CA2584474A1 - Atp-metrie pour detecter et denombrer les virus - Google Patents
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Abstract
La présente invention a trait à l'utilisation d'ATP-métrie pour détecter et dénombrer des virus, par le biais des NA libres de leurs cellules hôtes cibl es ou par le biais des NA liés au DNA ou RNA viral. Elle concerne également le procédé de détermination des virus par ATP-métrie.
Description
ATP-METRIE POUR DETECTER ET DENOMBRER LES VIRUS
Domaine de l'invention La présente invention a trait à une nouvelle technique d'ATP-métrie pour détecter et dénombrer les virus à partir des nucléotides adényliques (AN) des cellules hôtes ou du patrimoine génétique (DNA ou ARN) des virus. Elle concerne également l'utilisation de cette nouvelle technique et un procédé de mise en eeuvre à partir de cellules hôtes selon que les * virus à
déterminer sont lytiques (à l'issue de leur développement, ils clivent la paroi des cellules hôtes) ou non lytiques (à l'issue de leur développement, ils traversent la paroi des cellules hôtes sans la détruire), d'une part, ou à
partir du DNA ou du RNA des virus selon qu'il s'agit de virus à DNA ou à RNA, d'autre part.
Art antérieur On sait l'ATP-métrie, qui est fondée sur la réaction :
(1) luciférine + ATP + Oz + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons, permet de mesurer efficacement la teneur en ATP d'un milieu. Cette réaction est spécifique de l'ATP, quel que soit le système utilisé luciférine (substrat)/luciférase (enzyme). Elle permet de distinguer les cellules mortes (dépourvues d'ATP) des cellules vivantes quand celles-ci contiennent de l'ATP.
Cependant l'ATP-métrie n'est pas applicable aux virus en tant qu'organismes, dès lors les virus sont dépourvus d'ATP, d'ADP et d'AMP
intracellulaires libres. Pour leur développement, les virus utilisent l'ATP de leurs cellules hôtes. Quand ils arrivent à maturité, ils quittent leurs cellules 3 0 hôtes pour aller infecter d'autres cellules.
Or on sait que, à l'intérieur d'une même espèce ou variété de cellules non virales, la teneur en AN intracellulaires libres totaux est constante, eu égard à la relation (2) :
Domaine de l'invention La présente invention a trait à une nouvelle technique d'ATP-métrie pour détecter et dénombrer les virus à partir des nucléotides adényliques (AN) des cellules hôtes ou du patrimoine génétique (DNA ou ARN) des virus. Elle concerne également l'utilisation de cette nouvelle technique et un procédé de mise en eeuvre à partir de cellules hôtes selon que les * virus à
déterminer sont lytiques (à l'issue de leur développement, ils clivent la paroi des cellules hôtes) ou non lytiques (à l'issue de leur développement, ils traversent la paroi des cellules hôtes sans la détruire), d'une part, ou à
partir du DNA ou du RNA des virus selon qu'il s'agit de virus à DNA ou à RNA, d'autre part.
Art antérieur On sait l'ATP-métrie, qui est fondée sur la réaction :
(1) luciférine + ATP + Oz + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons, permet de mesurer efficacement la teneur en ATP d'un milieu. Cette réaction est spécifique de l'ATP, quel que soit le système utilisé luciférine (substrat)/luciférase (enzyme). Elle permet de distinguer les cellules mortes (dépourvues d'ATP) des cellules vivantes quand celles-ci contiennent de l'ATP.
Cependant l'ATP-métrie n'est pas applicable aux virus en tant qu'organismes, dès lors les virus sont dépourvus d'ATP, d'ADP et d'AMP
intracellulaires libres. Pour leur développement, les virus utilisent l'ATP de leurs cellules hôtes. Quand ils arrivent à maturité, ils quittent leurs cellules 3 0 hôtes pour aller infecter d'autres cellules.
Or on sait que, à l'intérieur d'une même espèce ou variété de cellules non virales, la teneur en AN intracellulaires libres totaux est constante, eu égard à la relation (2) :
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, voir à cet effet l'article de Champiat D. et al., Luminescence, 2001;16:193-198, où il est proposé, d'une part, de transformer l'AMP et, respectivement, l'ADP en ATP au moyen de pyruvate kinase et, respectivement, de myokinase, et d'autre part, de mesurer la lumière émise (en RLU, i.e. en unité relative de lumière) sans ajout puis après ajout de 10 L d'ATP
supplémentaire.
On vient de trouver de façon surprenante que la teneur en AN totaux obtenus par clivage du DNA ou du RNA du virus est également constante.
On sait de US 3575812 A, que l'on a déjà proposé de détecter des virus par ATP-métrie au moyen de l'ATP de leurs cellules hôtes. Les résultats obtenus ne sont pas reproductibles dès lors que la teneur en ATP
libre des cellules hôtes varie. Ceci est clairement confirmé par un article de 2005, postérieur à la date de priorité de la présente invention, voir Dick van der Kooij et al., Water Research, 2005; 39: 2789-2798, où il est montré que la teneur en ATP varie d'un facteur de 1 à 100 (voir figure 2 de cet article).
Comme on le verra plus loin il faut tenir compte (a) de la relation 2 précitée et (b) de la teneur en NA extracellulaires, quand le virus utilisé est lytique.
On sait également de US 6312902, qu'il a été proposé de cliver le DNA ou le RNA des virus pour déterminer leur présence dans un échantillon par ATP-métrie. Ce document ne décrit ni ne suggère la détermination des AN pour évaluer le nombre de souches virales pouvant être contenues dans ledit échantillon, d'une part, ni l'utilisation d'un ajout dosé, d'autre part.
But de l'invention Il existe un besoin, qui se manifeste avec acuité, en ce qui concerne la détection et la numération des virus.
On se propose donc de fournir une nouvelle solution technique mettant en ceuvre une ATP-métrie portant soit sur l'ensemble des AN libres
supplémentaire.
On vient de trouver de façon surprenante que la teneur en AN totaux obtenus par clivage du DNA ou du RNA du virus est également constante.
On sait de US 3575812 A, que l'on a déjà proposé de détecter des virus par ATP-métrie au moyen de l'ATP de leurs cellules hôtes. Les résultats obtenus ne sont pas reproductibles dès lors que la teneur en ATP
libre des cellules hôtes varie. Ceci est clairement confirmé par un article de 2005, postérieur à la date de priorité de la présente invention, voir Dick van der Kooij et al., Water Research, 2005; 39: 2789-2798, où il est montré que la teneur en ATP varie d'un facteur de 1 à 100 (voir figure 2 de cet article).
Comme on le verra plus loin il faut tenir compte (a) de la relation 2 précitée et (b) de la teneur en NA extracellulaires, quand le virus utilisé est lytique.
On sait également de US 6312902, qu'il a été proposé de cliver le DNA ou le RNA des virus pour déterminer leur présence dans un échantillon par ATP-métrie. Ce document ne décrit ni ne suggère la détermination des AN pour évaluer le nombre de souches virales pouvant être contenues dans ledit échantillon, d'une part, ni l'utilisation d'un ajout dosé, d'autre part.
But de l'invention Il existe un besoin, qui se manifeste avec acuité, en ce qui concerne la détection et la numération des virus.
On se propose donc de fournir une nouvelle solution technique mettant en ceuvre une ATP-métrie portant soit sur l'ensemble des AN libres
3 o des cellules hôtes, exprimés sous forme d'ATP, pour satisfaire ce besoin, lesdits AN étant libres extracellulairement quand le virus à tester est lytique et intracellulairement quand le virus à tester est non lytique, soit sur les AN
produits par clivage ou hydrolyse du DNA ou du RNA du virus.
Objet de l'inveiitioya Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :
(1) luciférine + ATP + 02 + MgZ++ luciférase ~ oxyluciférine + photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP
et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres d'une même famille de cellules est constante selon la relation (2) (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, après avoir transformé les ADP et AMP libres de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA
desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA-ase, avec transformation des dimères dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et AMP, la transfonnation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de virus est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.
Selon un second aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à partir des AN des cellules de la cible, ou des AN obtenus par clivage dut DNA ou RNA viral, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
3 0 Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un nécessaire de dosage pour mettre en oeuvre ledit procédé.
Ledit nécessaire de dosage est caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole et de l'ATP pour l'ajout dosé, et le cas échéant de la myokinase, de la pyruvate kinase, une DNA-ase, une RNA-ase et/ou de la pyruvate orthophosphate dikinase, et/ou des
produits par clivage ou hydrolyse du DNA ou du RNA du virus.
Objet de l'inveiitioya Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :
(1) luciférine + ATP + 02 + MgZ++ luciférase ~ oxyluciférine + photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP
et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres d'une même famille de cellules est constante selon la relation (2) (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, après avoir transformé les ADP et AMP libres de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA
desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA-ase, avec transformation des dimères dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et AMP, la transfonnation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de virus est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.
Selon un second aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à partir des AN des cellules de la cible, ou des AN obtenus par clivage dut DNA ou RNA viral, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
3 0 Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un nécessaire de dosage pour mettre en oeuvre ledit procédé.
Ledit nécessaire de dosage est caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole et de l'ATP pour l'ajout dosé, et le cas échéant de la myokinase, de la pyruvate kinase, une DNA-ase, une RNA-ase et/ou de la pyruvate orthophosphate dikinase, et/ou des
4 microbilles revêtues d'ApoH ou d'un anticorps spécifique du virus à
déterminer.
Ledit nécessaire pouvant en outre comporter, le cas échéant, des celhiles vivantes et saines de la cible.
