BE1028631B1 - Phagogramme automatique - Google Patents
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Abstract
Système pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages, le système comprenant : une plaque à microalvéoles comprenant une pluralité d’alvéoles, chacun de ladite pluralité d’alvéoles étant configuré pour contenir l’un d'une pluralité de phages, dans lequel ladite plaque à microalvéoles est configurée pour avoir un échantillon comprenant ladite bactérie distribuée dans ladite pluralité d’alvéoles ; au moins un réactif et/ou additif, configuré pour être ajouté à des mélanges dudit échantillon comprenant ladite bactérie avec un phage de ladite pluralité de phages ; et une unité de commande configurée pour interpréter et présenter les résultats de mesures sous la forme d'un phagogramme, lesdites mesures étant fournies par au moins un dispositif analytique, ledit au moins un dispositif analytique étant configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie. L'invention se rapporte également à un procédé correspondant pour utiliser ce dernier.
Description
Phagogramme automatique Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à un système pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages et pour rapporter lesdites sensibilités et des effets lytiques possibles sous la forme d'un phagogramme automatisé. L'invention se rapporte également à un procédé correspondant pour utiliser ce dernier. Arrière-plan La résistance aux antimicrobiens (AMR) est un problème croissant dans le monde, laquelle constitue une menace significative pour la santé humaine et animale, dans des environnements modernes tant vétérinaires que cliniques. Aujourd'hui, des bactéries pathogènes résistantes à pratiquement tous les antibiotiques disponibles dans le commerce ont émergé et il y a actuellement peu de molécules en projet pour le développement de nouvelles classes d'antibiotiques. L'article de Marston et al., « Antimicrobial Resistance », JAMA 316 (11) doi :
10.1001/jama.2016.11764 identifie des facteurs associés à l’AMR. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a nommé la résistance aux antibiotiques comme une des plus grandes menaces pour la santé mondiale, la sécurité alimentaire et le développement, et estime qu'au moins 700 000 personnes meurent chaque année à cause de maladies résistant aux médicaments (OMS, Joint News Release, avril 2019). Initialement cantonnée à quelques régions géographiques, 1’ AMR représente maintenant un défi pour les spécialistes de la santé dans le monde entier, depuis les microbiologistes cliniques et les spécialistes de la lutte contre les maladies infectieuses jusqu’ aux vétérinaires. La description récente de patients hébergeant des bactéries multirésistantes souligne le contexte clinique, mais également la conséquence potentielle d'une telle menace bactérienne.
Les avantages de l'utilisation de bactériophages en tant qu’agents antimicrobiens par rapport aux antibiotiques ont été connus pendant un certain temps. Un avantage significatif des phages est leur spécificité à des espèces (ou des souches de celles-ci) et à des genres, qui permettent à un traitement par phage de supprimer des organismes ciblés sans perturber le microbiome local, réduisant les risques d'infections opportunistes. Les phages ont besoin d’être administrés pendant une durée relativement courte et peuvent potentiellement être utilisés conjointement à des antibiotiques pour retarder la résistance. Une vue d'ensemble élaborée des avantages de l'utilisation de phages en tant que thérapie antibactérienne aussi bien que certaines des limitations et des défis est présentée dans Nikolich et al. « Bacteriophage Therapy : Developments and Directions » Antibiotics, 2020, 9, 135, doi :10.3390/antibiotics9030135, dont la Partie d'Introduction est incorporée dans ce document par référence.
Néanmoins, le comportement surtout spécifique à l'espèce ou surtout spécifique à la souche de phages et leur spectre d’activité particulièrement étroit peuvent également être interprétés comme un inconvénient significatif par rapport aux antibiotiques.
Pour surmonter cette faiblesse inhérente, une approche globale populaire pour la thérapie par phages se concentre sur la fabrication de mélanges statiques ou de « cocktails » de composants de phages multiples qui sont sélectionnés pour infecter une proportion la plus grande possible de souches infectant actuellement des patients et/ou des animaux, et/ou des environnements. Cependant, n'importe quel cocktail statique de phages sera seulement susceptible de traiter efficacement un sous-ensemble de patients et ces cocktails perdront rapidement toute pertinence comme les populations bactériennes continuent d'évoluer. Le lecteur trouvera des informations supplémentaires dans l'article de Rohde et al., « Expert Opinion on Three Phage Therapy Related Topics : Bacterial Phage Resistance, Phage Training and Prophages in Bacterial Production Strains », Viruses 2018, 10(4), 178 ; https://doi.org/10.3390/v10040178.
Comme variante, des stratégies de thérapie par phages personnalisées cherchent à réunir une plus grande biothèque de phages qui pourraient être réunis d'une manière faisable en un cocktail et pour traiter seulement des patients avec des phages qui ont été identifiés comme étant actifs sur leurs souches, produisant de ce fait une thérapeutique adaptée à une infection d'un patient individuel. Comme tel, une thérapeutique est développée en réponse directe à une infection d'un patient individuel, la thérapeutique contenant un phage ou des phages ayant une activité lytique contre l'agent pathogène dans l'infection.
L'article de Pirnay et al., « The Magistral Phage », Virus 2018, 10(2), 64 ; https://doi.org/10.3390/v10020064 examine la mise en œuvre d'un environnement de développement légal et réglementaire pour la préparation magistrale de médicaments à phages faits sur mesure. Un inconvénient supplémentaire est que les méthodologies de diagnostic courantes pour le test de sensibilité de phage in vitro sont conçues pour un environnement universitaire de laboratoire plutôt due le type d'environnement de test clinique qui peut être largement accessible à des patients.
Konopacki et al. révèlent dans « PhageScore : A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity », Biochemical Engineering Journal, 161, 2020, doi.org/10.1016/j.bej.2020.107652, un procédé pour l'évaluation d'efficacité de bactériophages en mesurant des courbes de croissance de bactéries à ODsoonm pendant une durée d'au moins 4 heures. Xie et al. révèlent dans « Development and Validation of a Microtiter Plate- based Assay for Determination of Bacteriophage Host Range and Virulence », Viruses 10, 189, doi:10.3390/v10040189, une étude pour mesurer le spectre d’activité et la virulence de phages pour une collection de 15 phages de Salmonelle contre un groupe de 20 souches de Salmonelle par l'utilisation d'un dosage par tache aussi bien que par un dosage en milieu liquide sur plateau à microtitration à deux concentrations de phages initiales à ODssonm pendant une durée d'au moins 12 heures.
Dans les deux études, tester la sensibilité d'un échantillon pathogène bactérien à une biothèque phagique peut être considéré comme consommateur de temps et exige une quantité commercialement infaisable d'opérations manuelles par du personnel qualifié.
En effet, les techniques actuellement utilisées exigent une culture en croissance de manière exponentielle, obtenue à partir d'un isolat de culture pure qui exige de manière classique un jour à produire, exigent au moins un jour supplémentaire à conduire ; et 5 exigent en outre du personnel hautement formé, ce dernier étant — inaccessible dans un environnement clinique professionnel.
Au moment où elle est identifiée, une infection provoquée par des agents pathogènes bactériens peut devenir risquée et même mortellement grave en l’espace de quelques jours, ou même de quelques heures. Donc, un besoin existe pour un procédé de vérification rapide si une souche particulière de bactéries est sensible à un bactériophage potentiellement thérapeutique.
WO 99/57304 se rapporte à un dosage pour identifier des bactéries présentes dans un échantillon et à un procédé pour traiter une infection bactérienne.
Le protocole révélé dans le document inclut la croissance d'un isolat bactérien durant dix-huit heures, la répartition d'échantillons sur une plaque de microtitration et l’incubation de la plague pendant dix-huit heures. L'interaction du phage et des bactéries est de ce fait déterminée en mesurant l’étendue de croissance bactérienne après incubation avec le phage.
WO 2004/041156 se rapporte à un procédé pour identifier des bactéries et pour sélectionner un bactériophage thérapeutique. L'expression d'une molécule rapporteuse indique si un bactériophage est susceptible d'infecter une cellule bactérienne dans un échantillon. Les échantillons collectés auprès d'un patient sont incubés pendant 4 à 12 heures.
WO 2017223101 se rapporte à un procédé de composition d’un cocktail de phages dirigé contre un agent pathogène bactérien, le procédé comprenant les étapes de construction d’un jeu de diversité bactérienne comprenant diverses souches de la même espèce bactérienne, et par la suite, de construction d'une biothèque phagique archivistique et d’une biothèque phagique de travail, dans lesquelles la dernière est examinée quant à un retard de croissance bactérienne et/ou un manque d'apparition de croissance bactérienne résistant aux phages.
Il y a par conséquent un besoin d'une détermination rapide et facile de bactériophages appropriés pour traiter une infection bactérienne particulière.
