样品总DNA 或者菌液为模板，进行逆转录和交叉引物恒温扩增反应，反应结束后利用一次性核酸检测装置内含的核酸试纸条进行结果判定。本发明具有特异性好，灵敏度高，操作简单方便，检测效率高等优点，能满足口岸和田间检测的基本需求。

附图说明

图1为多重RT-PCR特异性试验的结果，其中，M：DNA 100bp Ladder；泳道1:多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道2-7：RT-PCR分别检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图2为不同引物浓度配比对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bp Ladder；泳道1-7：引物浓度组合1-7的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图3为不同退火温度对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bp Ladder；泳道1-7：退火温度依次为49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图4为不同循环数对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bp Ladder；泳道1-6：循环数依次为20、25、30、35、40、45；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图5为不同延伸时间对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bp Ladder；泳道1-7：延伸时间依次为30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图6为多重RT-PCR稳定性试验的结果，其中，M：DNA 100bp Ladder；泳道1:多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道2：多重RT-PCR检测ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道3：多重RT-PCR检测TMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道4：多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道5：多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道6：多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道7：多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、EF1-α的扩增产物；泳道8：多重RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图7为多重RT-PCR体系灵敏度试验的结果，其中，M：DNA 100bp Ladder；泳道1：RNA稀释倍数为10^-0；泳道2：RNA稀释倍数为10^-1；泳道3：RNA稀释倍数为10^-2；泳道4：RNA稀释倍数为10^-3；泳道5：RNA稀释倍数为10^-4；泳道6：RNA稀释倍数为10^-5；泳道7：各质粒拷贝数为10^-6；泳道8：阴性对照，以ddH₂O代替模板。

图8为其它瓜类病毒和病原细菌对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bpLadder；泳道1：模板为TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；泳道2-12：模板依次为南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus)、瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus)、甜瓜花叶病毒(Melon mosaic virus)、番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、小西葫芦黄斑病毒(Zucchini yeIIow fIeck virus)、甜瓜黄单胞菌(X.melonis)、细菌性叶斑病菌(Xanthomonas cucurbitae)、细菌性角斑病菌(P.syringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)阴性对照，以健康黄瓜样品RNA代替模板；VE为空白对照，以ddH₂O代替模板。

图9为多重RT-PCR对田间样品的检测结果，其中，M：DNA 100bp Ladder；泳道1-22位22份瓜类样品的多重RT-PCR产物，CK为阴性对照，VE为空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的烟草花叶病毒阳性样品、小西葫芦黄花叶病毒阳性样品、西瓜花叶病毒阳性样品、黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性样品、黄瓜花叶病毒阳性样品和瓜类果斑病菌阳性样品。在文献，张靓,田茜,刘凤权,等.六种重要瓜类种传细菌可视基因芯片筛查方法研究[J].农业生物技术学报,2013,21(001):120-126；张永江,马荣群,辛言言,等.烟草花叶病毒属条形码鉴定方法的建立[J].湖北农业科学,2015,54(11):4；等中公开，公众可以从中国检验检疫科学研究院获取，用于重复本发明的实验。

实施例1、引物的设计与合成

参考现有文献和Genbank中已报道的序列，筛选和设计多重RT-PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus，WMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、瓜类果斑病菌(acidovorax citrulli，AC)，可特异地获得目标片段，且各目标片段可以用琼脂糖凝胶电泳清晰地区分开。最终，设计选取了针对TMV基因(参考序列GenBank：NC_001367.1)、ZYMV基因(参考序列GenBank：NC_003224.1)、WMV基因(参考序列GenBank：KU246036)、CGMMV基因(参考序列GenBank：D12505)、CMV基因(参考序列GenBank：KM527392)、AC基因(参考序列GenBank：MG655621.1)的6对引物。为减少假阳性的产生，以瓜类基因组EF1-α基因(参考序列CuGenDB：CsaV3_6G021670)作为内标基因，也设计了1对引物，具体引物序列如下所示。

用于特异性RT-PCR检测烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的引物对Ⅰ：

tmv-f:5’-tcggattcgttttaaatatgtctt-3’(序列1)

tmv-r:5’-aacgacagttcgagcttg-3’(序列2)

用于特异性rt-pcr检测小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus，zymv)的引物对ⅱ：

zymv-f:5’-tgccgaggtatggtttgct-3’(序列3)

zymv-r:5’-tgccgttcagtgtcttcg-3’(序列4)

