JP2024065113A - Crisprエフェクター系に基づく診断 - Google Patents
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Abstract
【課題】低コストで高い特異性と感度を提供する核酸検出技術を提供する。【解決手段】エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAを含む検出CRISPR系と;酵素活性を有する四重鎖を含む核酸アプタマーと、を含む核酸検出系である。【選択図】図1
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は、2018年1月29日出願の米国仮出願第62/623,531号の恩典を主張する。上記で特定した出願の全内容は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年1月29日出願の米国仮出願第62/623,531号の恩典を主張する。上記で特定した出願の全内容は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
電子的配列表への参照
電子的配列表(BROD-2505WP.ST25.txt”;サイズは2.7メガバイトであり、2019年1月28日に作製された)の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
電子的配列表(BROD-2505WP.ST25.txt”;サイズは2.7メガバイトであり、2019年1月28日に作製された)の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の助成を受けた研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号MH100706、及びMH110049、ならびに防衛威嚇緩和機関によって付与された認可番号HDTRA1-14-1-0006の下で政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号MH100706、及びMH110049、ならびに防衛威嚇緩和機関によって付与された認可番号HDTRA1-14-1-0006の下で政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本明細書に開示される主題は、一般に、CRISPRエフェクター系の使用に関連する迅速診断に関する。
本明細書に開示される主題は、一般に、CRISPRエフェクター系の使用に関連する迅速診断に関する。
核酸は、生物学的情報の普遍的な特徴である。ポータブルプラットフォームで、高感度で、かつ単一塩基の特異性を有する核酸を迅速に検出する能力は、多くの疾患の診断及びモニタリングに革命をもたらし、貴重な疫学情報を提供し、一般化可能な科学的ツールとして役立つことが可能となる。核酸を検出するための多くの方法が開発されているが(Du et al.,2017;Green et al.,2014;Kumar et al.,2014;Pardee et al.,2014;Pardee et al.,2016;Urdea et al.,2006)、それらは必然的に感度、特異性、単純さ、速度の間のトレードオフに悩まされる。例えば、qPCRアプローチは敏感であるが高価であり、複雑な機器に依存しており、使用できるのは実験室環境での高度な訓練を受けたオペレーターに限定されている。等温核酸増幅とポータブルプラットフォームを組み合わせた新しい方法(Du et al.,2017;Pardee et al.,2016)などの他のアプローチは、ポイントオブケア(POC)環境で高い検出特異性を提供するが、感度が低いせいで、用途がやや限られている。核酸診断がさまざまなヘルスケアの適用にますます適切なものになると、低コストで高い特異性と感度を提供する検出技術は、臨床研究と基礎研究の両方の環境で非常に有用になる。
一態様では、本発明は、エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAを含む検出CRISPR系と;酵素活性を有する四重鎖を含む核酸アプタマーとを備える、核酸検出系を提供する。いくつかの実施形態では、この酵素活性は、ペルオキシダーゼ活性であってもよい。いくつかの実施形態では、この系は、核酸増幅試薬をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、四重鎖の酵素活性は、試料中に色シグナルを生成する。いくつかの実施形態では、四重鎖の酵素活性の不活性化は、色シグナルの喪失をもたらし、色シグナルの喪失は、標的分子の存在を示す。
標的分子は標的DNAであってもよい。いくつかの実施形態では、この系は、標的DNAに結合し、RNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。CRISPR系のエフェクタータンパク質は、RNA標的化エフェクタータンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、RNA標的化エフェクタータンパク質は、1つ以上のHEPNドメインを含んでもよい。1つ以上のHEPNドメインは、RxxxxHモチーフ配列を含んでもよい。RxxxHモチーフは、R{N / H/K]X1X2X3H配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、X1は、R、S、D、E、Q、N、G、またはYであってもよく、X2は独立して、I、S、T、V、またはLであってもよく、X3は独立してL、F、N、Y、V、I、S、D、E、またはAである。
いくつかの実施形態では、CRISPR RNA標的化エフェクタータンパク質は、C2c2であってもよい。いくつかの実施形態では、C2c2は、Cas1遺伝子の20kb以内であってもよい。
C2c2エフェクタータンパク質は:Leptotrichia、Listeria、Corynebacter、Sutterella、Legionella、Treponema、Filifactor、Eubacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Mycoplasma、Bacteroides、Flaviivola、Flavobacterium、Sphaerochaeta、Azospirillum、Gluconacetobacter、Neisseria、Roseburia、Parvibaculum、Staphylococcus、Nitratifractor、Mycoplasma、Campylobacter、及びLachnospiraからなる群より選択される属の生物体に由来し得る。
C2c2またはCas13bエフェクタータンパク質は、以下からなる群より選択される生物体に由来し得る:Leptotrichia shahii;Leptotrichia wadei(Lw2);Listeria seeligeri;ラクノスピラ科細菌MA2020;ラクノスピラ科細菌NK4A179;[クロストリジウム(Clostridium)]aminophilum DSM 10710;Carnobacterium gallinarum DSM 4847;Carnobacterium gallinarum DSM 4847(2番目のCRISPR遺伝子座);Paludibacter propionicigenes WB4;Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317;リステリア科細菌FSL M6-0635;Leptotrichia wadei F0279;Rhodobacter capsulatus SB 1003;Rhodobacter capsulatus R121;Rhodobacter capsulatus DE442;Leptotrichia buccalis C-1013-b;Herbinix hemicellulosilytica;[真正細菌(Eubacterium)]rectale;真正細菌科細菌CHKCI004;Blautia sp.Marseille-P2398;Leptotrichia sp.口頭分類879 str.F0557;ラクノスピラ科細菌NK4A144;Chloroflexus aggregans;Demequina aurantiaca;Thalassospira sp.TSL5-1;Pseudobutyrivibrio sp.OR37;Butyrivibrio sp.YAB3001;Blautia sp.Marseille-P2398;Leptotrichia sp.Marseille-P3007;Bacteroides ihuae;ポルフィロモナダ科細菌KH3CP3RA;Listeria riparia;及びInsolitispirillum peregrinum。
特定の実施形態では、C2c2エフェクタータンパク質は、L.wadei F0279であっても、またはL.wadei F0279(Lw2)C2c2エフェクタータンパク質であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸アプタマーは、オクラトキシンA(OTA)を認識し得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、(合成)ミスマッチを含む対応する標的分子に結合するように設計されてもよい。このミスマッチは、上記標的分子におけるSNPまたは他の一塩基変異の上流であっても、または下流であってもよい。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、標的RNAもしくはDNA、またはRNA転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計される。1つ以上のガイドRNAは、疾患状態の診断となる1つ以上の標的分子に結合するように設計され得る。いくつかの実施形態では、疾患状態はがんであり得る。いくつかの実施形態では、疾患状態は自己免疫疾患であり得る。いくつかの実施形態では、疾患状態は感染症であり得る。感染は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物によって引き起こされ得る。
特定の実施形態では、感染症はウイルス感染症であってもよい。ウイルス感染は、DNAウイルスによって生じる。DNAウイルスは、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科(ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む)、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科(アフリカ豚コレラウイルスを含む)、バキュロウイルス科、シカウダウイルス科、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科、イリドウイルス科、マセイレウイルス科(Maseilleviridae)、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科(Phycodnaviridae)、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科(シミアンウイルス40、JCウイルス、BKウイルスを含む)、ポックスウイルス科(牛痘及び天然痘を含む)、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスであり得る。
ウイルス感染は、二本鎖RNAウイルス、プラス鎖RNAウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、レトロウイルス、もしくはそれらの組み合わせによって引き起こされ得る。
ウイルス感染は、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニウイルス科、オルソミクソウイルス科、もしくはデルタウイルスによって引き起こされ得る。
ウイルス感染は、コロナウイルス、SARS、ポリオウイルス、ライノウイルス、A型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはD型肝炎ウイルスによって引き起こされ得る。
いくつかの実施形態では、感染症は細菌感染症である。細菌感染を引き起こす細菌は、アシネトバクター種、アクチノバシラス種、アクチノミセス種、アクチノマイセート種、アクチノマイセス種、アエロコッカス種、アエロモナス種、アナプラズマ種、アルカリゲネス種、バチルス種、バクテリオデス種、バルトネラ種、ビフィドバクテリウム種、ボルデテラ種、ボレリア種、ブルセラ種、バークホルデリア種、カンピロバクター種、カプノサイトファガ種、クラミジア種、シトロバクター種、コクシエラ種、コリネバクテリウム種、クロストリジウム種、エイケネラ種、エンテロバクター種、エシェリキア種、エンテロコッカス種、エールリヒア種、表皮菌種、エリシュペロトリクス種、ユーバクテリウム種、フランシセラ種、フソバクテリウム種、ガルドネレラ種、ゲメラ種、ヘモフィルス種、ヘリコバクター種、キンゲラ種、クレブシエラ種、ラクトバシラス種、ラクトコッカス種、リステリア種、レプトスピラ種、レジオネラ種、レプトスピラ種、ロイコノストック種、マンハイミア種、ミクロスポラム種、ミクロコッカス種、モラクセラ種、モルガネル種、モビランカス種、ミクロコッカス種、マイコバクテリウム種、マイコプラズマ種、ノカルジア種、ナイセリア種、パスツレラ種、ペディオコッカス種、ペプトストレプトコッカス種、ピチロスポラム種、プレシオモナス種、プレボテラ種、ポルフィロモナス種、プロテウス種、プロビデンシア種、シュードモナス種、プロピオニバクテリウム種、ロドコッカス種、リケッチア種、ロドコッカス種、セラチア種、ステノトロフォモナス種、サルモネラ種、セラチア種、シゲラ種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、スピリルム種、ストレプトバシラス種、トレポネーマ種、トロフェリマ種、トリコフィトン(白癬菌)種、ウレアプラズマ種、ベイロネラ種、ビブリオ種、エルシニア種、キサントモナス種、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、感染症は真菌によって引き起こされ得る。真菌は、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ症、コクシジオミコーシス、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gatti,sp.Histoplasma sp.(例えば、Histoplasma capsulatum)、Pneumocystis sp.(例えば、Pneumocystis jirovecii)、Stachybotrys(例えば、Stachybotrys chartarum)、Mucroymcosis、Sporothrix、真菌性眼感染症白癬、Exserohilum、Cladosporium、Geotrichum、Saccharomyces、ハンゼヌラ種、カンジダ種、クルイウェロマイセス種、デバリオマイセス種、ピチア種、ペニシリウム種、クラドスポリウム種、ビソクラミス種またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、感染は原生動物によって引き起こされ得る。原生動物は、ユーグレノゾア、ヘテロロボセア、ディプロモナジダ、アメーボエゾア、割球、アピコンプレクサ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
感染症は、寄生生物によって引き起こされる可能性がある。寄生生物は、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、Leishmania braziliensis、L.infantum、L.mexicana、L.major、L.tropica、L.donovani、Naegleria fowleri、Giardia intestinalis(G.lamblia、G.duodenalis)、canthamoeba castellanii、Balamuthia madrillaris、Entamoeba histolytica、Blastocystic hominis、Babesia microti、Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayetanensis、Plasmodium falciparum、P.vivax、P.ovale、P.malariae、及びToxoplasma gondii、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、標的RNA分子を増幅するための試薬は、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、ニッキング酵素増幅反応(NEAR)、PCR、複数置換増幅(MDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、または分岐増幅法(RAM)を含む。
この系は、濃縮CRISPR系をさらに含んでもよく、この濃縮CRISPR系は、検出CRISPR系による検出の前に、対応する標的分子と結合するように設計される。濃縮CRISPR系は、触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質を含んでもよい。触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性なC2c2であり得る。
濃縮CRISPRエフェクタータンパク質は、タグをさらに含んでもよく、このタグを使用して、濃縮CRISPRエフェクター系をプルダウンするか、または濃縮CRISPR系を固体基材に結合する。いくつかの実施形態では、固体基材はフローセルであってよい。
別の態様では、本発明は、1つ以上の個々の別個のボリュームを含む診断デバイスを提供し、各々の個々の別個のボリュームは、本明細書に記載のCRISPR系を含む。
いくつかの実施形態では、各個別のボリュームは、核酸増幅試薬をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的DNAであってもよく、この個々の個別のボリュームは、標的DNAに結合し、かつRNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、個々の個別のボリュームは液滴であってもよい。いくつかの実施形態では、この個々の個別のボリュームは固体基材上に定義される。いくつかの実施形態では、この個々の個別のボリュームはマイクロウェルである。いくつかの実施形態では、この個々の個別ボリュームは基材上に定義されたスポットである。いくつかの実施形態では、この基材は、可塑性材料基材であり得る。いくつかの実施形態では、この可塑性材料基材は、紙基材であっても、または可塑性ポリマーベースの基材であってよい。
さらに別の態様では、本発明は、試料中の標的の核酸を検出するための方法を提供し、この方法は以下を含む:試料または試料のセットを、1つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のCRISPR系を含むこと;1つ以上の標的分子への1つ以上のガイドRNAの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすること;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここでCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると四重鎖を含むRNAアプタマーの改変を生じ、その結果四重鎖の酵素活性が不活性化されることと;酵素活性を検出することであって、この閾値未満の検出が、試料中の1つ以上の標的分子の存在を示すこと。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的DNAであり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、RNAポリメラーゼ部位を含むプライマーを用いて標的DNAを結合することをさらに含み得る。
この方法は、試料RNAまたはトリガーRNAを増幅することをさらに含み得る。RNAの増幅は、NASBAによる増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、RNAの増幅は、RPAによる増幅を含み得る。
この試料は、生物学的試料であっても、または環境試料であってもよい。
この生物学的試料とは、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の分泌体液、浸出液、滲出液(例えば、膿瘍または感染もしくは炎症部位の任意の他の部位から得られた液体)、または関節(例えば、正常な関節またはリウマチ関節炎、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎などの疾患に罹患した関節)から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであり得る。
環境試料は、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られてもよい。
1つ以上のガイドRNAは、標的RNAもしくはDNA、またはRNA転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計され得る。1つ以上のガイドRNAは、疾患状態の診断となる1つ以上の標的分子に結合するように設計され得る。
1つ以上のガイドRNAは、無細胞核酸に結合するように設計され得る。
いくつかの実施形態において、疾患状態とは、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患であり得る。
さらに別の態様では、本発明は、試料を本明細書に記載の核酸検出系と接触させること、及び上記接触した試料を側方流動イムノクロマトグラフィーアッセイに適用することを含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。
例となる実施形態の詳細な説明
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd edition(1989)(Sambrook,Fritsch、及びManiatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual、4th edition(2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel et al.eds.);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,及びG.R.Taylor eds.):Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow and Lane,eds.):Antibodies A Laboratory Manual,2nd edition 2013(E.A.Greenfield ed.);Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney,ed.);Benjamin Lewin,Genes IX,Jones及びBartletが公開,2008(ISBN 0763752223);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.が公開,1994(ISBN 0632021829);Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.が公開,1995(ISBN 9780471185710);Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992);ならびにMarten H.Hofker及びJan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,2nd edition(2011)に見出され得る。
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd edition(1989)(Sambrook,Fritsch、及びManiatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual、4th edition(2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel et al.eds.);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,及びG.R.Taylor eds.):Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow and Lane,eds.):Antibodies A Laboratory Manual,2nd edition 2013(E.A.Greenfield ed.);Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney,ed.);Benjamin Lewin,Genes IX,Jones及びBartletが公開,2008(ISBN 0763752223);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.が公開,1994(ISBN 0632021829);Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.が公開,1995(ISBN 9780471185710);Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992);ならびにMarten H.Hofker及びJan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,2nd edition(2011)に見出され得る。
本明細書で使用される場合、単数形「a(不定冠詞)」、「an(不定冠詞)」、及び「the(定冠詞)」は、文脈がそうではないと明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
「任意選択の、必要に応じ(optional)」または「任意選択で、必要に応じて(optionally)」という用語は、その後に記載される事象、状況または置き換えが発生する場合と発生しない場合があること、ならびにその記載にはその事象または状況が発生する場合及び発生しない場合が含まれることを意味する。
終点による数値範囲の列挙は、列挙された終点と同様に、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数を含む。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、パラメーター、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定の値の及び特定の値からの変動を、そのような変動が、開示された本発明において行うために適切である限り、例えば、特定された値の及び特定の値からの±10%以下、±5%以下、±1%以下、及び+/-0.1%以下の変動を含むことを意味する。修飾語「約」または「およそ」が指す値自体はまた、具体的であり、かつ好ましくは開示されていることを理解されたい。
本明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態の例」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所における「一実施形態では」、「ある実施形態では」、または「実施形態の例」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、本開示から当業者には明らかなように、1つ以上の実施形態では、任意の適切な方法で組み合わせられてもよい。さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる他の特徴ではなくいくつかを含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用され得る。
「C2c2」は現在、「Cas13a」と呼ばれ、この用語は、特段示さない限り、本明細書において交換可能に使用される。
本明細書に引用される全ての出版物、公開特許文書、及び特許出願は、各々の個々の出版物、公開特許文書、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
概要
微生物がクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(Microbial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)及びCRISPR関連(CRISPR-Cas)適応免疫系は、Cas9及びCpf1などのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む(Shmakov et al.,2017;Zetsche et al.,2015)。Cas9及びCpf1の両方がDNAを標的とするが、C2c2を含む単一のエフェクターRNA誘導RNaseが最近発見され(Shmakov et al.,2015)、特徴付けられた(Abudayyeh et al.,2016;Smargon et al.,2017)、特異的なRNA検知のためのプラットフォームを提供する。RNA誘導RNaseは、CRISPR RNA(crRNAs)を使用して簡単かつ便利に、標的RNAを切断するように再プログラム可能である。DNA標的のみを切断するDNAエンドヌクレアーゼCas9及びCpf1とは異なり、C2c2のようなRNA誘導RNaseは、そのRNA標的を切断した後も活性のままであり、近接した非標的RNAの「コラテラル」切断を引き起こす(Abudayyeh et al.,2016)。このcrRNAプログラムされたコラテラルRNA切断活性は、RNAガイド付きRNaseを使用して、読み出しとして機能し得るインビボのプログラム細胞死またはインビトロの非特異的RNA分解をトリガーすることにより、特定のRNAの存在を検出する機会を提供する(Abudayyeh et al.,2016;East-Seletsky et al.,2016)。コラテラル活性のクラス2酵素には、参照によって本明細書に援用される、Gootenberg et al.Science, 2018 Apr 27;360(6387):439-444に記載されるように、Cas13b及びCas12a酵素が挙げられる。
微生物がクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(Microbial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)及びCRISPR関連(CRISPR-Cas)適応免疫系は、Cas9及びCpf1などのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む(Shmakov et al.,2017;Zetsche et al.,2015)。Cas9及びCpf1の両方がDNAを標的とするが、C2c2を含む単一のエフェクターRNA誘導RNaseが最近発見され(Shmakov et al.,2015)、特徴付けられた(Abudayyeh et al.,2016;Smargon et al.,2017)、特異的なRNA検知のためのプラットフォームを提供する。RNA誘導RNaseは、CRISPR RNA(crRNAs)を使用して簡単かつ便利に、標的RNAを切断するように再プログラム可能である。DNA標的のみを切断するDNAエンドヌクレアーゼCas9及びCpf1とは異なり、C2c2のようなRNA誘導RNaseは、そのRNA標的を切断した後も活性のままであり、近接した非標的RNAの「コラテラル」切断を引き起こす(Abudayyeh et al.,2016)。このcrRNAプログラムされたコラテラルRNA切断活性は、RNAガイド付きRNaseを使用して、読み出しとして機能し得るインビボのプログラム細胞死またはインビトロの非特異的RNA分解をトリガーすることにより、特定のRNAの存在を検出する機会を提供する(Abudayyeh et al.,2016;East-Seletsky et al.,2016)。コラテラル活性のクラス2酵素には、参照によって本明細書に援用される、Gootenberg et al.Science, 2018 Apr 27;360(6387):439-444に記載されるように、Cas13b及びCas12a酵素が挙げられる。
本明細書に開示される実施形態は、アトモル感度を有するロバストなCRISPRベースの診断を提供するためにRNA標的化エフェクターを利用した。本明細書に開示される実施形態は、同等のレベルの感度でブロスのDNA及びRNAを検出し得、かつ単一の塩基対の違いに基づいて標的を非標的から区別し得る。さらに、本明細書に開示される実施形態は、便利な分布及びポイントオブケア(POC)用途のために、凍結乾燥形式で調製してもよい。そのような実施形態は、例えば、ウイルス検出、細菌株分類、高感度遺伝子型決定、及び疾患関連無細胞DNAの検出を含む、ヒトの健康における複数のシナリオにおいて有用である。参照を容易にするために、本明細書に開示される実施形態はまた、SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)とも呼ばれ得る。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、CRISPR系、対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNA、RNA-アプタマー、及び試料中で標的核酸分子を増幅するための任意の増幅試薬を含む核酸検出系に関する。1つ以上の検出アプタマーは、1つ以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、RNAポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が、標的ペプチドに対する検出アプタマーの結合の際にのみ露出されるように構成される。RNAポリメラーゼ部位の露出は、アプタマー配列を鋳型として使用してトリガーRNAオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。したがって、そのような実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、トリガーRNAに結合するように構成される。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、複数の個々の個別のボリュームを含む診断デバイスに関する。各個々の個別のボリュームは、CRISPRエフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNA、及び酵素活性を有する四重鎖を含むRNAアプタマーを含む。ある特定の例示的な実施形態では、RNA増幅試薬は、個々の個別のボリュームに事前にロードされてもよいし、または個々の個別のボリュームへの試料の添加と同時にもしくはその後にその個々の個別のボリュームに添加されてもよい。このデバイスは、マイクロ流体ベースのデバイス、ウェアラブルデバイス、またはこの個々の個別のボリュームが規定される可塑性材料基材を含むデバイスであってもよい。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、試料または試料のセットを一連の個々の個別ボリュームに分配することを含む、試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、各個々の個別ボリュームは、CRISPRエフェクタータンパク質、1つの標的オリゴヌクレオチドに結合するように設計された1つ以上のガイドRNA、及び酵素活性を有する四重鎖を含むRNAアプタマーを含む。次いで、試料のセットは、1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下で維持される。1つ以上のガイドRNAの標的核酸への結合は、次に、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化する。一旦活性化されると、CRISPRエフェクタータンパク質は、四重鎖の酵素活性を不活性化する。閾値未満の酵素活性の検出は、標的分子の存在を示す。
核酸検出系
いくつかの実施形態では、本発明は、エフェクタータンパク質を有する検出CRISPR系と、対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAと、酵素活性を有する四重鎖を含むRNAアプタマーとを含む核酸検出系を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、エフェクタータンパク質を有する検出CRISPR系と、対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAと、酵素活性を有する四重鎖を含むRNAアプタマーとを含む核酸検出系を提供する。
検出CRISPR系
一般には、本明細書及びWO2014/093622(PCT/US2013/074667)などの文書で使用されるCRISPR-CasまたはCRISPR系は、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現または活性の指向に関与する転写物及び他の要素を総称的に指し、これには、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAまたは活性な部分的tracrRNA)配列、tracr-mate配列(「ダイレクトリピート」、及び内因性CRISPR系の環境でのtracrRNA処理部分ダイレクトリピートを包含する)、ガイド配列(内因性CRISPR系の環境では「スペーサー」とも呼ばれる)、または本明細書で使用される「RNA(複数可)」(例えばCas9などのCasをガイドするためのRNA(複数可)、例えばCRISPR RNA及びトランス活性化(tracr)RNAまたはシングルガイドRNA(sgRNA)(キメラRNA))またはCRISPR遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般的に、CRISPR系は、標的配列の部位でCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる(内因性CRISPR系の環境ではプロトスペーサーとも呼ばれる)。CRISPRタンパク質がC2c2タンパク質である場合、tracrRNAは必要とされない。C2c2はAbudayyeh et al.(2016)“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”;Science;DOI:10.1126/science.aaf5573、ならびにShmakov et al.(2015)“Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”,Molecular Cell,DOI:dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。Cas13bは、Smargon et al.(2017)“Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28,”Molecular Cell.65,1-13;dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023.(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
一般には、本明細書及びWO2014/093622(PCT/US2013/074667)などの文書で使用されるCRISPR-CasまたはCRISPR系は、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現または活性の指向に関与する転写物及び他の要素を総称的に指し、これには、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAまたは活性な部分的tracrRNA)配列、tracr-mate配列(「ダイレクトリピート」、及び内因性CRISPR系の環境でのtracrRNA処理部分ダイレクトリピートを包含する)、ガイド配列(内因性CRISPR系の環境では「スペーサー」とも呼ばれる)、または本明細書で使用される「RNA(複数可)」(例えばCas9などのCasをガイドするためのRNA(複数可)、例えばCRISPR RNA及びトランス活性化(tracr)RNAまたはシングルガイドRNA(sgRNA)(キメラRNA))またはCRISPR遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般的に、CRISPR系は、標的配列の部位でCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる(内因性CRISPR系の環境ではプロトスペーサーとも呼ばれる)。CRISPRタンパク質がC2c2タンパク質である場合、tracrRNAは必要とされない。C2c2はAbudayyeh et al.(2016)“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”;Science;DOI:10.1126/science.aaf5573、ならびにShmakov et al.(2015)“Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”,Molecular Cell,DOI:dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。Cas13bは、Smargon et al.(2017)“Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28,”Molecular Cell.65,1-13;dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023.(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
1.エフェクタータンパク質
ある特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはPAM様モチーフは、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質複合体の目的の標的遺伝子座への結合を誘導する。いくつかの実施形態では、PAMは、5’PAM(すなわち、プロトスペーサーの5’末端の上流に位置する)であってもよい。他の実施形態では、PAMは、3’PAM(すなわち、プロトスペーサーの5’末端の下流に位置する)であってもよい。「PAM」という用語は、「PFS」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」という用語と交換可能に使用され得る。
ある特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)またはPAM様モチーフは、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質複合体の目的の標的遺伝子座への結合を誘導する。いくつかの実施形態では、PAMは、5’PAM(すなわち、プロトスペーサーの5’末端の上流に位置する)であってもよい。他の実施形態では、PAMは、3’PAM(すなわち、プロトスペーサーの5’末端の下流に位置する)であってもよい。「PAM」という用語は、「PFS」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」という用語と交換可能に使用され得る。
好ましい実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、3’PAMを認識し得る。ある特定の実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、5’Hである3’PAMを認識し得、ここで、Hは、A、CまたはUである。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Leptotrichia shahii C2c2p、より好ましくはLeptotrichia shahii DSM 19757 C2c2であり得、3’PAMは、5’Hである。
CRISPR複合体の形成の文脈において、「「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。標的配列は、RNAポリヌクレオチドを含んでもよい。「標的RNA」という用語は、標的配列であるかまたは標的配列を含むRNAポリヌクレオチドを指す。言い換えれば、標的RNAは、gRNAの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、かつCRISPRエフェクタータンパク質及びgRNAを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指向される、RNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