Résumé de l'Invention Selon un aspect de la présente invention, on propose un système pour mesurer la sensibilité d'une bactérie, la bactérie étant de préférence un agent pathogène bactérien, à une pluralité de phages, le système comprenant : - une plaque à microalvéoles comprenant une pluralité d’alvéoles, dans laquelle chacun de ladite pluralité d’alvéoles est configuré pour contenir l’un d'une pluralité de phages, dans laquelle ladite plaque à microalvéoles est en outre configurée pour avoir un échantillon comprenant ladite bactérie distribuée dans chacun de ladite pluralité d’alvéoles ; - au moins un réactif et/ou additif, configuré pour être ajouté à au moins un mélange dudit échantillon comprenant ladite bactérie et un phage de ladite pluralité de phages ; et - une unité de commande configurée pour interpréter et présenter les résultats de mesures sous la forme d'un phagogramme, lesdites mesures étant fournies par au moins un dispositif analytique, ledit au moins un dispositif analytique étant configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ledit agent pathogène bactérien.
Un avantage de la présente invention est que la sensibilité d'une bactérie peut être testée contre une pluralité de bactériophages par l'utilisation d'une unique plaque à microalvéoles ou d’un groupement défini de plaques. Comme tel, un phage interagissant avec ladite bactérie peut être identifié d'une façon relativement rapide. La plaque à microalvéoles est de préférence jetable et est de préférence munie d’un jeu ou d’une pluralité des bactériophages qui sont sélectionnés en raison de leur capacité à provoquer une inactivation de cellules, et de préférence une lyse cellulaire, et de préférence une propagation de phages, pour une espèce spécifique ou des genres d'une bactérie ou d'un agent pathogène bactérien et/ou des souches de ceux-ci, ou un jeu assemblé d'espèces spécifiques ou de genres de bactéries ou d’agents pathogènes bactériens et des souches de ceux-ci. De manière avantageuse, les effets de ladite sélection de bactériophages sur la bactérie peuvent être détectés par l'utilisation d'une seule technique expérimentale, au moyen d'un unique dispositif analytique et/ou progiciel.
Un avantage supplémentaire est que les mesures sont représentées sous la forme d'un phagogramme automatique, offrant de ce fait un résumé direct d'une interaction phage-bactérie et permettant l'identification de l'espèce bactérienne et/ou du ou des phage(s) qui provoquent une inactivation de cellules, une lyse cellulaire et de préférence une propagation de phages, dans ladite espèce bactérienne.
Un avantage supplémentaire de la présente invention est qu'un tel phagogramme peut être obtenu dans les limites d’une période de temps relativement courte, particulièrement en comparaison aux procédés actuellement existants pour obtenir de telles informations. En effet, le temps nécessaire entre la collecte d'un échantillon exploitable auprès d'un patient et la récupération du phagogramme peut même être réduit à quelques heures et, dans le cas où un échantillon natif peut être utilisé, il peut même être d’environ 1-2 à 4 heures.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, ledit échantillon est un échantillon natif provenant d'un patient.
Un avantage de ce mode de réalisation est que le système et le procédé tels que décrits dans ce document peuvent être appliqués directement en combinaison avec un échantillon natif, ledit échantillon natif étant de manière classique directement obtenu auprès d'un patient, d’un animal, d’un troupeau infectieux, ou de l'environnement. En raison de la spécificité dans l'interaction phage-bactérie, il peut n’y avoir aucun besoin d'isoler et de purifier la bactérie ou l'agent pathogène bactérien d'intérêt. On peut ensuite supposer qu'une pluralité de phages qui sont sélectionnés pour leur capacité à interagir avec une bactérie d'intérêt dans un échantillon ne vont pas réagir avec des bactéries sans rapport qui peuvent être présentes dans cet échantillon. De même, il peut n’y avoir aucun besoin d'obtenir un isolat de culture pur de l'agent pathogène bactérien d'intérêt à partir de l'échantillon de patient et/ou d’incuber l'échantillon collecté auprès d'un patient afin de cultiver un certain nombre d’unités de {formation de colonie (CFU) qui est considéré comme étant suffisant pour entrer en contact avec une pluralité de bactériophages. Comme tel, un temps crucial est économisé dans la recherche de l'identification de la source d'une infection bactérienne aussi bien que d'une identification de phages interagissant avec et/ou provoquant une lyse cellulaire de la bactérie ou de l'agent pathogène bactérien.
En comparaison, des protocoles pour obtenir un antibiogramme ont été développés pendant quelque temps et incluent la collecte d’échantillons de patient afin de produire des isolats de culture purs de l'agent infectieux. Cette procédure exige de manière classique une période d'attente de 18 heures tandis que des colonies de l'isolat de culture pur croissent. Seulement des antibiogrammes modernes peuvent alors produire un diagnostic exploitable de la sensibilité aux antibiotiques de l'isolat - de manière classique dans les limites d’une heure.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, la plaque à microalvéoles est jetable.
Tel qu’utilisé dans ce document, le terme « jetable » se réfère à une conception à utiliser une seule fois et ensuite à jeter.
Un avantage de ces modes de réalisation est que des microplaques peuvent être utilisées, lesquelles sont préparées à l’avance et scellées et prêtes à l'emploi au niveau du point d'utilisation. De telles microplaques peuvent être fournies avec un protocole pour l'utilisation, lequel peut inclure un produit formant programme informatique ou un script pour un processeur afin de fournir à chaque alvéole de la microplaque les bon(ne)s (quantités de) réactifs et/ou additifs. Une telle microplaque peut être une plaque standardisée, munie d’une pluralité de bactériophages susceptibles de provoquer une lyse cellulaire dans une bactérie spécifique, et ses souches, et peut être configurée pour rechercher la présence de ladite bactérie spécifique dans un échantillon.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, la pluralité d’alvéoles est en outre configurée pour contenir au moins une sélection de phages, dans lesquels chacun de ladite sélection de phages est sélectionné par la capacité à interagir avec et/ou inactiver une espèce bactérienne spécifique unique et des souches de celle-ci.
Un avantage de ces modes de réalisation est qu'en combinant des phages sur une unique microplaque qui ciblent des souches différentes et/ou des types de récepteur différents d'une espèce bactérienne spécifique, de manière classique un agent pathogène bactérien spécifique, une caractérisation de l'espèce ou de l'agent pathogène peut être obtenue, laquelle permet le développement d'une thérapie ou d’un cocktail de phages qui diminue fortement le risque que l'agent pathogène bactérien = développe une résistance aux phages. De préférence, une selection comprend une combinaison de phages de sorte qu’une interaction avec un nombre maximal de souches de l'espèce bactérienne peut être recherchée.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, ledit au moins un réactif et/ou additif comprend au moins l’un de ce qui suit : une molécule d'amorce, un ADN polymérase, un triphosphate de nucléoside (dNTP), une sonde de balise moléculaire susceptible d’émettre une fluorescence, un tampon, et un solvant compatible avec une amplification par qPCR- et/ou une enzyme. En outre, ledit au moins un dispositif analytique est configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie en mesurant l'abondance et/ou la concentration différentielle d'ADN de phage par l'utilisation d'une amplification en chaîne par polymérase quantitative.
Un avantage de ces modes de réalisation est que les interactions phage-bactérie peuvent être mesurées d’une facon relativement rapide, en comparaison à des procédés actuellement disponibles. De manière avantageuse, plusieurs échantillons peuvent être mesurés simultanément. Une mesure par gPCR d'une microplaque contenant des mélanges bactérie-phage peut être effectuée en moins de 2 heures. En outre, des informations détaillées concernant la prolifération de phages peuvent être calculées là où dans d'autres procédés de détection les informations sont souvent limitées à la mort de cellules bactériennes. De telles informations peuvent permettre de quantifier la virulence d'un certain phage en comparaison à d'autres.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, ledit au moins un réactif et/ou additif comprend au moins l’un de ce qui suit : un complexe Luciférine / Luciférase configuré pour permettre la détection de lyse de cellules bactériennes par l'appauvrissement d'ATP et émission lumineuse de fluorescéine concomitante, et un solvant et/ou une enzyme compatible avec le complexe Luciférine / Luciférase. En outre, ledit au moins un dispositif = analytique est configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie en mesurant ladite émission lumineuse.
Un avantage de ces modes de réalisation est que les interactions bactérie-phage peuvent être mesurées d’une facon relativement rapide, en comparaison à des procédés actuellement disponibles. De manière avantageuse, plusieurs échantillons peuvent être mesurés simultanément. Une mesure de bioluminescence d'une microplaque contenant des mélanges bactérie-phage avec un complexe luciférase / luciférine peut être effectuée en quelques minutes, de manière classique en environ 1 à 2 minutes, même en moins d'une minute. En outre, mesurer la bioluminescence en ajoutant un complexe luciférase / luciférine permet des résultats précis, la technique est sensible et assez facile à exécuter.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, ladite unité de commande est en outre configurée pour fournir une composition de phages sur la base dudit phagogramme, dans laquelle ladite composition de phages interagit avec un nombre maximal de types différents de récepteur de liaison de la bactérie ou de l'espèce bactérienne d'intérêt. De préférence, ladite composition ne contient pas plus de trois espèces de phage différentes. De préférence, chaque espèce de phage interagit avec un type différent de récepteur de liaison de l'espèce bactérienne d'intérêt.