Abréviatioizs Par commodité, la liste des abréviations et acronymes utilisés dans la présente iiivention a été fournie ci-après.
ADP adénosine diphosphate, AMP adénosine monophosphate, z 0 AN nucléotide adénylique (autre nomenclature utilisable : adénosine nucléotide), l'ensemble des AN comprend ici les ATP, ADP et AMP, ATP adénosine triphosphate, cAMP adénosine monophosphate cyclique, dADP adénosine diphosphate dimère, dAMP adénosine monophosphate dimère, GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate, NDPK nucléotide diphosphate kinase 2 0 RLU unité relative de lûmiére.
Description détaillée de l'invention Les virus Les virus ne sont pas des cellules. Ce sont des structures parasites intracellulaires. Les virus ne peuvent se reproduire que lorsqu'ils sont à
l'intérieur d'une cellule. On parle alors de virions (particules virales). Un virus en dehors ~ d'une cellule n'a aucune activité métabolique.
On distingue les virus qui parasitent les cellules procaryotes (bactériophages) de ceux qui parasitent les cellules eucaryotes.
Les particularités des virus sont essentiellement les suivantes. Ils occupent une "étrange région indéterminée" entre le vivant et le non vivant Ils resseinblent au vivant puisqu'ils ont du matériel génétique et sont capables de mutations et de recombinaisons. Ils peuvent donc évoluer et s'adapter à des milieux en changement. Mais en même temps, ils sont acellulaires : ils ne possèdent ni ribosomes, ni machinerie métabolique leur permettant de synthétiser des protéines et de générer de l'énergie. En l'absence de ces composants, les virus ne peuvent se reproduire qu'à
l'intérieur de cellules hôtes et même alors, leur mode de reproduction est unique.
On sait que toute cellule se reproduit en augmentant de taille, puis en
déterminer.
Ledit nécessaire pouvant en outre comporter, le cas échéant, des celhiles vivantes et saines de la cible.
Abréviatioizs Par commodité, la liste des abréviations et acronymes utilisés dans la présente iiivention a été fournie ci-après.
ADP adénosine diphosphate, AMP adénosine monophosphate, z 0 AN nucléotide adénylique (autre nomenclature utilisable : adénosine nucléotide), l'ensemble des AN comprend ici les ATP, ADP et AMP, ATP adénosine triphosphate, cAMP adénosine monophosphate cyclique, dADP adénosine diphosphate dimère, dAMP adénosine monophosphate dimère, GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate, NDPK nucléotide diphosphate kinase 2 0 RLU unité relative de lûmiére.
Description détaillée de l'invention Les virus Les virus ne sont pas des cellules. Ce sont des structures parasites intracellulaires. Les virus ne peuvent se reproduire que lorsqu'ils sont à
l'intérieur d'une cellule. On parle alors de virions (particules virales). Un virus en dehors ~ d'une cellule n'a aucune activité métabolique.
On distingue les virus qui parasitent les cellules procaryotes (bactériophages) de ceux qui parasitent les cellules eucaryotes.
Les particularités des virus sont essentiellement les suivantes. Ils occupent une "étrange région indéterminée" entre le vivant et le non vivant Ils resseinblent au vivant puisqu'ils ont du matériel génétique et sont capables de mutations et de recombinaisons. Ils peuvent donc évoluer et s'adapter à des milieux en changement. Mais en même temps, ils sont acellulaires : ils ne possèdent ni ribosomes, ni machinerie métabolique leur permettant de synthétiser des protéines et de générer de l'énergie. En l'absence de ces composants, les virus ne peuvent se reproduire qu'à
l'intérieur de cellules hôtes et même alors, leur mode de reproduction est unique.
On sait que toute cellule se reproduit en augmentant de taille, puis en
5 se divisant en deux nouvelles cellules, chacune renfermant un assortiment complet des composants nécessaires à la vie. En revanche, les virus sont désassemblés en leurs composants, c'est-à-dire en protéines et acide nucléique ; la machinerie métabolique de la cellule hôte produit alors quelques dizaines à quelques centaines de génomes viraux et autant de capsides protéiques qui constitueront les nouvelles enveloppes virales. Tous ces coinposants sont ensuite assemblés et produisent de nouvelles particules virales définitives.
Les virus ne croissent pas. Il semble qu'ils n'obéissent pas aux lois de la thermodynamique qui s'appliquent aux systèmes ouverts.
Par ailleurs, les virus peuvent être cristallisés. C'est là une propriété
des minéraux et de la plupart des molécules organiques, mais pas de la cellule vivante. Placés dans de bonnes conditions d'humidité et en présence de cellules vivantes, les virus et leur font produire de nouvelles particules virales.
2 0 Les cycles biologique viraux On rappelle que les virus sont constitués d'un acide nucléique et d'une enveloppe. Le génome viral Il est constitué par une seule molécule d'acide nucléique (DNA ou RNA), généralement linéaire ou circulaire, allant de quelques gènes à plusieurs centaines ce qui représente un certain nombre de 2 5 bases (NMP : AMP, CMP, GMP, TMP dans le cas du RNA, acide ribonucléique) ou (dNMP : dAMP, dCMP, dGMP, dTMP dans le cas du DNA, acide désoxyribonucléique). L'acide nucléique est entouré d'une coque protéique : la capside. Chez certains virus, cette capside est elle-même entourée d'une enveloppe membraneuse, formée d'une double couche 3 0 lipidique contenant des protéines.
On connaît chez les virus trois types de cycles reproductifs : le cycle lytique, le cycle lysogène et le cycle à libération continue. Les deux premiers cycles concernent presque exclusivement des bactériophages. Pour plus de 95% des phages connus, le matériel génétique est une molécule de 35 DNa double brin d'une taille de 5 à 650 kpb ( soit un potentiel de 10000 à
Les virus ne croissent pas. Il semble qu'ils n'obéissent pas aux lois de la thermodynamique qui s'appliquent aux systèmes ouverts.
Par ailleurs, les virus peuvent être cristallisés. C'est là une propriété
des minéraux et de la plupart des molécules organiques, mais pas de la cellule vivante. Placés dans de bonnes conditions d'humidité et en présence de cellules vivantes, les virus et leur font produire de nouvelles particules virales.
2 0 Les cycles biologique viraux On rappelle que les virus sont constitués d'un acide nucléique et d'une enveloppe. Le génome viral Il est constitué par une seule molécule d'acide nucléique (DNA ou RNA), généralement linéaire ou circulaire, allant de quelques gènes à plusieurs centaines ce qui représente un certain nombre de 2 5 bases (NMP : AMP, CMP, GMP, TMP dans le cas du RNA, acide ribonucléique) ou (dNMP : dAMP, dCMP, dGMP, dTMP dans le cas du DNA, acide désoxyribonucléique). L'acide nucléique est entouré d'une coque protéique : la capside. Chez certains virus, cette capside est elle-même entourée d'une enveloppe membraneuse, formée d'une double couche 3 0 lipidique contenant des protéines.
On connaît chez les virus trois types de cycles reproductifs : le cycle lytique, le cycle lysogène et le cycle à libération continue. Les deux premiers cycles concernent presque exclusivement des bactériophages. Pour plus de 95% des phages connus, le matériel génétique est une molécule de 35 DNa double brin d'une taille de 5 à 650 kpb ( soit un potentiel de 10000 à
6 1300000 nucléotides triphosphate) et leur taille varie de 24 et 200 nm.
Le cycle lytique se déroule quand un virus envahit une cellule, se reproduit, puis se disperse par suite de la lyse de la cellule hôte. Une cellule envahie par un virus lytique est presque invariablement tuée en un court laps de temps.
Dans le cycle lytique, il y a destruction du chromosome bactérien. Le DNA viral est traduit en protéines, celles qui sont nécessaires à la réplication du virus introduit. Il y a réplication du DNA viral. Ces copies constituent des matrices pour la synthèse des protéines de la capside. Cette synthèse est assurée par les ribosomes de la bactérie (détournement de la machinerie bactérienne) d'où une perturbation importante de l'énergie cellulaire et particulièrement des AN intracellulaires puisque les virus non pas de source d'énergie propre..
Ainsi lorsqu'il y aura synthèse d'acides nucléiques, les nucléotides (bases :ATP,CTP,GTP,TTP, soit les XTP) auront été fabriqués par la machinerie de la cellule hôte. Ensuite, il y a auto-assemblage des protéines et du DNA (ou RNA) viral. La bactérie éclate et libère de nombreux virions. Cette remarque est très importante pour nous permettre de différencier les acides nucléiques issus de virus ou de tout autre cellule 2 0 procaryote ou eucaryote, car avant de provoqué l'hydrolyse des acides nucléiques on dosera les nucléotides adényliques présents qui témoigneront de la présence de cellules non virales.
Le cycle lysogène se déroule quand un virus virulent ou lytique combine son matériel génétique avec celui de la cellule hôte et devient de ce fait dormant. Le DNA (ou RNA) du virus se réplique en même temps que celui de la cellule hôte laquelle porte le nom de cellule lysogène ; le virus ou phage est appelé prophage. Certain stimulus conduisent le prophage à devenir virulent et à entamer un cycle lytique. La cellule lysogène est alors lysée et les particules virales sont libérées.
