WO2020011994A1 - Dispositif microfluidique pour sélectionner des bactériophages capables d'infecter des bactéries contenues dans un échantillon - Google Patents

Dispositif microfluidique pour sélectionner des bactériophages capables d'infecter des bactéries contenues dans un échantillon Download PDF

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WO2020011994A1
WO2020011994A1 PCT/EP2019/068858 EP2019068858W WO2020011994A1 WO 2020011994 A1 WO2020011994 A1 WO 2020011994A1 EP 2019068858 W EP2019068858 W EP 2019068858W WO 2020011994 A1 WO2020011994 A1 WO 2020011994A1
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microfluidic device
sample
bacteriophage
inlet
channel
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PCT/EP2019/068858
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Jehan LIENART VAN LIDTH DE JEUDE
Johan QUINTENS
Jean-Paul PIRNAY
Olivier VANDENBERG
Herman Jacobus Blok
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Vésale Bioscience
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Microfluidic device for selecting bacteriophages capable of infecting bacteria contained in a sample
  • the present description relates to microfluidic devices for selecting bacteriophages capable of infecting bacteria, for example for selecting particular bacteriophages which can be used therapeutically for treating bacterial infections; the present invention also relates to methods making use of these devices.
  • Tuberculosis, dysentery, pneumonia, meningitis, cholera, anthrax, Lyme disease and brucellosis are just a few of the many bacterial diseases that can be harmful to humans and animals.
  • antibiotics such as penicillin, streptomycin and cephalosporin
  • Phage therapy or viral phage therapy is the therapeutic use of bacteriophages to treat a pathogenic bacterial infection. Phage therapy has many potential applications in human medicine as well as in dentistry, veterinary science and agriculture.
  • Bacteriophages are much more specific than antibiotics. They are typically harmless not only to the host organism, but also to other beneficial bacteria, such as the gut flora, by reducing the chances of opportunistic infections. They have a high therapeutic index, i.e. phage therapy is said to have few side effects. Because phages replicate in vivo, a small effective dose can be used.
  • a method of identifying specific bacteriophages is described in WO 2004/041156, in which a number of different recombinant bacteriophages is provided, each bacteriophage containing a reporter nucleic acid capable of being expressed when the bacteriophage infects a bacterial cell, said bacteriophages bacteriophages are contacted with a sample contaminated with bacteria in a conventional laboratory container such as bottles, tubes or in individual wells of a multiwell plate.
  • a conventional laboratory container such as bottles, tubes or in individual wells of a multiwell plate.
  • the inventors have developed a microfluidic device allowing rapid and easy determination of bacteriophages suitable for the treatment of a particular bacterial infection.
  • the present invention therefore relates to a microfluidic device for selecting bacteriophages capable of infecting bacteria contained in a sample, comprising:
  • a first entry intended to receive the sample or the bacteria to be tested; - at least a second input intended to receive at least one type of bacteriophage,
  • At least one outlet intended to receive a mixture comprising the at least one type of bacteriophage and the sample to be tested
  • said first inlet and said at least one second inlet being connected to allow said sample to migrate to said at least one second inlet, said at least one second inlet being connected to said outlet to allow mixing of said at least one type of bacteriophage and said sample to migrate to said outlet.
  • a microfluidic device allows rapid and easy identification of bacteriophages suitable for the treatment of a particular bacterial infection without the need for laboratory equipment.
  • the first input is connected to the at least one second input by a first channel
  • the at least one second input is connected to the at least one output by a second channel
  • the first channel is a resistive channel configured to reduce reflux
  • the output is configured so that said mixture can be collected in said output to be further analyzed by a reading means
  • the first entry comprises a substantially frustoconical shape with an internal diameter of between 1 and 5 mm
  • the microfluidic device comprises at least 8 second inputs, preferably between 8 and 12, each second input being intended to receive a different type of bacteriophage
  • the first input splits into a plurality of first channels so that said first input is connected to each second input by a first different channel
  • each second input is connected to an output by a second channel
  • the size, shape and design of the second channel are configured to improve the mixing of the sample and the bacteriophage
  • At least one of the second channels comprises a substantially tubular section having a diameter of between 0.3 and 1.5 mm
  • - at least one of the second channels includes u-shaped curves
  • the second channels splits into two sections, said two sections joining in a single section downstream of the second channel so that said second channel alternately comprises one and two sections,
  • At least one of the second channels includes internal asperities allowing a disturbance of flow of the mixture during migration
  • - at least one of the second channels includes internal asperities with a herringbone pattern, - at least one of the second channels comprises internal asperities with a rib-like pattern,
  • a second entry is empty and works blank, each of the other second entries comprising a bacteriophage.
  • the invention also relates to an apparatus for selecting a bacteriophage comprising:
  • microfluidic device 1 for selecting bacteriophages capable of infecting the bacteria contained in the sample according to the preceding claims
  • the invention also relates to a method of selecting bacteriophages capable of infecting bacteria contained in a sample, comprising:
  • FIG. 1 illustrates on a top view a microfluidic device according to the invention
  • FIG. 2 illustrates in a top view an apparatus according to the invention.
  • the invention relates to a microfluidic device 1 for selecting bacteriophages capable of infecting bacteria contained in a sample.
  • Said microfluidic device comprises:
  • At least one second input 22 intended to receive at least one type of bacteriophage
  • At least one outlet 23 intended to receive a mixture comprising the at least one type of bacteriophage and the sample to be tested;
  • said first inlet 21 and said at least one second inlet 22 being connected to allow said sample to migrate to said at least one second inlet 22, said at least one second inlet 22 being connected to said outlet 23 to allow mixing of the at least one type of bacteriophage and said sample to migrate to said outlet.
  • the first input 21 is intended to receive the sample to be tested. Its size and shape are therefore suitable for receiving an injection of a sample containing bacteria.
  • the bottom of said first inlet 21 is connected to at least one first channel 31 to allow the sample to be tested to migrate to the second inlet 22.
  • the first inlet 21 comprises a substantially frustoconical shape with an internal diameter between 0.1 and 5 mm, preferably between 0.4 and 0.6 mm.
  • the upper opening of the first entry 21 is advantageously circular.
  • the depth of the first inlet 21 is preferably between 2 and 4 mm.
  • the first input 21 is connected to the at least one second input 22 by a first channel 31.
  • the microfluidic device 1 comprises a plurality of second inputs 22.
  • the first channel 31 splits into a plurality of first channels 31 so that said first input 21 is connected to each second input 22 by a different first channel 31. The same amount of sample migrates to each second input 22.
  • the first channel 31 allows the sample to migrate from the first input 21 to the second input (s) 22.
  • Said first channel 31 is connected to the bottom of the first input 21 and to the bottom of the second input 22.
  • the shape and size of the first channel 31 are chosen so as to prevent the mixture of sample and bacteriophage from flowing back to the first inlet 21.
  • the first channels 31 are resistive channels configured to reduce the reflux.
  • the first input 21 is connected to each of the second inputs 22 by a first channel which splits into a plurality of first channels 31. The same amount of sample migrates to every second entry 22.
  • At least one of the first channels 31 has a substantially tubular section.
  • Said tubular section has a diameter between 0.05 and 0.3 mm, preferably between 0.1 and 0.2 mm.
  • At least one of the first channels 31 has a rectilinear shape.
  • the second inlet 22 is intended to receive or be filled with a specific bacteriophage which is brought into contact with the sample containing bacteria to test its capacity for infection of said bacteria.
  • the size and shape of the second inlet 22 are adapted to receive an injection of a bacteriophage.
