FR3109160A1 - Dispositif de diagnostic portable en forme de boitier cylindrique et ses utilisations - Google Patents

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Patrick Tabeling
Pierre GARNERET
Elian MARTIN
Etienne COZ
Elodie Brient-Litzler
Jran-Claude MANUGUERRE
Jessica Vanhomwegen
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Paris Sciences et Lettres Quartier Latin
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Paris Sciences et Lettres Quartier Latin
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Abstract

TITRE : DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC PORTABLE EN FORME DE BOITIER CYLINDRIQUE ET SES UTILISATIONS La présente invention concerne un dispositif portable pour effectuer le diagnostic d'agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes, etc.) en détectant rapidement leurs acides nucléiques dans un échantillon biologique à tester. La présente invention concerne également les utilisations du dispositif de diagnostic de l’invention et les procédés qu’il permet de mettre en œuvre. Figure de l’abrégé : Fig 4

Description

DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC PORTABLE EN FORME DE BOITIER CYLINDRIQUE ET SES UTILISATIONS
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un dispositif portable pour effectuer le diagnostic d'agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes,etc.) en détectant rapidement leurs acides nucléiques dans un échantillon biologique à tester. La présente invention concerne également les utilisations du dispositif de diagnostic de l’invention et les procédés qu’il permet de mettre en œuvre.
CONTEXTE DE L’INVENTION
Les tests d'amplification des acides nucléiques (NAAT –Nuclear Acid Amplification Test) détectent, par amplification, les acides nucléiques dans l'échantillon infecté. Les NAAT ont la capacité de détecter les agents pathogènes dès les premiers jours de l'infection, c'est-à-dire bien avant le développement de la réponse immunitaire. La technique se caractérise par de grandes sensibilités (10 – 100 particules) et d'excellentes spécificités, dues à une étape d'hybridation d'amorce. En raison de ses performances, le NAAT basé sur la PCR (Polymerase Chain Reaction) est considéré, sans conteste, comme la référence dans le domaine.
Bien qu'extrêmement utile, l'inconvénient des NAAT basés sur la PCR est le coût et l'utilisation d'équipements complexes. De nombreux instruments commerciaux sont désormais disponibles dans le commerce (ThermoFisher®, Roche®, Genexpert®,etc.). Cependant, le coût de l'équipement varie de 30 k € à 200 k €. Dans un grand nombre cas, ils ont besoin de personnes hautement qualifiées, et d’espaces propres et contrôlés en température et humidité pour exécuter les tests. Un tel équipement est situé dans un nombre limité d'endroits, d'hôpitaux et de laboratoires, nécessitant, dans la plupart des cas, le transport des échantillons pour être analysés, ou le transport des patients pour atteindre ces endroits, avec des risques de contamination importants. Ainsi, le coût et la complexité du NAAT basé sur la PCR entravent la possibilité d'effectuer des quantités massives de tests, ou le limitent à des pays riches.
En France, au début de l'épidémie de COVID-19 liée au virus SARS-CoV-2, en France, quelques milliers de tests ont été effectués chaque jour, un chiffre à comparer aux dizaines de milliers de personnes infectées. Il a fallu beaucoup de temps et de ressources pour passer à 10 – 20 000 tests par jour, courant avril 2020, le nombre étant encore insuffisant. Dans le cas de de cette maladie, certains pays comme la Corée du Sud ont mis en œuvre une approche de test importante, qui, couplée à l'isolement des patients positifs, a entraîné une diminution significative de la propagation du pathogène. Cependant, le déploiement de tests massifs nécessite une logistique coûteuse et complexe, qui ne peut être facilement déployée dans les pays à revenus moyen ou modeste.
Au cours des dernières années, avec l'avènement des technologies d'amplification isotherme (Rolling Circle Amplification[RCA],Loop Mediated Amplification[LAMP],Recombinase Polymerase Amplification[RPA],etc.), qui ne nécessitent pas de thermocyclage pour amplifier les acides nucléiques, un nouveau domaine de recherche s'est ouvert, suscitant l'espoir de réaliser des NAAT sur site, en utilisant des appareils beaucoup plus simples et moins chers que les plateformes PCR. Aujourd'hui, il existe une vingtaine de techniques d'amplification isotherme (A. Niemz, T.Ferguson, D. Boyle. “Point of care nucleic acid testing for infectious diseases”, Trends in biotechnology, 29, 240, 2011.). Parmi eux, l'amplification isotherme LAMP, qui fonctionne à 65°C, doit être mise en valeur, en raison de ses performances, en termes de taux d'amplification (deux fois plus rapides que la PCR), de sensibilité et de spécificité (similaire à la PCR), ainsi que de grandes quantités d'ADNc (Acide DésoxyriboNucléique complémentaire) produites pendant la réaction, facilitant la lecture.
Récemment, ont été réalisés des NAAT basés sur RPA et LAMP, le plus souvent inspirés par les idées développées, ces dernières années, dans le domaine de la « microfluidique papier » (S. Vellaet al., “Measuring markers of liver function using a micropatterned paper device designed for blood from a fingerstick”, Analytical Chemistry, vol. 84, pp. 2883-2891, 2012 ; J. Linneset al., “Paper based molecular diagnostic for Chlamydia trachomatis,RSC Advances, vol. 4, pp. 42245-42251, 2014 ; L. Magroet al., “Paper microfluidics for nucleic acid amplification testing (NAAT) of infectious diseases”, Lab on a Chip, 14, 2347-2371, 2017 ; L. Magroet al., “Paper-based RNA detection and multiplexed analysis for Ebola virus diagnostics”, Scientific Reports 7, 1347, 2017). Sans dégradation de qualité, ces tests remplacent la technique de la PCR, en termes de simplicité, de compacité et de coûts, ce qui la rend portable, utilisable dans les cabinets médicaux. Cependant, en pratique, les types de tests existant ne permettent pas de développer ces utilisations en «Point of Care», ou « de terrain », pour différentes raisons (pas de lyophilisation des produits, pas d’extraction d’ARN, système compliqué à utiliser pour le personnel médical, instrumentalisation environnante trop complexe,etc.).
BREF APERÇU DE L’INVENTION
En réponse aux besoins sanitaires actuels (i.e.pandémie COVID-19) et futurs, les inventeurs ont développé un nouveau dispositif de diagnostic portable et facilement déployable à grande échelle permettant le diagnostic d'agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes,etc.) basé sur la détection des acides nucléiques. Ce nouveau dispositif permet de mettre en œuvre des tests rapides, fiables et sûrs, et permet également de tester un ou plusieurs échantillons. Par ailleurs, ce nouveau dispositif, qui peut être à usage unique et/ou jetable, présente l’avantage d’être peu coûteux et utilisable localement. Ainsi et grâce au dispositif de diagnostic de l’invention, les diagnostics pourraient s’effectuer chez le médecin, au service d'urgence de l'hôpital, sur le lieu de travail, dans les pharmacies ou même à domicile.
Un des premiers objets de l’invention est donc un dispositif de diagnostic portable en forme de boîtier cylindrique. Un second objet de l’invention concerne les différentes utilisations possibles du dispositif de diagnostic l’invention. Un autre objet de l’invention concerne les procédés facilement réalisables par un utilisateur, lesquels permettent le diagnostic rapide d'agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes,etc.) de manière fiable et sûre. Un autre objet de l’invention concerne également les procédés de fabrication du dispositif de diagnostic de l’invention.
LISTE DES FIGURES
Les figures suivantes illustrent l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
LaFigure 1représente une vue en perspective du dispositif de diagnostic de l’invention.
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (8) membrane ; (12) zone réactionnelle et (13a et 13b) pastilles.
LaFigure 2représente une vue de dessus schématique du dispositif de diagnostic de l’invention.
(3) disque supérieur ; (8) membrane ; (9) fenêtre et (13a et 13b) pastilles.
LaFigure 3représente une vue de dessous schématique du dispositif de diagnostic de l’invention lorsque celui-ci comprend un évidement.
(5) disque inférieur ; (6) évidement et (13a et 13b) pastilles.
LaFigure 4représente une vue en perspective éclatée du dispositif de diagnostic de l’invention illustré Figures 1, 2 et 3.
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (7) ouverture réceptrice ; (8) membrane ; (9) fenêtre ; (11) filtre optique ; (13a et 13b) pastilles et (15) matériau absorbant.
LaFigure 5représente une vue en coupe brisée verticale du dispositif de diagnostic de l’invention suivant la ligne V-V (A) de la Figure 2 (i.e.sans évidement au niveau du disque inférieur (5)) et (B) de la Figure 3 (i.e.avec évidement au niveau du disque inférieur (5)).