3 0 Dans le cycle lysogène, le DNA (ou RNA) viral s'intègre dans le chromosome bactérien. La bactérie continue à vivre jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique. Certaine bactéries lysogènes sont d'une grande iinportance pour la santé humaine. Par exemple, la bactérie responsable de la diphtérie, Corynebacterium diphtheriae, n'élabore la toxine responsable de cette maladie que si son
Le cycle lytique se déroule quand un virus envahit une cellule, se reproduit, puis se disperse par suite de la lyse de la cellule hôte. Une cellule envahie par un virus lytique est presque invariablement tuée en un court laps de temps.
Dans le cycle lytique, il y a destruction du chromosome bactérien. Le DNA viral est traduit en protéines, celles qui sont nécessaires à la réplication du virus introduit. Il y a réplication du DNA viral. Ces copies constituent des matrices pour la synthèse des protéines de la capside. Cette synthèse est assurée par les ribosomes de la bactérie (détournement de la machinerie bactérienne) d'où une perturbation importante de l'énergie cellulaire et particulièrement des AN intracellulaires puisque les virus non pas de source d'énergie propre..
Ainsi lorsqu'il y aura synthèse d'acides nucléiques, les nucléotides (bases :ATP,CTP,GTP,TTP, soit les XTP) auront été fabriqués par la machinerie de la cellule hôte. Ensuite, il y a auto-assemblage des protéines et du DNA (ou RNA) viral. La bactérie éclate et libère de nombreux virions. Cette remarque est très importante pour nous permettre de différencier les acides nucléiques issus de virus ou de tout autre cellule 2 0 procaryote ou eucaryote, car avant de provoqué l'hydrolyse des acides nucléiques on dosera les nucléotides adényliques présents qui témoigneront de la présence de cellules non virales.
Le cycle lysogène se déroule quand un virus virulent ou lytique combine son matériel génétique avec celui de la cellule hôte et devient de ce fait dormant. Le DNA (ou RNA) du virus se réplique en même temps que celui de la cellule hôte laquelle porte le nom de cellule lysogène ; le virus ou phage est appelé prophage. Certain stimulus conduisent le prophage à devenir virulent et à entamer un cycle lytique. La cellule lysogène est alors lysée et les particules virales sont libérées.
3 0 Dans le cycle lysogène, le DNA (ou RNA) viral s'intègre dans le chromosome bactérien. La bactérie continue à vivre jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique. Certaine bactéries lysogènes sont d'une grande iinportance pour la santé humaine. Par exemple, la bactérie responsable de la diphtérie, Corynebacterium diphtheriae, n'élabore la toxine responsable de cette maladie que si son
7 DNA est infecté par un prophage portant le gène qui code pour la toxine diphtérique. On note le même phénomène chez CCostriciium botulinum, responsable du botulisme, et chez Streptococcus pyogenes, l'agent de la scarlatine.
Donc dans ces cas (cycle lytique voir lysogènique puisque lors de ce dernier, le virus devient dormant jusqu' à jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique.), c'est le dosage des AN
extracellulaires (libérés par la lyse de la paroi des cellules hôtes) et totaux desdites cellules hôtes qui permettra de mettre en évidence la présence de virus. Les NA extracellulaire nous permettront de quantifier le nombre de virus et le rapport ANextra/NAtotaux nous donnera le niveau de contamination.
Par exemple si ANextra = ANtota,,x cela implique ique toutes les cellules hôtes sont lysées donc morte (nécrose).
Le cycle à libération continue est le fait de quelques phages et de beaucoup de virus animaux. Ces virus se reproduisent et sont libérés sans interruption par des cellules hôtes qui demeurent intactes. Les virus pénètrent dans la cellule par endocytose. La vésicule d'endocytose fusionne avec'un lysosome qui permet la libération de la capside virale laquelle peut libérer son matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule hôte. Le 2 0 -matériel génétique est répliqué et utilisé pour produire de nouvelles capsides incluant du matériel génétique viral pour former des nucléocapsides. Celles-ci sont transportées par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi de la cellule hôte jusqu'à la membrane plasmique où la particule virale bourgeonne et est libérée, entouré d'une enveloppe 2 5 membranaire provenant de la cellule hôte. Les virus de la grippe, des oreillons, de la rougeole ou de la rage ont de tels cycles à libération continue.
Dans ce cas le dosage des AN extracellulaires n'apporte pas d'information, par contre comme signalé préalablement compte tenu de la 30 perturbation métabolique et particulièrement énergétique de la cellule hôte en présence de virus, le dosage des AN totaux permettrons de détecter cette anomalie par rapport aux dosage des AN des même cellules dépourvues de virus On peut augmenter cette sensibilité en dosant les autres nucléotides de
Donc dans ces cas (cycle lytique voir lysogènique puisque lors de ce dernier, le virus devient dormant jusqu' à jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique.), c'est le dosage des AN
extracellulaires (libérés par la lyse de la paroi des cellules hôtes) et totaux desdites cellules hôtes qui permettra de mettre en évidence la présence de virus. Les NA extracellulaire nous permettront de quantifier le nombre de virus et le rapport ANextra/NAtotaux nous donnera le niveau de contamination.
Par exemple si ANextra = ANtota,,x cela implique ique toutes les cellules hôtes sont lysées donc morte (nécrose).
Le cycle à libération continue est le fait de quelques phages et de beaucoup de virus animaux. Ces virus se reproduisent et sont libérés sans interruption par des cellules hôtes qui demeurent intactes. Les virus pénètrent dans la cellule par endocytose. La vésicule d'endocytose fusionne avec'un lysosome qui permet la libération de la capside virale laquelle peut libérer son matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule hôte. Le 2 0 -matériel génétique est répliqué et utilisé pour produire de nouvelles capsides incluant du matériel génétique viral pour former des nucléocapsides. Celles-ci sont transportées par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi de la cellule hôte jusqu'à la membrane plasmique où la particule virale bourgeonne et est libérée, entouré d'une enveloppe 2 5 membranaire provenant de la cellule hôte. Les virus de la grippe, des oreillons, de la rougeole ou de la rage ont de tels cycles à libération continue.
Dans ce cas le dosage des AN extracellulaires n'apporte pas d'information, par contre comme signalé préalablement compte tenu de la 30 perturbation métabolique et particulièrement énergétique de la cellule hôte en présence de virus, le dosage des AN totaux permettrons de détecter cette anomalie par rapport aux dosage des AN des même cellules dépourvues de virus On peut augmenter cette sensibilité en dosant les autres nucléotides de
8 la cellule hôte par luminescence comme proposé dans l'article de M.
Gendraud, Physiol. Vég. 1977 15(1) 121-132, selon le mécanisme :
XTP + ADP --> XDP + ATP en présence de NDPK
Ainsi selon un aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques à partir des AN
extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénoinbrer par ATP-métrie les virus à libération continue à partir des AN libres des cellules de la cible, ou à partir des AN produits par le clivage du DNA ou RNA viral.
On peut ainsi détecter et dénombrer les AN totaux liés qui se trouvent associés au patrimoine génétique des virus constitué par leur DNA pour les virus à DNA, ou leur RNA pour les virus à RNA, lesdits AN liés étant is libérés par action d'une DNA-ase ou RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP, dADP ét dATP en monomères AMP, ADP et ATP, lesdits AMP et ADP étant transformés en ATP pour mesurer les AN sous forme d'ATP.
Procédé mettant en ceuvre des cellules cibles 2 o On vise un procédé de détection et de numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1)' :
(1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la. cible non infectée est 2 5 constante selon la relation (2) :
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1 ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui 3 o est dépourvu de AN libres ;
(2 ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3 ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la 35 cible ;
Gendraud, Physiol. Vég. 1977 15(1) 121-132, selon le mécanisme :
XTP + ADP --> XDP + ATP en présence de NDPK
Ainsi selon un aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques à partir des AN
extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénoinbrer par ATP-métrie les virus à libération continue à partir des AN libres des cellules de la cible, ou à partir des AN produits par le clivage du DNA ou RNA viral.
On peut ainsi détecter et dénombrer les AN totaux liés qui se trouvent associés au patrimoine génétique des virus constitué par leur DNA pour les virus à DNA, ou leur RNA pour les virus à RNA, lesdits AN liés étant is libérés par action d'une DNA-ase ou RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP, dADP ét dATP en monomères AMP, ADP et ATP, lesdits AMP et ADP étant transformés en ATP pour mesurer les AN sous forme d'ATP.
Procédé mettant en ceuvre des cellules cibles 2 o On vise un procédé de détection et de numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1)' :
(1) luciférine + ATP + 02 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la. cible non infectée est 2 5 constante selon la relation (2) :
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1 ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui 3 o est dépourvu de AN libres ;
(2 ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3 ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la 35 cible ;
9 PCT/FR2005/002596 (4 ) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP ;
(5 ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4 ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
(6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, ptiis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
Pour la déduction du nombre de souches dudit virus, l'étape (7 ) peut coinprendre l'utilisation d'un système d'abaques pré-établi. En variante, la teneur en AN totaux extracellulaires peut être déterminée par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1 ) à
(7 ) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. En pratique, la technique de l'ajout dosé permet une bonne détermination directe du nombre de souches du virus. ~
2 0 On vise également un procédé de détection et de numération des souches d'un virus à libération continue par bioluminescence selon la réaction (1) :
(1) luciférine + ATP + 02 + Mg2* + Iuciférase -a oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) 3 0 (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(la ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susé-eptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres ;
(2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de 5 la cible ;
(40 ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP ;
(5 ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4 ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
(6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, ptiis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
Pour la déduction du nombre de souches dudit virus, l'étape (7 ) peut coinprendre l'utilisation d'un système d'abaques pré-établi. En variante, la teneur en AN totaux extracellulaires peut être déterminée par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1 ) à
(7 ) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. En pratique, la technique de l'ajout dosé permet une bonne détermination directe du nombre de souches du virus. ~
2 0 On vise également un procédé de détection et de numération des souches d'un virus à libération continue par bioluminescence selon la réaction (1) :
(1) luciférine + ATP + 02 + Mg2* + Iuciférase -a oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) 3 0 (2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(la ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susé-eptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres ;
(2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de 5 la cible ;
(40 ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP ;
10 (5a ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
(6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, et en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E).
