CN114015807A - 三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法，该方法以染毒三七叶片的cDNA为模板，以PCV4‑cp‑F和PCV4‑cp‑R为引物进行PCR扩增，获得重组质粒标准品pGEM‑T‑PCV4，制备一系列浓度梯度的重组质粒标准品，并以重组质粒标准品为模板，采用特异性引物PCV4‑QF和PCV4‑QR进行实时荧光定量PCR，以不同浓度的质粒标准品的Ct值构建标准曲线；待测样品按照相同条件进行实时荧光定量PCR，通过比对Ct值与标准曲线，实现三七中人参潜隐病毒4的定量检测；该方法具有快速简单、灵敏度高、特异性强等优点，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
近年来，植物病毒病在世界各国的危害日趋严重，所发现和报道的病毒种类日益增多。而植物病毒的检测与鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础工作，也是植物病毒分类学研究的一个重要环节。在上个世纪早期，植物病毒的鉴定与分类主要根据寄主范围、症状及介体传播方式等生物学性状；后来，理化特性分析及血清学技术广泛应用于植物病毒的鉴定与分类研究。随着分子生物学的迅速发展，许多分子生物学技术被应用于植物病毒的检测鉴定，给病毒分类鉴定提供了丰富可靠的技术。近年来，病毒的检测技术不断发展进步，诊断、检测植物病毒的方法越来越多，已形成一个系统的体系。
三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]是五加科人参属多年生药用草本植物，具有定痛消肿、止血散淤、抗癌、抗高血压、提高免疫力和保护心脑血管等多种功效，被广泛用作临床药物和滋补产品。三七主产于云南文山州，随着近年来三七产业的快速发展，在大规模生产中面临的一些问题也随之而来，其中三七病毒病的日益严重，对三七的产量和质量造成了严重影响。据报道，感染三七的病毒包括黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaicvirus, CMV）、番茄花叶病毒（Tomato masaic virus, ToMV）、番茄斑驳病毒（Tomatospotted wilt virus, TSWV）、三七Y病毒（Panax virus Y, PnVY）、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）及其卫星（Tomato yellow leafcurl China betasatellite, TYLCCNB）、三七A病毒（Panax notoginseng virus A, PnVA）及烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）等多种病毒。此外，还有学者将三七病毒病分为皱缩型、麻点叶斑型、褪绿型、花叶型、驴耳型、丛顶型、复合型等7个类型（陈昱君, 王勇, 杨建忠, 等. 三七皱缩型病毒病与环境因子的关系研究.现代农业科技,2014, 16: 108-109）。病毒感染三七后，病株株高、茎粗、叶长、叶宽、单株鲜重均明显减少，个别三七园会出现整体毁园现象。而目前由于生产上使用带病种子（苗），病健植株混合采挖、运输和收储，以及现有商品化病毒病药剂数量少、防效差等因素，使得三七病毒病的危害呈蔓延之势。
陈燕芳等通过寄主范围测定、电镜观察和血清学检测等方法对三七病毒病进行鉴定（陈燕芳, 金羽, 李桂芬, 等.三七病毒病鉴定初报.植物检疫, 2004(04): 212-213）。金羽等分别利用生物学、血清学以及分子生物学方法来鉴定三七病毒病病原（金羽. 三七病毒病病原的初步研究.东北农业大学, 2005）。此外，杨馨等利用PCR/RT-PCR技术对疑似病毒病症状的三七叶片样品进行病毒检测鉴定（杨馨, 孟鈺, 李梅蓉, 等. 云南三七病毒病的发生及病毒种类检测. 植物病理学报, 2019, 49(04): 456-464）。实时荧光定量PCR技术作为一种高灵敏、高特异性的核酸检测手段，相较于病毒分离培养和电镜观察等方法快捷准确，已在由真菌、细菌、病毒、线虫等引起植物病害的病原诊断和防治控制研究中得到了广泛应用。此外，在研究植物病害的产生机理及发生规律时，还能获知复杂环境中植物病毒含量的动态变化，为预防、早期诊断和动态监测提供技术保障。
