JP2008516626A - ウィルスの検知及び計量のためのatp法 - Google Patents

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Abstract

【解決手段】本発明は、対象宿主細胞の自由NA又はDNA若しくはRNAウィルスに結合されたNAを利用したウィルスの検知及び計量のためのATP法の利用に関する。また、ATP法によるウィルスの測定方法に関する。

Description

本発明は、ウィルスの宿主細胞又は遺伝子形質(DNA又はARN)のヌクレオチドアデニリル(AN)に基づくウィルスの検知及び計量のためのATP法の新技術に関する。また、この新技術の利用、及び、一方では、検知すべきウィルスが、溶解されるか(ウィルスの発達後に宿主細胞壁が切り離される)若しくは非溶解であるか(ウィルスの発達後に壁が無くならずに宿主細胞の壁を突き抜ける)に応じた宿主細胞をもとにした、又は、他方では、DNA若しくはRNAのウィルスに応じたウィルスのDNA又はRNAをもとにした利用法に関する。
反応
(1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
に基づくATP法が知られており、これにより培地内ATP含有量の効率的な測定が可能となる。この反応はルシフェリン(基質)/ルシフェラーゼ(酵素)を利用する方式がいかなるものであってもATPに特有なものである。これにより、細胞にATPが含まれる時に生きた細胞と死んだ細胞(無ATP)との識別が可能となる。
しかしながら、ATP法は、有機体としてウィルスに細胞内自由ATP、ADP及びAMPが無くなると同時にウィルスには適用不可能となる。ウィルスの発達に関して、宿主細胞のATPが利用される。ウィルスは成熟状態に達すると他の細胞を感染させるため宿主細胞を離れる。
更に、非ウィルス細胞の同一種又は変種の内部において、細胞内の全自由AN含有量は、関係式(2)
(2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
を考慮して、一定であることが知られている。この点については、一方で、ピルビル酸キナーゼ、ミオキナーゼがそれぞれ利用されるAMP及びADPのそれぞれのATPへの転換、他方で、10μL の添加無しの次いでATPの追加添加後の放出光の(RLU、すなわち光の関連した単位での)測定が提案されているシャンピアット ディー(Champiat D)等による「ルミネッセンス(Luminescence)」,2001年,第16号,P.193−198の論文を参照されたい。
米国特許第3575812号明細書 米国特許第6312902号明細書
ウィルスのDNA又はRNAの切除により得られる全AN含有量もまた一定であるという驚くべき方法は見出されたばかりである。
米国特許第3575812号明細書からウィルスの宿主細胞のATPを用いた自由ATP法によるウィルスの検知が既に提案されている。宿主細胞の自由ATP含有量が変動するとたちまち再現不可能となる結果が得られた。この点は、本発明の優先日後の2005年の論文により明確に確認されており、ATP含有量が1から100までの係数で変動することが示されているディック バン デ コージ(Dick van der Kooij)等による「ウォーター リサーチ(Water Research)」,2005年,第39号,P.2789−2798を参照されたい(この論文の図2参照)。この点は、後述する通り、利用されるウィルスが溶解している時の、(a) 前述の関係式2及び(b) 細胞外NA含有量の考慮が必要である。
米国特許第6312902号明細書からもまたATP法による試料中のウィルスを測定するためのDNA又はRNAのウィルスからの切除が提案されている。この文献では、前記試料中に含まれ得るウィルス株数の評価のためのANの測定の説明も、また添加の利用の示唆もしていない。
ウィルス数の検知及び計量に関する多大なニーズが存在する。
従って、このニーズを満たすために、ATPの形で表される、宿主細胞の自由ANの集合に重点がおかれたATP法を利用した新たな技術的解決策の提供が提案され、前記ANは、試験すべきウィルスが溶解している時には細胞外で、試験すべきウィルスが非溶解状態にある時には細胞内で自由であり、つまり、ウィルスのDNA若しくはRNAの切除又は加水分解によるAN生成物上にある。
本発明の第1発明によると、ウィルスの検知及び計量のための反応式(1)
(1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
の生物発光の利用が提供され、この利用は、(a) 前記ウィルスのATP、ADP及びAMPの無い水性培地液内のウィルスの対象細胞との接触、次いで、対象物の自由ADP及びAMPのATPへの転換後の、同一細胞族の細胞内自由ATP、ADP及びAMPの総量が関係式(2)
(2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという点が考慮されたATPの形での対象細胞を元とする自由ヌクレオチドアデニリル(AN)の含有量の測定、又は、(b) DNAアーゼ若しくはRNAアーゼそれぞれによる、dAMP、dADP及びdATPの二量体からATP、ADP及びAMPの単量体への転換並びに全AMP及びADPのATPへの転換を伴う、前記ウィルスのDNA又はRNAにより構成されるウィルス遺伝子形質の切除、次いで、同一ウィルス族の遺伝子物質のATP、ADP及びAMPの総計が前記関係式(2)により一定であるという点が考慮されたATPの形で表されるウィルスのDNA又はRNAの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル(AN)の含有量の測定、がそれぞれ行われるとともに、前記測定は、(i) ATP添加無しにそして(ii)既知量ATPの添加後に行われることを特徴とする。
本発明の第2発明によると、対象細胞のAN又はウィルスのDNA若しくはRNAの切除により得られるANをもとにしたATP法によるウィルスの検知及び計量方法が提供され、前記ANはATPの形で表される。
