CN113549618A

CN113549618A - 基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法

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Publication number: CN113549618A
Application number: CN202110723406.2A
Authority: CN
Inventors: 刘鸿博; 宋宏彬; 邱少富; 王立贵; 杜昕颖; 向莹; 杨明娟; 杨超杰; 刘洪波; 王辉; 王琪
Original assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113549618B

Abstract

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas13a检测SARS‑CoV‑2核酸的方法。本发明提供的方法简便、易行、快速，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，灵敏度为500拷贝/mL，显示出了极高的灵敏度。在实际应用中，检测灵敏度为98.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为98.04％，能有效检出新型冠状病毒的核酸样本。

Description

基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，属于微生物检测应用领域。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2，SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋白基因(Nucleocapsid，N)。感染人体后可造成新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。目前，新型冠状病毒的检测和确诊方法有：核酸检测法、免疫学检测方法和病毒分离培养，其中核酸检测是认可度最高的检测方法。

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”，该系统首先在大肠杆菌中被发现。随着对CRISPR-Cas系统作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示，研究人员发现该系统具有强大和广泛的应用潜力，如：作为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细菌进行快速分子分型等。新发现的Cas13a系统可用于核酸检测，实现病原体的快速诊断。CRISPR-Cas13a系统用于核酸检测的原理为：Cas13a蛋白首先与相应的crRNA结合形成Cas13a-crRNA复合体，目标RNA存在时，crRNA的中心种子区先与目标RNA互补结合，随后延伸到两端。目标RNA与crRNA的复合物可诱导Cas13a蛋白的高等真核生物和原核生物核苷酸结合(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding，HEPN)结构域相互靠近，产生活性的HEPN催化位点，Cas13a蛋白的RNA酶活性激活，可剪切任何暴露的RNA分子，包括与Cas13a-crRNA复合体结合的目标RNA和任何游离的RNA分子。基于该原理，将RNA制备成荧光淬灭探针，通过监测荧光信号的释放实现对目标RNA序列的特异性检测。然而，使用单一的CRISPR-Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。

常用的核酸扩增方法有：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR),重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA或Recombinase-aidAmplification，RAA)，环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)等。其中RAA可在较低温度下(37～42℃)，短时间内完成核酸扩增反应，具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点，在病原的快速检测领域有很大的应用潜力。

本发明的目的是基于CRISPR-Cas系统，结合RT-RAA/RAA恒温扩增与CRISPR荧光检测方法，提供一种可以快速检测新型冠状病毒的高灵敏、高特异的核酸检测方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种用于CRISPR-Cas13a技术检测SARS-CoV-2核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11中任一序列。

其次，本发明还提供了一种应用上述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas13a技术检测SARS-CoV-2核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的RNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas13a反应体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。

在一个更为优选的实施方案中，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.24-27任一所示序列的核酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.28-32任一所示序列的核酸。

尤为优选地，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.27所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.29所示。

在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.11所示。

在又一个优选的实施方案中，步骤(2)所述RNA探针的序列如SEQ ID NO.13所示。在本发明一个具体的实施方案中，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

第三，本发明还提供了一种CRISPR-Cas13a技术检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的RNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.24-27任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.28-32任一所示序列的下游引物。

在一个优选的实施方案中，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.27所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.29所示。

在另一个优选的实施方案中，所述RNA探针的序列如SEQ ID NO.13所示。

第四，本发明提供了一种用于制备上所述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.33所示，所述下游DNA单链的序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12中任一序列。

在一个优选的实施方案中，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.12所示。

最后，本发明提供了一种用于制备上述crRNA的方法，所述方法为先使序列如SEQID NO.33所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12中任一所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。

