CN113403429B - 同时检测辣椒三种rna病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT‑PCR引物组，引物对TMGMV‑F和TMGMV‑R为检测烟草轻型绿花叶病毒的引物，引物对CFEV1‑F和CFEV1‑R为检测小米椒内源RNA病毒1的引物，引物对PCV2‑F和PCV2‑R为检测辣椒潜隐病毒2的引物；本发明还公开了使用该多重RT‑PCR引物组检测辣椒三种RNA病毒的方法，通过一次RT‑PCR反应来检测植株是否感染上述三种病毒。本发明用三重RT‑PCR检测三种辣椒病毒即烟草轻型绿花叶病毒、小米椒内源RNA病毒1和辣椒潜隐病毒2，与目前单重RT‑PCR和双重RT‑PCR检测方法相比，用一次RT‑PCR反应可检测三种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。

Description

同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum)已成为我国第一大的蔬菜产业，其播种面积在蔬菜作物中位居第一，年产值约2500亿元(王立浩等，2019)。长期以来，我国辣椒病毒病发生十分普遍，且有逐年加重的趋势，严重影响辣椒的产量、品质和经济效益(汪沛等，2015；于海龙等，2020)。目前已知侵染辣椒的病毒有60种以上(Kenyon et al.，2014)，仅我国报道的已达33种，大部分为单链RNA(single strand RNA，ssRNA)病毒，少数为单链(single strand DNA，ssDNA)病毒和双链RNA(double strand RNA，dsRNA)病毒(Kenyon et al.，2014；Ruan，2012；Roossinck，2010)。大多数常见的病毒种类如黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)等3大ssRNA病毒属中的病毒已有较多的研究。
烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus，TMGMV)是Tobamovirus成员之一，是该属在辣椒上发生和危害报道较多的病毒之一，主要侵染辣椒外，番茄和茄子等重要茄科蔬菜都是TMGMV的自然寄主。感染TMGMV的辣椒植株表现出叶片畸形、斑驳、花叶和植株矮化等症状，造成辣椒产量下降，品质降低。近年来，随着国内外辣椒品种的引进和交流的发展、栽培制度及气候条件的变化，各地病毒种类也在发生变化。同时，随着病毒检测手段的日益发展，许多新的病毒种类逐渐被发现。
小米椒内源RNA病毒1(Capsicum frutescens endornavirus 1，CFEV 1)是内源RNA病毒科(Endornaviridae)内源RNA病毒属(Endornavirus)的一种ssRNA病毒，在辣椒上还发现另外2种内源RNA病毒即甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)和辣椒内源RNA病毒(Hot pepper endornavirus，HPEV)(Pfeiffer，1998；Safari&Roossinck，2018))。今年本研究团队已经在中国广西辣椒上发现CFEV 1，这之前在我国的辣椒上没见报道，为首次发现。与大多数内源RNA病毒相似，CFEV 1侵染寄主后表面上不会引起寄主任何症状，能够和寄主以慢性持久性方式共生。但现在已经从Endornaviridae中也发现一些内源RNA病毒成员能够对寄主产生影响，如内源RNA病毒VfEV可能与蚕豆细胞质雄性不育性有关，HmEV1-670可以减轻致病菌紫纹羽病菌的毒力，水稻寄主的RNA沉默通路能够识别水稻内源病毒OsEV的RNA，沉默途径中的关键酶OsDCL2的缺失可以影响OsEV的传播和维持。这些报道从深层次说明了此类病毒与寄主之间存在相互作用，并可以在寄主体内产生一定的影响。
辣椒潜隐病毒2(Pepper cryptic virus 2,PCV 2)是一种dsRNA病毒，属于双分体病毒科(Partitiviridae)丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)的典型成员，通过种子和花粉传播。PCV-2基因组包含两条dsRNA，其中dsRNA1编码依赖于RNA的RNA聚合酶RdRp，dsRNA2编码外壳蛋白(coat protein，CP)，每个dsRNA被单独包被成直径约30nm的病毒粒子。美国、韩国、土耳其、多米尼加、印度以及我国的江西、重庆、广东、山东和广西均有PCV 2侵染辣椒的报道(Liu et al.，2015；Saritha et al.，2016；Sun et al.，2017)。
在生产和育种中迫切需要辣椒病毒病原检测相关研究作指导，以促进病毒病的防控、抗病育种等方面研究工作的发展。传统的病毒检测和鉴定方法有生物学方法、电镜法、血清学法、反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR，即RT-PCR)法等。其中，生物学方法耗时耗力、灵敏度差，不同病毒侵染后也常常表现出相似症状而影响鉴定的准确性；电镜法需要昂贵的仪器，操作方法不易掌握，且对病毒属以下的分类不能判定；血清学法容易出现假阴性或假阳性，且试剂盒的成本高。RT-PCR法具有灵敏度高、快速、特异性较强等其它检测方法所不能比拟的优点，已成为当前植物病毒病检测的首选方法。目前，辣椒病毒单重RT-PCR检测研究较多，而多重RT-PCR研究仍然较少。生产实际中往往是多种病毒复合侵染植株，通过多重RT-PCR法同时检测多种病毒，可在短时间内检测大量样本，大大提高了检测效率，也大幅降低了检测成本。虽然国内外对辣椒上的常见病毒开发出了一些多重检测方法，然而针对TMGMV，CFEV 1，PCV-2这三种病毒的多重RT-PCR检测技术没有报道过。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种高效的、同时检测辣椒中三种RNA病毒的三重RT-PCR检测引物及方法。针对辣椒的3种病毒，即烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)、小米椒内源RNA病毒1(CFEV 1)和辣椒潜隐病毒2(PCV 2)，根据Genebank发布的这三种病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计引物，建立一个简单、高效、灵敏的三重RT-PCR检测技术体系以同时检测这三种病毒。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组，引物对TMGMV-F和TMGMV-R为检测烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)的引物，产物片段大小为523bp；引物对CFEV1-F和CFEV1-R为检测小米椒内源RNA病毒1(CFEV 1)的引物，片段大小为865bp；引物对PCV2-F和PCV2-R为检测辣椒潜隐病毒2(PCV 2)的引物，片段大小为717bp；具体如下：