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (6) évidement ; (7) ouverture réceptrice ; (8) membrane ; (9) fenêtre ; (10) matériau étanche ; (11) filtres optiques ; (13b) pastille et (15) matériau absorbant.
LaFigure 6représente une vue de dessus en perspective d’une première variante de mise en œuvre du dispositif de diagnostic de l’invention permettant d’effectuer huit tests sur le même dispositif.
(2) bloc de diagnostic (triangle noir) ; (3) disque supérieur ; (4) unité de détection (arc de cercle blanc) ; (7) ouverture réceptrice et (9a et 9b) fenêtres.
LaFigure 7représente une vue de dessus en perspective d’une seconde variante de mise en œuvre du dispositif de diagnostic de l’invention permettant d’effectuer douze tests sur le même dispositif.
(3) disque supérieur ; (8) membranes ; (12a, 12b) zones réactionnelles et (13a et 13b) pastilles.
LaFigure 8représente une vue de dessous du disque supérieur du dispositif de diagnostic de l’invention, lequel comprend des éléments tridimensionnels d’aide au mouvement de rotation.
(3) disque supérieur ; (8) membranes ; (11) filtre optique ; (16) rainure ; (17) jupe et (18) glissière.
LaFigure 9représente une vue schématique des plans permettant d’imprimer le disque supérieur du dispositif de diagnostic de l’invention à l’aide d’une imprimante 3D. Les chiffres et nombres correspondent à des dimensions sont en millimètre (mm).
LaFigure 10représente une vue schématique des plans permettant d’imprimer le disque inférieur du dispositif de diagnostic de l’invention à l’aide d’une imprimante 3D. Les chiffres et nombres correspondent à des dimensions sont en millimètre (mm).
Dispositifs utilisés pour la détection d’ARN de DENV2 et de SARS-CoV-2 dans des échantillons biologiques. (a) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon contenant de l’ARN DENV2 (échantillon positif). Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre grise hachurée : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP DENV2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale. (b) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon négatif. Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre blanche : intensité de fluorescence de la pastille de réaction RT-LAMP DENV2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale. (c) image des pastilles DENV2, échantillon positif à gauche, négatif à droite. Photographie prise avec unsmartphone. (d) Dispositif pour la détection de SARS-CoV-2, échantillon contenant de l’ARN SARS-CoV-2 (échantillon positif). Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre grise hachurée : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP SARS-CoV-2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale. (e) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon négatif. Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre blanche : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP SARS-CoV-2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale. (f) images des pastilles SARS-CoV-2, échantillon positif à gauche, négatif à droite. Photographie prise avec un appareil photographique numérique.
DESCRIPTION DETAILLEE
L’invention consiste à coupler une unité d'extraction et une unité d'amplification/détection dans un dispositif portable, lequel comprend des réactifs lyophilisésin situ. Des exemples de ce dispositif et ses variantes sont illustrés sur les Figures 1 à 10.
Un premier aspect de l’invention concerne un dispositif de diagnostic portable en forme de boîtier cylindrique incluant des moyens :
  • d’extraction d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’un échantillon à tester,
  • d’amplification isotherme (e.g.(RT)-LAMP, (RT)-LAMP-QUASR [Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters]) d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester, et
  • de détection des amplicons si ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt est présente dans l’échantillon à tester.
Un premier mode de réalisation très général de l’invention suivant ce premier aspect concerne un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés,
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
  • se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
Tel que décrit, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, celle-ci se fait par une rotation inverse, laquelle permet de revenir à la position initiale plus directement, par un chemin plus court, en évitant que la fenêtre (9) d’observation s’approche du matériau absorbant (15). L’invention concerne alors le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position se fait par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position. Autrement dit, un mode de réalisation avantageux très général de l’invention concerne un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés,
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
  • revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci.
Un autre mode de réalisation très général de l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le disque inférieur (5) comprend en outre au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et
lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12).
Autrement dit, cet autre mode de réalisation général concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et
lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ;
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle (12) et l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
  • se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, cet autre mode de réalisation général concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et
lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ;
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle (12) et l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
  • revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci.
Par «un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique», on entend un dispositif sensiblement de la taille d’une main (e.g.de 4,00 cm à 20,00 cm de diamètre,i.e.de 4, de 5, de 6, de 7, de 8, de 9, de 10, de 11, de 12, de 13, de 14, de 15, de 16, de 17, de 18, de 19 ou de 20 cm) facilement préhensible et ergonomique. De par les matériaux choisis, celui-ci est peu couteux à produire. Il est également léger ce qui facilite son utilisation. De plus et de par sa taille, celui-ci est également facilement transportable d’une pièce à l’autre,e.g.d’un laboratoire ou d’un hôpital. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel les disques supérieur (3) et inférieur (5) sont dans un matériau choisi parmi : l’acide polylactique (PLA) et le polycarbonate (CO-O-pPh-C(CH3)2-pPh-O)n). En particulier, il convient de noter que les matériaux utilisées pour fabriquer ces disques peuvent être opaques ou transparents (i.e.laisse passer la lumière). Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif étant compris de 5 à 30. En particulier, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif est compris de 5 à 10, de 10 à 15, de 15 à 20, de 20 à 25, de 25 à 30, de 10 à 20 ou de 15 à 25. En particulier, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif est de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30.
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des structures tridimensionnelles qui aident au guidage des rotations du disque supérieur sur le disque inférieur etvice versa, le rendant ainsi davantage ergonomique et encore plus facile d’utilisation. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel lesdites rotations sont guidées par un système de rainure(s) (16) et d’ergot(s), également appelé(s) taquet(s).
Alternativement, le diamètre des disques supérieur (3) et inférieur (5) peuvent être différents. Le système de rainure(s) et d’ergot(s) peut alors être remplacé ou complété par un système de jupe(s) (17) et de glissière(s) (18). Selon ce mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le disque supérieur (3) est plus grand que le disque inférieur (5) ou dans lequel le disque inférieur (5) est plus grand que le disque supérieur (3). En particulier, il convient de noter que la ou les jupe(s) sont disposées sur le disque le plus grand et la ou les glissière(s) (18) sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) pour guider les rotations du dispositif. Par conséquent, selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel lesdites rotations sont guidées un système de jupe(s) (17) et de glissière(s) (18).
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des structures tridimensionnelles qui aident à l’assemblage des disques supérieur (3) et inférieur (5) l’un sur l’autre. Par exemple, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend un plot au centre du disque inférieur (5), ou du disque supérieur (3), lequel s’emboîte dans un évidement circulaire creusé (découpé) au centre du disque supérieur (3), ou du disque inférieur (5). Cela peut également être une bague (i.e.une pièce supplémentaire) sur laquelle viennent s’emboîter (se clipser) les disques supérieur (3) et inférieur (5), ladite bague comprenant des moyens permettant aux disques de tourner l’un sur l’autre (e.g.glissières, rainures, ergots ou taquets,etc.).
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des pièces, moulées ou non avec (sur) les disques, permettant l’introduction de l’échantillon biologique à tester et des réactifs (ou tampons) sans perte de liquide.
Par «échantillon biologique à tester », on entend tout type d’échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques. Il peut s’agir de manière non-exhaustive de sang, d’urine, de sueur, de salive, de sécrétions de la sphère ORL (e.g.nez, oreilles, gorge), de liquide céphalo-rachidien, de liquide lymphatique, de liquide amniotique,etc.Il peut également s’agir de frottis naso-pharyngé, de frottis cervico-vaginal,etc.L’échantillon biologique à tester peut par ailleurs provenir d’un mammifère. En particulier, celui-ci provient d’un mammifère choisi parmi : l’Homme (i.e.enfant, adulte, femme et homme), les singes, les félins, les canins, les équidés, les cervidés, les bovins, les ovins et les volailles. De préférence, il s’agit d’un prélèvement humain.
Par «acides nucléiques», on entend l’acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou l’acide ribonucléique (ARN). L’invention, de par sa configuration circulaire, permet également de façon avantageuse de réaliser l’élution des acides nucléiques, et l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologiqueau même endroitdu dispositif évitant ainsi de trop nombreuses manipulations. De même, l’invention est configurée de sorte que la fenêtre (9) équipée d’un filtre optique (11) ne puisse jamais être au droit et en contact du matériau absorbant (15), dit tampon capillaire, évitant ainsi la contamination de la zone réactionnelle (12) par les absorbants pris dans le matériau absorbant (15).
