CN102449167B

CN102449167B - 一种检测核酸序列变异的方法

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Publication number: CN102449167B
Application number: CN201080023112.9A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 黄秋英
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2009-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2030-05-26
Also published as: EP2436777A4; EP2436777B1; WO2010135917A1; EP2436777A1; US20140162898A1; US20120077195A1; US9334533B2; CN102449167A; US8691504B2

Abstract

本发明提供了用于熔解曲线分析的核酸探针特别是自淬灭探针，利用所述核酸探针进行熔解曲线分析来检测核酸序列变异的方法，以及包含所述核酸探针的试剂盒。

Description

一种检测核酸序列变异的方法

技术领域

本发明涉及一种检测核酸序列变异的方法及用于该方法的探针和试剂盒，尤其是涉及一种通过自淬灭探针熔解曲线检测核酸序列变异的方法、自淬灭探针和试剂盒。

背景技术

用于检测核酸序列变异的熔解曲线分析，就是在实时PCR程序中增加一个升温步骤(有时也可以是降温步骤)，通过记录荧光随着温度的变化，检测扩增产物或者序列变异信息。目前的熔点分析包括了三种类型，分别是荧光染料法、荧光探针法和荧光染料联合荧光探针法。

荧光染料法原理十分简单，就是在PCR体系中加入能与双链DNA分子结合发出荧光的染料，如SYBR Green、SYTO-9、LC Green等，温度升高使双链DNA发生变性导致荧光降低，通过熔点变化可以指示序列变化(Wittwer C.T.，et al，BioTechniques，1997，22：130-138；Ririe K.M.，et al，Anal.Biochem，1997，245：154-160；美国专利，US 2006/0019253A1)；美国专利，US 2003/0224434A1)。尤其是结合高分辨熔解(HRM)分析(Wittwer C.T.，et al，Clin Chem，2003，49：853-860)可以检测单个核苷酸的变化。荧光探针法就是使用探针检测特定位置的序列变异，前提是探针与靶序列杂交后可以产生特异的荧光信号，这类探针在实时PCR中有很多种，但是用于熔解曲线分析的探针并不多，其中最著名的就是荧光能量共振转移探针(FRET探针，又称LightCycler^TM探针、相邻探针)(美国专利，US7,160,998B2；美国专利，US 6,472,156B1；美国专利，US6,140,054)，其它使用包括单标记的寡核苷酸探针(美国专利，US6,635,427B2)、HyBeacon(美国专利，US 2008/0311579A1)探针等。荧光染料联合荧光探针法就是同时加入荧光增敏或者荧光淬灭染料和荧光探针的方法，比如所谓的诱导荧光能量共振转移iFRET技术(美国专利，US 7,179,589B2)，就是加入荧光嵌入染料的同时再加入单标记的荧光探针，荧光嵌入染料结合双链DNA发出的荧光通过能量转移的方式可以增加荧光标记探针的荧光，温度升高使得探针脱离靶序列，增敏荧光降低。Gupta等人(美国专利，US 2007/0020665A1)公布了一种丙型肝炎病毒分型的方式，则是在PCR反应中同时加入荧光淬灭染料和荧光标记探针，杂交后发生荧光淬灭，温度升高使得探针脱离靶序列，淬灭的荧光得以恢复而会使荧光增加。

上述三种熔解曲线方式中，染料法系采用单一的荧光通道检测，目前主要用于扩增产物的判断，联合HRM后用于扩增序列中随机突变的检测，而不是某一特定位点突变的检测，更不用于多个特定位点突变的检测。荧光染料联合荧光探针法无论是增敏的方式还是淬灭的方式，都仅限于一些特殊的荧光染料，能够用于检测荧光的通道数目有限，检测的位点数同样有限，鉴于此，目前应用的例子极少。

探针法中最成功的例子是LightCycler^TM探针。LightCycler^TM探针由两条与模板互补、且相邻的特异探针组成，其中一条标记供体荧光基团称为检测探针，另外一个标记受体荧光基团，称为锚探针，并且检测探针的熔点比锚探针低10℃左右，供体荧光基团和受体荧光基团之间可以发生FRET。在没有靶序列存在时，两条探针处于游离状态，受体荧光基团不能被激发，因此不能检测到FRET信号；在有互补的靶序列存在时，两探针同时结合在互补的模板上，供体荧光基团和受体荧光基团相互靠近，激发供体荧光基团产生的荧光能量被荧光受体基团吸收而产生特定波长的荧光信号，就可以检测到FRET信号。当温度升高，检测探针首先从模板解离，可以检测到一个特定的熔点。当检测探针杂交的靶序列存在序列变异，变异的程度就影响解离的温度，形成不同的熔点，据此，可以判断是否发生了序列变异以及变异的具体类型。由于这种LightCycler^TM技术需要一条锚探针，而锚探针并不用于检测序列变异，因此，锚探针覆盖的区域会造成检测的盲区，当序列变异广泛存在时，锚探针区域的选择就变得困难。此外，由于LightCycler^TM探针采用的是检测FRET的方式，需要合适的波长组合的荧光供体和受体才能进行荧光能量共振转移，而目前能进行有效荧光能量共振转移的荧光供体和受体组合较有限，同时，检测FRET的光学通道不同于常规的检测单个荧光染料的情况，除了专门的仪器外，主流的实时PCR仪器都无法使用，加上FRET检测通道的数目本身也有限，因此，使得FRET技术在单管检测多个基因变异的应用上受到很大限制，

探针法中的单标记的寡核苷酸探针和HyBeacon探针都是只标记荧光基团的寡核苷酸探针，探针与靶杂交前后都会产生荧光强度的变化。这两种探针都可以进行熔解曲线分析，利用探针熔点的变化来检测核酸序列的变异。然而采用单标记的方式，没有标记淬灭基团，探针依靠特定的核酸序列或鸟嘌呤残基淬灭，会有较高的荧光背景，荧光强度变化有限，信躁比较低。此外，HyBeacon探针荧光基团都标记在探针内，这给探针的合成和标记都带来了一定的困难，限制了该探针熔解曲线法广泛用于核酸序列变异的检测。

探针法中也有一类含有小沟槽结合物(Minor groove binder，简称MGB)的双标记探针，特别是MGB位于5’端的探针，如MGB-Eclipse探针(Afonina，I.A.，et al，Biotechniques，2002，32：940-944，946-949)和Pleiades探针(Lukhtanov，E.A.，et al，Nucleic AcidsRes，2007，35：e30)因为可以抵制耐热DNA聚合酶(Taq)的5′-水解活性，也报道可用于熔解曲线分析。这类探针中的MGB可以起到提高熔点的作用，设计的目的在于缩短探针的同时还能保持相对高的熔点，而对于不匹配的靶序列，熔点则降低很多，因此主要用于特异地检测匹配的靶序列，并不用于突变检测用的熔解曲线分析，因为后者要求无论是匹配还是突变的靶序列，都需要籍有不同的熔点加以区分，并不需要不匹配的靶序列的熔点太低，而且此类探针的合成相对不带MGG的探针而言，也更加困难和昂贵。