Un avantage de ces modes de réalisation est qu'une composition de phages peut être obtenue, laquelle peut être appropriée pour le traitement d'une infection bactérienne provoquée par ladite bactérie ou agent pathogène bactérien. Les bactéries peuvent avoir un ou plusieurs motifs de récepteur spécifiques arrangés sur leur surface, qui obtiennent par médiation leurs cascades d'adsorption et de liaison. Ces motifs de récepteur peuvent être trouvés dans des molécules de surface de cellule incluant, de manière non exhaustive, des sucres, des glycoprotéines, des protéines, des lipides et des lipoprotéines. Les phages peuvent être susceptibles de détecter un ou plusieurs motifs de récepteur spécifiques et peuvent par conséquent être mis en tas dans des « groupes de récepteurs » selon les molécules spécifiques sur lesquelles leurs motifs de récepteur sont trouvés. C'est un avantage supplémentaire de ces modes de réalisation en ce qu'un seul système est nécessaire pour obtenir un diagnostic de compagnon possible pour une infection bactérienne, provoquée par un agent pathogène bactérien dans un échantillon, que l'on a fourni au système.
Dans des modes de réalisation du système selon la présente invention, l'unité de commande est en outre reliée à une base de données centrale et rapporte des résultats, y compris les phagogrammes obtenus, à celle- ci.
Un avantage de ces modes de réalisation est que les résultats d'un nombre élevé de phagogrammes effectués dans des environnements cliniques divers permettent l'identification des spectres d’activité de phages sur un groupement grand et approprié de bactéries.
Comme tel, des tendances de spectre d’activité par région, dans le temps, par système de santé et par indication peuvent être différenciées, permettant d’identifier des éruptions de maladies.
De telles éruptions peuvent être identifiées par « type de phage » ou le groupement spécifique de phages qui peut infecter une souche spécifique qui forme une signature unique et identifiable et qui peut être suivie par le phagogramme.
Selon un aspect de la présente invention, on propose un procédé pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages, le procédé comportant les étapes suivantes : - Fourniture d’une première composition comprenant ladite bactérie et une première plaque de microalvéoles comprenant une pluralité d’alvéoles,
chacun de ladite pluralité d’alvéoles contenant l’un de ladite pluralité de phages ;
- Distribution d'un premier échantillon de ladite première composition dans au moins un alvéole de ladite pluralité d’alvéoles ;
- Pour chacun dudit au moins un alvéole, autorisation d’incubation du mélange dudit premier échantillon comprenant ladite bactérie et un bactériophage contenu dans l’alvéole pour la durée d'une première période de temps ;
- Ajout d'au moins un réactif et/ou additif à chaque mélange, et - Transport jusqu’à et introduction d'au moins un mélange dans un dispositif analytique et mesure de l'interaction bactérie-phage dudit au moins un mélange par ledit dispositif analytique ; et
- Interprétation et présentation des mesures par ledit dispositif analytique sous la forme d'un phagogramme par une unité de commande.
Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, le procédé comprend en outre l'étape de transfert d’un second échantillon dudit mélange jusqu’à une seconde plaque à microalvéoles, avant d'ajouter ledit au moins un réactif, dans laquelle ladite seconde plaque à microalvéoles est configurée pour être compatible avec le dispositif analytique.
Un avantage de ces modes de réalisation est que l'utilisation d'une seconde plaque à microalvéoles permet l'utilisation de microplaques qui sont configurées pour être compatibles avec un dispositif analytique spécifique. En outre, lesdites secondes microplaques peuvent être configurées pour faciliter l'ajout de réactifs et/ou d’additifs supplémentaires avant analyse par le dispositif analytique.
Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, ladite première composition est un échantillon natif provenant d'un patient.
Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, mesurer l'interaction bactérie- phage par ledit dispositif analytique implique de mesurer l'abondance et/ou la concentration différentielle d'ADN de phage par utilisation d'une amplification en chaîne par polymérase quantitative.
Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, mesurer l'interaction bactérie-
phage par ledit dispositif analytique implique de détecter une lyse cellulaire en mesurant une bioluminescence par l'ajout d'activité de luciférase.
Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, le procédé comprend en outre l'étape de sélection d’une composition de phages sur la base dudit phagogramme, dans lequel les phages de ladite composition de phages interagissent avec un nombre maximal de types de récepteur de liaison différents de ladite bactérie. Selon un aspect de la présente invention, on propose un produit formant programme informatique comprenant un moyen formant code configuré pour amener un processeur à effectuer les fonctions desdits système et procédé.
Brève Description des Figures Ces particularités et autres particularités et avantages de modes de réalisation de la présente invention seront maintenant décrits plus en détail en se référant aux dessins annexés, dans lesquels : - La Figure 1 représente de manière schématique un système et un procédé pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages selon des modes de réalisation de l'invention. - Les Figures 2a à 2c représentent de manière schématique un procédé pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages et pour la sélection d'une composition de phages sur la base d'un phagogramme.
Description Détaillée de Modes de réalisation Définitions Le terme « bactériophage » ou « phage » se réfère dans ce document à n'importe quelle entité virale ou semblable à un virus dont l'hôte est une bactérie. Les phages forment un groupe de virus hautement divers.
Le terme « Phagogramme » se réfère dans ce document à une collection de données, de préférence sous la forme d'un tableau, récapitulant l'effet d'une pluralité de bactériophages individuels soit sur un agent pathogène bactérien individuel soit sur un environnement d'échantillon mélangé. Dans certains aspects équivalents à un antibiogramme, le phagogramme donne un profil de la résistance ou de la sensibilité d'un organisme à un groupe de phages.
L'expression « échantillon natif » se réfère à un échantillon contenant une bactérie, de manière classique une bactérie pathogène ou un agent pathogène bactérien infectieux, ledit échantillon étant collecté auprès d'un humain, d'un animal (ux), ou de l'environnement au cours de la pathogenèse ou de la progression graduelle d'une maladie spécifique. Aucun isolement et aucune monoculture d'un agent pathogène spécifique de l'échantillon n'ont été effectués.
Dans ce document, on considère qu’une bactérie est sensible à un phage quand une interaction avec ledit phage conduit à la mort ou à l'inactivation de ladite bactérie. De préférence, cette interaction conduit également à la propagation dudit phage à l'intérieur de ladite bactérie conduisant à une lyse cellulaire et à la libération d’une progéniture de phage.
Le terme « récepteur » se réfère à un groupe chimique ou à une molécule (fraction) comme une protéine ou un sucre sur la surface de cellule ou dans l'intérieur de cellule qui a une affinité pour un groupe chimique spécifique, une molécule, ou un virus.
Un récepteur est une fraction chimique cellulaire reconnue par une particule virale qui est impliquée en induisant de manière spécifique une adsorption.
Des applications et/ou des buts du système et du procédé décrits dans ce document incluent —- l'identification d'une bactérie, de manière classique un agent pathogène bactérien, dans un échantillon, l'échantillon étant un échantillon natif provenant d'un patient, ou un isolat de culture pur de ce dernier, — l'identification de n'importe quels phages qui provoquent une inactivation cellulaire et plus de préférence une lyse cellulaire et même plus de préférence une propagation de phage, dans ladite bactérie dans ledit échantillon, et/ou - le développement d'une composition ou d'un cocktail de phages dans le but de traiter une infection bactérienne provoquée par ladite bactérie.
Bien qu’une référence puisse être faite dans ce document à un agent pathogène bactérien ou à une bactérie pathogène, les termes qui sont utilisés de façon interchangeable dans ce document, le système et le procédé tels que décrits dans ce document peuvent être appliqués à n'importe quelle bactérie ou mélange des bactéries qui sont définies de manière taxinomique aux niveaux du variant, de la souche, de l'espèce, du Générique, ou de la Famille.
Dans des cas spécifiques, un patient peut déjà avoir été diagnostiqué avec une infection bactérienne, dans laquelle une espèce ou un genre spécifique d'agent pathogène bactérien peut être soupçonné d’avoir provoqué l'infection. Une sélection de bactériophages peut être ensuite mise en contact avec l'agent pathogène bactérien dans un échantillon, ou un isolat de culture pur de ce dernier, dans le but d'étudier et de mesurer l'efficacité de chaque phage individuel de la sélection contre ledit agent pathogène bactérien. Chacun des bactériophages dans la sélection a de préférence été sélectionné sur la base de sa capacité à affecter au moins une souche de l'espèce pathogène soupconnée.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, des bactériophages peuvent être sélectionnés du fait de leur capacité à être efficaces contre une espèce pathogène bactérienne spécifique. On considère de ce fait qu’un bactériophage est efficace quand il provoque une lyse cellulaire dans ladite espèce et se propage de préférence dans l'hôte bactérien, reproduisant son ADN de bactériophage dans la cellule hôte. Dans des modes de réalisation particuliers, des bactériophages peuvent être sélectionnés du fait de leur capacité à être efficaces contre l’une d'une variété de souches dudit agent pathogène bactérien. Une application du système peut ensuite être de vérifier l'identité bactérienne supposée et/ou de prévoir un Phagogramme fournissant des résultats quant à l'efficacité d'une sélection de bactériophages contre un agent pathogène bactérien ayant une ou plusieurs souches. Un avantage est que le système et le procédé tels que décrits dans ce document prévoient une manipulation et une procédure rapides de sorte qu'aucun temps de valeur n'est perdu dans la recherche d'un traitement efficace du patient.