本発明の別の発明によると、前記方法に用いる定量決定要素が提供される。
前記定量決定要素は、ルシオール及び添加用のATP、必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、DNAナーゼ、RNAナーゼ及び/又はピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ及び/又はApoHで覆われた磁気超微粉、及び/又は、測定ウィルスの特殊抗体からなるルシフェリン/ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする。
前記要素は、更に必要に応じて対象物の生きた健全な細胞を含む。
略号
便宜により、本発明に利用される略語及び頭字語の一覧を以下に示す。
ADP:アデノシン二リン酸塩
AMP:アデノシン一リン酸塩
AN:ヌクレオチドアデニリル(別の用語すなわちアデノシンヌクレオチドが使用可能)、ここでは、ATP、ADP及びAMPが含まれるANの集合
ATP:アデノシン三リン酸塩、
cAMP:アデノシン一リン酸塩環式化合物
dADP:アデノシン二リン酸塩二量体
dAMP:アデノシン一リン酸塩二量体
GDP:グアノシン二リン酸塩、
GTP:グアノシン三リン酸塩
NDPK:ヌクレオチド二リン酸塩キナーゼ
RLU:光の関連単位
ウィルスは細胞ではない。これは細胞内の寄生物である。ウィルスは細胞内にある時にのみ繁殖する。従って、ビリオン(ウィルス粒子)について述べられる。細胞外にあるウィルスは代謝活動を全くしない。原核動物細胞(バクテリオファージ)に寄生するウィルスと真核生物細胞に寄生するものとは区別される。
ウィルスの特徴は本質的に以下の通りである。ウィルスは、生きている物と生きていない物との間の「不定の奇妙な領域」を占拠すると同時に、遺伝子物質を有しているので生きていない物と生きた物とが似ており、更に突然変異及び組換えが可能である。従って、ウィルスは進化と同時に転換状態にある培地に順応可能である。しかしながら、同時にウィルスは無細胞性である。つまり、ウィルスは、リボソームも、蛋白の合成及びエネルギーの発生を可能にする代謝の仕組みも有していない。成分が存在しない状態ではウィルスは、宿主細胞内でないと繁殖不可能である上、ウィルスの繁殖の形は独特である。
すべての細胞は、サイズを増やしながら、次いで、それぞれの生命に必要な完全にひと揃いの成分が取り囲まれる2個の新細胞に分割されながら繁殖することが知られている。これに対して、ウィルスは、ウィルスの成分、つまり蛋白質及び核酸に分解され、その後、宿主細胞の代謝の仕組みにより数ダースから数百のウィルスゲノム及び新たなウィルス外被を構成する蛋白質キャプシッドがつくられる。これらの成分はすべて、その次に集められるとともに、最終的には新たなウィルス粒子をつくる。
ウィルスは増殖しない。ウィルスは開放系に当てはまる熱動力学の法則に従わないように思われる。
しかも、ウィルスは結晶化が可能である。これは、鉱物又は有機的分子の大部分の特性であるが、生きている細胞の特性ではない。良好な湿度条件で、しかも生きた細胞中に置かれると、ウィルスにより細胞に新たなウィルス粒子がつくられる。
生物学的ウィルスのサイクル
ウィルスは核酸及び外被から構成される。ウィルスのゲノムは、ある一定数の基部(NMP:RNAの場合のAMP、CMP、GMP、TMP、リボ核酸)又は(dNMP:DNAの場合のdAMP、dCMP、dGMP、dTMP、デオキシリボ核酸)を呈する約数個から数百個までの遺伝子に基づく全体的に直線状又は円形状の核酸(DNA又はRNA)の単一分子から構成される。核酸は蛋白質の殻、つまり、キャプシッドで囲まれている。あるウィルスの中では、このキャプシッド自身、蛋白質が含まれる脂質の二重層で形成される薄膜の外被で囲まれている。
ウィルスには3タイプの増殖サイクル、すなわち、溶菌サイクル、溶原サイクル及び連続放出サイクルが知られている。最初の2つのサイクルは殆どバクテリオファージだけに関係する。既知ファージの95%を越えるものについて、遺伝物質は、5から650kpbまでの(すなわち、10,000から1,300,000 までのヌクレオチド三リン酸塩)1個のDNA二重若枝の分子であり、これらのサイズは24から200 nmまで変動する。
溶菌サイクルは、ウィルスが細胞に侵入する時に展開して増殖し、次いで、溶解後に宿主細胞から分散する。溶解性ウィルスによって侵入された細胞は短時間のうちにほぼ間違いなく死ぬ。
溶菌サイクルでは、菌染色体の消滅がある。ウィルスのDNAは導入ウィルスの関わり合いに必要であるタンパク質に翻訳される。ウィルスのDNAはコピーされる。コピーはキャプシッドからのタンパク質合成用の母体からなる。この合成は、ウィルスが適切なエネルギー源ではないので、菌のリボソーム(菌の仕組みの流用)、つまり細胞エネルギーの大きな攪乱及び特に細胞内ANにより確保される。
こうして核酸の合成が起こる場合に、ヌクレオチド(基部はATP、CTP、GTP、TTP、すなわち、XTP)は宿主細胞の仕組みによりつくられる。次に、蛋白質及びウィルスDNA(又はRNA)の自己結合が起こる。菌は分裂すると同時に多数のビリオンを放出する。この点は、核酸の加水分解が引き起こされる前に非ウィルス細胞の存在の証拠となるヌクレオチドアデニリルが定量決定されるので、ウィルス又はその他すべての原核動物又は真核生物の細胞から生じる核酸の識別に極めて重要である。
溶原サイクルは、毒性又は溶解性ウィルスによりその遺伝物質が宿主細胞のものと組合せられる場合に展開されると同時に固定したようになる。ウィルスのDNA(又はRNA)は溶原性細胞の名前をもつ宿主細胞のものと反駁し合い、ウィルス又はファージは親ファージと呼ばれる。ある刺激剤により親ファージは毒性となり、溶原サイクルを開始させる。溶原性細胞は、従って、溶解されると同時にウィルス粒子が放出される。