CRISPRエフェクタータンパク質、特にC2c2をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化されたCRISPRエフェクタータンパク質である。コドン最適化配列の例は、この場合、真核生物、例えば、ヒト(すなわち、ヒトでの発現に最適化されている)、または本明細書で考察される別の真核生物、動物または哺乳動物での発現に最適化された配列である;例えば、WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)のSaCas9ヒトコドン最適化配列を参照のこと。これが好ましいが、他の例が可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化、または特定の臓器のコドン最適化が知られていることが理解されよう。いくつかの実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞での発現のために最適化されたコドンである。真核生物細胞は、限定はされないが、本明細書で考察されるヒトまたは非ヒト真核生物または動物または哺乳動物、例えば、植物、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳類もしくは霊長類を含む、哺乳動物などの特定の生物の細胞であってもまたはそれらに由来する細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセス及び/またはヒトもしくは動物、及びそのようなプロセスから生じる動物にも実質的な医学的利益なしに苦痛を引き起こす可能性が高い動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスは排除されてもよい。一般に、コドン最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンを有する天然配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、またはそれ以上のコドン)を置き換えることにより、目的の宿主細胞での発現を増強するために核酸配列を変更するプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス(生物間のコドン用法の相違)は、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関する場合が多く、これは、次に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたtRNAの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所定の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整し得る。コドン使用法の表は、例えば、kazusa.orjp/codon/で入手可能な「Codon Usage Database」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応され得る。Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Gene Forge(Aptagen;Jacobus、PA)なども利用可能である。いくつかの実施形態では、Casをコードする配列中の1つ以上のコドン(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、またはそれ以上、または全てのコドン)は、特定のアミノ酸について、最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Casトランスジェニック細胞、特にC2c2トランスジェニック細胞を提供することを含み得、ここで1つ以上のガイドRNAをコードする1つ以上の核酸が提供されるか、または細胞内で、1つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節要素と作動可能に接続して導入される。本明細書で使用する場合、「Casトランスジェニック細胞」という用語は、Cas遺伝子がゲノムに組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、または起源は、本発明によって特に限定されない。また、Cas導入遺伝子が細胞に導入される方法は様々であり得、そして当該分野で公知の任意の方法であり得る。ある特定の実施形態では、Casトランスジェニック細胞は、単離された細胞にCas導入遺伝子を導入することによって得られる。ある特定の他の実施形態では、Casトランスジェニック細胞は、Casトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、限定するものではないが、本明細書で言及されるCasトランスジェニック細胞は、Casノックイン真核生物などのCasトランスジェニック真核生物に由来し得る。参照により本明細書に組み込まれるWO2014/093622(PCT/US13/74667)が参照される。Rosa遺伝子座を標的とすることを目的とするSangamo BioSciencesに譲渡された米国特許公開第20120017290号及び20110265198号の方法は、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改変してもよい。Rosa遺伝子座を標的とすることを指向としたCellectisに譲渡された米国特許公開第20130236946号の方法もまた、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改変してもよい。さらなる例としては、参照により本明細書に援用されている、Cas9ノックインマウスについて説明している、Platt et.al.(Cell;159(2):440-455(2014))が言及される。Cas導入遺伝子は、Lox-Stop-polyA-Lox(LSL)カセットをさらに含んでもよく、それによりCre発現をCreリコンビナーゼにより誘導性にさせる。あるいは、Casトランスジェニック細胞は、単離された細胞にCas導入遺伝子を導入することによって得てもよい。導入遺伝子の送達系は、当該技術分野で周知である。例として、Cas導入遺伝子は、本明細書のいずれかにも記載されるように、ベクター(例えば、AAV、アデノウイルス、レンチウイルス)及び/または粒子及び/またはナノ粒子送達により、例えば真核細胞に送達され得る。
本明細書で言及されるCasトランスジェニック細胞などの細胞は、組み込まれたCas遺伝子またはCasを標的遺伝子座に導き得るRNAと複合体化したときにCasの配列特異的作用から生じる変異を有することに加えて、さらなるゲノム変化を含んでもよいことが当業者に理解される。
ある特定の態様では、本発明は、例えば、標的遺伝子座(すなわちガイドRNA)に細胞内でCas及び/またはCasを導き得るRNAを、送達または導入するため、ならびに、これらの成分を増殖させるため(例えば原核細胞において)のベクターを含む。本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にするか、または促進するツールである。それは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、その中に別のDNAセグメントを挿入して、挿入されたセグメントの複製を引き起こし得る。一般に、ベクターは、適切な制御要素を伴う場合、複製が可能である。一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、1つ以上の自由端を含むか、自由端を含まない(例えば、環状)核酸分子、DNA、RNA、またはその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野で公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などにより、追加のDNAセグメントを挿入し得る環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のDNAまたはRNA配列が、ウイルスにパッケージングするためにベクターに存在する(例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス(AAV))。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドを含む。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製し得る(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えDNA技術で有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでもよく、これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、1つ以上の調節要素を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節要素(複数可)に連結されていることを意味することを意図する(例えば、インビトロ転写/翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合、宿主細胞中で)。組換え及びクローニング方法に関しては、2004年9月2日にUS 2004-0171156 A1として公開された米国特許出願10/815,730が言及され、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される実施形態は、CRISPRエフェクター系を含むトランスジェニック細胞も含み得る。ある特定の例示的な実施形態では、トランスジェニック細胞は、個別の別個の容積として機能し得る。言い換えれば、マスキング構築物を含む試料は、例えば、適切な送達小胞で細胞に送達され得、標的が送達小胞に存在する場合、CRISPRエフェクターが活性化され、検出可能なシグナルが生成される。
ベクター(複数可)は、調節要素(複数可)、例えばプロモーター(複数可)を含んでもよい。このベクター(複数可)は、Casコード配列及び/または単一を含んでもよいが、おそらく、また1~2、1~3、1~4、1~5、3~6、3~7、3~8、3~9、3~10、3~8、3~16、3~30、3~32、3~48、3~50のRNA(複数可)(例えば、sgRNA)のような少なくとも3または8または16または32または48または50のガイドRNA(複数可)(例えば、sgRNA)コード配列を含んでもよい。単一のベクターには、各RNA(例えば、sgRNA)に対するプロモーターがあり得、有利には、最大約16までのRNA(複数可)が存在する場合;そして、単一のベクターが16を超えるRNA(複数可)を提供する場合、1つ以上のプロモーター(複数可)が2つ以上のRNA(複数可)の発現を駆動し得、例えば、32のRNA(複数可)がある場合、各プロモーターは、2つのRNA(複数可)の発現を駆動し得、48のRNA(複数可)がある場合、各プロモーターは3つのRNA(複数可)の発現を駆動し得る。単純な算術及び十分に確立されたクローニングプロトコルならびにこの開示における教示により、当業者は、AAVなどの適切な例示的なベクターのRNA(複数可)及びU6プロモーターなどの適切なプロモーターに関して本発明を容易に実施し得る。例えば、AAVのパッケージ制限は、約4.7kbである。単一のU6-gRNA(それに加えてクローニング用の制限部位)の長さは361bpである。したがって、当業者は、単一のベクターに約12~16、例えば13のU6-gRNAカセットを容易に収めることができる。これは、TALEアセンブリに使用されるゴールデンゲート戦略(genome-engineering.org/taleffectors/)などの任意の適切な方法でアセンブルされ得る。当業者はまた、タンデムガイド戦略を使用して、U6-gRNAの数を約1.5倍、例えば、12~16、例えば、13から約18~24、例えば、約19のU6-gRNAに増大し得る。したがって、当業者は、単一のベクター、例えば、AAVベクター中の約18~24、例えば、約19のプロモーター-RNA、例えば、U6-gRNAに容易に到達し得る。ベクター中のプロモーター及びRNAの数を増大させるためのさらなる手段は、単一のプロモーター(例えば、U6)を使用して、切断可能な配列によって分離されたRNAのアレイを発現させることである。そして、ベクター中のプロモーター-RNAの数を増大させるためのさらに別の手段は、コード配列または遺伝子のイントロン内の切断可能な配列によって分離されたプロモーター-RNAのアレイを発現させることである。そしてこの場合、発現を増大し得、組織特異的な方法で長いRNAの転写を可能にするポリメラーゼIIプロモーターを使用することが有利である(例えば、nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short及びnature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.htmlを参照のこと)。有利な実施形態では、AAVは、最大約50個の遺伝子を標的とするU6タンデムgRNAをパッケージし得る。したがって、当該技術分野の知識及び本開示の教示から、当業者は、制御下で、または1つ以上のプロモーターに作動可能にもしくは作動可能に連結された、ベクター(複数可)、例えば、単一のベクター(複数のRNAまたはガイドを発現する)を容易に作製及び使用し得る(特に本明細書で考察されるRNAまたはガイドの数に関して、過度の実験なしに)。
ガイドRNA(複数可)コード配列及び/またはCasコード配列は、機能的または機能的に調節要素に連結されてもよく、したがって調節要素(複数可)は発現を駆動する。プロモーター(複数可)は、構成的プロモーター(複数可)及び/または条件付きプロモーター(複数可)及び/または誘導性プロモーター(複数可)及び/または組織特異的プロモーター(複数可)であってもよい。プロモーターは、RNAポリメラーゼ、pol I、pol II、pol III、T7、U6、H1、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、及びEF1αプロモーターからなる群より選択され得る。有利なプロモーターはプロモーターU6である。
いくつかの実施形態では、核酸標的化系の1つ以上の要素は、内因性CRISPR RNA標的化系を含む特定の生物に由来する。いくつかの実施形態では、CRISPR系エフェクタータンパク質は、RNA標的化エフェクタータンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質CRISPR RNA標的化系は、少なくとも1つのHEPNドメインを含み、これには限定するものではないが、本明細書に記載のHEPNドメイン、当該技術分野で既知のHEPNドメイン、及びコンセンサス配列モチーフとの比較によりHEPNドメインであると認識されるドメインを含む。本明細書では、いくつかのそのようなドメインが提供されている。非限定的な一例では、コンセンサス配列は、本明細書で提供されるC2c2またはCas13bオルソログの配列から誘導してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、単一のHEPNドメインを含む。特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、2つのHEPNドメインを含む。
例示的な一実施形態では、エフェクタータンパク質は、RxxxxHモチーフ配列を含む1つ以上のHEPNドメインを含む。RxxxxHモチーフ配列は、限定するものではないが、本明細書に記載のHEPNドメインまたは当該技術分野で公知のHEPNドメイン由来のものであり得る。RxxxxHモチーフ配列は、2つ以上のHEPNドメインの部分を組み合わせることによって作成されたモチーフ配列をさらに含む。述べたように、コンセンサス配列は、「Novel CRISPR Enzymes and Systems」という表題の米国仮特許出願62/432,240、2017年3月15日出願の「Novel Type VI CRISPR Orthologs and systems」という表題の米国仮特許出願62/471,710、及び弁護士整理番号47627-05-2133として表示され、2017年4月12日に提出された「Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems」という表題の米国仮特許出願から誘導され得る。
本発明の一実施形態では、HEPNドメインは、R{N/H/K}X1X2X3Hの配列を含む少なくとも1つのRxxxxHモチーフを含む。本発明の実施形態では、HEPNドメインは、R{N/H}X1X2X3Hの配列を含むRxxxxHモチーフを含む。本発明の一実施形態では、HEPNドメインは、R{N/K}X1X2X3Hの配列を含む。ある特定の実施形態では、X1は、R、S、D、E、Q、N、G、Y、またはHである。ある特定の実施形態では、X2は、I、S、T、V、またはLである。ある特定の実施形態では、X3は、L、F、N、Y、V、I、S、D、E、またはAである。
本発明に従って使用するための追加のエフェクターは、例えば、これらに限定するものではないが、cas1遺伝子の開始から20kb及びcas1遺伝子の終わりから20kbの領域内の、cas1遺伝子へのそれらの近接性によって同定され得る。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、少なくとも1つのHEPNドメイン及び少なくとも500アミノ酸を含み、C2c2エフェクタータンパク質は、Cas遺伝子またはCRISPRアレイの上流または下流20kb内の原核生物ゲノムに天然に存在する。Casタンパク質の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1及びCsx12としても知られている)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、C2c2エフェクタータンパク質は、Cas1遺伝子の上流または下流20kb内の原核生物ゲノムに天然に存在する。「オルソログ」(本明細書では「オルソログ」とも呼ばれる)及び「ホモログ」(本明細書では「ホモログ」とも呼ばれる)という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによれば、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同性タンパク質は、構造的に関連していなくてもよく、また部分的にのみ構造的に関連している。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連していても、必ずしもそうでなくてもよいし、または部分的にのみ構造的に関連している。
特定の実施形態では、VI型RNA標的化Cas酵素は、C2c2である。他の例示的な実施形態では、VI型RNA標的化Cas酵素は、Cas13bである。特定の実施形態では、本明細書に言及されるC2c2などのVI型タンパク質のホモログまたはオルソログは、C2c2などのVI型タンパク質と少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%などの配列相同性または同一性を有する(例えば、Leptotrichia shahii C2c2、Lachnospiraceae bacterium MA2020 C2c2、Lachnospiraceae bacterium NK4A179 C2c2、Clostridium aminophilum(DSM 10710)C2c2、Carnobacterium gallinarum(DSM 4847)C2c2、Paludibacter propionicigenes(WB4)C2c2、Listeria weihenstephanensis(FSL R9-0317)C2c2、Listeriaceae bacterium(FSL M6-0635)C2c2、Listeria newyorkensis(FSL M6-0635)C2c2、Leptotrichia wadei(F0279)C2c2、Rhodobacter capsulatus(SB 1003)C2c2、Rhodobacter capsulatus(R121)C2c2、Rhodobacter capsulatus(DE442)C2c2、Leptotrichia wadei(Lw2)C2c2、またはListeria seeligeri C2c2のいずれかの野生型配列に基づく)。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるC2c2などのVI型タンパク質のホモログまたはオルソログは、野生型C2c2と少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列同一性を有する(例えば、Leptotrichia shahii C2c2、Lachnospiraceae bacterium MA2020 C2c2、Lachnospiraceae bacterium NK4A179 C2c2、Clostridium aminophilum(DSM 10710)C2c2、Carnobacterium gallinarum(DSM 4847)C2c2、Paludibacter propionicigenes(WB4)C2c2、Listeria weihenstephanensis(FSLR9-0317)C2c2、Listeriaceae bacterium(FSL M6-0635)C2c2、Listeria newyorkensis(FSL M6-0635)C2c2、Leptotrichia wadei(F0279)C2c2、Rhodobacter capsulatus(SB 1003)C2c2、Rhodobacter capsulatus(R121)C2c2、Rhodobacter capsulatus(DE442)C2c2、Leptotrichia wadei(Lw2)C2c2、またはListeria seeligeri C2c2のいずれかの野生型配列に基づいて)。
ある特定の他の例示的な実施形態では、CRISPR系のエフェクタータンパク質は、C2c2ヌクレアーゼである。C2c2の活性は、2つのHEPNドメインの存在に依存し得る。これらは、RNaseドメイン、すなわちヌクレアーゼ(特にエンドヌクレアーゼ)切断RNAであることが示されている。C2c2 HEPNは、DNA、または潜在的にDNA及び/もしくはRNAを標的にし得る。C2c2のHEPNドメインが少なくともRNAに結合し得、野生型の形態でRNAを切断し得ることに基づいて、C2c2エフェクタータンパク質がRNase機能を有することが好ましい。C2c2 CRISPR系に関しては、2016年6月17日に提出された米国仮出願62/351,662及び2016年8月17日に提出された米国仮出願62/376,377が参照される。また、2016年6月17日に提出された米国仮出願62/351,803も参照される。ブロード研究所番号10035.PA4及び代理人整理番号47627.03.2133が付与された、2016年12月8日に提出された米国仮出願「Novel Crispr Enzymes and Systems」も参照される。East-Seletsky et al.“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”Nature doi:10/1038/nature19802及びAbudayyeh et al.“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector”bioRxiv doi:10.1101/054742をさらに参照のこと。
CRISPR系におけるRNase機能は既知であり、例えば、特定のIII型CRISPR-Cas系についてmRNA標的化が報告されており(Hale et al.,2014,Genes Dev,vol.28,2432-2443、Hale et al.,2009,Cell,vol.139,945-956、Peng et al.,2015,Nucleic acid research,vol.43,406-417)及び重要な利点を提供する。Staphylococcus epidermis III-A型系では、標的間の転写により、Cas10-Csmリボ核タンパク質エフェクタータンパク質複合体内の独立した活性部位を介して、標的DNA及びその転写産物が切断される(Samai et al.,2015,Cell,vol.151,1164-1174を参照)。したがって、現在のエフェクタータンパク質を介してRNAを標的とするCRISPR-Cas系、組成物または方法が提供される。
一実施形態では、Casタンパク質は、限定するものではないが、Leptotrichia、Listeria、Corynebacter、Sutterella、Legionella、Treponema、Filifactor、Eubacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Mycoplasma、Bacteroides、Flaviivola、Flavobacterium、Sphaerochaeta、Azospirillum、Gluconacetobacter、Neisseria、Roseburia、Parvibaculum、Staphylococcus、Nitratifractor、Mycoplasma及びCampylobacterを含む属の生物体のC2c2オルソログであり得る。そのような属の生物の種は、本明細書において別に考察されるものであり得る。
CRISPR-Cas系酵素のオルソログを特定するいくつかの方法には、目的のゲノムのtracr配列を特定することが含まれる場合がある。tracr配列の識別は、以下のステップに関連し得る:CRISPR酵素を含むCRISPR領域を識別するために、データベースでダイレクトリピートまたはtracr mate配列を検索する。センス方向とアンチセンス方向の両方でCRISPR酵素に隣接するCRISPR領域で相同配列を検索する。転写ターミネーター及び二次構造を探す。ダイレクトリピートまたはtracr mate配列ではないが、ダイレクトリピートまたはtracrのメイト配列と50%を超える同一性を有する任意の配列を、潜在的なtracr配列として特定する。潜在的なtracr配列を取得し、それに関連付けられている転写ターミネーター配列を分析する。
本明細書に記載の機能のいずれかを、複数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素を含む、他のオルソログからのCRISPR酵素に操作し得ることが理解されるであろう。そのようなオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載されている。したがって、キメラ酵素は、限定するものではないが、Leptotrichia、Listeria、Corynebacter、Sutterella、Legionella、Treponema、Filifactor、Eubacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Mycoplasma、Bacteroides、Flaviivola、Flavobacterium、Sphaerochaeta、Azospirillum、Gluconacetobacter、Neisseria、Roseburia、Parvibaculum、Staphylococcus、Nitratifractor、Mycoplasma及びCampylobacterを含む生物体のCRISPR酵素オルソログの断片を含んでもよい。キメラ酵素は、第1の断片及び第2の断片を含んでもよく、これらの断片は、本明細書で述べた属の生物または本明細書で述べた属の生物体、または本明細書で述べた種の生物体のCRISPR酵素オルソログのものであり得、有利には、この断片は異なる種のCRISPR酵素オルソログ由来のものである。
実施形態では、本明細書で言及されるC2c2タンパク質は、C2c2の機能的バリアントまたはそのホモログもしくはオルソログも包含する。本明細書で使用されるタンパク質の「機能的バリアント」は、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持するそのようなタンパク質のバリアントを指す。機能的バリアントとしては、多形などを含む変異体(挿入、欠失、または置換変異体などであってもよい)が含まれ得る。このようなタンパク質と、通常は無関係の別の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの融合産物も機能的バリアントに含まれる。機能的バリアントは自然に発生する場合もあれば、人工的な場合もある。有利な実施形態は、操作された、または天然に存在しないVI型RNA標的化エフェクタータンパク質をさらに含んでもよい。
一実施形態では、C2c2またはそのオルソログもしくはホモログをコードする核酸分子(複数可)は、真核細胞における発現のためにコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書で考察したとおりであり得る。核酸分子(複数可)は、操作されたものであっても、または天然に存在しないものであってもよい。
一実施形態では、C2c2またはそのオルソログもしくはホモログは、1つ以上の変異をさらに含んでもよい(したがって、それをコードする核酸分子(複数可)は変異(複数可)を有し得る)。変異は、人為的に導入された変異であってもよく、限定するものではないが、触媒ドメインにおける1つ以上の変異を含み得る。Cas9酵素に関する触媒ドメインの例としては、限定するものではないが、RuvC I、RuvC II、RuvC III、及びHNHドメインが挙げられ得る。
ある実施形態では、C2c2またはそのオルソログもしくはホモログは、1つ以上の変異を含んでもよい。変異は、人為的に導入された変異であってもよく、限定するものではないが、触媒ドメインにおける1つ以上の突然変異を含んでもよい。Cas酵素に関する触媒ドメインの例としては、限定するものではないが、HEPNドメインが挙げられ得る。
ある実施形態では、C2c2またはそのオルソログもしくはホモログは、機能的ドメインに融合するかまたは作動可能に連結されている一般的な核酸結合タンパク質として使用され得る。例示的な機能的ドメインとしては、限定するものではないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳リプレッサー、ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ、スプライセオソーム、ビーズ、光誘導性/制御可能ドメインまたは化学的誘導/制御可能ドメインが挙げられ得る。
ある特定の例示的な実施形態では、C2c2エフェクタータンパク質は、以下からなる群より選択される生物に由来し得る;Leptotrichia、Listeria、Corynebacter、Sutterella、Legionella、Treponema、Filifactor、Eubacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Mycoplasma、Bacteroides、Flaviivola、Flavobacterium、Sphaerochaeta、Azospirillum、Gluconacetobacter、Neisseria、Roseburia、Parvibaculum、Staphylococcus、Nitratifractor、Mycoplasma、及びCampylobacter。
ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Listeria sp.C2c2p、好ましくはListeria seeligeriaのC2c2p、より好ましくはListeria seeligeria血清型1/2b strであってもよい。SLCC3954 C2c2p及びcrRNA配列は、長さが44~47ヌクレオチドであってもよく、5’29-ntのダイレクトリピート(DR)及び15nt~18ntのスペーサーがある。
ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Leptotrichia sp.のC2c2p、好ましくはLeptotrichia shahii C2c2p、より好ましくはLeptotrichia shahii DSM 19757 C2c2pであってもよく、及びcrRNA配列は、42~58ヌクレオチド長であってもよく、5’24-28-ntダイレクトリピート(DR)など少なくとも24ntの5’ダイレクトリピート、及び14nt~28ntのスペーサーなど少なくとも14ntのスペーサー、または19、20、21、22など以上のnt、例えば、18~28、19~28、20~28、21~28もしくは22~28ntなど少なくとも18ntのスペーサーを有する。
ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Leptotrichia sp.、Leptotrichia wadei F0279、またはListeria sp.、好ましくはListeria newyorkensis FSL M6-0635であってよい。
ある特定の例示的な実施形態では、本発明のC2c2エフェクタータンパク質としては、限定するものではないが、以下の21オルソログ種(例としては、複数のCRISPR遺伝子座)が挙げられる:Leptotrichia shahii、Leptotrichia wadei(Lw2)、Listeria seeligeri、Lachnospiraceae bacterium MA2020、Lachnospiraceae bacterium NK4A179、[Clostridium]aminophilum DSM 10710、Carnobacterium gallinarum DSM 4847、Carnobacterium gallinarum DSM 4847(第2CRISPR遺伝子座)、Paludibacter propionicigenes WB4、Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317、Listeriaceae bacterium FSL M6-0635、Leptotrichia wadei F0279、Rhodobacter capsulatus SB 1003、Rhodobacter capsulatus R121、Rhodobacter capsulatus DE442、Leptotrichia buccalis C-1013-b、Herbinix hemicellulosilytica、[Eubacterium]rectale、Eubacteriaceae bacterium CHKCI004、Blautia sp.Marseille-P2398、及びLeptotrichia sp.口腔分類群(oral taxon)879 str.F0557。12のさらなる非限定的な例は以下である:Lachnospiraceae bacterium NK4A144、Chloroflexus aggregans、Demequina aurantiaca、Thalassospira sp.TSL5-1、Pseudobutyrivibrio sp.OR37、Butyrivibrio sp.YAB3001、Blautia sp.Marseille-P2398、Leptotrichia sp.Marseille-P3007、Bacteroides ihuae、Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA、Listeria riparia、及びInsolitispirillum peregrinum。
特定の実施形態では、C2c2エフェクタータンパク質は、L.wadei F0279またはL.wadei F0279(Lw2)C2c2エフェクタータンパク質である。
ある特定の実施形態では、本発明によるC2c2タンパク質は、以下の表に記載されるようなオルソログの1つであるか、もしくはそれに由来するか、または以下の表に記載されるような2つ以上のオルソログのキメラタンパク質であるか、または以下の表に記載されている1つのオルソログの変異体もしくはバリアント(またはキメラ変異体もしくはバリアント)であり、異種/機能ドメインとの融合を伴う、または伴わない、本明細書のいずれか定義されている、デッド(dead)C2c2、スプリットC2c2、不安定化C2c2などを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、C2c2エフェクタータンパク質は、以下の表1から選択される。
上記の種の野性型タンパク質配列を下の表2に列挙する。ある特定の実施形態では、C2c2タンパク質をコードする核酸を示す。
本発明の実施形態では、Leptotrichia shahii C2c2、Lachnospiraceae bacterium MA2020 C2c2、Lachnospiraceae bacterium NK4A179 C2c2、Clostridium aminophilum(DSM 10710)C2c2、Carnobacterium gallinarum(DSM 4847)C2c2、Paludibacter propionicigenes(WB4)C2c2、Listeria weihenstephanensis(FSL R9-0317)C2c2、Listeriaceae bacterium(FSL M6-0635)C2c2、Listeria newyorkensis(FSL M6-0635)C2c2、Leptotrichia wadei(F0279)C2c2、Rhodobacter capsulatus(SB 1003)C2c2、Rhodobacter capsulatus(R121)C2c2、Rhodobacter capsulatus(DE442)C2c2、Leptotrichia wadei(Lw2)C2c2、またはListeria seeligeri C2c2のいずれかの野生型配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むエフェクタータンパク質が提供される
本発明の実施形態では、エフェクタータンパク質は、本明細書に記載のコンセンサス配列を含むがこれに限定されないVI型エフェクタータンパク質コンセンサス配列に対して少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、コンセンサス配列は、C2c2機能を媒介するC2c2オルソログ中の触媒残基及びHEPNモチーフを含むがこれらに限定されない、保存されたアミノ酸残基及びモチーフを位置決めするのを補助し得る、複数のC2c2オルソログから生成され得る。Geneiousアラインメントを使用して上記の33のオルソログから生成された、そのようなコンセンサス配列の1つは以下である:
MKISKVXXXVXKKXXXGKLXKXVNERNRXAKRLSNXLBKYIXXIDKIXKKEXXKKFXAXEEITLKLNQXXXBXLXKAXXDLRKDNXYSXJKKILHNEDINXEEXELLINDXLEKLXKIESXKYSYQKXXXNYXMSVQEHSKKSIXRIXESAKRNKEALDKFLKEYAXLDPRMEXLAKLRKLLELYFYFKNDXIXXEEEXNVXXHKXLKENHPDFVEXXXNKENAELNXYAIEXKKJLKYYFPXKXAKNSNDKIFEKQELKKXWIHQJENAVERILLXXGKVXYKLQXGYLAELWKIRINEIFIKYIXVGKAVAXFALRNXXKBENDILGGKIXKKLNGITSFXYEKIKAEEILQREXAVEVAFAANXLYAXDLXXIRXSILQFFGGASNWDXFLFFHFATSXISDKKWNAELIXXKKJGLVIREKLYSNNVAMFYSKDDLEKLLNXLXXFXLRASQVPSFKKVYVRXBFPQNLLKKFNDEKDDEAYSAXYYLLKEIYYNXFLPYFSANNXFFFXVKNLVLKANKDKFXXAFXDIREMNXGSPIEYLXXTQXNXXNEGRKKEEKEXDFIKFLLQIFXKGFDDYLKNNXXFILKFIPEPTEXIEIXXELQAWYIVGKFLNARKXNLLGXFXSYLKLLDDIELRALRNENIKYQSSNXEKEVLEXCLELIGLLSLDLNDYFBDEXDFAXYJGKXLDFEKKXMKDLAELXPYDQNDGENPIVNRNIXLAKKYGTLNLLEKJXDKVSEKEIKEYYELKKEIEEYXXKGEELHEEWXQXKNRVEXRDILEYXEELXGQIINYNXLXNKVLLYFQLGLHYLLLDILGRLVGYTGIWERDAXLYQIAAMYXNGLPEYIXXKKNDKYKDGQIVGXKINXFKXDKKXLYNAGLELFENXNEHKNIXIRNYIAHFNYLSKAESSLLXYSENLRXLFSYDRKLKNAVXKSLINILLRHGMVLKFKFGTDKKSVXIRSXKKIXHLKSIAKKLYYPEVXVSKEYCKLVKXLLKYK (配列番号325)
MKISKVXXXVXKKXXXGKLXKXVNERNRXAKRLSNXLBKYIXXIDKIXKKEXXKKFXAXEEITLKLNQXXXBXLXKAXXDLRKDNXYSXJKKILHNEDINXEEXELLINDXLEKLXKIESXKYSYQKXXXNYXMSVQEHSKKSIXRIXESAKRNKEALDKFLKEYAXLDPRMEXLAKLRKLLELYFYFKNDXIXXEEEXNVXXHKXLKENHPDFVEXXXNKENAELNXYAIEXKKJLKYYFPXKXAKNSNDKIFEKQELKKXWIHQJENAVERILLXXGKVXYKLQXGYLAELWKIRINEIFIKYIXVGKAVAXFALRNXXKBENDILGGKIXKKLNGITSFXYEKIKAEEILQREXAVEVAFAANXLYAXDLXXIRXSILQFFGGASNWDXFLFFHFATSXISDKKWNAELIXXKKJGLVIREKLYSNNVAMFYSKDDLEKLLNXLXXFXLRASQVPSFKKVYVRXBFPQNLLKKFNDEKDDEAYSAXYYLLKEIYYNXFLPYFSANNXFFFXVKNLVLKANKDKFXXAFXDIREMNXGSPIEYLXXTQXNXXNEGRKKEEKEXDFIKFLLQIFXKGFDDYLKNNXXFILKFIPEPTEXIEIXXELQAWYIVGKFLNARKXNLLGXFXSYLKLLDDIELRALRNENIKYQSSNXEKEVLEXCLELIGLLSLDLNDYFBDEXDFAXYJGKXLDFEKKXMKDLAELXPYDQNDGENPIVNRNIXLAKKYGTLNLLEKJXDKVSEKEIKEYYELKKEIEEYXXKGEELHEEWXQXKNRVEXRDILEYXEELXGQIINYNXLXNKVLLYFQLGLHYLLLDILGRLVGYTGIWERDAXLYQIAAMYXNGLPEYIXXKKNDKYKDGQIVGXKINXFKXDKKXLYNAGLELFENXNEHKNIXIRNYIAHFNYLSKAESSLLXYSENLRXLFSYDRKLKNAVXKSLINILLRHGMVLKFKFGTDKKSVXIRSXKKIXHLKSIAKKLYYPEVXVSKEYCKLVKXLLKYK (配列番号325)
別の非限定的な例では、コンセンサス配列の生成及び保存された残基の同定を支援するための配列アラインメントツールは、MUSCLEアラインメントツール(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)である。例えば、MUSCLEを使用すると、C2c2オルソログ間で保存されている次のアミノ酸位置を、Leptotrichia wadei C2c2において特定し得る:K2;K5;V6;E301;L331;I335;N341;G351;K352;E375;L392;L396;D403;F446;I466;I470;R474(HEPN);H475;H479(HEPN)、E508;P556;L561;I595;Y596;F600;Y669;I673;F681;L685;Y761;L676;L779;Y782;L836;D847;Y863;L869;I872;K879;I933;L954;I958;R961;Y965;E970;R971;D972;R1046(HEPN)、H1051(HEPN)、Y1075;D1076;K1078;K1080;I1083;I1090。
高度に保存された残基を示すHEPNドメインの例示的な配列アラインメントを、図50に示す。
ある特定の例示的な実施形態では、RNA標的化エフェクタータンパク質は、Cas13b及びグループ29またはグループ30タンパク質などのVI型-Bエフェクタータンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、RNA標的化エフェクタータンパク質は、1つ以上のHEPNドメインを含む。ある特定の例示的な実施形態では、RNA標的化エフェクタータンパク質は、C末端HEPNドメイン、N末端HEPNドメイン、またはその両方を含む。本発明の文脈において使用され得るVI型-Bエフェクタータンパク質の例に関して、「Novel CRISPR Enzymes and Systems」と題され、2016年10月21日に提出された米国特許出願第15/331,792号、「Novel CRISPR Enzymes and Systems」と題され、2016年10月21日出願の国際特許出願番号PCT/US2016/058302、及びSmargon et al.“Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28”Molecular Cell,65,1-13(2017);dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023,及び2017年3月15日出願の「Novel Cas13b Orthologues CRISPR Enzymes and System」と題された、譲渡される米国仮出願番号が参照される。具体的な実施形態では、Cas13b酵素は、Bergeyella zoohelcumに由来する。ある特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、表3に列挙されている任意の配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、Cas13bオルソログの野性型配列は、下の表4または5に見出される。
ある特定の例示的な実施形態では、RNA標的化エフェクタータンパク質は、2017年6月26日に出願された米国仮特許出願第62/525,165号、及び2017年8月16日に出願されたPCT出願番号US2017/047193に開示されているCas13cエフェクタータンパク質である。Cas13cの例示的な野生型オルソログ配列を以下の表6に示す。
特定の例示的な実施形態では、Cas13タンパク質は、以下のいずれかから選択され得る。
Cas12タンパク質
ある特定の例示的な実施形態では、アッセイは、複数のCas12オルソログまたは1つ以上のCas13オルソログと組み合わせた1つ以上のオルソログを含んでもよい。ある特定の例示的な実施形態では、Cas12オルソログは、Cpf1オルソログである。ある特定の他の例示的な実施形態では、Cas12オルソログは、C2c1オルソログである。
ある特定の例示的な実施形態では、アッセイは、複数のCas12オルソログまたは1つ以上のCas13オルソログと組み合わせた1つ以上のオルソログを含んでもよい。ある特定の例示的な実施形態では、Cas12オルソログは、Cpf1オルソログである。ある特定の他の例示的な実施形態では、Cas12オルソログは、C2c1オルソログである。
Cpf1オルソログ
本発明は、サブタイプV-Aとして示されるCpf1遺伝子座に由来するCpf1エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は、「Cpf1p」、例えば、Cpf1タンパク質とも呼ばれる(そしてそのようなエフェクタータンパク質またはCpf1タンパク質またはCpf1遺伝子座に由来するタンパク質は、「CRISPR酵素」とも呼ばれる)。現在、サブタイプV-A遺伝子座には、cas1、cas2、cpf1と呼ばれる別個の遺伝子、及びCRISPRアレイが含まれている。Cpf1(CRISPR関連タンパク質Cpf1、サブタイプPREFRAN)は、Cas9の対応するドメインと相同のRuvC様ヌクレアーゼドメインとともに、Cas9の特徴的なアルギニンリッチのクラスターの対応物を含む大きなタンパク質(約1300アミノ酸)である。ただし、Cpf1には、全てのCas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインがなく、RuvC様ドメインは、HNHドメインを含む長い挿入を含むCas9とは対照的に、Cpf1配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、CRISPR-Cas酵素は、RuvC様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
本発明は、サブタイプV-Aとして示されるCpf1遺伝子座に由来するCpf1エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は、「Cpf1p」、例えば、Cpf1タンパク質とも呼ばれる(そしてそのようなエフェクタータンパク質またはCpf1タンパク質またはCpf1遺伝子座に由来するタンパク質は、「CRISPR酵素」とも呼ばれる)。現在、サブタイプV-A遺伝子座には、cas1、cas2、cpf1と呼ばれる別個の遺伝子、及びCRISPRアレイが含まれている。Cpf1(CRISPR関連タンパク質Cpf1、サブタイプPREFRAN)は、Cas9の対応するドメインと相同のRuvC様ヌクレアーゼドメインとともに、Cas9の特徴的なアルギニンリッチのクラスターの対応物を含む大きなタンパク質(約1300アミノ酸)である。ただし、Cpf1には、全てのCas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインがなく、RuvC様ドメインは、HNHドメインを含む長い挿入を含むCas9とは対照的に、Cpf1配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、CRISPR-Cas酵素は、RuvC様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
RNA誘導型Cpf1のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。1つの実施形態では、Cpf1系は、RNAのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。別の実施形態では、Cpf1系は、ssDNAのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。したがって、操作されたCpf1系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作のプラットフォームを提供する。Cpf1は、哺乳類の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発された。Cpf1は、配列固有の標的DNA結合によって活性化されると、RNA及びssDNAのロバストなコラテラル切断が可能である。