本发明提供的CRISPR-Cas13a技术检测SARS-CoV-2的N基因的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需30-60分钟，便于基层的快速检测。当结合重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术时，即RAA-Cas13a检测技术的灵敏度高，至少可达到500copy/mL，符合《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》中对高敏感度新冠检测试剂的灵敏度描述。在实际应用中，检测灵敏度为98.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为98.04％，能有效检出新型冠状病毒的核酸样本。本方法仅需要提供37℃-42℃即可完成全部反应，通过简单的荧光读取设备即可判读结果，适合仪器条件较为简单的卫生机构或疫情现场开展使用。

附图说明

图1.N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点与其它冠状病毒基因序列比对结果图；

图2.crRNA T7体外转录单链DNA的设计示意图；

图3.含目的基因序列的pUC57质粒图谱；

图4.N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点筛选结果图；

图5.CRISPR-Cas13a核酸检测靶点N1恒温扩增引物筛选电泳图；

图6.Cas13a-N-1检测靶点特异性结果图；

图7.Cas13a-N-6检测靶点特异性结果图；

图8.CRISPR-Cas13a核酸检测靶点N6恒温扩增引物筛选电泳图；

图9.Cas13a-N-6靶点的检测灵敏度(稀释至1000拷贝/mL)结果图；

图10. 500拷贝/mL N基因阳性标准品检测结果图；

图11.Cas13a-N-6靶点检测模拟样本核酸结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

构建实施例1.6个N基因的CRISPR-Cas13a核酸检测

试剂：重组CRISPR-Cas13a蛋白(北京科昕生物科技有限公司，货号KX-E-003)、RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)(杭州众测生物科技有限公司)、基础型核酸扩增试剂(RAA法)(杭州众测生物科技有限公司)、新型冠状病毒(2019-nCoV)N基因假病毒(上海碧云天生物技术有限公司，货号C3021-1ml,N基因来源：(Gene ID：43740575))、RNase Inhibitor,Murine(M0314L)(美国New England Biolabs生物公司)、Ribonucleotide Solution Mix(N0466L)

(美国New England Biolabs生物公司)、T7 RNA Polymerase(M0251L)(美国NewEngland Biolabs生物公司)、Monarch RNA纯化试剂盒(T2030L)(美国New EnglandBiolabs生物公司)、HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒(E2050S)(美国New EnglandBiolabs生物公司)、DNase I(美国New England Biolabs生物公司)、MgCl₂(1M)(美国ThermoFisher Scientific生物公司)、无酶水(北京宝日医生物技术有限公司(takara中国))、新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(上海伯杰医疗科技有限公司)

仪器：Eppendorf 5424离心机(德国Eppendorf公司)、DeNovix DS-11FX超微量分光光度计(美国DeNovix公司)、7500FAST荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、多功能酶标仪(美国MolecularDevices公司)

1、新型冠状病毒基因序列分析寻找新型冠状病毒CRISPR-Cas核酸检测靶点

方法：从NCBI数据库中下载506条新型冠状病毒基因序列，使用mafft软件进行基因序列比对，参数设置为自动，得到新冠病毒的保守基因序列。同时，从NCBI数据库中下载其它六种可感染人的冠状病毒的基因序列，包括HCoV-OC43，HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV，将这些冠状病毒的基因序列与新型冠状病毒的基因序列再次进行比对，得到新型冠状病毒的特异性保守基因序列。

CRISPR-Cas13a系统的核酸检测目的基因序列3’端核苷酸非G。在序列比对得到的新冠病毒N基因序列保守区寻找CRISPR-Cas13a系统的核酸检测靶点。

结果：506条新型冠状病毒基因序列经过比较后，共找到6个N基因的CRISPR-Cas13a核酸检测靶点，见表1，与其它六种可感染人的冠状病毒基因序列无交叉，六个检测靶点的基因序列均有良好的特异性(图1)。图1中：a：Cas13a-N-1检测靶点，b：Cas13a-N-2检测靶点，c：Cas13a-N-3检测靶点，d：Cas13a-N-4检测靶点,，e：Cas13a-N-5检测靶点，f：Cas13a-N-6检测靶点。