因此，就需要一种新的荧光探针用于熔解曲线分析以实现多种变异的单管同时检测。这种荧光探针优选可以进行常见荧光基团的标记，可以在通用的实时PCR仪器上进行多色分析。这种探针还优选适合核酸扩增产物的熔解曲线分析，比如能在常规的PCR循环反应条件中不被降解或只有少量降解，以便保留足够多的完整的荧光探针用于后续的熔解曲线分析。这种探针更优选还必须容易合成，不涉及复杂的昂贵的化学修饰，这样才能降低使用成本。

发明内容

一方面，本发明提供一种通过用自淬灭探针进行熔解曲线分析来检测靶核酸序列变异的方法。该探针标记了荧光基团和淬灭基团，在本发明提供的反应条件下可以在核酸扩增后进行熔解曲线分析，以检测靶序列的变异。

本发明提供的方法包括了使用自淬灭探针以及使用自淬灭探针进行熔解曲线分析的相应实验条件。

所述的自淬灭探针一般指的是，探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团的寡核苷酸探针。该探针和靶核酸序列杂交时荧光荧光强度增加。可在所述探针的5′末端标记荧光基团而在3′末端标记淬灭基团，或可在所述探针的3′末端标记荧光基团而在5′末端标记淬灭基团。当所述探针单独存在时，所述荧光基团与所述淬灭基团彼此接近而相互作用致所述荧光基团发出的荧光被所述淬灭基团吸收而使探针荧光减弱，而当所述探针与其靶核酸序列杂交时，所述荧光基团与所述淬灭基团相互分离致所述荧光基团发出的荧光不能被所述淬灭基团吸收而使探针荧光增强。

本发明所用探针的序列包含如下序列：野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列，或，与野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列相比有若干(例如1-10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)错配，例如具有一个或多个(例如1-10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)单碱基的转换、颠换、插入和/或缺失的序列。

本发明所用探针的序列可以完全是或者包含有与其靶序列的互补序列，或可以是与所述靶核酸序列的完全互补序列相比具有一个或多个单碱基的转换、颠换、插入或缺失的序列。

所述的熔解曲线分析一般可以包括，在核酸扩增后，与靶序列结合的探针，在温度升高过程中脱离靶序列并引起荧光强度变化，通过实时检测这一个过程中荧光强度随温度的变化，获得荧光强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的熔解曲线，利用该熔解曲线可以检测靶序列的变异情况。上述熔解曲线分析也可以按另一种降温的方式获得，也就是从高温到低温，检测荧光的变化。通过数据处理进行熔解曲线分析。

所述的进行熔解曲线分析的相应实验条件，指的是能够使自淬灭探针实现熔解曲线分析的条件，优选包括如下的一种或者几种：

1)使用不对称PCR，即反应过程中，一种引物相对过量，它所延伸产生的链与探针杂交；

2)PCR扩增使用没有外切活性或者外切活性很低的耐热核酸聚合酶；

3)探针本身带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的化学修饰；和/或

4)探针采用发夹结构，既可以是天然发夹结构探针也可以是人工发夹结构，但多数是人工发夹结构探针，即通过在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。添加这种靶序列无关碱基的规则是，所形成的发夹结构中的臂序列中有部分或者全部碱基与靶列互补，并且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4-7个或4-6个碱基之间。

本发明的另一目的是提供一种均相检测核酸序列变异的方法，该方法通过熔解曲线分析来实现，熔解曲线采用探针法，本发明所使用的探针是一种线性或具有发夹结构的探针并与待分析靶序列完全互补或部分互补，探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团，该探针的特点是与靶序列结合后荧光增加，这种探针被称为自淬灭探针，也就是说该探针单独存在时荧光相对较弱，但是与靶序列杂交后荧光增加。熔解曲线分析及其技术方案是在需要检测核酸序列变异的区域设计并制备相应的自淬灭探针，通过扩增反应完成后的自淬灭探针熔解曲线分析，根据自淬灭探针熔点的变化情况，判断目的区域的核酸序列是否存在变异。

本发明的另一目的是提供同时检测多个不同区域核酸序列变异的方法，其技术方案是针对每个区域分别设计并制备相应的自淬灭探针，并对每条自淬灭探针标记不同的荧光基团，通过扩增反应完成后的自淬灭探针熔解曲线分析，根据各个自淬灭探针熔点的变化情况，判断对应的区域的核酸序列是否存在变异。

另一方面，本发明提供一种用于检测靶核酸序列变异(优选用于通过溶解曲线分析检测靶核酸序列变异)的自淬灭核酸探针。该探针标记了荧光基团和淬灭基团，使得与不存在靶核酸序列的情况相比，该探针和靶核酸序列杂交时荧光(或荧光强度)增加。优选地，该探针带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰。

本发明另一方面提供一种自淬灭探针，其中：

可在所述探针的5’末端标记荧光基团而在3’末端标记淬灭基团，或可在所述探针的3’末端标记荧光基团而在5’末端标记淬灭基团；

当所述探针单独存在时，所述荧光基团与所述淬灭基团彼此接近而相互作用致所述荧光基团发出的荧光被所述淬灭基团吸收而使探针荧光减弱，而当所述探针与其靶核酸序列杂交时，所述荧光基团与所述淬灭基团相互分离致所述荧光基团发出的荧光不能被所述淬灭基团吸收而使探针荧光增强；且

所述探针的序列可以是其靶核酸序列的完全互补序列，或可以是与所述靶核酸序列的完全互补序列相比具有一个或多个(例如1-10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)单碱基的转换、颠换、插入或缺失的序列。

本发明的另一个目的是提供了利用自淬灭探针依赖的熔解曲线分析检测核酸变异的试剂盒，试剂盒包括如下成分中的一种或者多种：靶序列扩增的引物，自淬灭探针，以及任选的其它核酸扩增反应的必须组分，包括耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液。

本发明一般可以包括以下步骤：

1)在需要检测核酸序列变异的区域设计并制备相应的自淬灭探针；

2)扩增含有待检测区域的片段；

3)扩增结束后进行熔解曲线分析，根据自淬灭探针的熔点的差异来判断待检测核酸序列是否具有变异以及可能的变异类型。

在一个具体方面，提供一种检测核酸序列变异的方法。该方法包括：1)在需要检测核酸序列变异的区域设计并制备相应的自淬灭探针，在探针的5′末端标记荧光基团(或淬灭基团)，探针的3′末端标记淬灭基团(或荧光基团)，必要时，探针需采用有利于熔解曲线分析的化学修饰和结构改造；2)用合适的引物PCR扩增含有待检测区域的片段，PCR扩增需采用有利于熔解曲线分析的反应条件；3)PCR结束后进行熔解曲线分析，根据自淬灭探针的熔点的差异来判断待检测核酸序列是否具有变异以及可能的变异类型。

所说的核酸序列变异指碱基的改变，可以是单个碱基的改变，也可以是两个或两个以上的碱基的改变，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失。