  • the bottom of said second inlet 22 is connected to at least a first channel 31 and to at least a second channel 32 so as to allow the mixture of said at least one type of bacteriophage and of said sample to migrate to outlet 23.
  • the second inlet 22 comprises a substantially frustoconical shape with an internal diameter between 0.1 and 5 mm, preferably between 0.4 and 0.6 mm.
  • the upper opening of the second entrance 22 is advantageously circular.
  • the depth of the first inlet 21 is preferably between 2 and 4 mm.
  • the microfluidic device 1 comprises a plurality of second inputs 22.
  • a second input 22 is intended to remain empty and to be used blank.
  • Each of the other second inputs 22 is intended to receive or be filled with a different specific bacteriophage.
  • the microfluidic device 1 comprises at least 8 second inputs 22. More preferably, the microfluidic device 1 comprises between 8 and 12 second inputs 22, each second input 22 being intended to receive or to be filled with a different type bacteriophage.
  • the second inputs 22 of the microfluidic device 1 according to the invention are pre-filled with a plurality of different bacteriophages.
  • the microfluidic device comprises a plurality of second inputs 22.
  • One of these second inputs 22 remains empty and runs blank.
  • Each of the other second inputs 22 includes a different specific bacteriophage.
  • bacteriophages are chosen according to the type of bacteria included in the sample.
  • the microfluidic device according to this embodiment is disposable and is advantageously intended for a single use.
  • the second different input 22 of the microfluidic device 1 contains phages reactive to a specific species of bacteria contained in the sample.
  • a microfluidic device 1 according to this embodiment can comprise phages against Staphylococcus aureus
  • a second microfluidic device 1 can comprise phages against Pseudomonas
  • another microfluidic device 1 can comprise phages against Klebsiella, etc.
  • the sample is obtained from a mammalian subject, preferably a human subject who is suspected of being infected with bacteria.
  • the sample may also include a cell, tissue, biopsy, secretion, exudate, fluid or gastric contents; for example, the sample may include blood, lymph, urine, skin scratch from a swab, serum, surface wash, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, sputum , stool, vomit, milk, tears, sweat, or biopsied tissue.
  • the sample can be introduced directly into the first entry, or the sample can be processed in a certain way before being introduced into the first entry in order to be contacted with the bacteriophage (s).
  • the sample can be diluted with a solvent, or the number of bacteria can be grown in culture before being introduced in the first entry to come into contact with the bacteriophage (s).
  • the bacteriophages which can be used in the present microfluidic device can be any wild type bacteriophage.
  • a bacteriophage is a virus that selectively infects prokaryotes, such as bacteria. Many bacteriophages are specific to a particular genus or species of host bacteria, in particular a mycobacteriophage which infects bacteria of the genus Mycobacterium.
  • the bacteriophage is a lytic bacteriophage; a lytic bacteriophage is a bacteriophage that follows the lytic pathway at the end of the lytic cycle, rather than entering the lysogenic pathway.
  • a lytic bacteriophage undergoes viral replication leading to lysis of the cell membrane of the host bacteria, destruction of the bacteria and release of bacteriophage offspring particles capable of infecting other bacterial cells.
  • the term "bacteriophage" can be shortened to "phage”.
  • the bacteriophage is chosen from clinical use to treat an infection (phage therapy).
  • the bacteriophage is selected from phages which have proven clinically useful for treating infections caused by the specified target bacteria.
  • the bacteriophage inside the second inlet 22 can be in liquid form, in gel form, in the form of dry powder or packaged in biopolymers.
  • the bacteriophage inside the second inlet 22 is in dry form, for example a lyophilized form.
  • the phages are brought to the liquid state in the at least one second inlet 22 and then the microfluidic device is lyophilized as a whole in order to obtain dried phages.
  • the quantity of phages is determined to allow sufficient incubation, said incubation leading to degradation of the sample in the case where the phage is suitable for the infection of the particular bacteria to be tested.
  • each phage sample contains between 10 5 and 10 9 pfu.
  • each phage sample contains a concentration of at least 10 8 pfu.
  • the at least one second inlet 22 is connected to the at least one outlet 23 by a second channel 32.
  • the second channel 32 allows the mixture of sample and bacteriophage to migrate from a second inlet 22 to an outlet 23. The incubation occurring during this migration of the mixture makes it possible to text the bacteriophage as regards its capacity to infect bacteria contained in the sample.
  • Said second channel 32 is connected to the bottom of the second inlet 22 and to the outlet 23.
  • each second input 22 is connected to an output 23 by a second channel 32.
  • the shape, size and design of the second channel 32 and its internal surface are chosen to promote mixing of the sample and the bacteriophage. A plurality of sizes, shapes and designs can improve such a mix.
  • the second channels 32 may have a rectilinear shape, a curved shape, u-shaped curves, a block shape or any other shape allowing fluid distribution of the sample and phage combination.
  • Figure 1 shows some particularly effective examples.
  • At least one of the second channels 32 has a substantially tubular section.
  • Said tubular section a a diameter between 0.1 and 1.5 mm, preferably between 0.4 and 0.6 mm.
  • At least one of the second channels 32 comprises a curved shape with a tubular section and a diameter around 0.5 mm.
  • the plurality of curves of the second channel 32 promotes mixing of the sample and the bacteriophage.
  • At least one of the second channels 32 comprises a textured internal wall.
  • this internal wall may include internal asperities allowing a disturbance in the flow of the mixture during migration.
  • Said asperities can have a ribbon shape, a well shape, a D shape, a strip shape, a chevron shape or any other suitable shape allowing a disturbance of flow of the mixture during migration.
  • At least one of the second channels 32 comprises a rectilinear shape with a tubular section having a diameter of around 1.20 mm, said second channel 32 comprising internal asperities with a herringbone pattern.
  • At least one of the second channels 32 splits into two sections, said two sections joining in a single section downstream of the channel so that said second channel 32 alternately comprises one and two sections.
  • Said sections have a diameter of around 0.6 mm and include internal asperities with a pattern of bands, said bands being oriented obliquely towards the channel.
  • the rough edges can be spaced 0.2 mm apart.
  • each second channel 32 has the same size, the same shape and the same design.
  • the shape, size and design of the second channel 32 and its internal surface are chosen in relation to the type of bacteriophage and / or sample passing through said second channel 32.
  • the length of the second channels 32 corresponds to the migration distance, that is to say the distance over which the mixture of said at least one type of bacteriophage and of said sample migrates inside said second channel 32. This length can be chosen according to the type of bacteriophage and sample.
  • the outlet 23 is connected to the second channel 32 and receives the mixture comprising said type of bacteriophage and the sample to be tested.
  • the output 23 is configured so that said mixture can be collected in said output 23 to be further analyzed by a reading means.
  • the mixture arriving in the outlet 23 is then collected in the outlet and analyzed by a reading device.
  • the outlet 23 comprises a substantially frustoconical shape with an internal diameter between 0.1 and 5 mm, preferably between 0.4 and 0.6 mm.
  • the upper opening of outlet 23 is advantageously circular.
  • the depth of the outlet 23 is preferably between 2 and 4 mm.
  • the microfluidic device 1 advantageously comprises a plurality of second inputs 22, first channels 31, second channels 32 and outputs 23.
  • the microfluidic device 1 comprises the same number of second inputs 22, first channels 31, second channels 32 and outputs 23.
  • the overall size of the microfluidic device 1 is generally correlated to the number of second input 22, second channel 32 and output 23 sets.
  • the microfluidic device 1 preferably comprises more than one set of second inlet 22, second channel 32 and outlet 23.
  • the microfluidic device 1 comprises between 8 and 12 sets of second inlet 22, second channel 32 and outlet 23.