溶原サイクルでは、ウィルス性DNA(又はRNA)は菌染色体内で一体化される。菌は外部の状態により溶原サイクルに移行するまで生き続ける。ある溶原性菌は人体の健康にとって大きな重要性をもつ。例えば、ジフテリアの原因であるジフテリア菌は、ジフテリア毒素に関して暗号化する遺伝子をもつ親ファージによりそのDNAが感染した場合にのみ、この病気の原因である毒素と同化しない。ボツリヌス中毒の原因であるボツリヌス菌又は化膿性連鎖球菌、猩紅熱体でも同じ現象が示される。
従って、これらの場合(溶菌サイクルによりこの後者の時に溶原性が見られるので、ウィルスは外部の状態により溶菌サイクル内に移行するまでは固定していることになる)、ウィルスが存在する証拠立てを可能にするのは、細胞外AN(宿主細胞壁の溶解により放出された)の定量決定であり、前記全宿主細胞である。細胞外NAによりウィルス数の定量化が可能となり、AN外部/NA全量関係により感染レベルが与えられる。例えば、AN外部/AN全量の場合にはすべての宿主細胞が溶解されている、つまり死んでいることを意味する(壊死)。
連続放出サイクルは、数個のファージ及び多数の動物性ウィルスの仕業である。これらのウィルスは、繁殖すると同時に無傷のままの宿主細胞により中断することなく放出される。ウィルスはエンドサイトーシスを通って細胞内に侵入する。エンドサイトーシスの小胞は、その宿主細胞の細胞形質内に遺伝物質を放出し得るウィルスキャプシッドの放出を可能にするリボソームと融合する。遺伝物質は、ヌクレオキャプシッドを形成するウィルス遺伝物質を含むキャプシッドが新たにつくられるために反駁されると同時に利用される。これらのヌクレオキャプシッドは、小胞体及び宿主細胞のゴルジ装置を通じてウィルス粒子が芽を出すと同時に放出され、宿主細胞から生ずる薄膜外被で囲まれる血漿薄膜まで運搬される。流行性感冒、流行性耳下腺炎、はしか又は狂犬病のウィルスはこの連続放出サイクルをもつ。
この場合に、細胞外ANの定量決定により情報が得られないのに対して、ウィルスが存在する宿主細胞の代謝及び特にエネルギーの攪乱を考慮して予め信号が出力されるので、全ANの定量決定により、この無ウィルス同一細胞のANの定量決定に関する異常の検知が可能となる。
エム.ゲンドロー(M.Gendraud)の論文「植物生理学(Physiol. Veg.)」,1977年,第15号(1),P.121 −132 に提案されているように、発光により宿主細胞の別のヌクレオチドが定量決定されて感度を上げることができる。その機構によると、NDPKの存在下において、
XTP+ADP→XDP+ATP
である。
このように、本発明のある発明では、対象物の細胞壁の溶解により細胞外に放出される、ATPの形で表されるANをもとにしたATP法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法が提供される。
本発明の別の発明によると、対象細胞の自由AN、又はウィルスDNA若しくはRNAの切除によるAN生成物をもとにした連続放出されるウィルスのATP法による検知及び計量の方法が提供される。
このようにして、DNAのあるウィルスに関するDNA、又はRNAのあるウィルスに関するRNAにより構成されるウィルスの遺伝形質と結合されて見つかる全結合AN数の検知及び計量が可能であり、前記結合ANは、DNAアーゼ又はRNAアーゼの作用、次いで、必要に応じてdAMP、dADP及びdATPの二量体からAMP、ADP及びATPの単量体への転換により放出され、前記AMP及びADPはATPの形でのANの測定のためATPに転換される。
対象細胞の利用法
反応式(1)
(1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
に応じた生物発光による溶解性ウィルス株の検知及び計量の方法が目的とされ、非感染対象細胞内自由ヌクレオチドアデニリル(AN)の総量は関係式(2)
(2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実に基づく前記方法は、以下の連続する段階を含むことを特徴とする。すなわち、
(1°)試験ウィルス(V)の株が含まれ得ると同時に自由ANの無い水性溶液試料(E)の準備
(2°)試料(E)の対象細胞との接触
(3°)その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続
(4°)生ずる細胞外培地の回収、並びにADP及びAMPのATPへの転換処理
(5°)段階(4°)から生ずる培地への、最初は(i) ATP添加無しで、次いで(ii)既知量のATPの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
(6°)ATPの添加無し、次いで既知量のATPの添加後の反応式(1)による放出光の増幅信号の測定
(7°)ATPの形での全細胞外自由AN含有量の測定、次いで最初の試料(E)内の前記ウィルス(V)の株数の推定
前記ウィルス株数の推定のため、段階(7°)では事前に作成される計算図表方式の利用が含まれ得る。変型例では細胞外全AN含有量が、前記ウィルスが存在しない状態での段階(1°)から(7°)までの繁殖により得られる目標細胞のものとの比較により決定され、次いで最初の試料(E)内の前記ウィルス(V)の株数が推定され得る。実際には、定量決定技術によりウィルス株数を直接的に、良好に決定することが可能となる。
また、反応式(1)
(1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
に基づく生物発光による連続放出にあるウィルス株数の検知及び計量の方法も対象とし、非感染の対象細胞内自由ヌクレオチドアデリニル(AN)の総量が関係式(2)
(2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
により一定であるという事実を考慮した前記方法は、以下の連続した段階を含むことを特徴とする。
(1a°)試験ウィルス(V)の株が含まれ得るとともに自由ANの無い水性液体試料(E)の準備
(2a°)試料(E)の対象細胞との接触
(3a°)その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続