「オルソログ」(本明細書では「オルソログ」とも呼ばれる)及び「ホモログ」(本明細書では「ホモログ」とも呼ばれる)という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによって、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連する。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する、異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリング(例えば、Greer,Science vol.228(1985)1055、及びBlundell et al.Eur J Biochem vol 172(1988),513を参照)または「structural BLAST」(Dey F,Cliff Zhang Q,Petrey D,Honig B.Toward a「structural BLAST」:using structural relationships to infer function.Protein Sci.2013Apr;22(4):359-66.doi:10.1002/pro.2225.)。CRISPR-Cas遺伝子座の分野での適用に関しては、Shmakov et al.(2015)も参照のこと。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ関連している。
Cpf1遺伝子は、いくつかの多様な細菌のゲノムに見られ、通常はcas1、cas2、及びcas4遺伝子とCRISPRカセット(例えば、Francisella cf.novicida Fx1のFNFX1_1431-FNFX1_1428)と同じ遺伝子座にある。したがって、この推定上の新規CRISPR-Cas系のレイアウトは、II型-Bのレイアウトに似ているようである。さらに、Cas9と同様に、Cpf1タンパク質には、トランスポゾンORF-Bと相同であり、かつ活性なRuvC様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びZnフィンガー(Cas9には存在しない)を含む、容易に識別可能なC末端領域が含まれている。ただし、Cas9とは異なり、Cpf1はまた、CRISPR-Cas状況のないいくつかのゲノムにも存在し、ORF-Bとの比較的高い類似性によって、それがトランスポゾン構成要素であり得ることが示唆される。これが本物のCRISPR-Cas系であり、Cpf1がCas9の機能的アナログである場合、それは新規なCRISPR-Casタイプ、すなわちV型であることが示唆された(Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.Makarova KS,Koonin EV.Methods Mol Biol.2015;1311:47-75を参照のこと)。しかし、本明細書に記載のとおり、Cpf1は、それを同一のドメイン構造は有さず、したがってサブタイプV-BにあるとされているC2c1pと区別するように、サブタイプV-Aにあるものとされている。
具体的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Streptococcus、Campylobacter、Nitratifractor、Staphylococcus、Parvibaculum、Roseburia、Neisseria、Gluconacetobacter、Azospirillum、Sphaerochaeta、Lactobacillus、Eubacterium、Corynebacter、Carnobacterium、Rhodobacter、Listeria、Paludibacter、Clostridium、Lachnospiraceae、Clostridiaridium、Leptotrichia、Francisella、Legionella、Alicyclobacillus、Methanomethyophilus、Porphyromonas、Prevotella、Bacteroidetes、Helcococcus、Leptospira、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacilus、MethylobacteriumまたはAcidaminococcusを含む属由来の生物体由来のCpf1エフェクタータンパク質である。
さらなる具体的な実施形態では、Cpf1エフェクタータンパク質は、S.mutans、S.agalactiae、S.equisimilis、S.sanguinis、S.pneumonia;C.jejuni、C.coli;N.salsuginis、N.tergarcus;S.auricularis、S.carnosus;N.meningitides、N.gonorrhoeae;L.monocytogenes、L.ivanovii;C.botulinum、C.difficile、C.tetani、C.sordelliiから選択される生物体由来である。
エフェクタータンパク質は、第1のエフェクタータンパク質(例えば、Cpf1)オルソログ由来の第1の断片、及び第2のエフェクター(例えば、Cpf1)タンパク質オルソログ由来の第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含み、この第1及び第2のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第1及び第2のエフェクタータンパク質(例えば、Cpf1)オルソログのうち少なくとも1つは、Streptococcus、Campylobacter、Nitratifractor、Staphylococcus、Parvibaculum、Roseburia、Neisseria、Gluconacetobacter、Azospirillum、Sphaerochaeta、Lactobacillus、Eubacterium、Corynebacter、Carnobacterium、Rhodobacter、Listeria、Paludibacter、Clostridium、Lachnospiraceae、Clostridiaridium、Leptotrichia、Francisella、Legionella、Alicyclobacillus、Methanomethyophilus、Porphyromonas、Prevotella、Bacteroidetes、Helcococcus、Letospira、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacilus、MethylobacteriumまたはAcidaminococcusを含む生物体由来のエフェクタータンパク質(例えば、Cpf1);例えば、第1及び第2の断片の各々が、Streptococcus、Campylobacter、Nitratifractor、Staphylococcus、Parvibaculum、Roseburia、Neisseria、Gluconacetobacter、Azospirillum、Sphaerochaeta、Lactobacillus、Eubacterium、Corynebacter、Carnobacterium、Rhodobacter、Listeria、Paludibacter、Clostridium、Lachnospiraceae、Clostridiaridium、Leptotrichia、Francisella、Legionella、Alicyclobacillus、Methanomethyophilus、Porphyromonas、Prevotella、Bacteroidetes、Helcococcus、Letospira、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacilus、MethylobacteriumまたはAcidaminococcusを含む生物体のCpf1から選択される、第1の断片及び第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここでこの第1及び第2の断片が、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質;例えば、第1の断片及び第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここでこの第1及び第2の断片が、S.mutans、S.agalactiae、S.equisimilis、S.sanguinis、S.pneumonia;C.jejuni、C.coli;N.salsuginis、N.tergarcus;S.auricularis、S.carnosus;N.meningitides、N.gonorrhoeae;L.monocytogenes、L.ivanovii;C.botulinum、C.difficile、C.tetani、C.sordellii;Francisella tularensis 1、Prevotella albensis、Lachnospiraceae bacterium MC2017 1、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10、Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17、Smithella sp.SCADC、Acidaminococcus sp.BV3L6、Lachnospiraceae bacterium MA2020、Candidatus Methanoplasma termitum、Eubacterium eligens、Moraxella bovoculi 237、Leptospira inadai、Lachnospiraceae bacterium ND2006、Porphyromonas crevioricanis 3、Prevotella disiens及びPorphyromonas macacaeのCpf1から選択され、この第1及び第2の断片が、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質を含んでもよい。
さらに好ましい実施形態では、Cpf1pは、Francisella tularensis 1、Prevotella albensis、Lachnospiraceae bacterium MC2017 1、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10、Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17、Smithella sp.SCADC、Acidaminococcus sp.BV3L6、Lachnospiraceae bacterium MA2020、Candidatus Methanoplasma termitum、Eubacterium eligens、Moraxella bovoculi 237、Leptospira inadai、Lachnospiraceae bacterium ND2006、Porphyromonas crevioricanis 3、Prevotella disiens及びPorphyromonas macacaeから選択される細菌種由来である。ある特定の実施形態では、Cpf1pは、Acidaminococcus sp.BV3L6、Lachnospiraceae bacterium MA2020から選択される細菌種由来である。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、限定するものではないが、Francisella tularensis subsp.Navicidaを含むFrancisella tularensis 1の亜種由来である。
いくつかの実施形態では、Cpf1pは、Eubacteriumの属由来の生物体由来である。いくつかの実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、Eubacterium rectaleの細菌種由来の生物体由来のCpf1タンパク質である。いくつかの実施形態では、Cpf1エフェクタータンパク質のアミノ酸配列は、NCBI Reference Sequence WP_055225123.1、NCBI Reference Sequence WP_055237260.1、NCBI Reference Sequence WP_055272206.1、またはGenBank ID OLA16049.1に相当する。いくつかの実施形態では、Cpf1エフェクタータンパク質は、NCBI Reference Sequence WP_055225123.1、NCBI Reference Sequence WP_055237260.1、NCBI Reference Sequence WP_055272206.1、またはGenBank ID OLA16049.1と、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70、例えば、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%という配列相動性または配列同一性を有する。当業者は、これが配列同一性が短縮型の長さにわたって決定される短縮型のCpf1タンパク質を含むことを理解する。いくつかの実施形態では、Cpf1エフェクターは、TTTNまたはCTTNのPAM配列を認識する。
具体的な実施形態では、本明細書で言及されるCpf1の相同体またはオルソログは、Cpf1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるCpf1のホモログまたはオルソログは、野性型Cpf1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%などの配列同一性を有する。Cpf1が1つ以上の変異を有する(変異した)場合、本明細書で言及される上記Cpf1のホモログまたはオルソログは、変異したCpf1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列同一性を有する。
一実施形態では、Cpf1タンパク質は、Acidaminococcus sp、Lachnospiraceae bacteriumまたはMoraxella bovoculiを含むがこれらに限定されない属の生物体のオルソログであり得る。具体的な実施形態では、V型Casタンパク質は、Acidaminococcus sp.BV3L6;Lachnospiraceae bacterium ND2006(LbCpf1)またはMoraxella bovoculi 237を含むがこれに限定されない種の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、本明細書で言及されるCpfのホモログまたはオルソログは、本明細書に開示されるCpf1配列の1つ以上と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるCpfのホモログまたはオルソログは、異性型FnCpf1、AsCpf1、またはLbCpf1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%などの配列同一性を有する。
具体的な実施形態では、本発明のCpf1タンパク質は、FnCpf1、AsCpf1、またはLbCpf1と、少なくとも60%、より具体的には少なくとも70、例えば少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるCpf1タンパク質は、野生型のAsCpf1またはLbCpf1と少なくとも60%、例えば少なくとも70%、より具体的には少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列同一性を有する。具体的な実施形態では、本発明のCpf1タンパク質は、FnCpf1と60%未満の配列同一性を有する。当業者は、これがCpf1タンパク質の切断型を含み、それにより配列同一性が切断型の長さにわたって決定されることを理解するであろう。
以下のうちの特定のものでは、Cpf1アミノ酸の後に、核局在化シグナル(NLS)(斜体字)、グリシン-セリン(GS)リンカー、及び3xHAタグが続く。1-Franscisella tularensis subsp.novicida U112(FnCpf1)(配列番号281);3-Lachnospiraceae bacterium MC2017(Lb3Cpf1)(配列番号282);4-Butyrivibrio proteoclasticus(BpCpf1)(配列番号283);5-Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10(PeCpf1)(配列番号284);6-Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17(PbCpf1)(配列番号285);7-Smithella sp.SC_K08D17(SsCpf1)(配列番号286);8-Acidaminococcus sp.BV3L6(AsCpf1)(配列番号287);9-Lachnospiraceae bacterium MA2020(Lb2Cpf1)(配列番号288);10-Candidatus Methanoplasma termitum(CMtCpf1)(配列番号289);11-Eubacterium eligens(EeCpf1)(配列番号290);12-Moraxella bovoculi 237(MbCpf1)(配列番号291);13-Leptospira inadai(LiCpf1)(配列番号292);14-Lachnospiraceae bacterium ND2006(LbCpf1)(配列番号293);15-Porphyromonas crevioricanis(PcCpf1)(配列番号294);16-Prevotella disiens(PdCpf1)(配列番号295);17-Porphyromonas macacae(PmCpf1)(配列番号296);18-Thiomicrospira sp.XS5(TsCpf1)(配列番号297);19-Moraxella bovoculi AAX08_00205(Mb2Cpf1)(配列番号298);20-Moraxella bovoculi AAX11_00205(Mb3Cpf1)(配列番号299);及び21-Butyrivibrio sp.NC3005(BsCpf1)(配列番号300)が続く。
さらなるCpf1オルソログとしては、NCBI WP_055225123.1、NCBI WP_055237260.1、NCBI WP_055272206.1、及びGenBank OLA16049.1が挙げられる。
C2c1オルソログ
本発明は、サブタイプV-Bとして示されるC2c1遺伝子座に由来するC2c1エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は「C2c1p」とも呼ばれ、例えばC2c1タンパク質である(そしてそのようなエフェクタータンパク質またはC2c1タンパク質またはC2c1遺伝子座に由来するタンパク質は「CRISPR酵素」とも呼ばれる)。現在、サブタイプV-B遺伝子座には、cas1-Cas4融合、cas2、C2c1と呼ばれる別個の遺伝子、及びCRISPRアレイが含まれている。C2c1(CRISPR関連タンパク質C2c1)は、Cas9の対応するドメインと相同のRuvC様ヌクレアーゼドメインとともに、Cas9の特徴的なアルギニンリッチなクラスターの対応物を含む大きなタンパク質(約1100~1300アミノ酸)である。ただし、C2c1には全てのCas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインがなく、RuvC様ドメインは、HNHドメインを含む長い挿入を含むCas9とは対照的に、C2c1配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、CRISPR-Cas酵素は、RuvC様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
本発明は、サブタイプV-Bとして示されるC2c1遺伝子座に由来するC2c1エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は「C2c1p」とも呼ばれ、例えばC2c1タンパク質である(そしてそのようなエフェクタータンパク質またはC2c1タンパク質またはC2c1遺伝子座に由来するタンパク質は「CRISPR酵素」とも呼ばれる)。現在、サブタイプV-B遺伝子座には、cas1-Cas4融合、cas2、C2c1と呼ばれる別個の遺伝子、及びCRISPRアレイが含まれている。C2c1(CRISPR関連タンパク質C2c1)は、Cas9の対応するドメインと相同のRuvC様ヌクレアーゼドメインとともに、Cas9の特徴的なアルギニンリッチなクラスターの対応物を含む大きなタンパク質(約1100~1300アミノ酸)である。ただし、C2c1には全てのCas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインがなく、RuvC様ドメインは、HNHドメインを含む長い挿入を含むCas9とは対照的に、C2c1配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、CRISPR-Cas酵素は、RuvC様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
C2c1(Cas12bとしても知られる)タンパク質は、RNA誘導ヌクレアーゼである。その切断は、tracr RNAに依存して、ガイド配列及びダイレクトリピートを含むガイドRNAを動員し、このガイド配列は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、DNA/RNAヘテロ二本鎖を形成する。現在の研究に基づくと、C2c1ヌクレアーゼ活性は、PAM配列の認識も必要とし、それに依存する。C2c1 PAM配列は、Tリッチな配列である。いくつかの実施形態では、PAM配列は、5’TTN3’または5’ATTN3’であり、Nは任意のヌクレオチドである。具体的な実施形態では、PAM配列は5’TTC3’である。具体的な実施形態では、PAMは、Plasmodium falciparumの配列にある。
C2c1は、5’オーバーハングまたは標的配列のPAM遠位側の「スティッキーエンド」で、標的遺伝子座に互い違いのカットを作成する。いくつかの実施形態では、5’オーバーハングは7ntである。Lewis and Ke、Mol Cell.2017Feb2;65(3):377-379を参照のこと。
本発明は、C2c1(V型-B;Cas12b)エフェクタータンパク質及びオルソログを提供する。「オルソログ」(orthologue)(本明細書では「オルソログ」(ortholog)とも呼ばれる)及び「ホモログ」(homologue)(本明細書では「ホモログ」(homolog)とも呼ばれる)という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによって、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連する。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」とは、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。ホモログ及びオルソログは、ホモロジーモデリングによって特定され得る(例えば、Greer,Science vol.228(1985)1055、及びBlundell et al.Eur J Biochem vol 172(1988),513を参照のこと)または「structural BLAST」(Dey F、Cliff Zhang Q、Petrey D、Honig B.Toward a“structural BLAST”:using structural relationships to infer function.Protein Sci.2013 Apr;22(4):359-66.doi:10.1002/pro.2225.を参照のこと)。CRISPR-Cas遺伝子座の分野での適用に関しては、Shmakov et al(2015)も参照のこと。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。
C2c1遺伝子は、典型的にはcas1、cas2、及びcas4遺伝子ならびにCRISPRカセットを有する同じ遺伝子座において、いくつかの多様な細菌ゲノムに見られる。したがって、この推定上の新規CRISPR-Cas系のレイアウトは、II型-Bのレイアウトに似ているようである。さらに、Cas9と同様に、C2c1タンパク質には、活性なRuvC様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びZnフィンガー(Cas9にはない)が含まれている。
具体的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Alicyclobacillus、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacillus、Candidatus、Desulfatirhabdium、Citrobacter、Elusimicrobia、Methylobacterium、Omnitrophica、Phycisphaerae、Planctomycetes、Spirochaetes、及びVerrucomicrobiaceaeを含む属に由来する生物体に由来するC2c1エフェクタータンパク質である。
さらなる具体的な実施形態では、C2c1エフェクタータンパク質は、Alicyclobacillus acidoterrestris(例えば、ATCC 49025)、Alicyclobacillus contaminans(例えば、DSM 17975)、Alicyclobacillus macrosporangiidus(例えば、DSM 17980)、Bacillus hisashii株C4、Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2、Desulfovibrio inopinatus(例えば、DSM 10711)、Desulfonatronum thiodismutans(例えば、株MLF-1)、Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12、Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2、Opitutaceae bacterium TAV5、Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1、Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10、Spirochaetes bacterium GWB1_27_13、Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429、Tuberibacillus calidus(例えば、DSM 17572)、Bacillus thermoamylovorans(例えば、株B4166)、Brevibacillus sp.CF112、Bacillus sp.NSP2.1、Desulfatirhabdium butyrativorans(例えば、DSM 18734)、Alicyclobacillus herbarius(例えば、DSM 13609)、Citrobacter freundii(例えば、ATCC 8090)、Brevibacillus agri(例えば、BAB-2500)、Methylobacterium nodulans(例えば、ORS 2060)から選択される種に由来する。
エフェクタータンパク質は、第1のエフェクタータンパク質(例えば、C2c1)オルソログ由来の第1の断片及び第2のエフェクター(例えば、C2c1)タンパク質オルソログ由来の第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含み得、ここでこの第1及び第2のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第1及び第2のエフェクタータンパク質(例えば、C2c1)オルソログの少なくとも1つは、Alicyclobacillus、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacillus、Candidatus、Desulfatirhabdium、Elusimicrobia、Citrobacter、Methylobacterium、Omnitrophicai、Phycisphaerae、Planctomycetes、Spirochaetes、and Verrucomicrobiaceaeを含む生物体由来のエフェクタータンパク質(例えば、C2c1)、例えば、第1の断片及び第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、この第1及び第2の断片の各々は、Alicyclobacillus、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacillus、Candidatus、Desulfatirhabdium、Elusimicrobia、Citrobacter、Methylobacterium、Omnitrophicai、Phycisphaerae、Planctomycetes、Spirochaetes、及びVerrucomicrobiaceaeを含む生物体のC2c1から選択され、ここでこの第1及び第2の断片は、同じ細菌由来ではない、エフェクタータンパク質、例えば、第1の断片及び第2の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、この第1及び第2の断片の各々は、Alicyclobacillus acidoterrestris(例えば、ATCC 49025)、Alicyclobacillus contaminans(例えば、DSM 17975)、Alicyclobacillus macrosporangiidus(例えば、DSM 17980)、Bacillus hisashii株C4、Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2、Desulfovibrio inopinatus(例えば、DSM 10711)、Desulfonatronum thiodismutans(例えば、株MLF-1)、Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12、Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2、Opitutaceae bacterium TAV5、Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1、Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10、Spirochaetes bacterium GWB1_27_13、Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429、Tuberibacillus calidus(例えば、DSM 17572)、Bacillus thermoamylovorans(例えば、株B4166)、Brevibacillus sp.CF112、Bacillus sp.NSP2.1、Desulfatirhabdium butyrativorans(例えば、DSM 18734)、Alicyclobacillus herbarius(例えば、DSM 13609)、Citrobacter freundii(例えば、ATCC 8090)、Brevibacillus agri(例えば、BAB-2500)、Methylobacterium nodulans(例えば、ORS 2060)のC2c1から選択され、ここでこの第1及び第2の断片は、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質を含んでもよい。
より好ましい実施形態では、C2c1pは、Alicyclobacillus acidoterrestris(例えば、ATCC 49025)、Alicyclobacillus contaminans(例えば、DSM 17975)、Alicyclobacillus macrosporangiidus(例えば、DSM 17980)、Bacillus hisashii株C4、Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2、Desulfovibrio inopinatus(例えば、DSM 10711)、Desulfonatronum thiodismutans(例えば、株MLF-1)、Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12、Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2、Opitutaceae bacterium TAV5、Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1、Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10、Spirochaetes bacterium GWB1_27_13、Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429、Tuberibacillus calidus(例えば、DSM 17572)、Bacillus thermoamylovorans(例えば、株B4166)、Brevibacillus sp.CF112、Bacillus sp.NSP2.1、Desulfatirhabdium butyrativorans(例えば、DSM 18734)、Alicyclobacillus herbarius(例えば、DSM 13609)、Citrobacter freundii(例えば、ATCC 8090)、Brevibacillus agri(例えば、BAB-2500)、Methylobacterium nodulans(例えば、ORS 2060).ある特定の実施形態では、Alicyclobacillus acidoterrestris(例えば、ATCC 49025)、Alicyclobacillus contaminans(例えば、DSM 17975)から選択される細菌種に由来する。
具体的な実施形態では、本明細書で言及されるC2c1のホモログまたはオルソログは、C2c1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるC2c1のホモログまたはオルソログは、例えば、野生型C2c1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列同一性を有する。C2c1が1つ以上の変異を有する(変異した)場合、本明細書で言及される上記C2c1の相同体またはオルソログは、変異したC2c1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%の、例えば、少なくとも95%などの配列同一性を有する。
一実施形態では、C2c1タンパク質は、限定するものではないが、Alicyclobacillus、Desulfovibrio、Desulfonatronum、Opitutaceae、Tuberibacillus、Bacillus、Brevibacillus、Candidatus、Desulfatirhabdium、Elusimicrobia、Citrobacter、Methylobacterium、Omnitrophicai、Phycisphaerae、Planctomycetes、Spirochaetes、及びVerrucomicrobiaceaeを含む属の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、V型Casタンパク質は、限定するものではないが、Alicyclobacillus acidoterrestris(例えば、ATCC 49025)、Alicyclobacillus contaminans(例えば、DSM 17975)、Alicyclobacillus macrosporangiidus(例えば、DSM 17980)、Bacillus hisashii株C4、Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2、Desulfovibrio inopinatus(例えば、DSM 10711)、Desulfonatronum thiodismutans(例えば、株MLF-1)、Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12、Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2、Opitutaceae bacterium TAV5、Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1、Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10、Spirochaetes bacterium GWB1_27_13、Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429、Tuberibacillus calidus(例えば、DSM 17572)、Bacillus thermoamylovorans(例えば、株B4166)、Brevibacillus sp.CF112、Bacillus sp.NSP2.1、Desulfatirhabdium butyrativorans(例えば、DSM 18734)、Alicyclobacillus herbarius(例えば、DSM 13609)、Citrobacter freundii(例えば、ATCC 8090)、Brevibacillus agri(例えば、BAB-2500)、Methylobacterium nodulans(例えば、ORS 2060)を含む種の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、本明細書で言及されるC2c1のホモログまたはオルソログは、本明細書に開示される1つ以上のC2c1配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるC2c1のホモログまたはオルソログは、野生型AacC2c1またはBthC2c1と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列同一性を有する。
具体的な実施形態では、本発明のC2c1タンパク質は、AacC2c1またはBthC2c1と、少なくとも60%、より具体的には少なくとも70、例えば少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えば、少なくとも95%などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるC2c1タンパク質は、野生型AacC2c1と、少なくとも60%、例えば少なくとも70%、より具体的には少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、例えばでは少なくとも95%などの配列同一性を有する。具体的な実施形態では、本発明のC2c1タンパク質は、AacC2c1と60%未満の配列同一性を有する。当業者は、これがC2c1タンパク質の切断形態を含み、それにより配列同一性が切断形態の長さにわたって決定されることを理解するであろう。
本発明による、ある特定の方法では、CRISPR-Casタンパク質は、変異したCRISPR-Casタンパク質が、標的配列を含む標的遺伝子座の一方または両方のDNA鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異されることが好ましい。特定の実施形態では、C2c1タンパク質の1つ以上の触媒ドメインを変異させて、標的配列の1つのDNA鎖のみを切断する変異Casタンパク質を生成する。
特定の実施形態では、CRISPR-Casタンパク質は、変異したCRISPR-Casタンパク質が実質的に全てのDNA切断活性を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異され得る。いくつかの実施形態では、CRISPR-Casタンパク質は、変異酵素の切断活性が、酵素の非変異型の核酸切断活性の約25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%以下である場合、全てのDNA及び/またはRNA切断活性を実質的に欠いていると見なされ得る;一例は、変異形態の核酸切断活性が、非変異形態と比較してゼロまたは無視できる場合であり得る。
本明細書で提供される方法の、ある特定の実施形態では、CRISPR-Casタンパク質は、1つのDNA鎖のみを切断する変異したCRISPR-Casタンパク質、すなわち、ニッカーゼである。より具体的には、本発明の文脈において、ニッカーゼは、非標的配列、すなわち、標的配列の反対のDNA鎖上にあり、PAM配列の3’にある配列内の切断を確実にする。さらなるガイダンスによって、そして限定するものではないが、Alicyclobacillus acidoterrestrisからのC2c1のNucドメインのアルギニンからアラニンへの置換(R911A)は、両方の鎖をニッカーゼに切断するヌクレアーゼからC2c1をニッカーゼに変換する(一本鎖を切断する)。酵素がAacC2c1ではない場合、対応する位置の残基に変異を生じさせ得ることは、当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、C2c1タンパク質は、RuvCドメインに変異を含む触媒的に不活性なC2c1である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なC2c1タンパク質は、Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1におけるアミノ酸位置D570、E848、またはD977に対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なC2c1タンパク質は、Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1におけるD570A、E848A、またはD977Aに対応する変異を含む。
RNA誘導C2c1のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。1つの実施形態では、C2c1系は、RNAのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。別の実施形態では、C2c1系は、ssDNAのコラテラル非特異的切断を提供し、利用するように操作される。したがって、操作されたC2c1系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作、ならびに細胞死の誘導のためのプラットフォームを提供する。C2c1は、哺乳動物の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発された。C2c1は、配列固有の標的DNA結合によって活性化されると、RNA及びssDNAのロバストなコラテラル切断が可能である。
ある特定の実施形態では、C2c1は、インビトロ系または細胞において、一時的または安定的に提供または発現され、細胞核酸を非特異的に切断するように標的化または誘発される。一実施形態では、C2c1は、ssDNA、例えばウイルスのssDNAをノックダウンするように操作される。別の実施形態では、C2c1は、RNAをノックダウンするように操作される。系は、ノックダウンが細胞またはインビトロの系に存在する標的DNAに依存するように、またはこの系もしくは細胞への標的核酸の添加によって誘発されるように考案され得る。
一実施形態では、C2c1系は、例えば異常なDNAの切断が不完全または効果的でない可能性がある場合に、異常なDNA配列の存在によって識別可能な細胞のサブセットにおいてRNAを非特異的に切断するように操作される。非限定的な一例では、がん細胞に存在し、細胞形質転換を駆動するDNA転座が標的とされる。染色体DNA及び修復を受ける細胞の小集団は、生き残る可能性があるが、非特異的なコラテラルリボヌクレアーゼ活性は、有利に、存在し得る生存細胞の細胞死をもたらす。
コラテラル活性は、多くの臨床診断に有用なSHERLOCKと呼ばれる高感度でかつ特異的な核酸検出プラットフォームについて近年活用された(Gootenberg,J.S.et al.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science356,438-442(2017))。
本発明によれば、操作されたC2c1系は、DNAまたはRNAエンドヌクレアーゼ活性のために最適化され、哺乳動物細胞で発現され、細胞内のレポーター分子または転写物を効果的にノックダウンするように標的化され得る。
2.ガイドRNA
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」、「crRNA」「ガイドRNA」または「シングルガイドRNA」または「gRNA」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズして、ガイド配列及びCRISPRエフェクタータンパク質を含むRNA標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を差し向けるように、標的核酸配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。いくつかの例示的な実施形態では、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;available at www.novocraft.com)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)が挙げられる。核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くための(核酸標的化ガイドRNA内の)ガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化CRISPR系の構成要素は、核酸標的化複合体の成分をコードするベクターを用いてトランスフェクションなどによって、続いて、本明細書に記載のSurveyorアアッセイなどによる、標的核酸配列内の優先的標的化(例えば、切断)の評価によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験されるガイド配列及びその試験ガイドとは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の構成要素を、を提供すること、ならびに試験と対照のガイドの配列の反応の間の標的配列での結合または切断率の比較により試験管内で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするために、ガイド配列、したがって核酸標的ガイドを選択してもよい。標的配列はDNAであってもよい。標的配列は、任意のRNA配列であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーRNA(mRNA)、プレmRNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長非コードRNA(lncRNA)、及び低分子細胞質RNA(scRNA)からなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA、プレmRNA、及びrRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ncRNA及びlncRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列であってもよい。