用于特异性rt-pcr检测西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus，wmv)的引物对ⅳ：

wmv-f:5’-ctgaaagtccgtatatgccta-3’(序列5)

wmv-r:5’-gacccgaaatgctaactgtga-3’(序列6)

用于特异性rt-pcr检测黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,cgmmv)的引物对ⅲ：

cgmmv-f:5’-gcttcttatgttcccgtc-3’(序列7)

cgmmv-r:5’-tctgaccagactaccgaa-3’(序列8)

用于特异性rt-pcr检测黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)的引物对ⅴ：

cmv-f:5’-ggacaaatctgaatcaacca-3’(序列9)

cmv-r:5’-aatatcagcgcgcatcg-3’(序列10)

用于特异性rt-pcr检测瓜类果斑病菌(acidovorax citrulli)的引物对ⅵ：

ac-f:5’-ccacacttatcggttgttggaa-3’(序列11)

ac-r:5’-ttatcgcaggctatcacgtct-3’(序列12)

为了减少假阳性的产生，加入了更加特异的ef1-α为内参基因。所述引物组合中还包括用于特异性rt-pcr检测内参基因ef1-α的引物对ⅶ：

ef1-α-f:5’-gttattggccatgtcgact-3’(序列13)

ef1-α-r:5’-tcgtggtgcatttcaacagac-3’(序列14)

其中TMV的扩增产物为序列15所示的大小为152bp的核苷酸序列、ZYMV的扩增产物为序列16所示的大小为205bp的核苷酸序列、WMV的扩增产物为序列17所示的大小为318bp的核苷酸序列、CGMMV的扩增产物为序列18所示的大小为419bp的核苷酸序列、CMV的扩增产物为序列19所示的大小为529bp的核苷酸序列、AC的扩增产物为序列20所示的大小为662bp的核苷酸序列，EF1-α的扩增产物为序列21所示的大小为821bp的核苷酸序列。

实施例2、多重RT-PCR特异性试验

以本发明的引物组合物为引物，分别以烟草花叶病毒阳性样品、小西葫芦黄花叶病毒阳性样品、西瓜花叶病毒阳性样品、黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性样品、黄瓜花叶病毒阳性样品和瓜类果斑病菌阳性样品的混合物、烟草花叶病毒阳性样品、小西葫芦黄花叶病毒阳性样品、西瓜花叶病毒阳性样品、黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性样品、黄瓜花叶病毒阳性样品以及瓜类果斑病菌阳性样品为模板，以ddH₂O代替模板作为阴性对照，使用常规RT-PCR体系进行特异性实验，结果如图1所示，图1为RT-PCR特异性试验的结果，其中，M：DNA 100bpLadder；泳道1:RT-PCR检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物的等比例混合物；泳道2-7：RT-PCR分别检测TMV、ZYMV、WMV、CGMMV、CMV、AC、EF1-α的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。从图1可以看出，选取的引物可以清晰、特异的单一条带的，扩增产物间分离清晰，各引物之间无明显的干扰(图1)，扩增条带经送测序公司测序比对后确认目的扩增产物，可以进行多重RT-PCR体系的建立。

实施例3、瓜类病毒和细菌多重RT-PCR体系的建立

1、多重RNA体系的建立

以实施例2中的混合样品的RNA为模板，在单一病毒检测常规RT-PCR的基础上建立了多重RT-PCR体系，总体系为20μL。经过正交实验确定了引物的最终浓度，正交试验中使用的不同引物浓度和配比组合详见表1，(图2)分别为TMV正向引物(10μM)0.2μL、10μM TMV反向引物(10μM)0.2μL、10μM ZYMV正向引物(10μM)0.2μL、10μM ZYMV反向引物(10μM)0.2μL、10μM WMV正向引物(10μM)0.1μL、10μM WMV反向引物(10μM)0.1μL、10μM CGMMV正向引物(10μM)0.4μL、10μM CGMMV反向引物(10μM)0.4μL、10μM CMV正向引物(10μM)0.2μL、10μM CMV反向引物(10μM)0.2μL、10μM AC正向引物(10μM)0.2μL、10μM AC反向引物(10μM)0.2μL、10μMEF1-α正向引物(10μM)0.4μL、10μM EF1-α反向引物(10μM)0.4μL。正交试验中使用的不同引物浓度和配比组合详见表1，试验结果如图2所示。图2中为为不同引物浓度配比对多重RT-PCR结果的影响，其中M：DNA 100bp Ladder；泳道1-7：引物浓度组合1-7的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH₂O代替模板。从图2中可以看出，泳道4中的条带最为清晰，效果最好，故而泳道4中的对应的浓度组合4为最优浓度组合。