(4a°)対象細胞の回収、生ずる細胞内培地が回収されるためのこれらの溶解、次いでADP及びAMPのATPへの転換のための前記細胞内培地の処理
(5a°)段階(4a°)から生ずる培地内への、最初は(i) ATPの添加無しに、次いで(ii)既知量のATP添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入
(6a°)ATPの添加無し、次いで既知量のATPの添加後の反応式(1)による放出光の増幅信号の測定
(7a°)最初の試料(E)中の前記ウィルス(V)の株数の推定のためのATPの形での細胞内自由ANの全含有量の決定
段階(7a°)は、段階(7°)について上記で示されたように、特に、前記ウィルスが存在しない状態での段階(1a°)から(7a°)までの繁殖状態で処理された対象細胞との比較により行われ得る。変型例では、細胞内全ANの含有量の決定は予め作成された計算図表方式により行われ得る。次に、前記試料(E)内の前記ウィルス(V)の株数が推定される。
まとめると、段階(1°)〜(2°)及び(5°)は段階(1a°)〜(2a°)及び(5a°)に一致し、段階(3°)及び(6°)〜(7°)はほぼ段階(3a°)及び(6a°)〜(7a°)に類似している一方で、段階(4°)は段階(4a°)とは異なる。同一又は類似の段階が実施される方式は共通に処理される。これに対して、段階(4°)及び段階(4a°)の方式はそれぞれ別々に処理される。
試料(E)は水性組成であり、必要に応じて、有機性組成であり得る。この試料(E)は、水性が都合の良く、ガス(特に洗浄を通じて)、固体(特に接触、溶解若しくは分散を通じて)又は液体(特に抽出、溶解若しくは乳化を通じて)から採取される。
前述の反応式(1)により、オキシルシフェリン、AMPの光子及び1又は数種のリン酸塩主にピロリン酸塩が提供される。この反応は、最適濃度にあるATP、ルシフェリン及びルシフェラーゼに特有のものであり、これらの三物質が存在すると同時に放出される光子の数はATP量に直接比例する。有機体及びすべての反応培地内では、細胞外ATPは、再循環により、又は主たる分解により比較的急速に消える。
ATPは、エネルギー源(機械エネルギー、浸透エネルギー、化学エネルギー、熱エネルギー、光エネルギー)として、リン酸塩ドナー、ピロリン酸塩ドナー、AMPドナー及びアデノシンドナーを細胞内に介在する。
同一種の細胞中のATP含有量は物理的状態に応じて大きく変動し、検知閾値は一般的に103 個の菌数である。本発明によると、ATPが1アトモル(放出光信号の安定化無しで)から0.5 アトモル(前記信号の安定化有りで)まで最上の感度が達成され、これは菌1個の全細胞内自由ANの平均含有量にほぼ相当する。
関係式(2)を考慮すると、AMPの合成に介在する前駆物質である環式アデノシン一リン酸塩(cAMP)の細胞内含有量は無視される。この含有量は本発明の反応培地内では実用上無視できる。
本発明によると、酵素(ルシフェラーゼ)、光胞子基質(ルシフェリン)、補酵素(ATPの場合に)、ルシオール(フォチナス・ピラリス)に関する良く知られた原理が採用される。結果は、光度計(又は輝度計)にRLUで表示され、ATP量に比例するにもかかわらず、これによって試料の本当のATP濃度決定は可能ではない。
この問題を改善するために、最初の読み取り(ATPの提供無しで実施)後に、既知量(例えば、102 から10ピコモルまでのATP)の提供が推奨される。しかしながら、前記細胞内のATP含有量は、生理学的状態に応じた急速な「逆転」があって一定に留まらないので、提供される技術では定量的な数量測定が可能ではない。
これに対して、所与の対象細胞はすべて同一のAN含有量を示す。本発明によれば、ATPの形で示されるAN含有量が決定されながら、対象細胞及びウィルス株数の定量的決定の実施が可能になる。
有利な方法では、分離及び濃縮に関する本発明の方法の段階(1°)又は(1a°)は、
・薄膜の濾過、
・特に真空かつ雰囲気温度(15〜25℃)下の蒸発・遠心分離、及び/又は
・免疫捕捉
により行われる。
免疫捕捉技術は好ましい。この技術により、抗体によりウィルスの固定によるウィルス株の濃縮及び純化が可能となる。実際の方法では、これらの抗体はウィルスを損なうことなくウィルス表面の抗原体に向けられ得る。また同様に実際の方法では、これらの抗体は、磁場内でのウィルス−抗体−球タイプの接合生成物の濃縮及び純化並びに前記接合生成物の回収のために磁気乳液球上に不動化される。変型例では、ウィルス株が固定される抗体に結合される非磁気又は非磁化の球により、また、上澄みの移し取りにより前記株の濃縮及び純化が可能となる。
免疫捕捉実施の最良の形は、ApoH、すなわち、生きた物質を固定すると同時に死んだ有機体の破片類特に壁を固定しないタンパク質で覆われた磁気超微粉の利用である。ApoHは細胞死(アポプトーシス)の直前又は瞬間にだけ現れる1種の蛋白質である。
前記接合生成物は、引き続き必要な場合には、抗体にもはや結合されない細胞の濃縮された液体組成を処理するために特に溶離により分離される。
必要に応じて、感度が下がる希釈が制限されるために、生成物のロス無しに数分間での大量の試料又は反応する培地の乾燥を可能にする蒸発−遠心分離装置(2,000 〜10,000回転/15分から2,000 〜10,000回転/分までの運転)により前記液体組成を濃縮することが賢明である。屋内温度での蒸気−遠心分離により株が含まれる培地の水分の大部分が除去可能となる利点がある。
また、都合の良い方法では、ウィルス株の対象株との接触、次いでこれらの発達に関する段階(2°)〜(3°)又は(2a°)〜(3a°)は専門家に既知の形により行われる。
段階(4a°)において、対象細胞壁の溶解は、
(i) TrisプラスEDTA、及び/又は、
(ii)DMSO、
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波処理(約1分間)、急速冷却(特に、冷蔵庫における)と続き、更に必要な場合には生ずる液体培地を回収するための遠心分離により、段階(3a°)から生ずる培地内で行われる。溶解は細胞内ANへの接近が可能となるために必要である。