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」、「crRNA」「ガイドRNA」または「シングルガイドRNA」または「gRNA」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズして、ガイド配列及びCRISPRエフェクタータンパク質を含むRNA標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を差し向けるように、標的核酸配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。いくつかの例示的な実施形態では、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;available at www.novocraft.com)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)が挙げられる。核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くための(核酸標的化ガイドRNA内の)ガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化CRISPR系の構成要素は、核酸標的化複合体の成分をコードするベクターを用いてトランスフェクションなどによって、続いて、本明細書に記載のSurveyorアアッセイなどによる、標的核酸配列内の優先的標的化(例えば、切断)の評価によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験されるガイド配列及びその試験ガイドとは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の構成要素を、を提供すること、ならびに試験と対照のガイドの配列の反応の間の標的配列での結合または切断率の比較により試験管内で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするために、ガイド配列、したがって核酸標的ガイドを選択してもよい。標的配列はDNAであってもよい。標的配列は、任意のRNA配列であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーRNA(mRNA)、プレmRNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長非コードRNA(lncRNA)、及び低分子細胞質RNA(scRNA)からなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA、プレmRNA、及びrRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ncRNA及びlncRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドは、核酸標的化ガイド内の二次構造の程度を低減するように選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約75%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約25%以下、約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約1%以下、またはそれ未満の%である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの1つの例は、mFoldであり、mFoldは、Zuker and Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーRNAfoldであり、これは、Institute for Theoretical Chemistry at the University of Viennaで開発されたものである(例えば、A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24、及びPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62を参照のこと)。
特定の実施形態では、ガイドRNAまたはcrRNAは、ダイレクトリピート(DR)配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。ある特定の実施形態では、ガイドRNAまたはcrRNAは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流(すなわち5’)に位置してもよい。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流(すなわち、3’)に位置してもよい。
ある特定の実施形態では、crRNAは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、15~35ntである。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、少なくとも15ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサー長は、15~17nt、例えば15、16、または17nt、17~20nt、例えば17、18、19、または20nt、20~24nt、例えば20、21、22、23、または24nt、23~25nt、例えば23、24、または25nt、24~27nt、例えば24、25、26、または27nt、27~30nt、例えば27、28、29、または30nt、30~35nt、例えば30、31、32、33、34、または35nt、あるいは35nt、またはそれ以上である。
一般に、CRISPR-Cas、CRISPR-Cas9またはCRISPR系とは、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)などの前述の文書で使用されているものであり、Cas遺伝子をコードする配列、特にCRISPR-Cas9の場合はCas9遺伝子、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えば、tracrRNAまたは活性部分tracrRNA)をコードする配列、tracr-mate配列(内因性CRISPR系の状況で「ダイレクトリピート」及びtracrRNAで処理された部分的なダイレクトリピートを含む)、ガイド配列(内因性CRISPR系の状況で「スペーサー」とも呼ばれる)、またはその用語が本明細書で使用される「RNA(複数可)」(例えば、Cas9をガイドするRNA(複数可)、例えばCRISPR RNA及びトランス活性化(tracr)RNAまたはシングルガイドRNA(sgRNA)(キメラRNA))またはCRISPR遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を総称的に指す。一般に、CRISPR系は、標的配列の部位でCRISPR複合体の形成を促進する要素(内因性CRISPR系の状況ではプロトスペーサーとも呼ばれる)によって特徴付けられる。CRISPR複合体の形成の状況において、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。標的配列への相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と呼ばれる。標的配列は、DNAまたはRNAポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、オルガネラ、小胞、リポソームまたは粒子の中またはそれに由来する核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、特に非核用途の場合、NLSは好ましくない。いくつかの実施形態では、CRISPR系は、1つ以上の核輸出シグナル(NES)を含む。いくつかの実施形態では、CRISPR系は、1つ以上のNLS及び1つ以上のNESを含む。いくつかの実施形態では、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを検索することにより、インシリコでダイレクトリピートを同定し得る:1.II型CRISPR遺伝子座に隣接するゲノム配列の2Kbのウィンドウで見られる;2.20~50bpの範囲;及び3.20~50bpの間隔。いくつかの実施形態では、これらの基準のうちの2つ、例えば1と2、2と3、または1と3を使用し得る。いくつかの実施形態では、3つ全ての基準を使用してもよい。
本発明の実施形態では、ガイド配列という用語及びガイドRNAという用語、すなわちCasを標的ゲノム遺伝子座にガイドし得るRNAは、WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)などの前述の引用文献のように交換可能に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指示すために、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列される場合、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列のアラインメントに適した任意のアルゴリズムを使用して決定され得る。その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comで入手可能)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)が挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、またはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド長未満である。好ましくは、ガイド配列は、10~30ヌクレオチド長である。CRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を指示すガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成要素は、CRISPR配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、続いて、本明細書に記載のSurveyorアッセイなどによる、標的配列内の優先的切断の評価などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むCRISPR複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験と対照ガイド配列反応の間の標的配列での結合または切断速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
CRISPR-Cas系のいくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、または100%またはそれ以上であってもよく;ガイドまたはRNAまたはsgRNAは、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75より多い、またはそれより多いのヌクレオチド長であってもよく;あるいは、ガイドまたはRNAまたはsgRNAは、長さが約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12より少ない、またはそれ未満のヌクレオチド長であってもよく;有利には、tracr RNAは、30または50ヌクレオチド長である。しかし、本発明のある態様は、オフ標的相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイドを低減することである。実際、この実施例では、本発明は、CRISPR-Cas系が80%を超えて約95%までの相補性、例えば83%~84%または88~89%または94~95%の相補性を有する、標的配列とオフ標的配列との間を区別し得る変異(例えば、18ヌクレオチドを有する標的と、1、2または3つのミスマッチを有する18ヌクレオチドのオフ標的を区別する)を含むことが示されている。したがって、本発明の状況では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、94.5%または95%または95.5%または96%または96.5%または97%または97.5%または98%または98.5%または99%または99.5%または99.9%、または100%より大きい。オフ標的は、配列とガイドとの間の100%または99.9%または99.5%または99%または99%または98.5%または98%または97.5%または97%または96.5%または96%または95.5%または95%または94.5%または94%または93%または92%または91%または90%または89%または88%または87%または86%または85%または84%または83%または82%または81%または80%未満の相補性であり、オフ標的が配列とガイドとの間で100%または99.9%または99.5%または99%または99%または98.5%または98%または97.5%または97%または96.5%または96%または95.5%または95%または94.5%の相補性であることが有利である。
ガイド改変
あるある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然には存在しない核酸、及び/または天然には存在しないヌクレオチド、及び/またはヌクレオチドアナログ、及び/または化学的改変を含む。天然には存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド、及び天然には存在しないヌクレオチドの混合物が挙げられ得る。天然には存在しないヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び/または塩基部分で改変され得る。本発明のある1つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の1つでは、ガイドは、1つ以上のリボヌクレオチド及び1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、1つ以上の天然には存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合、ボラノリン酸連結、リボース環の2’と4’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、または架橋型核酸(BNA)を有するヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、2’-O-メチルアナログ、2’-デオキシアナログ、2-チオウリジンアナログ、N6-メチルアデノシンアナログ、または2’-フルオロアナログが挙げられる。改変塩基のさらなる例としては、限定するものではないが、2-アミノプリン、5-ブロモ-ウリジン、シュードウリジン(Ψ)、N1-メチルシュードウリジン(me1Ψ)、5-メトキシウリジン(5moU)、イノシン、7-メチルグアノシンが挙げられる。ガイドRNAの化学改変の例としては、限定するものではないが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、ホスホロチオエート(PS)、S-拘束エチル(cEt)、または2’-O-メチル-3’-チオPACE(MSP)を1つ以上の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドは、オン標的特異性とオフ標的特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性の向上、及び活性の増大を含み得る(2015年6月29日にオンラインで公開されたHendel,2015,Nat Biotechnol.33(9):985-9,doi:10.1038/nbt.3290、Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111、Allerson et al.,J.Med.Chem.2005,48:901-904、Bramsen et al.,Front.Genet.,2012,3:154、Deng et al.,PNAS,2015,112:11870-11875、Sharma et al.,MedChemComm.,2014,5:1454-1471、Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989、Li et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1,0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066を参照のこと)。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの5’末端及び/または3’末端は、さまざまな機能性部分によって改変され、こうした機能性部分としては、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる(Kelly et al.,2016,J.Biotech.233:74-83を参照のこと)。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的DNAに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Cas9、Cpf1、またはC2c1に結合する領域に1つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある1つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、限定されないが、5’及び/または3’末端、ステムループ領域及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の5’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の5’ハンドルを化学的に改変すると、ガイドの機能が消失し得る(Li,et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1:0066を参照のこと)。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、または少なくとも75個のヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端または5’末端のいずれかに位置する3~5ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変(2’-F改変など)が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端に2’-F改変が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する3~5ヌクレオチドが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、S-拘束エチル(cEt)、または2’-O-メチル-3’-チオPACE(MSP)で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る(Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989を参照のこと)。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート(PS)で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する5を超えるヌクレオチドが、2’-O-Me、2’-F、またはS-拘束エチル(cEt)で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る(Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111を参照のこと)。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、その3’末端及び/または5’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分としては、限定するものではないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、またはローダミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、化学部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子(DNA、RNA、タンパク質、またはナノ粒子など)に付加するために使用され得る。化学的に改変されたそのようなガイドは、CRISPR系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用され得る(Lee et al.,eLife,2017,6:e25312,DOI:10.7554を参照のこと)。
あるある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然には存在しない核酸、及び/または天然には存在しないヌクレオチド、及び/またはヌクレオチドアナログ、及び/または化学的改変を含む。天然には存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド、及び天然には存在しないヌクレオチドの混合物が挙げられ得る。天然には存在しないヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び/または塩基部分で改変され得る。本発明のある1つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の1つでは、ガイドは、1つ以上のリボヌクレオチド及び1つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、1つ以上の天然には存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合、ボラノリン酸連結、リボース環の2’と4’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、または架橋型核酸(BNA)を有するヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、2’-O-メチルアナログ、2’-デオキシアナログ、2-チオウリジンアナログ、N6-メチルアデノシンアナログ、または2’-フルオロアナログが挙げられる。改変塩基のさらなる例としては、限定するものではないが、2-アミノプリン、5-ブロモ-ウリジン、シュードウリジン(Ψ)、N1-メチルシュードウリジン(me1Ψ)、5-メトキシウリジン(5moU)、イノシン、7-メチルグアノシンが挙げられる。ガイドRNAの化学改変の例としては、限定するものではないが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、ホスホロチオエート(PS)、S-拘束エチル(cEt)、または2’-O-メチル-3’-チオPACE(MSP)を1つ以上の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドは、オン標的特異性とオフ標的特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性の向上、及び活性の増大を含み得る(2015年6月29日にオンラインで公開されたHendel,2015,Nat Biotechnol.33(9):985-9,doi:10.1038/nbt.3290、Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111、Allerson et al.,J.Med.Chem.2005,48:901-904、Bramsen et al.,Front.Genet.,2012,3:154、Deng et al.,PNAS,2015,112:11870-11875、Sharma et al.,MedChemComm.,2014,5:1454-1471、Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989、Li et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1,0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066を参照のこと)。いくつかの実施形態では、ガイドRNAの5’末端及び/または3’末端は、さまざまな機能性部分によって改変され、こうした機能性部分としては、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる(Kelly et al.,2016,J.Biotech.233:74-83を参照のこと)。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的DNAに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Cas9、Cpf1、またはC2c1に結合する領域に1つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある1つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、限定されないが、5’及び/または3’末端、ステムループ領域及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の5’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の5’ハンドルを化学的に改変すると、ガイドの機能が消失し得る(Li,et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1:0066を参照のこと)。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、または少なくとも75個のヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端または5’末端のいずれかに位置する3~5ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変(2’-F改変など)が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの3’末端に2’-F改変が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する3~5ヌクレオチドが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、S-拘束エチル(cEt)、または2’-O-メチル-3’-チオPACE(MSP)で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る(Hendel et al.,Nat.Biotechnol.(2015)33(9):985-989を参照のこと)。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート(PS)で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する5を超えるヌクレオチドが、2’-O-Me、2’-F、またはS-拘束エチル(cEt)で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る(Ragdarm et al.,0215,PNAS,E7110-E7111を参照のこと)。本発明のある1つの実施形態では、ガイドは、その3’末端及び/または5’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分としては、限定するものではないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、またはローダミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、化学部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子(DNA、RNA、タンパク質、またはナノ粒子など)に付加するために使用され得る。化学的に改変されたそのようなガイドは、CRISPR系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用され得る(Lee et al.,eLife,2017,6:e25312,DOI:10.7554を参照のこと)。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるCRISPR系は、ガイド配列を含むcrRNAまたは類似のポリヌクレオチドを利用し得、このポリヌクレオチドは、RNA、DNAまたはRNAとDNAの混合物であるか、及び/またはこのポリヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチドアナログを含む。この配列は、バルジ、ヘアピンまたはステムループ構造などの天然のcrRNAの構造を含むがこれらに限定されない任意の構造を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、RNAまたはDNA配列であり得る第2のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する。
ある特定の実施形態では、化学的に改変されたガイドRNAが使用される。ガイドRNAの化学改変の例としては、限定するものではないが、2’-O-メチル(M)、2’-O-メチル3’ホスホロチオエート(MS)、または2’-O-メチル3’チオPACE(MSP)の、1つ以上の末端ヌクレオチドでの組み込みが挙げられる。このような化学的に改変されたガイドRNAは、非改変ガイドRNAと比較して、安定性向上及び活性向上があり得るが、オン標的対オフ標的の特異性は予測し得ない。(Hendel,2015,Nat Biotechnol.33(9):985-9,doi:10.1038/nbt.3290,2015年6月29日オンライン公開、を参照のこと)。化学的に改変されたガイドRNAとしてはさらに、限定するものではないが、ホスホロチオエート結合及びリボース環の2’と4’炭素間のメチレン架橋を含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチドを有するRNAが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75以上、またはそれより多いヌクレオチド長またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12より少ない、またはそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、10~30ヌクレオチド長である。CRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を指示すガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成要素(試験すべきガイド配列を含む)は、CRISPR配列の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクションなどによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、次に、Surveyorアッセイなどによる、標的配列内の優先的切断の評価が続く。同様に、標的RNAの切断は、標的配列、CRISPR複合体の構成要素(試験すべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照配列を含む)を提供すること、ならびに試験と対照のガイド配列反応との間の標的配列での切断の結合または速度を比較することにより、試験管で評価してもよい。他のアッセイが可能であり、当業者が思いつくであろう。
いくつかの実施形態では、ガイドに対する改変は、化学改変、挿入、欠失、または分割である。いくつかの実施形態では、化学改変としては、限定するものではないが、2’-O-メチル(M)アナログ、2’-デオキシアナログ、2-チオウリジンアナログ、N6-メチルアデノシンアナログ、2’-フルオロアナログ、2-アミノプリン、5-ブロモ-ウリジン、シュードウリジン(Ψ)、N1-メチルシュードウリジン(me1Ψ)、5-メトキシウリジン(5moU)、イノシン、7-メチルグアノシン、2’-O-メチル-3’-ホスホロチオエート(MS)、S-拘束エチル(cEt)、ホスホロチオエート(PS)、または2’-O-メチル-3’-チオPACE(MSP)を組み込むことが挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドは、ホスホロチオエート改変のうちの1つ以上を含む。あるある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または25個が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、シード領域における1つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、3’末端における1つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、5’ハンドルにおけるヌクレオチドはいずれも、化学的に改変されない。いくつかの実施形態では、シード領域における化学改変は、軽微な改変(2’-フルオロアナログの組み込みなど)である。具体的な実施形態では、シード領域のヌクレオチドの1ヌクレオチドが、2’-フルオロアナログで置き換えられる。いくつかの実施形態では、3’末端における5または10個のヌクレオチドが化学的に改変される。Cpf1 CrRNAの3’末端をそのように化学的に改変することで、遺伝子切断効率が改善する(Li,et al.,Nature Biomedical Engineering,2017,1:0066参照のこと)。具体的な実施形態では、3’末端における5ヌクレオチドが、2’-フルオロアナログで置き換えられる。具体的な実施形態では、3’末端における10のヌクレオチドが、2’-フルオロアナログで置き換えられる。具体的な実施形態では、3’末端における5ヌクレオチドが、2’-O-メチル(M)アナログで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ガイドの5’ハンドルのループが改変される。いくつかの実施形態では、欠失、挿入、分割、または化学改変を有するように、ガイドの5’ハンドルのループが改変される。ある特定の実施形態では、ループは、ヌクレオチドを3つ、4つ、または5つ含む。ある特定の実施形態では、ループは、UCUU、UUUU、UAUU、またはUGUUという配列を含む。
ガイド配列、したがって核酸標的ガイドRNAは、任意の標的核酸配列または標的分子を標的とするように選択され得る。CRISPR複合体の形成の文脈において、「標的配列」または「標的分子」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列または分子を指し、ここで標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、CRISPR複合体の形成を促進する。標的配列は、RNAポリヌクレオチドを含んでもよい。「標的RNA」という用語は、標的配列であるかまたはそれを含むRNAポリヌクレオチドを指す。言い換えると、標的RNAは、gRNAの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、かつCRISPRエフェクタータンパク質及びgRNAを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指向される、RNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。標的配列はDNAであってもよい。標的配列は、任意のRNA配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーRNA(mRNA)、プレmRNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子核RNA(snRNA)、低分子核RNA(snoRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長鎖非コードRNA(lncRNA)、及び小細胞質RNA(scRNA))からなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA、プレmRNA、及びrRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ncRNA及びlncRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的DNAである。いくつかの実施形態では、この系は、標的DNAと結合し、RNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、28ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、少なくとも18ヌクレオチドであり、28ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、19~28ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、19~25ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、20ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、23ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は25ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、切断効率の調節は、ミスマッチの導入、例えばスペーサー/標的に沿ったミスマッチの位置を含む、スペーサー配列と標的配列の間の1つまたは2つのミスマッチなどの、例えば、1つ以上のミスマッチの導入によって利用され得る。例えば二重のミスマッチがより中心的(すなわち、3’または5’ではない)であるほど、より多くの切断効率が影響を受ける。したがって、スペーサーに沿ったミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の100%未満の切断が望ましい場合(例えば、細胞集団において)、スペーサーと標的配列との間の1つ以上、好ましくは2つなどのミスマッチがスペーサー配列に導入され得る。ミスマッチ位置のスペーサーに沿ってより中央にあるほど、切断率は低くなる。
ある特定の例示的な実施形態では、切断効率を利用して、単一ヌクレオチド多型(SNP)、変形、または(点)変異など、単一ヌクレオチドが異なる2つ以上の標的を区別し得る単一ガイドを設計してもよい。CRISPRエフェクターは、SNP(または他の単一ヌクレオチドの変形)に対する感度が低下している可能性があり、ある特定レベルの効率でSNP標的を切断し続ける。したがって、2つの標的または標的のセットについて、標的の1つ、すなわち、オン標的のSNPに相補的であるヌクレオチド配列を用いてガイドRNAを設計してもよい。ガイドRNAはさらに、合成ミスマッチを有するように設計されている。本明細書で使用される場合、「合成ミスマッチ」とは、天然に存在するSNPの上流または下流に導入される非天然に生じるミスマッチ、例えば、上流または下流で最大5ヌクレオチド、例えば4、3、2、または1ヌクレオチド上流または下流、好ましくは上流または下流で最大3ヌクレオチド、より好ましくは上流または下流で最大2ヌクレオチド、最も好ましくは上流または下流で1ヌクレオチド(すなわち、SNPに隣接)を指す。CRISPRエフェクターがオン標的SNPに結合すると、合成ミスマッチで単一のミスマッチのみが形成され、CRISPRエフェクターは引き続き活性化され、検出可能なシグナルが生成される。ガイドRNAがオフ標的のSNPにハイブリダイズすると、SNPからのミスマッチ及び合成ミスマッチの2つのミスマッチが形成され、検出可能なシグナルは生成されない。したがって、本明細書に開示される系は、集団内のSNPを区別するように設計され得る。例えば、この系を使用して、単一のSNPが異なる病原性株を区別するか、または限定するものではないが、がん関連SNPなどの疾患関連SNPなどの特定の疾患特異的SNPを検出してもよい。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAを、SNPがスペーサー配列の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30(5’末端から開始)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、SNPがスペーサー配列の1、2、3、4、5、6、7、8、または9位(5’末端から始まる)に位置するように設計される。ある特定の実施形態では、ガイドRNAを、SNPがスペーサー配列の2、3、4、5、6、または7位(5’末端から始まる)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAを、SNPがスペーサー配列の3、4、5、または6位(5’末端から始まる)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAを、SNPがスペーサー配列の3位(5’末端から始まる)に位置するように設計する。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチ(例えば、合成ミスマッチ、すなわちSNP以外の追加の変異)がスペーサー配列の位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30(開始5’の端)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチがスペーサー配列の1、2、3、4、5、6、7、8、または9位(5’末端から始まる)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチがスペーサー配列の4、5、6、または7位(5’末端から始まる)に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチがスペーサーの3位、4位、5位、6位、または7位に位置するように設計する(5’末端から始まる)。ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチが(5’末端から始まる)スペーサー配列の5位に位置するように設計する。
ある特定の実施形態では、ミスマッチがSNPの2ヌクレオチド上流に位置するようにガイドRNAを設計する(すなわち、1つの介在ヌクレオチド)。
ある特定の実施形態では、ミスマッチがSNPの2ヌクレオチド下流に位置するようにガイドRNAを設計する(すなわち、1つの介在ヌクレオチド)。
ある特定の実施形態では、ガイドRNAは、ミスマッチがスペーサー配列の5位に位置し(5’末端から始まる)、SNPがスペーサー配列の3位に位置する(5’末端から始まる)ように設計する。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、本明細書に記載されるように標的RNAまたはDNAにおける単一ヌクレオチド多型を検出するように設計されてもよいし、またはそれは、RNA転写物のスプライスバリアントを検出するように設計されてもよい。
本明細書に記載の実施形態は、本明細書に考察されるベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察される真核細胞中で(インビトロ、すなわち単離された真核細胞中で)1つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。変異(複数可)は、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した細胞(複数可)の各標的配列における1つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列における1~75ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異としては、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列における1、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列における5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列における10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられる。変異としては、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列で20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド(複数可)RNA(複数可)を介した上記細胞(複数可)の各標的配列における40、45、50、75、100、200、300、400または500ヌクレオチドの導入、欠失または置換が挙げられ得る。
典型的には、内因性CRISPR系の状況では、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズし、1つ以上のCasタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む)の形成は、標的配列における、または(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、またはそれ以上の塩基対以内の)その近位での切断をもたらすが、特にRNA標的の場合には、例えば二次構造に依存し得る。
本明細書で使用される場合、「マスキング構築物」とは、本明細書に記載される活性化CRISPR系エフェクタータンパク質によって切断されるか、または他の方法で不活性化され得る分子を指す。「マスキング構築物」という用語は、代わりに「検出構築物」と呼ばれる場合もある。ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、RNAベースのマスキング構築物である。RNAベースのマスキング構築物は、CRISPRエフェクタータンパク質によって切断可能なRNA要素を含む。RNA要素の切断は、薬剤を放出するか、または検出可能なシグナルの生成を可能にする立体構造変化を生成する。検出可能なシグナルの生成を防止またはマスキングするためにRNA要素をどのように使用できるかを示す例示的な構築物を以下に記載しており、本発明の実施形態はその変種を含む。切断の前、またはマスキング構築物が「活性な」状態の場合、マスキング構築物は、正の検出可能なシグナルの生成または検出をブロックする。ある特定の例示的な実施形態では、最小のバックグラウンドシグナルが、活性なRNAマスキング構築物の存在下で生成され得ることが理解されよう。正の検出可能なシグナルは、光学的、蛍光的、化学発光的、電気化学的、または当該分野で公知の他の検出方法を使用して検出され得る任意のシグナルであり得る。「正の検出可能なシグナル」という用語は、マスキング構築物の存在下で検出可能な他の検出可能なシグナルと区別するために使用される。例えば、特定の実施形態では、マスキング剤が存在するときに第1のシグナル(すなわち、負の検出可能なシグナル)が検出され得、次いで標的分子の検出及び活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質によるマスキング剤の切断または非活性化の際に第2のシグナル(例えば、正の検出可能なシグナル)に変換される。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、遺伝子産物の生成を抑制し得る。遺伝子産物は、試料に加えられるレポーター構築物によってコードされてもよい。マスキング構築物は、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)または低分子干渉RNA(siRNA)などのRNA干渉経路に関与する干渉RNAであってもよい。マスキング構築物はまた、マイクロRNA(miRNA)を含んでもよい。存在している間、マスキング構築物は、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、標識プローブ、アプタマー、または抗体によって、ただしマスキング構築物の存在について、そうでなければ検出可能である、蛍光タンパク質または他のRNA転写物またはタンパク質であってもよい。エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物は切断されるか、さもなければサイレンシングされて、遺伝子産物の発現及び検出が正の検出可能なシグナルとして可能になる。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な正のシグナルを生成するために必要な1つ以上の試薬を隔離して、マスキング構築物からの1つ以上の試薬の放出が検出可能な正のシグナルの生成をもたらし得る。1つ以上の試薬は、比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、または他の任意の検出可能なシグナルを生成するために組み合わされてもよく、そのような目的に適していることが知られている任意の試薬を含んでもよい。特定の例示的な実施形態では、1つ以上の試薬は、1つ以上の試薬に結合するRNAアプタマーによって隔離される。標的分子の検出時にエフェクタータンパク質が活性化され、RNAまたはDNAアプタマーが分解されると、1つ以上の試薬が放出される。