Les phages engendrent vraiment une résistance dans des bactéries de manière similaire aux antibiotiques, des mutants résistants étant souvent déficients dans le récepteur de liaison utilisé par le phage pour identifier des bactéries cibles. Pour des bactéries pathogènes, ces récepteurs de liaison sont souvent également des facteurs de virulence impliqués dans un aspect critique de pathogenèse. Dans des modes de réalisation selon l'invention, des bactériophages peuvent en outre être sélectionnés en raison de leur capacité à utiliser collectivement un nombre maximal de récepteurs différents de l'agent pathogène bactérien. Comme tel, des facteurs de virulence multiples peuvent être ciblés simultanément. Une application classique du système pour la conception d'un traitement implique de mesurer l'efficacité d'une sélection de phages contre un agent pathogène bactérien dans un échantillon, dans lequel lesdits phages ciblent un nombre maximal de récepteurs hôte et au moins l’une d'une variété de souches dudit agent pathogène bactérien, et dans lequel ledit échantillon est un échantillon natif provenant d'un patient, ou un isolat de culture pur de ce dernier. L'invention est basée sur le principe que l'interaction fortement spécifique entre des phages et des bactéries peut être déterminée par la mesure de conséquences diverses de l'expression de phage lorsqu’en contact avec un échantillon bactérien. L'effet du phage sur une bactérie hôte va varier de la lyse complète de la bactérie associée à la propagation de phage jusqu’à l’absence d’effet perceptible. En identifiant un phage qui est efficace en provoquant la mort cellulaire dans une espèce ou une souche de bactérie hôte si particulière, de préférence accompagnée par une propagation de phage, un traitement peut être développé pour un patient subissant une infection bactérienne.
Les inventeurs ont constaté qu'une telle expression de phage peut être mesurée tandis que le phage est à des phases différentes de son cycle.
On sait due les Bactériophages se propagent par les étapes suivantes (1) Attachement à des cellules hôtes sensibles spécifiques, (2) Remplacement du métabolisme d'hôte par un métabolisme de phage, arrêtant la croissance cellulaire, (3) Reproduction de l'ADN de bactériophage, (4) Encapsulation de cet ADN de Bactériophage dans des particules de phage qui deviennent infectieuses, et (5) Lyse de la cellule pour libérer des particules infectieuses qui peuvent trouver de nouveaux hôtes. on a maintenant trouvé qu’une interaction phage/bactérie hôte peut être mesurée d’une facon rapide et fiable en utilisant des techniques qui mesurent la prolifération de phage dans les étapes (3) et (5) de son cycle. La figure 1 représente de manière schématique un système 100 et un procédé pour l'identification d'une bactérie dans un échantillon, pour l'identification de n'importe duels phages qui provoquent au moins une inactivation cellulaire dans ladite bactérie, et/ou pour le développement d'une composition de phages dans le but de traiter une infection bactérienne provoquée par ladite bactérie, selon les modes de réalisation de l'invention. Comme tel, le système 100 et le procédé décrits dans ce document mesurent la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages.
Selon un aspect de l'invention, on propose un système 100. Le système 100 comprend une plaque à microalvéoles 110 comprenant une pluralité d’alvéoles 120, chaque alvéole de ladite pluralité d’alvéoles étant configurée pour contenir l’un d'une pluralité de phages, dans lequel ladite plaque à microalvéoles 110 est en outre configurée pour avoir un échantillon comprenant une bactérie, de préférence une bactérie pathogène, distribuée dans chaque alvéole de ladite pluralité d’alvéoles.
Selon des modes de réalisation de l'invention, la plaque à microalvéoles 110 comprend au moins 6 alvéoles, de préférence au moins 12 alvéoles, plus de préférence au moins 24 alvéoles et même plus de préférence au moins 48 alvéoles. En outre, on comprendra que la plaque à microalvéoles 110 peut contenir au plus 9 000 alvéoles, de préférence au plus 5 000 alvéoles, plus de préférence au plus 1 000 alvéoles, même plus de préférence au plus 500 alvéoles et le plus de préférence au plus 200 alvéoles. De manière classique, ladite plaque à microalvéoles 110 va contenir 96 alvéoles, ou pas loin. Les alvéoles sont habituellement agencés en une matrice rectangulaire 2:3.
Dans le but de l'invention, l'expression « plaque à microalvéoles » est utilisée de façon interchangeable avec les expressions « microplaque » ou « plaque de microtitration ».
Selon des modes de réalisation, le dessus de chaque alvéole de la microplaque 110 est scellé dans le but de retenir le contenu de l’alvéole et de séparer le contenu de l’alvéole de l'environnement. Ledit film d'étanchéité (non représenté sur la figure) peut être un film d'étanchéité individuel pour chaque alvéole unique. De préférence, un seul film d'étanchéité est généralement utilisé pour sceller tous les alvéoles de ladite pluralité d’alvéoles 120.
De préférence, les alvéoles sont scellés par une seule feuille de polymère transparente, ladite feuille pouvant être perforée par exemple par les pointes de pipettes jetables qui sont utilisées par un robot de distribution de liquide.
Les microplaques 110 sont de préférence faites de ou contiennent des matières polymères, comme un polycarbonate, du polypropylène ou du polystyrène, bien que n'importe quelle matière qui est sensiblement inerte aux réactions avec le contenu de l’alvéole puisse être utilisée. La microplaque peut être colorée, comme du noir ou du blanc, pour faciliter la mesure de luminescence ou fluorescence. Les microplaques peuvent également comprendre des éléments structurels différents, dont au moins un est fait de ou contient une des matières précédemment mentionnées. Une microplaque à 96 alvéoles aura de manière classique un volume de travail de 100 ul à 360 ul.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, les alvéoles de la microplaque 110 sont configurés pour contenir un seul type ou une seule espèce de phage pour chaque alvéole.
Les bactériophages peuvent être insérés en distribuant un liquide contenant des phages d'un seul type de phage spécifique dans une alvéole, lequel liquide est enlevé par la suite par évaporation ou lyophilisation, laissant le phage dans un état solide dans le fond de l’alvéole.
Les phages peuvent également être retenus dans l’alvéole dans une matrice solide, par exemple comme faisant partie d'un support, par exemple un support poreux. Indépendamment du procédé utilisé, les phages peuvent être dissous dans un milieu liquide, de manière classique un milieu adueux contenant une espèce bactérienne d'intérêt, en quelques secondes.
Il est important qu'aucune contamination croisée notable ne se produise entre des alvéoles, à cause de l'interaction entre une espèce de Bactérie et un phage qui a migré depuis un alvéole voisin.
Selon des modes de réalisation préférés, chaque alvéole de la microplaque 110 contient au plus un seul type de phage, lesquels phages ont été sélectionnés en raison de leur capacité à affecter une espèce du domaine de Bactéries. De manière avantageuse, cela permet d'identifier la présence d'une certaine espèce de Bactérie en administrant un échantillon contenant ladite espèce à tous les alvéoles occupés et en observant l'effet des phages sélectionnés sur l'espèce Bactérienne aussi bien qu'observer le degré de sensibilité de la bactérie à n'importe lequel des phages de la pluralité de phages présents sur la microplaque 110.
Une espèce Bactérienne peut venir sous la forme d'une ou plusieurs souches différentes de ladite espèce. On sait que des phages interagissant avec une espèce de Bactérie affectent des souches de celle-ci à un degré différent. En mesurant l'interaction phage- hôte bactérien pour un groupe sélectionné de phages que l'on sait affecter ladite espèce, on peut déduire de manière avantageuse quel(s) phage(s) est/sont plus couronné (s) de succès dans la lyse des cellules administrées. De plus, tester une variété de phages qui sont connus chacun pour avoir un effet possible sur une espèce Bactérienne particulière, permet la sélection d'au moins un phage qui peut avoir l'effet le plus prononcé sur ladite souche à utiliser dans un traitement.
Selon des modes de réalisation de l'invention, une microplaque 110 contient au moins une sélection de phages, dans laquelle une sélection de phages se réfère à un groupe de deux phages ou plus qui ont la capacité d’affecter au moins une souche d'une espèce pathogène Bactérienne spécifique.
De préférence, ladite sélection est aussi complète que possible de sorte qu'autant de souches que possibles d'une espèce Bactérienne unique, et des mutants de celle-ci, peuvent être identifiées comme sensibles par interaction avec au moins un bactériophage de la sélection.
De préférence, une sélection de bactériophages sera aussi complète que possible de sorte qu'un nombre maximal de récepteurs hôte, signifiant des récepteurs de liaison, de l'espèce pathogène Bactérienne spécifique est ciblé.