(4°)又は段階(4a°)におけるADP及びAMPのATPへの転換はミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼを用いて行われる。反応機構を以下に示す。
Figure 2008516626
時間の節約のため、ADP及びAMPのATPへの転換に関する本発明の方法の段階(5°)は、段階(4°)と同時に行われ得る。
都合の良い方法では、本発明の方法の段階(5°)又は(5a°)はルシオール(フォチナス・ピラリス)のルシフェリン及びルシフェラーゼを用いて行われる。基質及び酵素はルシオールと同時に抽出され得る。
実用的な方法では、少なくとも10分間ほぼ一定値の光子の放出を安定化させる物質の存在状態において反応式(1)により放出される光の測定に関する段階(6°)又は(6a°)が行われることが推奨される。このためにふさわしい物質には、以下のものが挙げられる。すなわち、
・前述の反応式(1)の最中に生成される、AMP及びピロリン酸をATPに転換させるピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ(PPDK)、
・反応する培地に存在し得る残留ADP及び/又はAMPを分解させるアデノシンリン酸塩ジアミナーゼ
最初の酵素は、ほぼ連続してATPを発生させながら安定した信号をもたらす。第2の酵素により、光エネルギー源としてのATPの利用法が攪乱されずに、ADP及び/又はAMPの培地内の残留物の存在による少量の液体からの雑音を小さくすることが可能となる。
前記第2の酵素アデノシンリン酸塩ジアミナーゼは、更に都合良いことに、反応する培地内のヌクレオチド残留物の除去のためだけでなく、特に、場合に応じて前述の段階(1°)の時に存在する試料に存在する細胞外ヌクレオチド残留物を消滅させながら排除するために利用される。
実際には、反応式(1)による光子の放出を安定化させるために、特に段階(5°)におけるPPDKの利用が推奨される。
本発明の方法は、特に、HIV、バクテリオファージのようなウィルス、C型肝炎ウィルスの検知及び計量に適用される。
最初に結合され、その後このようにして得られるANが、段階(4°)でミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼによりATPに転換される。
光子の放出は、ATP添加無しで、次いでATPの添加後に、段階(5°)又は(5a°)で上記に示したようにルシオールのルシフェリン/ルシオールルシフェラーゼを用いて行われる。ルシオールのルシフェリン/ルシフェラーゼ集合体は特に、例えばControlifeという会社から市販で入手可能である。
有利な方法では、PPDKを用いて光子の前記放出を安定化させながら上記に示したように操作される。
増幅信号の測定及びその決定は、段階(6°)及び(7°)において上記に示したように行われる。
本発明によると、ATP法によるウィルスの検知及び計量に関する方法が推奨され、この方法には以下を含むことを特徴とする。すなわち、
−DNAアーゼ又はRNAアーゼを用いたウィルスDNA又はRNAの切除、次いで必要に応じてdAMP及びdADPの二量体のAMP及びADPの単量体への転換
−こうして得られるAMP及びADPのATPへの転換
−まず(i) ATPの添加無しで、次いで(ii)既知量のATPの添加後のATPのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触
−ATP添加無しで次いでATPの添加後の反応式(1)により放出される光の増幅信号の測定、及び、
−これをもとにしたウィルス数の推定のためのATPの形で表された最初の結合された全AN含有量の決定
ウィルスの遺伝形質の利用法
本方法は、以下に前述の段階を参照して簡潔に説明される。
上記段階(1°)として水性液試料(E)を用意する。分離/濃縮は、
・薄膜上の濾過、
・特に、真空下の室温(15〜25℃)下の蒸気・遠心分離、及び/又は、
・免疫捕獲
により都合良くはApoHを用いて行われる。
(i) TrisプラスEDTA、及び/又は
(ii)DMSO
が含まれる水性緩衝剤の追加、次いで対象細胞を開くためのマイクロ波による処理(約1分間)、引き続く急速冷却(特に冷蔵庫による)、更に必要な場合には、生ずる培地液の回収のための遠心分離によりウィルス壁が溶解される。
ウィルスDNA又はRNAが、(i) オロゴヌクレオチドの放出用のエンドヌクレアーゼ 、例えば、DNAアーゼ若しくはRNAアーゼ(特に、系統5'のGの切除用のRNAアーゼT1若しくは系統5'のC/Uの切除用膵臓RNAアーゼ)、又は制限酵素、(ii)エクソヌクレアーゼ、又は(iii) 牛の脾臓のフォスフォジエステラーゼ(3'-Pが放出される5'-OH からのRNA切除用)若しくは蛇毒(5'-Pが放出される3'-OH からのRNAの切除用)のフォスフォジエステラーゼにより切り離されて、dAMP、dADP及びdATPの二量体がAMP、ADP及びATPの単量体に転換される。
ヌクレオチド一リン酸塩のヌクレオシド三リン酸塩への転換は、米国特許第6312902号明細書に説明してある操作機構が利用可能である。
本発明による好ましい機構には以下のものが含まれる。すなわち、
I.
(a) 特定DNAに関するDNAポリメラーゼリバーストランスクリプターゼの作用下、RNAに関するRNAポリメラーゼの作用下の、
ANn+PPi→ANn-1+XTP XTP
に従う。
この転換では数種の酵素、特にAMVリバーストランスクリプターゼ、MMLVリバーストランスクリプターゼ、DNAポリメラーゼα及びβ、タックポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、クレナウ断片、ポリA ポリメラーゼが、0.1 から100 U/mlまでの濃度で利用された。
(b) NDPKを使った以下の機構に従う。
Figure 2008516626

但し、ADPは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、NDPKは0.1 から10U/ml。
II.