  • FIG. 1 is an illustration of a microfluidic device 1 according to the invention.
  • This microfluidic device 1 comprises eight second inlets 22, eight first channels 31, eight second channels 32 and eight outlets 23.
  • Two of said second channels 32 comprise a curved shape with a tubular section having a diameter around 0.5 mm.
  • Three of said second channels 32 comprise a rectilinear shape with a tubular section having a diameter of about 1.20 mm, said second channel 32 comprising internal asperities with a herringbone pattern.
  • Three of said second channels 32 split into two sections, said two sections joining in a single section downstream of the channel so that said second channel 32 alternately comprises one and two sections, said sections having a diameter of about 0.6 mm and comprising internal asperities with a striped pattern, said strips being oriented obliquely with respect to the channel.
  • the total length of the microfluidic device 1 illustrated in FIG. 1 is 90 mm. Its width is approximately 50 mm. Its thickness is approximately 4 mm. The distance between the second inlet 22 and the outlet 23 is approximately 70 mm. In the case where said second channel 32 is rectilinear, this distance corresponds to the migration distance.
  • the microfluidic device may include a different length and width, for example a length of about 140 mm and a length of about 140 mm. Larger dimensions imply a longer migration distance and a longer incubation time. These dimensions may vary depending on the type of sample and the type of bacteriophage.
  • the microfluidic device according to FIG. 1 comprises a plurality of different second channels 32.
  • the microfluidic device 1 according to the invention preferably comprises a plurality of identical second channels 32 so that the migration distance and the incubation time remain the same in all of the second channels 32.
  • microfluidic devices can be juxtaposed.
  • the microfluidic device 1 according to the invention can be made of any substantially transparent material.
  • the microfluidic device 1 can consist of poly (methyl methacrylate) (PMMA), polycarbonate (PC) or cyclic olefin copolymer (COC).
  • the material of the microfluidic device 1 is substantially transparent and makes it possible to observe the bacteria under the microscope or with any optical detector.
  • the bottom of the microfluidic device can comprise a layer of glass.
  • Said glass layer advantageously has a thickness of between 100 and 150 ⁇ m.
  • Said materials can be coated or activated with a plasma treatment so as to improve their wetting properties.
  • the sample which was introduced into the first inlet 21 of the microfluidic device 1 migrates through the first channel 31 to the second inlet 22 and the bacteriophage. Then, the sample and the bacteriophage slowly migrate through the second channel 32 and are mixed with each other. During migration, the bacteria and phages have time to interact with each other, resulting in a high number of intact bacteria when the phages are not active, or a high number of phages and no bacteria when the phages are active. This migration takes about one to two hours, but can be longer for typical phages (phage-dependent factor).
  • the mixture arrives at outlet 23. The mixture is then collected in outlet 23 and analyzed by a reading device to read the activity of the bacteria contained in the mixture.
  • the invention also relates to an apparatus 100 for selecting a bacteriophage.
  • the microfluidic device 1 described above is intended to be integrated into the device 100.
  • the device 100 for the selection of a bacteriophage comprises:
  • microfluidic device 1 for selecting bacteriophages capable of infecting the bacteria contained in the sample as described above
  • the injection unit 110 may be any suitable means for injecting the target bacteria / sample for investigation.
  • the injection unit can be automated or manual.
  • said injection unit 110 may comprise a syringe pump.
  • the injection unit advantageously comprises a pump so as to place the sample under sufficient pressure to allow its displacement towards the first inlet 21 of the microfluidic device 1.
  • the sample can be prepared in a bottle connected to the injection unit, for example by a hose. Then the injection pump brings the sample into the first inlet 21. Then the sample migrates from the first inlet 21 to the outlet 23 thanks to the aspiration of Bernoulli.
  • the sample is therefore injected into a microfluidic device 1 as described above using the injection unit 110.
  • the apparatus 100 also includes a reading device 120 for reading the activity of bacteriophages.
  • Said reading device is connected to outlet 23 so that the mixture of sample and of a specific bacteriophage arriving in said outlet 23 is transferred to reading device 120.
  • Said reading device 120 allows the reading of the activity of the bacteria and thereby determining whether the bacteriophage is suitable for treating a particular bacterial infection.
  • the reading device 120 detects an absence of bacteria or a relatively small amount of bacteria, this means that the bacteriophage has infected the bacteria, said bacteriophage therefore being suitable for treating the particular bacterial infection. On the contrary, if the reading device 120 detects a notable presence of bacteria, this means that the bacteriophage has not infected the bacteria, said bacteriophage not being suitable for the treatment of the particular bacterial infection.
  • the reading device 120 comprises an electrochemical impedance spectroscopy (EIS).
  • EIS electrochemical impedance spectroscopy
  • the reading device 120 includes a flow cytometer.
  • the reading device 120 can include any other different solution measuring the presence or absence of bacteria.
  • the device 120 is coupled to analytical software allowing storage or other development of the results.
  • the present invention also relates to a method of selecting bacteriophages capable of infecting bacteria contained in a sample. Said method comprises:
  • Step E1 of the bacteriophage selection process consists in providing a microfluidic device 1 as described above.
  • this step consists in introducing at least one specific bacteriophage into at least one second entry 22.
  • the microfluidic device 1 comprises a plurality of second inputs 22.
  • a second input 22 is intended to remain empty and to be used blank.
  • Each of the other second inputs 22 is filled with a different specific bacteriophage.
  • the bacteriophage is chosen from phages which are clinically usable for treating an infection.
  • the bacteriophage is used in a dry form, for example in a lyophilized form.
  • the drying of the bacteriophage can be carried out in any conventional manner before being introduced into the second entry.
  • the phages are brought into the liquid phase into the at least one second inlet 22, then the microfluidic device is lyophilized as a whole in order to obtain dried phages.
  • each phage sample contains a concentration of at least 10 8 pfu.
  • the microfluidic device 1 already comprises bacteriophages inside the second inlets 22.
  • Said phages can be in the form of a liquid or gel or packaged in biopolymers. In such a case, it is not necessary to introduce phages within said second inputs 22.
  • the step E2 of introducing the test sample into the first entry 21 can be carried out by any suitable means for injecting the target bacteria / sample for investigation.
  • the introduction of the sample can be automated or manual.
  • the sample can be introduced by means of a syringe pump.
  • the sample will be drawn into a syringe which would then be placed in a pump to slowly bring the sample precisely to its place.
  • the sample can be introduced into the first inlet 21 with a micropipette or an Eppendorf pipette.
  • the sample can be pretreated before its introduction into the first inlet 21.
  • said sample can be diluted in a phosphate buffered saline solution (PBS) before being introduced into the first inlet 21.
  • Step E3 of bringing said sample into contact and incubation with each of the specific bacteriophages is carried out via the microfluidic device 1.
  • the fluid with the bacteria
  • the sample comes into contact with the at least one bacteriophage contained in the second input 22.
  • the mixture of said at least one type of bacteriophage and of said sample then migrates through the second channels 32 of the microfluidic device 1. Incubation occurs during this migration.
  • the incubation time is typically 1 to 2 hours apart for certain phages which require a longer reaction time. All the channels flow advantageously at the same speed.
  • the temperature is preferably about 36 to 38 ° C and is set by the machine.
  • Step E4 of collecting each mixture of sample and of a specific bacteriophage is carried out downstream of the microfluidic device 1. After its migration through the second channel 32, the mixture arrives at the outlet 23. Thus, said mixture is collected by a reading device 120. Said reading device 120 allows the reading of the activity of bacteria and therefore determines whether the bacteriophage is capable of infecting bacteria contained in the sample.