如果适当的话，本文所用“核苷酸”或“碱基”可互换使用，可经过修饰或未经修饰。

所说的需要检测核酸序列变异的区域可能是一个或多个。

所说的自淬灭探针是一条寡核苷酸探针或DNA类似物探针，其本身的熔点应该不低于引物熔点，长度一般为10-100个碱基，优选的是20-60个碱基。

所说的自淬灭探针在结构上可以是单链线性的，但也可以包含二级结构尤其是发夹结构，发夹结构既可以是天然发夹结构探针也可以是人工发夹结构，但多数是人工发夹结构探针，即通过在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。添加这种靶序列无关碱基的规则是，所形成的发夹结构中的臂序列中有部分或者全部碱基与靶列互补，并且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4-7个或4-6个碱基之间。

当所述探针单独存在时，所述荧光基团与所述淬灭基团彼此接近而相互作用致所述荧光基团发出的荧光被所述淬灭基团吸收而使探针荧光减弱，而当所述探针与其靶核酸序列杂交时，所述荧光基团与所述淬灭基团相互分离致所述荧光基团发出的荧光不能被所述淬灭基团吸收而使探针荧光增强

所说的自淬灭探针是通过熔点变化(或者熔解曲线)变化区分野生型靶序列和变异靶序列，探针可以设计成与野生型靶序列完全互补，也可以设计成变异靶序列完全互补。同时为达到上述目的，在探针序列中也可以引入个别错配碱基。

所说的自淬灭探针在5′末端标记荧光基团(或淬灭基团)，3′末端标记淬灭基团(或荧光基团)，因此，探针在没有与靶序列杂交时，荧光基团和淬灭基团互相作用，导致荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，因而探针本身的荧光很弱；探针在与靶序列杂交时，能够形成双链结构，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因而杂交后探针的荧光增加。

所说的荧光基团包括目前各种荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CAL FluorGold 540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590，ROX，CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705等。

所说的淬灭基团包括目前各种淬灭剂，如DABCYL、BHQ类(如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA等。

所说的自淬灭探针一般由普通碱基组成，但是其中也可以包含特殊修饰的碱基。这些特殊修饰的碱基可以帮助调节探针的结合能力，例如增强探针结合能力或者削弱结合能力，增加熔解曲线分析的灵活性。比如能够增强探针结合能力的特殊修饰碱基如锁定核酸(即locked nucleic acids，缩写为LNA)碱基等，能够削弱结合能力的通用结合碱基I等。因此，在一个实施方案中，本发明的探针可由未经修饰的碱基组成。在一个优选实施方案中，对探针的碱基进行修饰。在一个优选实施方案中，本发明的探针包含能增强或减弱探针结合能力的碱基。又在一个优选实施方案中，所述能增强探针结合能力的碱基包括锁定核酸碱基。还在一个优选实施方案中，所述能减弱探针结合能力的碱基包括通用结合碱基I。

在优选实施方案中，所说的自淬灭探针在使用具有5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶进行PCR扩增时，探针可以进行抵抗DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性的修饰；在使用具有3′→5′核酸外切活性的DNA聚合酶进行PCR扩增时，探针可以进行抵抗DNA聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性的修饰。这样在整个扩增反应中，探针的完整性得以保持，可以发生后续的杂交反应和熔解曲线分析。

所说的能够抵抗DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的修饰，优选的方式是使探针的5′端能抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰5′端碱基之间的连接，采用修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸LNA)或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰5′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化(phosphorothioate)连接，甲基磷酸键(methylphosphonate)连接，硼酸磷酸(boranophosphate)化连接，肽核酸(peptide nucleicacid)连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，这种修饰位于于5′端的第一个碱基和第二个碱基之间。

所说能够抵抗DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的修饰，优选的方式是使探针的3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰3′端碱基之间的连接，采用修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸)，或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰3′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化连接，甲基磷酸键连接，硼酸磷酸化连接，肽核酸连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，而且这种修饰位于3′端的第一个碱基和第二个碱基之间。

在优选的实施方案中，探针还可以采用有利于熔解曲线分析的二级结构，优选的是采用发夹结构，尤其是探针末端形成臂结构的发夹结构。这种末端形成臂结构的方式，多数情况下需要在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。具体实现方式是，在探针的一端或者两端添加一定数目的靶序列无关碱基，使得两端形成人工发夹结构。添加无关碱基的规则是，发夹结构中的臂序列部分中，需要有部分或者全部与靶列互补，而且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4-7个或4-6个碱基之间。这样做的目的是保证发夹结构与靶序列之间杂交有足够高的效率，使之可以有效用地于熔解曲线分析。使用发夹探针进行熔解曲线分析的好处是，在多数情况下，同样的反应条件下，发夹探针比线性探针更好地耐受酶切，而且发夹探针的背景信号比线性探针更低。

在优选的实施方案中，所说的有利于熔解曲线分析的扩增条件包括采用不对称扩增模式，其延伸产物与探针杂交的引物一般是另一条引物的2-100之间，优选的是2-50倍之间。

在优选的实施方案中，所说的有利于熔解曲线分析的扩增条件还包括那些保证扩增后探针得以完整保存的条件，因为探针都是在扩增之前预先加入到反应管内。比如，在探针本身不具备抵抗酶的5’-外切酶和3’-外切酶活性的能力时，就可以采用不具备5′-外切酶和3′-外切酶活性的耐热核酸聚合酶，如KlentTaq，或者采用5′-外切酶活性很低并且缺乏3′-外切酶活性的耐热核酸聚合酶，如TaqFS。具备上述性质的酶很多，具体实验都可以参考上述要求加以选择。

在一个实施方案中，本发明的探针的待检核酸区段可以是一个，所述区域包含具有一种或多种单核苷酸变异的待检等位核酸序列。

在一个优选实施方案中，本发明的探针的待检核酸区段可以是两个或两个以上，所述各区域各包含具有一种或多种单核苷酸变异的待检等位核酸序列，优选针对每个区域分别设计并制备相应的自淬灭探针，并对每条自淬灭探针标记相同或不同的荧光基团，通过扩增反应完成后的自淬灭探针熔解曲线分析，根据各个自淬灭探针熔点的变化情况，判断对应区段的核酸序列是否存在变异。

本发明的自淬灭探针在一个检测体系中的数目可以是单个，也可以是多个。在使用多个自淬灭探针时，可通过使用不同的荧光标记基团进行标记而实现各自淬灭探针的彼此区分；也可通过使用相同的荧光标记基团进行标记，并利用其与待检等位核酸序列杂交后的熔点差异来实现各自淬灭探针的彼此区分；也可通过在使用不同的荧光标记基团的同时结合使用不同的熔点来实现各自淬灭探针的彼此区分，从而达到增加检测区段数目的目的。

本发明的探针的长度一般是5-100个碱基，例如10-100个，10-50个，15到50个，20到50个，10-40个碱基，再例如10-20，20-30，30-40，15-30，20-40个，15-25个。

本发明的基本原理如下：

尽管下文描述了本发明假设的原理，但是，本发明的范围并不受到这些原理的限制。

在DNA热变性过程中，有50％DNA变性解链时的温度称为双链DNA的解链温度，又称熔解解温度或熔点(Tm)。在溶剂固定的前提下，双链DNA的Tm值是固定不变的。当DNA双链完全互补时，形成的双链结构较为稳定，使DNA双链解开所需温度较高，故Tm值也较高；DNA双链不完全互补时，形成的双链结构较不稳定，使双链解开所需温度较低，故Tm值也较低，而且Tm降低的程度也是依赖不完全互补的具体序列的。