(a) 以下によるANの加水分解段階、すなわち、
ANn+H2O→ANn-1+XMP
ANn+エクソヌクレアーゼ→nXMP
[すなわち、RNAならNMP、又はDNAならdNMP]
(b) PRPPシンテラーゼを使った以下の機構に従う。
Figure 2008516626


[XTPはRNAならNTP、DNAならdNTP]
5フォスフォリボシル・ピロフォスフェート・シンテラーゼ(又はリボース・フォスフェート・ピロフォスフォキナーゼ)は様々な合成方法に共通の酵素であり、そのプリンの合成及びピリミジンの合成は人体中にある。この合成によりペントース・フォスフフェート法から生ずるαDリボースへのピロフォスファートの伝搬反応が触媒反応化される。これは0.001 から10U/mlまでのATP濃度での利用が有利である。ATPはピロフォスフェートの補酵素ドナーでありかつエネルギードナーでもある。
5フォスフォリボシル・ピロフォスフェート(すなわち、5−PRPP)は、いわば1種の代謝「交差点」であり、ヌクレオチドの合成、すなわち、
アデノシン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ、
ヒポキサンチン−グアニン・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ(HGPRTアーゼ)、
オロテート・フォスフォリボシル・トランスフラーゼ(U錯合成物)、
5−PRPPアミドトランスフラーゼ、
など数多くの種類の酵素の基質として介在する。
酵素はプリンヌクレオチド、ADP及びGDPにより抑制される。
(c) NDKPを使った以下の機構に従う。
Figure 2008516626

但し、ADPは0.01から0.50μM 、好ましくは0.5μM 、NDPKは0.1から100 U/ml。(NDPKが使用される場合、フォスフェートドナーはdCTP又はα、β−メチレンアデノシン5’−三リン酸塩である)
III.ヌクレオチド・モノフォスフェート・キナーゼ(NMPK)及びピルビル酸キナーゼを使った以下の機構に従う。
Figure 2008516626

又は、NMPK及び/又はミオキナーゼも使われる。
この最後の技術は本発明により推奨される。制約される難しい段階は核酸の加水分解である。検知の閾値はウィルスゲノムの基部の数の組成に依存する。
ATPの原子量が551 であること並びにATPの検知閾値は光度計及び反応物に依存することが分かったが、現在アトモルオーダーであって、アボガドロ数(6,022 ×1023)の利用により検出可能なウィルスの粒子数の予想は容易であり、ATP法による定量決定はルシオールのルシフェリン/ルシフェラーゼ(製品はControlife社により製造されている)を使用して行われる。
本発明のその他の利点及び特徴は実施例に沿った説明を読めば更に良く理解される。勿論、これらの要素は限定的なものではなく、例示として提供されるものである。
(実施例1)
ウィルスDNA又はRNAについてのATP法に関する手順
−Tris HCl 50mM、pH7.6 のNaCl 150 mMで緩衝された100 mlの試料
−用意された10μl の球の添加(ApoH又は検査ウィルスの特定抗体)
−通常回転の攪拌下の37℃での30分から90分間の培養
−PBS中の洗浄1回
−磁気方式が使われる球の回収
−球をDMSO型からの抽出溶液に接触させながらのウィルスの溶解
−その後、核酸のヌクレオチドへの加水分解及びこれらのATPへの転換
予測
−緩衝溶液:DNA(又はRNA)の変性が回避される培地のpHの変動限界
−SDS(ドデシル硫酸塩ナトリウム):脂質層を断ち切る洗浄剤
−EDTA(エチレン・ジアミン・テトラアセテート):カルシウムイオンのキレート化合物、DNAを消滅させると同時にすべての細胞に存在している酵素、DNアーゼの活動にはCa2+イオンが必要である。
−溶液中(あまり重くない)の物質の固体粒子(最も重い)の急速分離のために遠心分離にかける
−冷えたナトリウムアセテート及びDNA不可溶化用の冷凍エタノール
(実施例2)
バクテリオファージの定量決定
溶解性ウィルスであるバクテリオファージの対象細胞として乳酸菌が利用された。
牛乳及びチーズ工場内では、乳製品の品質は乳酸菌に依存し、前記乳酸菌の消滅を防止するためにバクテリオファージ含有量が監視されている。
乳酸菌の既知個体群[本請求と同日に提出された発明の名称「細胞内ヌクレオチドアデニリルに基づく細胞数の検知及び計量のためのATP法、特に無ATP菌の決定のための利用及び方法」の特許請求に記載された方法により決定される]について、バクテリオファージの増殖量(0ウィルス/L、1ウィルス/L、10ウィルス/L、20ウィルス/L)が添加された。前述の段階(1°)〜(7°)の実施により、開始時点(0ウィルス/L、1ウィルス/L、10ウィルス/L、20ウィルス/L)の正確な個体群が判明した。
(実施例3)
宿主細胞のNaの定量決定によるバクテリオファージ群の検知
(a) ヌクレオチドATP、ADP、AMPの定量決定が、ルシフェリン/ルシフェラーゼの複合物の存在する生物発光により実施された。ルシフェラーゼはホタル族(フォチナス・ピラリス又はルシオラ・ミングレリカ))の腹部から抽出された1種の酵素である。ルシフェリンの各分子が、ATP1モル及びO2 1モルにより酸化され、光エネルギー1量子が前述の全体反応式(1)により放出された。
ATPの定量決定は生物発光により直接行われ得る。ここではミオキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを利用して、前述の反応式(3)、(3a)及び(4)による酵素反応によりADP及びAMPのATPへの転換が必要である。
材料及び方法
菌株:中温性連鎖球菌の2種の工業生産株、SM10及びSM26が、平均的ファージを検出するために、毒性ファージ(それぞれ、Φ10、Φ26)の検知に使用され、取上げられたのはSM16溶原株である。
培養培地:合成培地M17がすべての試験に採用された。
毒性ファージの作用:M17培地が100 ml含まれる250 mlのエルレンマイエル中で増殖が続いた。エルレンマイエルは16時間培養して1%p/Vまで接種されて、32℃の培養状態におかれた。光学密度(580 nmと計測された)が0.1 に達した時、毒性ファージ(109 pfu /ml)mlが含まれる溶液が添加された。