TMGMV-F：3’-TTCCGCTTATGCAGATCCTGT-5’，如SEQ ID NO.1所示；
TMGMV-R：3’-GACGAACAACCACTGCTGAT-5’，如SEQ ID NO.2所示；
CFEV1-F：3’-TTTCCAACACCGTGGACCAT-5’，如SEQ ID NO.3所示；
CFEV1-R：3’-ACAGGGACGAGTGCATTGAG-5’，如SEQ ID NO.4所示；
PCV2-F：3’-CACGTGTGAGGGCATTTGAC-5’，如SEQ ID NO.5所示；
PCV2-R：3’-GTCCGACACCGTATGCCTTT-5’，如SEQ ID NO.6所示。
包含上述引物组的试剂或试剂盒。
采用如上所述的引物组检测辣椒TMGMV、CFEV1和PCV2三种病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下操作步骤：
(1)提取带病毒症状的辣椒组织的总RNA，反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用如上所述的引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
优选地，步骤(1)中选择田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片提取其总RNA。
优选地，所述PCR的反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板1.5μL、烟草轻型绿花叶病毒正向引物和反向引物各0.5μL、小米椒内源RNA病毒1正向引物和反向引物各0.3～0.4μL辣椒潜隐病毒2正向引物和反向引物各0.4～0.5μL、超纯水补至所需体积。
优选地，PCR的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火25～30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸共32个循环，最后72℃2min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明用三重RT-PCR检测3种辣椒RNA病毒即烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)、小米椒内源RNA病毒1(CFEV 1)和辣椒潜隐病毒2(PCV 2)，与目前单重RT-PCR和双重RT-PCR检测方法相比，用一次RT-PCR反应可检测3种病毒，检测的病毒种类增多，检测效率进一步提高，检测的成本显著降低。
附图说明
图1是本发明引物组同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR及各病毒单重PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例1
引物设计
根据Genebank发布的烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)、小米椒内源RNA病毒1(CFEV1)和辣椒潜隐病毒2(PCV 2)这3种辣椒病毒全基因组或部分序列的保守序列设计PCR引物，为了使设计出的引物能够用于多重RT-PCR反应，且能达到最佳PCR扩增效率，发明人对引物的长度、碱基、特异性、二级结构等进行了综合设计，最终得到了3对引物(见表1)，其中引物对TMGMV-F和TMGMV-R为检测烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)的引物，产物片段大小为523bp；引物对CFEV1-F和CFEV1-R为检测小米椒内源RNA病毒1(CFEV 1)的引物，片段大小为865bp；引物对PCV2-F和PCV2-R为检测辣椒潜隐病毒2(PCV 2)的引物，片段大小为717bp。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
表1三重RT-PCR检测辣椒RNA病毒的引物及其检测的病毒
采用同时检测辣椒三种病毒的多重RT-PCR引物组检测辣椒中TMGMV、CFEV1和PCV2三种病毒的多重RT-PCR检测方法，具体操作步骤如下：
(1)辣椒植株叶片RNA的提取：取田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片，液氮中保存，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，反转录过程如下：
①配制反转录变性反应混合液(10.0μL)：Oligo dT Primer(50μM)1.0μL、dNTPMixture(10mM each)1.0μL、模板总RNA 1.0μg，用去RNase超纯水补至10.0μL；
②变性：65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
③配制反转录反应液：向上述变性后的混合液(10.0μL)中分别加入5×反应缓冲液4.0μL、RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL、反转录酶(200U/μL)1.0μL，用去RNase超纯水补至20.0μL，缓慢混匀，配制成反转录反应液；
④反转录反应。反应条件为：42℃温浴1h；95℃ 5min；冰上冷却；