植物潜隐病毒（cryptic virus）属于分裂病毒科，通常包含2至3个单顺反子基因组dsRNA片段，这些基因组片段被单独封装，称为二分病毒和三分病毒。此外，潜隐病毒通过花粉或种子传播，主要与其他病毒混合感染真菌、植物和原生动物（Kumar S,Subbarao BL,Kumari R, et al. Molecular characterization of a novel cryptic virusinfecting pigeonpea plants［J］. PLoS One, 2017, 12(8): e0181829）。其中，潜隐病毒在无症状以及有斑驳、叶斑和坏死的植物中发现较多，且大多数单一的潜隐病毒不会引起明显的症状，或者在少数情况下会引起非常轻微的症状（Vazquez I I, Adams I P,Hodgetts J, et al. High throughput sequencing and RT-qPCR assay reveal thepresence of rose cryptic virus-1 in the United Kingdom［J］. Journal of PlantPathology, 2019, 101: 1171–1175）。人参潜隐病毒4（Panax cryptic virus 4, PCV4）是首尔国立大学农业与生命科学研究所在人参中发现的一种新型潜隐病毒，并获得了1609bp长的外壳蛋白全基因序列（MT159322.1），但目前未见有关于PCV4的深入研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三七中人参潜隐病毒4（PCV4）的实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法可实现供试材料三七中人参潜隐病毒的定量检测，同时具有检测时间短以及灵敏度高的技术特点。
本发明人参潜隐病毒4实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）以感染人参潜隐病毒4的三七叶片的cDNA为模板，采用引物PCV4-cp-F和PCV4-cp-R进行PCR扩增，PCR扩增产物回收纯化后，与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒标准品pGEM-T- PCV4，其中引物PCV4-cp-F核苷酸序列如SEQID NO:1所示，引物PCV4-cp-R核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
（2）以经过梯度稀释的重组质粒标准品为模板，采用上游引物PCV4-QF和下游引物PCV4-QR进行实时荧光定量PCR，以重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线，其中上游引物PCV4-QF核苷酸序列如SEQID NO:3所示，下游引物PCV4-QR核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
（3）提取待测样品的总RNA，并以该RNA为模板进行反转录，得到待测样品的cDNA，以待测样品的cDNA为模板，采用上游引物PCV4-QF和下游引物PCV4-QR进行实时荧光定量PCR，并将获得的Ct值带入构建的标准曲线中，实现待测样品中人参潜隐病毒4的定量检测。
所述实时荧光定量PCR的反应体系为2×SYBR Green Mix 10μL、无核酸酶水7μL、上游引物PCV4-QF 1μL、下游引物PCV4-QR 1μL、cDNA模板1μL。
本发明方法实现了供试材料中的人参潜隐病毒4的定量测定，而且检测结果可直接通过电脑软件读出，不需要凝胶电泳以及成像检测等操作。另外，该检测方法具有节约时间以及灵敏度高的优点，解决了现有检测手段复杂费时、周期长、且对操作的实验室有一定要求的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的重组质粒pGEM-T-PCV4实时荧光定量PCR的特异性检测图，其中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，图上曲线分别是pGEM-T-PCV4重组质粒、pGEM-T-PnVA（三七A病毒的cp基因）重组质粒及RNase-Free ddH2O的扩增曲线；
图2为以PCV4-QF和PCV4-QR为特异性引物，通过常规PCR检测PCV4的灵敏度测试结果图；以PCV4-QF和PCV4-QR为特异性引物，常规PCR扩增的产物大小为241bp，其中，M：DNAladder marker；0：negative control；9：8.81×109 copies/μL；8：8.81×108copies/μL；7：8.81×107copies/μL；6：8.81×106 copies/μL；5：8.81×105 copies/μL；4：8.81×104copies/μL；3：8.81×103 copies/μL；2：8.81×102 copies/μL；1：8.81×10 copies/μL；
图3为本发明实施例2提供的检测方法分析PCV4的灵敏度测试结果图；其中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度；8：8.81×108copies/μ L；7：8.81×107 copies/μL；6：8.81×106 copies/μL；5：8.81×105 copies/μL；4：8.81×104copies/μL；3：8.81×103copies/μL；2：8.81×102 copies/μL；1：8.81×10 copies/μL。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
需要指出的是，在本发明的所有实施例以及应用例中，感染PCV4的三七叶片于2021年4月采自云南省文山州砚山县三七种植基地。