表1 N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点

注：检测靶点的位置以NC 045512基因序列为参照。

2、设计合成各检测靶点的crRNA

根据各靶点的基因序列以及CRISPR-Cas13核酸检测系统，设计相应的crRNA。crRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。crRNA序列可由生物公司直接合成，或通过T7体外转录的方式获得。本试剂盒主要通过T7体外转录的方式得到各核酸检测靶点的crRNA，下文将对该过程进行详细介绍。

(1)设计并合成crRNA的T7体外转录模板

在CRISPR-Cas13a系统中，将RNA序列中的目标基因序列进行反向互补，在该反向互补序列的5’端插入CRISPR-Cas13a核酸检测系统的保守基因序列，即可得到该检测靶点的crRNA序列。在该crRNA序列的5’端插入T7启动子基因序列：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQID NO.33)，将该基因序列反向互补后即可得到该检测靶点的T7体外转录单链DNA模板，如图2所示。图2中：crRNA序列中划线部分为CRISPR-Cas13a核酸检测系统的保守基因序列，体外转录模板序列中划线的部分为T7启动子的反向互补序列。

(2)T7体外转录生成crRNA

1)退火生成T7体外转录所需双链DNA

使用退火的方法生成T7体外转录双链DNA时，需要上游DNA单链和下游DNA单链，其中上游(T7-Foward)为T7启动子序列(SEQ ID NO.33)，下游(T7-Reverse)为各核酸检测靶点的T7体外转录单链DNA模板序列，按照表2所示方案配置退火反应体系。将该反应体系置于PCR仪、水浴锅或恒温金属浴中，95℃孵育10分钟，关闭仪器电源，仪器温度自然降至室温后取出；或将该反应体系放入PCR仪中95℃孵育10分钟后，以0.1℃/s的速率降温至4℃后取出，退火产物于-20℃保存备用。

表2退火反应体系

2)T7体外转录生成crRNA

将各核酸检测靶点的退火产物作为样本DNA，使用T7体外转录试剂盒(HiScribeT7快速高效RNA合成试剂盒，NEB)进行体外转录，体外转录反应体系如表3所示。将配置好的转录体系混匀并短暂离心后，置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中过夜孵育(12-16小时)。

表3退火体外转录反应体系

3)crRNA的纯化回收

将过夜孵育的样本取出，向反应管中依次加入20μL无酶水和2μL DNase I，以去除残留的DNA核酸，混匀并短暂离心后置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中孵育15分钟后取出。

使用Monarch RNA纯化回收试剂盒，按照说明书对crRNA进行纯化回收，具体步骤如下：

a)添加100μL RNA Cleanup Binding Buffer至50μL的样本中，吹打混匀后室温静置10分钟，以确保crRNA与反应液充分结合；

b)添加150μL无水乙醇至样本中并吹打混匀，将吸附柱放入收集管中，添加样品反应液至吸附柱中，静置几分钟后13000r离心1分钟，弃废液；

c)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL RNA Cleanup WashBuffer，13000r离心1分钟，弃废液，该步骤重复两次；洗液第一次使用时应根据说明加入相应体积的无水乙醇；

d)将吸附柱转移至1.5ml无酶管中，加入20-30μL无酶水至吸附膜，对纯化的样本crRNA进行洗脱，室温下静置10分钟后13000r离心1分钟，收集离心液；使用超微量分光光度计测量crRNA浓度，于-80℃冰箱保存备用。

所有的T7体外转录单链DNA模板序列，以及T7启动子基因序列均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

结果：根据CRISPR-Cas13a系统核酸检测的原理，以及其crRNA的保守基因序列，设计得到6个N基因的crRNA和crRNA T7体外转录单链DNA序列，通过直接合成或T7体外转录的方式得到检测靶点的crRNA。具体基因序列详见表4。

