CN109609660A - 一种个体识别体系、检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种个体识别体系，该个体识别体系包括27个SNP位点，并针对本发明的27个SNP位点设计扩增引物和单碱基延伸引物，本发明还提供了上述个体识别体系的检测方法，基于MassARRAY质谱平台，联合多重PCR技术、单碱基延伸技术进行检测，具有高灵敏性和高准确性的特点。本发明还提供了上述个体识别体系的应用，利用该个体识别体系可以针对新生儿遗传特质相关SNP位点进行检测，通过该检测信息，帮助父母从基因层面更科学的了解新生儿自身遗传特质。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种个体识别体系、检测方法及其应用。
背景技术
目前，传统的建立新生儿DNA档案的方法都是基于STR的方法，STR分型技术存在诸多的不足，例如突变率高，花费大，实验周期较长等。随着科学技术的发展，单核苷酸多态性(SNP)作为第三代遗传标记，越来越多的进入人们的视野。虽然SNP位点的遗传信息量不如STR等标记丰富，但是SNP的分布密度高，遗传稳定。SNP检测比STR检测对DNA样本的要求更低，适应更多的特殊环境。
由于SNP最大限度地代表了不同个体之间的遗传差异，可用于人体外貌特征表型推断和生物学祖源推断，在无法直接锁定犯罪嫌疑人的情况下，可帮助提供侦查线索，缩小侦查范围，从而可以对传统仅仅通过STR分型检测技术建立新生儿DNA档案进行补充。
目前存在的主要技术问题是：SNP检测技术多为TaqMan-PCR、二代平台测序及芯片技术，但是TaqMan检测方法具有淬火难以彻底、本底较高，成本高、检测量低等缺陷，而二代测序技术费时费力，检测费用高，基因芯片技术虽检测人数多、位点多，时间短，但重复准确性低，操作过程繁琐，检测费用高。目前现有的核酸质谱检测技术，并没有完全公开同时针对新生儿遗传特质相关的SNP位点的检测技术，同时这些技术大都停留在肿瘤检测的相关方面。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种个体识别体系，帮助父母从基因层面更科学的了解新生儿自身遗传特质，讲述宝宝的先天遗传特征，并为认识每个独一无二的宝宝提供参考依据。
本发明的目的之二在于提供一种个体识别体系的检测方法。
本发明的目的之三在于提供一种上述个体识别体系的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种个体识别体系，该个体识别体系包括以下SNP位点：rs1726866、rs671、rs762551、rs182549、rs4988235、rs12540951、rs7349332、rs1160312、rs17646946、rs7349332、rs12913832、rs1800414、rs17822931、rs10212419、rs7559271、rs1042725、rs6060371、rs6591536、rs307377、rs307355、rs713598、rs752688、rs8065080、rs1050450、rs5063、rs699、rs6269、rs2155219。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在人类基因组中广泛存在。本发明对人类基因组中发生频率较高的SNP进行筛选，并组合成一个对个体而言唯一的识别体系，从而与相应的表型性状相对应进行个体的识别，本发明的位点中包括和饮食习惯相关的rs1726866，和酒精性脸红对应的rs671，和咖啡因代谢能力对应的rs762551，和乳糖代谢能力对应的rs182549、rs4988235，和发量对应的rs12540951、rs7349332、rs1160312，和卷发或者直发对应的rs17646946、rs7349332，和眼睛颜色对应的rs12913832，和皮肤颜色对应的rs1800414，和耳垢类型对应的rs17822931，和耳垂大小对应的rs10212419，和鼻子挺拔度对应的rs7559271，和身高对应的rs1042725、rs6060371，和对花香敏感度对应的rs6591536，和鲜味敏感度对应的rs307377，和甜味敏感度对应的rs307355，和苦味敏感度对应的rs713598，和辣味敏感度对应的rs752688，和咸味敏感度对应的rs8065080，和盐敏感度对应的rs1050450、rs5063、rs699，和疼痛敏感度对应的rs6269，和花粉过敏相对应的rs2155219。上述位点包含了常见的遗传特质，检测结果作为现有STR分型检测结果的补充，用于建立新生儿DNA档案数据库，结果准确。
进一步地，该个体识别体系包括上述SNP位点的引物信息，所述引物信息包括扩增引物和单碱基延伸引物。
进一步地，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQID NO.1-27所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.28-54所示，所述单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.55-81所示。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述述个体识别体系的检测方法，包括以下步骤：
(1)取待检测的干血滤纸片或口腔拭子样本，提取基因组DNA，检测合格后保存备用；
(2)以上述步骤(1)中提取的DNA为模板，以SEQ ID NO.1-54的序列为特异性引物进行PCR扩增反应获得目标位点的PCR产物片段；
(3)对反应产物进行碱性磷酸酶处理；
(4)将步骤(3)处理后的PCR反应产物进行单碱基延伸反应，所用单碱基延伸引物的序列为如SEQ ID NO.55-81所示；
(5)将上述步骤(4)处理后的延伸产物进行树脂纯化；
(6)将上述步骤(5)树脂纯化后的延伸产物进行质谱分析，得到SNP位点所对应的分子量质谱峰图。
进一步地，上述步骤(2)中PCR扩增反应体系为：取0.8μl的water(HPLC grade)，0.5μl含有20mM MgCl2的10x PCR Buffer、0.4μl浓度为25mM MgCl2、0.1μl浓度为25mMdNTP Mix、1μl浓度为0.5uM Primer Mix、0.2μl浓度为5U/μl PCR Enzyme、2μl浓度为5ng/μL DNA，反应液总体积为5μl混合后涡旋震荡离心；PCR反应程序为：95℃预变性2min、然后95℃30s、56℃30s，共45个循环，72℃60s，72℃5min，最后4℃保存。
