CN111690774A - 一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光vpcr试剂盒和方法 - Google Patents

一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光vpcr试剂盒和方法 Download PDF

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张磊
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周静
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Abstract

本发明涉及包含SEQ ID NO.1～2所示引物对和SEQ ID NO.3所示探针的用于小鼠肝炎病毒检测的超快速实时荧光VPCR试剂盒，还涉及用于检测肺小鼠肝炎病毒的方法。本发明试剂盒及方法可以准确检测样品中的小鼠肝炎病毒，基因扩增在40分钟内完成，快速简便，成本低廉，特异性和灵敏度高，应用前景良好。

Description

一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒和 方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒和方法。
背景技术
小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)属冠状病毒科、冠状病毒属，为单股正链RNA病毒。自然宿主为小鼠，也容易感染裸鼠与免疫缺陷小鼠。小鼠肝炎病毒一般呈隐形或亚临床感染，但具有高度传染性，传染途径依不同型分为飞沫传染或经口传染。小鼠肝炎病毒可能引起小鼠肝炎、脑炎和肠炎，感染后的小鼠免疫功能有可能下降，从而会引起鼠群急性感染，导致动物死亡。
随着我国生物科学、医学、药学等方面科研水平的不断提高，实验动物行业变成了不可或缺的组成部分之一，影响着整个科学研究的质量。实验动物微生物学标准GB/T14926.22-2001规定：MHV是实验动物清洁级及以上级别小鼠必须检测的项目之一，及时检出MHV具有重要意义。目前，用于检测MHV的方法主要为酶联免疫吸附方法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光方法(Immuno-fluorescence assay,IFA)和免疫酶法(Immuno-enzymatic Assay，IEA)。虽然免疫检测方法具有简便快捷、对实验室设备和人员要求较低的优势，但进行抗体检测时，从病毒进入小鼠机体到小鼠产生特异性的抗体需要几天的窗口期，该技术难以在小鼠感染初期检出阳性结果；而且还容易受到小鼠体内的干扰物质影响，导致假阴性结果出现，从而造成病毒在小鼠间传播开来。核酸作为病原体感染后最先能被检测到的标志物，其检测对于及时、有效地检出MHV、保证动物实验结果的准确性具有非常重要的意义。目前MHV核酸检测方法包括普通PCR、实时荧光PCR和恒温扩增等。普通PCR需要开盖进行凝胶电泳，操作繁琐，容易污染，并且检测通量非常低。恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一种新型的体外核酸扩增技术，具有恒温、高效、不需要特殊仪器设备等优点，但由于其对引物设计要求特别高、需要的酶种类多且结果不太稳定等原因，目前尚未广泛应用于实验动物核酸检测。专利CN101914631B中发明了一种检测小鼠肝炎病毒的实时荧光定量PCR的方法，扩增检测同时完成，自动化程度高，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，实时荧光PCR是目前核酸检测应用最广的方法。但是存在检测时间长的问题，通常需要1-2小时，导致MHV检测效率低，不适合用于大量样本筛查。因此对于小鼠肝炎病毒的检测，目前迫切需要发明快速准确的检测方法。
本单位(中国科学院成都生物研究所)在2018年申请了最新的核酸扩增专利技术--VPCR技术(专利号：201810647599.6)，该方法改变了传统PCR需要在两个或三个温度点上的固定时间来进行变性、退火及延伸的DNA扩增方式，而变为在高低的两个温度点之间不间断地进行往复升降温，让DNA双链的打开、引物对模板的结合与延伸在一个持续变温过程中完成，前期的方法学研究(Theranostics,2019,9,1572-1579.)表明VPCR这种动态的加热方式不但不会牺牲每次循环的扩增效率，同时在保证与传统PCR相当的灵敏度与准确性的前提下，能够利用现有的核酸扩增装置和扩增体系将PCR的反应时间缩短三分之二。将VPCR技术和实时荧光PCR技术进行结合，应用到MHV检测中，能将检测时间从2个小时缩短至40分钟，从而大幅度提高了检测的效率，适用于大量样本的快速筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒和方法。
本发明提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对、SEQ ID NO.3所示的探针。
本发明还提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测小鼠肝炎病毒的试剂中的用途。
其中，所述试剂是检测实验动物样品中的小鼠肝炎病毒的试剂。
本发明提供的用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒包括：RNA提取试剂、PCR反应液1、PCR反应液2、阴性质控品和阳性质控品，PCR反应液1中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液1中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。
本发明提供的一种检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR方法，其特征在于：检测步骤如下：
(1)提取样本RNA：取待检样本，用RNA提取试剂提取待检样本中的RNA；
(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的PCR反应液1、PCR反应液2按比例混合，加入待测样本RNA，进行逆转录和实时荧光PCR扩增，程序为：
逆转录50℃5min，
预变性95℃10s，
95℃0s，55℃0s收集荧光，进行50个循环；
(3)结果检测：通过荧光曲线对RNA扩增结果进行判定；
其中，所述待检样本可以为实验动物血液、血浆或血清样本。
综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测小鼠肝炎病毒，特异性和灵敏度高、适用性广、重复性好、检出限低；检测快速简便，基因扩增检测能在40分钟内完成，是目前小鼠肝炎病毒RNA检测最快的方法；成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为小鼠肝炎病毒检测方法的特异性验证图。
图2为不同浓度小鼠肝炎病毒模板RNA扩增图。
图3为不同浓度模板与Ct值的关系图。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒和检测方法
一、本发明试剂盒成分
包含RNA提取试剂、PCR反应液1、PCR反应液2、阴性质控品和阳性质控品。PCR反应液1中含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对、SEQ ID NO.3所示的荧光探针、PCR缓冲液以及脱氧核糖核苷三磷酸等成分；PCR反应液2含有检测需要的逆转录酶和DNA聚合酶。