Par «séquence d’acides nucléiques d’intérêt», on entend une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome d’un pathogène (virus, bactérie, microorganisme,etc.) et dont la détection dans un échantillon biologique permet le diagnostic d’une pathologie. Il peut donc s’agir par exemple d’une séquence d’ADN contenu dans le plasmide génomique d’une bactérie (e.g. Salmonelle, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Helicobacter, etc.) ou d’une séquence d’ARN contenu dans le transcriptome de ladite bactérie. Il peut également s’agir d’une séquence d’ADN et/ou d’ARN contenu dans le génome d’un virus (e.g.SARS-CoV-2, virus de la Dengue, virus de l’immunodéficience humaine [VIH],etc.). L’invention étant un dispositif de diagnostic, celui-ci permet de tester un échantillon biologique pour savoir s’il présente, par exemple, une infection (virale, bactérienne ou à un autre microorganisme,etc.), d’où l’expression «susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique». Autrement dit, dans le contexte sanitaire actuel (i.e.pandémie COVID-19), le dispositif de diagnostic de l’invention permet de tester un patient, voire la population, pour savoir s’il présente (ou non) une infection (i.e.infection virale à SARS-CoV-2) et prendre les mesures adéquates (traitement médical, confinement,etc.). Par «séquence d’acides nucléiques d’intérêt», on entend également une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome (ADN) ou le transcriptome (ARN) d’un mammifère (e.g.l’Homme) dont la présence serait en lien avec une prédisposition à une pathologie ou au diagnostic d’une pathologie. Le dispositif de diagnostic de l’invention tel que décrit offre donc l’avantage d’être polyvalent et de s’adapter facilement au diagnostic recherché et/ou au contexte sanitaire.
Par «unité de détection», on entend l’ensemble minimal qui permet de mettre en œuvre le diagnostic d’un échantillon biologique à tester. Comme indiqué, celle-ci est pourvue :
  • d’une membrane (8) biologiquement compatible, laquelle reçoit l’échantillon biologique à tester, et laquelle permet d’extraire les acides nucléiques (ADN et/ou ARN) de l’échantillon à tester et de les retenir par affinité en présence des réactifs appropriés lorsqu’elle est au droit du matériau absorbant ;
  • d’un matériau absorbant (15), lequel recueille et stock les liquides qui passent au travers de la susdite membrane (8) ;
  • d’une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles aptes à permettre, après élution des acides nucléiques (ADN et/ou ARN) de la susdite membrane (8), l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique en présence de réactifs appropriés ;
  • d’une fenêtre (9) équipé d’un filtre optique (11) sur le disque supérieur (3) et apte à venir se positionner au droit de la zone réactionnelle (12) ; et
  • éventuellement d’un évidement (6) équipé d’un matériau étanche (10) sur le disque inférieur (5) au-dessous de la zone réactionnelle (12) et en particulier permettant à la lumière d’atteindre les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b).
Par «fenêtre», on entend une ouverture découpée dans la matière du disque supérieur (3). Toutefois et afin d’assurer l’herméticité et l’étanchéité du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la ou les fenêtres sont munies d’un filtre optique (11). Ce filtre optique peut être positionné de façon amovible (e.g.film adhésif, clapet, voletetc.) ou être intégré dans la masse du disque supérieur (3), ou même placé sur un dispositif extérieur. Par «filtre optique», on entend un dispositif qui laisse passer tout ou partie du rayonnement lumineux et qui permet d’analyser le rayon lumineux en sortie du test. Ainsi, par «filtre optique» on désigne des matériaux ayant des propriétés optiques spécifiques (e.g.passe-bande, coupe-bande, passe-haut, passe-bas), des filtres colorés (e.g.gélatines photographiques,etc.), des dispositifs tels que des cubes optiques permettant la lecture d’un signal fluorescent. Par ailleurs et dans le cadre d’un test colorimétrique ou d’un test turbidimétrique (ou tout autre méthode de visualisation d’amplification) il peut s’agir d’un filtre aidant à la lecture du test. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le filtre optique est choisi parmi : un filtre passe-bande, un filtre coupe-bande, un filtre passe-haut, un filtre passe-bas, de la gélatine photographique et un cube optique.
Par «évidement», on entend une ouverture découpée dans la matière du disque inférieur (5). Toutefois et afin d’assurer l’herméticité et l’étanchéité du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la ou les évidements sont munis d’un matériau étanche (10). Ce matériau étanche peut être positionné de façon amovible (e.g.film adhésif, clapet, voletetc.) ou être intégré dans la masse du disque inférieur (5), ou même placé sur un dispositif extérieur. Par «matériau étanche», on entend tout type de matériau plastique ou autre, imperméable et compatible avec les réactions d’amplification. Il peut être transparent et laisser passer la lumière dans le cadre d’une lecture de fluorescence par transmission. Celui-ci peut être également opaque dans le cadre d’une lecture colorimétrique ou d’une lecture de fluorescence par réflexion. L’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau étanche est choisi parmi : un filtre passe-bande, un filtre coupe-bande, un filtre passe-haut, un filtre passe-bas, de la gélatine photographique et un cube optique.
Par «matériau absorbant», également appelé tampon capillaire ou éponge absorbante, on entend un matériau qui, au moment de l’extraction des acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester au niveau de la membrane (8) en présence des réactifs [également appelés tampons] appropriés, est capable d’absorber, de contenir et de stocker les liquides qui passent au travers de la membrane (8). Celui-ci, capable de contenir un volume d’au moins 1 mL (1 cm3), peut par ailleurs être placé sur un réceptacle prévu pour l’accueillir. Ce matériau absorbant peut notamment être un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton, tout autre matériau absorbant voire il peut s’agir par exemple d’un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique classique. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est en mesure de contenir un volume d’au moins 1 mL (1 cm3). Au sens de l’invention, «au moins 1 mL» s’entend d’un volume compris de 1 mL à 2 mL ou compris de 1 mL à 1,50 mL. «Au moins 1 mL» signifie également que le volume absorbable par le matériau absorbant (15) est de 1 mL; 1,10 mL ; 1,15 mL ; 1,20 mL ; 1,25 mL ; 1,30 mL ; 1,35 mL ; 1,40 mL ; 1,45 mL ; 1,50 mL ; 1,55 mL ; 1,60 mL ; 1,65 mL ; 1,70 mL ; 1,75 mL ; 1, 80 mL ; 1,85 mL ; 1,90 mL ; 1,95 mL ou de 2,00 mL. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier, et ledit matériau absorbant (15) est de préférence en mesure de contenir un volume d’au moins 1 mL. En particulier, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique.
Par «membrane biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques … en présence de réactifs appropriés», également appelée membrane de capture, on entend une membrane capable de recevoir un échantillon biologique à tester, de supporter l’ajout de réactifs (ou tampons) permettant l’extraction des acides nucléiques (ADN et/ou ARN) contenus dans ledit échantillon et de disposer de propriétés physico-chimiques capables de retenir (e.g.par affinité) les acides nucléiques extraits avant leur élution. Cette membrane peut notamment être en cellulose, en silice, en fibre de verre, ou en tout autre matériau poreux permettant la rétention physico-chimique des acides nucléiques. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre.
Par «pastilles biologiquement compatibles … aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt … en présence de réactifs appropriés», on entend des pastilles faites dans un matériau capable de recueillir les acides nucléiques (ADN et/ou ARN) extraits de l’échantillon biologique à tester après leur élution de la membrane (8). Ce matériau, perméable à la lumière, permet également, en présence des réactifs appropriés (e.g.amorces, fluorophores, enzymes, dNTPs [désoxyribonucléoside triphosphate quelconques],etc.), de supporter et d’assurer l’amplification puis la détection visuelle (fluorescence, colorimétrie,etc.) d’au moins une séquence d’acides nucléiques susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. Ces pastilles peuvent notamment être en fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant), en cellulose, ou en tout autre matériau poreux biocompatible ou rendu biocompatible par un traitement préalable. A noter également que ces pastilles sont adjacentes,i.e.côte à côte, tout en étant indépendantes,i.e.qu’elles ne se touchent pas évitant ainsi des contaminations entre pastilles adjacentes. De plus, ces pastilles par unité de détection sont au moins au nombre de une, de préférence au moins au nombre de deux, c’est-à-dire qu’une unité de détection peut comprendre, une, deux, trois, quatre, cinq ou six pastilles. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel les au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles sont dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
Avantageusement, ces réactifs appropriés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) peuvent être lyophilisésin situà la surface (ou dans) les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatible de la zone réactionnelle (12). La lyophilisation étant l’un des meilleurs moyens de conserver sur le long terme l’intégrité de ces réactifs, il est possible, après avoir fabriqué le dispositif de diagnostic (1) de l’invention, d’y lyophiliser ces réactifs. Le dispositif de diagnostic (1) de l’invention peut alors être préparé à l’avance à grande échelle, stocké sur le long terme et être déployé rapidement en cas de crise sanitaire. Il peut également être immédiatement utilisé après l’étape de lyophilisation décrite ci-dessus. Avantageusement, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
Autrement dit, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et
  • éventuellement au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et
lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ;
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle et éventuellement l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
  • se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
  • un disque supérieur (3) comprenant :
  • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
  • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
  • un disque inférieur (5) comprenant :
  • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
  • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et
  • éventuellement au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et
lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ;
l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle et éventuellement l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
  • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
  • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
  • revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique,
la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci.