Selon des modes de réalisation de l'invention, le nombre de phages peut être optimisé et mis en correspondance avec le nombre d'unités de formation de colonie de PBactéries (CFU) dans l'échantillon. En effet, si le nombre de phages est trop bas dans l’alvéole par rapport au nombre de cellules de bactéries cibles, le test va exiger une Limite de Quantification plus basse que nécessaire pour fonctionner comme moins de cellules sont infectées et qu’une moindre reproduction survient. Cependant, si la concentration en phages dans l’alvéole est trop élevée par rapport à la concentration en bactéries cibles, les phages de progéniture qui doivent être détectés ont pu être inondés par le nombre de phages ajoutés à la chambre d'échantillon, exigeant une sensibilité plus élevée que nécessaire. De préférence, sans se soucier du type ou de l'espèce de phage, le nombre de phages est sensiblement le même dans chaque alvéole de la microplaque 110, les écarts par rapport au nombre moyen de phages dans tous les alvéoles ne dépassant pas 20 %, de préférence 15 %, plus de préférence 10 %, même plus de préférence 5 % et le plus de préférence 2 %. De préférence, le nombre de phages est le même pour chaque alvéole de la microplaque 110.
Selon des modes de réalisation de l'invention, un alvéole de la microplaque 110 contiendra un phage ayant un nombre d'au moins 10° unités de formation de plaque (PFU), de préférence au moins 107 PFU et au plus 1011 PFU, de préférence au plus 1010 PFU et plus de préférence au plus 10° PFU. De manière classique, pour des phages occupant seulement un unique alvéole de la microplaque 110, un alvéole contiendra environ 108 phages PFU.
Selon des modes de réalisation de l'invention, la microplaque 110 contient une seule sélection de phages, ciblant les souches d'une unique espèce Bactérienne.
Comme variante, la microplaque 110 contient deux, trois ou quatre sélections de phages ou plus, ciblant respectivement deux, trois ou quatre espèces Bactériennes différentes ou plus. De manière avantageuse, cela permet d'identifier la présence d'au moins deux, trois ou quatre espèces Bactériennes différentes ou plus.
L'utilisation de deux, trois, quatre sélections de phages ou plus sur une microplaque peut permettre l'identification simultanée putative de plusieurs espèces bactériennes et d’évaluer la sensibilité de cette espèce à une pluralité de phages.
Comme tel, un échantillon natif (probablement mélangé) peut être testé. L'interaction mesurée entre un phage et un échantillon natif peut être ensuite présumée pour indiquer fidèlement la présence de bactéries d'intérêt.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, l'identification de n'importe quels phages qui provoquent une inactivation cellulaire dans l'agent pathogène bactérien d'intérêt, peut dépasser la capacité d'une microplaque unique 110. Dans de tels cas, on utilise un groupement ou une pluralité de microplaques 110.
De préférence, une sélection de bactériophages occupe physiquement un jeu d’alvéoles voisins sur la microplaque 110.
En conséquence de ce qui précède, le Phagogramme peut de manière avantageuse divulguer d'un coup d'œil l'identité putative d'une espèce Bactérienne, aussi bien que la sensibilité de l'espèce à une pluralité de phages.
Selon des modes de réalisation, ladite plaque à microalvéoles 110 est une plaque préparée à l’avance comprenant une pluralité de phages et ayant une protection scellant lesdits alvéoles. Ladite plaque préparée à l’avance est configurée pour être introduite dans un robot classique de laboratoire, comme un robot de distribution de liquide, dans laquelle des échantillons contenant une espèce bactérienne peuvent être répartis et distribués dans lesdits alvéoles, perforant de ce fait ledit film d'étanchéité. Ladite plaque préparée à l’avance est de manière classique une plaque à microalvéoles jetable. On a trouvé qu’une telle plaque à microalvéoles préparée à l’avance, quand elle est conservée à une température de 20 °C et une humidité de 50 %, peut être conservée pendant une durée d'au moins 12 mois. Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, au moins un alvéole de ladite pluralité d’alvéoles sera rempli d'une composition « vierge », dans laquelle ladite composition vierge ne contient pas de concentration en phages d'un type spécifique qui est plus élevée qu'une concentration de fond. De manière avantageuse, en comparant des mesures de la composition vierge et des autres alvéoles contenant des phages, l'effet de phages sur une espèce de bactérie peut être étudié. Selon un aspect de l'invention, on propose un procédé pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages.
Le procédé comprend les étapes suivantes : - Fourniture d’une première composition 130 comprenant ladite bactérie et une première plaque à microalvéoles 110 comprenant une pluralité d’alvéoles 120, chacun de ladite pluralité d’alvéoles 120 contenant l’un de ladite pluralité de phages ;
- Distribution d'un premier échantillon 131 de ladite première composition 130 dans au moins un alvéole de ladite pluralité d’alvéoles 120 ;
- Pour chacun dudit au moins un alvéole,
autorisation d’incubation du mélange dudit premier échantillon 131 comprenant ladite bactérie avec un bactériophage contenu dans l’alvéole pour la durée d'une première période de temps ;
- De manière facultative, transfert d’un second échantillon 141 dudit mélange à une seconde plaque à microalvéoles 150,
- Ajout d'au moins un réactif et/ou additif 160 pour chaque mélange sur ladite première 110 ou ladite seconde 150 plaque à microalvéoles,
- Transport vers et introduction d'au moins un mélange ou d’un échantillon final 171 dudit au moins un mélange, après réception dudit au moins un réactif et/ou additif 160, dans un dispositif analytique 180 et mesure de l'interaction bactérie-phage dudit échantillon final par ledit dispositif analytique ; et - Interprétation et présentation des mesures par ledit dispositif analytique 180 sous la forme d'un phagogramme par une unité de commande (non représentée sur la figure).
Selon des modes de réalisation de l'invention, la première composition 130 comprend au moins une espèce bactérienne d'intérêt qui peut être un agent pathogène bactérien ou infectieux.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, ladite première composition 130 se référera à ou contiendra un échantillon provenant d’un patient, étant un échantillon natif provenant d'un patient, contenant ledit agent pathogène bactérien. On comprendra que ladite espèce bactérienne se réfère dans ce document à une espèce ou à un Genre d'intérêt du domaine de Bactérie, qui est soumis à une identification par ledit procédé et pour laquelle un traitement peut être recherché. L'échantillon provenant d’un patient peut et inclura très probablement d'autres espèces de Bactéries, mais en raison de la spécificité élevée de l'interaction bactériophage/Bactérie hôte, ces autres espèces ne Ss'immisceront pas dans la détection d'une possible expression de phage.
Selon des variantes de modes de réalisation de l'invention, ladite première composition 130 se réfère à ou contient un isolat de culture pur de l'échantillon natif d'un patient.
Indépendamment du fait qu’un échantillon natif ou un isolat de culture pur est utilisé dans le système et le procédé décrits dans ce document, la première composition 130 contiendra en outre au moins un tampon, comme un tampon de McFarlan ou tout autre tampon approprié connu dans l'état de la technique.
De manière classique, la première composition 130 aura un volume d'au moins 200 ml. Un échantillon de l'espèce bactérienne peut être obtenu auprès d'un patient, soit humain soit animal. Ledit animal peut être du bétail ou des animaux de ferme. De manière classique, l'échantillon sera obtenu auprès d'un patient, soupconné d'avoir une infection bactérienne. L'échantillon peut inclure une cellule, un tissu, une biopsie, une sécrétion ou un exsudat, un fluide, ou un contenu gastrique obtenu auprès du sujet. Des exemples d'échantillons incluent, de manière non exhaustive, du sang, de la lymphe, de l'urine, une raclure ou un frottis de peau, une sécrétion nasale, du cérumen, du sérum, un lavage de surface, du plasma, du liquide céphalorachidien, de la salive, un crachat, des selles, un vomissement, du lait, des larmes, de la sueur, un tissu ponctionné, une litière, des rejets, ou l'eau de lavage des œufs.
L'échantillon peut cependant également être obtenu en provenance de l'environnement, en particulier dans des cas où on soupçonne que des parties de l'environnement sont contaminées par des bactéries, qui peuvent en outre infecter des créatures vivantes. Dans des variantes de modes de réalisation, l'échantillon est obtenu en provenance d'un lieu environnemental, comme une source d'alimentation, une source d'eau, une surface de sol, ou un bâtiment.
Étant donné que l'origine de l'échantillon peut varier énormément, la concentration de l'espèce Bactérienne d'intérêt dans l'échantillon variera en conséquence. On a trouvé que pour un échantillon natif à utiliser directement dans la première composition 130, sans isolement de l'espèce Bactérienne d'intérêt,
une concentration d'au moins 10° CFU/ml, de préférence au moins 10° CFU/ml et plus de préférence d’au moins 107 CFU/ml est exigée. Une telle concentration minimale est cependant soumise à la qualité globale de l'échantillon.
Dans des modes de réalisation préférés selon l'invention, la première composition 130 contient un échantillon natif provenant d’un patient, dans lequel la concentration de l'espèce Bactérienne d'intérêt dans la composition 130 est d’au moins 10° CFU/ml, de préférence au moins 106 CFU/ml et plus de préférence d’au moins 107 CFU/ml.
Dans ces modes de réalisation, il n'y a aucun besoin d'isoler l'espèce Bactérienne d'intérêt et par la suite de faire croître ladite espèce à une concentration prédéterminée qui est exigée par la limite de détection desdites techniques d'analyse. Cela permet l'analyse rapide d'une bactérie infectieuse dans un échantillon provenant d’un patient, allant de l'identification de la souche bactérienne particulière dans l'échantillon provenant d’un patient jusqu’à l'identification d'au moins un bactériophage affectant la population Bactérienne. L'identification d'un tel bactériophage peut alors conduire à un traitement pour le patient impliqué. La détection des phages réactifs au même moment détermine précisément l'espèce de bactérie responsable de l'infection.