各自序列如表1所示：
表1本发明引物及探针
Figure BDA0002545523930000021
Figure BDA0002545523930000031
注：F为上游引物，R为下游引物，P为探针，荧光探针为在探针P(SEQ ID NO.3)的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团，荧光基团可以是FAM，淬灭基团可以是BHQ，荧光探针结构可以为5’-FAM-SEQ ID NO.3-BHQ-3’。
二、采用本发明试剂盒检测小鼠肝炎病毒
1、采取RNA提取试剂提取样品的RNA
2、定量PCR扩增
配制定量PCR扩增体系：
在冰盒中配制如下反应体系，反应体系为25μL：
PCR反应液1 19.0μL
酶混合液 1μL
样品RNA 5.0μL
在各设定的反应管中分别加入制备好的样品RNA溶液，盖紧管后混匀，6000r/min离心5s～10s。将密封好的反应管转移至扩增区。
实时荧光PCR检测：
a)将上一步离心后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
b)实时荧光PCR反应条件：逆转录50℃5min，预变性95℃10s，→50×(95℃0s→55℃0s收集荧光)。
c)检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
3、结果判定与表述：
阈值设定原则：
阈值设定为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×StdDev[cycle(3-15)]。
有效性原则:
以下条件有一条不满足时，实验视为无效；
a)空白对照：无FAM荧光信号检出或Ct值≥45.0，未出现典型的扩增曲线。
b)阴性对照：无FAM荧光信号检出或Ct值≥45.0，未出现典型的扩增曲线。
c)阳性对照：有FAM等荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值＜30.0。
样品检测：
a)当检测体系有FAM荧光信号检出，且Ct值＜45.0，并出现典型的扩增曲线时，判定被检样品为阳性。
b)当45.0≤Ct值≤50.0时，且有典型的扩增曲线时，则需重复实验。再次扩增后检测体系的Ct值仍≤45.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品为阳性。当再次扩增后，检测体系Ct值＞45.0，或无典型的扩增曲线，则判定被检样品为阴性。
结果的表述：
结果为阳性者，表述为“检出小鼠肝炎病毒RNA”；
结果为阴性者，表述为“未检出小鼠肝炎病毒RNA”。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明试剂盒及方法的特异性检测
分别以小鼠肝炎病毒、小鼠腺病毒1型、小鼠腺病毒2型、小鼠微小病毒、共计4种病毒核酸为模板，用实施例1的试剂盒及方法，进行Real-time PCR扩增。
扩增结束后，通过观察对不同模板核酸的扩增曲线及Ct值来判定其特异性。若无典型扩增曲线且Ct值大于45或无Ct值，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。
实验结果见图1。结果显示，4种病毒RNA中，仅有小鼠肝炎病毒RNA样品有Ct值，有典型扩增曲线且平均Ct值为21.3，小于45，判定为含有小鼠肝炎病毒RNA，其它病毒均未检出，特异性验证结果理想。
可见，本发明方法和试剂盒的检测结果与样本的实际情况一致，说明本发明方法和试剂盒特异性好，可以准确检测小鼠肝炎病毒。
试验例2本发明试剂盒及方法的灵敏度检测
取已验证的小鼠肝炎病毒RNA，按浓度梯度进行倍比稀释作为反应模板(模板浓度分别为5copies/μL、50copies/μL、5×102copies/μL、5×103copies/μL、5×104copies/μL、5×105copies/μL，用实施例1的试剂盒及方法，进行扩增反应。确定模板RNA浓度范围与Ct值线性关系，同时根据公式，计算检测方法的扩增效率。并确定模板RNA的灵敏度。
结果见表2和图2-3。
表2不同浓度模板的Ct值
模板浓度 Ct值
5copies/μL /
50copies/μL 40.21
5×10<sup>2</sup>copies/μL 35.24
5×10<sup>3</sup>copies/μL 32.87
5×10<sup>4</sup>copies/μL 29.55
5×10<sup>5</sup>copies/μL 25.75
结果显示，当模板RNA浓度在50copies/μL至5×105copies/μL间时，模板RNA浓度和获得的Ct值之间线性关系好(相关系数98.9％)，扩增效率高，为94.5％。当阈值设为45个循环时，RNA检测的灵敏度为50copies/μL，灵敏度高。
综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测小鼠肝炎病毒，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
四川省中医药科学院
<120> 一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒和方法
<130> 1
<141> 2020-06-17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
catcaacctc aaggaagttg gcac 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caacatgagc cacaacctgt gca 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgtatgtga aatggccttg gtatgtttgg 30

Claims (6)

1.SEQ ID NO.1～2所示的引物对。
2.SEQ ID NO.3所示的探针。
3.SEQ ID NO.1～2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测小鼠肝炎病毒的试剂中的用途。
4.根据权利要求3所示的用途，其特征在于：所述试剂是检测小鼠肝炎病毒的试剂。
5.一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPCR试剂盒，包括：RNA提取试剂、PCR反应液1、PCR反应液2、阴性质控品和阳性质控品，PCR反应液1中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液1中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。
6.一种检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光VPC方法，其特征在于：
检测步骤如下：
(1)提取样本RNA：取待检样本，用RNA提取试剂提取待检样本中的RNA；
(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的PCR反应液1、PCR反应液2按比例混合，加入待测样本RNA，进行逆转录和实时荧光PCR扩增，程序为：
逆转录50℃5min，
预变性95℃10s，
95℃0s，55℃0s收集荧光，进行50个循环；
(3)结果检测：通过荧光曲线对RNA扩增结果进行判定。
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