表1.不同引物浓度配比的筛选

2、优化多重RT-PCR体系反应条件

在步骤1中浓度组合4的实验中，分别设定退火温度依次为49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃，其他实验条件不变，进行多重RT-PCR温度梯度优化，试验结果如图3所示，从图3中可以看出，综合各引物对简的退火温度，最终选择55℃。

在步骤1中浓度组合4的实验中，分别设定20、25、30、35、40、45六个梯度的循环数，其他实验条件不变，进行多重RT-PCR循环数梯度的优化，试验结果如图4所示，结果显示35个循环以上都可以得到较好的扩增，结合扩增效率，最终选择35个循环。

在步骤1中浓度组合4的实验中，分别设定延伸时间30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒七个梯度延伸时间，其他实验条件不变，进行多重RT-PCR延伸时间的优化，试验结果如图5所示，结果显示延伸60秒以上都可以得到较好的扩增，最终选择延伸60秒。

结合上述优化实验，最终确定多重RT-PCR反应条件为：50℃30分钟；94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。

3、检测与结果判定

取6μL反应产物经1.5％琼脂糖凝胶(凝胶中预先按1:10000比例添加GelRed核酸凝胶染料)在1×TAE缓冲液中130V电泳45min，然后于凝胶成像系统中观察，若于152bp处有条带，表明烟草花叶病毒为阳性；若于205bp处有条带，表明小西葫芦黄花叶病毒为阳性；若于318bp处有条带，表明西瓜花叶病毒为阳性；若于419bp处有条带，表明黄瓜绿斑驳花叶病毒为阳性；若于529bp处有条带，表明黄瓜花叶病毒为阳性；若于662bp处有条带，表明瓜类果斑病菌为阳性。

在使用上述条件的得到的引物组合物进行植物样品的检测时，可以按照下述方法进行植物样品的取样和提取总RNA

取样方法：为使所建立的多重RT-PCR技术有更广泛的适用性，根据病毒和细菌在瓜类植株内的分布特点，确定种子、叶片、茎秆、花、果实与根系均可以作为取样部位。所有取样部位均可以直接研磨提取植物总RNA。

提取总RNA方法：采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取植物总RNA，具体操作步骤按操作指南：

称取新鲜植物组织样品0.5-0.1g装入2mL EP管中，液氮冰冻后，用研磨仪研磨成粉状，加入500μL裂解液SL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)，立即涡旋剧烈震荡混匀。12,000rpm(～13,400×g)离心2min。

将上清液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。注意：如果上清液体积有损失，请相应调整乙醇的加量。

向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD缓冲液，轻柔混匀。

向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。

向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

重复上一步骤。

12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液，-20℃保存备用。

实施例4、瓜类病毒和细菌多重RT-PCR中非特异扩增验证

以实施例2中烟草花叶病毒阳性样品、小西葫芦黄花叶病毒阳性样品、西瓜花叶病毒阳性样品、黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性样品、黄瓜花叶病毒阳性样品以及瓜类果斑病菌阳性样品为模板的单一扩增产物为模板，通过TA克隆方法连入19-T(Takara生物公司)载体中，按质粒提取试剂盒说明书(擎科生物)提取质粒，并送测序验证，构建为/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-CMV、19-T-AC、/>19-T-EF1-α。以提取的质粒分别混合为模板，模仿病原物在田间复合侵染的可能的复杂情况，模板组合分别1：含有/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-CMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道2：含有/>19-T-ZYMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、19-T-CMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道3：含有/>19-T-TMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-CMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道4：含有/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-CMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道5：含有19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道6：含有/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-AC、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道7：含有/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、19-T-CMV、/>19-T-EF1-α的混合物；泳道8：含有/>19-T-TMV、/>19-T-ZYMV、/>19-T-WMV、/>19-T-CGMMV、/>19-T-CMV、/>19-T-AC的混合物。扩增体系：模板1μL，/>Master Mix 12.5μL，10μM TMV-F 0.2μL、10μMTMV-R 0.2μL、10μM ZYMV-F 0.2μL、10μM ZYMV-R 0.2μL、10μM WMV-F 0.1μL、10μM WMV-R0.1μL、10μM CGMMV-F 0.4μL、10μM CGMMV-R 0.4μL、10μM CMV-F 0.2μL、10μM CMV-R 0.2μL、10μM AC-F 0.2μL、10μM AC-R 0.2μL、10μM EF1-α-F 0.4μL、10μM EF1-α-R 0.4μL、ddH₂O7.7μL；反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。结果如图6所示，图6中，试验结果可以看出，在复合侵染的情况下，所建立的技术都可以特异、清晰地检测出目的病毒和细菌，且未出现非特异性扩增现象(图6)。