  • a subject is known to have a bacterial infection, or suspected of having a bacterial infection, and the method allows the identification of one or more bacteriophages which can be chosen to treat the subject.

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Abstract

Dispositif microfluidique (1) pour sélectionner des bactériophages capables d'infecter des bactéries contenues dans un échantillon, comprenant : •- une première entrée (21) destinée à recevoir l'échantillon à tester; •- au moins une seconde entrée (22) destinée à recevoir au moins un type de bactériophage, •- au moins une sortie (23) destinée à recevoir un mélange comprenant le au moins un type de bactériophage et l'échantillon à tester; ladite première entrée (21) et ladite au moins une seconde entrée (22) étant raccordées pour permettre audit échantillon de migrer vers ladite au moins une seconde entrée (22), ladite au moins une seconde entrée (22) étant raccordée à ladite sortie (23) pour permettre au mélange du au moins un type de bactériophage et dudit échantillon de migrer vers ladite sortie.

Description

Dispositif microfluidique pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon
La présente description concerne des dispositifs microfluidiques pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter des bactéries, par exemple pour sélectionner des bactériophages particuliers utilisables au plan thérapeutique pour traiter des infections bactériennes ; la présente invention concerne également des procédés faisant usage de ces dispositifs.
Des bactéries provoquant des maladies peuvent menacer la santé d’humains, d’animaux et de plantes. La tuberculose, la dysenterie, la pneumonie, la méningite, le choléra, l’anthrax, la maladie de Lyme et la brucellose sont juste un petit nombre des nombreuses maladies bactériennes qui peuvent être nocives pour les humains et les animaux.
Traditionnellement, des antibiotiques chimiques, tels que la pénicilline, la streptomycine et la céphalosporine, ont été utilisés pour traiter une variété d’infections bactériennes. Cependant, la résistance bactérienne aux antibiotiques est de plus en plus un problème en santé humaine et en santé vétérinaire. Les bactériophages offrent une alternative thérapeutique prometteuse aux antibiotiques.
La thérapie par phages ou la thérapie par phages viraux est l’utilisation thérapeutique de bactériophages pour traiter une infection bactérienne pathogène. La thérapie par phages a de nombreuses applications potentielles en médecine humaine ainsi qu’en dentisterie, en science vétérinaire et en agriculture.
Les bactériophages sont beaucoup plus spécifiques que les antibiotiques. Ils sont typiquement inoffensifs non seulement pour l’organisme hôte, mais également pour d’autres bactéries bénéfiques, telles que la flore intestinale, en réduisant les chances d’infections opportunistes. Ils ont un indice thérapeutique élevé, c’est-à-dire qu’une thérapie par phages serait censée donner lieu à peu d’effets secondaires. Du fait que les phages se répliquent in vivo, on peut utiliser une petite dose efficace.
Pour éviter la progression prolongée d’une maladie bactérienne, il est important d’identifier les bactériophages spécifiques qui conviennent au traitement d’une infection bactérienne particulière. Comme de nombreux pathogènes bactériens peuvent créer une infection sérieuse en quelques jours, ou même en quelques heures, il existe un besoin d’un procédé permettant de s’assurer rapidement si une souche particulière de bactéries est sensible à un bactériophage potentiellement thérapeutique.
Un procédé d’identification de bactériophages spécifiques est décrit dans le document WO 2004/041156, dans lequel un nombre de différents bactériophages recombinants est fourni, chaque bactériophage contenant un acide nucléique reporter capable d’être exprimé lorsque le bactériophage infecte une cellule bactérienne, lesdits bactériophages sont mis en contact avec un échantillon contaminé par une bactérie dans un récipient de laboratoire classique tel que des bouteilles, des tubes ou dans des puits individuels d’une plaque à puits multiples. Cependant, ce procédé requiert la préparation d’une bibliothèque de bactériophages recombinants et nécessite d’organiser des équipements de laboratoire.
Pour pallier l’inconvénient des procédés existants, les inventeurs ont développé un dispositif microfluidique permettant une détermination rapide et aisée de bactériophages convenant au traitement d’une infection bactérienne particulière.
La présente invention concerne donc un dispositif microfluidique pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon, comprenant :
- une première entrée destinée à recevoir l’échantillon ou la bactérie à tester ; - au moins une seconde entrée destinée à recevoir au moins un type de bactériophage,
- au moins une sortie destinée à recevoir un mélange comprenant le au moins un type de bactériophage et l’échantillon à tester ;
ladite première entrée et ladite au moins une seconde entrée étant raccordées pour permettre audit échantillon de migrer vers ladite au moins une seconde entrée, ladite au moins une seconde entrée étant raccordée à ladite sortie pour permettre au mélange dudit au moins un type de bactériophage et dudit échantillon de migrer vers ladite sortie.
Un dispositif microfluidique selon l’invention permet une identification rapide et aisée de bactériophages convenant au traitement d’une infection bactérienne particulière sans nécessiter d’équipements de laboratoire.
L’invention peut également comprendre l’une quelconque des caractéristiques suivantes prises individuellement ou dans n’importe quelle combinaison techniquement possible :
- la première entrée est raccordée à la au moins une seconde entrée par un premier canal,
- la au moins une seconde entrée est raccordée à la au moins une sortie par un second canal,
- le premier canal est un canal résistif configuré de manière à réduire le reflux,
- la sortie est configurée de sorte que ledit mélange puisse être recueilli dans ladite sortie pour être encore analysé par un moyen de lecture,
- la première entrée comprend une forme sensiblement tronconique avec un diamètre interne compris entre 1 et 5 mm, - le dispositif microfluidique comprend au moins 8 secondes entrées, de préférence entre 8 et 12, chaque seconde entrée étant destinée à recevoir un type différent de bactériophage,
- la première entrée se scinde en une pluralité de premiers canaux de sorte que ladite première entrée soit raccordée à chaque seconde entrée par un premier canal différent,
- chaque seconde entrée est raccordée à une sortie par un second canal,
- la taille, la forme et la conception du second canal sont configurées de manière à améliorer le mélange de l’échantillon et du bactériophage,
- au moins l’un des seconds canaux comprend une section sensiblement tubulaire ayant un diamètre compris entre 0,3 et 1 ,5 mm,
- au moins l’un des seconds canaux comprend une forme courbe,
- au moins l’un des seconds canaux comprend une forme rectiligne,
- au moins l’un des seconds canaux comprend des courbes en forme de u,
- au moins l’un des seconds canaux comprend une forme de bloc,
- au moins l’un des seconds canaux se scinde en deux sections, lesdites deux sections se rejoignant en une section unique en aval du second canal de sorte que ledit second canal comprenne en alternance une et deux sections,
- au moins l’un des seconds canaux comprend des aspérités internes permettant une perturbation d’écoulement du mélange au cours de la migration,
- au moins l’un des seconds canaux comprend des aspérités internes avec un motif en chevrons, - au moins l’un des seconds canaux comprend des aspérités internes avec un motif de type nervure,
- une seconde entrée est vide et fonctionne à blanc, chacune des autres secondes entrées comprenant un bactériophage.
L’invention concerne également un appareil pour sélectionner un bactériophage comprenant :
- une unité d’injection 110 pour injecter des bactéries/échantillon cible pour investigation,
- un dispositif microfluidique 1 pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter les bactéries contenues dans l’échantillon selon les revendications précédentes,
- un dispositif de lecture 120 pour lire l’activité des bactéries.