L'étape (7a) peut être réalisée comme indiqué plus* haut pour l'étape 2 0 (7 ) ; notamment par comparaison.avec les cellules de la cible traitées en reproduisant les étapes (la ) à(7a ) en l'absence dudit virus,. En variante, la détermination de la teneur en AN totaux intracellulaires peut être réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli. On en déduit ensuite le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E).
En bref les étapes (1 )-(2 ) et (5 ) sont identiques aux étapes (la )-(2a ) et (5a ) ; les étapes (3 ) et (6 )-(7 ) sont sensiblement analogues aux étapes (3a ) et (6a )-(7a ) ; et l'étape (4 ) est différente de l'étape (40 ).
Les modalités de la mise en oeuvre des étapes identiques ou similaires seront traitées en commun. En revanche, celles des étapes respectives (4 ) et (4a ) 3 0 seront traitées séparément.
L'échantillon (E) est une composition liquide aqueuse, le cas échéant il peut être une composition liquide organique. Cet échantillon (E) provient d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide qui est avantageusement aqueux.
(6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, et en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E).
L'étape (7a) peut être réalisée comme indiqué plus* haut pour l'étape 2 0 (7 ) ; notamment par comparaison.avec les cellules de la cible traitées en reproduisant les étapes (la ) à(7a ) en l'absence dudit virus,. En variante, la détermination de la teneur en AN totaux intracellulaires peut être réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli. On en déduit ensuite le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E).
En bref les étapes (1 )-(2 ) et (5 ) sont identiques aux étapes (la )-(2a ) et (5a ) ; les étapes (3 ) et (6 )-(7 ) sont sensiblement analogues aux étapes (3a ) et (6a )-(7a ) ; et l'étape (4 ) est différente de l'étape (40 ).
Les modalités de la mise en oeuvre des étapes identiques ou similaires seront traitées en commun. En revanche, celles des étapes respectives (4 ) et (4a ) 3 0 seront traitées séparément.
L'échantillon (E) est une composition liquide aqueuse, le cas échéant il peut être une composition liquide organique. Cet échantillon (E) provient d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide qui est avantageusement aqueux.
11 La réaction (1) précitée fournit de l'oxyluciférine, des photons, de l'AMP et un ou plusieurs phosphates, principalement le pyrophosphate. Elle est spécifique de l'ATP, la luciférine et la luciférase étant à une concentration optimale, le nombre de photons émis dès que ces trois substances sont en présence, est directement proportionnel à la quantité
d'ATP. Dans l'organisme et tout milieu réactionnel, l'ATP extracellulaire disparaît relativement rapidement, soit par réutilisation, soit principalement par dégradation.
L'ATP intervient dans la cellule en taiit que source d'énergie (énergie mécanique, énergie osmotique, énergie chimique, énergie calorique, énergie lumineuse) donneur de phosphate, donneur de pyrophosphate, donneur d'AMP et donneur d'adénosine.
La teneur en ATP dans les cellules d'une même espèce varie fortement selon l'état physiologique. Le seuil de détection est de l'ordre de 103 bactéries. Selon l'invention, on va atteindre une meilleure sensibilité qui va de 1 attomole d'ATP (sans stabilisation du signal lumineux émis) jusqu'à
0,5 attomole d'ATP (avec stabilisation dudit signal), ce qui correspond approximativement au contenu moyen en AN intracellulaires totaux d'une bactérié.
2 0 Quand on considère la relation (2), on néglige ici la teneur intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (cAIVIP), qui est le précurseur intervenant dans la synthèse de l'AMP. Cette teneur est pratiquement négligeable dans les milieux réactionnels de l'invention.
On utilise selon l'invention le principe bien connu de la luciole 2 5 (Pliotiszus pyralis), qui fonctionne avec un enzyme (luciférase), un substrat luminophore (luciférine) et un coenzyme (en l'occurrence l'ATP). Le résultat est souvent affiché au photoinètre (ou luminomètre) en RLU, qui bien que proportionnel à la quantité d'ATP, ne permet pas de déterminer d'un échantillon à l'autre la concentration réelle en ATP.
3 0 Pour remédier à cette difficulté, on préconise l'apport d'une quantité
connue (par exemple 102 à 10 pmol d'ATP), après la première lecture (entreprise sans apport d'ATP). Cependant, la technique de l'apport dit dosé
ne permet pas une détermination quantitative de la numération car la teneur en ATP dans lesdites cellules ne reste pas constante y a un "turnover"
35 rapide en fonction de l'état physiologique.
d'ATP. Dans l'organisme et tout milieu réactionnel, l'ATP extracellulaire disparaît relativement rapidement, soit par réutilisation, soit principalement par dégradation.
L'ATP intervient dans la cellule en taiit que source d'énergie (énergie mécanique, énergie osmotique, énergie chimique, énergie calorique, énergie lumineuse) donneur de phosphate, donneur de pyrophosphate, donneur d'AMP et donneur d'adénosine.
La teneur en ATP dans les cellules d'une même espèce varie fortement selon l'état physiologique. Le seuil de détection est de l'ordre de 103 bactéries. Selon l'invention, on va atteindre une meilleure sensibilité qui va de 1 attomole d'ATP (sans stabilisation du signal lumineux émis) jusqu'à
0,5 attomole d'ATP (avec stabilisation dudit signal), ce qui correspond approximativement au contenu moyen en AN intracellulaires totaux d'une bactérié.
2 0 Quand on considère la relation (2), on néglige ici la teneur intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (cAIVIP), qui est le précurseur intervenant dans la synthèse de l'AMP. Cette teneur est pratiquement négligeable dans les milieux réactionnels de l'invention.
On utilise selon l'invention le principe bien connu de la luciole 2 5 (Pliotiszus pyralis), qui fonctionne avec un enzyme (luciférase), un substrat luminophore (luciférine) et un coenzyme (en l'occurrence l'ATP). Le résultat est souvent affiché au photoinètre (ou luminomètre) en RLU, qui bien que proportionnel à la quantité d'ATP, ne permet pas de déterminer d'un échantillon à l'autre la concentration réelle en ATP.
3 0 Pour remédier à cette difficulté, on préconise l'apport d'une quantité
connue (par exemple 102 à 10 pmol d'ATP), après la première lecture (entreprise sans apport d'ATP). Cependant, la technique de l'apport dit dosé
ne permet pas une détermination quantitative de la numération car la teneur en ATP dans lesdites cellules ne reste pas constante y a un "turnover"
35 rapide en fonction de l'état physiologique.
12 En revanche, les cellules d'une cible donnée présentent toutes la même teneur en AN. Selon l'invention, en déterminant la teneur en AN, exprimée sous forme d'ATP, on va pouvoir réaliser des déterminations quantitatives pour la numération des cellules de la cible et des souches de virus.
De façon avantageuse, l'étape (1 ) ou (1 a ) du procédé de l'invention, qui est relative à l'isolation et concentration, est effectuée par = filtration sur membrane, = évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou = immunocapture.
La technique d'immunocapture est préférée. Elle permet la concentration et la purification des souches du virus par fixation de celles-ci par des anticorps. De façon pràtique, ces anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes de surface du virus sans le détruire. De façon également pratique, ces anticorps sont immobilisés sur des microbilles de latex magnétique en vue de la concentration et de la purification des produits de conjugaison du type virus-anticorps-bille dans un champ magnétique et du recueil desdits produits de conjugaison. En variante, des microbilles non magnétiques ou non magnétisables, liées aux anticorps qui 2 0 fixent les souches du virus, permettent également, par décantation, la concentration et la purification desdites souches.
Le meilleur mode pour la mise en omuvre de l'immunocapture consiste à utiliser des microbilles magnétiques revêtue de ApoH, une protéine qui fixe la matière vivante et ne fixe pas les fragments, notainment la paroi, d'organismes morts. Il est rappelé que 1"ApoH est une protéine qui se manifeste uniquement juste avant ou au moment de la mort cellulaire (apoptose).
Lesdits produits de conjugaison sont ensuite séparés, si nécessaire, notamment par élution, pour disposer d'une composition liquide concentrée 3 0 de souches virales qui ne sont plus liées aux anticorps.
Le cas échéant, pour limiter les dilutions qui diminuent la sensibilité, il peut être judicieux de concentrer ladite composition liquide au moyen d'un dispositif d'évaporation-centrifugation (opérant de 2000-10000 tours/15 minutes à 2000-10000 tours/1 minute), qui permet de sécher un grand nombre d'échantillons ou de milieux réactionnels en quelques
De façon avantageuse, l'étape (1 ) ou (1 a ) du procédé de l'invention, qui est relative à l'isolation et concentration, est effectuée par = filtration sur membrane, = évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou = immunocapture.
La technique d'immunocapture est préférée. Elle permet la concentration et la purification des souches du virus par fixation de celles-ci par des anticorps. De façon pràtique, ces anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes de surface du virus sans le détruire. De façon également pratique, ces anticorps sont immobilisés sur des microbilles de latex magnétique en vue de la concentration et de la purification des produits de conjugaison du type virus-anticorps-bille dans un champ magnétique et du recueil desdits produits de conjugaison. En variante, des microbilles non magnétiques ou non magnétisables, liées aux anticorps qui 2 0 fixent les souches du virus, permettent également, par décantation, la concentration et la purification desdites souches.