实施例5、瓜类病毒和细菌多重RT-PCR体系灵敏度试验

将实施例2中的阳性样品混合，按照实施例3的方法提取总RNA，将提取的总RNA按十倍浓度梯度进行稀释，然后将稀释后的样品各取4μL模板进行多重RT-PCR检测，确定检测灵敏度。结果如图7所示，从图7中可以看出，多重PCR的检测灵敏度为10^-3，即达到了常规单一PCR检测灵敏度，足以满足检测的需要。

实施例6、瓜类病毒和细菌多重RT-PCR体系特异性验证

以本实验保存的其它瓜类病毒和细菌样品为模板，使用实施例2种建立的多重RT-PCR体系对其进行扩增，以验证该扩增体系是否会被其它病毒和细菌干扰，结果如图8所示，建立的多重RT-PCR体系不受其它病毒和细菌的干扰。

实施例7、瓜类病毒和细菌多重RT-PCR体系检测待测植物样本

以各地送检的瓜类种子和叶片样本为材料，详见表2，提取总RNA为模板，验证所建立的多重RT-PCR技术的可行性。

提取总RNA、多重RT-PCR体系及优化的RT-PCR反应条件同实施例2的描述。结果表明检测结果达到了非常好的效果(图9)。

表2参试样品情况

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcggattcgt tttaaatatg tctt 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacgacagtt cgagcttg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgccgaggta tggtttgct 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgccgttcag tgtcttcg 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgaaagtcc gtatatgcct a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacccgaaat gctaactgtg a 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttcttatg ttcccgtc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctgaccaga ctaccgaa 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggacaaatct gaatcaacca 20

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatatcagcg cgcatcg 17

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccacacttat cggttgttgg aa 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttatcgcagg ctatcacgtc t 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttattggcc atgtcgact 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcgtggtgca tttcaacaga c 21

<210> 15

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcggattcgt tttaaatatg tcttacagta tcactactcc atctcagttc gtgttcttgt 60

catcagcgtg ggccgaccca atagagttaa ttaatttatg tactaatgct ttaggaaatc 120

agtttcaaac acaacaagct cgaactgtcg tt 152

<210> 16

<211> 205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgccgttcag tgtcttcgct agtggtggca acatttccat caaggccaaa caaccttgaa 60

gaaacattgc taagagccgc tgctttcatc tgcgcaacag cttcacgggc tctttcggga 120

gttttagaat tgacttcgta gaagtcgaag gcatatcggg ctaaactcct atcccgtagg 180

tttcgaagca aaccatacct cggca 205

<210> 17

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgaaagtcc gtatatgcct agatacggat tactaagaaa tttgagagac agggaattag 60

cacgttatgc ttttgacttc tatgaggtta cttctaaaac accaaatagg gcaagagaag 120

caatagcaca aatgaaggcc gcagctctcg cgggaattaa cagcaggtta tttggacttg 180

atggtaatat ctcgaccaat tccgaaaata ctgagaggca cactgcaagg gacgtaaatc 240

agaatatgca tactttgttg ggtatgggtt caacgcagta aagactaagt aaactggtca 300

cagttagcat ttcgggtc 318

<210> 18

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcttcttatg ttcccgtcag gactttactt aattttctag ttgcttcaca aggtaccgct 60

ttccagactc aagcgggaag agattctttc cgcgagtccc tgtctgcgtt accctcgtct 120

gtcgtagata ttaattctag attcccagat gcgggttttt acgctttcct caacggtcct 180

gtgttgaggc ctatcttcgt ttcgcttctc agctccacgg atacgcgtaa tagggtcatt 240

gaggttgtag atcctagcaa tcctacgact gctgagtcgc ttaacgctgt aaagcgtact 300

gatgacgcgt ctacagccgc tagggccgag atagataatt taatagagtc tatttctaag 360

ggttttgatg tttacgatag ggcttcattt gaagccgcgt tttcggtagt ctggtcaga 419

<210> 19

<211> 529

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggacaaatct gaatcaacca gtgctggtcg taaccgtcga cgtcgtccgc gtcgtggttc 60