进一步地，上述步骤(3)中的碱性磷酸酶处理过程为：配制虾碱性磷酸酶处理反应液，将步骤(2)中的PCR反应产物进行碱性磷酸酶处理，消除反应体系中剩余的dNTP，其消化反应体系为：1.53μl的Nanopure Water、0.17μl的SAP Buffer、0.30μl的浓度为1.7U/ulSAP Enzyme，反应液总体积为2μl；上述消化反应的程序为37℃40min，85℃5min，最后在4℃保存。
进一步地，上述步骤(4)中单碱基延伸反应体系为：0.619μl Nanopure water、0.2μl iPLEX Buffer、0.2μl iPLEX Termination mix、0.94μl Extend Primer Mix、0.041μliPLEX Enzyme，反应液总体积为2μl；上述单碱基延伸反应程序为：上述单碱基延伸反应程序为：94℃预变性30s、然后94℃5s；52℃5s、80℃5s、共进行5个内循环；94℃5s、52℃5s、80℃5s共进行35个外循环；72℃保持3min、最后4℃保存。
进一步地，上述步骤(5)中树脂纯化过程为：在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10min使其晾干，在384样本板的每个有样本的孔中加16μL水，将384样本板轻轻翻转过来扣在已放树脂的Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中，将384样本板放置在翻转离心机中室温旋转混匀30min，对延伸产物进行脱盐纯化。
进一步地，上述步骤(6)的质谱分析过程为：将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上，将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件处理后获取SNP位点所对应的分子量质谱峰图。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的个体识别体系包括27个SNP位点，并针对本发明的27个SNP位点设计扩增引物和单碱基延伸引物，本发明还提供了上述个体识别体系的检测方法，基于MassARRAY质谱平台，联合多重PCR技术、单碱基延伸技术进行检测，具有高灵敏性和高准确性的特点。本发明还提供了上述个体识别体系的应用，利用该个体识别体系可以针对新生儿遗传特质相关SNP位点进行检测，通过该检测信息，帮助父母从基因层面更科学的了解新生儿自身遗传特质。
附图说明
图1为本发明实施例2检测一个DNA样本rs10212419位点的结果图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种个体识别体系，其包含的SNP位点的详细信息如表1所示：
表1
实施例2
一种个体识别体系的检测方法，包括以下步骤：
(1)取待检测的干血滤纸片外周血样本或口腔拭子样本，提取基因组DNA，使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，DNA质检合格，用去离子水稀释为浓度15-20ng/ul，-20℃保存备用；
(2)以上述步骤(1)中提取的DNA为模板，以表2所示的SEQ ID NO.1-54的序列为特异性引物进行PCR扩增反应获得目标位点的PCR产物片段，其中PCR扩增反应体系为：取0.8μl的water(HPLC grade)，0.5μl含有20mM MgCl2的10x PCR Buffer、0.4μl浓度为25mMMgCl2、0.1μl浓度为25mM dNTP Mix、1μl浓度为0.5uM Primer Mix、0.2μl浓度为5U/μlPCREnzyme、2μl浓度为5ng/μL DNA，反应液总体积为5μl混合后涡旋震荡离心；PCR反应程序为：95℃预变性2min、然后95℃30s、56℃30s，共45个循环，72℃，60s，72℃5min，最后4℃保存；
(3)对反应产物进行碱性磷酸酶处理：配制虾碱性磷酸酶处理反应液，将步骤(2)中的PCR反应产物进行碱性磷酸酶处理，消除反应体系中剩余的dNTP，其消化反应体系为：1.53μl的Nanopure Water，、0.17μl的SAP Buffer、0.30μl的浓度为1.7U/ul SAP Enzyme，反应液总体积为2μl；上述消化反应的程序为37℃40min，85℃5min，最后在4℃保存；
(4)将步骤(3)处理后的PCR反应产物进行单碱基延伸反应，所用单碱基延伸引物的序列为如表2中SEQ ID NO.55-81所示，单碱基延伸反应体系为：0.619μl Nanopurewater、0.2μl iPLEX Buffer、0.2μl iPLEX Termination mix、0.94μl Extend PrimerMix、0.041μl iPLEX Enzyme，反应液总体积为2μl；94℃预变性30s、然后94℃5s；52℃5s、80℃5s、共进行5个内循环；94℃5s、52℃5s、80℃5s共进行35个外循环；72℃保持3min、最后4℃保存。
(5)将上述步骤(4)处理后的延伸产物进行树脂纯化：在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10min使其晾干，在384样本板的每个孔中加16μL水，将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中，将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟，对延伸产物进行脱盐纯化；
(6)将上述步骤(5)树脂纯化后的延伸产物进行质谱分析：将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上，将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，如图1所示为rs10212419位点的结果图。
表2
随机抽取了5个样本采用本发明的方法进行27个与个体遗传特质相关SNP位点的检测，同时对每个样本的27个SNP位点进行直接测序，以其中一个样本为例，二者比对后结果如表3所示：
表3
| SNP位点名称 | MassARRAY判读结果 | 一代测序结果 |
| rs1800414 | CT | CT |
| rs1726866 | GA | GA |
| rs12540951 | G | G |
| rs1042725 | T | T |
| rs6060371 | G | G |
| rs713598 | GC | GC |
| rs17646946 | G | G |
| rs699 | G | G |
| rs307377 | C | C |
| rs6269 | GA | GA |
| rs1160312 | GA | GA |