Le meilleur mode pour la mise en omuvre de l'immunocapture consiste à utiliser des microbilles magnétiques revêtue de ApoH, une protéine qui fixe la matière vivante et ne fixe pas les fragments, notainment la paroi, d'organismes morts. Il est rappelé que 1"ApoH est une protéine qui se manifeste uniquement juste avant ou au moment de la mort cellulaire (apoptose).
Lesdits produits de conjugaison sont ensuite séparés, si nécessaire, notamment par élution, pour disposer d'une composition liquide concentrée 3 0 de souches virales qui ne sont plus liées aux anticorps.
Le cas échéant, pour limiter les dilutions qui diminuent la sensibilité, il peut être judicieux de concentrer ladite composition liquide au moyen d'un dispositif d'évaporation-centrifugation (opérant de 2000-10000 tours/15 minutes à 2000-10000 tours/1 minute), qui permet de sécher un grand nombre d'échantillons ou de milieux réactionnels en quelques
13 minutes, sans perte de produits. L'évaporation-centrifugation à température ambiante offre l'avantage de pouvoir éliminer la majeur partie de l'eau du milieu contenant les souches.
De façon également avaiitageuse, les étapes (2 )-(3 ) ou (2a )-(3a ) relatives à la mise en contact des souches virales avec les souches de. la cible puis à leur développement sont réalisées selon un mode connu de la personne du métier.
A l'étape (4a ) la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a ) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. La lyse est requise afin de pouvoir accéder aux AN
intracellulaires.
La transformation à l'étape (4 ) ou (4a ) des ADP et AMP en ATP est réalisée 'au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. Les mécanismes 2 0 réactionnels sont les suivants :
myokinase (3) AMP + ATP =- 2ADP
myokinase (3a) AMP + GTP ADP + GDP
COO O COO
1 il pyruvate kinase 1 (4) i -O-p-O i =0 CHa O CH3 ADP ATP
phosphoënolpyruvate pyruvate Pour gagner du temps, l'étape (5 ) du procédé de l'invention relative à
la transformation des ADP et AMP en ATP peut être mise en oeuvre en même tenips que l'étape (4 ).
De façon avantageuse, l'étape (5 ) ou (5a ) du procédé de l'invention
De façon également avaiitageuse, les étapes (2 )-(3 ) ou (2a )-(3a ) relatives à la mise en contact des souches virales avec les souches de. la cible puis à leur développement sont réalisées selon un mode connu de la personne du métier.
A l'étape (4a ) la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a ) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. La lyse est requise afin de pouvoir accéder aux AN
intracellulaires.
La transformation à l'étape (4 ) ou (4a ) des ADP et AMP en ATP est réalisée 'au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. Les mécanismes 2 0 réactionnels sont les suivants :
myokinase (3) AMP + ATP =- 2ADP
myokinase (3a) AMP + GTP ADP + GDP
COO O COO
1 il pyruvate kinase 1 (4) i -O-p-O i =0 CHa O CH3 ADP ATP
phosphoënolpyruvate pyruvate Pour gagner du temps, l'étape (5 ) du procédé de l'invention relative à
la transformation des ADP et AMP en ATP peut être mise en oeuvre en même tenips que l'étape (4 ).
De façon avantageuse, l'étape (5 ) ou (5a ) du procédé de l'invention
14 est mise en oeuvre avec la luciférine et la luciférase de luciole (Pltotifaais pyralis). Le substrat et l'enzyme sont susceptibles d'être extraits simultanément de la luciole.
De façon pratique, il est recommandé de réaliser l'étape (6 ) ou (6a ) relative à la mesure de la lumière émise par la réaction (1) en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner :
= la pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) qui transforme l'AMP et le pyrophosphate, produits au cours de la réaction (1) précitée, en ATP, et = l'adénosine phosphate déaminase, qui dégrade l'ADP et/ou l'AMP résiduels pouvant être présents dans le milieu réactionnel Le premier enzyme fournit un signal stable en régénérant l'ATP de façon sensiblement continue. Le second enzyme permet de diminuer le bruit de fond dû à la présence résiduelle dans le milieu d'essai d'ADP et/ou d'AMP, sans que le processus d'utilisation de l'ATP comme source d'énergie lumineuse soit perturbé.
Ledit second enzyme, l'adénosine phosphate déaininase, est plus 2 0 avantageusement utilisé pour éliminer les résidus de nucléotides dans le milieu réactionnel et plus particulièrement pour écarter en les détruisant les résidus de nucléotides extracellulaires présents le cas échéant dans l'échantillon lors de l'étape (1 ) précitée.
En pratique, pour stabiliser l'émission de photons conformément à la réaction (1), on recommande plus particulièrement l'utilisation de PPDK à
l'étape (5 ).
Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la numération des virus, tels que HIV, les bactériophages, le virus de l'hépatite C.
3 0 On transforme les AN, initialement liés et ainsi obtenus, en ATP au moyen de Myokinase et de Pyruvate kinase comme à l'étape (4 ).
L'émission de photons est mise en oeuvre au moyen de luciférine de luciole et luciférase de luciole comme indiqué plus haut pour la réalisation de l'étape (5 ) ou (5a ) sans ajout d'ATP puis après ajout dosé d'ATP.
L'ensemble luciférine/luciférase de luciole est disponible dans le commerce, notaminent auprès de la société dite Controlife.
De façon avantageuse on opère comme indiqué ci-dessus en stabilisant ladite émission de photons au moyen de PPDK.
La mesure du signal amplifié et la détermination sont réalisées comme 5 indiqué plus haut aux étapes (6 ) et (7 ).
Selon l'invention, on préconise un procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de 10 RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP
et dADP en monomères AMP et ADP, - la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, - la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord
De façon pratique, il est recommandé de réaliser l'étape (6 ) ou (6a ) relative à la mesure de la lumière émise par la réaction (1) en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner :
= la pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) qui transforme l'AMP et le pyrophosphate, produits au cours de la réaction (1) précitée, en ATP, et = l'adénosine phosphate déaminase, qui dégrade l'ADP et/ou l'AMP résiduels pouvant être présents dans le milieu réactionnel Le premier enzyme fournit un signal stable en régénérant l'ATP de façon sensiblement continue. Le second enzyme permet de diminuer le bruit de fond dû à la présence résiduelle dans le milieu d'essai d'ADP et/ou d'AMP, sans que le processus d'utilisation de l'ATP comme source d'énergie lumineuse soit perturbé.
Ledit second enzyme, l'adénosine phosphate déaininase, est plus 2 0 avantageusement utilisé pour éliminer les résidus de nucléotides dans le milieu réactionnel et plus particulièrement pour écarter en les détruisant les résidus de nucléotides extracellulaires présents le cas échéant dans l'échantillon lors de l'étape (1 ) précitée.
En pratique, pour stabiliser l'émission de photons conformément à la réaction (1), on recommande plus particulièrement l'utilisation de PPDK à
l'étape (5 ).
Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la numération des virus, tels que HIV, les bactériophages, le virus de l'hépatite C.
3 0 On transforme les AN, initialement liés et ainsi obtenus, en ATP au moyen de Myokinase et de Pyruvate kinase comme à l'étape (4 ).
L'émission de photons est mise en oeuvre au moyen de luciférine de luciole et luciférase de luciole comme indiqué plus haut pour la réalisation de l'étape (5 ) ou (5a ) sans ajout d'ATP puis après ajout dosé d'ATP.
L'ensemble luciférine/luciférase de luciole est disponible dans le commerce, notaminent auprès de la société dite Controlife.
De façon avantageuse on opère comme indiqué ci-dessus en stabilisant ladite émission de photons au moyen de PPDK.
La mesure du signal amplifié et la détermination sont réalisées comme 5 indiqué plus haut aux étapes (6 ) et (7 ).
Selon l'invention, on préconise un procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de 10 RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP
et dADP en monomères AMP et ADP, - la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, - la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord
15 (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP, - la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et - la déterinination de la teneur en AN totaux initialement liés, 2 0 exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus.
Procédé mettant en cuuvre le patrimoine génétique des virus Ce procédé va être maintenant décrit de façon succincte par référence aux étapes précédentes.
On fait appel à un échantillon liquide aqueux (E) comme à l'étape (1 ) 2 5 ci-dessus. L'isolation/concentration est effectuée par = filtration sur membrane, = évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou = immunocapture.
3 o comme indiqué plus haut, avantageusement au moyen d'ApoH.
On lyse la paroi virale par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les 35 cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au
Procédé mettant en cuuvre le patrimoine génétique des virus Ce procédé va être maintenant décrit de façon succincte par référence aux étapes précédentes.
On fait appel à un échantillon liquide aqueux (E) comme à l'étape (1 ) 2 5 ci-dessus. L'isolation/concentration est effectuée par = filtration sur membrane, = évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 C), et/ou = immunocapture.
3 o comme indiqué plus haut, avantageusement au moyen d'ApoH.
On lyse la paroi virale par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les 35 cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au
16 réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant.