ccgctccgcc tcctcctccg cggatgctaa ctttagagtc ttgtcgcagc agctttcgcg 120

acttaataag acgttggcag ctggtcgtcc aactattaac cacccaacct ttgtagggag 180

tgaacgctgt agacctgggt acacgttcac atctattacc ctaaggccac caaaaataga 240

ccgtgggtct tattacggta aaaggttgtt actacctgat tcagtcacgg aatatgataa 300

gaagcttgtt tcgcgcattc aaattcgagt taatcctttg ccgaaatttg attctaccgt 360

gtgggtgaca gtccgtaaag ttcttgcctc ctcggactta tccgttgccg ccatctctgc 420

tatgttcgcg gacggagcct caccggtact ggtttatcaa tatgccgcat ctggagtcca 480

aaccaacaat aaattgttgt gtgatctttc ggcgatgcgc gctgatatt 529

<210> 20

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccacacttat cggttgttgg aagaagtcgg tgctaaccga catgggtctg tagctcagct 60

ggttagagca ccgtcttgat aaggcggggg tcgttggttc gagcccaact agacccacca 120

aatcttccga acataagatg cgaggatcag tgggggatta gctcagctgg gagagcacct 180

gctttgcaag cagggggtcg tcggttcgat cccgtcatcc tccaccaacc aatacgctct 240

gcggtagggc gaagaaacca acaccaaagc ggcttcgcga gaggcctctt tgttgttggt 300

ccggtataga ccggatcaat cggctgttct ttaaaaattc atagagtcga atcagcgttg 360

ccggcggaaa gcaggaaact gcaccgtgcc gccggtgaca aaaatttgat tgcgtcaaaa 420

cgaatattca attgagcgaa agcttgttga aattcagtaa tgacgaattg ttctctaggt 480

agcaataccg aagaagaatt cacattacgg cataacgcgc gaggtgaaag acctcgcaag 540

tccttgaaag aaagcggaga tgtctcgcaa gagatgtcaa ggttataggg tcaagtgact 600

aagagcatgt ggtggatgcc ttggcgatga taggcgacga aagacgtgat agcctgcgat 660

aa 662

<210> 21

<211> 821

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgtggtgca tttcaacaga cttaacttca gtggtcagtc cagttggtcc gaaggtaaca 60

accataccag gcttgaggac accagtttca acacgtccaa cagggacagt tccaatacca 120

ccaatcttgt aaacgtcctg aagtgggaga cggaggggct tgtctgaggg cctcttgggc 180

tcagagatca agtcaagagc ctcaagaagg gttggtccct tgtaccaatc aaggttggtg 240

gacctctcaa tcatgttgtc accctcgaaa ccagagatgg gaacgaaggg gattttgtct 300

gggttgtatc cgaccttctt gaggtatgat gagacttcct tcacaatttc atcgtacctt 360

gccttggagt atttgggtgt ggtggcatcc atcttgttgc agcagcagat catttgcttg 420

acaccaaggg tgaaagcaag aagagcgtgc tcacgggtct gaccatcctt ggaaatacca 480

gcctcaaaac caccagtggt ggagtcaata atgaggacag cacagtcagc ctgtgaggtt 540

ccagtaatca tgttcttgat aaagtcacga tgtccgggag catcaatgac tgtgcagtag 600

tacttggtgg tctcaagctt ccacagggca atgtcaatgg taataccacg ttcacgctct 660

gccttaagtt tgtcgagcac ccaagcatac ttgaatgacc tcttgttcat ctcagcggct 720

tccttctcga atctctcaat cacacgcttg tcaatcccac caagcttgta gataagatga 780

ccagtggtgg tcgactttcc agagtcgaca tggccaataa c 821

Claims

1.用于鉴定六种瓜类病毒细菌的成套引物对，由特异引物对A、特异引物对B、特异引物对C、特异引物对D、特异引物对E、特异引物对F和特异引物对G组成；

所述特异引物对A由引物TMV-F和引物TMV-R组成；

所述特异引物对B由引物ZYMV-F和引物ZYMV-R组成；

所述特异引物对C由引物WMV-F和引物WMV-R组成；

所述特异引物对D由引物CGMMV-F和引物CGMMV-R组成；

所述特异引物对E由引物CMV-F和引物CMV-R组成；

所述特异引物对F由引物AC-F和引物AC-R组成；

所述特异引物对G由引物EF1-α-F和引物EF1-α-R组成。

所述引物TMV-F为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述引物TMV-R为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述引物ZYMV-F为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述引物ZYMV-R为如下b3)或b4)：