| rs2155219 | GT | GT |
| rs307355 | TC | TC |
| rs762551 | CA | CA |
| rs182549 | C | C |
| rs7559271 | GA | GA |
| rs5063 | C | C |
| rs752688 | CT | CT |
| rs10212419 | G | G |
| rs4988235 | G | G |
| rs671 | GA | GA |
| rs8065080 | CT | CT |
| rs6591536 | AG | AG |
| rs17822931 | T | T |
| rs12913832 | A | A |
| rs1050450 | G | G |
| rs7349332 | TC | TC |
由表3可以看出采用本发明的方法检测27个与个体遗传特质相关SNP位点的结果和采用直接测序方法得到的结果相一致，说明本发明的方法检测准确性高，可操作性强。
以个体毛发形状类型为例，采用本发明实施例2的方法本对志愿者代号2204的rs17646946及rs7349332位点进行检测，结果表明该志愿者的发质类型属于轻微卷发。而该志愿者本身发质类型也确实属于轻微卷发。该检测结果与志愿者实际情况相符，同时证明了rs17646946及rs7349332位点与个体毛发形状的相关性。
采用上述方法对具有其他表型的志愿者进行检测，本发明提供的SNP位点和其表型性状具有一致性，由此可知，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和高准确性的特点。利用本发明提供的个体识别体系可以针对新生儿遗传特质相关SNP位点进行检测，通过该检测信息，帮助父母从基因层面更科学的了解新生儿自身遗传特质。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 郑州华之源医学检验实验室有限公司
<120> 一种个体识别体系、检测方法及其应用
<160> 81
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgttggatg ttgcttggag tgccaccatc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg aattcaccac ttgactgagg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
acgttggatg aagccctcaa gtctcttgtc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgttggatg agacccaggt gatgaagtag 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg gcatgtgcac acgtagtatc 30
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg aggtcccaca ctcacagttt 30
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgttggatg gattttcgat gcacttctgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg tactggaact cctagatccg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgttggatg gatggtcaaa gtaggcacac 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgttggatg cagcagttac tcaatacgtg 30
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg ggacttggtg gcagatttga 30
<210> 47
<211> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgttggatg caccacgcca atagccattt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acgttggatg cagttcttca tgagactggc 30
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgttggatg agtcagaagg ttgtgcagag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg gcattgcttg tgtatagcag 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acgttggatg atgtactagt aggcctctgc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acgttggatg acgcgcatcg cacgcaaat 29
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg ccttttactg gcattccagc 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acgttggatg tcggcccctg atgatgatag 30
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acatctgctt cccac 15
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tgctgtctca agggc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aggtgtgagc caccg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cagcatccaa cctact 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtccacactg gctccc 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catctaccat gcgtcctg 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