On clive le DNA ou le RNA viral au moyen (i) d'endonucléases pour libérer des ologonucléotides, par exemples des DNA-ase ou RNA-ase (notamment RNA-ase T1 pour clivage de G du coôté 5', ou RNA-ase pancréatique pour clivage de C/U du côté 5') ou encore des enzymes de restriction, (ii) d'exonucléase, ou (iii) de phosphodiestérase de rate de boeuf (pour cliver le RNA à partir de 5'-OH libérant des 3'-P) ou de phosphodiestérase de venin de serpent (pour cliver le RNA à partir de 3'-OH libérant les 5'-P) et transforme les dimères présents dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et ATP.
Pour la transformation des nucléotide monophosphates en nucléoside triphosphates, on peut utiliser les- mécanismes opératoires décrit dans le brevet US 6312902 B.
Les mécanismes préférés selon l'invention comprennent ce qui suit.
I
(a) Selon ANõ +PPi -> ANn_1 +XTP XTP
sous l'action :
de DNA polymérase reverse transcriptase pour l'DNA, 2 o de RNA polymérase pour RNA.
Plusieurs enzymes ont été utilisés dans cette transformation, notamment :
- AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, DNA
polymérase a et [i, Taq polymérase, T4 DNA polymérase, Klenow 2 5 fragment, poly A polymérase, à des concentrations de 0,1 à 100 U/ml.
(b)-->Avec NDPK, selon : -NDPK
XTP + .ADP XDP + ATP
avec 0,01 à 0,50 M de préférence 0,5 M d'ADP et 0,1 à 10 U/ml de 30 NDPK.
II
(a) Etape d'hydrolyse des AN, selon :
ANõ+H2O-> ANn_1+XMP
ANn + exonucléase --> nXMP
35 [soit NMP si RNA, ou dNMP si DNA]
On clive le DNA ou le RNA viral au moyen (i) d'endonucléases pour libérer des ologonucléotides, par exemples des DNA-ase ou RNA-ase (notamment RNA-ase T1 pour clivage de G du coôté 5', ou RNA-ase pancréatique pour clivage de C/U du côté 5') ou encore des enzymes de restriction, (ii) d'exonucléase, ou (iii) de phosphodiestérase de rate de boeuf (pour cliver le RNA à partir de 5'-OH libérant des 3'-P) ou de phosphodiestérase de venin de serpent (pour cliver le RNA à partir de 3'-OH libérant les 5'-P) et transforme les dimères présents dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et ATP.
Pour la transformation des nucléotide monophosphates en nucléoside triphosphates, on peut utiliser les- mécanismes opératoires décrit dans le brevet US 6312902 B.
Les mécanismes préférés selon l'invention comprennent ce qui suit.
I
(a) Selon ANõ +PPi -> ANn_1 +XTP XTP
sous l'action :
de DNA polymérase reverse transcriptase pour l'DNA, 2 o de RNA polymérase pour RNA.
Plusieurs enzymes ont été utilisés dans cette transformation, notamment :
- AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, DNA
polymérase a et [i, Taq polymérase, T4 DNA polymérase, Klenow 2 5 fragment, poly A polymérase, à des concentrations de 0,1 à 100 U/ml.
(b)-->Avec NDPK, selon : -NDPK
XTP + .ADP XDP + ATP
avec 0,01 à 0,50 M de préférence 0,5 M d'ADP et 0,1 à 10 U/ml de 30 NDPK.
II
(a) Etape d'hydrolyse des AN, selon :
ANõ+H2O-> ANn_1+XMP
ANn + exonucléase --> nXMP
35 [soit NMP si RNA, ou dNMP si DNA]
17 (b)---->Avec PRPP synthétase, selon :
PRPP synthétase XMP + PRPP ribose + XTP
[XTP est soit NTP si RNA, soit dNTP si DNA]
La 5-phosphoribosyl pyrophosphate synthétase (ou ribose-phosphate pyrophosphokinase) est une enzyme commune à diverses voies de synthèse, dont la synthèse des purines et celle des pyrimidines chez l'homme. Elle catalyse une réaction de transfert de pyrophosphate sur l'a-D-ribose issu de la voie des pentoses-phosphates. Elle est avantageusement utilisée à la concentration de 0.001 à 10 U/ml. L'ATP est le coenzyme donneur de pyrophosphate et donneur d'énergie.
Le 5-phosphoribosyl-pyrophosphate (i. e. 5-PRPP) est un "carrefour"
métabolique, intervenant comme substrat de nombreuses enzymes de synthèse des nucléotides :
adénine phosphoribosyl transférase hypoxanthine-Guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT-ase) orotate phosphoribosyl transférase (complexe U) 5-PRPP amidotransférase.
L'enzyme est inhibée par les nucléotides puriques : ADP et GDP
(c) avec NDKP, selon :
NDPK
XTP + ADP XDP + ATP
avec 0,01 à 0,50 M, de préférence 0,5 M d'ADP, et de 0.1 à 100U/ml de NDPK, (quand on utilise la NDPK, le donneur de phosphate est dCTP ou l'a, [i-lnéthylèneadenosine 5'-triphosphate.
III Avec nucléotide monophosphate kinase (NMPK) et pyruvate kinase, selon :
NMPK
XTP + AMP XDP +ADP
Pyruvate kinase ADP + PEP 10 ATP
PRPP synthétase XMP + PRPP ribose + XTP
[XTP est soit NTP si RNA, soit dNTP si DNA]
La 5-phosphoribosyl pyrophosphate synthétase (ou ribose-phosphate pyrophosphokinase) est une enzyme commune à diverses voies de synthèse, dont la synthèse des purines et celle des pyrimidines chez l'homme. Elle catalyse une réaction de transfert de pyrophosphate sur l'a-D-ribose issu de la voie des pentoses-phosphates. Elle est avantageusement utilisée à la concentration de 0.001 à 10 U/ml. L'ATP est le coenzyme donneur de pyrophosphate et donneur d'énergie.
Le 5-phosphoribosyl-pyrophosphate (i. e. 5-PRPP) est un "carrefour"
métabolique, intervenant comme substrat de nombreuses enzymes de synthèse des nucléotides :
adénine phosphoribosyl transférase hypoxanthine-Guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT-ase) orotate phosphoribosyl transférase (complexe U) 5-PRPP amidotransférase.
L'enzyme est inhibée par les nucléotides puriques : ADP et GDP
(c) avec NDKP, selon :
NDPK
XTP + ADP XDP + ATP
avec 0,01 à 0,50 M, de préférence 0,5 M d'ADP, et de 0.1 à 100U/ml de NDPK, (quand on utilise la NDPK, le donneur de phosphate est dCTP ou l'a, [i-lnéthylèneadenosine 5'-triphosphate.
III Avec nucléotide monophosphate kinase (NMPK) et pyruvate kinase, selon :
NMPK
XTP + AMP XDP +ADP
Pyruvate kinase ADP + PEP 10 ATP
18 ou encore avec NMPK et/ou myokinase.
Cette dernière technique est celle qui est recommandée selon l'invention. L'étape limitante et délicate est l'étape d'hydrolyse des acides nucléiques. Le seuil de détection est fonction de la coinposition du nombre de bases du génome viral.
En sachant que le poids moléculaire de l'ATP est de 551 et que le seuil de détection de l'ATP est fonction du luminomètre et du réactif, mais qu'aujourdhui il est de l'ordre de l'attomole, par utilisation du nombre d'Avogadro (6,022 x 1023), il est facile de prévoir le noinbre de particules virales détectables, le dosage par ATP métrie étant réalisé avec le couple luciférase/luciférine de luciole (de produit est fabriqué par la société dite Controlife).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration.
Exemple 1 Protocole pour ATP-métrie sur le DNA ou RNA viral - 100m1 d'échantillon tamponné Tris HC150mM, NaCI 150 mM à
pH7,6.
2 0 - On ajoute 10 l de billes prêtes à l'emploi (avec ApoH ou anticorps spécifique du virus recherché).
- Incuber de 30 à 90 min à 37 C sous agitation rotative modérée.
- Laver une fois dans du PBS.
- Récupérer les billes avec un système aimanté.
2 5 - Lyser les virus, en mettant les billes en contact avec une solution extractante du type DMSO.
- Ensuite procéder à l'hydrolyse des acides nucléiques en nucléotides et à leur transformation en ATP.
Prévoir :
30 - Solution tampon : limite les variations de pH du milieu ce qui évite la dénaturation du DNA (ou RNA).
Cette dernière technique est celle qui est recommandée selon l'invention. L'étape limitante et délicate est l'étape d'hydrolyse des acides nucléiques. Le seuil de détection est fonction de la coinposition du nombre de bases du génome viral.
En sachant que le poids moléculaire de l'ATP est de 551 et que le seuil de détection de l'ATP est fonction du luminomètre et du réactif, mais qu'aujourdhui il est de l'ordre de l'attomole, par utilisation du nombre d'Avogadro (6,022 x 1023), il est facile de prévoir le noinbre de particules virales détectables, le dosage par ATP métrie étant réalisé avec le couple luciférase/luciférine de luciole (de produit est fabriqué par la société dite Controlife).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration.
Exemple 1 Protocole pour ATP-métrie sur le DNA ou RNA viral - 100m1 d'échantillon tamponné Tris HC150mM, NaCI 150 mM à
pH7,6.
2 0 - On ajoute 10 l de billes prêtes à l'emploi (avec ApoH ou anticorps spécifique du virus recherché).
- Incuber de 30 à 90 min à 37 C sous agitation rotative modérée.
- Laver une fois dans du PBS.
- Récupérer les billes avec un système aimanté.
2 5 - Lyser les virus, en mettant les billes en contact avec une solution extractante du type DMSO.