En particulier, ce mode de réalisation peut comprendre :
  • le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend deux pastilles, l’une (13a ou 13b) servant de pastille test et l’autre (13b ou 13a) servant de pastille contrôle négatif ; et/ou
  • le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend deux pastilles, l’une (13a ou 13b) servant de pastille test et l’autre (13b ou 13a) servant de pastille contrôle positif ; et/ou
  • le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend trois pastilles, l’une servant de pastille test et les deux autres servant de pastilles contrôle négatif et contrôle positif.
Par «pastille test», on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle est lyophiliséin situl’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. De cette manière, si un signal positif est obtenu à l’issue du test alors l’échantillon contient ladite d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt et le diagnostic est positif (sous réserve des résultats obtenus sur la ou les pastilles contrôles). Autrement dit, dans le contexte sanitaire actuel (i.e.pandémie COVID-19), si un signal positif est obtenu sur cette pastille test, le patient présente une infection au SARS-CoV-2 et les mesures adéquates (traitement médical, confinement,etc.) peuvent être prises.
Par «pastille contrôle négatif», on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé. On entend également une pastille biologiquement compatible sur laquelle un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé. De cette manière, cette pastille à l’issue du test ne peut pas révéler positivement la présence d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt. Si cela se produit, le test est invalidé et doit être refait.
Par «pastille contrôle positif», on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle sur laquelle est lyophiliséin situ:
  • l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et
  • ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
De cette manière, cette pastille à l’issue du test doit révéler positivement la présence d’une séquence d’acides nucléiques. Si cela ne se produit pas, le test est invalidé et doit être refait. Avantageusement, il convient de noter que la séquence d’acides nucléiques révélée par le biais de la pastille contrôle positif et des réactifs lyophilisésin situpeut être dissociée (différente) de ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
  • une pastille test (13a ou 13b) sur laquelle est lyophiliséin situl’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ; et
  • une pastille contrôle négatif (13b ou 13a) sur laquelle :
    • aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé ; ou
    • un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
  • une pastille test (13a ou 13b) sur laquelle est lyophiliséin situl’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ; et
  • une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophiliséin situ:
    • l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et
    • ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
  • une pastille test sur laquelle est lyophiliséin situl’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ;
  • une pastille contrôle négatif (13b ou 13a) sur laquelle :
    • aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé, ou
    • un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé ; et
  • une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophiliséin situ:
    • l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et
    • ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
De manière avantageuse, ce dernier mode de réalisation particulier permet une meilleure lecture des résultats grâce aux contrastes de couleurs qu’il est possible d’observer entre les trois pastilles. Ceci permet également de sécuriser davantage l’interprétation des résultats. Alternativement, ce mode de réalisation comprenant trois pastilles peut-être décrit comme étant le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles contiennent des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et dont l’une au moins contient également un acide nucléique d’intérêt lyophilisé apte à être amplifié par les susdits réactifs lyophilisés.
Comme évoqué précédemment, on entend par «réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique» les outils moléculaires (amorces éventuellement modifiées aux extrémités 5’ et/ou 3’) capables de s’hybrider à une séquence d’acides nucléiques d’intérêt (ADN et/ou ARN), d’amplifier celle-ci (enzymes, dNTPs) et de visuellement (fluorescence, colorimétrie,etc.) révéler sa présence. Parmi ces moyens on y retrouve de manière non exhaustive les outils moléculaires permettant de mettre en œuvre des technologies d'amplification d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) isotherme (e.g.RCA, LAMP, RPA, LAMP-QUASR,etc.) qui ne nécessitent pas de thermocyclage, A noter que l’amplification d’ARN nécessite en amont une étape de rétro-transcription (RT) de l’ARN en ADN par le biais d’enzyme particulières (i.e.retro-transcriptases virales,etc.), laquelle étape est également effectuée au niveau des pastilles (13a et 13b) et dont les outils moléculaires peuvent être également lyophilisés. Au sens de l’invention, on entend donc par «amplification» l’étape de retro-transcription d’un ARN cible (i.e.porteur de ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt) en ADN et l’étape d’amplification de cet ADN par une polymérase. Par conséquent, si ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester provient d’une séquence d’ARN (e.g.ARN génomique viral dont on cherche à détecter la présence), il est essentiel que le dispositif comprennent les moyens permettant sa rétro-transcription et son amplification, puis sa détection (e.g.RT-LAMP, RT-LAMP-QUASR,etc.).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB ; et
  • un agent intercalant.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une rétro-transcriptase ;
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB ; et
  • un agent intercalant.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB,
dont l’une au moins, à l’exception de l’amorce F3 et de l’amorce B3, est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
  • au moins un oligonucléotide complémentaire de l’amorce FIP, de l’amorce BIP, de l’amorce LoopF ou de l’amorce LoopB,
ledit oligonucléotide étant apte à se coupler de manière réversible à l’amorce dont il est le complémentaire et ledit oligonucléotide étant modifié en 3’ par un quencher.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB,
dont les amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB sont modifiés en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
  • quatre oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB,
lesdits oligonucléotides étant aptes à se coupler de manière réversible aux amorces dont ils sont le complémentaire et lesdits oligonucléotides étant modifiés en 3’ par un quencher.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une rétro-transcriptase ;
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB,
dont l’une au moins, à l’exception de l’amorce F3 et de l’amorce B3, est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
  • au moins un oligonucléotide complémentaire de l’amorce FIP, de l’amorce BIP, de l’amorce LoopF ou de l’amorce LoopB,
ledit oligonucléotide étant apte à se coupler de manière réversible à l’amorce dont il est le complémentaire et ledit oligonucléotide étant modifié en 3’ par un quencher.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
  • une rétro-transcriptase ;
  • une polymérase ;
  • des dNTPs ;
  • un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB,
dont les amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB sont modifiés en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
  • quatre oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB,
lesdits oligonucléotides étant aptes à se coupler de manière réversible aux amorces dont ils sont le complémentaire et lesdits oligonucléotides étant modifiés en 3’ par un quencher.
Parmi les réactifs lyophilisés, du MgSO4, de la Bétaïne et du Tréhalose peuvent être ajoutés et lyophilisés.
Par «rétro-transcriptase», également appelé transcriptase inverse, on entend une enzyme capable de convertir de l’ARN en ADN. Celle-ci peut être l’AMV rétrotranscriptase ou tout autre transcriptase inverse purifiées à partir d’un rétrovirus ou rétrotransposon, ou tout autre transcriptase inverse ayant subie des optimisation à type d’évolution dirigée ou autre pour en améliorer les performances. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ladite rétro-transcriptase est l’AMV rétrotranscriptase.
Par «polymérase», on entend une enzyme capable de répliquer de l’ADN en ADN. Celle-ci peut être l’enzyme polymérase Bst, l’enzyme polymérase GspSSD ou tout autre enzyme polymérase employée dans une amplification d’acide nucléique (à type de PCR ou d’amplification isotherme). En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ladite polymérase est choisi parmi : l’enzyme polymérase Bst et l’enzyme polymérase GspSSD.
Par «dNTPs», on entend le mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy guanine tri-phosphate) et dTTP (désoxy thymine tri-phosphate).
Par «un jeu d’au moins six amorces», on entend des séquences d’acides nucléiques permettant l’amplification isotherme d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. Par ailleurs, par «dont l’une au moins … est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore», on entend qu’une, deux, trois ou quatre amorces sont modifiées en 5’ par l’ajout d’un fluorophore à l’exception des amorces F3 et B3 qui eux ne sont jamais modifiés. Ces amorces modifiées en 5’ par l’ajout d’un fluorophore peuvent être également appelées sondes puisqu’elles permettent la détection du signal. De préférence, l’invention en met en œuvre quatre, modifiés en 5’, à savoir : l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB. En particulier ces au moins six amorces peuvent être :
  • les amorces de séquences SEQ ID NOs : 1 à 6 permettant de détecter une séquence d’acides nucléiques d’intérêt du virus de la Dengue de sérotype 2 (DENV2) ; ou
  • les amorces de séquences SEQ ID NOs : 7 à 12 permettant de détecter une séquence d’acides nucléiques d’intérêt du virus SARS-CoV-2 responsable du COVID-19 (Lin Yuet al.,Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO; DOI :10.1101/2020.02.20.20025874).