ある特定の例示的な実施形態では、ガイドRNAは、疾患状態の診断となる1つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。
いくつかの実施形態では、疾患はがんであってもよい。がんとしては、限定するものではないが、白血病(例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤血球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫(例えば、ホジキン病、非ホジキン病)、ウォルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、または多発性骨髄腫などの液体腫瘍を含み得る。
がんは、限定するものではないが、肉腫及び癌腫などの固形腫瘍を含み得る。固形腫瘍の例としては、限定するものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、上皮癌、気管支癌、肝癌、結腸直腸癌(例えば、結腸癌、直腸癌)、肛門癌、膵臓癌(例えば、膵臓腺癌、膵島細胞癌、神経内分泌腫瘍)、乳癌(例えば、乳管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液癌)、卵巣癌(例えば、卵巣上皮癌または表面上皮間質性腫瘍、例としては、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍及びムチン性嚢胞腺癌、性索間質性腫瘍)、前立腺癌、肝臓癌及び胆管癌(例えば、肝細胞癌、胆管癌、血管腫)、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫)、子宮頸癌、子宮癌(例えば、子宮内膜腺癌、子宮乳頭漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫及び平滑筋肉腫、混合ミュラー腫瘍)、精巣癌、胚細胞腫瘍、肺癌(例えば、肺腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫)、膀胱癌、印環細胞癌、頭頸部癌(例えば、扁平上皮癌)、食道癌腫(例えば、食道腺癌)、脳の腫瘍(例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫)、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、黒色腫、胃癌(例えば、胃腺癌、消化管間質腫瘍)、またはカルチノイドが挙げられる。リンパ増殖性障害も増殖性疾患と見なされる。
いくつかの実施形態において、疾患は自己免疫疾患であってもよく、これには必ずしも限定するものではないが、関節リウマチ、ループス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、1型糖尿病、ギランバレー症候群、グレーブス病、またはその他の自己免疫疾患が挙げられる。
いくつかの実施形態では、疾患は感染症であってもよい。感染症としては、必ずしも限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物による感染症が挙げられる。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、対象から得られる生物学的試料などの、試料中の1つ以上の微生物因子の存在を検出することに関する。特定の例示的な実施形態では、微生物は、細菌、真菌、酵母、原生動物、寄生生物、またはウイルスであってよい。したがって、本明細書に開示される方法は、微生物種の迅速な同定、微生物タンパク質(抗原)、抗体、抗体遺伝子の存在のモニタリング、特定の表現型(例えば、細菌耐性)の検出、疾患の進行及び/または発生のモニタリング、ならびに抗生物質スクリーニングを必要とする他の方法とともに(または組み合わせての)他の方法の使用に適合され得る。本明細書に開示された実施形態の迅速かつ高感度の診断能力、単一ヌクレオチドの違いまでの微生物種のタイプの検出、及びPOCデバイスとして展開される能力のため、本明細書に開示された実施形態は、適切な抗生物質または抗ウイルス薬の選択など、治療計画のガイドとして使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、微生物汚染の存在について環境試料(空気、水、表面、食品など)をスクリーニングするために使用され得る。
開示されるのは、細菌、ウイルス、真菌、酵母、または寄生生物種などの微生物種を同定する方法である。本明細書に開示される特定の実施形態は、単一の試料内または複数の試料にわたって微生物種を特定及び区別し、多くの異なる微生物の認識を可能にする方法及び系を説明する。本方法は、試料中の標的核酸配列の存在を検出することにより、病原体の検出及び1つ以上の生物体の2つ以上の種、例えば細菌、ウイルス、酵母、原生動物、及び真菌またはそれらの組み合わせの識別を、生物学的または環境的試料中において、可能にする。試料から得られた正のシグナルは、微生物の存在を示す。複数の微生物は、2つ以上のエフェクタータンパク質の使用を採用することにより、本発明の方法及び系を使用して同時に同定し得、各エフェクタータンパク質は、特定の微生物標的配列を標的とする。このようにして、多数の微生物を一度に検出し得る特定の対象に対してマルチレベル分析を実行し得る。いくつかの実施形態では、複数の微生物の同時検出は、1つ以上の微生物種を特定し得るプローブのセットを使用して実行され得る。
試料の多重分析は、試料の大規模な検出を可能にし、分析の時間とコストを削減する。ただし、マルチプレックス分析は、生物学的試料の利用可用性によって制限される場合が多い。しかしながら、本発明によれば、複数のエフェクタータンパク質を単一の試料に加え得、各マスキング構築物を別個のクエンチャー色素と組み合わせ得るように、マルチプレックス分析の代替を行い得る。この場合、単一の試料でマルチプレックス検出を行うために、各クエンチャー色素から正のシグナルを個別に取得し得る。
本明細書に開示されるのは、試料中の1つ以上の生物体の2つ以上の種の間を識別するための方法である。この方法はまた、試料中の1つ以上の生物体の1つ以上の種を検出するのに適している。
いくつかの実施形態では、試料中の微生物を検出するための方法が提供され、この方法は、試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のCRISPR系を含むことと;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の微生物特異的標的への結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすることと;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここでCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにRNAベースのマスキング構築物が改変されることと;検出可能な正のシグナルを検出することであって、ここで検出可能な正のシグナルの検出が試料中の1つ以上の標的分子の存在を示すこととを含む。1つ以上の標的分子は、2つ以上の微生物種/菌株を互いに識別するために使用され得る、標的ヌクレオチドタイド配列を含む、mRNA、gDNA(コードまたは非コード)、trRNA、またはrRNAであり得る。ガイドRNAは、標的配列を検出するように設計され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、ガイドRNAと標的RNA配列との間のハイブリダイゼーションを改善するために特定のステップを利用し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを増強するための方法は、参照により本明細書に組み入れられる「Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization」と題されたWO2015/085194に開示されている。微生物特異的標的は、RNAもしくはDNAまたはタンパク質であり得る。DNA法場合、本明細書に記載されるようなRNAポリメラーゼプロモーターを導入するDNAプライマーの使用をさらに含み得る。標的がタンパク質である場合、この方法は、本明細書に記載されるタンパク質検出に特異的なアプタマー及びステップを利用するであろう。
i)ウイルス
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、試料中のウイルスを検出することに関する。本明細書に開示される実施形態は、(例えば、対象または植物の)ウイルス感染を検出するため、または一塩基多型が異なるウイルス株を含むウイルス株を決定するために使用され得る。ウイルスは、DNAウイルスであっても、RNAウイルスであっても、またはレトロウイルスであってもよい。本発明で有用なウイルスの非限定的な例としては、限定するものではないが、エボラ、麻疹、SARS、チクングニア、肝炎、マールブルグ、黄熱病、MERS、デング熱、ラッサ、インフルエンザ、ラブドウイルスまたはHIVが挙げられる。肝炎ウイルスとしては、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎を含み得る。インフルエンザウイルスは、例えば、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザを含み得る。HIVは、HIV 1またはHIV 2を含み得る。特定の例示的な実施形態では、ウイルス配列は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョ(Bundibugyo)ウイルス、タイフォレストエボラ(Tai Forest ebola)ウイルス、レストンエボラ(Reston ebola)ウイルス、アチモタ(Achimota)、Aedesフラビウイルス、アグアカタ(Aguacate)ウイルス、アカバネ(Akabane)ウイルス、アレチノフィドレプタレナウイルス(Alethinophid reptarenavirus)、アルパフアヨマアンマレナウイルス(Allpahuayo mammarenavirus)、アマパリマンマレナウイウルス(Amapari mmarenavirus)、アンデス(Andes)ウイルス、アポイ(Apoi)ウイルス、アラバン(Aravan)ウイルス、アロア(Aroa)ウイルス、Arumwotウイルス、タイヘイヨウサケパラミクソウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス(Australian bat lyssavirus)、鳥ボルナウイルス(Avian bornavirus)、トリメタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)、トリパラミクソウイルス、ペンギンまたはフォークランド諸島ウイルス(penguin or Falkland Islandsvirus)、BKポリオーマウイルス、バガザ(Bagaza)ウイルス、バンナ(Banna)ウイルス、コウモリヘルペスウイルス、コウモリサポウイルス(Bat sapovirus)、ベアカノンマンマレナウイルス(Bear Canon mammarenavirus)、Beilongウイルス、ベータコロナウイルス(Betacoronoavirus)、ベータパピローマウイルス(Betapapillomavirus)1-6、バーンヤ(Bhanja)ウイルス、Bokeloh bat lyssavirus、ボルナ病ウイルス、バーボン(Bourbon)ウイルス、ウシヘパシウイルス(Bovine hepacivirus)、ウシパラインフルエンザ(Bovine parainfluenza)ウイルス3、ウシ呼吸器合胞体(Bovine respiratory syncytial)ウイルス、Brazoranウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリシウイルス科(Caliciviridae)ウイルス、カリフォルニア脳炎(California encephalitis)ウイルス、カンディル(Candiru)ウイルス、犬ジステンパー(Canine distemper)ウイルス、イヌニューモウイルス、シダー(Cedar)ウイルス、細胞融合剤(Cell fusing agent)ウイルス、クジラモルビリウイルス(Cetacean morbillivirus)、チャンディプラ(Chandipura)ウイルス、Chaoyangウイルス、チャパレマンマレナウイルス(Chapare mammarenavirus)、チングニア(Chikungunya)ウイルス、コロブスモンキーパピローマウイルス(Colobus monkey papillomavirus)、コロラドダニ熱(Colorado tick fever)ウイルス、牛痘(Cowpox)ウイルス、クリミヤ・コンゴ(Crimean-Congo)出血熱ウイルス、Culexフラビウイルス、クピキシマンマレナウイルス(Cupixi mammarenavirus)、デング(Dengue)ウイルス、ドブラバ-ベルグラード(Dobrava-Belgrade)ウイルス、ドンガン(Donggang)ウイルス、ジュグベ(Dugbe)ウイルス、ドゥベンヘイジ(Duvenhage)ウイルス、東部ウマ脳炎(Eastern equine encephalitis)ウイルス、エテンベコウモリ(Entebbe bat)ウイルス、エンテロウイルス(Enterovirus)A-D、ヨーロッパコウモリリッサウイルス(European bat lyssavirus)1-2、Eyachウイルス、ネコモルビリウイルス(Feline morbillivirus)、フェルドランス(Fer-de-Lance)パラミクソウイルス、フィッツロイリバー(Fitzroy River)ウイルス、フラビウイルス科(Flaviviridae)ウイルス、フレクサルマンマレナウイルス(Flexal mammarenavirus)、GBウイルスC、Gairoウイルス、ゲミサーキュラーウイルス(Gemycircularvirus)、ガチョウ(Goose)パラミクソウイルスSF02、グレートアイランド(Great Island)ウイルス、グアナリトマンマレナウイルス(Guanarito mammarenavirus)、ハンタン(Hantaan)ウイルス、ハンタウイルス(Hantavirus)Z10、ハートランド(Heartland)ウイルス、ヘンドラ(ウイルス)、肝炎A/B/C/E、デルタ型肝炎(Hepatitis delta)ウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒト内因性レトロウイルスK、ヒト腸内コロナウイルス、ヒト生殖器関連環状DNAウイルス(Human genital-associated circular DNA virus)-1、ヒトヘルペスウイルス1-8、ヒト免疫不全ウイルス1/2、ヒトマストアデノウイルス(Huan mastadenovirus)A-G、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1-4、ヒトパラエコーウイルス、ヒトピコルナウイルス、ヒトスマコウイルス(Human smacovirus)、イコマリッサウイルス(Ikoma lyssavirus)、イルヘウス(Ilheus)ウイルス、インフルエンザA-C、イッピイマンマレナウイルス(Ippy mammarenavirus)、イルクート(Irkut)ウイルス、J-ウイルス、JCポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンマンマレナウイルス(Junin mammarenavirus)、KIポリオーマウイルス、カディピロ(Kadipiro)ウイルス、カミチリバー(Kamiti River)ウイルス、ケドゥグ(Kedougou)ウイルス、ホジェンド(Khujand)ウイルス、ココベラ(Kokobera)ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ラゴスコウモリ(Lagos bat)ウイルス、ランガット(Langat)ウイルス、ラッサマンマレナウイルス(Lassa mammarenavirus)、ラチノマンマレナウイルス(Latino mammarenavirus)、レオパーズヒル(Leopards Hill)ウイルス、リアオニン(Liao ning)ウイルス、ユンガン(Ljungan)ウイルス、Lloviuウイルス、Louping illウイルス、Lujo mammarenavirus、ルナマンマレナウイルス(Luna mammarenavirus)、Lunkウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎マンマレナウイルス(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus)、Lyssavirus Ozernoe、MSSI2\.225ウイルス、マチュポマンマレナウイルス(Machupo mammarenavirus)、ママストロウイルス(Mamastrovirus)1、マンサニリャ(Manzanilla)ウイルス、マプエラ(Mapuera)ウイルス、マーブルグ(Marburg)ウイルス、マヤロ(Mayaro)ウイルス、麻疹ウイルス、メナングル(Menangle)ウイルス、Mercadeoウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、モバラマンマレナウイウルs(Mobala mammarenavirus)、モドック(Modoc)ウイルス、モヤン(Moijang)ウイルス、モコロ(Mokolo)ウイルス、サル痘(Monkeypox)ウイルス、マンタナホオヒゲコウモリ白血球炎(Montana myotis leukoenchalitis)ウイルス、モペイアラッサウイルス再集合体(Mopeia lassa virus reassortant)29、Mopeia mammarenavirus、モロゴロ(Morogoro)ウイルス、モスマン(Mossman)ウイルス、ムンプスウイルス、マウス肺炎(Murine pneumonia)ウイルス、マレー渓谷脳炎(Murray Valley encephalitis)ウイルス、ナリバ(Nariva)ウイルス、ニューカッスル病(Newcastle disease)ウイルス、ニパ(Nipah)ウイルス、ノーウォーク(Norwalk)ウイルス、ノルウェーラットヘパシウイルス(Norway rat hepacivirus)、ウンタヤ(Ntaya)ウイルス、オニョンニョンウイルス、オリベロスマンマレナウイルス(Oliveros mammarenavirus)、オムスク出血熱(Omsk hemorrhagic fever)ウイルス、オロポーチ(Oropouche)ウイルス、パラインフルエンザウイルス5、パラナマンマレナウイルス(Parana mammarenavirus)、パラマッタリバー(Parramatta River)ウイルス、小反芻動物病(Peste-des-petits-ruminants)ウイルス、ピカンデマンレナウイルス(Pichande mammarenavirus)、ピコルナウイルス科ウイルス、ピリタールマンマレナウイルス(Pirital mammarenavirus)、ピシヘペウイルス(Piscihepevirus)A、ブタパラインフルエンザウイルス1、ブタルブラウイルス、ポワッサンウイルス、霊長類Tリンパ球向性ウイルス1-2、霊長類エリスロパルボウイルス1、プンタトロウイルス、プウマラウイルス、クアンビンウイルス、狂犬病ウイルス、ラズダンウイルス、爬虫類ボルナウイルス1、ライノウイルスA-B、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、リオブラボーウイルス、げっ歯類トルクテノ(Rodent Torque Teno)ウイルス、げっ歯類ヘパシウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルスA-I、ロイヤルファームウイルス、風疹ウイルス、サビアマンマレナウイルス、セイラムウイルス、サンドフライ熱ナポリウイルス、サンドフライ熱シチリアウイルス、札幌ウイルス、サスペリウイルス、シールアネロウイルス、セムリキ森林ウイルス、センダイウイルス、ソウルウイルス、セピックウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症熱性血小板減少症症候群ウイルス、シャモンダウイルス、シモニコウモリウイルス、シュニウイルス、シンブウイルス、シミアントルクテノウイルス、シミアンウイルス40-41、シンノンブレウイルス、シンドビスウイルス、スモールアネロウイルス、ソスガウイルス、スペインヤギ脳炎ウイルス、スポンドウェニウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、サンシャインウイルス、TTV様ミニウイルス、タカリベマンマレナウイルス、タイラウイルス、
タマナコウモリウイルス、タミアミマンマレナウイルス、テンブスウイルス、トゴトウウイルス、トッタパラヤンウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ティオマンウイルス、トガウイルス科ウイルス、トルクテノカニス(Torque teno canis)ウイルス、トルクテノドゥルークーリ(Torque teno douroucouli)ウイルス、トルクテノネコ(Torque teno felis)ウイルス、トルクテノミジ(Torque teno midi)ウイルス、トルクテノサス(Torque teno sus)ウイルス、トルクテノタマリン(Torque teno tamarin)ウイルス、トルクテノ(Torque teno)ウイルス、トルクテノアザラシ(Torque teno zalophus)ウイルス、トウホク(Tuhoko)ウイルス、トゥーラ(Tula)ウイルス、ツパイ(Tupaia)パラミクソウイルス、ウストゥ(Usutu)ウイルス、ウークニエミ(Uukuniemi)ウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、WUポリオーマウイルス、ウェッセルブロンウイルス、西コーカサスコウモリウイルス、西ナイルウイルス、西部馬脳炎ウイルス、ホワイトウォーターアロヨマンマレナウイルス、黄熱病ウイルス、横瀬ウイルス、ユグボグダノバックウイルス、ザイールエボラウイルス、ジカウイルス、またはZygosaccharomyces bailiiウイルスZウイルスの配列であってもよい。検出され得るRNAウイルスの例としては、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、またはデルタウイルスのうちの1つ以上(またはそれらの任意の組み合わせ)が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、コロナウイルス、SARS、ポリオウイルス、ライノウイルス、A型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはD型肝炎ウイルスである。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、試料中のウイルスを検出することに関する。本明細書に開示される実施形態は、(例えば、対象または植物の)ウイルス感染を検出するため、または一塩基多型が異なるウイルス株を含むウイルス株を決定するために使用され得る。ウイルスは、DNAウイルスであっても、RNAウイルスであっても、またはレトロウイルスであってもよい。本発明で有用なウイルスの非限定的な例としては、限定するものではないが、エボラ、麻疹、SARS、チクングニア、肝炎、マールブルグ、黄熱病、MERS、デング熱、ラッサ、インフルエンザ、ラブドウイルスまたはHIVが挙げられる。肝炎ウイルスとしては、A型肝炎、B型肝炎、またはC型肝炎を含み得る。インフルエンザウイルスは、例えば、A型インフルエンザまたはB型インフルエンザを含み得る。HIVは、HIV 1またはHIV 2を含み得る。特定の例示的な実施形態では、ウイルス配列は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョ(Bundibugyo)ウイルス、タイフォレストエボラ(Tai Forest ebola)ウイルス、レストンエボラ(Reston ebola)ウイルス、アチモタ(Achimota)、Aedesフラビウイルス、アグアカタ(Aguacate)ウイルス、アカバネ(Akabane)ウイルス、アレチノフィドレプタレナウイルス(Alethinophid reptarenavirus)、アルパフアヨマアンマレナウイルス(Allpahuayo mammarenavirus)、アマパリマンマレナウイウルス(Amapari mmarenavirus)、アンデス(Andes)ウイルス、アポイ(Apoi)ウイルス、アラバン(Aravan)ウイルス、アロア(Aroa)ウイルス、Arumwotウイルス、タイヘイヨウサケパラミクソウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス(Australian bat lyssavirus)、鳥ボルナウイルス(Avian bornavirus)、トリメタニューモウイルス(Avian metapneumovirus)、トリパラミクソウイルス、ペンギンまたはフォークランド諸島ウイルス(penguin or Falkland Islandsvirus)、BKポリオーマウイルス、バガザ(Bagaza)ウイルス、バンナ(Banna)ウイルス、コウモリヘルペスウイルス、コウモリサポウイルス(Bat sapovirus)、ベアカノンマンマレナウイルス(Bear Canon mammarenavirus)、Beilongウイルス、ベータコロナウイルス(Betacoronoavirus)、ベータパピローマウイルス(Betapapillomavirus)1-6、バーンヤ(Bhanja)ウイルス、Bokeloh bat lyssavirus、ボルナ病ウイルス、バーボン(Bourbon)ウイルス、ウシヘパシウイルス(Bovine hepacivirus)、ウシパラインフルエンザ(Bovine parainfluenza)ウイルス3、ウシ呼吸器合胞体(Bovine respiratory syncytial)ウイルス、Brazoranウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリシウイルス科(Caliciviridae)ウイルス、カリフォルニア脳炎(California encephalitis)ウイルス、カンディル(Candiru)ウイルス、犬ジステンパー(Canine distemper)ウイルス、イヌニューモウイルス、シダー(Cedar)ウイルス、細胞融合剤(Cell fusing agent)ウイルス、クジラモルビリウイルス(Cetacean morbillivirus)、チャンディプラ(Chandipura)ウイルス、Chaoyangウイルス、チャパレマンマレナウイルス(Chapare mammarenavirus)、チングニア(Chikungunya)ウイルス、コロブスモンキーパピローマウイルス(Colobus monkey papillomavirus)、コロラドダニ熱(Colorado tick fever)ウイルス、牛痘(Cowpox)ウイルス、クリミヤ・コンゴ(Crimean-Congo)出血熱ウイルス、Culexフラビウイルス、クピキシマンマレナウイルス(Cupixi mammarenavirus)、デング(Dengue)ウイルス、ドブラバ-ベルグラード(Dobrava-Belgrade)ウイルス、ドンガン(Donggang)ウイルス、ジュグベ(Dugbe)ウイルス、ドゥベンヘイジ(Duvenhage)ウイルス、東部ウマ脳炎(Eastern equine encephalitis)ウイルス、エテンベコウモリ(Entebbe bat)ウイルス、エンテロウイルス(Enterovirus)A-D、ヨーロッパコウモリリッサウイルス(European bat lyssavirus)1-2、Eyachウイルス、ネコモルビリウイルス(Feline morbillivirus)、フェルドランス(Fer-de-Lance)パラミクソウイルス、フィッツロイリバー(Fitzroy River)ウイルス、フラビウイルス科(Flaviviridae)ウイルス、フレクサルマンマレナウイルス(Flexal mammarenavirus)、GBウイルスC、Gairoウイルス、ゲミサーキュラーウイルス(Gemycircularvirus)、ガチョウ(Goose)パラミクソウイルスSF02、グレートアイランド(Great Island)ウイルス、グアナリトマンマレナウイルス(Guanarito mammarenavirus)、ハンタン(Hantaan)ウイルス、ハンタウイルス(Hantavirus)Z10、ハートランド(Heartland)ウイルス、ヘンドラ(ウイルス)、肝炎A/B/C/E、デルタ型肝炎(Hepatitis delta)ウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒト内因性レトロウイルスK、ヒト腸内コロナウイルス、ヒト生殖器関連環状DNAウイルス(Human genital-associated circular DNA virus)-1、ヒトヘルペスウイルス1-8、ヒト免疫不全ウイルス1/2、ヒトマストアデノウイルス(Huan mastadenovirus)A-G、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1-4、ヒトパラエコーウイルス、ヒトピコルナウイルス、ヒトスマコウイルス(Human smacovirus)、イコマリッサウイルス(Ikoma lyssavirus)、イルヘウス(Ilheus)ウイルス、インフルエンザA-C、イッピイマンマレナウイルス(Ippy mammarenavirus)、イルクート(Irkut)ウイルス、J-ウイルス、JCポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンマンマレナウイルス(Junin mammarenavirus)、KIポリオーマウイルス、カディピロ(Kadipiro)ウイルス、カミチリバー(Kamiti River)ウイルス、ケドゥグ(Kedougou)ウイルス、ホジェンド(Khujand)ウイルス、ココベラ(Kokobera)ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ラゴスコウモリ(Lagos bat)ウイルス、ランガット(Langat)ウイルス、ラッサマンマレナウイルス(Lassa mammarenavirus)、ラチノマンマレナウイルス(Latino mammarenavirus)、レオパーズヒル(Leopards Hill)ウイルス、リアオニン(Liao ning)ウイルス、ユンガン(Ljungan)ウイルス、Lloviuウイルス、Louping illウイルス、Lujo mammarenavirus、ルナマンマレナウイルス(Luna mammarenavirus)、Lunkウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎マンマレナウイルス(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus)、Lyssavirus Ozernoe、MSSI2\.225ウイルス、マチュポマンマレナウイルス(Machupo mammarenavirus)、ママストロウイルス(Mamastrovirus)1、マンサニリャ(Manzanilla)ウイルス、マプエラ(Mapuera)ウイルス、マーブルグ(Marburg)ウイルス、マヤロ(Mayaro)ウイルス、麻疹ウイルス、メナングル(Menangle)ウイルス、Mercadeoウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、モバラマンマレナウイウルs(Mobala mammarenavirus)、モドック(Modoc)ウイルス、モヤン(Moijang)ウイルス、モコロ(Mokolo)ウイルス、サル痘(Monkeypox)ウイルス、マンタナホオヒゲコウモリ白血球炎(Montana myotis leukoenchalitis)ウイルス、モペイアラッサウイルス再集合体(Mopeia lassa virus reassortant)29、Mopeia mammarenavirus、モロゴロ(Morogoro)ウイルス、モスマン(Mossman)ウイルス、ムンプスウイルス、マウス肺炎(Murine pneumonia)ウイルス、マレー渓谷脳炎(Murray Valley encephalitis)ウイルス、ナリバ(Nariva)ウイルス、ニューカッスル病(Newcastle disease)ウイルス、ニパ(Nipah)ウイルス、ノーウォーク(Norwalk)ウイルス、ノルウェーラットヘパシウイルス(Norway rat hepacivirus)、ウンタヤ(Ntaya)ウイルス、オニョンニョンウイルス、オリベロスマンマレナウイルス(Oliveros mammarenavirus)、オムスク出血熱(Omsk hemorrhagic fever)ウイルス、オロポーチ(Oropouche)ウイルス、パラインフルエンザウイルス5、パラナマンマレナウイルス(Parana mammarenavirus)、パラマッタリバー(Parramatta River)ウイルス、小反芻動物病(Peste-des-petits-ruminants)ウイルス、ピカンデマンレナウイルス(Pichande mammarenavirus)、ピコルナウイルス科ウイルス、ピリタールマンマレナウイルス(Pirital mammarenavirus)、ピシヘペウイルス(Piscihepevirus)A、ブタパラインフルエンザウイルス1、ブタルブラウイルス、ポワッサンウイルス、霊長類Tリンパ球向性ウイルス1-2、霊長類エリスロパルボウイルス1、プンタトロウイルス、プウマラウイルス、クアンビンウイルス、狂犬病ウイルス、ラズダンウイルス、爬虫類ボルナウイルス1、ライノウイルスA-B、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、リオブラボーウイルス、げっ歯類トルクテノ(Rodent Torque Teno)ウイルス、げっ歯類ヘパシウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルスA-I、ロイヤルファームウイルス、風疹ウイルス、サビアマンマレナウイルス、セイラムウイルス、サンドフライ熱ナポリウイルス、サンドフライ熱シチリアウイルス、札幌ウイルス、サスペリウイルス、シールアネロウイルス、セムリキ森林ウイルス、センダイウイルス、ソウルウイルス、セピックウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症熱性血小板減少症症候群ウイルス、シャモンダウイルス、シモニコウモリウイルス、シュニウイルス、シンブウイルス、シミアントルクテノウイルス、シミアンウイルス40-41、シンノンブレウイルス、シンドビスウイルス、スモールアネロウイルス、ソスガウイルス、スペインヤギ脳炎ウイルス、スポンドウェニウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、サンシャインウイルス、TTV様ミニウイルス、タカリベマンマレナウイルス、タイラウイルス、
タマナコウモリウイルス、タミアミマンマレナウイルス、テンブスウイルス、トゴトウウイルス、トッタパラヤンウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ティオマンウイルス、トガウイルス科ウイルス、トルクテノカニス(Torque teno canis)ウイルス、トルクテノドゥルークーリ(Torque teno douroucouli)ウイルス、トルクテノネコ(Torque teno felis)ウイルス、トルクテノミジ(Torque teno midi)ウイルス、トルクテノサス(Torque teno sus)ウイルス、トルクテノタマリン(Torque teno tamarin)ウイルス、トルクテノ(Torque teno)ウイルス、トルクテノアザラシ(Torque teno zalophus)ウイルス、トウホク(Tuhoko)ウイルス、トゥーラ(Tula)ウイルス、ツパイ(Tupaia)パラミクソウイルス、ウストゥ(Usutu)ウイルス、ウークニエミ(Uukuniemi)ウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、WUポリオーマウイルス、ウェッセルブロンウイルス、西コーカサスコウモリウイルス、西ナイルウイルス、西部馬脳炎ウイルス、ホワイトウォーターアロヨマンマレナウイルス、黄熱病ウイルス、横瀬ウイルス、ユグボグダノバックウイルス、ザイールエボラウイルス、ジカウイルス、またはZygosaccharomyces bailiiウイルスZウイルスの配列であってもよい。検出され得るRNAウイルスの例としては、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、またはデルタウイルスのうちの1つ以上(またはそれらの任意の組み合わせ)が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、コロナウイルス、SARS、ポリオウイルス、ライノウイルス、A型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはD型肝炎ウイルスである。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、タバコモザイクウイルス(TMV)、トマト黄化えそウイルス(TSWV)、キュウリモザイクウイルス(CMV)、ジャガイモウイルスY(PVY)、RTウイルスカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、プラムポックスウイルス(PPV)、ブロムモザイクウイルス(BMV)、ジャガイモウイルスX(PVX)、柑橘類トリステザウイルス(CTV)、オオムギ黄萎ウイルス(BYDV)、ジャガイモ葉巻ウイルス(PLRV)、トマトブッシースタントウイルス(Tomato bushy stunt virus)(TBSV)、イネツングロ球状ウイルス(RTSV)、イネ黄斑ウイルス(RYMV)、イネホジャブランカウイルス(RHBV)、トウモロコシラヤドフィノウイルス(MRFV)、トウモロコシ委縮モザイクウイルス(MDMV)、サトウキビモザイクウイルス(SCMV)、サツマイモ斑紋モザイクウイルス(SPFMV)、サツマイモサンクンベインクロステロウイルス(sweet potato sunken vein closterovirus)(SPSVV)、ブドウファンリーフウイルス(GFLV)、ブドウAウイルス(GVA)、ブドウBウイルス(GVB)、ブドウフレックウイルス(GFkV)、ブドウ葉巻随伴ウイルス1、-2、及び-3、(GLRaV-1、-2、及び-3)、アラビスモザイクウイルス(ArMV)、またはルペストリスステムピット随伴(Rupestris stem pitting-associated)ウイルス(RSPaV)を含む群から選択される植物ウイルスであり得る。好ましい実施形態では、標的RNA分子は、上記病原体の一部であるか、または上記病原体のDNA分子から転写される。例えば、標的配列は、RNAウイルスのゲノムに含まれ得る。上記病原体が上記植物に感染するかまたは感染した場合、CRISPRエフェクタータンパク質が上記植物の上記病原体の上記標的RNA分子を加水分解することがさらに好ましい。したがって、CRISPR系は、CRISPR系(またはその完了に必要な部分)が治療に適用されたとき、すなわち感染が起こった後、または予防的に、すなわち感染が起こる前に適用されたときの両方で、植物病原体から標的RNA分子を切断し得ることが好ましい。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスはレトロウイルスであってよい。本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得るレトロウイルスの例としては、属アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、またはメタウイルス科、シュードウイルス科、及びレトロウイルス科(HIVを含む)、ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルスを含む)、及びカリモウイルス科(カリフラワーモザイクウイルスを含む)のウイルスの1つ以上または任意の組み合わせが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスはDNAウイルスである。本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得るDNAウイルスの例としてハ、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科(ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む)、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科(アフリカ豚コレラウイルスを含む)、バキュロウイルス科、Cicaudaviridae、Clavaviridae、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、Hytrosaviridae、イリドウイルス科、Maseilleviridae、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科(Phycodnaviridae)、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科(シミアンウイルス40、JCウイルス、BKウイルスを含む)、ポックスウイルス科(牛痘及び天然痘を含む)、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスなど由来のウイルスの1つ以上(または任意の組み合わせ)が挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌感染を有することが疑われる対象における種特異的細菌感染を診断する方法は、対象から細菌リボソームリボ核酸を含む試料を入手すること;試料を1つ以上の記載されたプローブと接触させること、ならびに試料に存在する細菌のリボソームリボ核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出すること記載され、ここでハイブリダイゼーションの検出により、対象が、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Acinetobacter baumannii、Candida albicans、Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Proteus mirabilis、Staphylococcus agalactiae、またはStaphylococcus maltophiliaまたはそれらの組み合わせに感染していることが示される。
特定の実施形態では、ウイルス感染は、二本鎖RNAウイルス、プラス鎖RNAウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、レトロウイルス、またはそれらの組み合わせによって引き起こされ得る。
ii)細菌