- Ensuite procéder à l'hydrolyse des acides nucléiques en nucléotides et à leur transformation en ATP.
Prévoir :
30 - Solution tampon : limite les variations de pH du milieu ce qui évite la dénaturation du DNA (ou RNA).
19 - SDS (sodium dodécyl sulfate) : détergent qui rompt les couches de lipides.
- EDTA (éthylène diamine tétraacétate) : chélateur des ions calcium.
Les ions Ca2+ sont nécessaires à l'activité des DNases, enzymes qui détruisent le DNA et sont présentes dans toutes les cellules.
- Centrifuger pour séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).
- Acétate de sodium froid et éthanol glacé pour insolubiliseer le DNA.
Exemple 2 Dosage de bactériophages On a utilisé des bactéries lactiques en tant que cellules cibles des bactériophages qui sont des virus lytiques.
Dans les laiteries et les fromageries, la qualité des produits laitiers est fonction de la quantité d'acide lactique produit par les bactéries lactiques, et il convient de surveiller la teneur en bactériophages pour einpêcher la destruction desdites bactéries lactiques.
A une population connue de bactéries lactiques [déterminée selon le procédé décrit dans la demande de brevet intitulée : "ATP-métrie à partir de Nucléotides Adényliques intracellulaires pour détecter et dénombrer des 2 0 cellules, utilisation et procédé de mise en aeuvre pour la détermination de bactéries notamment dépourvues d'ATP" déposée le même jour que la présente demande] on a ajouté des quantités croissantes de bactériophages (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L, 20 virus/L). Par la mise en oruvre des étapes (1 ) -(7 ) précitées, on retrouve les populations correctes de départ 2 5 (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L et 20 virus/L).
Exemple 3 Détection de bactériophages par dosage des Na des cellules hôtes (a) Le dosage des nucléotides ATP, ADP, AMP est effectué par bioluminescence en présence du complexe luciférine-luciférase. La 3 0 luciférase est une enzyme extraite de l'abdomen de luciole (Photiaus pyralis ou Luciola mingrelica). Une molécule de luciférine est oxydée par 1 mole d'ATP et 1 mole de 02 et pour chaque molécule de luciférine, un quantum d'énergie lumineuse est émis selon la réaction globale (1) précitée:
Le dosage de l'ATP peut s'effectuer directement par 35 bioluminescence. Ici il est nécessaire de transformer 1'ADP et de l'AMP en ATP par réactions enzymatiques, en utilisant la myolcinase et la pyruvate kinase selon les réactions (3), (3a) et (4) précitée.
MATERIEL ET METHODES
Souches bactériennes : deux souches industrielles de Streptocoques 5 mésophiles, SM10 et SM26, ont été utilisées pour la mise au point de la détection de phages virulents (respectivement ep 10 et 926) ; pour la détection de phages tempérés, c'est la souche SM16 lysogène qui a été
retenue.
Milieu de culture : Le milieu synthétique M 17 a été employé dans tous 10 les essais.
Action d'un phage virulent : La croissance est suivie dans des Erlenmeyers de 250 ml, contenant 100 ml de milieu M17. Les Erlenmeyers sont inoculés à 1 % p/v avec une -culture âgée de 16 heures et mise à
incuber à 32 C. Lorsque la densité optique (mesurée à 580 nm) atteint 0,1 15 on ajoute lml de la solution contenant les phages virulents (109 pfu/ml).
Action d'un phage tempéré : L'induction du prophage intégré dans le DNA est déclenchée par action de la mitomycine (MC) à 0,3 g/ml dès que la croissance atteint 0,1 de densité optique.
Mesure de la croissance : La croissance est suivie parallèlement par 2 0 mesure de la densité optique et par dôsage des nucléotides adényliques.
Trois échantillons son t ainsi préparés : n 1 - dosage des nucléotides totaux - 200 l d'échantillon + 1.8 ml de DMSO pur + 10 ml tampon Tris (20 mM Tris, 10 mM acétate Mg, pH 7,75) ; n 2 - dosage des nucléotides extracellulaires - 200 L d'échantillon, filtré sur membrane Millipore (0.22 2 5 m) + 4.8 ml tampon Tris 1: n 3 - dosage des nucléotides sans extraction, ni filtration - 200 l d'échantillon + 4,8 ml tampon Tris 1.
A 200 l d'échantillon préparé on ajoute 100 l de luciférase et :
- pour le dosage de l'ATP, 50 I de tampon Tris 2 (20 mM Tris, 10 mM
acétate de Mg, 5 mM acétate de K, 40 M PEP), 3 0 - pour réaliser un témoin interne, 50 l de tampon Tris 2 contenant 10 picomoles d'ATP, - pour le dosage de l'ATP et de l'ADP, 50 l de tampon Tris 2 contenant 2 U de pyruvate-kinase, et - pour le dosage de l'ATP, l'ADP et l'AMP, 50 l de tampon Tris 2 35 contenant 2 U de pyruvate-kinase et 2 U de myokinase.
RESULTATS
D'après les figures 1 et 2, les courbes de croissance obtenues par dosage de l'ATP sont équivalentes à celles obtenues par mesure de la densité optique. Dans les deux cas (action des bactériophages et lyse des bactéries après addition de mitomycine), la décroissance due à la lyse des cellules est plus accentuée dans les mesures d'ATP que par mesure de la densité optique (courbes al et bl, figures 1 et 2). La concentration en ATP
reflète mieux la quantité de bactéries "vivantes" alors que la mesure de la densité optique inclut en plus les débris cellulaires présents dans le milieu en quantité importante lors des phénomènes de lyse.
Les résultats rapportés dans les figures 1 et 2 correspondent aux mesures de l'ATP total (par extration de l'ATP intracellulaire au DMSO).
Les flèches indiquent l'instant d'introduction du phage.
Comme indiqué dans US 3575812 A précité, on ne dose que les RLU
de l'ATP total (intra- et extracellulaire) sans utiliser l'ajout dosé Certes il met en évidence une variation des RLU dans les cellules attaquées par les phages, mai's certaines fois dans les exemples de ce brevet US les valeurs sont croissantes et d'autres fois décroissantes. Ceci est dû au fait qu'un témoin. interne n'est pas utilisé et que on ne distingue pas l' ATP
intracellulaire de l'ATP extracellulaire.
Les résultats de la figure 3 donnée ci-après permettent de comparer les dosages de l'ATP extracellulaire par rapport à l'ATP total.
L'avantage de doser les NA extracellulaires réside dans la simplification du protocole : on n'a plus besoin de lyser les cellules (cette lyse est effectuée par les phages). Les courbes des AN extracellulaires après filtration et sans filtration sont identiques (elles se chevauchent).
(b) La figure 4 montre une culture de souche de Streptocoques M10, phagée en début de culture par le Phage SM10 L'exemple 3 montre dans ses trois variantes que le dosage directe des AN extracellulaires permet un contrôle en continu. En effet, ce contrôle peut s'effectuer par prélévement automatique d'un échantillon suivi de la transformation des AN en ATP puis du dosage de l'ATP ainsi formé par bioluminescence avec une lecture instantanée.
Les résultats obtenus selon, les trois variantes de l'exemple 3 ont été
obtenus à partir d'essais réalisés sur le milieu synthétique de référence M17.
Or dans un milieu naturel, il est difficile de faire de la densité optique, de plus les autres techniques de contrôle sont soit fastidieuses soit imprécises pour permettre détecter rapidement l'action d'un virus qu'il soit "virulent"
ou "tempéré". En revanche, le dosage des NA est rapide et l'utilisation utilisant du témoin interne constitué d'une solution d'ATP connue permet de quantifier.
Le rapport ANextra/ANtotaux permet de mettre en évidence une attaque virale et son importance. On peut ainsi dépister jusqu'à 10 phages par ml Le dosage des AN extracellulaires, en ce qui concerne les virus lytiques, permet une détection plus rapide et plus simple. C'est la seule méthode qui permette de repérer une attaque virale dans un milieu complexe contenant différentes espèces de virus, en mettant cette échantillon en contact avec différentes cultures de cellules hôtes. Selon l'invention on augmente, la sensibilité en dosant les AN et non les, RLU de I'ATP.
- EDTA (éthylène diamine tétraacétate) : chélateur des ions calcium.
Les ions Ca2+ sont nécessaires à l'activité des DNases, enzymes qui détruisent le DNA et sont présentes dans toutes les cellules.
- Centrifuger pour séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).
- Acétate de sodium froid et éthanol glacé pour insolubiliseer le DNA.
Exemple 2 Dosage de bactériophages On a utilisé des bactéries lactiques en tant que cellules cibles des bactériophages qui sont des virus lytiques.
Dans les laiteries et les fromageries, la qualité des produits laitiers est fonction de la quantité d'acide lactique produit par les bactéries lactiques, et il convient de surveiller la teneur en bactériophages pour einpêcher la destruction desdites bactéries lactiques.
A une population connue de bactéries lactiques [déterminée selon le procédé décrit dans la demande de brevet intitulée : "ATP-métrie à partir de Nucléotides Adényliques intracellulaires pour détecter et dénombrer des 2 0 cellules, utilisation et procédé de mise en aeuvre pour la détermination de bactéries notamment dépourvues d'ATP" déposée le même jour que la présente demande] on a ajouté des quantités croissantes de bactériophages (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L, 20 virus/L). Par la mise en oruvre des étapes (1 ) -(7 ) précitées, on retrouve les populations correctes de départ 2 5 (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L et 20 virus/L).