Par «oligonucléotide», on entend une séquence d’une dizaine de nucléotide. Par exemple un oligonucléotide de 5 à 20 nucléotides, c’est-à-dire de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucléotides. Par «oligonucléotide complémentaire», on entend un oligonucléotide qui peut se lier spécifiquement à une séquence d’acides nucléiques. En l’espèce, il s’agit d’oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB, dont l’un au moins, ou deux, ou trois et de préférence les quatre sont modifiés en 3’ par un quencher. Ce dernier est un quencher capable d’éteindre le fluorophore greffé en 5’ d’un ou des amorces FIB, BIP, LoopF et/ou LoopB. En particulier, cet au moins un et de préférence quatre oligonucléotides sont choisis parmi les séquences SEQ ID NOs : 13 à 17 dont :
  • la séquence SEQ ID NO : 13 est complémentaire de l’amorce BIP de séquence SEQ ID NO : 4 utilisé dans le diagnostic d’une infection au virus de la Dengue de sérotype 2 ; et
  • les séquences SEQ ID NOs : 14 à 17 sont respectivement les complémentaires des séquences SEQ ID NOs : 9 à 12 utilisés dans le diagnostic d’une infection au virus SARS-CoV-2.
Par «agent intercalant», on entend une molécule capable de s'intercaler de manière réversible dans l'ADN et de devenir fluorescente lorsqu’elle est dans la double hélice. Celui-ci peut être du SYBRGreen, un fluorophore de type SYTO (SYTO9, SYTO82,etc.), de l’EvaGreen, du bromure d’éthidium ou tout autre agent intercalant de l’ADN employé dans le suivi d’amplification d’acide nucléique en temps réel. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit agent intercalent est choisi parmi : le SYBRGreen, un fluorophore de type SYTO (SYTO9, SYTO82,etc.), l’EvaGreen et le bromure d’éthidium.
Par «fluorophore», également appelé fluorochrome, on entend une substance chimique ou protéique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit fluorophore est choisi parmi : les fluorophores de type Alexa Fluor (Alexa 350, Alexa 488, alexa 555, Alexa 647,etc.), les fluorophores de types Cyanine (CY3, CY3.5, CY5,etc.), les fluorophores de type FAM (fluorescein amidite), l’Isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les fluorophores de type HEX, les fluorophores de Texas Red et les fluorophore de type ATTO. De préférence, les fluorophores de type FAM et les fluorophores de Texas Red sont utilisés.
Par «quencher», également appelé désactivateur, on entend une substance chimique ou protéique capable de désactiver (d’éteindre) l’état excité d’un fluorophores. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit quencher est choisi parmi : le DabCyl, le BHQ-1, le BHQ-2, le BHQ-3, le Cy5Q, le Cy7Q, l’Iowa Black FQ, l’Iowa Black RQ, l’IRDye QC-1, l’QSY35, le QSY7, le QXL520, le QXL570, le QXL610 et le QXL680. De préférence, les quenchers Iowa Black FQ et Iowa Black RQ sont utilisés.
Il convient toutefois de noter que l’invention lorsqu’elle utilise une technologie d’amplification isotherme et de détectionviaun système fluorophore/quencher (e.g.(RT)-LAMP-QUASR), il est essentiel de choisir le bon couple. Le tableau 1 ci-après (Peng, X.et al., 2009,A nonfluorescent, broad-range quencher dye for Förster resonance energy transfer assays. Analytical biochemistry, 388(2), 220-228) permet de réaliser ce choix. Par exemple, si le fluorophore utilisé est le Texas Red alors il est préférable d’utiliser l’Iowa Black RQ.
Tableau 1.Liste des fluorophores et des quenchers spectralement compatibles (case grisée = compatible)
Tel que décrit ci-dessus, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend une seule unité de détection (4) et permet de ne tester qu’un seul échantillon biologique. Avantageusement, celui-ci peut être configuré pour accueillir différentes unités de détection réparties sur l’ensemble des disques supérieur (3) et inférieur (5). Cette configuration offre ainsi à l’utilisateur un dispositif multi-échantillons très pratique de par sa polyvalence puisque selon sa configuration celui-ci peut servir :
  • soit à partir d’un échantillon, de réaliser différents diagnostics (e.g.virus Zika,SARS-CoV-2, VIH,Salmonella,etc.) ;
  • soit à partir de plusieurs échantillons, de réaliser un seul type de diagnostic (e.g.virus Zika ou SARS-CoV-2 ou VIH ouSalmonella,etc.) ;
  • soit à partir de plusieurs échantillons, de réaliser différents diagnostics (e.g.virus Zika,SARS-CoV-2, VIH,Salmonella,etc.).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant :
  • au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, et
  • au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant :
  • au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, ou
  • au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
Avantageusement et suivant cette configuration multi-échantillons, les fenêtres (9) disposées sur le disque supérieur (3) des unités de détection disposées sur un même rayon peuvent être regroupées et n’en former qu’une. Il en est de même pour les éventuels évidements (6) disposés sur un même rayon sur le disque inférieur (5) qui peuvent n’en former qu’un. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel :
  • les fenêtres (9) disposées sur un même rayon du disque supérieur (3) sont regroupées et n’en forme qu’une, et/ou
  • les éventuels évidements (6) disposés sur un même rayon du disque inférieur (5) sont regroupés et n’en forme qu’un.
Alternativement et au regard de cette configuration multi-échantillons, l’invention peut être définie comme étant un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boite cylindrique fermée plate comprenant :
  • un disque inférieur (5) ; et
  • un disque supérieur (3),
les deux disques étant :
  • montés l’un sur l’autre et mobiles l’un par rapport à l’autre de sorte que le disque supérieur (3) est apte à effectuer un mouvement de rotation sur le disque inférieur (5) dans les deux sens de rotation possibles ; et
  • segmentés enx blocs de diagnostic(2), x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et chaque bloc de diagnostic comprenanty unités de détection(4) d’échantillons à tester, chaque unité de détection comprenant :
  • un réceptacle comprenant un matériau absorbant(15) disposé soit sur la surface supérieure du disque inférieur (5), soit intégré dans la masse de ladite surface supérieure du disque inférieur (5),
et ledit matériau absorbant (15) étant capable de contenir un volume d’au moins 1 mL ;
  • une zone réactionnelle(12) disposée dans le disque inférieur, ladite zone réactionnelle (12) comprenantau moins une de préférence au moins deux pastilles(13a et 13b) biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes sur un même cercle du disque inférieur (5) ou un même rayon du disque inférieur (5),
et dont l’une au moins comprend éventuellement à sa surface des réactifs lyophilisés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon à tester ;
  • éventuellement unévidemment(6) disposé dans le disque inférieur (5), ledit évidement (6) étant muni d’unmatériau étanche(10),
ledit évidement (6) muni d’un matériau étanche (10) étant au droit de la zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, et
ledit matériau étanche (10) étant soit positionné sur l’évidement (6) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque inférieur (5) ;
  • une ouverture réceptrice(7) disposée dans le disque supérieur (3), ladite ouverture étant :
    • positionnée sur un cercle du disque supérieur, lequel cercle est parallèle au cercle du disque inférieur (3) sur lequel est positionnée la susdite zone réactionnelle (12) ;
    • équipée d’une membrane(8) biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques de l’échantillon à tester en présence des réactifs appropriés ; et
    • apte à être positionnée au droit de la susdite zone réactionnelle et de la recouvrir en partie ou en totalité ;
et
  • une fenêtre(9) disposée dans le disque supérieur (3), ladite fenêtre (9) étant munie d’un filtre optique(11),
ladite fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) étant apte à être positionnée au droit de la zone réactionnelle (12) de l’unité de détection (4), et
ledit filtre optique (11) étant soit positionné sur la fenêtre (9) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque supérieur (3),
y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et lorsque qu’y est supérieur ou égal à 2, les différents éléments du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3) des unités de détection (4) sont respectivement adjacents et indépendants le long d’un rayon respectif du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3),
et chaque bloc de diagnostic (2) étant configuré de sorte que le disque supérieur (3) peut, par rotation d’un angle d’au moins 30°, passer :
  • d’unepremière positiondans laquelle :
    • l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) se trouve au droit du matériau absorbant (15) de ladite unité de détection (4) pour permettre l’extraction et la rétention des acides nucléiques dudit échantillon à tester ; et
    • la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4),
  • à uneseconde positiondans laquelle :
    • l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) et la recouvre en partie ou en totalité pour permettre l’élution des acides nucléiques dudit échantillon à tester en présence des réactifs appropriés, lesdits acides nucléiques par gravité se retrouvant sur lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite unité de détection (4) ; et
    • la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve décalée d’un angle d’au moins 30°,
  • puis dese positionner sur ladite première positionde sorte que la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve de nouveau au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) pour former une chambre d’amplification et de détection sensiblement hermétique et sensiblement étanche, ladite chambre permettant l’amplification et le détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boite cylindrique fermée plate tel que décrit ci-dessus comprenant :