平均ファージの作用:DNA内に合体される親ファージの誘導は、増殖が0.1 の光学密度に達するとすぐ0.3 μg /mlのミトマイシン(MC)の作用により開始される。
増殖方式:増殖は光学密度の測定及びヌクレオチドアデニリルの定量決定により平行して続けられた。
第1:全ヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料+1.8 mlの純粋DMSO+10mlの緩衝剤Tris(20mMのTris、10 mMのMgアセテート、pH 7.75)、第2:細胞外ヌクレオチドの定量決定、−Millipore薄膜(0.22 μm )上で濾過された200 μL の試料+4.8 mlの緩衝剤Tris1、第3:抽出も濾過もしないヌクレオチドの定量決定、−200 μl の試料+4.8 mlの緩衝剤Tris1、の3個の試料が用意された。
用意された試料200 μl にルシフェラーゼ100 μl が添加されるとともに、
−ATPの定量決定に関して、50μl の緩衝剤Tris2(20mMのTris、10mMのMgアセテート、5mMのKアセテート、40μM のPEP)、
−内部証拠を得るために、ATP10ピコモルを含む50μlの緩衝剤Tris2、
−ATP及びADPの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ2Uを含む50μl の緩衝剤Tris2、及び
−ATP、ADP及びAMPの定量決定のために、ピルビル酸キナーゼ2U及びミオキナーゼ2Uを含む50μl の緩衝剤Tris2
結果
図1及び図2によると、ATPの定量決定により得られる増殖曲線は光学密度の測定により得られるものと等しい。2つの場合(バクテリオファージの作用及びミトマイシンの添加後の菌の溶解)、細胞の溶解による減少は、光学密度の測定よりATPの測定が大きく強調される(図1及び図2の曲線a1及び曲線b1)。光学密度の測定では溶解現象時に大量培地内により多くの細胞破片が含まれるにもかかわらず、ATP濃度では「生きている」菌の数量がより良く反映されている。
図1及び図2に示された結果は、全ATPの測定値と一致する(DMSOのある細胞内ATPの抽出による)。矢印によりファージの導入の瞬間が表示される。
前述の米国特許第3575812号明細書に示されるように、添加剤が利用されない全ATP(細胞内外の)はRLUでのみ定量決定されている。確かに、ファージにより攻撃された細胞ではRLUの変動が明らかであるが、この米国特許の例では、数回値が増加しているだけでなく、別の回では減少している。これは、内部証拠を利用していないだけでなく、細胞内ATPと細胞外ATPとが区別されていないためである。
図3の結果により細胞内ATPの全ATPに対する定量決定の比較が可能となる。
細胞外NAの定量決定の利点は手順の単純化にあり、細胞の溶解(この溶解はファージにより行われる)の必要はもはやない。濾過後及び濾過無しの細胞外ANの曲線は一致している(これらは重なっている)。
(b) 図4にはPhageSM10により培養の最初にファージが与えられた連鎖球菌 M10の株の培養が示される。
細胞外ANの直接定量決定により連続した検査が可能となるこれらの3変型例が、実施例3により示される。実際、この検査は試料の自動採取により行われ、ANのATPへの転換が続き、次いで、このような瞬間的読み取りが利用される生物発光により形成されるATPの定量決定が行われる。
実施例3の3変型例による結果は、合成培地M17で行われた試験から得られた。更に、自然培地では、光学密度を用いるのが困難であり、その上、他の検査技術は手間がかかり、不精確であり、「毒性」又は「鎮静」しているウィルス作用の迅速な検知が不可能である。それに対して、NAの定量決定は迅速であるだけでなく、既知のATP溶液からなる内部証拠を利用した方法により定量化が可能となる。
AN外部/AN全部関係によりウィルスの攻撃とその大きさが明らかとなる。こうしてml当たり10ファージまでの検知が可能である。
細胞外ANの定量決定は溶解性ウィルスに関するものであり、これにより、より迅速かつより単純な検知が可能となる。これは、この試料を様々な宿主細胞の培養液と接触させながら、様々なウィルス種が含まれる複雑な培地内のウィルス攻撃が標定され得る唯一の方法である。本発明によると、ATPのRLUではなくANが定量決定されるため感度が増す。
ATP濃度測定による増殖検査を示す図である。 ATP濃度測定による増殖検査を示す図である。 細胞内ATP及び細胞外ATPのATP濃度測定による増殖検査を示す図である。 連鎖球菌 M10の株の培養状態を示す図である。

Claims (14)

  1. ウィルスの検知及び計量のための反応式(1)
    (1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
    による生物発光の利用において、
    (a) ATP、ADP及びAMPが含まれない水性液培地中における対象細胞とウィルスとの接触が、次いでATPの形で表される対象細胞から生じる自由ヌクレオチドアデニリル(AN)の含有量の測定が、対象物のADP及びAMPのATPへの転換後に、同一ウィルス族の自由細胞内のATP、ADP及びAMPの総量が、関係式(2)
    (2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
    により一定である点が考慮されて行われるか、又は、(b) DNAアーゼ若しくはRNAアーゼそれぞれによる、dAMP及びdADPの二量体からAMP及びADPの単量体への転換、並びにAMP及びADPのすべてのATPへの転換を伴う前記ウィルスのDNA又はRNAにより構成されるウィルス遺伝形質の切除が、次いで、(i) ATPの添加無し及び(ii)ATPの既知量の添加後に行われる、ATPの形で表されるウィルス性DNA若しくはRNAの切除から生ずるヌクレオチドアデニリル(AN)の含有量の測定が、前記族の遺伝子物質のATP、ADP及びAMPの総量が前記関係式(2)により一定である点が考慮されて、それぞれ行われることを特徴とする利用。
  2. 溶解性ウィルスのATP法が、対象物のセルロース壁の溶解により細胞外に放出されるATPの形で表されるAN数に基づくことを特徴とする請求項1記載の利用。