实施例1：获取人参隐性病毒4重组质粒标准品
利用软件Primer Primer5.0软件设计人参潜隐病毒（PCV4）外壳蛋白(cp)基因的特异性扩增引物用于制备质粒标准品，引物为PCV4-cp-F：ttcactacctcctccccaa和PCV4-cp-R：tgacttcatc aatcctcgg，此外，特异性引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。取感染人参潜隐病毒4的三七叶片提取总RNA，用液氮将三七叶片研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV（promega）以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μg Total RNA，依次加入50ng oligo（dT），2μL dNTP（2.5 mM each）、DEPC水至反应体积为14.5μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μL 5×First-stand buffer、0.5μLRNasin（200 U）、1μL M-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。
利用引物PCV4-cp-F和PCV4-cp-R对感病三七叶片的cDNA进行PCR扩增。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小（773bp）的特异条带进行切胶回收，纯化后连接至pGEM-T载体上，并转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆进行培养，用小量提取试剂盒提取质粒，然后进行测序和酶切鉴定，获得重组质粒标准品。所述重组质粒标准品的OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，纯度高，因此制成的标准曲线能够更加准确的反映Ct值与起始模板浓度的关系。
实施例2：人参潜隐病毒4荧光定量PCR检测体系的建立
根据重组质粒标准品的分子量将其质量浓度换算为拷贝数浓度，采用的公式为copies/μL＝(ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/(DNA length×660)（程胜群, 吕文河, 高艳玲等. 马铃薯S病毒RT-qPCR通用检测体系的建立与应用. 华北农学报, 2020, 35(6):187-194）。再用Easy Dilution将本发明实施例1制备的pGEM-T-PCV4重组质粒标准品依次稀释成8.81×109~8.81×101copies/μL，共9个浓度梯度。以上述经梯度稀释的重组质粒标准品为模板、以PCV4-QF（gctcaaacgccgagaaatg）和PCV4-QR（gtgccggaaccttcaaaaaa）为引物进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR的反应体系为：2×SYBR Green Mix 10μL、无核酸酶水7μL、上游引物PCV4-QF 1μL、下游引物PCV4-QR 1μL、cDNA模板1μL。扩增程序为：94℃预变性2mins；94℃变性15s；60℃，40s，于60℃收集荧光信号，共40个循环；熔解曲线分析（60-95℃）。反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线。PCV4重组质粒浓度在8.81×102～8.81×109拷贝/μL时，Ct值与 PCV4 病毒重组质粒拷贝数对数之间具有良好的线性关系，相关系数（R2）达0.994，扩增效率(E)为104.4％，直线方程为y＝-3.222log(x)+35.678；其中，重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为x轴，Ct值为y轴。
此外，为了验证本发明提供的这种实时荧光定量PCR检测方法的检测效果，特进行以下实验分析：
特异性分析
以实施例1方法分别制备重组质粒pGEM-T-PCV4、pGEM-T-PnVA (PnVA为三七A病毒的cp基因)为模板，同时以无核糖核酸酶水（RNase-Free ddH2O）为空白对照，对建立的人参潜隐病毒4qPCR检测体系进行特异性分析。结果如图1所示，只有pGEM-T-PCV4为模板的qPCR样品具有明显的扩增曲线，且熔解曲线为单一峰。对照病毒（pGEM-T-PnVA）和空白对照无明显峰值，表明本研究建立的实时荧光定量PCR具有检测PCV4的特异性。
灵敏度比较
对实施例2提供的pGEM-T-PCV4质粒（重组质粒标准品)以10倍梯度稀释成8.81×109～8.81×101copies/μL 9个浓度梯度，然后以此为模板，分别进行常规PCR和实时荧光定量PCR检测。图2结果显示，常规PCR的检测下限为104拷贝/μL。图3结果表明实时荧光定量PCR的检测下限为102拷贝/μL（CT value≤30），可见实时荧光定量PCR的灵敏度是常规PCR的100倍。