  • un disque inférieur (5) ; et
  • un disque supérieur (3),
les deux disques étant :
  • montés l’un sur l’autre et mobiles l’un par rapport à l’autre de sorte que le disque supérieur (3) est apte à effectuer un mouvement de rotation sur le disque inférieur (5) dans les deux sens de rotation possibles ; et
  • segmentés enx blocs de diagnostic(2), x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et chaque bloc de diagnostic comprenanty unités de détection(4) d’échantillons à tester, chaque unité de détection comprenant :
  • un réceptacle comprenant un matériau absorbant(15) disposé soit sur la surface supérieure du disque inférieur (5), soit intégré dans la masse de ladite surface supérieure du disque inférieur (5),
et ledit matériau absorbant (15) étant capable de contenir un volume d’au moins 1 mL ;
  • une zone réactionnelle(12) disposée dans le disque inférieur, ladite zone réactionnelle (12) comprenantau moins une de préférence au moins deux pastilles(13a et 13b) biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes sur un même cercle du disque inférieur (5) ou un même rayon du disque inférieur (5),
et dont l’une au moins comprend éventuellement à sa surface des réactifs lyophilisés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon à tester ;
  • éventuellement unévidemment(6) disposé dans le disque inférieur (5), ledit évidement (6) étant muni d’unmatériau étanche(10),
ledit évidement (6) muni d’un matériau étanche (10) étant au droit de la zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, et
ledit matériau étanche (10) étant soit positionné sur l’évidement (6) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque inférieur (5) ;
  • une ouverture réceptrice(7) disposée dans le disque supérieur (3), ladite ouverture étant :
    • positionnée sur un cercle du disque supérieur, lequel cercle est parallèle au cercle du disque inférieur (3) sur lequel est positionnée la susdite zone réactionnelle (12) ;
    • équipée d’une membrane(8) biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques de l’échantillon à tester en présence des réactifs appropriés ; et
    • apte à être positionnée au droit de la susdite zone réactionnelle et de la recouvrir en partie ou en totalité ;
et
  • une fenêtre(9) disposée dans le disque supérieur (3), ladite fenêtre (9) étant munie d’un filtre optique(11),
ladite fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) étant apte à être positionnée au droit de la zone réactionnelle (12) de l’unité de détection (4), et
ledit filtre optique (11) étant soit positionné sur la fenêtre (9) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque supérieur (3),
y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et lorsque qu’y est supérieur ou égal à 2, les différents éléments du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3) des unités de détection (4) sont respectivement adjacents et indépendants le long d’un rayon respectif du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3),
et chaque bloc de diagnostic (2) étant configuré de sorte que le disque supérieur (3) peut, par rotation d’un angle d’au moins 30°, passer :
  • d’unepremière positiondans laquelle :
    • l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) se trouve au droit du matériau absorbant (15) de ladite unité de détection (4) pour permettre l’extraction et la rétention des acides nucléiques dudit échantillon à tester ; et
    • la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4),
  • à uneseconde positiondans laquelle :
    • l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) et la recouvre en partie ou en totalité pour permettre l’élution des acides nucléiques dudit échantillon à tester en présence des réactifs appropriés, lesdits acides nucléiques par gravité se retrouvant sur lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite unité de détection (4) ; et
    • la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve décalée d’un angle d’au moins 30°,
  • puis derevenir par rotation inverse à ladite première positionde sorte que la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve de nouveau au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) pour former une chambre d’amplification et de détection sensiblement hermétique et sensiblement étanche, ladite chambre permettant l’amplification et le détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester,
et chaque bloc de diagnostic (2) étant également configuré de sorte que la ou les fenêtres (9a et 9b) munies d’un filtre optique (11) d’une ou des unités de détection (4) d’un bloc de diagnostic (2) ne puissent pas être au droit du ou des réceptacles comprenant un matériau absorbant (15) dudit bloc de diagnostic (2) ou d’un autre bloc de diagnostic (2’) quelle que soit la position du disque supérieur (3) par rapport au disque inférieur (5).
L’ensemble des modes de réalisation étant compatibles les uns avec les autres et pouvant être combinés les uns avec les autres, ces derniers s’appliquent à cette définition alternative de l’invention. L’inverse est également vrai. De plus, l’ensemble des définitions fournies s’applique à tous les modes de réalisation décrits.
Par «x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1», on entend que x peut être égale à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. On entend également qu’x peut être compris de 1 à 10, de 1 à 5, de 2 à 10, de 4 à 8. Par «y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1», on entend qu’y peut être égale à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. On entend également qu’y peut être compris de 1 à 20, de 1 à 6, de 1 à 12, de 1 à 5, de 1 à 10, de 5 à 15 ou de 10 à 20.
Par «un angle d’au moins 30°», on entend que la rotation du disque supérieur (3) sur le disque inférieur (5) peut être de 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 85°, 90°, 95°, 100°, 105°, 110°, 115°, 120°, 125°, 130°, 135°, 140°, 145°, 150°, 155°, 160°, 165°, 170°, 175°, 180°, 185°, 195°, 200°, 205°, 210°, 215°, 220°, 225°, 230°, 235°, 240°, 245°, 250°, 255°, 260°, 265°, 270°, 275°, 280°, 285°, 295°, 300°, 305°, 310°, 315 ou de 320° voire de 360° laissant le disque supérieur (3) tourner librement (i.e.faire un tour complet) sur le disque inférieur (5) etvice versa. On entend également un angle compris de 30° à 320°. Bien entendu, il convient de noter que l’angle de rotation possible est fonction du nombre de blocs de diagnostic (2) que l’on dispose sur le dispositif de diagnostic (1) de l’invention et ce, afin que l’ensemble des blocs de diagnostic fonctionnent, de préférence, simultanément.
En particulier, selon cette alternative l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel x et y sont choisis parmi les couples :
  • x = 1 et y = 1 (correspondant à la configuration un échantillon biologique) ;
  • x = 1 et y est compris de 1 à 6 ;
  • x = 2 et y est compris de 1 à 6 ;
  • x = 3 et y est compris de 1 à 6.
Selon cette alternative, l’invention concerne avantageusement le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y fenêtres (9) munies d’un filtre optique (11) disposées sur le disque supérieur (3) n’en forme qu’une.
Selon cette alternative, l’invention concerne avantageusement le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y éventuels évidements (6) munis d’un matériau étanche (10) disposés sur le disque inférieur (5) n’en forme qu’un.
Selon cette alternative, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y fenêtres (9) munies d’un filtre optique (11) disposées sur le disque supérieur (3) n’en forme qu’une et
dont l’ensemble des y éventuels évidemment (6) munis d’un matériau étanche (10) disposés sur le disque inférieur (5) n’en forme qu’un.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant en outre des moyens, notamment :
  • au moins une pince capable de saisir ledit dispositif et d’appliquer une pression permettant de bloquer et de serrer le disque supérieur sur le disque inférieur, ladite pression assurant l’herméticité et l’étanchéité du dispositif, et
équipée d’un système chauffant apte à être positionné au droit de la ou des zones réactionnelles du dispositif évitant la création d’un gradient de température sur la ou les zones réactionnelles à chauffer.
Un second aspect de l’invention concerne l’utilisation du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus pour détecterin vitroau moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester. Cette au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’intérêt pouvant être :
  • une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome d’un pathogène (virus, bactérie, microorganisme,etc.), ou
  • une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome (ADN) ou le transcriptome (ARN) d’un mammifère (e.g.l’Homme) dont la présence serait en lien avec une prédisposition à une pathologie,
l’utilisation selon l’invention permet le diagnostic d’infections dues à un ou plusieurs pathogènes et également le diagnostic de maladies génétiques. Cette utilité et cette polyvalence du dispositif de diagnostic (1) de l’invention sont bien sûr conditionnées par les réactifs (outils moléculaires) éventuellement lyophilisés à la surface d’une ou des pastilles dites « test ». Par exemple, s’il y est lyophilisé (ou ajouté extemporanément), l’ensemble des amorces permettant la détection d’au moins une séquence d’acides nucléique du coronavirus SARS-CoV-2, l’utilisation décrite permet de diagnostiquer une infection à ce virus. De même, s’il y est lyophilisé (ou ajouté extemporanément), l’ensemble des amorces permettant la détection d’au moins une séquence d’acides nucléique du virus de la Dengue de sérotype 1, l’utilisation décrite permet de diagnostiquer une infection à ce virus.Etc.