Enfin, l’invention concerne également un procédé de sélection de bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon, comprenant :
- une étape (E1 ) de fourniture un dispositif microfluidique tel que décrit ci-dessus ;
- une étape (E2) d’introduction dudit échantillon à tester dans la première entrée,
- une étape (E3) de mise en contact et d’incubation dudit échantillon avec au moins un bactériophage dans le second canal correspondant ;
- une étape (E4) de collecte du mélange d’échantillon et du bactériophage et de détection si le bactériophage est capable d’infecter des bactéries contenues dans l’échantillon.
L’invention sera mieux comprise à la lumière de la description suivante qui est seulement indicative et qui n’est pas destinée à limiter ladite invention, accompagnée des figures suivantes sur lesquelles : - la Figure 1 illustre sur une vue du dessus un dispositif microfluidique selon l’invention,
- la Fig. 2 illustre sur une vue du dessus un appareil selon l’invention.
Description détaillée
Comme illustré sur la figure 1 , l’invention concerne un dispositif microfluidique 1 pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon. Ledit dispositif microfluidique comprend :
- une première entrée 21 destinée à recevoir l’échantillon à tester ;
- au moins une seconde entrée 22 destinée à recevoir au moins un type de bactériophage,
- au moins une sortie 23 destinée à recevoir un mélange comprenant le au moins un type de bactériophage et l’échantillon à tester ;
ladite première entrée 21 et ladite au moins une seconde entrée 22 étant raccordées pour permettre audit échantillon de migrer vers ladite au moins une seconde entrée 22, ladite au moins une seconde entrée 22 étant raccordée à ladite sortie 23 pour permettre au mélange du au moins un type de bactériophage et dudit échantillon de migrer vers ladite sortie.
La première entrée 21 est destinée à recevoir l’échantillon à tester. Sa taille et sa forme sont donc adaptées pour recevoir une injection d’un échantillon contenant des bactéries. Le fond de ladite première entrée 21 est raccordé à au moins un premier canal 31 pour permettre à l’échantillon à tester de migrer vers la seconde entrée 22.
De préférence, la première entrée 21 comprend une forme sensiblement tronconique avec un diamètre interne compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,4 et 0,6 mm. L’ouverture supérieure de la première entrée 21 est avantageusement circulaire. La profondeur de la première entrée 21 est de préférence comprise entre 2 et 4 mm.
Avantageusement, la première entrée 21 est raccordée à la au moins une seconde entrée 22 par un premier canal 31.
Avantageusement, le dispositif microfluidique 1 selon l’invention comprend une pluralité de secondes entrées 22. Dans ce cas, le premier canal 31 se scinde en une pluralité de premiers canaux 31 de sorte que ladite première entrée 21 soit raccordée à chaque seconde entrée 22 par un premier canal différent 31. La même quantité d’échantillon migre vers chaque seconde entrée 22.
Le premier canal 31 permet à l’échantillon de migrer de la première entrée 21 à la ou aux secondes entrées 22. Ledit premier canal 31 est raccordé au fond de la première entrée 21 et au fond de la seconde entrée 22.
La forme et la taille du premier canal 31 sont choisies de manière à empêcher le mélange d’échantillon et de bactériophage de refluer vers la première entrée 21.
Avantageusement, les premiers canaux 31 sont des canaux résistifs configurés pour réduire le reflux.
Dans le cas où le dispositif microfluidique 1 de l’invention comprend plusieurs secondes entrées 22, la première entrée 21 est raccordée à chacune des secondes entrées 22 par un premier canal qui se scinde en une pluralité de premiers canaux 31. La même quantité d’échantillon migre vers chaque seconde entrée 22.
Avantageusement, au moins l’un des premiers canaux 31 présente une section sensiblement tubulaire. Ladite section tubulaire a un diamètre compris entre 0,05 et 0,3 mm, de préférence entre 0,1 et 0,2 mm.
De préférence, au moins l’un des premiers canaux 31 a une forme rectiligne. La seconde entrée 22 est destinée à recevoir ou à être remplie d’un bactériophage spécifique qui est mis en contact avec l’échantillon contenant des bactéries pour tester sa capacité d’infection desdites bactéries.
La taille et la forme de la seconde entrée 22 sont adaptées pour recevoir une injection d’un bactériophage. Le fond de ladite seconde entrée 22 est raccordé à au moins un premier canal 31 et à au moins un second canal 32 de manière à permettre au mélange dudit au moins un type de bactériophage et dudit échantillon de migrer vers la sortie 23.
De préférence, la seconde entrée 22 comprend une forme sensiblement tronconique avec un diamètre interne compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,4 et 0,6 mm. L’ouverture supérieure de la seconde entrée 22 est avantageusement circulaire. La profondeur de la première entrée 21 est de préférence comprise entre 2 et 4 mm.
Avantageusement, le dispositif microfluidique 1 comprend une pluralité de secondes entrées 22. Dans un tel cas, une seconde entrée 22 est destinée à rester vide et à être utilisée à blanc. Chacune des autres secondes entrées 22 est destinée à recevoir ou à être remplie d’un bactériophage spécifique différent.
De préférence, le dispositif microfluidique 1 comprend au moins 8 secondes entrées 22. De manière plus préférée, le dispositif microfluidique 1 comprend entre 8 et 12 secondes entrées 22, chaque seconde entrée 22 étant destinée à recevoir ou à être remplie d’un type différent de bactériophage.
Selon un mode de réalisation, les secondes entrées 22 du dispositif microfluidique 1 selon l’invention sont préremplies d’une pluralité de différents bactériophages.
Avantageusement, le dispositif microfluidique comprend une pluralité de secondes entrées 22. L’une de ces secondes entrées 22 reste vide et fonctionne à blanc. Chacune des autres secondes entrées 22 comprend un bactériophage spécifique différent.
Ces bactériophages sont choisis en fonction du type de bactéries comprises dans l’échantillon.
Le dispositif microfluidique selon ce mode de réalisation est jetable et est avantageusement destiné à un seul usage. La seconde entrée différente 22 du dispositif microfluidique 1 contient des phages réactifs à une espèce spécifique de bactéries contenues dans l’échantillon. Par exemple, un dispositif microfluidique 1 selon ce mode de réalisation peut comprendre des phages contre Staphylococcus aureus, un second dispositif microfluidique 1 peut comprendre des phages contre Pseudomonas et un autre dispositif microfluidique 1 peut comprendre des phages contre Klebsiella, etc.
L’échantillon est obtenu auprès d’un sujet mammifère, de préférence un sujet humain qui est suspecté d’être infecté par des bactéries.
En plus d’une suspension bactérienne, l’échantillon peut également comprendre une cellule, un tissu, une biopsie, une sécrétion, un exsudât, un fluide ou un contenu gastrique ; par exemple, l’échantillon peut comprendre du sang, de la lymphe, de l’urine, une éraflure de peau d’un écouvillon, du sérum, un lavage de surface, un plasma, un fluide cérébrospinal, de la salive, un crachat, des selles, une vomissure, du lait, des larmes, de la sueur ou un tissu biopsié.
L’échantillon peut être directement introduit dans la première entrée, ou l’échantillon peut être traité d’une certaine manière avant d’être introduit dans la première entrée afin d’être mis en contact avec le ou les bactériophages.
Par exemple, l’échantillon peut être dilué avec un solvant, ou le nombre de bactéries peut être développé en culture avant d’être introduit dans la première entrée pour venir au contact avec le ou les bactériophages.
Les bactériophages qui peuvent être utilisés dans le présent dispositif microfluidique peuvent être n’importe quel bactériophage de type sauvage.
Un bactériophage est un virus qui infecte sélectivement des procaryotes, tels que des bactéries. De nombreux bactériophages sont spécifiques à un genre ou une espèce particulière de bactéries hôtes, notamment un mycobactériophage qui infecte des bactéries du genre Mycobacterium.