基于上述理论，探针与靶杂交形成双链结构，与完全匹配的靶杂交，则形成的双链结构的Tm值较高，若与不完全匹配的靶杂交时，形成的双链结构Tm值较低。因此，若能检测到探针Tm值的变化，就能判断靶核酸序列是否存在变异，乃至变异的具体类型。

荧光标记的探针要用于核酸序列变异检测优选需要满足以下三个条件：一是探针与靶序列杂交前后必须有荧光强度的变化；二是探针在扩增过程中必须保持完整，以用于扩增后的熔解曲线分析；三是探针不能有过强的特异性，否则具有变异的核酸序列不易与探针杂交。本发明所述的自淬灭探针则能较好的满足以上三个条件。自淬灭探针在熔解曲线分析过程中，低温阶段与靶序列杂交，这时探针与靶形成刚性、稳定的双链结构，荧光基团与淬灭基团距离较远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因此可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，探针逐渐从靶上解离，解离下的探针呈单链自由卷曲状态，探针标记的荧光基团和淬灭基团互相靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团所吸收，此时只能检测到微弱的荧光信号。对自淬灭探针在熔解曲线分析过程中进行荧光信号的检测，就能观察到探针与靶的杂交和解离过程，形成荧光强度随着温度变化而变化的曲线，即探针的熔解曲线，对熔解曲线求导分析，就可以找到荧光变化最强的点，对应的温度即是探针的Tm值。探针与完全匹配的靶杂交时形成的双链结构Tm值最高，与具有不同序列变异的靶杂交时形成的双链Tm较低，不同的变异类型则可以形成不同的Tm值。因此，自淬灭探针熔解曲线法可以用于核酸序列变异的检测。

因此，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体的熔点，根据该熔点，可以检测待测核酸的变异。

或者，优选地，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体以及探针与参照核酸之间杂交体的熔点，根据这两个熔点的差异，可以检测待测核酸的变异。参照核酸可以是例如野生型核酸。

优选地，用同一个扩增反应获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点，或者，用同一个熔解曲线测定反应物获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点。更优选地，同一个扩增反应中包含至少一个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个核酸的变异。更优选地，同一个扩增反应中包含多个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个待测核酸中存在的多个变异。优选地，所述多个探针标记不同的荧光基团。所述多个探针可以是至少2、3、5、7、10、15或者20个，并且最多10个、15个、20个、30或者50个或者更多，例如2-5个、2-10个，2-20个、5-10个或者5-20个。所述多个待测核酸可是例如至少2、3、5、7、10、15、或者20个，并且最多10个、20个、50个或者100个或者更多，例如2-10个、2-20个，2-50个。所述多个变异可是例如至少2、3、5、7、10、15、20、30、50、或者个100，并且最多10、20、50、100、或者200个或者更多，例如5-10个，5-20个，5-50个，10-50个，10-100个，或者10-200个。

与现有核酸序列变异检测技术相比，本发明具有以下突出优点：

1)该技术属于均相检测系统，PCR扩增完成后只需要进行简单的熔解曲线分析就可以完成检测，整个过程可以无需开盖，既可以在同一台荧光PCR仪上完成，也可以在普通扩增仪上扩增后再转移到荧光PCR仪器进行熔解曲线分析，因此操作简便、灵活，而且由于整个过程闭管操作，不易造成PCR产物污染。

2)该技术克服了实时PCR直接检测基因突变数目的限制，比如目前采用TaqMan探针、分子信标、置换探针、蝎子引物等探针检测序列变异的模式，即一种序列需要一种特异的检测探针的模式。与此不同的是，本发明提供的方法是仅用一条自淬灭探针就可以同时进行其所覆盖区域多种序列变异的检测。

3)该技术与现有的可以用于熔解曲线分析的探针技术(如：FRET探针、单标记的寡核苷酸探针、HyBeacon探针等)相比，具有易于合成和纯化(探针采用末端标记的方式是最普通的标记方式)、荧光本底较低和信躁比较高(探针能够自我淬灭)、易于多重检测(采用多个不同荧光基团标记，每一个荧光基团对应一种探针，可以在同一反应管中加入多种探针)、检测成本低(一种探针可以检测其所覆盖的多个变异位点)等优点。

附图说明

图1为不同靶序列存在下的自淬灭探针的熔解曲线图。左图显示的是自淬灭探针随着温度变化相应的荧光变化情况，将左图的温度与荧光强度的变化求导并取其负数(-dF/dT)就得到右图，即熔解曲线，直接反应了在不同靶序列存在情况下自淬灭探针的熔点。图中的长线段虚线表示匹配靶序列(target 1)；实线表示单碱基错配靶序列(target 2)；点状虚线表示无靶序列。

图2是自淬灭探针检测不同基因型的标本。左图为自淬灭探针实时PCR检测的结果；右图是PCR结束后对自淬灭探针熔解曲线分析结果。图中黑色虚线表示αα/αα基因型，黑色实线表示-α^3.7/--SEA基因型，灰色实线表示-α^4.2/--SEA基因型，灰色虚线表示阴性控制(Negativecontrol)。

图3为不同靶序列存在下LNA修饰的自淬灭探针的熔解曲线图。

图4多色标记自淬灭探针熔解曲线法单管检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变。其中黄色(Yellow)通道检测的为Probe 204，橙色(Orange)通道检测的为Probe 180。图中各个熔解曲线所代表的突变类型如图标所示。

图5.线性自淬灭探针长度对熔解曲线的影响。长度分别是26、30、36、41nt碱基的线性自淬灭探针，分别称作26-nt probe，30-ntprobe，36-nt probe，41-nt probe(分别见图5中26nt，30nt，36nt，和41nt各图)。它们对于匹配程度不同的靶序列(target)的熔解曲线分析结果。所有探针都可以都可以进行熔解曲线分析，并具备区分靶序列变异的能力(图中未标注具体序列)。

图6.反应条件对PCR-熔解曲线分析法的影响。用不对称PCR扩增的，所用的耐高温聚合酶无论是具有外切酶活性的Taq(实线)还是外切活性大为降低的TaqFS(虚线)，使用三步法(左图)还是两步法(右图)，都能给出熔解曲线分析结果。灰线表示不存在模板的情况。而凡是使用对称PCR扩增都未得到熔解曲线分析结果(图中未给出)。

图7.发夹型自淬灭探针与不同靶序列的熔解曲线图。左图显示的是荧光强度随温度变化相应的变性曲线，将左图的温度与荧光强度的变化求导并取其负数(-dF/dT)就得到右图，即熔解曲线。熔解曲线可以给出在不同靶序列与发夹型自淬灭探针杂交的熔点。图中实线表示匹配靶序列，虚线表示单个碱基错配靶序列，灰线表示无靶序列。

图8.发夹型自淬灭探针用于PCR扩增后熔解曲线分析检测不同基因型的标本。左图为自淬灭探针实时PCR检测的结果；右图是PCR结束后对自淬灭探针熔解曲线分析结果。图中黑色实线表示-α^3.7/--SEA基因型，黑色虚线表示阴性控制(Negative control)，灰色实线表示-α^4.2/--SEA基因型，灰色虚线表示αα/αα基因型。