以下は、本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得る微生物の種類の例示的なリストを提供する。ある特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌である。開示された方法に従って検出され得る細菌の例としては、限定するものではないが、とりわけ、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus sp.,Actinomycetes、Actinomyces sp.(例えば、Actinomyces israelii及びActinomyces naeslundii)、Aeromonas sp.(例えば、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)、及びAeromonas caviae)、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale Alcaligenes xylosoxidans、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Bacillus sp.(例えば、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis、and Bacillus stearothermophilus)、Bacteroides sp.(例えば、Bacteroides fragilis)、Bartonella sp.(例えば、Bartonella bacilliformis及びBartonella henselae、Bifidobacterium sp.,Bordetella sp.(例えば、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、and Bordetella bronchiseptica)、Borrelia sp.(例えば、Borrelia recurrentis、及びBorrelia burgdorferi)、Brucella sp.(例えば、Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melintensis及びBrucella suis)、Burkholderia sp.(例えば、Burkholderia pseudomallei及びBurkholderia cepacia)、Campylobacter sp.(例えば、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Campylobacter lari及びCampylobacter fetus)、Capnocytophaga sp.,Cardiobacterium hominis、Chlamydia trachomatis、Chlamydophila pneumoniae、Chlamydophila psittaci、Citrobacter sp.Coxiella burnetii、Corynebacterium sp.(例えば、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium jeikeum及びCorynebacterium)、Clostridium sp.(例えば、Clostridium perfringens、Clostridium difficile、Clostridium botulinum及びClostridium tetani)、Eikenella corrodens、Enterobacter sp.(例えば、Enterobacter aerogenes、Enterobacter agglomerans、Enterobacter cloacae及びEscherichia coli、including opportunistic Escherichia coli、such as enterotoxigenic E.coli、enteroinvasive E.coli、enteropathogenic E.coli、enterohemorrhagic E.coli、enteroaggregative E.coli及びuropathogenic E.coli)Enterococcus sp.(例えば、Enterococcus faecalis及びEnterococcus faecium)Ehrlichia sp.(例えば、Ehrlichia chafeensia及びEhrlichia canis)、Epidermophyton floccosum、Erysipelothrix rhusiopathiae、Eubacterium sp.,Francisella tularensis、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、Haemophilus sp.(例えば、Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyi、Haemophilus aegyptius、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus haemolyticus及びHaemophilus parahaemolyticus、Helicobacter sp.(例えば、Helicobacter pylori、Helicobacter cinaedi及びHelicobacter fennelliae)、Kingella kingii、Klebsiella sp.(例えば、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella granulomatis及びKlebsiella oxytoca)、Lactobacillus sp.,Listeria monocytogenes、Leptospira interrogans、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Peptostreptococcus sp.,Mannheimia hemolytica、Microsporum canis、Moraxella catarrhalis、Morganella sp.,Mobiluncus sp.,Micrococcus sp.,Mycobacterium sp.(例えば、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、及びMycobacterium marinum)、Mycoplasm sp.(例えば、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma hominis、及びMycoplasma genitalium)、Nocardia sp.(例えば、Nocardia asteroides、Nocardia cyriacigeorgica及びNocardia brasiliensis)、Neisseria sp.(例えば、Neisseria gonorrhoeae及びNeisseria meningitidis)、Pasteurella multocida、Pityrosporum orbiculare(Malassezia furfur)、Plesiomonas shigelloides.Prevotella sp.,Porphyromonas sp.,Prevotella melaninogenica、Proteus sp.(例えば、Proteus vulgaris及びProteus mirabilis)、Providencia sp.(例えば、Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri及びProvidencia stuartii)、Pseudomonas aeruginosa、Propionibacterium acnes、Rhodococcus equi、Rickettsia sp.(例えば、Rickettsia rickettsii、Rickettsia akari及びRickettsia prowazekii、Orientia tsutsugamushi(formerly:Rickettsia tsutsugamushi)及びRickettsia typhi)、Rhodococcus sp.,Serratia marcescens、Stenotrophomonas maltophilia、Salmonella sp.(例えば、Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Salmonella cholerasuis及びSalmonella typhimurium)、Serratia sp.(例えば、Serratia marcesans及びSerratia liquifaciens)、Shigella sp.(例えば、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii及びShigella sonnei)、Staphylococcus sp.(例えば、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus hemolyticus、Staphylococcus saprophyticus)、Streptococcus sp.(例えば、Streptococcus pneumoniae(for example chloramphenicol耐性血清型4 Streptococcus pneumoniae、スペクチノマイシン耐性血清型6B Streptococcus pneumoniae、ストレプトマイシン耐性血清型9V Streptococcus pneumoniae、エリスロマイシン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、オプトチン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、リファンピシン耐性血清型18C Streptococcus pneumoniae、テトラサイクリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、ペニシリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、及びトリメトプリム耐性血清型23F Streptococcus pneumoniae、クロラムフェニコール耐性血清型4 Streptococcus pneumoniae、スペクチノマイシン耐性血清型6B Streptococcus pneumoniae、ストレプトマイシン耐性血清型9V Streptococcus pneumoniae、オプトチン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、リファンピシン耐性血清型18C Streptococcus pneumoniae、ペニシリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、またはトリメトプリム耐性血清型23F Streptococcus pneumoniae)、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Group A streptococci、Streptococcus pyogenes、Group B streptococci、Streptococcus agalactiae、Group C streptococci、Streptococcus anginosus、Streptococcus equismilis、Group D streptococci、
Streptococcus bovis、Group F streptococci、及びStreptococcus anginosus Group G streptococci)、Spirillum minus、Streptobacillus moniliformi、Treponema sp.(例えば、Treponema carateum、Treponema petenue、Treponema pallidum及びTreponema endemicum、Trichophyton rubrum、T.mentagrophytes、Tropheryma whippelii、Ureaplasma urealyticum、Veillonella sp.,Vibrio sp.(例えば、Vibrio cholerae、Vibrio parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio alginolyticus、Vibrio mimicus、Vibrio hollisae、Vibrio fluvialis、Vibrio metchnikovii、Vibrio damsela及びVibrio furnisii)、Yersinia sp.(例えば、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、及びYersinia pseudotuberculosis)ならびにXanthomonas maltophiliaのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。
以下は、本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得る微生物の種類の例示的なリストを提供する。ある特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌である。開示された方法に従って検出され得る細菌の例としては、限定するものではないが、とりわけ、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus sp.,Actinomycetes、Actinomyces sp.(例えば、Actinomyces israelii及びActinomyces naeslundii)、Aeromonas sp.(例えば、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)、及びAeromonas caviae)、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale Alcaligenes xylosoxidans、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Bacillus sp.(例えば、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis、and Bacillus stearothermophilus)、Bacteroides sp.(例えば、Bacteroides fragilis)、Bartonella sp.(例えば、Bartonella bacilliformis及びBartonella henselae、Bifidobacterium sp.,Bordetella sp.(例えば、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、and Bordetella bronchiseptica)、Borrelia sp.(例えば、Borrelia recurrentis、及びBorrelia burgdorferi)、Brucella sp.(例えば、Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melintensis及びBrucella suis)、Burkholderia sp.(例えば、Burkholderia pseudomallei及びBurkholderia cepacia)、Campylobacter sp.(例えば、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Campylobacter lari及びCampylobacter fetus)、Capnocytophaga sp.,Cardiobacterium hominis、Chlamydia trachomatis、Chlamydophila pneumoniae、Chlamydophila psittaci、Citrobacter sp.Coxiella burnetii、Corynebacterium sp.(例えば、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium jeikeum及びCorynebacterium)、Clostridium sp.(例えば、Clostridium perfringens、Clostridium difficile、Clostridium botulinum及びClostridium tetani)、Eikenella corrodens、Enterobacter sp.(例えば、Enterobacter aerogenes、Enterobacter agglomerans、Enterobacter cloacae及びEscherichia coli、including opportunistic Escherichia coli、such as enterotoxigenic E.coli、enteroinvasive E.coli、enteropathogenic E.coli、enterohemorrhagic E.coli、enteroaggregative E.coli及びuropathogenic E.coli)Enterococcus sp.(例えば、Enterococcus faecalis及びEnterococcus faecium)Ehrlichia sp.(例えば、Ehrlichia chafeensia及びEhrlichia canis)、Epidermophyton floccosum、Erysipelothrix rhusiopathiae、Eubacterium sp.,Francisella tularensis、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、Haemophilus sp.(例えば、Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyi、Haemophilus aegyptius、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus haemolyticus及びHaemophilus parahaemolyticus、Helicobacter sp.(例えば、Helicobacter pylori、Helicobacter cinaedi及びHelicobacter fennelliae)、Kingella kingii、Klebsiella sp.(例えば、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella granulomatis及びKlebsiella oxytoca)、Lactobacillus sp.,Listeria monocytogenes、Leptospira interrogans、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Peptostreptococcus sp.,Mannheimia hemolytica、Microsporum canis、Moraxella catarrhalis、Morganella sp.,Mobiluncus sp.,Micrococcus sp.,Mycobacterium sp.(例えば、Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium avium、Mycobacterium bovis、及びMycobacterium marinum)、Mycoplasm sp.(例えば、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma hominis、及びMycoplasma genitalium)、Nocardia sp.(例えば、Nocardia asteroides、Nocardia cyriacigeorgica及びNocardia brasiliensis)、Neisseria sp.(例えば、Neisseria gonorrhoeae及びNeisseria meningitidis)、Pasteurella multocida、Pityrosporum orbiculare(Malassezia furfur)、Plesiomonas shigelloides.Prevotella sp.,Porphyromonas sp.,Prevotella melaninogenica、Proteus sp.(例えば、Proteus vulgaris及びProteus mirabilis)、Providencia sp.(例えば、Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri及びProvidencia stuartii)、Pseudomonas aeruginosa、Propionibacterium acnes、Rhodococcus equi、Rickettsia sp.(例えば、Rickettsia rickettsii、Rickettsia akari及びRickettsia prowazekii、Orientia tsutsugamushi(formerly:Rickettsia tsutsugamushi)及びRickettsia typhi)、Rhodococcus sp.,Serratia marcescens、Stenotrophomonas maltophilia、Salmonella sp.(例えば、Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Salmonella cholerasuis及びSalmonella typhimurium)、Serratia sp.(例えば、Serratia marcesans及びSerratia liquifaciens)、Shigella sp.(例えば、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii及びShigella sonnei)、Staphylococcus sp.(例えば、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus hemolyticus、Staphylococcus saprophyticus)、Streptococcus sp.(例えば、Streptococcus pneumoniae(for example chloramphenicol耐性血清型4 Streptococcus pneumoniae、スペクチノマイシン耐性血清型6B Streptococcus pneumoniae、ストレプトマイシン耐性血清型9V Streptococcus pneumoniae、エリスロマイシン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、オプトチン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、リファンピシン耐性血清型18C Streptococcus pneumoniae、テトラサイクリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、ペニシリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、及びトリメトプリム耐性血清型23F Streptococcus pneumoniae、クロラムフェニコール耐性血清型4 Streptococcus pneumoniae、スペクチノマイシン耐性血清型6B Streptococcus pneumoniae、ストレプトマイシン耐性血清型9V Streptococcus pneumoniae、オプトチン耐性血清型14 Streptococcus pneumoniae、リファンピシン耐性血清型18C Streptococcus pneumoniae、ペニシリン耐性血清型19F Streptococcus pneumoniae、またはトリメトプリム耐性血清型23F Streptococcus pneumoniae)、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Group A streptococci、Streptococcus pyogenes、Group B streptococci、Streptococcus agalactiae、Group C streptococci、Streptococcus anginosus、Streptococcus equismilis、Group D streptococci、
Streptococcus bovis、Group F streptococci、及びStreptococcus anginosus Group G streptococci)、Spirillum minus、Streptobacillus moniliformi、Treponema sp.(例えば、Treponema carateum、Treponema petenue、Treponema pallidum及びTreponema endemicum、Trichophyton rubrum、T.mentagrophytes、Tropheryma whippelii、Ureaplasma urealyticum、Veillonella sp.,Vibrio sp.(例えば、Vibrio cholerae、Vibrio parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio alginolyticus、Vibrio mimicus、Vibrio hollisae、Vibrio fluvialis、Vibrio metchnikovii、Vibrio damsela及びVibrio furnisii)、Yersinia sp.(例えば、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、及びYersinia pseudotuberculosis)ならびにXanthomonas maltophiliaのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。
iii)真菌類
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は真菌または真菌種である。開示された方法に従って検出され得る真菌の例としては、限定するものではないが、Aspergillus、Blastomyces、Candidiasis、Coccidiodomycosis、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gatti、sp.Histoplasma sp.(例えば、Histoplasma capsulatum)、Pneumocystis sp.(例えば、Pneumocystis jirovecii)、Stachybotrys(例えば、Stachybotrys chartarum)、Mucroymcosis、Sporothrix、真菌性眼感染白癬(fungal eye infections ringworm)、Exserohilum、Cladosporiumのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は真菌または真菌種である。開示された方法に従って検出され得る真菌の例としては、限定するものではないが、Aspergillus、Blastomyces、Candidiasis、Coccidiodomycosis、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gatti、sp.Histoplasma sp.(例えば、Histoplasma capsulatum)、Pneumocystis sp.(例えば、Pneumocystis jirovecii)、Stachybotrys(例えば、Stachybotrys chartarum)、Mucroymcosis、Sporothrix、真菌性眼感染白癬(fungal eye infections ringworm)、Exserohilum、Cladosporiumのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、真菌は酵母である。開示された方法に従って検出し得る酵母の例としては、限定するものではないが、Aspergillus種(例えば、Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus及びAspergillus clavatus)、Cryptococcus sp.(例えば、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gattii、Cryptococcus laurentii及びCryptococcus albidus)、Geotrichum種、Saccharomyces種、Hansenula種、Candida種(例えば、Candida albicans)、Kluyveromyces種、Debaryomyces種、Pichia種、またはそれらの組み合わせのうちの1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。ある特定の実施形態では、この真菌類は、カビ(mold)である。カビの例としては限定するものではないが、Penicillium種、Cladosporium種、Byssochlamys種、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
iv)原生動物
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は原生動物である。開示された方法及びデバイスに従って検出され得る原生動物の例としては、限定するものではないが、Euglenozoa、Heterolobosea、Diplomonadida、Amoebozoa、Blastocystic,及びApicomplexaのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。Euglenozaの例としては、限定するものではないが、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、Leishmania braziliensis、L.infantum、L.mexicana、L.major、L.tropica,及びL.donovaniが挙げられる。Heteroloboseaの例としては、限定するものではないが、Naegleria fowleriが挙げられる。Diplomonadidsの例としては、限定するものではないが、Giardia intestinalis(G.lamblia、G.duodenalis)が挙げられる。Amoebozoaの例としては、限定するものではないが、Acanthamoeba castellanii、Balamuthia madrillaris、Entamoeba histolyticaが挙げられる。Blastocystsの例としては、限定するものではないが、Blastocystic hominisが挙げられる。Apicomplexaの例としては、限定するものではないが、Babesia microti、Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayetanensis、Plasmodium falciparum、P.vivax、P.ovale、P.malariae,及びToxoplasma gondiiが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は原生動物である。開示された方法及びデバイスに従って検出され得る原生動物の例としては、限定するものではないが、Euglenozoa、Heterolobosea、Diplomonadida、Amoebozoa、Blastocystic,及びApicomplexaのうちの任意の1つ以上(またはその任意の組み合わせ)が挙げられる。Euglenozaの例としては、限定するものではないが、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、Leishmania braziliensis、L.infantum、L.mexicana、L.major、L.tropica,及びL.donovaniが挙げられる。Heteroloboseaの例としては、限定するものではないが、Naegleria fowleriが挙げられる。Diplomonadidsの例としては、限定するものではないが、Giardia intestinalis(G.lamblia、G.duodenalis)が挙げられる。Amoebozoaの例としては、限定するものではないが、Acanthamoeba castellanii、Balamuthia madrillaris、Entamoeba histolyticaが挙げられる。Blastocystsの例としては、限定するものではないが、Blastocystic hominisが挙げられる。Apicomplexaの例としては、限定するものではないが、Babesia microti、Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayetanensis、Plasmodium falciparum、P.vivax、P.ovale、P.malariae,及びToxoplasma gondiiが挙げられる。
v)寄生生物
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は寄生生物である。開示された方法に従って検出され得る寄生生物の例としては、限定するものではないが、オンコセルカ種及びプラスモディウム種のうちの1つ以上(またはそれらの任意の組み合わせ)が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は寄生生物である。開示された方法に従って検出され得る寄生生物の例としては、限定するものではないが、オンコセルカ種及びプラスモディウム種のうちの1つ以上(またはそれらの任意の組み合わせ)が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、寄生生物の例としては、必ずしも限定するものではないが、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、Leishmania braziliensis、L.infantum、L.mexicana、L.major、L.tropica、L.donovani、Naegleria fowleri、Giardia intestinalis(G.lamblia、G.duodenalis)、canthamoeba castellanii、Balamuthia madrillaris、Entamoeba histolytica、Blastocystic hominis、Babesia microti、Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayetanensis、Plasmodium falciparum、P.vivax、P.ovale、P.malariae、及びToxoplasma gondii、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
3.RNAアプタマー
特定の実施形態では、ガイドはエスコートされたガイドである。「エスコートされた」とは、CRISPR-Cas系または複合体またはガイドが、細胞内に選択された時間または場所に送達され、その結果、CRISPR-Cas系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、3 CRISPR-Cas系または複合体またはガイドの活性及び仕向け先は、細胞表面タンパク質またはその他の局所的な細胞成分などの、アプタマーリガンドに対する結合親和性を有するエスコートRNAアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、特定の時間に細胞に適用される外部エネルギー源などの一時的エフェクターなどの、細胞上または細胞内のアプタマーエフェクターに応答性であり得る。
特定の実施形態では、ガイドはエスコートされたガイドである。「エスコートされた」とは、CRISPR-Cas系または複合体またはガイドが、細胞内に選択された時間または場所に送達され、その結果、CRISPR-Cas系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、3 CRISPR-Cas系または複合体またはガイドの活性及び仕向け先は、細胞表面タンパク質またはその他の局所的な細胞成分などの、アプタマーリガンドに対する結合親和性を有するエスコートRNAアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、特定の時間に細胞に適用される外部エネルギー源などの一時的エフェクターなどの、細胞上または細胞内のアプタマーエフェクターに応答性であり得る。
エスコートされたCRISPR-Cas系または複合体は、ガイド分子構造、構成、安定性、遺伝子発現、またはそれらの任意の組み合わせを改善するように設計された機能的構造を有するガイド分子を有する。そのような構造は、アプタマーを含んでもよい。
アプタマーは、例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化と呼ばれる技術を使用して他のリガンドに緊密に結合するように設計または選択され得る生体分子である(SELEX;Tuerk C,Gold L:「Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase」Science 1990,249:505-510)。核酸アプタマーは、例えば、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから選択されてもよく、幅広い生物医学的に関連する標的に対して高い結合親和性及び特異性を有し、アプタマーの幅広い治療的有用性を示唆している(Keefe,Anthony D.,Supriya Pai、及びAndrew Ellington.「Aptamers as therapeutics」Nature Reviews Drug Discovery 9.7(2010):537-550)。これらの特性はまた、ドラッグデリバリービヒクルとしてのアプタマーの幅広い使用を示唆している(Levy-Nissenbaum,Etgar,et al.「Nanotechnology and aptamers:applications in drug delivery.「Trends in biotechnology 26.8(2008):442-449;及び、Hicke BJ、Stephens AW.「Escort aptamers:a delivery service for diagnosis and therapy.」J Clin Invest 2000,106:923-928.)。フルオロフォアと結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するRNAアプタマーなどの、特性を変化することによってキューに応答する、分子スイッチとして機能するアプタマーも構築され得る(Paige,Jeremy S.,Karen Y.Wu、及びSamie R.Jaffrey.「RNA mimics of green fluorescent protein.」Science 333.6042(2011):642-646)。アプタマーは、例えば、細胞表面タンパク質を標的する、標的化siRNA治療用デリバリーシステムの構成要素として使用され得ることも示唆されている(Zhou、Jiehua、及びJohn J.Rossi「Aptamer-targeted cell-specific RNA interference.」Silence 1.1(2010):4)。
したがって、特定の実施形態では、ガイド分子は、例えば、細胞膜を横切る、細胞内区画への、または核への送達を含む、ガイド分子送達を改善するように設計された1つ以上のアプタマー(複数可)によって修飾される。そのような構造は、ガイド分子を選択可能なエフェクターに送達可能、誘導可能または応答可能にさせるために、1つ以上のアプタマー(複数可)に加えて、またはそのような1つ以上のアプタマー(複数可)なしで、部分(複数可)を含んでもよい。したがって、本発明は、pH、低酸素、O2濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、露光、機械的破壊(例えば超音波)、磁場、電場、または電磁放射を含むがこれらに限定されない正常または病理学的生理学的状態に応答するガイド分子を包含する。
特定の実施形態では、RNA-アプタマーは、オクラトキシンA(OTA)を認識する。OTAは、Aspergillus ochraceus、A.carbonarius、A.niger、及びPenicillium verrucosumを含むいくつかの真菌種によって生成されるマイコトキシンである。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個々の個別のボリューム(以下でさらに定義される)で固体基材上に固定化され得、単一の試薬を隔離する。例えば、この試薬は、染料を含むビーズであってもよい。固定化試薬によって隔離されると、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物から解放されると、例えば凝集または溶液濃度の単純な増大によって検出可能なシグナルを生成し得る。ある特定の例示的な実施形態では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得る、RNAベースのアプタマーである。他の実施形態では、この固定されたマスキング剤は、標的分子の検出の際に、活性化されたエフェクタータンパク質によって切断され得るssDNAベースのアプタマーである。
ある特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、溶液中の固定化試薬に結合し、それにより、溶液中で遊離している別個の標識された結合パートナーに結合する試薬の能力を遮断する。したがって、試料に洗浄工程を適用すると、標識された結合パートナーは、標的分子の非存在下で試料から洗い流され得る。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化される場合、マスキング構築物は、マスキング構築物が試薬に結合する能力を妨害するのに十分な程度まで切断され、それにより標識結合パートナーが固定化試薬に結合することが可能になる。したがって、標識された結合パートナーは、洗浄工程後も残り、試料中の標的分子の存在を示す。特定の態様において、固定化された試薬に結合するマスキング構築物は、RNAアプタマーである。この固定化試薬はタンパク質であってもよく、標識された結合パートナーは標識された抗体であってもよい。あるいは、固定化試薬はストレプトアビジンであってもよく、標識された結合パートナーは、標識されたビオチンであってもよい。上記の実施形態で使用される結合パートナー上の標識は、当技術分野で公知の任意の検出可能な標識であってよい。さらに、他の公知の結合パートナーを、本明細書に記載されている全体的な設計に従って使用してもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物はリボザイムを含んでもよい。リボザイムは触媒作用を有するRNA分子である。リボザイムとは、天然及び人工の両方であり、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によって標的化され得るRNAを含むかまたはそれからなる。リボザイムは、負の検出可能なシグナルを生成するか、または正の制御シグナルの生成を防止する反応を触媒するように選択されても、または操作されてもよい。活性化されたエフェクタータンパク質によるリボザイムの失活時に、負の制御シグナルを生成するか、または正の検出可能なシグナルの生成を防止する反応が除去され、それによって正の検出可能なシグナルを生成することが可能になる。例示的な一実施形態では、リボザイムは、比色反応を触媒して、溶液を第1の色として表示し得る。リボザイムが不活性化されると、その溶液は第2の色に変わる。第2の色は検出可能な正のシグナルである。リボザイムを使用して比色反応を触媒する方法の例は、Zhao et al.「Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glumS」,Biosens Bioelectron.2014;16:337-42に記載されており、そのような系が、本明細書に開示されている実施形態の文脈において機能するようにどのように改変され得るかの例を示す。あるいは、リボザイムは、存在する場合、例えば、RNA転写物の切断産物を生成し得る。したがって、正の検出可能なシグナルの検出は、リボザイムの非存在下でのみ生成される非切断RNA転写物の検出を含み得る。
ある特定の例示的な実施形態では、1つ以上の試薬は、酵素などのタンパク質であり、比色、化学発光、または蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルの生成を促進し得、阻害または隔離されて、その結果、そのタンパク質は、1つ以上のRNAアプタマーのタンパク質への結合によって検出可能なシグナルを生成し得ない。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、RNAアプタマーは、検出可能なシグナルを生成するタンパク質の能力をもはや阻害しない程度まで切断または分解される。特定の例示的な実施形態では、アプタマーは、トロンビン阻害剤アプタマーである。特定の例示的な実施形態では、トロンビン阻害剤アプタマーは、GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC(配列番号414)の配列を有する。このアプタマーが切断されるとき、トロンビンが活性になり、ペプチドの比色または蛍光基質を切断する。特定の例示的な実施形態では、この比色基質は、トロンビンのペプチド基質に共有結合したパラ-ニトロアニリド(pNA)である。トロンビンによって切断されると、pNAが放出されて黄色になり、目で簡単に見えるようになる。特定の例示的な実施形態では、蛍光基質は、蛍光検出器を使用して検出され得る青色フルオロフォアである7-アミノ-4-メチルクマリンである。阻害アプタマーはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ベータ-ガラクトシダーゼ、または子牛のアルカリホスファターゼ(CAP)、及び上記の一般的な原理の範囲内で使用可能である。
ある特定の実施形態では、RNAseまたはDNAse活性は、酵素阻害アプタマーの切断を介して比色分析的に検出される。DNAseまたはRNAse活性を比色シグナルに変換する1つの潜在的なモードは、RNAアプタマーまたはssDNAの切断を、比色出力を生成できる酵素の再活性化と組み合わせることである。RNAまたはDNA切断がない場合、インタクトなアプタマーは酵素標的に結合し、その活性を阻害する。この読み出しシステムの利点は、酵素が追加の増幅ステップを提供することである:コラテラル活性(例えば、Cpf1またはCas13aコラテラル活性)によってアプタマーから解放されると、比色酵素は、比色産物を生成し続け、シグナルの増加をもたらす。
有利には、ある特定の実施形態では、比色読み取り値で酵素を阻害する既存のアプタマーが使用される。トロンビン、プロテインC、好中球エラスターゼ、スブチリシンなど、比色読み取りがあるいくつかのアプタマー/酵素の対が存在する。これらのプロテアーゼは、pNAに基づく比色基質を有し、市販されている。特定の実施形態では、一般的な比色酵素を標的とする新規アプタマーが使用される。β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、または子牛の腸のアルカリホスファターゼなどの一般的かつ強力な酵素は、SELEXなどの選択戦略によって設計された人工アプタマーの標的となり得る。このような戦略は、ナノモルの結合効率を有するアプタマーの迅速な選択を可能にし、比色読み取りのための追加の酵素/アプタマーの対の開発に使用し得る。
ある特定の実施形態では、RNAse活性は、RNAテザー阻害剤の切断を介して比色分析的に検出される。多くの一般的な比色酵素には、競合する可逆的な阻害剤がある:例えば、β-ガラクトシダーゼは、ガラクトースによって阻害され得る。これらの阻害剤の多くは弱いが、それらの効果は、局所濃度の増大によって増大され得る。RNAse活性に阻害剤の局所濃度をリンクさせることにより、比色酵素と阻害剤の対をRNAseセンサーに組み込んでもよい。小分子阻害剤に基づく比色RNAseセンサーには、3つの構成要素が含まれる:比色酵素、阻害剤、及び阻害剤と酵素の両方に共有結合し、阻害剤を酵素につなぐ架橋性RNA。切断されていない構成では、この酵素は、小分子の局所濃度の増大によって阻害される;RNAが切断されるとき(例えば、Cas13コラテラル切断などにより)、阻害剤が放出され、比色酵素が活性化される。比色シフトを検出する能力によって、可視波長での使用を容易にする検出へのアプローチが得られる。
ある特定の実施形態では、RNAse活性は、実施例8に記載のように、G-四重鎖の形成及び/または活性化を介して比色分析的に検出される。DNAのG四重鎖は、ヘム(鉄(III)-プロトポルフィリンIX)と複合体を形成し、ペルオキシダーゼ活性を有するDNAzymeを形成し得る。ペルオキシダーゼ基質(例えば、ABTS:(2,2’-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩))が供給された場合、過酸化水素の存在下でG-四重鎖-ヘム複合体は、基質の酸化を生じ、基質は次に溶液中で緑色になる。G-四重鎖形成DNA配列の例は、GGGTAGGGCGGGGGTTGGGA(配列番号415)である。RNA配列をこのDNAアプタマーにハイブリダイズさせることにより、G-四重鎖構造の形成が制限される。RNAseコラテラルの活性化(例えば、C2c2複合体コラテラル活性化)の際、RNAステープルが切断され、G四重鎖が形成され、ヘムが結合する。色の形成は酵素的であるため、この戦略は特に魅力的であり、すなわち、RNAse活性化を超える追加の増幅が存在する。
ある特定の実施形態では、DNAse活性は、実施例8に記載のように、G-四重鎖の形成及び/または活性化を介して比色分析的に検出される。DNAのG四重鎖は、ヘムと複合体を形成し(鉄(III)-プロトポルフィリンIX)、ペルオキシダーゼ活性を有するDNAzymeを形成し得る。ペルオキシダーゼ基質(例えば、ABTS:(2,2’-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩))が供給された場合、過酸化水素の存在下でG-四重鎖-ヘム複合体は、基質の酸化を生じ、基質は次に溶液中で緑色になる。G-四重鎖形成DNA配列の例は:GGGTAGGGCGGGGGTTGGGA(配列番号415)である。ssDNA配列をこのDNAアプタマーにハイブリダイズさせることにより、G-四重鎖構造の形成が制限される。DNAseコラテラルの活性化(例えば、Cpf1複合体コラテラル活性化)の際、DNAステープルが切断され、G四重鎖が形成され、ヘムが結合する。色の形成は酵素的であるため、この戦略は特に魅力的であり、すなわち、DNAse活性化を超える追加の増幅が存在する。
いくつかの実施形態では、核酸検出系は、酵素活性を有する四重鎖を含むRNA-アプタマーまたはDNAアプタマーを含む。特定の実施形態では、酵素活性はペルオキシダーゼ活性である。実施形態では、この方法、系、およびアッセイは、1つ以上の標的分子の指標としてフルオロフォアおよびクエンチャーを利用し得る。別の実施形態では、この方法、系およびアッセイは、1つ以上の標的分子の指標として比色シフトを利用し得る。標的分子は、DNA、RNA、またはそれらの組み合わせであり得る。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個々の個別の容積(以下でさらに定義される)で固体基材上に固定化され得、単一の試薬を隔離する。例えば、試薬は、染料を含むビーズであり得る。固定化試薬によって隔離されると、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物から解放されると、例えば凝集または溶液濃度の単純な増大によって検出可能なシグナルを生成し得る。特定の例示的な実施形態では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得る、RNAベースのアプタマーまたはssDNAベースのアプタマーである。