Avantageusement, la configuration multi-échantillons permet de diagnostiquer pour un ou plusieurs échantillons biologiques à tester plusieurs types d’infections. Par exemple, dans la configuration ou x = 2 et y = 3, un bloc de diagnostic serait utilisé pour testerin vitroun premier échantillon biologique et détecterin vitros’il souffre d’une infection au virus de la grippe, au virus du COVID-19 (SARS-CoV-2) et/ou à la bactérieStaphylococcus aureus, et
le second bloc de diagnostic serait utilisé pour testerin vitroun second échantillon biologique et détecterin vitros’il souffre d’une infection au virus de la grippe, au virus du COVID-19 (SARS-CoV-2) et/ou à la bactérieStaphylococcus aureus. Cette exemple peut être généralisé à x bloc de diagnostic pour x échantillons biologiques, chacun des x blocs comprenant y unités de détection permettant de testerin vitrola présence (ou non) d’y infections virales, bactériennes ou liées à d’autres microorganismes (e.g.champignon). De la même manière, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention peut être utilisé pour testerin vitroy maladies génétiques.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecterin vitroune infection virale (e.g.VIH, virus de la Dengue, virus Zika, virus Sigma 3, SARS-CoV-2,etc.), une infection bactérienne (e.g. Salmonelle, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Helicobacter, etc.), une infection liée à un microorganisme (e.g.champignon) et/ou une maladie génétique (e.g.mucoviscidose, neurofibromatose de type 1, hémophilie, trisomie 21, myopathie,etc.). En particulier, l’invention concerne l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecterin vitroune infection virale. L’invention concerne également l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecterin vitroune infection virale et en particulier pour détecterin vitroune infection virale au SARS-CoV-2. De préférence, l’invention concerne l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecterin vitroune infection virale au SARS-Cov-2. Comme évoqué précédemment, ce mode de réalisation de l’invention est conditionné par l’utilisation, par exemple, des amorces de séquences SEQ ID NO : 7 à 12 sur la pastille test présente sur la zone réactionnelle (12).
Un autre aspect de l’invention concerne le procédé de détectionin vitrod’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus.
En particulier, l’invention concerne le procédé de détectionin vitrod’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ;
  2. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ;
  3. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ;
  4. tourner le disque supérieur (3) pour revenir à la position initiale ; et
  5. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Selon la configuration du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la susdite étape d. peut se faire soit par une rotation inverse de celle de l’étape b., soit par une rotation dans le même sens que celle de l’étape b. Avantageusement, l’invention concerne le procédé de détectionin vitrod’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ;
  2. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ;
  3. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ;
  4. tourner le disque supérieur (3) dans le sens inverse pour revenir à la position initiale ; et
  5. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Puisque le procédé ci-dessus implique l’utilisation du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, tout ce qui s’applique aux utilisations (définitions,etc.) s’applique également aux procédés.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. déposer l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ;
  2. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester au niveau de cette membrane (8) biologiquement compatible ;
  3. laver ladite membrane (8) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ;
  4. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ;
  5. sécher ladite membrane (8) biologiquement compatible de cette unité de détection (4)
  6. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ;
  7. tourner le disque supérieur (3) dans le même sens qu’à l’étape b. ou dans le sens inverse de l’étape b. pour revenir à la position initiale ;
  8. chauffer à 65°C pendant 40 min la zone réactionnelle (12) pour amplifier ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique ; et
  9. détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Que l’invention concerne les utilisations telles que décrites ci-dessus ou les procédés tels que décrits ci-dessus, l’observation d’un signal positif (e.g.émission de lumière par fluorescence, apparition d’une coloration) au niveau de la pastille test signifie que ladite au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) a été amplifiée et est présente dans l’échantillon biologique. Par exemple, s’il était voulu de testerin vitroune infection au SARS-CoV-2 chez un patient, l’observation de ce signal positif signifie que le patient est infecté par le coronavirus SARS-CoV-2 et souffre du COVID-19. A l’inverse et par exemple, s’il était voulu de testerin vitroune infection au SARS-CoV-2 chez un patient, l’inobservation d’un signal positif signifie que le patient n’est pas infecté par le coronavirus SARS-CoV-2 et ne souffre pas du COVID-19. Toutefois, pour s’assurer de la véracité de ce testin vitro, il convient de considérer également les résultats d’un contrôle positif et/ou d’un contrôle positif, lesquels peuvent être réalisés en dehors du dispositif de diagnostic (1) de l’invention. De préférence, ces contrôles sont intégrés au dispositif de diagnostic (1) de l’inventionviala pastille contrôle positif qui doit toujours révéler un signal positif et/ouviala pastille contrôle négatif qui doit toujours révéler un signal négatif (i.e.absence de fluorescence, absence de couleur). Si ce n’est pas le cas à l’issue du test, celui-ci est invalidé et dot être refait. La présence d’une seconde pastille sur la zone réactionnelle est donc préférée pour la fiabilité et la sureté du test de diagnosticin vitroque permet de mettre en œuvre le dispositif de diagnostic (1) de l’invention. Par ailleurs, il convient de noter que l’observation des signaux sur chacune des pastilles obtenus par colorimétrie, fluorométrie,etc., peut-être réalisé au moyen de l’œil humain, de caméra ou d’appareil photo classiquement utilisés en laboratoire ou en hôpital. Il peut même s’agir d’appareil photo desmartphone. De plus et selon la technologie de détection choisie, il est possible de réaliser un suivi cinétique du test (e.g.(RT)-LAMP) ou un suivi « point final » (e.g.(RT)-LAMP-QUASR).
Un autre aspect de l’invention concerne le procédé de fabrication (e.g.industriel) du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus. En particulier, l’invention concerne le procédé de fabrication du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. fabriquer (e.g.impression 3D ou injection dans un moule) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
  2. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15) et au moins un filtre optique (11) ; et
  3. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. fabriquer (e.g.impression 3D ou injection dans un moule) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
  2. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et
  3. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. fabriquer (e.g.impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
  2. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solutionRNA free;
  3. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et
  4. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. fabriquer (e.g.impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
  2. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solutionRNA free;
  3. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ;
  4. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; et
  5. lyophiliser sur au moins une pastille (13a ou 13b) des réactifs aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
Alternativement, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
  1. fabriquer (e.g.impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
  2. lyophiliser sur au moins une pastille (13a ou 13b) des réactifs aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
  3. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solutionRNA free;
  4. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et
  5. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
EXEMPLES
Les exemples suivants illustrent l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
EXEMPLE 1 – FABRICATION DU DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC PORTABLE EN FORME DE BOITIER CYLINDRIQUE DE L’INVENTION
Création des disques
(1) À l'aide du logiciel Fusion 360 licence Autodesk, ont été réalisés 2 pièces circulaires d'un diamètre de 65 mm et l'autre de 58 mm ci-après nommés respectivement disque supérieur et disque inférieur.
Sur le disque supérieur ont été reproduites les dimensions du schéma 1 présentéFigure 9.
Sur le disque inférieur ont été reproduites les dimensions de schéma 2 présentéFigure 10.
Les dimensions des schémas sont en millimètre (mm).
(2) Les pièces 3D des 2 disques ont été exportées en format STL et implémentées dans le logiciel Makerboot.
(3) L'impression avec l'imprimante Replicator 2X a été configurée avec les paramètres d'impressions suivants :
  • Température buse : 210°C
  • Température plateau : 50°C
  • Épaisseur de couche : 100 µm
  • Vitesse d'écriture : 110 mm/s
  • Remplissage : 45 %
  • Technique de remplissage : Hexagonale
(4) Les trajectoires d'impression en format 3gs ont été exportées et implémentées dans l’imprimante et l’impression a été lancée.
(5) Après 3h d'impression, les 2 disques ont été récupérés en les détachant du plateau d'impression.
Assemblage des différents éléments sur les disques
(1) Après avoir nettoyé le disque supérieur avec une solutionRNA free:
  • a été disposé un scotch double face sur les contours des 2 ouvertures (3 mm de large), la face scotchée étant la face intérieur du disque supérieur où existe la rainure de guidage ;
  • a été disposée la membrane biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques, dite membrane de capture, au niveau de l’ouverture réceptrice en forme de trou oblong, ladite membrane de capture ayant été préalablement encapsulée dans un scotch PCR perforé sur chaque face ; et
  • le bon maintien de l’ensemble a été assuré en appuyant sur les contours du trou oblong pour assurer le meilleur contact possible entre le scotch et le disque supérieur.
(2) L’opération (1) a été répétée avec le filtre optique préalablement découpé et assemblé avec une feuille PCR thermo rétractable pour la face en contact avec le disque supérieur.