重复性分析
选取实施例1提供的8.81×108～8.81×104 copies/μL 5个稀释度的pGEM-T-PCV4质粒为模板进行组内(同次qPCR实验的三个重复)和组间（三次qPCR实验）实时荧光定量PCR反应，以Ct值的标准差（SD）和变异系数（cv）作为判断标准。分析结果见表1，建立的qPCR体系组内重复的最大变异系数为1.45%，组间重复的最大变异系数为3.60%(表1)，表明建立的qPCR体系具有较好的重复性。
表1实时荧光定量PCR的重复性分析
实施例3：田间感病三七叶片中人参潜隐病毒4的检测
利用实施例2的方法对10份感病三七叶片进行了检测，按照与实施例2中相同的扩增条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，分析结果见表2，供试样品中PCV4的检出率为80％（Ct值≤30），正常生长（健康）的三七叶片及空白对照的检测结果均为阴性，表明该方法可用于三七病毒病样品中PCV4的检测。
表2本发明对10份三七病毒病叶片的检测结果
其中，在表2中， “+”为阳性，“－”为阴性；“Positive control” 为阳性对照，以pGEM-T-PCV4质粒（重组质粒标准品)作为qPCR的模板； “CK”是空白对照，以无核糖核酸酶水作为qPCR的模板；“The virus-free plants”为正常生长（健康）的三七。qPCR 的Ct值大于30时，Ct值与 PCV4 病毒重组质粒拷贝数对数之间的线性关系较差，因而Ct值大于30的检测结果视为阴性。
综上所述，与现有技术相比，本发明提供的这种检测方法其具有特异性和灵敏度高、重复性好、无污染、耗时短的优点。本发明实施例根据PCV4cp基因的序列设计合成了特异性引物，并产生重组质粒作为标准品构建了标准曲线，建立了针对性检测三七样品中PCV4的实时荧光定量PCR方法，实现了PCV4的定量检测。此外，检测结果可由软件直接得出，不需要进行PCR后处理；该方法能够特异的检测PCV4，并对PnVA与RNase-Free ddH2O无特异扩增；该方法稳定性好，组内重复的最大变异系数为1.45%，组间重复的最大变异系数为3.60%；能够检测到最低102拷贝/μL的重组质粒，灵敏度是常规PCR技术的100倍。该方法的建立将为进一步研究PCV4的侵染、增殖、分布及时序变化等规律提供可靠的技术手段，并为研发三七病毒的多重定量检测体系奠定基础。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
ttcactacct cctccccaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
tgacttcatc aatcctcgg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gctcaaacgc cgagaaatg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gtgccggaac cttcaaaaaa 20
Claims (2)
1.一种三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以感染人参潜隐病毒4的三七叶片的cDNA为模板，采用引物PCV4-cp-F和PCV4-cp-R进行PCR扩增，PCR扩增产物回收纯化后，与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒标准品pGEM-T-PCV4，其中引物PCV4-cp-F核苷酸序列如SEQID NO:1所示，引物PCV4-cp-R核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
（2）制备一系列浓度梯度的重组质粒标准品溶液，并以重组质粒标准品溶液为模板，采用上游引物PCV4-QF和下游引物PCV4-QR进行实时荧光定量PCR，以重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线，其中上游引物PCV4-QF核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物PCV4-QR核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
（3）提取待测样品的总RNA，并以该RNA为模板进行反转录，得到待测样品的cDNA，以待测样品的cDNA为模板，采用上游引物PCV4-QF和下游引物PCV4-QR进行实时荧光定量PCR，并将获得的Ct值带入构建的标准曲线中，实现待测样品中人参潜隐病毒4的定量检测。
2.根据权利要求1所述的三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为2×SYBR Green Mix 10μL、无核酸酶水7μL、上游引物PCV4-QF 1μL、下游引物PCV4-QR 1μL、cDNA模板1μL。
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