表4 N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点crRNA和crRNA T7体外转录序列

3、靶点阳性质粒标准品

方法：将包括N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点的目的基因序列，以及该基因序列其前后各200-300bp的核苷酸序列，插入pUC57质粒(北京天一辉远生物科技有限公司，pUC57质粒序列见SEQ ID NO.35)骨架中(402…424bp区间被替换)，合成新冠病毒N基因阳性质粒标准品。使用相同的方法，选择近似位置的基因序列，合成其它六种可感染人的冠状病毒的N基因的阳性质粒标准品。pUC57质粒的质粒图谱如图3所示，Target标识为插入序列所在位置。在本发明的一个具体实施方案中，插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。所有的质粒全基因组序列均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

4、基于CRISPR-Cas13a系统的核酸检测

合成RNA荧光报告探针

RNA序列两端分别标记FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团，即可构成RNA荧光报告探针。报告探针的序列为：5’-FAM-uuuuuu-BHQ1-3’(SEQ ID NO.13)，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

CRISPR-Cas13a系统的荧光检测

使用本研究建立的CRISPR-Cas13a核酸检测体系对新冠病毒N基因各检测靶点的核酸扩增产物进行检测。

表5 CRISPR-Cas13a荧光检测体系

注：荧光定量PCR仪的反应体系总体积为25μL，表中各反应组分均减半。

阳性结果判定

与阴性对照相比，检测60分钟时荧光强度有明显升高，经过统计学分析，三次重复实验的荧光强度值与阴性对照间有统计学差异。

5、核酸扩增(RT-RAA/RAA法)

(1)设计各检测靶点的恒温扩增引物

RAA恒温扩增引物的设计要求为：引物长度为30-35bp，引物的5’端为AT碱基富集区，引物的3’端为CG碱基富集区，避免引物自身形成发夹结构，避免上下游引物之间形成引物二聚体，可不考虑引物本身的溶解温度Tm值。另外，在设计CRISPR-Cas13a核酸检测靶点的恒温扩增引物时，应在上游扩增引物的5’端加入T7启动子序列，此时上游引物的序列较长，应注意避免引物自身发夹结构的形成。在本实验中，设计恒温扩增引物时，在保证引物扩增效率的情况下，使扩增产物的片段长度尽量小。

在每个CRISPR核酸检测目的基因处设计多条上游扩增引物和多条下游扩增引物，配对组合后对含有各检测靶点基因序列的阳性质粒标准品进行扩增。

所有的引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

(2)反转录-RAA扩增(RT-RAA)

使用RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)，对新型冠状病毒阳性标准品或样本核酸进行一步法反转录-恒温扩增反应，核酸扩增体系见表6。将配置好的反应溶液置于42℃恒温金属浴或PCR仪中反应30分钟，扩增完成后取出，扩增产物于4℃保存备用。

表6 RAA恒温扩增体系

注：A液为水化溶液，B液为乙酸镁。

核酸扩增效果可通过DNA凝胶电泳检测判定。

6、对6个N基因CRISPR-Cas13a核酸检测靶点的评价

CRISPR-Cas13a系统的靶向剪切目标为RNA序列，需将各靶点扩增产物或阳性质粒体外转录为RNA后方可进行检测。因此，本研究设计了包含6个N基因检测靶点序列的恒温扩增引物，其中上游引物序列加入了T7启动子，引物序列信息见表7。将该引物的扩增产物作为样本核酸进行CRISPR-Cas13a荧光检测，使用相同的核酸检测体系，仅crRNA不同，且各靶点crRNA浓度保持一致，相同的反应条件下，对N基因的6个CRISPR-Cas13a核酸检测靶点进行筛选。检测结果如图4所示，图4中：a：6个核酸检测靶点60分钟内各靶点荧光值变化折线图；b：6个核酸检测靶点检测60分钟时的荧光强度值，各组荧光值与阴性对照组比较，*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001，****为P＜0.0001。NC为阴性对照。6个检测靶点的荧光值与阴性对照相比均有统计学差异，荧光值最高的检测靶点为Cas13a-N-1，P＜0.0001，选为N基因的CRISPR-Cas13a核酸检测靶点优选荧光值较高的N1、N6靶点进入下一轮实验，进一步评价该靶点的特异性和检测下限。