Exemple 3 Détection de bactériophages par dosage des Na des cellules hôtes (a) Le dosage des nucléotides ATP, ADP, AMP est effectué par bioluminescence en présence du complexe luciférine-luciférase. La 3 0 luciférase est une enzyme extraite de l'abdomen de luciole (Photiaus pyralis ou Luciola mingrelica). Une molécule de luciférine est oxydée par 1 mole d'ATP et 1 mole de 02 et pour chaque molécule de luciférine, un quantum d'énergie lumineuse est émis selon la réaction globale (1) précitée:
Le dosage de l'ATP peut s'effectuer directement par 35 bioluminescence. Ici il est nécessaire de transformer 1'ADP et de l'AMP en ATP par réactions enzymatiques, en utilisant la myolcinase et la pyruvate kinase selon les réactions (3), (3a) et (4) précitée.
MATERIEL ET METHODES
Souches bactériennes : deux souches industrielles de Streptocoques 5 mésophiles, SM10 et SM26, ont été utilisées pour la mise au point de la détection de phages virulents (respectivement ep 10 et 926) ; pour la détection de phages tempérés, c'est la souche SM16 lysogène qui a été
retenue.
Milieu de culture : Le milieu synthétique M 17 a été employé dans tous 10 les essais.
Action d'un phage virulent : La croissance est suivie dans des Erlenmeyers de 250 ml, contenant 100 ml de milieu M17. Les Erlenmeyers sont inoculés à 1 % p/v avec une -culture âgée de 16 heures et mise à
incuber à 32 C. Lorsque la densité optique (mesurée à 580 nm) atteint 0,1 15 on ajoute lml de la solution contenant les phages virulents (109 pfu/ml).
Action d'un phage tempéré : L'induction du prophage intégré dans le DNA est déclenchée par action de la mitomycine (MC) à 0,3 g/ml dès que la croissance atteint 0,1 de densité optique.
Mesure de la croissance : La croissance est suivie parallèlement par 2 0 mesure de la densité optique et par dôsage des nucléotides adényliques.
Trois échantillons son t ainsi préparés : n 1 - dosage des nucléotides totaux - 200 l d'échantillon + 1.8 ml de DMSO pur + 10 ml tampon Tris (20 mM Tris, 10 mM acétate Mg, pH 7,75) ; n 2 - dosage des nucléotides extracellulaires - 200 L d'échantillon, filtré sur membrane Millipore (0.22 2 5 m) + 4.8 ml tampon Tris 1: n 3 - dosage des nucléotides sans extraction, ni filtration - 200 l d'échantillon + 4,8 ml tampon Tris 1.
A 200 l d'échantillon préparé on ajoute 100 l de luciférase et :
- pour le dosage de l'ATP, 50 I de tampon Tris 2 (20 mM Tris, 10 mM
acétate de Mg, 5 mM acétate de K, 40 M PEP), 3 0 - pour réaliser un témoin interne, 50 l de tampon Tris 2 contenant 10 picomoles d'ATP, - pour le dosage de l'ATP et de l'ADP, 50 l de tampon Tris 2 contenant 2 U de pyruvate-kinase, et - pour le dosage de l'ATP, l'ADP et l'AMP, 50 l de tampon Tris 2 35 contenant 2 U de pyruvate-kinase et 2 U de myokinase.
RESULTATS
D'après les figures 1 et 2, les courbes de croissance obtenues par dosage de l'ATP sont équivalentes à celles obtenues par mesure de la densité optique. Dans les deux cas (action des bactériophages et lyse des bactéries après addition de mitomycine), la décroissance due à la lyse des cellules est plus accentuée dans les mesures d'ATP que par mesure de la densité optique (courbes al et bl, figures 1 et 2). La concentration en ATP
reflète mieux la quantité de bactéries "vivantes" alors que la mesure de la densité optique inclut en plus les débris cellulaires présents dans le milieu en quantité importante lors des phénomènes de lyse.
Les résultats rapportés dans les figures 1 et 2 correspondent aux mesures de l'ATP total (par extration de l'ATP intracellulaire au DMSO).
Les flèches indiquent l'instant d'introduction du phage.
Comme indiqué dans US 3575812 A précité, on ne dose que les RLU
de l'ATP total (intra- et extracellulaire) sans utiliser l'ajout dosé Certes il met en évidence une variation des RLU dans les cellules attaquées par les phages, mai's certaines fois dans les exemples de ce brevet US les valeurs sont croissantes et d'autres fois décroissantes. Ceci est dû au fait qu'un témoin. interne n'est pas utilisé et que on ne distingue pas l' ATP
intracellulaire de l'ATP extracellulaire.
Les résultats de la figure 3 donnée ci-après permettent de comparer les dosages de l'ATP extracellulaire par rapport à l'ATP total.
L'avantage de doser les NA extracellulaires réside dans la simplification du protocole : on n'a plus besoin de lyser les cellules (cette lyse est effectuée par les phages). Les courbes des AN extracellulaires après filtration et sans filtration sont identiques (elles se chevauchent).
(b) La figure 4 montre une culture de souche de Streptocoques M10, phagée en début de culture par le Phage SM10 L'exemple 3 montre dans ses trois variantes que le dosage directe des AN extracellulaires permet un contrôle en continu. En effet, ce contrôle peut s'effectuer par prélévement automatique d'un échantillon suivi de la transformation des AN en ATP puis du dosage de l'ATP ainsi formé par bioluminescence avec une lecture instantanée.
Les résultats obtenus selon, les trois variantes de l'exemple 3 ont été
obtenus à partir d'essais réalisés sur le milieu synthétique de référence M17.
Or dans un milieu naturel, il est difficile de faire de la densité optique, de plus les autres techniques de contrôle sont soit fastidieuses soit imprécises pour permettre détecter rapidement l'action d'un virus qu'il soit "virulent"
ou "tempéré". En revanche, le dosage des NA est rapide et l'utilisation utilisant du témoin interne constitué d'une solution d'ATP connue permet de quantifier.
Le rapport ANextra/ANtotaux permet de mettre en évidence une attaque virale et son importance. On peut ainsi dépister jusqu'à 10 phages par ml Le dosage des AN extracellulaires, en ce qui concerne les virus lytiques, permet une détection plus rapide et plus simple. C'est la seule méthode qui permette de repérer une attaque virale dans un milieu complexe contenant différentes espèces de virus, en mettant cette échantillon en contact avec différentes cultures de cellules hôtes. Selon l'invention on augmente, la sensibilité en dosant les AN et non les, RLU de I'ATP.
Claims (14)
1.Utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase .fwdarw. oxyluciférine +
photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP
et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, après avoir transformé les ADP et AMP de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA
desdits virus; au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA-ase, avec transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP
et ADP, la transformation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA
ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de virus est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase .fwdarw. oxyluciférine +
photons, pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP
et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, après avoir transformé les ADP et AMP de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA
desdits virus; au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA-ase, avec transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP
et ADP, la transformation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA
ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de virus est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.
2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'ATP-métrie des virus lytiques est entreprise à partir des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'ATP-métrie des virus à libération continue est entreprise à partir des AN
intracellulaires libérés par la lyse provoquée de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
intracellulaires libérés par la lyse provoquée de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
4. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.
5. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à
libération continue, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN
intracellulaires libres des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP, la teneur en AN intracellulaires libres totaux des cellules infectées de la cible étant différente de celles des mêmes cellules non infectées de ladite cible.
libération continue, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN
intracellulaires libres des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP, la teneur en AN intracellulaires libres totaux des cellules infectées de la cible étant différente de celles des mêmes cellules non infectées de ladite cible.
6. Procédé suivant la revendication 4, pour la détection et la numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1) (1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase .fwdarw. oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres;
(2°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible;
(3°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible;
(4°) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP;
(5°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP;
(6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP;
et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres;
(2°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible;
(3°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible;
(4°) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP;
(5°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP;
(6 ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP;
et (7 ) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que, à l'étape (7 ), la teneur en AN totaux extracellulaires est déterminée au moyen d'un système d'abaques ou par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1 ) à (7 ) en l'absence dudit virus, pour en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
8. Procédé suivant la revendication 5, pour la détection et la numération des souches d'un virus non lytique par bioluminescence selon la réaction (1) qui suit :
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase --> oxyluciférine + photons, ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1a ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN ;
(2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible ;
(4a ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP ;
(5a ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
(6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, pour en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase --> oxyluciférine + photons, ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à:
(1a ) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN ;
(2a ) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;
(3a ) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible ;
(4a ) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP ;
(5a ) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a ) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
(6a ) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ;
et (7a ) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, pour en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.
9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (7a ), la teneur en AN totaux intracellulaires est réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli, ou par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1a ) à (7a ) en l'absence dudit virus, pour en déduire le nombre de virus (V) de l"échantillon (E) initial.
10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (4a ), la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a ) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant.
11. Procédé suivant la revendication 6 ou 8, caractérisé en ce que l'étape (4 ) ou (4a ) de la transformation des ADP et AMP en ATP est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une phase de capture des virus ou de leur cellules hôtes au moyen de microbilles magnétiques revêtues d'ApoH.
13. Nécessaire de dosage mettant en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole et de l'ATP pour l'ajout dosé, et le cas échéant de la myokinase, de la pyruvate kinase, de la pyruvate orthophosphate dikinase et/ou des microbilles magnétiques revêtues d'ApoH.
14. Procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP
et dADP en monomères AMP et ADP, - la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, - la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP, - la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et - la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus.
- le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP
et dADP en monomères AMP et ADP, - la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP, - la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP, - la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et - la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus.
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