Le bactériophage est un bactériophage lytique ; un bactériophage lytique est un bactériophage qui suit la voie lytique lors de l’achèvement du cycle lytique, plutôt que d’entrer dans la voie lysogénique. Un bactériophage lytique subit une réplication virale menant à la lyse de la membrane cellulaire de la bactérie hôte, à la destruction de la bactérie et à la libération de particules bactériophages de progéniture capables d’infecter d’autres cellules bactériennes. Le terme « bactériophage » peut être raccourci en « phage ». De préférence, le bactériophage est choisi parmi un usage clinique pour traiter une infection (thérapie par les phages). En particulier, le bactériophage est sélectionné parmi des phages qui se sont révélés cliniquement utiles pour traiter des infections provoquées par les bactéries cibles spécifiées.
Le bactériophage à l’intérieur de la seconde entrée 22 peut se présenter sous forme liquide, sous forme de gel, sous forme de poudre sèche ou conditionné dans des biopolymères.
De préférence, le bactériophage à l’intérieur de la seconde entrée 22 est sous forme sèche, par exemple une forme lyophilisée. En variante, les phages sont amenés à l’état liquide dans la au moins une seconde entrée 22 et ensuite le dispositif microfluidique est lyophilisé dans son ensemble afin d’obtenir des phages séchés. La quantité de phages est déterminée pour permettre une incubation suffisante, ladite incubation menant à une dégradation de l’échantillon dans le cas où le phage convient à l’infection des bactéries particulières à tester. De préférence, chaque échantillon de phage contient entre 105 et 109 pfu. Avantageusement, chaque échantillon de phage contient une concentration d’au moins 108 pfu.
Avantageusement, la au moins une seconde entrée 22 est raccordée à la au moins une sortie 23 par un second canal 32. Le second canal 32 permet au mélange d’échantillon et de bactériophage de migrer d’une seconde entrée 22 à une sortie 23. L’incubation se produisant au cours de cette migration du mélange permet de texter le bactériophage quant à sa capacité à infecter des bactéries contenues dans l’échantillon. Ledit second canal 32 est raccordé au fond de la seconde entrée 22 et à la sortie 23.
Dans le cas où le dispositif microfluidique 1 contient plusieurs secondes entrées 22, chaque seconde entrée 22 est raccordée à une sortie 23 par un second canal 32.
La forme, la taille et la conception du second canal 32 et de sa surface interne sont choisies pour promouvoir le mélange de l’échantillon et du bactériophage. Une pluralité de tailles, de formes et de conceptions peut améliorer un tel mélange. En particulier, les seconds canaux 32 peuvent avoir une forme rectiligne, une forme courbe, des courbes en forme de u, une forme de bloc ou toute autre forme permettant une distribution de fluide de la combinaison d’échantillon et de phage.
La figure 1 montre certains exemples particulièrement efficaces.
Avantageusement, au moins l’un des seconds canaux 32 présente une section sensiblement tubulaire. Ladite section tubulaire a un diamètre compris entre 0,1 et 1 ,5 mm, de préférence entre 0,4 et 0,6 mm.
De préférence, au moins l’un des seconds canaux 32 comprend une forme courbe avec une section tubulaire et un diamètre aux environs de 0,5 mm. La pluralité de courbes du second canal 32 favorise le mélange de l’échantillon et du bactériophage.
Avantageusement, au moins l’un des seconds canaux 32 comprend une paroi interne texturisée. En particulier, cette paroi interne peut comprendre des aspérités internes permettant une perturbation d’écoulement du mélange au cours de la migration. Lesdites aspérités peuvent avoir une forme de ruban, une forme de puits, une forme de D, une forme de bande, une forme de chevron ou n’importe quelle autre forme appropriée permettant une perturbation d’écoulement du mélange au cours de la migration.
De préférence, au moins l’un des seconds canaux 32 comprend une forme rectiligne avec une section tubulaire ayant un diamètre aux environs de 1 ,20 mm, ledit second canal 32 comprenant des aspérités internes avec un motif en chevrons.
Avantageusement, au moins l’un des seconds canaux 32 se scinde en deux sections, lesdites deux sections se rejoignant en une seule section en aval du canal de sorte que ledit second canal 32 comprenne en alternance une et deux sections. Lesdites sections ont un diamètre aux environs de 0,6 mm et comprennent des aspérités internes avec un motif de bandes, lesdites bandes étant orientées en oblique vis- à-vis du canal. Les aspérités en bandes peuvent être espacées l’une de l’autre de 0,2 mm.
N’importe quelle autre forme, taille et conception du second canal et de sa surface interne qui favorise le mélange de l’échantillon et du bactériophage reste compatible avec le dispositif microfluidique 1 selon l’invention. Avantageusement, dans le cas où le dispositif microfluidique 1 comprend plusieurs secondes entrées 22 et plusieurs seconds canaux 32, chaque second canal 32 a la même taille, la même forme et la même conception.
La forme, la taille et la conception du second canal 32 et de sa surface interne sont choisies par rapport au type de bactériophage et/ou d’échantillon passant à travers ledit second canal 32.
La longueur des seconds canaux 32 correspond à la distance de migration, c’est-à-dire à la distance au cours de laquelle le mélange dudit au moins un type de bactériophage et dudit échantillon migre à l’intérieur dudit second canal 32. Cette longueur peut être choisie selon le type de bactériophage et d’échantillon.
La sortie 23 est raccordée au second canal 32 et reçoit le mélange comprenant ledit type de bactériophage et l’échantillon à tester.
Avantageusement, la sortie 23 est configurée de sorte que ledit mélange puisse être recueilli dans ladite sortie 23 pour être encore analysé par un moyen de lecture. Ainsi, le mélange arrivant dans la sortie 23 est ensuite recueilli dans la sortie et analysé par un dispositif de lecture.
De préférence, la sortie 23 comprend une forme sensiblement tronconique avec un diamètre interne compris entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,4 et 0,6 mm. L’ouverture supérieure de la sortie 23 est avantageusement circulaire. La profondeur de la sortie 23 est de préférence comprise entre 2 et 4 mm.
Le dispositif microfluidique 1 selon l’invention comprend avantageusement une pluralité de secondes entrées 22, de premiers canaux 31 , de seconds canaux 32 et de sorties 23. Dans ce cas, le dispositif microfluidique 1 comprend le même nombre de secondes entrées 22, de premiers canaux 31 , de seconds canaux 32 et de sorties 23. La taille globale du dispositif microfluidique 1 est généralement corrélée au nombre d’ensembles de seconde entrée 22, de second canal 32 et de sortie 23.
Le dispositif microfluidique 1 selon l’invention comprend de préférence plus d’un ensemble de seconde entrée 22, de second canal 32 et de sortie 23.
De manière plus préférée, le dispositif microfluidique 1 selon l’invention comprend entre 8 et 12 ensembles de seconde entrée 22, de second canal 32 et de sortie 23.
La figure 1 est une illustration d’un dispositif microfluidique 1 selon l’invention. Ce dispositif microfluidique 1 comprend huit secondes entrées 22, huit premiers canaux 31 , huit seconds canaux 32 et huit sorties 23. Deux desdits seconds canaux 32 comprennent une forme incurvée avec une section tubulaire ayant un diamètre autour de 0,5 mm. Trois desdits seconds canaux 32 comprennent une forme rectiligne avec une section tubulaire ayant un diamètre d’environ 1 ,20 mm, ledit second canal 32 comprenant des aspérités internes avec un motif en chevrons. Trois desdits seconds canaux 32 se scindent en deux sections, lesdites deux sections se rejoignant dans une seule section en aval du canal de sorte que ledit second canal 32 comprenne en alternance une et deux sections, lesdites sections ayant un diamètre d’environ 0,6 mm et comprenant des aspérités internes avec un motif en bandes, lesdites bandes étant orientées en oblique vis-à-vis du canal.