表7 N基因CRISPR-Cas13a恒温扩增引物

构建实施例2.Cas13a-N-1靶点的RAA恒温扩增及CRISPR-Cas13a检测

1.恒温扩增引物的设计和筛选

Cas13a-N-1检测靶点共设计合成了5条上游引物，3条下游引物，各引物基因序列信息见表8。将上下游引物两两配对组合，RAA扩增含有新冠病毒N基因序列的阳性质粒，通过DNA凝胶电泳分析各引物对核酸扩增情况，如图5所示。图5中：1-3泳道：1F与1R-3R依次配对；4-6泳道：2F与1R-3R依次配对；7-9泳道：3F与1R-3R依次配对；10-12泳道：4F与1R-3R依次配对；13-15泳道：5F与1R-3R依次配对。2泳道为最终选择引物对扩增结果。扩增效果近似时，对扩增产物进行CRISPR-Cas13a检测，最终选择扩增产物片段较小且扩增效果相对较好的引物对Cas13a-N-1-AF1/Cas13a-N-1-AR2建立该靶点的恒温扩增体系。

表8 Cas13a-N-1检测靶点恒温扩增引物

2.Cas13a-N-1检测靶点的特异性

结果：使用筛选得到的Cas13a-N-1检测靶点的扩增引物，对其它六种冠状病毒的N基因阳性质粒进行RAA恒温扩增，随后进行CRISPR-Cas13a检测，观测荧光值升高情况。检测结果如图6所示，图6中，NC为阴性对照。检测60分钟时，除新冠病毒N基因阳性质粒荧光值升高外，人冠状病毒OC43的N基因检测时荧光值也有轻微升高，因此排除该检测靶点。选择特异度高的Cas13a-N-6靶点进行后续实验。

构建实施例3.Cas13a-N-6靶点的RAA恒温扩增及CRISPR-Cas13a检测

1.Cas13a-N-6检测靶点恒温扩增引物的设计和筛选

Cas13-N-6检测靶点共设计合成了4条上游引物，5条下游引物，各引物基因序列详见表9。将上下游引物配对组合，RAA扩增新冠病毒N基因阳性质粒，通过DNA凝胶电泳检测分析不同引物对的扩增效果，扩增效果近似的引物对，对其扩增产物进行CRISPR-Cas13a检测，最终选取扩增效果较好，产物片段较小的引物对Cas13a-N-6-AF4/Cas13a-N-6-AR2建立恒温扩增反应，如图8所示。图8中：1-5泳道：1F与1R-5R依次配对；6-10泳道：2F与1R-5R依次配对；11-15泳道：3F与1R-5R依次配对；16-20泳道：4F与1R-5R依次配对。17泳道为最终选择引物对扩增结果。

表9 Cas13a-N-6检测靶点恒温扩增引物

2.Cas13a-N-6检测靶点的特异性

使用Cas13a-N-6-AF4/Cas13a-N-6-AR2引物对，RAA扩增其它六种冠状病毒N基因阳性质粒，扩增产物进行CRISPR-Cas13a荧光检测，观测荧光值变化情况。检测结果如图7所示，图7中，：NC为阴性对照。连续监测60分钟，Cas13a-N-6靶点检测特异性良好，其它冠状病毒N基因阳性质粒的荧光值无升高。最终选择Cas13a-N-6作为新冠病毒N基因RAA-CRISPR-Cas13a荧光检测的靶点。

3.Cas13a-N-6检测靶点的检测下限

将N基因阳性质粒作为标准品，用于评价各靶点RAA-CRISPR荧光检测的灵敏度/检测下限。使用超微量分光光度计测量阳性质粒的浓度，根据质粒浓度和质粒片段大小计算质粒拷贝数。对质粒浓度进行十倍梯度稀释，直至稀释到单拷贝每微升为止。