Comme variante, un isolat de culture pur de l'espèce Bactérienne est d'abord obtenu, lequel peut être par la suite cultivé à une concentration prédéterminée. Cela est effectué de manière classique en amplifiant l'espèce de bactéries d'intérêt sur un milieu approprié.
Dans ces variantes de modes de réalisation selon l'invention, la première composition 130 contient un isolat pur obtenu à partir d'un échantillon natif d’un patient, dans lequel la concentration de l'espèce Bactérienne d'intérêt dans la composition 130 est d’au moins 10° CFU/ml, de préférence au moins 10° CFU/ml et plus de préférence d’au moins 107 CFU/ml.
Dans une étape du procédé selon l'invention, un premier échantillon 131 de ladite première composition 130 est distribué dans au moins un alvéole de ladite pluralité d’alvéoles 120 de la microplaque 110. De préférence, la microplaque 110 est organisée comme précédemment décrit dans ce document.
Les bactéries et les phages sont de préférence mélangés dans un milieu liquide dans ledit alvéole. Le liquide pour fournir le milieu liquide provient de manière classique du premier échantillon 131, comprenant au moins l'espèce bactérienne d'intérêt et le tampon. En n'utilisant pas de gel, le milieu liquide facilite de manière avantageuse le transfert d’échantillons dudit mélange vers un dispositif pour analyse supplémentaire.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, le milieu liquide est sélectionné afin d'être susceptible de dissoudre sensiblement la population de bactériophages complète dans une période de temps de quelques secondes.
Selon —l'invention, le phage est situé dans l’alvéole et un premier échantillon 131 contenant l'espèce de bactérie est ajouté au phage dans l’alvéole.
Dans une étape du procédé selon l'invention, on permet audit premier échantillon 131 comprenant ledit agent pathogène bactérien mélangé avec un bactériophage contenu dans l’alvéole d'incuber pour la durée d'une première période de temps. Dans des modes de réalisation selon l'invention, ladite première période de temps est d’au moins 30 minutes, de préférence au moins 40 minutes et plus de préférence au moins 50 minutes. Ladite première période de temps n'est de préférence pas plus longue que 2 heures, plus de préférence pas plus longue due 90 minutes. De manière classique, ladite première période de temps est d’environ 1 heure. On a trouvé que cette période de temps permet au bactériophage de se relier aux récepteurs de liaison de l'espèce de Bactérie, dans le cas où une telle interaction entre les deux est possible.
Pendant ladite première période de temps, mélanger les phages et l'espèce bactérienne d'intérêt se produit à une température d'au moins 30 °C, de préférence au moins 33 °C et le plus de préférence au moins 36 °C. On comprendra en outre que mélanger les deux composants se produit à une température d'au plus 40 °C, de préférence au plus 39 °C et le plus de préférence au plus 38 °C. De manière classique, les phages et l'espèce bactérienne d'intérêt sont mélangés dans les alvéoles à une température d'environ 37 °C. Dans une étape suivante, des seconds échantillons 141 desdits mélanges sont transportés pour la mesure dans un dispositif analytique 180 pour une caractérisation supplémentaire.
De manière facultative, pour chaque alvéole, un second échantillon 141 contenant le mélange de bactériophage et de l'espèce Bactérienne est transféré à une seconde plaque à microalvéoles 150, ladite seconde plague à microalvéoles 150 étant configurée pour introduire lesdits mélanges dans ledit dispositif analytique 180, de sorte que des échantillons dans ses alvéoles peuvent être mesurés par le dispositif 180.
Ladite seconde plaque à microalvéoles 150 est de ce fait configurée pour être compatible avec le dispositif analytique 180, qui peut exiger souvent des volumes plus petits d'échantillons. Le transfert de seconds échantillons 141 de ladite première microplaque 110 vers ladite seconde microplaque 150 est effectué de manière classique par l'utilisation d'un robot de pipetage de liquide. Le dispositif analytique 180 peut alors, dans une étape du procédé selon l'invention, analyser et mesurer les échantillons sur la seconde microplaque 150. Dans une étape suivante du procédé selon l'invention, un moyen de traitement informatique ou une unité de commande peuvent alors disposer des mesures fournies par le dispositif 180 et permettre une interprétation et une présentation des mesures sous la forme d’un Phagogramme.
Dans des modes de réalisation du système et du procédé selon l'invention, le moyen de traitement informatique ou l'unité de commande sont configurés pour diriger les parties du système et les étapes du procédé prévues en son sein, de sorte que ledit Phagogramme peut être obtenu d'une facon automatisée.
L'unité de commande peut être ou peut contenir une unité de commande pour diriger, évaluer et traiter les étapes du procédé, comme un transfert d'échantillons entre des microplaques, commander température des mélanges et des microplaques, commander l'ajout de réactifs et/ou additifs supplémentaires 160, l'analyse des échantillons ou des mélanges par le dispositif analytique 180, et/ou obtenir les résultats des mesures sous la forme d’un Phagogramme.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, l'unité de commande peut être en outre configurée pour communiquer les résultats dudit phagogramme à un serveur central, permettant de ce fait le partage de manière avantageuse du phagogramme avec une pluralité d'utilisateurs de système.
Dans des modes de réalisation préférés selon l'invention, des réactifs et/ou des additifs supplémentaires 160 sont ajoutés aux mélanges phage/bactérie avant la mesure sur ledit dispositif analytique 180. Le temps d'administration avant la mesure, la nature et le nombre d'un tel au moins un réactif et/ou additif 160 dépend de la technique d'analyse qui est choisie. Ledit au moins un réactif et/ou additif 160 peut être ajouté aux mélanges de phage/bactérie quand situés sur la seconde microplaque
150.
Comme variante, les mélanges dans les alvéoles de la première microplaque 110 sont analysés par le dispositif analytique 180. N'importe quel au moins un réactif et/ou additif 160 est ajouté aux mélanges phage/bactérie placés dans les alvéoles de la première microplaque 110, qui est configurée pour être compatible avec le dispositif 180, de sorte que les échantillons dans ses alvéoles peuvent être mesurés par le dispositif 180.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, ladite analyse supplémentaire comprend au moins l’une de : - Mesure de l'abondance de l'ADN de phage dans le second échantillon 141 par utilisation d’une qPCR et de fluorescence ; - Détection d’une lyse cellulaire en mesurant la bioluminescence par l’ajout de luciférase.
La présente invention est basée entre autres sur les idées des inventeurs que les deux dites techniques sont susceptibles de mesurer et d'identifier une interaction entre le phage et la cellule de bactérie hôte dans un échantillon provenant d’un patient dans les limites d’un temps raisonnable, permettant en fin de compte la sélection d'un phage approprié ou d’une combinaison de phages appropriée pour le traitement d'un patient affecté par ladite bactérie.
On a trouvé que toutes les deux mesurent de manière sûre l'interaction bactériophage / bactérie hôte. De manière classique, seulement une des deux dites techniques sera utilisée à la fois.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, ledit au moins un dispositif analytique 180 est configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ledit agent pathogène bactérien en mesurant le gradient de concentration de l'ADN de phage par l'utilisation d'une amplification en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). L'interaction phage/bactérie hôte est ainsi évaluée par l'utilisation d’une GPCR, qui est une technique de laboratoire bien connue basée sur l'Amplification en Chaîne par Polymérase.
Le processus de PCR consiste de manière générale en une série d’étapes, incluant (1) La dénaturation, consistant à chauffer l'échantillon à une température d'environ 94 °C à 96 °C, permettant aux liaisons hydrogène de l'ADN double brin dans l'échantillon de se briser, donnant deux molécules d'ADN à simple brin ; (2) La renaturation, en baissant la température dans l'échantillon à environ 50 °C à 65 °C, permettant la liaison d'amorces à simple brin à chacune des molécules d'ADN à simple brin.
De manière classique, on utilise deux amorces différentes, chacune étant le complément d’une région cible des molécules d'ADN à simple brin, au niveau de l'extrémité 3’ de chaque brin ; et (3) L'allongement, en avant une ADN polymérase qui synthétise un nouvel ADN double brin en ajoutant des dNTP libres (des triphosphates de nucléoside contenant de la désoxyribose) en provenance du mélange de réaction.
Sous des conditions optimales, le nombre de séquences d'ADN est doublé à chaque étape d'allongement.
Avec chaque cycle successif, les brins de matrice d’origine plus tous les brins nouvellement produits deviennent des brins de matrice pour le tour suivant d'allongement, conduisant à une amplification exponentielle de la région cible d'ADN spécifique.
Les processus de dénaturation, de renaturation et d'allongement constituent un cycle simple.
De multiples cycles sont nécessaires pour amplifier la cible d'ADN à des millions de copies.