图9.相同荧光标记的两种探针同时检测两种突变的基因型。通过设计将两个探针熔点相差拉大，高熔点探针(P1)检测突变型的熔点也高于低熔点探针(P8)的野生型。这样二者就互不影响，可以用一个通道中使用两个探针检测多个基因型。图中各个熔解曲线所代表的基因型如图标所示。

图10.在同一反应管内，用五种不同荧光标记的发夹型自淬灭探针混合检测β-珠蛋白基因的多个突变。该体系利用了Rotor-gene 6000的五个检测通道，设计五种相应荧光物质标记的探针，分别检测了β-珠蛋白基因的多个突变位点的基因型。图中各小图给出了在五个荧光通道中检测的结果，每个荧光通道给出的结果对应于相应荧光探针检测的结果。图中各个熔解曲线所代表的基因型如图标所示。

实施例

以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的对突变进行检测。这些并不脱离本发明描述的基本概念。

实施例1.人工合成不同的互补靶核酸序列考察线性自淬灭探针熔解曲线法用于检测核酸序列变异的能力。

本实例设计了一条针对α-珠蛋白基因5′非翻译区的自淬灭探针，通过人工合成与探针完全互补和带有点突变的靶核酸序列，考察自淬灭探针熔解曲线法区分不同靶核酸序列的能力。所用的自淬灭探针和靶核酸序列为：

Probe 1：5′-FAM-CCTGGTGTTTGTTCCTTCCC-BHQ-3′(SEQ IDNO：1)，5′端第一个碱基和第二个碱基之间的连接采用硫代磷酸化连接。

Target 1：5′-GCACCACGCA-3’(SEQ ID NO：2)

Target 2：5′-GCACCACGCA-3’(SEQ ID NO：3)

其中，靶核酸序列加下划线部分与探针互补，Target 2加框表示的碱基为突变的碱基，所用的靶核酸序列和探针都在上海生工生物工程有限公司合成。

25μL反应液中含10×PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，1.5mM MgCl₂，5pmol probe 1，不加靶核酸序列或者加入10pmol上述靶核酸序列中的一种。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应程序为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM通道荧光信号。该实验在Rotor-Gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图1，从图中我们可以观察到，在没有靶核酸序列存在时，自淬灭探针处于单链自由卷曲状态，荧光基团由与淬灭基团相互靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团所淬灭，随着温度的变化，荧光强度的变化也不明显；当有靶核酸序列存在时，自淬灭探针低温时与互补的靶核酸序列形成刚性且稳定的双链结构，使荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光，随着温度的升高，双链结构逐渐解链，而荧光逐渐下降。对不同的靶核酸序列，形成稳定性不同的双链结构，具有各自不同的熔点。其中自淬灭探针与完全互补的靶核酸序列(Target 1)形成的双链结构较稳定，故熔点较高，与突变的靶核酸序列形成的双链结构稳定性较差，故熔点较低。当加入的靶核酸序列为Target 1时，自淬灭探针的熔点为66.97℃；当加入的靶核酸序列为有一个碱基不匹配的Target 2时，自淬灭探针的熔点为60.98℃。因此，根据自淬灭探针熔点的不同就可以判断加入的是哪种靶核酸序列。因此，自淬灭探针熔解曲线法可以用于检测核酸序列变异。

实施例2.用线性自淬灭探针PCR-熔解曲线分析法检测不同基因型的标本。

本实例设计了针对α-珠蛋白基因5′非翻译区的自淬灭探针Probe 1(见实施例1)，根据探针熔点的差别来区分α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因，使用人类基因组模板，实时PCR扩增后，对Probe1进行熔解曲线分析，来说明自淬灭探针熔解曲线法可以用于基因分型。所用的引物为：

P1：5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAGAGGAGTCTGAATCTGGA-3′(SEQ IDNo：4)和P2：5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCCCTCTGGCGATAGTCA-3′(SEQ IDNo：5)。

PCR反应体系为：25μL反应液中含10×PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，4.0mM MgCl₂，5pmol probe 1，0.2mM dNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.1μM上游引物P1，1μM下游引物P2，0.1μMProbe 1，5μL人类基因组模板(约50ng)或者5μL的无菌水(阴性控制)。所使用的标本分为三种型：αα/αα、-α^3.7/--^SEA(只有α2-珠蛋白基因)和-α^4.2/--^SEA(只有α1-珠蛋白基因)。PCR反应条件为95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，52℃20s，72℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集FAM通道荧光数据。PCR反应后，95℃变性1min，35℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从35℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

线性自淬灭探针Probe 1与α2-珠蛋白基因5′非翻译区的序列完全匹配，而与α1-珠蛋白基因5′非翻译区的序列有一个碱基不匹配。如图2所示，Probe 1与完全匹配的序列结合时熔点较高(65.13℃)，与有单个碱基差异的序列结合时熔点较低(58.48℃)。由于实时PCR扩增曲线本身的荧光强度高低的重现性相对较差，而各基因型的差别就在于扩增曲线的荧光强度差异上(图2左图)，因此，很难对各种基因型进行区分。而PCR后的熔解曲线分析(图2右图)则可以很好的区分各种基因型。基因型αα/αα具有α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因，故具有两个熔点峰；基因型-α^3.7/--^SEA只有α2-珠蛋白基因，故只有高熔点的峰；基因型-α^4.2/-^SEA只有α1-珠蛋白基因，故只有低熔点的峰。因此，自淬灭探针溶解曲线法可以用于基因分型，只要根据熔点峰的有无及熔点的高低就可以对不同的基因型进行区分。

实施例3.人工合成不同的互补序列的自淬灭探针熔解曲线法用于检测核酸序列变异的能力。

乙肝病毒的DNA聚合酶编码区C区204位密码子由蛋氨酸(methionine，M)发生碱基突变成为缬氨酸(valine，V)(ATG→ATT)或异亮氨酸(isoleucine，I)(ATG→GTG)就会导致对一线药物拉米夫定的耐药，并且很可能伴有第180位密码子由亮氨酸(leucine，L)突变为蛋氨酸(M)(CTG/TTG→ATG)。

本实实例设计了针对乙肝病毒的DNA聚合酶编码区C区的自淬灭探针，用人工合成的靶核酸序列考察LNA修饰的自淬灭探针熔解曲线法用于检测核酸序列变异的能力。所用的自淬灭探针和靶核酸序列为：

Probe 204：5′-TET-TTCAGTTATTGATGATGTGG-BHQ-3′(SEQ ID No.6)