质粒拷贝数计算如公式(I)所示：

注：c为质粒浓度，DNAlength为阳性质粒的基因序列全长，x为最终得到的质粒拷贝数。

结果：使用筛选得到的Cas13a-N-6靶点的扩增引物对，RAA恒温扩增梯度稀释的各浓度新冠病毒N基因阳性质粒，并对扩增产物进行CRISPR-Cas13a检测。结果如图9所示。图9中，a：Cas13a-N-6靶点CRISPR荧光检测30分钟内各浓度样本荧光值变化折线图；b：各浓度样本Cas13a-N-6靶点CRISPR检测30分钟的荧光强度值，各组荧光值均与阴性对照组比较，****为P＜0.0001。NC为阴性对照。反应30min后，Cas13a-N-6检测靶点的检测下限即可达到1000拷贝/mL，CRISPR检测荧光值与阴性对照相比P＜0.0001，其它浓度阳性质粒样本的荧光值与阴性对照相比P值均小于0.0001。因此，本研究建立的基于CRISPR-Cas13a核酸检测系统，RAA核酸扩增联合Cas13a-N-6检测靶点的CRISPR荧光检测，对新冠病毒N基因的检测灵敏度高，至少可达到1000copy/mL，符合国家对核酸检测产品灵敏度的要求。

根据国务院联防联控机制发布的《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》，要求医疗机构对集中隔离人员使用高灵敏检测试剂(检测限≤500拷贝/mL)。对本研究建立的反应体系进行灵敏度补充实验。结果如图10所示，针对500copy/mL的N基因阳性标准品，本方法能够检出显著的荧光值升高，即检测下限可达500copy/mL。

应用实施例1：新型冠状病毒模拟样本检测

对新型冠状病毒N基因假病毒进行核酸提取，得到新冠病毒N基因模拟核酸样本，用来验证N基因检测靶点的RT-RAA-CRISPR核酸检测的有效性。

结果：使用上述过程建立的RT-RAA恒温扩增与CRISPR-Cas13a核酸检测技术，对不同浓度的新冠病毒N基因模拟核酸样本进行检测，验证Cas13-N-6靶点的检测情况。结果如图11所示，图11中，：各组荧光值与阴性对照组比较，*为P＜0.05，**为P＜0.01。NC为阴性对照。CRISPR荧光检测30分钟后，所有浓度的N基因模拟核酸样本均被检出，P＜0.05。因此，基于CRISPR-Cas13a系统，结合RAA扩增和CRISPR检测的Cas13a-N-6靶点该能有效检出新冠病毒核酸样本。

应用实施例2：新型冠状病毒核酸样本检测

使用上述建立的新冠病毒N基因的核酸检测平台，对经过核酸检测金标准“荧光定量PCR法”确认的新冠病毒核酸样本进行检测，验证各靶点RT-RAA-CRISPR荧光检测对实际核酸样本的检出情况。

RT-PCR方法：使用上海伯杰医疗科技有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，对新型冠状病毒样本核酸进行检测与鉴定。按照说明书配制反应体系，使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪对样本核酸进行检测，按照说明书设置反应条件，选择FAM，HEX，ROX荧光通道，根据各荧光通道的CT值判定新冠病毒核酸样本的检测结果。

结果：收集了50份新型冠状病毒阳性临床核酸样本，50份阴性样本，阴性样本来自无症状一般人群，经荧光定量RT-PCR实验验证后，所有核酸样本完整性良好。使用本研究建立的RT-RAA恒温扩增方法与CRISPR-Cas13a核酸检测技术，对新型冠状病毒核酸样本进行检测。检测结果如表10所示，阳性样本检出49个，阴性样本全部检出，该检测方法的检测灵敏度为98.00％，特异度为100.00％，阳性预测值为100.00％，阴性预测值为98.04％，能有效检出新型冠状病毒的核酸样本，与荧光定量PCR法一致性较高。

表10样本荧光定量PCR检测与CRISPR检测一致性(Cas13a-N-6)