  3. 連続放出中にあるウィルスのATP法が、対象物の細胞壁の溶解により放出されるATPの形で表される細胞内AN数に基づくことを特徴とする請求項1記載の利用。
  4. ATP法による溶解性ウィルスの検知及び計量の方法において、
    対象細胞壁の溶解により細胞外に放出されるATPの形で表されるAN数の測定を含むことを特徴とする方法。
  5. ATP法による連続放出中のウィルスの検知及び計量の方法において、
    ATPの形で表される、対象物の同一非感染細胞とは異なる対象感染細胞の細胞内自由ANの全含有量による対象細胞の細胞内自由ANの測定を含むことを特徴とする方法。
  6. 非感染対象物の細胞内ヌクレオチドアデニリル(AN)の総量が関係式(2)
    (2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
    により一定であるという点に基づく、反応式(1)
    (1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
    による生物発光による溶解性ウィルス株数の検知及び計量のための方法において、
    (1°)試験ウィルス(V)の株が含まれ得ると同時に自由ANの全く無い水性試料液(E)の準備、
    (2°)前記試料(E)の対象細胞との接触、
    (3°)その発達後に生ずるウィルスにより対象壁が溶解するまでの生成反応培地の培養継続、
    (4°)生ずる細胞外培地の回収、並びにADP及びAMPのATPへの転換処理、
    (5°)段階(4°)から生ずる培地への最初に(i) ATPの添加無しで、次いで(ii)既知量のATPの添加後のルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
    (6°)最初にATPの添加無しで、次いで、既知量のATPの添加後の反応式(1)による放出光の増幅信号の測定、及び
    (7°)ATPの形の細胞外自由ANの全含有量の決定、次いで、最初の試料(E)中の前記ウィルス(V)の株数の推定、
    からなる連続する段階を含むことを特徴とする請求項4記載の方法。
  7. 最初の試料(E)中の前記ウィルス(V)の株数の推定のため、段階(7°)において、細胞外ANの全含有量が、計算図表方式により又は段階(1°)から(7°)までの段階の前記ウィルスが存在しない状態の繁殖により得られる対象細胞のものと比較して決定されることを特徴とする請求項6記載の方法。
  8. 非感染対象細胞内のヌクレオチドアデニリル(AN)の総量が関係式(2)
    (2)[AN]=[ATP]+[ADP]+[AMP]=Cte
    により一定であるという点に基づく、反応式(1)
    (1)ルシフェリン+ATP+O2 +Mg2++ルシフェラーゼ→オキシルシフェリン+光子
    による生物発光を通じた非溶解性ウィルスの株数の検知及び計量のための方法において、
    (1a°)試験ウィルス(V)の株が含まれ得るとともにANの全く無い水性試料液(E)の準備、
    (2a°)前記試料(E)の対象細胞との接触、
    (3a°)その発達後に生ずるウィルスが対象壁を越えるまでの生成反応培地の培養継続、
    (4a°)対象細胞の回収、生ずる細胞内培地を回収するためのこれらの溶解、次いでADP及びAMPがATPに転換されるための前記細胞内培地の処理、
    (5a°)最初に(i) ATPの添加無しの、次いで、(ii)既知量のATPの導入後の、段階(4a°)から生ずる培地へのルシフェリン及びルシフェラーゼの導入、
    (6a°)最初にATPの添加無しの、次いで、既知量のATPの導入後の、反応式(1)による放出光増幅信号の測定、
    (7a°)最初の試料(E)中の前記ウィルス(V)の株数の推定のためのATPの形での細胞内自由ANの全含有量の決定、
    からなる連続した段階を含むことを特徴とする請求項5記載の方法。
  9. 最初の試料(E)のウィルス(V)の数の推定のため、段階(7a°)において、細胞内全AN含有量の決定が、予め作成された計算図表方式により、又は前記ウィルスが存在しない(1a°)から(7a°)までの段階の繁殖により得られる対象細胞のものとの比較により行われることを特徴とする請求項8記載の方法。
  10. 段階(4a°)において、対象細胞壁の溶解が、
    (i) TrisプラスEDTA、及び/又は、
    (ii)DMSO
    を含む水性緩衝剤の追加により、次いで対象細胞を開けるためのマイクロ波処理(約1分間)により、その後に続く急速冷却(特に冷蔵庫で)により、更に必要ならば生ずる液体培地回収用の遠心分離により、段階(3a°)から生ずる培地内で行われることを特徴とする請求項8記載の方法。
  11. ADP及びAMPのATPへの転換の段階(4°)又は段階(4a°)がミオキナーゼ及びピルビル酸キナーゼにより行われることを特徴とする請求項6又は請求項8記載の方法。
  12. ApoHで覆われた磁気超微粉によるウィルス又はその宿主細胞の捕捉段階を含むことを特徴とする請求項4乃至請求項11のいずれかに記載の方法。
  13. ルシオール及び添加用ATP、更に必要に応じてミオキナーゼ、ピルビル酸キナーゼ、ピルビル酸オルトリン酸塩ジキナーゼ、及び/又は、ApoHで覆われた磁気超微粉のルシフェリン/ルシフェラーゼ集合体を含むことを特徴とする請求項4乃至請求項12のいずれかに記載の方法に用いる定量決定要素。
  14. ATP法によるウィルスの検知及び計量の方法において、
    −DNAアーゼ又はRNAアーゼによるDNA又はRNAの切除、次いで、必要に応じてdAMP及びdADPの二量体からAMP及びADPの単量体への転換、
    −こうして得られるAMP及びADPのATPへの転換、
    −まず(i) ATPの添加無しで、次いで(ii)既知量のATPの添加後のATPのルシフェリン及びルシフェラーゼとの接触、
    −ATPの添加無し、次いで既知量のATPの添加後の反応式(1)により放出される光の増幅信号の測定、及び、
    −そのウィルス数の推定のためのATPの形で表される最初に結合された全AN含有量の決定
    を含むことを特徴とする方法。
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