accctcgccc ccttgtgtt 19
<210> 64
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acctcaacca cttcttctgc 20
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctttgtgata tcatcctgtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacgtagtat cttgtataac c 21
<210> 68
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
accacactca cagttttcac tt 22
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cttatgcatt gccagtgtac tc 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 81
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagcggcca gtttcatttg agcattaa 28
Claims (10)
1.一种个体识别体系，其特征在于，该个体识别体系包括以下SNP位点：rs1726866、rs671、rs762551、rs182549、rs4988235、rs12540951、rs7349332、rs1160312、rs17646946、rs7349332、rs12913832、rs1800414、rs17822931、rs10212419、rs7559271、rs1042725、rs6060371、rs6591536、rs307377、rs307355、rs713598、rs752688、rs8065080、rs1050450、rs5063、rs699、rs6269、rs2155219。
2.根据权利要求1所述个体识别体系，其特征在于，该个体识别体系包括上述SNP位点的引物信息，所述引物信息包括扩增引物和单碱基延伸引物。
3.根据权利要求2所述个体识别体系，其特征在于，所述扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1-27所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.28-54所示，所述单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.55-81所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待检测的干血滤纸片或口腔拭子样本，提取DNA，检测合格后保存备用；
(2)以上述步骤(1)中提取的DNA为模板，以SEQ ID NO.1-54的序列为特异性引物进行PCR扩增反应获得目标位点的PCR产物片段；
(3)对反应产物进行碱性磷酸酶处理；
(4)将步骤(3)处理后的PCR反应产物进行单碱基延伸反应，所用单碱基延伸引物的序列为如SEQ ID NO.55-81所示；
(5)将上述步骤(4)处理后的延伸产物进行树脂纯化；
(6)将上述步骤(5)树脂纯化后的延伸产物进行质谱分析，得到SNP位点所对应的分子量质谱峰图。
5.根据权利要求4所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，上述步骤(2)中PCR扩增反应体系为：0.8μl的water(HPLC grade)，0.5μl含有20mM MgCl2的10x PCR Buffer、0.4μl浓度为25mM MgCl2、0.1μl浓度为25mM dNTP Mix、1μl浓度为0.5uM Primer Mix、0.2μl浓度为5U/μl PCR Enzyme、2μl浓度为5ng/μL DNA，反应液总体积为5μl，混合后涡旋震荡离心；PCR反应程序为：95℃预变性2min、然后95℃30s、56℃30s，共45个循环，72℃，60s，72℃5min，最后4℃保存。
6.根据权利要求4所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，上述步骤(3)中的碱性磷酸酶处理过程为：配制虾碱性磷酸酶处理反应液，将步骤(2)中的PCR反应产物进行碱性磷酸酶处理，消除反应体系中剩余的dNTP，其消化反应体系为：1.53μl的Nanopure Water、0.17μl的SAP Buffer、0.30μl的浓度为1.7U/ul SAP Enzyme，反应液总体积为2μl；上述消化反应的程序为37℃40min，85℃5min，最后在4℃保存。
7.根据权利要求4所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，上述步骤(4)中单碱基延伸反应体系为：0.619μl Nanopure water、0.2μl iPLEX Buffer、0.2μl iPLEXTermination mix、0.94μl Extend Primer Mix、0.041μl iPLEX Enzyme，反应液总体积为2μl；上述单碱基延伸反应程序为：94℃预变性30s、然后94℃5s；52℃5s、80℃5s、共进行5个内循环；94℃5s、52℃5s、80℃5s共进行35个外循环；72℃保持3min、最后4℃保存。
8.根据权利要求4所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，上述步骤(5)中树脂纯化过程为：在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10min使其晾干，在384样本板的每个有样本的孔中加16μL水，将384样本板轻轻翻转过来扣在已放树脂的Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中，将384样本板放置在翻转离心机中室温旋转混匀30min，对延伸产物进行脱盐纯化。
9.根据权利要求4所述个体识别体系的检测方法，其特征在于，上述步骤(6)的质谱分析过程为：将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上，将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件处理后获取SNP位点所对应的分子量质谱峰图。
10.如权利要求1所述个体识别体系在建立新生儿DNA档案的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190412 |