(2)以步骤(1)反转录后得到的cDNA为模板，用如上所述的3对引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
在设计PCR扩增反应体系和反应程序时，为了达到最佳PCR扩增效率，发明人根据模板的类型(cDNA或DNA)和引物组的特点，设计了最佳反应体系和反应程序的各阶段(包括变性、退火、延伸等)最佳参数、循环次数等，具体的反应体系和反应程序如下：
PCR的反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板1.5μL、烟草轻型绿花叶病毒正向引物和反向引物各0.5μL、小米椒内源RNA病毒1正向引物和反向引物各0.3μL辣椒潜隐病毒2正向引物和反向引物各0.4μL、超纯水补至所需体积；
PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火28s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸共32个循环，最后72℃ 2min；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据产物片段大小及阳性对照(图1)，判断病毒感染情况。
图1中，泳道1和3是DNA Marker2000，泳道2、4、5和6的模板都含有三种病毒(TMGMV、CFEV1和PCV2)，泳道2是使用3对引物进行三重RT-PCR扩增的产物，泳道4是使用引物PCV2-F和PCV2-R进行单重PCR扩增的产物，泳道5是使用引物TMGMV-F和TMGMV-R进行单重PCR扩增的产物，泳道6是使用引物CFEV1-F和CFEV1-R进行单重PCR扩增的产物。
从图1中可以看出，在本次检测过程中，泳道1同时检测出辣椒具有TMGMV、CFEV1和PCV2三种病毒，而泳道4、5、6均只用1对引物进行单重PCR扩增，虽然模板中含有3种病毒的cDNA，但也只能检测到1种病毒。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组及其方法
<130> JC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ttccgcttat gcagatcctg t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gacgaacaac cactgctgat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tttccaacac cgtggaccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
acagggacga gtgcattgag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cacgtgtgag ggcatttgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gtccgacacc gtatgccttt 20

Claims (6)

1.一种同时检测辣椒三种RNA病毒的多重RT-PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括：
检测烟草轻型绿花叶病毒的引物对TMGMV-F和TMGMV-R，PCR产物片段大小为523bp；检测小米椒内源RNA病毒1的引物对CFEV1-F和CFEV1-R，PCR产物片段大小为865bp；检测辣椒潜隐病毒2的引物对PCV2-F和PCV2-R，PCR产物片段大小为717bp；具体如下：
TMGMV-F：3’-TTCCGCTTATGCAGATCCTGT-5’，如SEQ ID NO.1所示；
TMGMV-R：3’-GACGAACAACCACTGCTGAT-5’，如SEQ ID NO.2所示；
CFEV1-F：3’-TTTCCAACACCGTGGACCAT-5’，如SEQ ID NO.3所示；
CFEV1-R：3’-ACAGGGACGAGTGCATTGAG-5’，如SEQ ID NO.4所示；
PCV2-F：3’-CACGTGTGAGGGCATTTGAC-5’，如SEQ ID NO.5所示；
PCV2-R：3’-GTCCGACACCGTATGCCTTT-5’，如SEQ ID NO.6所示。
2.一种包含如权利要求1所述多重RT-PCR引物组的试剂或试剂盒。
3.一种采用如权利要求1所述的多重RT-PCR引物组检测辣椒烟草轻型绿花叶病毒、小米椒内源RNA病毒1及辣椒潜隐病毒2三种病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)提取带病毒症状的辣椒组织的总RNA，反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据产物片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
4.根据权利要求3所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：步骤(1)中选择田间带病毒症状的辣椒幼嫩叶片提取其总RNA。
5.根据如权利要求3所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系25.0μL，包括2×Taq PCR Mix反应液12.5μL、cDNA模板1.5μL、烟草轻型绿花叶病毒正向引物和反向引物各0.5μL、小米椒内源RNA病毒1正向引物和反向引物各0.3～0.4μL辣椒潜隐病毒2正向引物和反向引物各0.4～0.5μL、超纯水补至所需体积。
6.根据如权利要求3所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，PCR的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火25～30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸共32个循环，最后72℃2min。
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