b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；

所述引物WMV-F为如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；

所述引物WMV-R为如下c3)或c4)：

c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；

所述引物CGMMV-F为如下d1)或d2)：

d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；

所述引物CGMMV-R为如下d3)或d4)：

d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；

所述引物CMV-F为如下e1)或e2)：

e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；

所述引物CMV-R为如下e3)或e4)：

e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；

所述引物AC-F为如下f1)或f2)：

f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；

所述引物AC-R为如下f3)或f4)：

f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；

所述引物EF1-α-F为如下g1)或g2)：

g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；

所述引物EF1-α-R为如下b3)或b4)：

g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；

2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：

所述引物TMV-F、所述引物TMV-R、所述引物ZYMV-F、所述引物ZYMV-R、所述引物WMV-F、所述引物WMV-R、所述引物CGMMV-F、所述引物CGMMV-R、所述引物CMV-F、所述引物CMV-R、所述引物AC-F、所述引物AC-R、所述引物EF1-α-F和所述引物EF1-α-R的摩尔比为2:2:2:2:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4。

3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下h1)-h8)中任一所述的应用：

h1)制备用于鉴定六种瓜类病毒细菌的产品；

h2)鉴定六种瓜类病毒细菌；

h4)鉴定待测病原物是否为六种瓜类病毒细菌；

h5)制备用于鉴别六种瓜类病毒细菌的产品；

h6)鉴别六种瓜类病毒细菌；

h8)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；

4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；

所述试剂盒的功能为如下i1)-i4)中任一种：

i1)鉴定六种瓜类病毒细菌中的至少一种；

i2)鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌；

i3)鉴别六种瓜类病毒细菌；

i4)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；

5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下(Ⅰ)或(Ⅱ)的步骤：

(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；

(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。

6.一种鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测病原物的RNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

7.一种鉴别六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测病毒的RNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

8.一种检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测样品的RNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；

9.权利要求1中所述的特异引物对A或权利要求1中所述的特异引物对B或权利要求1中所述的特异引物对C或权利要求1中所述的特异引物对D或权利要求1中所述的特异引物对E或权利要求1中所述的特异引物对F或权利要求1中所述的特异引物对G。

10.如下n1)-n21)任一所述的应用：

n1)权利要求1中所述的特异引物对A在制备用于检测烟草花叶病毒的产品中的应用；

n2)权利要求1中所述的特异引物对A在鉴定烟草花叶病毒中的应用；

n3)权利要求1中所述的特异引物对A在鉴定待测病毒是否为烟草花叶病毒中的应用；

n4)权利要求1中所述的特异引物对B在制备用于检测小西葫芦黄花叶病毒的产品中的应用；

n5)权利要求1中所述的特异引物对B在鉴定小西葫芦黄花叶病毒中的应用；

n6)权利要求1中所述的特异引物对B在鉴定待测病毒是否为小西葫芦黄花叶病毒中的应用。

n7)权利要求1中所述的特异引物对C在制备用于检测西瓜花叶病毒的产品中的应用；

n8)权利要求1中所述的特异引物对C在鉴定西瓜花叶病毒中的应用；

n9)权利要求1中所述的特异引物对C在鉴定待测病毒是否为西瓜花叶病毒中的应用；

n10)权利要求1中所述的特异引物对D在制备用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的产品中的应用；

n11)权利要求1中所述的特异引物对D在鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用；

n12)权利要求1中所述的特异引物对D在鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用；

n13)权利要求1中所述的特异引物对E在制备用于检测黄瓜花叶病毒的产品中的应用；

n14)权利要求1中所述的特异引物对E在鉴定黄瓜花叶病毒中的应用；

n15)权利要求1中所述的特异引物对E在鉴定待测病毒是否为黄瓜花叶病毒中的应用；

n16)权利要求1中所述的特异引物对F在制备用于检测瓜类果斑病菌的产品中的应用；

n17)权利要求1中所述的特异引物对F在鉴定瓜类果斑病菌中的应用；

n18)权利要求1中所述的特异引物对F在鉴定待测细菌是否为瓜类果斑病菌中的应用；

n19)权利要求1中所述的特异引物对G在制备用于检测瓜类内参基因的产品中的应用；

n20)权利要求1中所述的特异引物对G在检测瓜类内参基因中的应用；

n21)权利要求1中所述的特异引物对G在鉴定待测基因是否为瓜类内参基因中的应用。