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaacu guugcgacua cgugaugagg 60

aacg 64

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttcctcat cacgtagtcg caacagttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatccccccc tatagtgagt cgtatta 87

<210> 3

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaagc aagagcagca ucaccgccau 60

ugcc 64

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaatggcg gtgatgctgc tcttgcttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt atta 84

<210> 5

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuuga uggcaccugu guaggucaac 60

cacg 64

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtggttgac ctacacaggt gccatcaagt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt atta 84

<210> 7

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacgcaa aaugacuuga ucuuugaaau 60

uugg 64

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaaatttca aagatcaagt cattttgcgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt atta 84

<210> 9

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguaa ggcuugaguu ucaucagccu 60

ucuu 64

<210> 10

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagaaggctg atgaaactca agccttacgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt atta 84

<210> 11

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguca gcacugcuca uggauuguug 60

caau 64

<210> 12

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgcaacaa tccatgagca gtgctgacgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt atta 84

<210> 13

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

uuuuuu 6

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc 50

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aacgtttata tagcccatct gccttgtgtg gtc 33

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc 50

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taatacgact cactataggg tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aac 53

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taatacgact cactataggg acggcatcat atgggttgca actgagggag cc 52

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taatacgact cactataggg caactgaggg agccttgaat acaccaaaag at 52

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

taatacgact cactataggg ttgaatacac caaaagatca cattggcacc cgc 53

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agagcagcat caccgccatt gccagccatt ctag 34

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcaagcagca gcaaagcaag agcagcatca ccgc 34

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctgtcaagca gcagcaaagc aagagcagca tcacc 35

<210> 24

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taatacgact cactataggg cgcatacaaa acattcccac caacagagcc ta 52

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

taatacgact cactataggg acgcatacaa aacattccca ccaacagagc ct 52

<210> 26

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taatacgact cactataggg gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa act 53

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

taatacgact cactataggg aaactcaagc cttaccgcag agacagaaga aa 52

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aacgtttata tagcccatct gccttgtgtg gtc 33

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttgtgtggtc tgcatgagtt taggcctgag ttgag 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcgaaaacgt ttatatagcc catctgcctt gtgtg 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgaaaacgtt tatatagccc atctgccttg tgtgg 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaaacgttta tatagcccat ctgccttgtg tggtc 35

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

taatacgact cactataggg 20

<210> 34

<211> 1460

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 34

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

actcatgcag accacacaag gcagatgggc tatataaacg ttttcgcttt tccgtttacg 1320

atatatagtc tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact acatagcaca agtagatgta 1380

gttaacttta atctcacata gcaatcttta atcagtgtgt aacattaggg aggacttgaa 1440

agagccacca cattttcacc 1460

<210> 35

<211> 2710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700

ccctttcgtc 2710

Claims

1.一种用于CRISPR-Cas13a技术检测SARS-CoV-2核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11中任一序列。

2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas13a技术检测SARS-CoV-2核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.24-27任一所示序列的核酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.28-32任一所示序列的核酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.27所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.29所示。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述crRNA分子的序列如SEQ IDNO.11所示。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述RNA探针的序列如SEQID NO.13所示。

8.一种CRISPR-Cas13a技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的RNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.24-27任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.28-32任一所示序列的下游引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.27所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.29所示。

10.根据权利要求8或9任一所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA探针的序列如SEQ IDNO.13所示。

11.一种用于制备权利要求1所述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.33所示，所述下游DNA单链的序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12中任一序列。

12.根据权利要求11所述的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述下游DNA单链的序列为SEQ ID NO.12所示。

13.一种用于制备权利要求1所述crRNA的方法，其特征在于，先使序列如SEQ ID NO.33所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10、SEQ ID NO.12中任一所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述下游DNA单链的序列为SEQ IDNO.12所示。

15.一种用于评价权利要求8所述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒，其特征在于，所述质粒是在序列如SEQ ID NO.35所示的pUC57质粒的402bp至424bp区间插入序列如SEQ IDNO.34所示的核酸构建而成。