204 W1：5′-CAAAACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.7)

204 W2：5′-CAAAACCACATCATCCATATAACTAAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.8)

204 W3：5′-CAAAACCACATCATCCATATAGCTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.9)

204 W4：5′-CAAAAACACATCATCCATATAACTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.10)

204 V1：5′-CAAAACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.11)

204 V2：5′-CAAAACCACATCATCCACATAACTAAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.12)

204 V3：5′-CAAAACCACATCATCCACATAGCTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.13)

204 V4：5′-CAAAAACACATCATCCACATAACTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.14)

204 I1：5′-CAAAACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.15)

204 I2：5′-CAAAACCACATCATCAATATAACTAAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.16)

204 I3：5′-CAAAACCACATCATCAATATAGCTGAAAGCCAAA-3′(SEQ ID No.17)

204 I4：5′-CAAAAACACATCATCAATATAACTGAAAGCCAA-3′(SEQ ID No.18)

其中，探针加框的碱基用相应的锁定核酸LNA替代，并且5′端第一个碱基和第二个碱基之间的连接采用硫代磷酸化连接；靶核酸序列加下划线部分与探针互补，靶核酸序列加粗的碱基与探针上的碱基不匹配，其中204 M1，204 M2、204 M1、204 M3、204 M4为具有不同多态性的野生型靶核酸序列，204 V1、204 V2、204 V3、204 V4为具有不同多态性的204位点氨基酸由蛋氨酸变成为缬氨酸的靶核酸序列，204 I1、204 I2、204 I3、204 I4为具有不同多态性的204位点氨基酸由蛋氨酸变成为异亮氨酸的靶核酸序列。

上述靶核酸序列和探针都在上海生工生物工程有限公司合成。

25μL反应液中含10X PCR buffer(含25mM Mg²⁺)2.5μL，0.2μM探针，0.4μM的靶核酸序列。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应程序为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从45℃递增至76℃进行熔解曲线分析，并且采集Yellow通道荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图3，从图中我们可以观察到，加入各种的靶核酸序列，探针会形成各自不同的熔点。当靶核酸序列是野生型靶核酸序列204W1、204 W2、204 W3、204 W4时，探针的熔点依次是65.88℃、63.88℃、63.54℃、61.79℃；当靶核酸序列是携带突变的靶核酸序列204 V1、204 V2、204 V3、204 V4、204 I1、204 I2、204 I3、204 I4，探针的熔点依次是58.23℃、54.8℃、53.42℃、55.62℃、56.07℃、52.46℃、50.1℃、52.53℃。虽然有个别熔点比较接近，但是4种野生型和8种突变型之间熔点区别比较大，即使是区分最小的野生型(204 W3)和突变型(204 V1)，两者熔点差异为3.56℃。因此，LNA修饰的自淬灭探针熔解曲线法用于检测核酸序列变异。

实施例4.多色标记线性自淬灭探针单管同时检测多个不同位点的突变。

前面的实施例表明，一个自淬灭探针可以同时覆盖邻近的突变位点，进行多个突变同时检测。本实例则用来说明即使不相邻的突变，通过使用不同颜色标记的自淬灭探针，亦可以实现单管多重检测。

本实实例设计了分别针对乙肝病毒的DNA聚合酶编码区B区和C区的自淬灭探针，并对每个探针标记不同的荧光基团。所用的探针为Probe 204和Probe 180，引物为F和R，引物和探针的序列为：Probe 204(同实施例3)，Probe 180：5′-ROX-CCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAG-BHQ-3′(SEQ ID No.19)，F：5′-GGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATC-3′(SEQ ID No.20)，R：5′-GTTTACAGGAAGTTTCCTAAAACAC-3′(SEQ ID No.21)。

其中的探针部分，加框的碱基用相应的LNA替代，并且5′端第一个碱基和第二个碱基之间的连接采用硫代磷酸化连接。

PCR反应体系为：25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，4.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.1μM上游引物F，1μM下游引物R，0.2μM探针，5μL人工构建质粒模板或无菌水(阴性控制)。所用的质粒模板的类型包括：204M+180M；204M+180L1；204M+180L2；204V+180L1；204I+180L1。其中204M+180M指模板的C区204位密码子编码的氨基酸为蛋氨酸，而B区180位密码子编码的氨基酸为蛋氨酸；204M+180L指模板的C区204位密码子编码的氨基酸为蛋氨酸，而B区180位密码子为TTG且编码的氨基酸为亮氨酸；204M+180L2指模板的C区204位密码子编码的氨基酸为蛋氨酸，而B区180位密码子为CTG且编码的氨基酸为亮氨酸；204V+180L1指模板的C区204位密码子编码的氨基酸为缬氨酸，而B区180位密码子为TTG且编码的氨基酸为亮氨酸；204I+180L1指模板的C区204位密码子编码的氨基酸为异亮氨酸，而B区180位密码子为TTG且编码的氨基酸为亮氨酸。

PCR反应条件为95℃3min预变性，循环周期为95℃15s，50℃20s，72℃20s，共40个循环，在每个循环退火阶段采集Yellow和Orange通道荧光数据。PCR反应后，95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从45℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集Yellow和Orange通道荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图4，探针Probe 204(Yellow通道)和Probe 180(Orange通道)都可以根据其熔点对模板的基因型进行区分，单管放置多个不同颜色标记的自淬灭探针并不会造成探针之间的干扰，每条探针都能够很好的检测各自覆盖区域的突变，因此，对自淬灭探针标记进行多色标记，就可以同时检测多个不同位点的突变。

实施例5.线性自淬灭探针长度对熔解曲线分析影响的考察

我们设计了长度分别是26、30、36、41碱基的线性自淬灭探针，分别称作26-nt probe，30-nt probe，36-nt probe，41-nt probe(见表1)。考察它们对于匹配程度不同的靶序列(target)的熔解曲线分析结果。反应条件如下：25μL反应液中含2.5μL 10×PCRbuffer[10mM Tris-HCl，50mM KCl，5％glycerol(W/V)，pH 8.6]，3.0mM MgCl₂，0.2μM探针，不加靶核酸序列或者加入终浓度为0.4μM的上述靶核酸序列中的一种。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应程序为：95℃变性1min，35℃保温5min，随后按1℃/step的升温速率从35℃递增至90℃进行熔解曲线分析。

结果(见图5)表明，这些不同长度从26、30、36、41碱基的线性自淬灭探针都可以进行熔解曲线分析，而且都具备区分靶序列变异的能力。

表1.四种不同长度的线性自淬灭探针及其靶序列

实施例6.反应条件对PCR-熔解曲线分析法的影响

我们分别比较对称PCR和不对称PCR，使用具有外切活性的Taq酶和外切酶活性降低的TaqFS酶，PCR扩增循环采用两步法和三步法，实验条件如下：PCR扩增体系为：25μL反应体系中含有1×PCRbuffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，5％glycerol，pH 8.6)，3.0mM MgCl₂，200μM dNTPs，1.0U Taq或者TaqFS，0.04μM上游引物，0.4μM下游引物，0.1μM探针，5μL的质粒模板(1.0×10⁵copies)，水作为阴性控制。PCR扩增程序程序为：95℃3min预变性，然后是95℃10s，68℃(每一循环降低1度)10s，72℃20s，共10个循环，接下来是95℃10s，58℃10s，75℃(三步法)或者58℃(两步法)20s，共计40个循环。在每个循环退火阶段采集ROX通道的荧光信号。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，熔解曲线分析程序为：95℃变性1min，45℃保温5min，随后按1℃/step的升温速率从45℃递增至90℃进行熔解曲线分析。扩增的片段是霍乱弧菌的recA基因片段，上游引物是5′-TGTGCGTTTATCGATGCCGAGCAC-3′(SEQID No.56)，下游引物是5′-GCTTTTGGTGTCAAAGCCGC-3′(SEQ ID No.57)，线性自淬灭探针是5′-ROX-CCTGATACCGACGAGCAAGCACTGGA-BHQ2-3′(SEQ ID No.58)。