La longueur totale du dispositif microfluidique 1 illustré sur la figure 1 est de 90 mm. Sa largeur est d’environ 50 mm. Son épaisseur est d’environ 4 mm. La distance entre la seconde entrée 22 et la sortie 23 est d’environ 70 mm. Dans le cas où ledit second canal 32 est rectiligne, cette distance correspond à la distance de migration.
Le dispositif microfluidique peut comprendre une longueur et une largeur différentes, par exemple une longueur d’environ 140 mm et une longueur d’environ 140 mm. Des dimensions plus grandes impliquent une distance de migration plus longue et un temps d’incubation plus long. Ces dimensions peuvent varier selon le type d’échantillon et le type de bactériophage.
Le dispositif microfluidique selon la figure 1 comprend une pluralité de différents seconds canaux 32. Cependant, le dispositif microfluidique 1 selon l’invention comprend de préférence une pluralité de seconds canaux identiques 32 de sorte que la distance de migration et le temps d’incubation restent les mêmes dans tous les seconds canaux 32.
Si nécessaire, plusieurs dispositifs microfluidiques peuvent être juxtaposés.
Le dispositif microfluidique 1 selon l’invention peut être fabriqué en un matériau sensiblement transparent quelconque. Avantageusement, le dispositif microfluidique 1 peut être constitué de poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA), de polycarbonate (PC) ou de copolymère d’oléfine cyclique (COC).
Le matériau du dispositif microfluidique 1 est sensiblement transparent et permet d’observer les bactéries au microscope ou avec n’importe quel détecteur optique.
Selon un mode de réalisation, le fond du dispositif microfluidique peut comprendre une couche de verre. Ladite couche de verre a avantageusement une épaisseur comprise entre 100 et 150 pm.
Lesdits matériaux peuvent être revêtus ou activés avec un traitement au plasma de manière à améliorer leurs propriétés mouillantes.
En service, l’échantillon qui a été introduit dans la première entrée 21 du dispositif microfluidique 1 migre à travers le premier canal 31 vers la seconde entrée 22 et le bactériophage. Ensuite, l’échantillon et le bactériophage migrent lentement à travers le second canal 32 et sont mélangés l’un à l’autre. Au cours de la migration, la bactérie et les phages ont le temps d’interagir mutuellement, ce qui entraîne un nombre élevé de bactéries intactes lorsque les phages ne sont pas actifs, ou un nombre élevé de phages et aucune bactérie lorsque les phages sont actifs. Cette migration prend environ une à deux heures, mais peut être plus longue pour des phages typiques (facteur dépendant du phage). À la fin du second canal 32, le mélange arrive à la sortie 23. Le mélange est ensuite recueilli dans la sortie 23 et analysé par un dispositif de lecture pour lire l’activité des bactéries contenues dans le mélange.
Comme illustré sur la figure 2, l’invention concerne également un appareil 100 pour sélectionner un bactériophage. Le dispositif microfluidique 1 décrit ci-dessus est destiné à être intégré à l’appareil 100. L’appareil 100 pour la sélection d’un bactériophage comprend :
- une unité d’injection 110 pour injecter des bactéries/échantillon cibles pour investigation,
- un dispositif microfluidique 1 pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter les bactéries contenues dans l’échantillon comme décrit ci-dessus,
- un dispositif de lecture 120 pour lire l’activité des bactéries.
L’unité d’injection 110 peut être n’importe quel moyen approprié pour injecter les bactéries/échantillon cibles pour investigation. L’unité d’injection peut être automatisée ou manuelle. En particulier, ladite unité d’injection 110 peut comprendre une pompe à seringue. L’unité d’injection comprend avantageusement une pompe de manière à placer l’échantillon sous une pression suffisante pour permettre son déplacement vers la première entrée 21 du dispositif microfluidique 1. En service, l’échantillon peut être préparé dans un flacon raccordé à l’unité d’injection, par exemple par un tuyau. Ensuite, la pompe d’injection amène l’échantillon dans la première entrée 21. Puis l’échantillon migre de la première entrée 21 à la sortie 23 grâce à l’aspiration de Bernoulli.
L’échantillon est donc injecté dans un dispositif microfluidique 1 comme décrit ci-dessus grâce à l’unité d’injection 110.
L’appareil 100 comprend également un dispositif de lecture 120 pour lire l’activité des bactériophages. Ledit dispositif de lecture est raccordé à la sortie 23 de sorte que le mélange d’échantillon et d’un bactériophage spécifique arrivant dans ladite sortie 23 soit transféré au dispositif de lecture 120. Ledit dispositif de lecture 120 permet la lecture de l’activité des bactéries et le fait de déterminer ainsi si le bactériophage convient pour traiter une infection bactérienne particulière.
Si le dispositif de lecture 120 détecte une absence de bactéries ou une quantité relativement faible de bactéries, cela signifie que le bactériophage a infecté les bactéries, ledit bactériophage étant donc approprié pour traiter l’infection bactérienne particulière. Au contraire, si le dispositif de lecture 120 détecte une présence notable de bactéries, cela signifie que le bactériophage n’a pas infecté les bactéries, ledit bactériophage ne convenant pas au traitement de l’infection bactérienne particulière.
Avantageusement, le dispositif de lecture 120 comprend une spectroscopie à impédance électrochimique (EIS).
En variante, le dispositif de lecture 120 comprend un cytomètre en flux. Le dispositif de lecture 120 peut comprendre n’importe quelle autre solution différente mesurant une présence ou absence bactérienne.
De préférence, le dispositif 120 est couplé à un logiciel analytique permettant un stockage ou un autre développement des résultats. La présente invention concerne également un procédé de sélection de bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon. Ledit procédé comprend :
- une étape (E1 ) de fourniture d’un dispositif microfluidique comme décrit ci-dessus ;
- une étape (E2) d’introduction dudit échantillon à tester dans la première entrée ;
- une étape (E3) de mise en contact et d’incubation dudit échantillon avec au moins un bactériophage dans le second canal correspondant ;
- une étape (E4) de recueil du mélange d’échantillon et du bactériophage et de détection pour voir si le bactériophage est capable d’infecter des bactéries contenues dans l’échantillon.
L’étape E1 du procédé de sélection de bactériophages consiste à fournir un dispositif microfluidique 1 comme décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, cette étape consiste à introduire au moins un bactériophage spécifique dans au moins une seconde entrée 22.
Avantageusement, le dispositif microfluidique 1 comprend une pluralité de secondes entrées 22. Dans ce cas, une seconde entrée 22 est destinée à rester vide et à être utilisée à blanc. Chacune des autres secondes entrées 22 est remplie d’un bactériophage spécifique différent.
Avantageusement, le bactériophage est choisi parmi des phages cliniquement utilisables pour traiter une infection.
De préférence, le bactériophage est utilisé sous une forme sèche, par exemple sous une forme lyophilisée. Le séchage du bactériophage peut être effectué de n’importe quelle manière classique avant d’être introduit dans la seconde entrée. En variante, les phages sont amenés en phase liquide dans la au moins une seconde entrée 22, puis le dispositif microfluidique est lyophilisé dans son ensemble afin d’obtenir des phages séchés.
La quantité de phages est déterminée de manière à permettre une incubation suffisante, ladite incubation menant à une dégradation de l’échantillon dans le cas où le phage convient au traitement de l’infection bactérienne particulière. Avantageusement, chaque échantillon de phage contient une concentration d’au moins 108 pfu.