例示的な一実施形態では、マスキング構築物は、検出剤が凝集しているか溶液中に分散しているかに応じて色が変化する検出剤を含む。例えば、コロイド金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子に移動するにつれて、目に見える紫色から赤色にシフトする。したがって、特定の例示的な実施形態では、そのような検出剤は、1つ以上の架橋分子によって全体として保持され得る。例えば、図43を参照のこと。架橋分子の少なくとも一部は、RNAを含む。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際、架橋分子のRNA部分が切断され、検出剤が分散して、対応する色の変化がもたらされる。例えば、図46を参照のこと。ある特定の例示的な実施形態では、架橋分子はRNA分子である。他の実施形態では、架橋分子は、コラテラルssDNA活性を示すCasタンパク質とともに利用できるssDNA分子である。ある特定の例示的な実施形態では、検出剤は、コロイド金属である。コロイド金属材料は、液体、ヒドロゾル、または金属ゾルに分散された水不溶性金属粒子または金属化合物を含んでもよい。コロイド金属は、周期表のIA、IB、IIB及びIIIB族の金属、ならびに遷移金属、特にVIII族の金属から選択され得る。好ましい金属としては、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル及びカルシウムが挙げられる。他の適切な金属としては、さまざまな酸化状態の全てで次のものが含まれる:リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、プラチナ、及びガドリニウム。金属は、好ましくは、適切な金属化合物、例えば、Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+及びCa2+イオンから誘導されるイオン形態で提供される。
RNA架橋が活性化されたCRISPRエフェクターによって切断されると、前述の色のシフトが観察される。特定の例示的な実施形態では、粒子はコロイド金属である。特定の他の例示的な実施形態では、コロイド金属はコロイド金である。特定の例示的な実施形態では、コロイドナノ粒子は、15nmの金ナノ粒子(AuNP)である。金コロイドナノ粒子の固有の表面特性に起因して、溶液に完全に分散すると、520nmで最大の吸光度が観察され、肉眼では赤色に見える。AuNPが凝集すると、最大吸収の赤シフトが示され、色が暗くなり、最終的に溶液から濃い紫色の凝集体として沈殿する。特定の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から延びるDNAリンカーを含むように改変される。個々の粒子は、DNAリンカーの少なくとも一部に各端でハイブリダイズする一本鎖RNA(ssRNA)架橋によって一緒にリンクされる。したがって、ナノ粒子は、リンクされた粒子及び凝集体のウェブを形成し、暗い沈殿物としてみられる。本明細書に開示されるCRISPRエフェクターが活性化されると、ssRNA架橋が切断され、AU NPSがリンクされたメッシュから解放され、可視の赤色が生成される。DNAリンカーと架橋配列の例を以下に示す。DNAリンカーの末端にあるチオールリンカーは、AuNPSへの表面コンジュゲーションに使用され得る。他の形態のコンジュゲーションが使用されてもよい。ある特定の例示的な実施形態では、AuNPの2つの集団が、各DNAリンカーについて1つ、生成され得る。これにより、ssRNA架橋が適切な向きで適切に結合しやすくなる。ある特定の例示的な実施形態では、第1のDNAリンカーは3’末端によってコンジュゲートされ、第2のDNAリンカーは5’末端によってコンジュゲートされる。ssDNAコラテラル活性を示すCRISPR-エフェクタータンパク質のための同様の系をまた、本明細書に示される開示に従って設計してもよい。
ある他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な標識及びその検出可能な標識のマスキング剤が付着しているRNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。そのような検出可能な標識/マスキング剤の対の例は、フルオロフォアとフルオロフォアのクエンチャーである。フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光分子との間の非蛍光複合体の形成の結果として、フルオロフォアの消光が起こり得る。この機構は、基底状態の複合体形成、静的消光、または接触消光として公知である。したがって、RNAオリゴヌクレオチドは、フルオロフォア及びクエンチャーが、接触クエンチングが起こるのに十分に近接するように設計され得る。フルオロフォア及びそれらの同族クエンチャーは、当技術分野で公知であり、当業者によってこの目的のために選択され得る。特定のフルオロフォア/クエンチャーの対は、本発明の文脈において重要ではなく、フルオロフォア/クエンチャーの対の選択のみがフルオロフォアのマスキングを確実にする。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際に、RNAオリゴヌクレオチドが切断され、それにより、接触消光効果を維持するために必要なフルオロフォアとクエンチャーとの間の近接を切断する。したがって、フルオロフォアの検出を使用して、試料中の標的分子の存在を決定してもよい。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、金ナノ粒子などの1つ以上の金属ナノ粒子が付着している1つ以上のRNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する複数のRNAオリゴヌクレオチドによって架橋された複数の金属ナノ粒子を含む。一実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する3つのRNAオリゴヌクレオチドによって架橋された3つの金ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質によるRNAオリゴヌクレオチドの切断は、金属ナノ粒子によって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、1つ以上の量子ドットが付着している1つ以上のRNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質によるRNAオリゴヌクレオチドの切断は、量子ドットによって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
例示的な一実施形態では、マスキング構築物は量子ドットを含み得る。量子ドットは、表面に付着した複数のリンカー分子を有し得る。リンカー分子の少なくとも一部は、RNAを含む。リンカー分子は、量子ドットの消光が起こるのに十分近接してクエンチャーが維持されるように、リンカーの一端で量子ドットに、リンカーの長さに沿ってまたは末端で1つ以上のクエンチャーに取り付けられる。リンカーは分岐していてもよい。上記のように、量子ドット/クエンチャーの対は重要ではなく、量子ドット/クエンチャーの対の選択のみがフルオロフォアのマスキングを保証する。量子ドット及びそれらの同族クエンチャーは、当技術分野で公知であり、当業者によってこの目的のために選択され得る。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、リンカー分子のRNA部分が切断され、それにより、量子ドットと、消光効果を維持するのに必要な1つ以上のクエンチャーとの間の近接が排除される。特定の例示的な実施形態では、量子ドットは、ストレプトアビジンコンジュゲートされている。RNAは、ビオチンリンカーを介して結合され、配列/5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(配列番号:416)または/5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(配列番号:417)の配列でクエンチング分子を動員し、/5Biosgは、ビオチンタグであり、かつ/3lAbRQSp/はIowaブラッククエンチャーである。切断すると、本明細書に開示される活性化エフェクターによって、量子ドットは可視的に蛍光を発する。
同様の方法で、蛍光エネルギー転移(FRET)を使用して、検出可能な正のシグナルを生成してもよい。FRETは、エネルギー的に励起されたフルオロフォア(すなわち、「ドナーフルオロフォア」)からの光子が別の分子(すなわち、「アクセプター」)の電子のエネルギー状態を、励起一重項状態のより高い振動レベルに上げる非放射プロセスである。ドナーフルオロフォアは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光を発することなく基底状態に戻る。アクセプターは、別のフルオロフォアであっても、または非蛍光分子であってもよい。アクセプターがフルオロフォアである場合、転送されたエネルギーは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光として放出される。アクセプターが非蛍光分子である場合、吸収されたエネルギーは熱としての損失である。したがって、本明細書に開示される実施形態の文脈では、フルオロフォア/クエンチャーの対は、オリゴヌクレオチド分子に付着したドナーフルオロフォア/アクセプターの対で置き換えられる。インタクトな場合、マスキング構築物は、アクセプターから放出される蛍光または熱によって検出される第1のシグナル(検出可能な負のシグナル)を生成する。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際に、RNAオリゴヌクレオチドが切断され、FRETが破壊されて、その結果、ドナーフルオロフォアの蛍光が検出されるようになる(正の検出可能なシグナル)。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、長いRNAの短いヌクレオチドへの切断に応答して、それらの吸光度を変化させる挿入色素の使用を含む。そのような色素はいくつか存在する。例えば、ピロニンYは、RNAと複合体を形成し、572nmに吸収を有する複合体を形成する。RNAの切断により、吸光度が失われ、色が変化する。メチレンブルーは、RNA切断時に688nmでの吸光度が変化する同様の方法で使用され得る。したがって、特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によるRNAの切断時に吸光度を変化させるRNA及び挿入色素複合体を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、HCR反応のための開始因子を含んでもよい。例えば、Dirks及びPierce.PNAS 101,15275-15728(2004)を参照のこと。HCR反応は、2つのヘアピン種のポテンシャルエネルギーを利用する。ヘアピンの1つ上の対応する領域に相補的な部分を有する一本鎖開始因子が以前の安定した混合物に放出されると、1つの種のヘアピンが開く。このプロセスは、次に、他の種のヘアピンを開く一本鎖領域を露出させる。このプロセスは、次に、元の開始因子と同一の一本鎖領域を露出させる。結果として生じる連鎖反応は、ヘアピンの供給がなくなるまで成長するニックの入った二重らせんの形成につながる可能性がある。得られた生成物の検出は、ゲル上で、または比色分析で行ってもよい。比色検出法の例としては、例えば、Lu et al.Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction-triggered enzyme cascade amplification ACS Appl Mater Interfaces,2017,9(1):167-175,Wang et al.「An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers」Analyst 2015,150,7657-7662、及びSong et al.「Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection.」Applied Spectroscopy,70(4):686-694(2016)に開示される方法が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、HCR開始因子配列、及びこの開始因子がHCR反応を開始するのを防ぐ、ループまたはヘアピンなどの切断可能な構造要素を含み得る。活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質による構造要素の切断時に、次に開始因子が放出されてHCR反応を引き起こし、その検出は試料中の1つ以上の標的の存在を示す。ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、RNAループを有するヘアピンを含む。活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質がRNAループを切断するとき、この開始因子が解放されてHCR反応が誘発され得る。
標的の増幅
ある特定の例示的な実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化する前に、標的RNA及び/またはDNAを増幅してもよい。任意の適切なRNAまたはDNA増幅技術が使用され得る。ある特定の例示的な実施形態では、RNAまたはDNA増幅は等温増幅である。特定の例示的な実施形態では、等温増幅は、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、またはニック酵素の増幅反応(NEAR)であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、限定するものではないが、PCR、複数置換増幅(MDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、または分岐増幅法(RAM)を含む非等温増幅法を使用してもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化する前に、標的RNA及び/またはDNAを増幅してもよい。任意の適切なRNAまたはDNA増幅技術が使用され得る。ある特定の例示的な実施形態では、RNAまたはDNA増幅は等温増幅である。特定の例示的な実施形態では、等温増幅は、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、またはニック酵素の増幅反応(NEAR)であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、限定するものではないが、PCR、複数置換増幅(MDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、または分岐増幅法(RAM)を含む非等温増幅法を使用してもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、RNAまたはDNA増幅は、RNA/DNA二重鎖を作成するための配列特異的リバースプライマーによる標的RNAの逆転写で開始される、NASBAである。次に、RNase Hを使用してRNA鋳型を分解し、T7プロモーターなどのプロモーターを含むフォワードプライマーが結合して相補性鎖の伸長を開始し、二本鎖DNA産物を生成しすることを可能にする。次に、RNAポリメラーゼプロモーターを介したDNA鋳型の転写により、標的RNA配列のコピーが作成される。重要なことに、新しい標的RNAはそれぞれガイドRNAによって検出され得るので、アッセイの感度がさらに向上する。次いで、ガイドRNAによる標的RNAの結合は、CRISPRエフェクタータンパク質の活性化につながり、この方法は上記で概説したように進行する。NASBA反応には、適度な等温条件下、例えば約41℃で進行し得るという追加の利点があり、現場での、臨床検査室から離れた、早期かつ直接の検出用に配備された系及びデバイスに適するようになる。
ある特定の他の例示的な実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)反応を使用して、標的核酸を増幅し得る。RPA反応は、配列特異的プライマーを二重鎖DNAの相同配列と対合し得るリコンビナーゼを使用する。標的DNAが存在する場合、DNA増幅が開始され、熱サイクルまたは化学融解などの他の試料操作は必要ない。RPA増幅系全体は、乾燥した製剤として安定しており、冷蔵せずに安全に輸送され得る。RPA反応はまた、37~42℃の最適反応温度での等温温度で実行されてもよい。配列特異的プライマーは、検出されるべき標的核酸配列を含む配列を増幅するように設計される。ある特定の例示的な実施形態では、T7プロモーターなどのRNAポリメラーゼプロモーターを、プライマーの1つに加える。これは、標的配列及びRNAポリメラーゼプロモーターを含む増幅された二本鎖DNA産物をもたらす。RPA反応の後、またはその間に、二本鎖DNA鋳型からRNAを生成するRNAポリメラーゼを追加する。次に、増幅された標的RNAをCRISPRエフェクター系によって検出し得る。このようにして、標的DNAは、本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得る。RPA反応は、標的RNAの増幅にも使用され得る。標的RNAは、最初に逆転写酵素を使用してcDNAに変換され、次に第2の鎖のDNA合成が行われ、この時点でRPA反応は上記で概説したとおり進行する。
本発明の一実施形態では、ニッキング酵素は、CRISPRタンパク質である。したがって、dsDNAへのニックの導入は、プログラム可能であり、配列特異的であり得る。図112は、dsDNA標的の反対の鎖を標的とするように設計された2つのガイドから始まる、本発明の実施形態を描写する。本発明によれば、ニッカーゼは、Cpf1、C2c1、Cas9、またはDNA二重鎖の一本鎖を切断するか、または切断するように設計された任意のオルソログまたはCRISPRタンパク質であり得る。次いで、ニックの入った鎖は、ポリメラーゼによって伸長され得る。一実施形態では、ニックの位置は、ポリメラーゼによる鎖の伸長が、ニック部位間の標的二本鎖DNAの中央部分に向かうように選択される。特定の実施形態では、プライマーは、伸長鎖にハイブリダイズし得る反応に含まれ、その後、プライマーのさらなるポリメラーゼ伸長により、以下のような2つのdsDNA片が再生される:第1鎖Cpf1ガイド部位または第1及び第2鎖Cpf1ガイド部位の両方を含む第1のdsDNA、ならびに第2鎖Cpf1ガイド部位または第1及び第2の鎖Cprfガイド部位の両方を含む第2のdsDNA。これらの断片は、ニッキング部位の間の標的の領域を指数関数的に増幅する周期的な反応で、ニッキングされ、拡張され続ける。
この増幅は、等温であり、温度について選択され得る。一実施形態では、増幅は37度で急速に進行する。他の実施形態では、等温増幅の温度は、異なる温度で操作可能なポリメラーゼ(例えば、Bsu、Bst、Phi29、クレノウフラグメントなど)を選択することによって選択されてもよい。
したがって、ニッキング等温増幅技術は、(例えば、ニッキング酵素増幅反応またはNEARにおいて)固定された配列優先性を有するニッキング酵素を使用するが、これは、元のdsDNA標的を変性して、ニッキング基質を標的の末端に追加する、プライマーのアニーリング及び伸長を可能にすることと、CRISPRニッカーゼの使用であって、このニッキング部位は、変性ステップが不要であることを意味する、ガイドRNAを介してプログラム可能であり得る使用と、反応全体を真に等温にし得ることとを必要とする。これはまた、ニッキング基質を追加するこれらのプライマーが反応の後半で使用されるプライマーとは異なるので、反応を簡略化し、すなわち、NEARには2つのプライマーセット(すなわち4プライマー)が必要であるが、Cpf1のニッキング増幅には1つのプライマーセット(すなわち2プライマー)しか必要としない。これにより、Cpf1増幅のニッキングは、変性を行ってから等温温度に冷却するための複雑な機器を使わなくても、操作がはるかに簡単で簡単になる。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される系は、増幅試薬を含んでもよい。核酸の増幅に有用な異なる成分または試薬が、本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載される増幅試薬は、Tris緩衝液などの緩衝液をさらに含んでもよい。Tris緩衝液は、例えば、限定するものではないが、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、25mM、50mM、75mM、1Mなどの濃度を含む、所望の適用または使用に適切な任意の濃度で使用され得る。当業者は、本発明で使用するためのTrisなどの緩衝液の適切な濃度を決定し得るであろう。
核酸断片の増幅を改善するために、塩化マグネシウム(MgCl2)、塩化カリウム(KCl)、または塩化ナトリウム(NaCl)などの塩を、PCRなどの増幅反応に含んでもよい。塩濃度は特定の反応及び用途に依存するが、いくつかの実施形態では、特定のサイズの核酸断片は、特定の塩濃度で最適な結果を生み出す場合がある。より大きな生成物は、望ましい結果を生み出すために、塩濃度の変更、通常はより低い塩を必要とする場合もあり、より小さな生成物の増幅は、より高い塩濃度でより良い結果を生じ得る。当業者は、塩濃度の変化とともに塩の存在及び/または濃度が、生物学的または化学反応のストリンジェンシーを変化し得させ、したがって、適切な条件を提供する任意の塩が、本発明の反応のために、及び本明細書に記載のとおり使用され得ることを理解するであろう。
生物学的反応または化学反応の他の構成要素は、その中の物質の分析のために細胞を破壊するかまたは溶解するために、細胞溶解成分を含んでもよい。細胞溶解成分は、限定するものではないが、界面活性剤、上記の塩、例えば、NaCl、KCl、硫酸アンモニウム[(NH4)2SO4]、またはその他を含んでもよい。本発明に適切であり得る界面活性剤としては、TritonX-100、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、CHAPS(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート)、臭化エチルトリメチルアンモニウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール(NP-40)が挙げられ得る。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依存し得、場合によっては反応に特異的であり得る。増幅反応は、限定するものではないが、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mMなどの濃度を含む、本発明に適切な任意の濃度で使用されるdNTP及び核酸プライマーを含んでもよい。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、Taqポリメラーゼ、Q5ポリメラーゼなどを含む、当該技術分野で公知であり、本発明に有用な任意の特定のポリメラーゼであっても、または一般的なポリメラーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される増幅試薬は、ホットスタート増幅での使用に適切であり得る。ホットスタート増幅は、いくつかの実施形態では、アダプター分子もしくはオリゴの二量体化を低減または排除するか、そうでなければ不要な増幅産物もしくはアーチファクトを防ぎ、所望の産物の最適な増幅を得るために有益であり得る。増幅に使用するために本明細書に記載されている多くの成分は、ホットスタート増幅にも使用してもよい。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用に適切な試薬または成分は、必要に応じて、1つ以上の組成物成分の代わりに使用され得る。例えば、特定の温度または他の反応条件で所望の活性を示すポリメラーゼまたは他の試薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用のために設計または最適化された試薬を使用してもよく、例えば、ポリメラーゼは、転位後または特定の温度に達した後に活性化され得る。そのようなポリメラーゼは、抗体ベースであっても、またはアパタマーベースであってもよい。本明細書に記載されるポリメラーゼは、当該技術分野で公知である。そのような試薬の例としては、限定するものではないが、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートdNTP、及び光ケージ化dNTPが挙げられる。そのような試薬は、当該技術分野で公知であり、入手可能である。当業者は、個々の試薬に適切な最適温度を決定し得るであろう。
核酸の増幅は、特定の熱サイクル機械または装置を使用され得、単一の反応またはバルクで実行され得るので、任意の所望の反応数を同時に実行し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、マイクロ流体デバイスまたはロボットデバイスを使用して実行してもよいし、または所望の増幅を達成するために温度の手動変更を使用して実行してもよい。いくつかの実施形態では、最適化を実行して、特定の用途または材料に最適な反応条件を得てもよい。当業者は、十分な増幅を得るために反応条件を理解し、最適化し得るであろう。
ある特定の実施形態では、本発明の方法または系によるDNAの検出は、検出の前に(増幅された)DNAのRNAへの転写を必要とする。
本発明の検出方法は、様々な組み合わせでの核酸増幅及び検出手順を含み得ることが明らかであろう。検出されるべき核酸は、任意の適切な方法によって増幅されて、検出され得る中間産物を提供し得る、DNA及びRNAを含むがこれらに限定されない、天然の核酸であっても、または合成の核酸であってもよい。中間産物の検出は、直接またはコラテラル活性によって検出可能なシグナル部分を生成する、CRISPRタンパク質の結合及び活性化を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によってもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、検出可能な正のシグナルをさらに増幅するさらなる修飾を導入してもよい。例えば、活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質のコラテラル活性化は、二次標的もしくは追加のガイド配列、またはその両方を生成するために使用してもよい。例示的な一実施形態では、反応溶液は、高濃度でスパイクされる二次標的を含むであろう。二次標的は、一次標的(すなわち、アッセイが検出するように設計されている標的)とは異なる場合があり、特定の例では、全ての反応容量にわたって共通であり得る。二次標的の二次ガイド配列は、例えば、RNAループのあるヘアピンなどの二次構造的特徴により、保護されてもよく、第2の標的にもCRISPRエフェクタータンパク質にも結合できない。活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質による保護基の切断(すなわち、溶液中の1次標的(複数可)との複合体の形成による活性化後)、及び溶液中の遊離のCRISPRエフェクタータンパク質との複合体の形成、及び2次標的のスパイクからの活性化。特定の他の例示的な実施形態では、同様の概念が、二次標的配列への第2のガイド配列と共に使用される。二次標的配列は、二次標的上の構造的特徴または保護基を保護し得る。二次標的から保護基を切断すると、追加のCRISPRエフェクタータンパク質/二次ガイド配列/二次標的複合体の形成が可能になる。さらに別の例示的な実施形態では、一次標的(複数可)によるCRISPRエフェクタータンパク質の活性化を使用して、保護または環状化プライマーを切断し、次いでこれを放出して、本明細書に開示されるような等温増幅反応を、二次ガイド配列、二次標的配列、またはその両方をコードする鋳型で実施する。この増幅された鋳型のその後の転写により、より多くの二次ガイド配列及び/または二次標的配列が生成され、その後、追加のCRISPRエフェクタータンパク質のコラテラル活性化が続く。
RNA誘導型Cpf1のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。一実施形態では、Cpf1系を操作して、RNAのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。別の実施形態では、Cpf1系を操作して、ssDNAのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。したがって、設計されたCpf1系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作のプラットフォームを提供する。Cpf1は、哺乳類の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発される。Cpf1は、配列特異的な標的DNA結合によって活性化されると、RNA及びssDNAのロバストなコラテラル切断が可能である。
RNA誘導C2c1のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。一実施形態では、C2c1系を操作して、RNAのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。別の実施形態において、C2c1系を操作して、ssDNAのコラテラル非特異的切断を提供及び利用する。したがって、設計されたC2c1系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作、ならびに細胞死の誘導のためのプラットフォームを提供する。C2c1は、哺乳動物の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発されている。C2c1は、配列特異的な標的DNA結合によって活性化されると、RNA及びssDNAのロバストなコラテラル切断が可能である。
標的RNA/DNA濃縮(富化)
ある特定の例示的な実施形態では、標的RNAまたはDNAは、標的RNAまたはDNAの検出または増幅の前に最初に濃縮されてもよい。特定の例示的な実施形態では、この濃縮は、CRISPRエフェクター系による標的核酸の結合によって達成され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、標的RNAまたはDNAは、標的RNAまたはDNAの検出または増幅の前に最初に濃縮されてもよい。特定の例示的な実施形態では、この濃縮は、CRISPRエフェクター系による標的核酸の結合によって達成され得る。
現在の標的特異的濃縮プロトコルは、プローブとのハイブリダイゼーションの前に一本鎖核酸を必要とする。様々な利点のうちでも、本実施形態は、このステップをスキップして、二本鎖DNA(部分的または完全に二本鎖のいずれか)への直接標的化を可能にし得る。さらに、本明細書に開示される実施形態は、等温濃縮を可能にする、より速い速度論及びより容易なワークフローを提供する酵素駆動の標的化方法である。特定の例示的な実施形態では、濃縮は、20~37℃という低い温度で行われ得る。特定の例示的な実施形態では、異なる標的核酸へのガイドRNAのセットが、単一のアッセイにおいて使用され、複数の標的及び/または単一の標的の複数のバリアントの検出を可能にする。
ある特定の例示的な実施形態では、デッド(dead)CRISPRエフェクタータンパク質は、溶液中の標的核酸に結合し、次いで上記溶液から単離されてもよい。例えば、標的核酸に結合したデッドCRISPRエフェクタータンパク質は、デッドCRISPRエフェクタータンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーなどの他の分子を使用して溶液から単離され得る。
他の例示的な実施形態では、デッドCRISPRエフェクタータンパク質は、固体基質に結合し得る。固定された基質とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの付着に適切であるか、または適切になるように改変され得る任意の材料を指す場合がある。可能性のある基材としては、限定するものではないが、ガラスと改変された機能化ガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon(商標)など)、多糖類、ナイロン、またはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料、例としては、シリコン及び変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、及びその他のさまざまなポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則正しいパターンでの分子の固定化に適したパターン化表面を含む。特定の実施形態では、パターン化表面は、固体支持体の露出した層の中または上の異なる領域の配置を指す。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェルまたは窪みのアレイを含む。固体支持体の組成及び形状は、その用途によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び/またはアレイなどの平面構造である。したがって、基材の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの1つ以上の表面を含む。本明細書で使用する「フローセル」という用語は、1つ以上の流体試薬を流すことができる固体表面を備えるチャンバを指す。本開示の方法で容易に使用できる例示的なフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームは、例えば、Bentley et al.Nature 456:53-59(2008)、WO04/0918497、米国特許第7,057,026号;WO 91/06678;WO 07/123744;米国特許第7,329,492号;米国特許第7,211,414号;米国特許第7,315,019号;米国特許第7,405,281号、及び米国特許出願公開第2008/0108082号に記載されている。いくつかの実施形態では、固体支持体またはその表面は、チューブまたは容器の内面または外面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェアまたはビーズを含む。「ミクロスフェア」、「ビーズ」、「粒子」は、プラスチック、セラミック、ガラス、及びポリスチレンを含むがこれらに限定されない様々な材料でできた小さな個別の粒子を意味する固体基材の文脈内で意味するものとする。特定の実施形態では、ミクロスフェアとは、磁性ミクロスフェアまたはビーズである。あるいはまたはさらに、ビーズは多孔性であってもよい。ビーズのサイズは、ナノメートルの範囲、例えば、100nmから数ミリメートル、例えば1mmである。
次に、標的核酸を含むか、または含む疑いのある試料を基質に曝露して、結合したデッドCRISPRエフェクタータンパク質への標的核酸の結合を可能にし得る。次に、非標的分子を洗い流してもよい。特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、本明細書に開示される方法を使用してさらに検出するために、CRISPRエフェクタータンパク質/ガイドRNA複合体から放出されてもよい。特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、本明細書に記載されるように最初に増幅されてもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、CRISPRエフェクターは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施形態では、CRISPRエフェクターは、化学的にタグ付けされ得る。例えば、CRISPRエフェクターは化学的にビオチン化されてもよい。別の例示的な実施形態では、融合は、CRISPRエフェクターに融合をコードする追加の配列を追加することによって作成され得る。そのような融合の1つの例は、AviTag(商標)であり、これは、固有の15アミノ酸ペプチドタグ上の単一のビオチンの高度に標的化された酵素コンジュゲーションを採用している。特定の実施形態では、CRISPRエフェクターは、GST、Myc、ヘマグルチニン(HA)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、フラグ、Hisタグ、TAPタグ、及びFcタグなどであるがこれらに限定されない捕捉タグで標識され得る。結合タグは、融合、化学タグ、捕捉タグのいずれであっても、標的核酸に結合した後、CRISPRエフェクター系をプルダウンするか、またはCRISPRエフェクター系を固体基材に固定するために使用され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、ガイドRNAは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施形態では、ガイドRNA全体は、ビオチン化ウラシルなどの1つ以上のビオチン化ヌクレオチドを組み込んだインビトロ転写(IVT)を使用して標識してもよい。いくつかの実施形態では、ビオチンは、ガイドRNAの3’末端への1つ以上のビオチン基の付加など、ガイドRNAに化学的または酵素的に付加され得る。結合タグは、例えば、ガイドRNA/標的核酸をストレプトアビジンコーティング固体基質に曝露することにより、結合が起こった後にガイドRNA/標的核酸複合体をプルダウンするために使用されてもよい。
特定の実施形態では、固体基材は、フローセルであってもよい。特定の実施形態では、フローセルは、試験試料中の分析物の存在または量を検出するためのデバイスであり得る。フローセルデバイスは、試験試料に含まれ得る分析物に対して電気的または光学的に検出可能な応答を生成する固定化試薬手段を有し得る。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、操作された、または天然に存在しないCRISPRエフェクターを、濃縮目的で使用してもよい。一実施形態では、改変は、エフェクタータンパク質の1つ以上のアミノ酸残基の変異を含み得る。1つ以上の変異は、エフェクタータンパク質の1つ以上の触媒的に活性なドメインにあってよい。エフェクタータンパク質は、上記1つ以上の変異を欠くエフェクタータンパク質と比較して、ヌクレアーゼ活性が低下または消失している可能性がある。エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座でのRNA鎖の切断を指示しない場合がある。好ましい実施形態では、1つ以上の変異は、2つの変異を含み得る。好ましい実施形態では、1つ以上のアミノ酸残基は、C2c2エフェクタータンパク質、例えば、操作されたまたは天然には存在しないエフェクタータンパク質またはC2c2で改変される。特定の実施形態では、変異アミノ酸残基の1つ以上の改変は、変異R597A、H602A、R1278A及びH1283Aのような、R597、H602、R1278及びH1283(Lsh C2c2アミノ酸と呼ばれる)に対応するC2c2中のもののうちの1つ以上、またはLsh C2c2オルソログの対応するアミノ酸残基である。
特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基の1つ以上の改変は、C2c2コンセンサス番号付けに応じて、K2、K39、V40、E479、L514、V518、N524、G534、K535、E580、L597、V602、D630、F676、L709、I713、R717(HEPN)、N718、H722(HEPN)、E773、P823、V828、I879、Y880、F884、Y997、L1001、F1009、L1013、Y1093、L1099、L1111、Y1114、L1203、D1222、Y1244、L1250、L1253、K1261、I1334、L1355、L1359、R1362、Y1366、E1371、R1372、D1373、R1509(HEPN)、H1514(HEPN)、Y1543、D1544、K1546、K1548、V1551、I1558に対応するC2c2のもののうち1つ以上である。ある特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基の1つ以上の改変は、R717及びR1509に対応するC2c2のそれらの1つ以上である。ある特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基のうち1つ以上は、K2、K39、K535、K1261、R1362、R1372、K1546及びK1548に対応するC2c2内のものの1つ以上である。ある特定の実施形態では、上記変異は、変化したまたは改変された活性を有するタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、上記変異は、低下した特異性などの低下した活性を有するタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、上記変異は、触媒活性を有さない(すなわち、「デッド」C2c2)タンパク質をもたらす。一実施形態では、上記アミノ酸残基は、Lsh C2c2アミノ酸残基、または異なる種に由来するC2c2タンパク質の対応するアミノ酸残基に対応する。これらの手順を容易にし得るデバイス。いくつかの実施形態では、Cas13bエフェクターと1つ以上の機能的ドメインの融合タンパク質のサイズを小さくするために、Cas13bエフェクターのC末端を、そのRNA結合機能を維持したたまで切断し得る。例えば、少なくとも20アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも80アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸、または少なくとも150アミノ酸、または少なくとも200アミノ酸、または少なくとも250アミノ酸、または少なくとも300アミノ酸、または少なくとも350アミノ酸、または最大120アミノ酸、または最大140アミノ酸、または最大160アミノ酸、または最大180アミノ酸、または最大200アミノ酸、または最大250アミノ酸、または最大300アミノ酸、または最大350アミノ酸、または最大400アミノ酸は、Cas13bエフェクターのC末端で切断されてもよい。Cas13b切断の特定の例としては、C末端Δ984-1090、C末端Δ1026-1090、及びC末端Δ1053-1090、C末端Δ934-1090、C末端Δ884-1090、C末端Δ834-1090、C-末端Δ784-1090、及びC末端Δ734-1090が含まれ、ここで、アミノ酸位置は、Prevotella sp.P5-125 Cas13bタンパク質のアミノ酸位置に対応する。
したがって、いくつかの例示的な実施形態では、CRISPR系は、触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質を含み得る。特定の実施形態では、触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性なC2c2であってもよい。
上記の濃縮システムはまた、ある特定の核酸の試料を枯渇させるためにも使用され得る。例えば、ガイドRNAは、非標的RNAを結合して試料から非標的RNAを除去するように設計され得る。例示的な一実施形態では、ガイドRNAは、特定の核酸変異を保持する核酸を結合するように設計されてもよい。例えば、所与の試料では、より多くのコピー数の非変異型核酸が予想される場合がある。したがって、本明細書に開示される実施形態を使用して、試料から非変異核酸を除去し、検出CRISPRエフェクター系が所与の試料中の標的変異配列を検出できる効率を高めてもよい。
診断デバイス
本明細書で説明される系は、診断デバイス上で具現化し得る。多くの基材及び構成が使用され得る。デバイスは、デバイス内の複数の個別のボリュームを定義し得る場合がある。本明細書で使用される場合、「個々の個別のボリューム」とは、標的分子の移動を防止及び/または阻害する特性によって定義され得る、容器、レセプタクル、または他の定義されたボリュームもしくは空間などの個別の空間、例えば、壁、例えば、ウェルの壁、チューブ、または液滴の表面などの物理的特性によって定義されるボリュームまたは空間を指し、これは不透過性もしくは半透過性であってもよく、または化学的、拡散速度制限、電磁もしくは光照明、あるいは定義された空間内に試料を含み得るそれらの任意の組み合わせなどの他の手段によって定義されてもよい。個々の個別のボリュームは、核酸バーコードなどの分子タグによって識別され得る。「拡散速度が制限される」とは(例えば、拡散によって定義されたボリューム)は、拡散によって標的分子の1つの流れから他の流れへの移行が制限される、2つの平行な層流の場合と同様に、拡散の制約が空間または体積を効果的に定義するので、特定の分子または反応にのみアクセスできる空間を意味する。「化学的」な定義されたボリュームまたは空間とは、サイズなどの化学的または分子的特性のおかげで特定の標的分子のみが存在し得る空間を意味し、例えば、ゲルビーズは、ビーズの内部に入る可能性のある種の選択を可能にし得る、ビーズの表面電荷、マトリックスサイズまたは他の物理的性質などによって、他ではなく特定の種がビーズに入ることを排除し得る。「電磁的に」定義されたボリュームまたは空間とは、標的分子の電磁特性または電荷もしくは磁気特性などのそれらの支持体を使用して、磁場内にまたは磁石に直接、磁性粒子を捕捉するなど、空間内の特定の領域を定義し得る空間を意味する。「光学的に」規定されたボリュームとは、規定された空間またはボリューム内の標的分子のみが標識され得るように、可視、紫外、赤外線、または他の波長の光でそれを照射することによって規定され得る、空間の任意の領域を意味する。非壁または半透過性の個別のボリュームを使用する利点の1つは、緩衝液、化学活性剤、またはその他の試薬などの一部の試薬が個別のボリュームを通過し得る一方で、標的分子などの他の材料は別個のボリュームまたは空間に維持され得るということである。通常、個別のボリュームには、標的分子を、標識を可能にする条件下で、インデックス可能な核酸識別子を用いて標識するのに適した流体媒体(例えば、水溶液、オイル、緩衝液、及び/または細胞増殖を支持可能な媒体)が含まれる。開示された方法において有用な例示的な個別のボリュームまたは空間としては、とりわけ、液滴(例えば、マイクロ流体液滴及び/またはエマルジョン液滴)、ヒドロゲルビーズまたは他のポリマー構造(例えば、ポリエチレングリコールジアクリレートビーズまたはアガロースビーズ)、組織スライド(例えば、特定の領域、ボリューム、または空間が化学的、光学的、または物理的手段によって定義された、固定ホルマリンパラフィン包埋組織スライド)、配列されたアレイまたはランダムパターンで試薬を配置することによって領域が定義された顕微鏡スライド、チューブ(遠心チューブ、マイクロ遠心チューブ、試験管、キュベット、コニカルチューブなど)、ボトル(ガラスボトル、プラスチックボトル、セラミックボトル、エーレンマイヤーフラスコ、シンチレーションバイアルなど)、ウェル(プレートのウェルなど)、プレート、ピペット、またはピペットチップが挙げられる。特定の実施形態では、区画は、油中水型エマルジョン中の水性液滴である。特定の実施形態では、正確なまたは均一な容量を必要とする、本明細書に記載の用途、方法、または系のいずれかが、音響液体ディスペンサーの使用を採用し得る。