实验结果如图6可以看出，凡是使用对称PCR扩增都未得到熔解曲线分析结果(未列出)，用不对称PCR扩增的，所用的耐高温聚合酶无论具有外切酶活性的Taq还是外切活性大为降低的TaqFS，使用三步法还是两步法，都能给出熔解曲线分析结果。虽然在使用Taq时，酶切的程度会大些，但是基本不影响实验结果。

实施例7.人工合成的互补靶序列考察发夹型自淬灭探针熔解曲线法用于检测靶序列变异的能力

本实例设计了一条针对α-珠蛋白基因5′非翻译区的发夹型自淬灭探针，通过人工合成与探针完全互补和带有点突变的靶核酸序列，考察发夹型自淬灭探针熔解曲线法区分不同靶核酸序列的能力。所用的自淬灭探针Probe H：5′-FAM-cgGGTGTTTGTTCCTTCCCG-BHQ1-3′(SEQID No.59)，下划线表示发夹的臂序列部分，小写字母表示人工添加的靶序列无关序列。完全互补靶序列为Target-M：

5′-ACCGGGAAGGAACAAACACCAGGACGCAAAAAGCA-CGGGGCTGGGCTG-3′(SEQ ID No.60)，含有突变的靶序列为Target-UM：5′-ACGGACGCAAAAAGCA-CGGGGCTGGGCTG-3′(SEQ ID No.61)。下划线部分与探针互补，加框字母表示相应的碱基突变所在的位置。

人工合成的靶序列与荧光探针的熔解曲线分析体系为：25μL反应液中含有1×SSP buffer[67mM Tris-HCl pH 8.0，16.6mM(NH4)₂SO₄，6.7mM EDTA，0.085mg/mL BSA]，2.0mM MgCl₂，0.1μM的发夹型自淬灭探针0.2μM的靶序列Target-M或Target-UM或不加靶序列(阴性控制)。熔解曲线分析程序为：95℃变性1min，35℃，保温2min，随后按1℃/step升温速率，从40℃递增至75℃进行熔解曲线分析，在熔解曲线过程中采集FAM通道的荧光信号。本实验在Rotor-Gene 6000实时PCR仪(Corbett Research，澳大利亚)上进行。

如图7(左图)所示，没有靶序列存在时，由低温到高温的温度变化过程中，发夹型自淬灭探针自身的颈环结构逐渐打开，检测到的荧光信号随着温度的升高而增强，其中荧光变化最强的点对应的温度即为发夹型自淬灭探针自身二聚结构的熔点。当有互补的靶序列存在时，低温时发夹型自淬灭探针发出强烈的荧光；随着温度的升高，荧光强度缓慢下降，接近探针与靶杂交形成的双链杂交体的熔点时，荧光强度下降速率加快，其中荧光变化最强的点对应的温度即是探针与靶序列形成的双链杂交体的熔点；到达较高温时，荧光强度不再继续变化。发夹型自淬灭探针与不同的靶序列杂交形成的双链杂交体稳定性不同，因而具有不同的Tm值，从Tm值的差异就可以判断靶序列的差异。如图7(右图)所示，发夹型自淬灭探针自身二聚结构形成的熔点峰与双链杂交体形成的熔点峰朝向不一致，二者完全不会干扰，并且与双链杂交体形成的熔点峰相比，探针自身的二聚结构形成的峰几乎可以忽略不计。因此，发夹型自淬灭探针也可以用于熔解曲线分析。

实施例8.发夹型自淬灭探针PCR-熔解曲线分析法检测不同基因型的标本

采用实施例7中的发夹型自淬灭Probe H，并且采用实施例2中的反应体系和反应条件(用探针Probe H代替探针Probe 1)。实验结果如图8，由于实时PCR扩增曲线本身的荧光强度高低的重现性相对较差，而各基因型的差别就在于扩增曲线的荧光强度差异上(图8左图)，因此，很难对各种基因型进行区分。而PCR后的熔解曲线分析(图8右图)则可以很好的区分各种基因型。基因型αα/αα具有α1-珠蛋白基因和α2-珠蛋白基因，故具有两个熔点峰；基因型-α^3.7/--^SEA只有α2-珠蛋白基因，故只有高熔点的峰；基因型-α^4.2/--^SEA只有α1-珠蛋白基因，故只有低熔点的峰。因此，自淬灭探针溶解曲线法可以用于基因分型，只要根据熔点峰的有无及熔点的高低就可以对不同的基因型进行区分。

比较线性自淬灭探针和发夹型自淬灭探针的PCR-熔解曲线分析结果，可以看出，发夹型自淬灭探针在低温区的背景信号低，而线性自淬灭探针在低温区有明显的噪音峰，该结果说明了发夹型自淬灭探针的优势。

实施例9.相同荧光标记的两种探针同时检测两种突变的基因型

对于同时存在的但距离较远的突变需要使用不同的探针进行检测，通过使用相同荧光标记的不同探针，但是彼此的熔点有所差别，也可在同一个反应管中也能实现对不同区域突变的检测。以检测β-珠蛋白的两种突变-28(A＞G)突变和IVS-2-654(C＞T)突变的检测为例加以说明。

我们针对两种突变的野生型分别设计两条探针，两者Tm值差异较大，故两探针与野生型靶杂交时，具有距离熔点峰相距较远，很容易分辨。若模板中含有突变，则会出现新的熔点峰，依靠新出现的熔点峰的Tm值大小，可以对不同区域的突变进行区分。自淬灭发夹探针P1与野生型靶完全匹配，故与-28(A＞G)突变型靶杂交的Tm值较低；自淬灭发夹探针P8与IVS-2-654(C＞T)突变型的靶完全匹配，故与野生型的靶杂交的Tm值较低。PCR扩增体系为：25μL反应体系中含有1×SSP buffer[67mM Tris-HCl，pH 8.0，16.6mM(NH₄)₂SO₄，6.7mMEDTA，0.085mg/mL BSA]，2.0mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，1U Taq(HS)(TAKARA公司，为热启动Taq酶，具有5′→3′外切酶活性)，0.1μMF1，0.8μM引物R1，0.05μM引物F3，0.4μM引物R3，0.2μM探针P1，0.15μM探针P8(各引物和探针的序列见表2)，5μL的质粒模板或人类基因组DNA模板(约为50ng)。PCR扩增程序程序为：95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，52℃20s，72℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集相应检测通道的荧光信号。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，熔解曲线分析程序为：95℃变性1min，35℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集相应检测通道的荧光信号。实时PCR和熔解曲线分析都在Rotor-Gene 6000实时PCR仪上进行。