Tandis que le processus de PCR offre un procédé rapide et bon marché pour obtenir une amplification d'ADN, une qPCR ou PCR en temps réel a l'avantage qu'elle peut mesurer et suivre le processus d'amplification en temps réel, mesurant donc le gradient de concentration d'ADN, par l'utilisation d’une spectroscopie par fluorescence. La spectroscopie par fluorescence ou fluorimétrie se réfère dans ce document à une technique analytique pour détecter et analyser la fluorescence dans l'échantillon.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, des sondes de balise moléculaire sont utilisées pour mesurer la concentration de bactériophages dans un mélange phage-bactérie hôte en mesurant la fluorescence dans ledit mélange.
Dans des modes de réalisation spécifiques selon l'invention, de telles sondes de balise moléculaire sont des sondes TagMan.
Les sondes de balise moléculaire utilisées dans ce document consistent en un {fluorophore attaché en covalence à l'extrémité 5' de la sonde et en un désactiveur au niveau de l'extrémité 3'. Tant que le fluorophore et le désactiveur sont à proximité l’un de l’autre, la molécule de désactiveur étouffe la fluorescence émise par le fluorophore.
Les sondes de balise moléculaire utilisées dans ce document sont de manière classique conçues de sorte qu'elles renaturent dans une région spécifique d'une molécule d'ADN à simple brin qui est complémentaire à la séquence de sonde, amplifiée par un jeu spécifique d'amorces.
Comme la polymérase étend l'amorce dans l'étape d’allongement et synthétise le brin double naissant, la sonde de balise moléculaire qui s’est renaturée est dégradée, libérant de ce fait le fluorophore et brisant la proximité entre le fluorophore et le désactiveur. Donc, une fluorescence est détectée qui est directement proportionnelle à la quantité de fluorophores libérés. Le signal de fluorescence résultant permet des mesures quantitatives de l'accumulation de la matière d'ADN de bactériophage.
Il est inhérent au processus de qPCR que les amorces, la polymérase d’acide nucléique et les sondes moléculaires sont sélectionnées en vue du bactériophage qui est mélangé avec la Bactérie hôte. Avant analyse par le dispositif analytique 180, chaque mélange spécifique de bactériophage-bactérie hôte dans les alvéoles de la première microplaque 110 ou de la seconde microplaque 150 peut par conséquent être fourni par une composition sélective spécifique, contenant au moins l’une d'amorces, de polymérase d’acide nucléique et de sondes moléculaires qui sont liées au bactériophage spécifique qui est présent dans un alvéole de la microplaque 110 ou dans le mélange.
Selon des modes de réalisation de l'invention, ledit au moins un réactif et/ou additif 160 qui est ajouté à l'échantillon avant analyse par le dispositif analytique 180 comprend au moins l’un de ce qui suit : - au moins une molécule d'amorce ; - ADN polymérase ; — ONTP ; - une sonde de balise moléculaire, susceptible d’émettre une fluorescence ; - un tampon ; — solvants et enzymes compatibles avec une amplification par qPCR connus dans l'état de la technique. Ledit au moins un réactif et/ou additif 160 peut être spécifique pour une combinaison unique de bactériophage-bactérie hôte. De manière classique, ledit au moins un réactif et/ou additif 160 peut être spécifique pour le bactériophage dans le mélange. Les inventeurs ont constaté que par l'utilisation de qPCR, une différentiation peut être faite entre des phages qui peuvent et ne peuvent pas efficacement infecter l'espèce bactérienne d'intérêt qui peut être présente dans des échantillons obtenus auprès d'un patient. Cela est fait en mesurant directement l'abondance d'ADN de phage à l'intérieur de cellules infectées. En d'autres termes, la reproduction d'ADN de phage à l'intérieur de cellules infectées - ou leur manque - est utilisée comme un banc d'essai et un point de comparaison pour évaluer les capacités d'un phage à infecter une bactérie d'intérêt. Une telle comparaison est alors faite avec l'ADN toujours encapsulé entourant des cellules non infectées et des témoins négatifs dans d'autres mélanges bactérie-phage.
La présente invention est basée sur l'idée que, en raison de son extraordinaire sensibilité, une qPCR permet la mesure même de petits changements dans l'abondance cible, ce qui permet la détection de changements même relativement petits dans l'abondance d'ADN de phage amené par reproduction. De manière avantageuse, la spécificité cible permet à la technique qPCR d'être utilisée directement sur des échantillons provenant de patients plutôt que sur des isolats de culture purs, économisant un temps significatif.
Dans des modes de réalisation décrits ci-dessus, le dispositif analytique 180 peut alors se référer à un outil ou à un instrument analytique qPCR, conçu pour mesurer la concentration différentielle d'ADN de phage en temps réel. De manière avantageuse, un tel instrument est configuré pour évaluer et mesurer en parallèle, signifiant que le gradient de concentration d'ADN de phage de plusieurs alvéoles peut être obtenu simultanément. De manière classique, l'instrument est configuré pour mesurer la fluorescence dans les alvéoles de microplaque à 96 alvéoles.
Dans des modes de réalisation selon l'invention, ledit au moins un dispositif analytique 180 est configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie ou ledit agent pathogène bactérien en détectant la lyse cellulaire dudit agent pathogène par des mesures de bioluminescence qui est provoquée par l'ajout d'un complexe Luciférase/Luciférine.
La luciférase est utilisée dans une variété d'applications. Des dosages pour déterminer la présence ou l'absence de microbes en utilisant l'oxydation Induite par la luciférase d'ATP bactérien ont existé depuis longtemps. Ils sont couramment utilisés dans une variété de diagnostics aussi bien que dans des kits disponibles dans le comerce pour détecter une contamination bactérienne.
La réaction catalysée par l'enzyme de luciférase et émettant de la lumière, est la suivante (formule (1)) : Luciférase Lucéférine + O + ATP _____> Oxyluciférine + CO, + AMP + PP; (1)
dans laquelle PP; se rapporte à du pyrophosphate. Dans la réaction de luciférase, de la lumière est émise quand la luciférase agit sur le substrat de luciférine approprié. L'émission de photons peut être détectée par un appareil sensible à la lumière comme un luminomètre ou des microscopes optiques modifiés. La réaction de luciférase permet d'observer des processus biologiques. La présente invention est basée sur l'idée existante que la Luciférase peut agir comme une protéine de capteur ATP. La luciférase est donc utilisée pour détecter la fuite d'ATP provenant d'une cellule lysée affichant efficacement de ce fait la libération en temps réel d'ATP par bioluminescence. Excitées par l’ATP pour produire la bioluminescence, les luciférases permettent la détection très sensible de la quantité d'ATP dans la solution même dans des concentrations très basses.
La plupart des cellules bactériennes saines contiennent environ 2 x 10718 mole d’ATP par cellule, et des kits et des outils analytiques disponibles dans le commerce ont de manière classique une limite de detection entre 1 x 10717 mole d’ATP et 1 x 103 mole d’ATP. En conséquence, un dosage basé sur ce principe peut s'attendre à détecter jusqu’à une plage entre environ 5 et environ 50 000 cellules bactériennes saines. Les inventeurs ont constaté que même au niveau de l'extrémité =: élevée de la plage de limite de détection, un test basé sur le principe de mesure de bioluminescence provoquée par une combinaison d'une Luciférine compatible et d'une Luciférase, détecte de manière fiable l'ATP libéré par la lyse de 2 % des cellules viables disponibles dans les isolats de culture purs les moins abondants.
on a trouvé que la combinaison Luciférine / Luciférase n'est pas spécifique au bactériophage utilisé. Donc, une combinaison Luciférine / Luciférase appropriée peut être utilisée pour tous les mélanges bactériophage-bactérie hôte.
On a en outre trouvé de manière avantageuse que des concentrations élevées de la combinaison Luciférine / Luciférase n'affectent pas les mesures de bioluminescence.
Selon des modes de réalisation de l'invention, ledit au moins un réactif et/ou additif 160 qui est ajouté à l'échantillon avant analyse par le dispositif analytique 180 comprend au moins l’un de ce qui suit : - une combinaison ou un complexe Luciférine / Luciférase conçu pour permettre la détection de lyse cellulaire bactérienne par l'appauvrissement d'ATP des cellules lysées par la combinaison ou le complexe Luciférine / Luciférase en émettant simultanément de la lumière ; - des solvants et des enzymes compatibles avec le complexe Luciférine / Luciférase connus dans l'état de la technique.
Dans les modes de réalisation décrits ci-dessus, le dispositif analytique 180 peut alors se référer à un appareil sensible à la lumière comme un luminomètre ou un microscope optique, conçu pour mesurer la luminescence émise par la réaction décrite dans la formule (1).
Dans des modes de réalisation préférés selon l'invention, un tel instrument est configuré pour évaluer et mesurer en parallèle, signifiant que la bioluminescence de mélanges de plusieurs alvéoles peut être mesurée simultanément.
L'instrument peut être configuré pour mesurer la bioluminescence dans les alvéoles d’une microplaque à 96 alvéoles. Comme variante, l'instrument est configuré pour mesurer les mélanges de manière séquentielle. Dans des modes de réalisation du procédé selon la présente invention, le procédé comprend en outre l'étape de sélection d’une composition de phages sur la base du phagogramme, présenté par l'unité de commande, dans lequel les phages de ladite composition de phages sont sélectionnés en raison de la capacité d'interagir avec un nombre maximal de types différents de récepteur de liaison de ladite bactérie.