(3) Après avoir nettoyé le disque inférieur avec une solutionRNA free:
  • a été disposé le matériau absorbant, dit tampon capillaire, dans le réceptacle (ou cavité) en demi-cercle ; et
  • ont été disposés les 2 pastilles d'amplification et de détection dans les logements circulaires évidés prévus à cet effet au niveau de la zone réactionnelle, lequel évidement permet en particulier à la lumière d’atteindre lesdites pastilles.
Assemblage des disques
Les deux disques supérieur et inférieur ont été assemblés en faisant attention à ce que le taquet de buté (ou ergot) soit bien dans la rainure de guidage et que le trou au centre du disque supérieur soit aligné avec le plot central du disque inférieur.
Le dispositif ainsi prêt peut être soit stocké et utilisé ultérieurement, soit directement utilisé.
Lyophilisation in situ des réactifs
En sus de la fabrication du dispositif de diagnostic de l’invention, une étape de lyophilisation des outils moléculaires permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester peut être ajoutée. Pour cela, dNTPs, enzymes, amorces,etc.sont mélangés puis adsorbés sur les pastilles. Ensuite, les pastilles de réactions sont incubées à - 20°C durant 20 minutes, puis à - 80°C durant 20 minutes, puis lyophilisées dans un lyophilisateur à une pression de 3 mbar durant une nuit (8h). Les pastilles ainsi lyophilisées peuvent alors être placées dans les logements prévus à cet effet dans le dispositif de l’invention.
EXEMPLE 2 – UTILISATIONS DU DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC DE L’INVENTION POUR DIAGNOSTIQUER UNE INFECTION AU VIRUS DE LA DENGUE ET UNE INFECTION AU CORONAVIRUS SARS-COV-2
Matériels & Méthodes
Lyophilisation des composés
Les composés suivants ont été lyophilisés dans chaque pastille (18 µL) :
  • 0,85 mM de chaque désoxyribonucléotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
  • 5 mM de MgSO4
  • 0,5 mM de Bétaïne
  • 0,2 µM de chaque amorce F3 et B3
  • 0,8 µM de chaque amorce FIP et BIP
  • 0,4 µM de chaque amorce LoopF et LoopB
  • une concentration de quencher une fois et demie supérieure à la concentration de l’amorce sonde (1,2 µM si l’amorce sonde est FIP ou BIP, 0,6 µM si l’amorce sonde est LoopF ou LoopB)
  • 7,2 unités d’enzyme polymérase GspSSD2.0
  • 0,9 unités d’enzyme rétro-transcriptase AMV-RT
  • 5 % v/v de Tréhalose, permettant la stabilité du lyophilisat.
Pour la détection du virus DENV2, les amorces de séquences SEQ ID NOs : 1 à 6 ont été utilisées, lesquelles amplifient une séquence cible du gèneNS4B, et l’amorce BIP (SEQ ID NO : 4) a servi de sonde puisque modifiée en 5‘ par l’ajout d’un fluorophore FAM. L’oligonucléotide-quencher de séquence SEQ ID NO : 13 a été utilisé et modifié en 3’ par l’ajout d’Iowa Black FQ.
Pour la détection du coronavirus SARS-CoV-2, les amorces de séquences SEQ ID NOs : 7 à 12 ont été utilisées, lesquelles amplifient une séquence cible du gèneORF1ab(Lin Yuet al.,Rapid colorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO; DOI :10.1101/2020.02.20.20025874), et l’amorce LoopF (SEQ ID NO : 11) a servi de sonde puisque modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore Texas Red. L’oligonucléotide-quencher de séquence SEQ ID NO : 16 a été utilisé et modifié en 3’ par l’ajout d’Iowa Black RQ.
Ces amorces (etc.) ont été lyophilisées (cf. supra) dans une pastille test au côté d’une pastille contrôle positif interne dans laquelle a également été lyophilisé l’ADN/ARN matrice permettant d’initier la réaction.
Une fois lyophilisées, les pastilles ont été disposées dans les logements prévues à cet effet.
Utilisation du dispositif
(1) Extraction des acides nucléiques de l’échantillon
  • Mélanger 50 µL d’échantillon au tampon de lyse « buffer AVL » (Qiagen®) ou de tout autre tampon de lyse dont la composition est proche du tampon de lyse publié : Boomet al., J. P. M. E. (1990).Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology, 28(3), 495-503
  • Vortexer durant 15 secondes
  • Incuber à température ambiante durant 10 minutes.
  • Ajouter 200 µL d’éthanol pur
  • Vortexer durant 15 secondes
  • Déposer le lysat sur la membrane de capture.
  • Rincer la membrane de capture avec un ou plusieurs tampons de rinçage : 200 µL de Tampon AW1 (Qiagen®), puis 200 µL de tampon AW2 (Qiagen®) ou de tout autre tampon de rinçage dont la composition est proche du tampon de rinçage publié : Boomet al., J. P. M. E. (1990).Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology, 28(3), 495-503
  • Laisser sécher la membrane de capture 15 minutes.
(2) Elution dans les pastilles réactionnelles et étape de chauffage
  • Tourner le disque supérieur pour mettre en vis-à-vis la membrane de capture et les pastilles, et réhydrater la membrane de capture avec 43 µL de tampon de réaction « Buffer » dilué au 1X (Qiagen®) permettant l’élution des acides nucléiques
  • Tourner le disque supérieur soit dans le même sens soit en sens inverse de façon à venir recouvrir les pastilles avec le filtre optique, ici, un adhésif type «PCR tape»
  • Incuber le dispositif à 65°C durant 30 à 45 minutes,e.g.dans un four ou sur des résistances chauffantes.
Aux fins de cet exemple, les échantillons utilisés ont été un échantillon infecté par le virus DENV2 et un échantillon non-infecté par le virus DENV2. Ont été également utilisé un extrait ARN du SARS-CoV-2 et un contrôle négatif sans extrait de cet ARN.
Acquisition des données
L’acquisition de la fluorescence en point finalviales sondes utilisées et les quenchers associés a été réalisée :
  • pour le virus DENV2 (fluorophore = FAM) avec une longueur d’excitation de 945 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm ; et
  • pour le coronavirus SARS-CoV-2 (fluorophore = Texas Red) avec une longueur d’onde d’excitation de 586 nm et une longueur d’onde d’émission de 603 nm.
Des photographies ont été également prises avec unsmartphone(Iphone®) ou un appareil photographique Nikon®commercial.
Résultats
La Figure 11 montre les résultats obtenus, lesquels ont confirmé que le dispositif est capable, de manière sûre et fiable, de détecter le virus DENV2 et le coronavirus SARS-CoV-2 uniquement dans les échantillons où leur matériel génétique respectif est présent.

Claims (16)

  1. Dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
    • un disque supérieur (3) comprenant :
    • au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
    • au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible,
    cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
    • un disque inférieur (5) comprenant :
    • un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
    • au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés,
    l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
    • passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
    • à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
    • se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
  2. Dispositif de diagnostic (1) selon la revendication 1 dans lequel le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position se fait par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position.
  3. Dispositif de diagnostic (1) selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier, et
    ledit matériau absorbant (15) est de préférence en mesure de contenir un volume d’au moins 1 mL.
  4. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une des revendications précédentes dans lequel le matériau absorbant (15) est dans un matériau choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique.
  5. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une des revendications précédentes dans lequel la membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre.
  6. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles sont dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
  7. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes,
    l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
  8. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles contiennent des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et
    dont l’une au moins contient également un acide nucléique d’intérêt lyophilisé apte à être amplifié par les susdits réactifs lyophilisés.
  9. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif étant compris de 5 à 30.
  10. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel lesdites rotations sont guidées par un système de rainure(s) et d’ergot(s).
  11. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant :
    • au moins deux unités de détection (4) qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, ou
    • au moins deux unités de détection (4) qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
  12. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre des moyens, notamment :
    • au moins une pince capable de saisir ledit dispositif et d’appliquer une pression permettant de bloquer et de serrer le disque supérieur sur le disque inférieur, ladite pression assurant l’herméticité et l’étanchéité du dispositif, et
    équipée d’un système chauffant apte à être positionné au droit de la ou des zones réactionnelles du dispositif évitant la création d’un gradient de température sur la ou les zones réactionnelles à chauffer.
  13. Utilisation du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 pour détecterin vitroau moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester.
  14. Utilisation selon la revendication 13 pour détecterin vitroune infection virale et en particulier pour détecterin vitroune infection virale au SARS-CoV-2.
  15. Procédé de détectionin vitrod’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
    a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ;
    b. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ;
    c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ;
    d. tourner le disque supérieur (3) pour revenir à la position initiale ; et
    e. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
  16. Procédé de fabrication du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
    1. fabriquer les disques supérieur (3) et inférieur (5) ;
    2. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15) et au moins un filtre optique (11) ; et
    3. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
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