结果如图9所示，当模板为野生型(W)时，探针P1和P8都只有与野生型靶杂交的熔点，其中P1与野生型靶杂交形成双链杂交体的Tm值为67.92℃，P8与野生型靶杂交形成双链杂交体的Tm值为53.27℃；当模板为IVS-2-654(C＞T)纯合突变型(IVS-2-654M)时，P8探针的Tm值产生了变化，为56.6℃，而P1探针的靶仍为野生型，Tm值保持不变；当模板为-28(A＞G)纯合突变型(-28M)时，P1探针的Tm值产生了变化，为60.97℃，而P8探针的靶仍为野生型，Tm值保持不变。因此，根据各探针熔点的变化，我们可以识别不同区域的突变，从而实现了同种荧光标记的不同探针对不同区域突变的检测。

实施例10.不同荧光标记的发夹型自淬灭探针同时检测多个突变的基因型

利用不同荧光标记的自淬灭探针，可以单管检测多个突变，本实施例描述了在同一反应管内，用五种不同荧光标记的发夹型自淬灭探针检测β-珠蛋白的多个突变，即：FAM标记的探针P1检测-28(A＞G)，-29(A＞G)两种突变，ROX标记的P2检测CD17(A＞T)，CD15/16(+G)和CD14/15(+G)三种突变，CAL Fluor Red 635标记的P3检测IVS-1-1(G＞T)，IVS-1-5(G＞C)以及CD26(G＞A)三个突变，HEX标记的P4检测CD41/42(-TCTT)突变和CD43(G＞T)突变，Quasar 705标记的P5检测CD71/72(+A)和CD71/72(+T)两种突变。将这五种探针和两对引物即F1，R1，F2，R2混合(引物和探针序列见表2)，可以实现对所有突变基因型的单管同时检测。PCR扩增体系为：25μL反应液中含有1×SSP buffer，3.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs，1U Taq(HS)，0.1μM F1，1.0μM R1，0.2μM F2，1.6μM R2，0.2μM P1，0.2μM P2，0.1μM P3，0.3μM P4，0.1μM P5，5μL的人类基因组DNA模板(约50ng)。PCR的扩增程序和熔解曲线分析程序同实施例9。

图10给出了代表性的检测结果，每一个探针所覆盖的突变的基因型都得到了正确的检测。

表2.实施例9和实施10所用引物和探针列表

*下划线表示与靶序列互补的序列，小写字母为添加的靶序列无关序列。

参考文献：

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14.Lukhtanov，E.A.，et al，Nucleic Acids Res，2007，35：e30.

Claims

1.用于检测核酸是否存在变异或变异类型的方法，所述方法不用于疾病诊断，并且包括：

(1)针对需要检测核酸序列变异的核酸制备探针，其中所述探针是自淬灭探针，其标记了荧光基团和淬灭基团，使得与不存在靶核酸序列的情况相比，该探针和靶核酸序列杂交时荧光或荧光强度增加，并且，所述探针不包含能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰；

(2)通过不对称PCR扩增含有待检测核酸的片段，其中，在所述不对称PCR中，反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针杂交，并且在扩增前在扩增反应中加入所述探针，并且，所述不对称PCR所使用的聚合酶具有外切酶活性；

(3)扩增结束后对步骤(2)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，根据自淬灭探针所对应的熔点或者所述探针和待检测核酸序列之间杂交体的熔点或者该熔点的差异来判断待检测核酸是否具有变异以及任选地判断可能的变异类型。

2.用于检测核酸是否存在变异或变异类型的方法，所述方法不用于疾病诊断，并且包括：

(1)针对基因组中一个或多个待检是否各包含一种或多种具有靶序列变异的待检等位核酸序列的核酸区段，制备能够覆盖所述待检核酸区段的数量的探针，并于PCR反应开始前将所述探针加入下述(2)的反应体系中，其中所述探针是自淬灭探针，其标记了荧光基团和淬灭基团，使得与不存在靶核酸序列的情况相比，该探针和靶核酸序列杂交时荧光或荧光强度增加，并且，所述探针不包含能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰；

(2)通过不对称PCR在PCR反应体系中扩增基因组中所述一个或多个待检是否各包含一种或多种具有所述靶序列变异的所述待检等位核酸序列的核酸区段，在所述不对称PCR中，反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，且它所延伸而产生的链与探针杂交，并且，所述不对称PCR所使用的聚合酶具有外切酶活性；

(3)仍于所述反应体系中，在逐步升温下监控步骤(1)中制备的各探针与步骤(2)中扩增的各待检等位核酸序列的相互作用所致的荧光变化，从而同时得到所述各探针所对应的熔解曲线；

(4)对通过步骤(3)得到的熔解曲线求导，并取其负导数-dF/dT，从而得到所述各探针所对应的熔点；及

(5)通过比较步骤(4)得到的对应于各待检等位核酸序列和各探针之间的熔解温度来分析各待检等位核酸序列间是否存在靶序列变异。

3.权利要求1或2的方法，其中，所述变异是单核苷酸变异。

4.权利要求1或2的方法，其中，所述扩增反应中包含参照核酸或者野生型核酸。

5.权利要求1或2的方法，其中，在所述探针的5'末端标记荧光基团而在3'末端标记淬灭基团，或在所述探针的3'末端标记荧光基团而在5'末端标记淬灭基团。

6.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的序列包含或者是野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列。

7.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的序列与野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列相比具有一个或多个错配。

8.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1-10个错配。

9.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1-5个错配。

10.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1-4个错配。

11.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1-3个错配。

12.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1-2个错配。

13.权利要求7的方法，其中，所述探针具有1个或2个错配。

14.权利要求7的方法，其中，所述错配是单碱基的转换、颠换、插入或缺失。

15.权利要求1或2的方法，其中，所述荧光基团包括或者选自下列标记物：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE,HEX,CAL Orange560、TAMRA、CAL Red590、ROX、CAL Red610、TEXAS RED、CALRed635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5和/或Quasar705。

16.权利要求1或2的方法，其中，所述淬灭基团包括或者选自下列淬灭剂：DABCYL、BHQ类淬灭剂、ECLIPSE和/或TAMRA。

17.权利要求16的方法，其中，所述BHQ类淬灭剂选自BHQ-1和BHQ-2。

18.权利要求1或2的方法，其中，所述探针由未经修饰的碱基组成。

19.权利要求1或2的方法，其中，所述探针包含能增强或减弱探针结合能力的碱基。

20.权利要求19的方法，其中，所述能增强探针结合能力的碱基包括锁定核酸碱基。

21.权利要求19的方法，其中，所述能减弱探针结合能力的碱基包括通用结合碱基I。

22.权利要求1或2的方法，其中，所述探针是线性探针，其长度为5-100个碱基。

23.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为10-100个碱基。

24.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为10-50个碱基。

25.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为15-50个碱基。

26.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为20-50个碱基。

27.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为10-40个碱基。

28.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为10-20个碱基。

29.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为20-30个碱基。

30.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为30-40个碱基。

31.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为15-30个碱基。

32.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为20-40个碱基。

33.权利要求1或2的方法，其中，所述探针的长度为15-25个碱基。

34.权利要求3的方法，其中，所述单核苷酸变异是同一物种的不同个体间的同一基因座位上的核酸序列中的一个或多个相同或不同位置的单碱基的转换、颠换、插入或缺失，且所述基因组的一个或多个核酸区段相同或不同。