Selon un autre mode de réalisation, le dispositif microfluidique 1 comprend déjà des bactériophages à l’intérieur des secondes entrées 22. Lesdits phages peuvent être sous forme de liquide ou de gel ou conditionnés dans des biopolymères. Dans un tel cas, il n’est pas nécessaire d’introduire des phages au sein desdites secondes entrées 22.
L’étape E2 d’introduction de l’échantillon à tester dans la première entrée 21 peut être réalisée par n’importe quel moyen approprié pour injecter les bactéries/échantillon cibles pour investigation.
L’introduction de l’échantillon peut être automatisée ou manuelle. En particulier, l’échantillon peut être introduit au moyen d’une pompe à seringue. Dans ce cas, l’échantillon sera aspiré dans une seringue qui serait alors placée dans une pompe pour amener lentement l’échantillon de manière précise à sa place. En variante, l’échantillon peut être introduit dans la première entrée 21 avec une micropipette ou une pipette d’Eppendorf.
Avantageusement, l’échantillon peut être prétraité avant son introduction dans la première entrée 21. En particulier, ledit échantillon peut être dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant d’être introduit dans la première entrée 21. L’étape E3 de mise en contact et d’incubation dudit échantillon avec chacun des bactériophages spécifiques est réalisée via le dispositif microfluidique 1. Une fois que l’échantillon avantageusement dissous dans du PBS est introduit dans la première entrée 21 du dispositif microfluidique 1 , le fluide (avec les bactéries) est automatiquement aspiré au moyen d’une aspiration de Bernoulli vers les secondes entrées 22. À ce niveau, l’échantillon entre en contact avec le au moins un bactériophage contenu dans la seconde entrée 22. Le mélange dudit au moins un type de bactériophage et dudit échantillon migre ensuite à travers les seconds canaux 32 du dispositif microfluidique 1. L’incubation se produit au cours de cette migration.
Avantageusement, le temps d’incubation est typiquement de 1 à 2 heures à part pour certains phages qui nécessitent un temps de réaction plus long. Tous les canaux s’écoulent avantageusement à la même vitesse. La température est de préférence d’environ 36 à 38 °C et est établie par la machine.
L’étape E4 de recueil de chaque mélange d’échantillon et d’un bactériophage spécifique est réalisée en aval du dispositif microfluidique 1. Après sa migration à travers le second canal 32, le mélange arrive à la sortie 23. Ainsi, ledit mélange est recueilli par un dispositif de lecture 120. Ledit dispositif de lecture 120 permet la lecture de l’activité des bactéries et détermine donc si le bactériophage est capable d’infecter des bactéries contenues dans l’échantillon.
Dans un mode de réalisation spécifique, un sujet est connu pour avoir une infection bactérienne, ou suspecté d’avoir une infection bactérienne, et le procédé permet l’identification d’un ou plusieurs bactériophages qui peuvent être choisis pour traiter le sujet.

Claims

Revendications
1. Dispositif microfluidique (1 ) pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon, comprenant :
- une première entrée (21 ) destinée à recevoir l’échantillon à tester ;
- au moins une seconde entrée (22) destinée à recevoir au moins un type de bactériophage,
- au moins une sortie (23) destinée à recevoir un mélange comprenant le au moins un type de bactériophage et l’échantillon à tester ;
ladite première entrée (21 ) et ladite au moins une seconde entrée (22) étant raccordées pour permettre audit échantillon de migrer vers ladite au moins une seconde entrée (22), ladite au moins une seconde entrée (22) étant raccordée à ladite sortie (23) pour permettre au mélange du au moins un type de bactériophage et dudit échantillon de migrer vers ladite sortie.
2. Dispositif microfluidique (1 ) selon la revendication 1 , dans lequel la première entrée (21 ) est raccordée à la au moins une seconde entrée (22) par un premier canal (31 ), ladite au moins une seconde entrée (22) étant raccordée à la au moins une sortie (23) par un second canal (32).
3. Dispositif microfluidique (1 ) selon la revendication 2, dans lequel le premier canal (31 ) est un canal résistif configuré de manière à réduire le reflux.
4. Dispositif microfluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite sortie (23) est configurée de sorte que ledit mélange puisse être recueilli dans ladite sortie (23) pour être encore analysé par un moyen de lecture.
5. Dispositif microfluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la première entrée (21 ) comprend une forme sensiblement tronconique avec un diamètre interne compris entre 1 et 5 mm.
6. Dispositif microfluidique (1 ) selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif microfluidique comprend au moins 8 secondes entrées (22), de préférence entre 8 et 12, chaque seconde entrée (22) étant destinée à recevoir un type de bactériophage différent.
7. Dispositif microfluidique (1 ) selon la revendication 6, dans lequel la première entrée (21 ) se scinde en une pluralité de premiers canaux (31 ) de sorte que ladite première entrée (21 ) soit raccordée à chaque seconde entrée (22) par un premier canal différent (31 ).
8. Dispositif microfluidique (1 ) selon les revendications 6 à
7, dans lequel chaque seconde entrée (22) est raccordée à une sortie (23) par un second canal (32).
9. Dispositif microfluidique (1 ) selon les revendications 2 à
8, dans lequel la taille, la forme et la conception du second canal (32) sont configurées de manière à améliorer le mélange de l’échantillon et du bactériophage.
10. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 9, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend une section sensiblement tubulaire ayant un diamètre compris entre 0,3 et 1 ,5 mm.
11. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 10, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend une forme courbe.
12. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 10, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend une forme rectiligne.
13. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 10, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend des courbes en forme de u.
14. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 10, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend une forme de bloc.
15. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 10, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) se scinde en deux sections, lesdites deux sections se rejoignant en une seule section en aval du second canal (32) de sorte que ledit second canal (32) comprenne en alternance une et deux sections.
16. Dispositif microfluidique (1 ) selon les revendications 6 à 15, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend des aspérités internes permettant une perturbation d’écoulement du mélange au cours de la migration.
17. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 16, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend des aspérités internes avec un motif en chevrons.
18. Dispositif microfluidique selon les revendications 6 à 17, dans lequel au moins l’un des seconds canaux (32) comprend des aspérités internes avec un motif de type nervures.
19. Dispositif microfluidique 1 selon les revendications 6 à 18, dans lequel une seconde entrée (22) est vide et fonctionne à blanc, chacune des autres secondes entrées (22) comprenant un bactériophage.
20. Appareil 100 pour une sélection d’un bactériophage comprenant :
- une unité d’injection 110 pour injecter des bactéries/échantillon cibles pour investigation, - un dispositif microfluidique 1 pour sélectionner des bactériophages capables d’infecter les bactéries contenues dans l’échantillon selon les revendications précédentes,
- un dispositif de lecture 120 pour lire l’activité des bactéries.
21. Appareil 100 selon la revendication 20, dans lequel le dispositif de lecture 120 comprend une spectroscopie à impédance électrochimique (EIS).
22. Procédé de sélection de bactériophages capables d’infecter des bactéries contenues dans un échantillon, comprenant :
- une étape (E1 ) de fourniture d’un dispositif microfluidique comme décrit ci-dessus ;
- une étape (E2) d’introduction dudit échantillon à tester dans la première entrée ;
- une étape (E3) de mise en contact et d’incubation dudit échantillon avec au moins un bactériophage dans le second canal correspondant ;
- une étape (E4) de collecte du mélange d’échantillon et du bactériophage et de détection pour voir si le bactériophage est capable d’infecter des bactéries contenues dans l’échantillon.
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