Les figures 2a à 2c représentent de manière schématique ces modes de réalisation.
Selon ces modes de réalisation, un but du procédé est de proposer une composition ou une combinaison de types de phage sur la base d'un phagogramme.
De préférence, une telle composition consistera en un à trois phages, dans laquelle chacun de ces un à trois phages cible un type de récepteur ou une famille de récepteurs, de préférence des types de récepteur différents. Une combinaison de types de phage peut être utilisée comme une base pour un traitement d'une infection provoquée par ladite bactérie.
Selon des modes de réalisation, l'unité de commande est configurée pour exécuter les étapes du procédé ci-dessus sur la base des résultats des mesures fournies par ledit dispositif analytique sous la forme d'un Phagogramme en utilisant le système et en suivant le procédé tel que précédemment décrit. L'unité de commande interprétera les résultats obtenus en attribuant des phages aux groupes de récepteurs, dans lesquels les phages dans un groupe de récepteurs interagissent avec une bactérie via un type de récepteur de liaison spécifique, et en classant lesdits phages dans le groupe sur la base de l'interaction réussie avec l'espèce de bactérie.
On se réfère aux figures 2a à 2b. Dans un cas particulier, 14 phages qui reconnaissent cing familles de récepteurs ou les types de récepteur de liaison différents d'une espèce bactérienne d'intérêt sont trouvés comme ayant une activité contre l'espèce. Cinq phages sont trouvés qui ciblent la {famille de récepteurs o de l'espèce bactérienne, trois phages qui ciblent la famille de récepteurs B, deux phages qui ciblent la famille de récepteurs ò, un phage qui cible la famille de récepteurs y et trois phages qui ciblent la famille de récepteurs s sont identifiés comme étant appropriés pour avoir une interaction maximale avec la bactérie et pour combattre une infection provoquée par la bactérie.
Par la suite, pour chaque famille de récepteurs, l'unité de commande est configurée pour sélectionner un phage unique à partir de chaque groupe de récepteurs qui est le plus approprié pour cibler la famille de récepteurs liée et pour identifier le meilleur phage à l'intérieur de ce groupe. Afin de produire un cocktail de trois phages, trois familles de récepteurs à cibler ont besoin d’être sélectionnées. Cela sera fait en classant chaque cible de famille de récepteurs du plus au moins pour chaque indication possible avec une sensibilité aux antibiotiques et sans sensibilité aux antibiotiques. En se référant à la figure 2b, la famille de récepteurs a, la famille de récepteurs B et la famille de récepteurs se sont retenues.
Pour sélectionner un phage à l'intérieur d’un groupe de récepteurs, et en se référant à la figure 2c, l'unité de commande utilisera les informations fournies par le phagogramme et sélectionnera de manière classique un phage qui a montré l'interaction la plus élevée avec l'espèce bactérienne, c'est-à-dire que ce phage est sélectionné pour lequel la bactérie a montré la sensibilité la plus élevée.
Ce processus permet la proposition automatisée d'un cocktail pour qu’un médecin prescrive ce qui sera adapté à la sensibilité de la souche bactérienne du patient aussi bien que le contexte clinique de leur infection.
Tandis que l'invention a été décrite ci-dessus en se référant à des modes de réalisation spécifiques, cela est fait dans un but représentatif et non limitatif, la portée de l'invention est définie par les revendications annexées. Les hommes de l’art apprécieront aisément que des combinaisons de particularités différentes de celles décrites dans ce document soient possibles sans s'écarter de la portée de l'invention revendiquée.
Claims (13)
1. Système (100) pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages, le système (100) comprenant : - Une plaque à microalvéoles (110) comprenant une pluralité d’alvéoles (120), dans lesquels chacun de ladite pluralité d’alvéoles (120) est configuré pour contenir l’un d'une pluralité de phages, dans laquelle ladite plaque à microalvéoles (110) est en outre configurée pour avoir un échantillon comprenant ladite bactérie distribuée dans chacun de ladite pluralité d’alvéoles (120) ; - Au moins un réactif et/ou additif (160), configure pour être ajouté à au moins un mélange dudit échantillon comprenant ladite bactérie avec un phage de ladite pluralité de phages ; et - Une unité de commande configurée pour interpréter et présenter les résultats de mesures sous la forme d'un phagogramme, lesdites mesures étant fournies par au moins un dispositif analytique (180), ledit au moins un dispositif analytique (180) étant configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie ; dans lequel ledit au moins un réactif et/ou additif (160) comprend au moins l’un de ce qui suit : une molécule d'amorce, une polymérase d'ADN, un triphosphate de nucléoside (dNTP), une sonde de balise moléculaire susceptible d’émettre une fluorescence, un tampon et un solvant et/ou une enzyme compatible avec une amplification qPCR ; et dans lequel ledit dispositif analytique (180) est en outre configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie en mesurant l'abondance et/ou la concentration différentielle d'ADN de phage par l'utilisation d'une amplification en chaîne par polymérase quantitative ; ou, dans lequel ledit au moins un réactif et/ou additif (160) comprend au moins l’un de ce qui suit : un complexe Luciférine / Luciférase configure pour permettre la détection de lyse de cellule bactérienne par l'épuisement d'ATP et l'émission lumineuse concomitante de fluorescéine et un solvant et/ou une enzyme compatible avec un complexe Luciférine / Luciférase, et dans lequel ledit dispositif analytique (180) est en outre configuré pour mesurer l'interaction de chacun de ladite pluralité de phages avec ladite bactérie en mesurant ladite émission lumineuse.
2. Système selon la revendication 1, dans lequel ledit échantillon est un échantillon natif provenant d'un patient.
3. Système selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel ladite plaque à microalvéoles (110) est jetable.
4. Système selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite pluralité d’alvéoles (120) est en outre configurée pour contenir au moins une sélection de phages, dans lequel chacun de ladite sélection de phages est sélectionné par la capacité à interagir avec et/ou inactiver une espèce bactérienne spécifique unique et des souches de celle-ci.
5. Système selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite unité de commande est en outre configurée pour fournir une composition de phages sur la base dudit phagogramme, dans lequel ladite composition de phages interagit avec un nombre maximal de types de récepteur de liaison différents de ladite bactérie.
6. Procédé pour mesurer la sensibilité d'une bactérie à une pluralité de phages, le procédé ayant les étapes suivantes : - Fourniture d’une première composition (130) comprenant ladite bactérie et une première plaque à microalvéoles (110) comprenant une pluralité d’alvéoles (120), chacun de ladite pluralité d’alvéoles (120) contenant l’un de ladite pluralité de phages ; - Distribution d'un premier échantillon (131) de ladite première composition (130) dans au moins un alvéole de ladite pluralité d’alvéoles (120) ; - Pour chacun dudit au moins un alvéole, autorisation d’incubation du mélange dudit premier échantillon (131) comprenant ladite bactérie et un bactériophage contenu dans l’alvéole pour la durée d'une première période de temps ; - Ajout d'au moins un réactif et/ou additif (160) à chaque mélange ; - Transport vers et introduction d'au moins un mélange dans un dispositif analytique (180) et mesure de l'interaction bactérie-phage dudit au moins un mélange par ledit dispositif analytique (180) ; et - Interprétation et présentation des mesures par ledit dispositif analytique (180) sous la forme d'un phagogramme par une unité de commande.
7, Procédé selon la revendication 6, dans lequel le procédé comprend en outre l'étape de transfert d’un second échantillon (141) dudit mélange jusqu’à une seconde plaque à microalvéoles (150), avant d'ajouter ledit au moins un réactif, dans lequel ladite seconde plaque à microalvéoles est configurée pour être compatible avec le dispositif analytique (180).
8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, dans lequel ladite première composition (130) est un échantillon natif provenant d'un patient.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la mesure de l'interaction bactérie-phage par ledit dispositif analytique (180) implique la mesure de l'abondance et/ou de la concentration différentielle d'ADN de phage par l'utilisation d'une amplification en chaîne par polymérase quantitative.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, dans lequel la mesure de l'interaction bactérie-phage par ledit dispositif analytique (180) implidue la détection de lyse cellulaire en mesurant une bioluminescence par ajout de luciférase.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel le procédé comprend en outre l'étape de sélection d’une composition de phages sur la base du phagogramme, dans lequel les phages de ladite composition de phages sont sélectionnés en raison de la capacité à interagir avec un nombre maximal de types de récepteur de liaison différents de ladite bactérie.
12. Une plaque à microalvéoles (110) comprenant une pluralité d'alvéoles (120), chaque alvéole de ladite pluralité d’alvéoles étant configurée pour contenir l’un d'une pluralité de phages, destinée à être utilisée dans le système selon les revendications 1-5 et le procédé selon les revendications 6-11.
13. Produit formant programme informatique comprenant un moyen formant code configuré pour amener un processeur d'une unité de commande à effectuer les fonctions dudit système selon les revendications 1 à S et le procédé selon les revendications 6 à 11.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20220419 |