本明細書で説明される系は、診断デバイス上で具現化し得る。多くの基材及び構成が使用され得る。デバイスは、デバイス内の複数の個別のボリュームを定義し得る場合がある。本明細書で使用される場合、「個々の個別のボリューム」とは、標的分子の移動を防止及び/または阻害する特性によって定義され得る、容器、レセプタクル、または他の定義されたボリュームもしくは空間などの個別の空間、例えば、壁、例えば、ウェルの壁、チューブ、または液滴の表面などの物理的特性によって定義されるボリュームまたは空間を指し、これは不透過性もしくは半透過性であってもよく、または化学的、拡散速度制限、電磁もしくは光照明、あるいは定義された空間内に試料を含み得るそれらの任意の組み合わせなどの他の手段によって定義されてもよい。個々の個別のボリュームは、核酸バーコードなどの分子タグによって識別され得る。「拡散速度が制限される」とは(例えば、拡散によって定義されたボリューム)は、拡散によって標的分子の1つの流れから他の流れへの移行が制限される、2つの平行な層流の場合と同様に、拡散の制約が空間または体積を効果的に定義するので、特定の分子または反応にのみアクセスできる空間を意味する。「化学的」な定義されたボリュームまたは空間とは、サイズなどの化学的または分子的特性のおかげで特定の標的分子のみが存在し得る空間を意味し、例えば、ゲルビーズは、ビーズの内部に入る可能性のある種の選択を可能にし得る、ビーズの表面電荷、マトリックスサイズまたは他の物理的性質などによって、他ではなく特定の種がビーズに入ることを排除し得る。「電磁的に」定義されたボリュームまたは空間とは、標的分子の電磁特性または電荷もしくは磁気特性などのそれらの支持体を使用して、磁場内にまたは磁石に直接、磁性粒子を捕捉するなど、空間内の特定の領域を定義し得る空間を意味する。「光学的に」規定されたボリュームとは、規定された空間またはボリューム内の標的分子のみが標識され得るように、可視、紫外、赤外線、または他の波長の光でそれを照射することによって規定され得る、空間の任意の領域を意味する。非壁または半透過性の個別のボリュームを使用する利点の1つは、緩衝液、化学活性剤、またはその他の試薬などの一部の試薬が個別のボリュームを通過し得る一方で、標的分子などの他の材料は別個のボリュームまたは空間に維持され得るということである。通常、個別のボリュームには、標的分子を、標識を可能にする条件下で、インデックス可能な核酸識別子を用いて標識するのに適した流体媒体(例えば、水溶液、オイル、緩衝液、及び/または細胞増殖を支持可能な媒体)が含まれる。開示された方法において有用な例示的な個別のボリュームまたは空間としては、とりわけ、液滴(例えば、マイクロ流体液滴及び/またはエマルジョン液滴)、ヒドロゲルビーズまたは他のポリマー構造(例えば、ポリエチレングリコールジアクリレートビーズまたはアガロースビーズ)、組織スライド(例えば、特定の領域、ボリューム、または空間が化学的、光学的、または物理的手段によって定義された、固定ホルマリンパラフィン包埋組織スライド)、配列されたアレイまたはランダムパターンで試薬を配置することによって領域が定義された顕微鏡スライド、チューブ(遠心チューブ、マイクロ遠心チューブ、試験管、キュベット、コニカルチューブなど)、ボトル(ガラスボトル、プラスチックボトル、セラミックボトル、エーレンマイヤーフラスコ、シンチレーションバイアルなど)、ウェル(プレートのウェルなど)、プレート、ピペット、またはピペットチップが挙げられる。特定の実施形態では、区画は、油中水型エマルジョン中の水性液滴である。特定の実施形態では、正確なまたは均一な容量を必要とする、本明細書に記載の用途、方法、または系のいずれかが、音響液体ディスペンサーの使用を採用し得る。
ある特定の例示的な実施形態では、個々の個別のボリュームは、固体基板上に定義される。ある特定の実施形態では、個々の別個のボリュームは、マイクロウェルである。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、多数のスポットを定義し得る可塑性材料基材を備える。診断及びバイオセンシングでの使用に適した可塑性基材材料は、当技術分野で公知である。可塑性基材材料は、セルロース系繊維などの植物由来の繊維から作製されてもよく、または可塑性ポリエステルフィルム及び他のポリマータイプなどの可塑性ポリマーから作製されてもよい。規定された各スポット内で、本明細書に記載されている系の試薬が個々のスポットに適用される。各スポットには、異なるガイドRNAもしくはガイドRNAのセットを除いて、同じ試薬が含まれてもよいし、または、複数の標的を一度にスクリーニングするための異なる検出アプタマーが適用可能である。したがって、本明細書の系及びデバイスは、同じ標的、または限られた数の標的の存在について、複数の供給源(例えば、異なる個人からの複数の臨床試料)、または試料中の複数の異なる標的の存在について単一の試料(または同じ供給源由来の複数の試料)のアリコートから、試料をスクリーニングし得る。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載される系の要素は、紙または布の基材上に凍結乾燥される。特定の例示的なデバイスで使用され得る例示的な可塑性材料ベースの基材は、Pardee et al.Cell.2016,165(5):1255-66及びPardee et al.Cell.2014,159(4):950-54に開示される。血液を含む生体液に使用するのに適した可塑性材料ベースの基材は、Shevkoplyasらに対する「Paper based diagnostic test」という名称の国際特許出願公開WO/2013/071301、Siegelらへの「Paper-based microfluidic systems」と題された米国特許出願公開第2011/0111517号、及びShafieeら「Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets」Scientific Reports 5:8719(2015)に開示されている。さらなる可塑性可塑性ベースの材料としては、Wang et al.「Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics」Cell 34(11):909-21(2016)に開示される着用可能な診断デバイスにおける使用に適切な材料が挙げられる。さらなる可塑性ベースの材料は、ニトロセルロース、ポリカーボネート、メチルエチルセルロース、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリスチレン、またはガラスを含んでもよい(例えば、US20120238008を参照)。ある特定の実施形態では、個別のボリュームは、限定されないが、ワックス、フォトレジスト、または固体インクなどの疎水性表面によって分離される。
特定の実施形態では、可塑性材料基材は、紙基材または可塑性ポリマーベースの基材である。
いくつかの実施形態では、センサーまたはインジケーターとして機能する線量計またはバッジを提供して、それによって着用者がある特定の微生物または他の薬剤への曝露について通知されるようにしてもよい。例えば、本明細書に記載される系は、特定の病原体を検出するために使用され得る。同様に、上に開示されたアプタマーベースの実施形態は、ポリペプチドならびに特定のアプタマーが結合し得る化学物質などの他の物質の両方を検出するために使用され得る。そのようなデバイスは、潜在的に危険な物質への曝露に関する情報を可能な限り迅速に提供するために、例えば、生物兵器または化学兵器の検出のために、兵士または他の軍人、ならびに臨床医、研究者、病院スタッフなどの監視に役立つ可能性がある。他の実施形態では、そのような監視バッジは、免疫不全患者、火傷患者、化学療法を受けている患者、子供、または高齢者における危険な微生物または病原体への曝露を防止するために使用され得る。
本明細書に記載の系及びデバイスを使用して分析され得る試料源としては、対象の生物学的試料または環境試料が挙げられる。環境試料には、表面または流体が含まれる場合がある。生物学的試料としては、限定するものではないが、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脊髄液、脳脊髄液、皮膚または粘膜のスワブ、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。例示的な実施形態では、環境試料は、食品または他の敏感な組成物及び材料の調製に使用される表面などの固体表面から採取される。
他の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系の要素は、表面または試料流体を拭き取るために使用されるスワブまたは布などの使い捨て基材上に配置されてもよい。例えば、この系は、果物または野菜などの食品の表面を拭くことによって、食品上の病原体の存在を試験するために使用してもよい。同様に、使い捨て基材は、安全性スクリーニングで使用するためなど、特定の微生物または物質を検出するために他の表面を拭き取るために使用してもよい。使い捨ての基材は、法医学でも用途があり、CRISPR系は、検出するため、例えば、容疑者、もしくはある特定の組織もしくは細胞マーカーを特定して試料中に存在する生物学的物質の種類を特定するために使用され得るDNA SNPの特定に設計されている。同様に、使い捨て基材は、口からの唾液試料などの患者からの試料、または皮膚のスワブの収集に使用され得る。他の実施形態では、肉製品上または肉製品内の汚染物質の存在の有無を検出するために、肉製品の試料またはスワブを採取してもよい。
ほぼリアルタイムの微生物診断が、食品、臨床、産業、及びその他の環境設定に必要である(例えば、Lu TK、Bowers J、及びKoeris MS.、Trends Biotechnol.2013 Jun;31(6):325-7を参照のこと)。特定の実施形態では、本発明は、病原体(例えば、Campylobacter jejuni、Clostridium perfringens、Salmonella spp.、Escherichia coli、Bacillus cereus、Listeria monocytogenes、Shigella spp.、Staphylococcus aureus、Staphylococcal enteritis、Streptococcus、Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Yersinia enterocolitica及びYersinia pseudotuberculosis、Brucella spp.、Corynebacterium ulcerans、Coxiella burnetii、またはPlesiomonas shigelloides)に特異的なガイドRNAを用いる食品媒介病原体の迅速な検出に使用される。
いくつかの実施形態では、個々の個別のボリュームはそれぞれ、本明細書に記載されるような核酸増幅試薬を含み得る。したがって、標的分子は標的DNAであり得、個々の個別のボリュームは、標的DNAと結合し、本明細書に記載されるRNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、デバイスは流動ストリップであるか、流動ストリップを含む。例えば、側方流動ストリップでは、RNAse(C2c2など)を色で検出可能である。RNAレポーターは、5’端に1番目の分子(例えばFITCなど)が接続され、3’端に第2の分子(例えばビオチンなど)が接続されるように(またはその逆)改変される。側方流動ストリップは、第1のラインでハイブリダイズした抗第1分子(例えば、抗FITC)抗体及び第2の下流ラインで抗二次分子(例えば、抗ビオチン)抗体を備えた2つの捕捉ラインを有するように設計されている。反応がストリップを流れると、切断されていないレポーターは第1の捕捉ラインで抗第1分子抗体に結合し、切断されたレポーターは第2の分子を遊離させ、第2の捕捉ラインでの第2の分子の結合を可能にする。例えば、金ナノ粒子などのナノ粒子にコンジュゲートされた第2の分子サンドイッチ抗体は、1番目または第2のラインで任意の第2の分子に結合し、強力な読み出し/シグナル(例えば、色)をもたらす。より多くのレポーターが切断されるほど、より多くのシグナルが第2の捕捉ラインに蓄積され、より少ないシグナルが第1のラインに現れる。ある特定の態様では、本発明は、核酸またはポリペプチドを検出するための、本明細書に記載されている流動ストリップの使用に関する。ある特定の態様では、本発明は、本明細書で定義される流動ストリップ、例えば、(側方)流動試験または(側方)フローイムノクロマトアッセイを用いて核酸またはポリペプチドを検出するための方法に関する。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、異なる液滴(すなわち、個々の個別のボリューム)を生成及び/または融合するマイクロ流体デバイスである。例えば、スクリーニングされる試料を含む第1のセットの液滴が形成されてもよく、本明細書に記載される系の要素を含む第2のセットの液滴が形成されてもよい。次に、第1及び第2の液滴セットが融合され、次に、本明細書に記載される診断方法を、融合された液滴セットに対して実行する。本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、シリコーンベースのチップであってもよく、限定するものではないが、ホットエンボス、エラストマーの成形、射出成形、LIGA、ソフトリソグラフィー、シリコン製造及び関連する薄膜処理技術を含む、様々な技術を使用して製造され得る。マイクロ流体デバイスを製造するための適切な材料には、限定するものではないが、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリカーボネート、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、及びポリ(メチルアクリレート)(PMMA)が挙げられる。一実施形態では、PDMSにおけるソフトリソグラフィーを使用して、マイクロ流体デバイスを調製してもよい。例えば、モールド(鋳型)は、基材内のフローチャネル、バルブ、及びフィルターの位置を規定するフォトリソグラフィーを使用して作製され得る。基材材料を型に流し込み、硬化させてスタンプを作成する。次に、スタンプは、ガラスなどであるがこれに限定されない固体支持体に密封される。いくつかのタンパク質を吸収し、ある特定の生物学的プロセスを阻害し得る、PDMSなどのいくつかのポリマーは疎水性であるせいで、不動態化剤が必要な場合がある(Schoffner et al.Nucleic Acids Research,1996,24:375-379)。適切な不動態化剤は当技術分野で公知でありこれには、限定するものではないが、シラン、パリレン、n-ドデシル-b-D-マトシド(DDM)、プルロニック、Tween-20、他の類似の界面活性剤、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン、コラーゲン、ならびに他の同様のタンパク質及びペプチドが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、この系及び/またはデバイスは、単一の実験で数百万の細胞の高感度かつ定量的測定の全てにおいて、またはそれを可能にするために、フローサイトメトリーの読み出しへの変換に適合させてもよく、PrimeFlowアッセイなどの既存の流動ベースの方法の際に改善し得る。ある特定の例示的な実施形態では、細胞は、非重合ゲルモノマーを含む液滴にキャストされてもよく、次いで、フローサイトメトリーによる分析に適した単一細胞の液滴にキャストされてもよい。蛍光検出可能標識を含む検出構築物は、非重合ゲルモノマーを含む液滴にキャストされてもよい。ゲルモノマーの重合の際に液滴内にビーズを形成する。ゲルの重合はフリーラジカルの形成によるので、蛍光レポーターはゲルに共有結合する。検出構築物は、アミンなどのリンカーを含むようにさらに改変されてもよい。ゲル形成後にクエンチャーを加えてもよく、リンカーを介してレポーター構築物に結合する。したがって、クエンチャーはゲルに結合しておらず、レポーターがCRISPRエフェクタータンパク質によって切断されるときに自由になり拡散して離れる。液滴内のシグナルの増幅は、検出構築物をハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR開始因子)増幅に結合することによって達成され得る。DNA/RNAハイブリッドヘアピンは、RNase感受性ドメインを有するヘアピンループを含み得るゲルに組み込まれ得る。RNase感受性ドメインを有するヘアピンループ内の鎖置換足場を保護することにより、HCR開始因子は、CRISPRエフェクタータンパク質によるヘアピンループの切断後に選択的に脱保護され得る。足場媒介性の鎖置換によるHCR開始因子の脱保護に続いて、蛍光HCRモノマーをゲルに洗い流して、開始因子が脱保護されているシグナル増幅を可能にし得る。
本発明の文脈で使用され得るマイクロ流体デバイスの例は、Hour et al.「Direct Detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics」Lap Chip.15(10):2297-2307(2016)に記載されている。
本明細書に記載の系では、クリニック設定外の対象の生物学的液などの生物学的試料を評価し、医療従事者によってアクセス可能な中央サーバーにアッセイの結果を遠隔的に報告する着用可能な医療デバイスにさらに組み込んでもよい。このデバイスは、Peetersらに対する、「Needle-free Blood Draw」と題された米国特許出願公開第2015/0342509号、Andrew Conardに対する「Nanoparticle Phoresis」と題された米国特許出願公開第2015/0065821号に開示されたデバイスなど、血液を自己サンプリングする能力を備え得る。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、マイクロプレートウェルなどの個々のウェルを含み得る。マイクロプレートウェルのサイズは、標準の6、24、96、384、1536、3456、または9600サイズのウェルというサイズであり得る。ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系の要素は、凍結乾燥され、分配及び使用の前にウェルの表面に適用されてもよい。
本明細書に開示されるデバイスは、入口及び出口ポート、または開口部をさらに備えてもよく、次にこれらは、デバイスへの及びデバイスからの流体の導入及び抽出のために、バルブ、チューブ、チャネル、チャンバ、及びシリンジ及び/またはポンプに接続され得る。このデバイスは、マイクロ流体デバイス内の流体の方向性のある動きを可能にする流体フローアクチュエータに接続されてもよい。アクチュエータの例としては、限定するものではないが、シリンジポンプ、機械的に作動する再循環ポンプ、電気浸透ポンプ、バルブ、ベローズ、ダイヤフラム、または流体の移動を強制するための気泡が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、デバイスを通して流体を移動させるために一緒に機能するプログラム可能なバルブを有するコントローラーに接続される。ある特定の例示的な実施形態では、このデバイスは、以下でさらに詳細に論じられるコントローラーに接続される。このデバイスは、デバイスの入口ポートに挿入するために金属ピンで終端するチューブによって、フローアクチュエータ、コントローラー、及び試料ローディングデバイスに接続され得る。
本明細書に示されるように、系の要素は凍結乾燥された場合に安定であり、したがって、支持デバイスを必要としない実施形態も企図され、すなわち、この系は、本明細書に開示される反応を支持し、そして任意の表面または流体に適用されて、その表面または溶液からの正の検出可能なシグナルの検出を可能にし得る。凍結乾燥に加えて、この系はペレット化された形で安定して保管及び利用されてもよい。適切なペレット化形態を形成するのに有用なポリマーは、当技術分野で公知である。
ある特定の実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、デバイス内の各個別のボリュームに結合される。各別個のボリュームは、異なる標的分子に特異的な異なるガイドRNAを含み得る。特定の実施形態では、試料は、それぞれが標的分子に特異的なガイドRNAを含む、2つ以上の別個のボリュームを含む固体基材に曝露される。理論に縛られることなく、各ガイドRNAは、試料からその標的分子を捕捉し、その試料を個別のアッセイに分割する必要はない。したがって、貴重な試料が保存され得る。エフェクタータンパク質は、親和性タグを含む融合タンパク質であってもよい。親和性タグは当技術分野で周知である(例えば、HAタグ、Mycタグ、フラグタグ、Hisタグ、ビオチン)。エフェクタータンパク質は、ビオチン分子に連結されてもよく、個別のボリュームはストレプトアビジンを含んでもよい。他の実施形態では、CRISPRエフェクタータンパク質は、エフェクタータンパク質に特異的な抗体によって結合される。CRISPR酵素を結合する方法は以前に説明されている(例えば、US20140356867A1を参照のこと)。
本明細書に開示されるデバイスはまた、他の方法によって試料を分析するための、当該分野で公知のポイントオブケア(POC)デバイスの要素を備えてもよい。例えば、St John and Price「Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing」(Clin Biochem Rev.2014 Aug;35(3):155-167)を参照のこと。
本発明は、ワイヤレスラボオンチップ(LOC)診断センサーシステム(例えば、米国特許番号9,470,699「Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof」を参照)と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、本発明は、ワイヤレスデバイス(例えば、携帯電話、携帯情報端末(PDA)、タブレット)によって制御されるLOCで実行され、結果は上記デバイスに報告される。
無線周波数識別(RFID)タグシステムは、RFIDリーダー(インテロゲータとも呼ばれる)による受信のためにデータを送信するRFIDタグを含む。典型的なRFIDシステムでは、個々の物体(例えば、店舗の商品)には、トランスポンダを含む比較的小さなタグが装備されている。トランスポンダには、固有の電子製品コードが割り当てられたメモリチップがある。RFIDリーダーは、通信プロトコルを使用して、タグ内のトランスポンダをアクティブにするシグナルを発信する。したがって、RFIDリーダーは、タグに対してデータを読み書きし得る。さらに、RFIDタグリーダーは、RFIDタグシステムアプリケーションに従ってデータを処理する。現在、パッシブ型とアクティブ型のRFIDタグがある。パッシブ型のRFIDタグは、内部電源を備えていないが、RFIDリーダーから受信した無線周波数シグナルによって給電される。あるいは、アクティブ型のRFIDタグは、アクティブ型のRFIDタグがより大きな伝送範囲とメモリ容量を所有できるようにする内部電源を備えている。パッシブタグ対アクティブタグの使用は、特定のアプリケーション次第である。
ラボオンザチップ技術は、科学文献に十分に記載されており、複数のマイクロ流体チャネル、入力または化学ウェルからなる。RFID電子チップからの導電性リードは、各試験ウェルに直接リンクできるので、ウェル内の反応は、無線周波数識別(RFID)タグ技術を使用して測定され得る。アンテナは、電子チップの別の層に印刷してもよいし、デバイスの背面に直接取り付けてもよい。さらに、リード線、アンテナ、電子チップをLOCチップに埋め込んでもよく、それによって電極または電子機器の短絡を防いでもよい。LOCは、複雑な試料の分離と分析を可能にするため、この技術により、複雑、または高価なリーダーとは独立してLOC試験を行ってもよい。むしろ、携帯電話またはPDAなどの単純なワイヤレスデバイスを使用してもよい。一実施形態では、ワイヤレスデバイスは、より複雑なLOC分析のために、マイクロ流体チャネルの分離及び制御も制御する。一実施形態では、LED及び他の電子測定または感知デバイスを、LOC-RFIDチップに備える。理論に縛られるものではないが、この技術は使い捨てであり、分離と混合を必要とする複雑な試験を実験室の外で行うことを可能にする。
好ましい実施形態では、LOCは、マイクロ流体デバイスであってもよい。LOCは、パッシブチップであり得、このチップは、ワイヤレスデバイスを通じて電力が供給され、制御される。特定の実施形態では、LOCは、試薬を保持するためのマイクロ流体チャネル及び試料を導入するためのチャネルを含む。特定の実施形態では、ワイヤレスデバイスからのシグナルは、LOCに電力を送達し、試料及びアッセイ試薬の混合を活性化する。具体的には、本発明の場合、この系は、マスキング剤、CRISPRエフェクタータンパク質、及び標的分子に特異的なガイドRNAを含み得る。LOCの活性化の際に、マイクロ流体デバイスは試料とアッセイ試薬を混合し得る。混合の際、センサーがシグナルを検出し、その結果をワイヤレスデバイスに送信する。特定の実施形態では、アンマスキング剤は、導電性RNA分子である。導電性RNA分子は、導電性材料に付着され得る。導電性分子は、導電性ナノ粒子、導電性タンパク質、タンパク質もしくはラテックスに付着した金属粒子、または導電性である他のビーズであってもよい。特定の実施形態では、DNAまたはRNAを使用するならば、導電性分子を、一致するDNAまたはRNA鎖に直接付着してもよい。導電性分子の放出は、センサー全体で検出され得る。アッセイは、一段階プロセスであってもよい。
表面積の導電率は正確に測定され得るので、使い捨てワイヤレスRFID電気アッセイで定量的な結果が可能である。さらに、試験領域を非常に小さくし得、特定の領域でより多くの試験を実行できるため、コストを節約につながる。ある特定の実施形態では、それぞれが異なるCRISPRエフェクタータンパク質及びセンサーに固定化されたガイドRNAと関連付けられた別個のセンサーが、複数の標的分子を検出するために使用される。理論に拘束されることはないが、さまざまなセンサーの活性化は、ワイヤレスデバイスによって区別される場合がある。
本明細書に記載される導電性方法に加えて、使い捨てRFIDアッセイのための基本的な低コスト通信及び電力プラットフォームとしてRFIDまたはブルートゥース(Bluetooth)に依存する他の方法が使用され得る。例えば、光学的手段を使用して、所与の標的分子の存在及びレベルを評価し得る。ある特定の実施形態では、光学センサーは、蛍光マスキング剤のアンマスキングを検出する。
ある特定の実施形態では、本発明のデバイスは、アッセイの診断読み取りのための手持ち式携帯型デバイスを含み得る(例えば、Vashist et al.、Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management,Diagnostics 2014,4(3),104-128;mReader from Mobile Assay;及びHolomic Rapid Diagnostic Test Readerを参照のこと)。
本明細書で述べるように、ある特定の実施形態は、実施形態がPOC状況で、及び/またはシグナルを読み出すためのより複雑な検出機器へのアクセスが制限され得るリソース不足環境で利用される場合に、ある特定の付随する利点を有する比色変化による検出を可能にする。しかし、本明細書に開示される携帯可能な実施形態は、可視範囲外のシグナルの検出を可能にする手持ち式分光光度計と結合されてもよい。本発明と組み合わせて使用され得る手持ち式分光光度計デバイスの例は、Das et al.「Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid,non-destructive testing of fruit ripeness.」Nature Scientific Reports.2016,6:32504,DOI:10.1038/srep32504に記載されている。最後に、量子ドットベースのマスキング構築物を利用するある特定の実施形態では、手持ち式UV光または他の適切なデバイスの使用が、量子ドットによって提供されるほぼ完全な量子収量のおかげで、シグナルを検出するために首尾よく使用され得る。
試料中で標的核酸を検出するための方法
本明細書ではまた、試料内の標的核酸を検出する方法も提供され、この方法は、試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のCRISPR系を含むこと;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、このCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、四重鎖を含むRNAアプタマーが修飾され、その結果四重鎖の酵素活性が不活性化されること;ならびに酵素活性を検出することであって、ここで閾値を下回る検出は、試料中の1つ以上の標的分子の存在を示すこと、を含む。
本明細書ではまた、試料内の標的核酸を検出する方法も提供され、この方法は、試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のCRISPR系を含むこと;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、このCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、四重鎖を含むRNAアプタマーが修飾され、その結果四重鎖の酵素活性が不活性化されること;ならびに酵素活性を検出することであって、ここで閾値を下回る検出は、試料中の1つ以上の標的分子の存在を示すこと、を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、標的分子は、本明細書の他の場所に記載されているような標的DNAであってよい。ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、本明細書の他の場所に記載されるように、RNAポリメラーゼ部位を含むプライマーと標的DNAを結合することをさらに含み得る。
ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、本明細書の他の場所に記載されるように、試料RNAまたはトリガーRNAを増幅することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、RNAの増幅は、本明細書に記載されるようなNASBAによる増幅を含む。いくつかの実施形態では、RNAの増幅は、本明細書に記載されるようなRPAによる増幅を含む。
いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料であっても、または環境試料であってもよい。環境試料としては、必ずしもこれらに限定されないが、食品試料(新鮮な果物または野菜、肉)、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属の表面、木材の表面、プラスチックの表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、大気もしくは他のガス試料への暴露、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含むがこれらに限定されない任意の材料で作製された家庭用/商業用/産業用の表面を拭き取り、汚染物質を検査してもよい。土壌試料は、環境目的及び/またはヒト、動物、もしくは植物の病気の試験の両方のために、病原菌もしくは寄生生物、または他の微生物の存在について試験してもよい。淡水試料、廃水試料、または生理食塩水試料などの水試料を、清浄度及び安全性、ならびに/または飲料適性について評価し、例えば、Cryptosporidium parvum、Giardia lamblia、または他の微生物汚染の存在を検出し得る。さらなる実施形態では、生体試料は、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿膜腫、膿、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブを含むがこれらに限定されない供給源から得てもよい。いくつかの特定の実施形態において、環境試料または生物学的試料は、粗製試料であってもよく、そして/または1つ以上の標的分子は、方法の適用前に試料から精製も増幅もされなくてもよい。微生物の同定は、多数の用途に有用及び/または必要であり得、したがって、当業者によって適切であると見なされる任意の供給源からの任意のタイプの試料が、本発明に従って使用され得る。
生物学的試料は、限定されないが、とりわけ、細菌、酵母、原生動物、及びアメーバなどの単細胞生物、多細胞生物を含む任意の生きた生物体から得られるか、排泄されるか、または分泌される任意の固体または流体試料(例えば、植物または動物、例としては、診断もしくは検討されるべき状態もしくは疾患、例えば、健常もしくは見かけ上健常なヒト対象、または病原性細菌またはウイルスのような病原性微生物での感染に罹患したヒト患者由来の試料)である。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体液、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍またはその他の感染または炎症部位から得られた液体)から得られる生物学的液体、または関節(例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節)から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであり得る。
試料はまた、任意の臓器または組織(腫瘍生検などの生検または剖検標本を含む)から得られた試料であってもよいし、あるいは細胞(初代細胞または培養細胞のいずれか)または任意の細胞、組織もしくは臓器によって調整された培地を含んでもよい。例示的な試料としては、限定されないが、細胞、細胞溶解物、血液スメア、細胞遠心調製物、細胞診スメア、体液(例えば、血液、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、気管支肺胞洗浄液、精液など)、組織生検(例えば、腫瘍生検)、細針吸引、及び/または組織切片(例えば、クリオスタット組織切片及び/またはパラフィン包埋組織切片)が挙げられる。他の例では、試料は循環腫瘍細胞を含む(これは細胞表面マーカーによって識別可能である)。特定の例では、試料は直接使用(例えば、新鮮または凍結)するか、または使用前に、例えば固定(例えば、ホルマリンを使用)及び/またはワックスに埋め込む(例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料)ことにより操作してもよい。対象から組織を得る任意の方法を利用してもよく、使用する方法の選択は、組織の種類、対象の年齢、または開業医が利用できる手順などの様々な要因に依存することは理解されよう。そのような試料を取得するための標準的な技術は、当技術分野で利用可能である。例えば、Schluger et al.,J.Exp.Med.176:1327-33(1992);Bigby et al.,Am.Rev.Respir.Dis.133:515-18(1986);Kovacs et al.,NEJM 318:589-93(1988);及びOgnibene et al.,Am.Rev.Respir.Dis.129:929-32(1984)を参照のこと。
特定の実施形態では、生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、血清腫、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体の分泌物、漏出物、浸出物(例えば、膿瘍または感染もしくは炎症部位の任意の他の部位から得られた液体)、または関節(例えば、正常な関節または疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎に冒された関節)から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであってもよい。
特定の実施形態では、環境試料は、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られてもよい。
いくつかの実施形態では、1つ以上の同定された標的配列は、本明細書に記載されるような標的配列に特異的であり、かつ、その標的配列に結合するガイドRNAを使用して検出され得る。本発明の系及び方法は、異なる微生物種間に存在する一塩基多型の間でも識別し得、したがって、本発明による複数のガイドRNAの使用は、種の間を識別するために使用され得る標的配列の数をさらに拡大または改善し得る。例えば、いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、種、属、科、目、綱、門、界、もしくは表現型、またはそれらの組み合わせで微生物を識別し得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上のガイドRNAは、本明細書の他の場所に記載されるように、標的RNAもしくはDNA、またはRNA転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、疾患状態の診断である1つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。本明細書の他の箇所に記載されているように、病状は、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患であり得る。
いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、無細胞核酸に結合するように設計されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料を本明細書に記載の核酸検出系と接触させること、及び接触した試料を、本明細書に記載されるように、側方流動イムノクロマトグラフィック分析に適用することを含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。
タンパク質の検出
本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーの組み込みを介して、核酸の検出に加えて、ポリペプチド(または他の分子)の検出に適合され得る。ポリペプチド検出アプタマーは、上記のマスキング構築物アプタマーとは異なる。まず、アプタマーは1つ以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。例示的な一実施形態では、標的分子は標的ポリペプチドである。別の例示的な実施形態では、標的分子は、標的治療用分子などの標的化合物である。SELEXなどの所与の標的に特異性を有するアプタマーを設計及び選択する方法は、当技術分野で公知である。所定の標的に対する特異性に加えて、アプタマーはさらに、RNAポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むように設計されている。ある特定の例示的な実施形態では、RNAポリメラーゼプロモーターは、T7プロモーターである。アプタマー結合を標的に結合する前は、RNAポリメラーゼ部位は、RNAポリメラーゼにアクセスできないか、そうでなければ認識不能である。しかしながら、アプタマーは、標的の結合時にアプタマーの構造が高次構造変化を受けて、その結果、次にRNAポリメラーゼプロモーターが露出されるように構成される。RNAポリメラーゼプロモーターの下流のアプタマー配列は、RNAポリメラーゼによるトリガーRNAオリゴヌクレオチドの生成のための鋳型として機能する。したがって、アプタマーの鋳型部分は、所与のアプタマー及びその標的を同定するバーコードまたは他の同定配列をさらに組み込んでもよい。上記のガイドRNAは、これらの特定のトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識するように設計してもよい。トリガーオリゴヌクレオチドへのガイドRNAの結合は、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化し、これが進行して前述のようにマスキング構築物を非活性化し、正の検出可能なシグナルを生成する。
本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーの組み込みを介して、核酸の検出に加えて、ポリペプチド(または他の分子)の検出に適合され得る。ポリペプチド検出アプタマーは、上記のマスキング構築物アプタマーとは異なる。まず、アプタマーは1つ以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。例示的な一実施形態では、標的分子は標的ポリペプチドである。別の例示的な実施形態では、標的分子は、標的治療用分子などの標的化合物である。SELEXなどの所与の標的に特異性を有するアプタマーを設計及び選択する方法は、当技術分野で公知である。所定の標的に対する特異性に加えて、アプタマーはさらに、RNAポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むように設計されている。ある特定の例示的な実施形態では、RNAポリメラーゼプロモーターは、T7プロモーターである。アプタマー結合を標的に結合する前は、RNAポリメラーゼ部位は、RNAポリメラーゼにアクセスできないか、そうでなければ認識不能である。しかしながら、アプタマーは、標的の結合時にアプタマーの構造が高次構造変化を受けて、その結果、次にRNAポリメラーゼプロモーターが露出されるように構成される。RNAポリメラーゼプロモーターの下流のアプタマー配列は、RNAポリメラーゼによるトリガーRNAオリゴヌクレオチドの生成のための鋳型として機能する。したがって、アプタマーの鋳型部分は、所与のアプタマー及びその標的を同定するバーコードまたは他の同定配列をさらに組み込んでもよい。上記のガイドRNAは、これらの特定のトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識するように設計してもよい。トリガーオリゴヌクレオチドへのガイドRNAの結合は、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化し、これが進行して前述のようにマスキング構築物を非活性化し、正の検出可能なシグナルを生成する。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、試料または試料のセットを一連の個々の個別ボリュームに分配する追加のステップであって、この各個々の個別ボリュームは、ペプチド検出アプタマー、CRISPRエフェクタータンパク質、1つ以上のガイドRNA、マスキング構築物を含むステップと、1つ以上の標的分子への検出アプタマーの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートし、対応する標的へのアプタマーの結合がRNAポリメラーゼプロモーター結合部位の露出をもたらし、その結果トリガーRNAの合成がRNAポリメラーゼのRNAポリメラーゼプロモーター結合部位への結合により開始されるステップとを含む。
別の例示的な実施形態では、アプタマーの結合は、アプタマーが標的ポリペプチドに結合すると、プライマー結合部位を露出し得る。例えば、アプタマーは、RPAプライマー結合部位を露出し得る。これによって、次に、プライマーの添加または包含は、上記で概説したRPA反応などの増幅反応に供給される。
ある特定の例示的な実施形態では、アプタマーは、目的の標的に結合すると二次構造を変化し得、一本鎖DNAの新しい領域を露出し得る高次構造スイッチングアプタマーであり得る。特定の例示的な実施形態において、一本鎖DNAのこれらの新しい領域は、ライゲーションのための基質として使用され得、アプタマーを伸長し、そして本明細書に開示される実施形態を使用して特異的に検出され得る、より長いssDNA分子を作製する。アプタマーの設計は、グルコースなどの低エピトープ標的を検出するための三元複合体とさらに組み合わせられ得る(Yang et al.2015:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.5b01634)。高次構造シフトのアプタマー及び対応するガイドRNA(crRNA)の例を以下に示す。
例示的な方法及びアッセイ
アッセイプラットフォームの低コスト及び適応性は、(i)一般的なRNA/DNA/タンパク質定量、(ii)迅速な多重化RNA/DNA及びタンパク質の発現検出、ならびに(iii)標的核酸、ペプチド及びタンパク質(臨床試料及び環境試料の両方における)の高感度検出を含む多くの用途に役立つ。さらに、本明細書に開示される系は、細胞などの生物学的設定内での転写物の検出に適合され得る。本明細書に記載されているCRISPRエフェクターの非常に特異的な性質を考えると、生細胞における転写産物または疾患関連変異の対立遺伝子特異的発現を追跡することが可能であり得る。
アッセイプラットフォームの低コスト及び適応性は、(i)一般的なRNA/DNA/タンパク質定量、(ii)迅速な多重化RNA/DNA及びタンパク質の発現検出、ならびに(iii)標的核酸、ペプチド及びタンパク質(臨床試料及び環境試料の両方における)の高感度検出を含む多くの用途に役立つ。さらに、本明細書に開示される系は、細胞などの生物学的設定内での転写物の検出に適合され得る。本明細書に記載されているCRISPRエフェクターの非常に特異的な性質を考えると、生細胞における転写産物または疾患関連変異の対立遺伝子特異的発現を追跡することが可能であり得る。
ある特定の例示的な実施形態では、単一の標的に特異的な単一のガイド配列が別々のボリュームに配置される。次に、各ボリュームは、異なる試料または同じ試料のアリコートを受け取り得る。ある特定の例示的な実施形態では、別々の標的に対するそれぞれの複数のガイド配列は、複数の標的が異なるウェルでスクリーニングされ得るように単一のウェルに配置され得る。単一の容積内の複数のガイドRNAを検出するために、ある特定の例示的な実施形態では、異なる特異性を有する複数のエフェクタータンパク質が使用され得る。例えば、1つのオルソログは、Aを優先的に切断するが、他のオルソログはC、G、U/Tを優先的に切断する。したがって、単一のヌクレオチドの全てであるか、または十分な部分を備えるマスキング構築物を生成してもよく、それぞれが異なる波長で検出され得る異なるフルオロフォアを有する。このようにして、最大4つの異なる標的を、単一の個別のボリュームでスクリーニングし得る。ある特定の例示的な実施形態では、2つのCas13aオルソログ、2つのCas13bオルソログ、または2つのCas13オルソログなど、同じクラスのCRISPRエフェクタータンパク質からの異なるオルソログを使用してもよい。様々なCas13タンパク質のヌクレオチド優先性を、図67に示す。ある特定の他の例示的な実施形態では、Cas13a及びCas13bのオルソログ、またはCas13a及びCas13cのオルソログ、またはCas13bのオルソログ及びCas13cのオルソログなど、ヌクレオチド編集の優先性が異なる異なるオルソログを使用してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、ポリU優先のCas13タンパク質及びポリA優先のCas13bタンパク質を使用する。ある特定の例示的な実施形態では、ポリU優先のCas13bタンパク質は、Prevotella intermedia Cas13bであり、ポリA優先のCas13bタンパク質は、Prevotella sp.MA2106 Cas13bタンパク質(PsmCas13b)である。ある特定の例示的な実施形態では、ポリU優先のCas13タンパク質は、Leptotrichia wadei Cas13a(LwaCas13a)タンパク質であり、ポリA優先のCas13タンパク質は、Prevotella sp.MA2106 Cas13bタンパク質である。特定の例示的な実施形態では、ポリU優先性を有するCas13タンパク質は、Capnocytophaga canimorsus Cas13タンパク質(CcaCas13b)である。
一塩基編集の優先性に加えて、Cas13オルソログの他のモチーフ切断優先性に基づいて、追加の検出構築物を設計し得る。例えば、Cas13オルソログは、ジヌクレオチド配列、トリヌクレオチド配列、または4、5、6、7、8、9、もしくは10個のヌクレオチドモチーフを含むより複雑なモチーフを優先的に切断し得る。したがって、本明細書に開示される実施形態を使用するマルチプレックスアッセイの上限は、識別可能な検出可能な標識の数によって主に制限される。そのようなモチーフを同定するための例示的な方法は、以下の実施例にさらに開示されている。
本明細書に示されるように、CRISPRエフェクター系は、標的分子のアトモル濃度までの検出が可能である。例えば、図13、14、19、22及び下記の実施例を参照のこと。上記系の感度に起因して、迅速かつ高感度の検出を必要とする多くの用途は、本明細書に開示された実施形態から利益を得る可能性があり、本発明の範囲内であることが企図される。アッセイ及び適用の例については、以下で詳しく説明する。
rRNA配列に基づく検出
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法を使用して、試料中の複数の微生物種を区別し得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、16S、23S、及び5Sサブユニットを含むリボソームRNA配列に基づき得る。関連するrRNA配列を同定する方法は、米国特許出願公開第2017/0029872号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ガイドRNAのセットが、各々の種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計され得る。ガイドRNAはまた、属、科、目、綱、門、もしくは界、またはそれらの組み合わせで微生物を区別するRNA遺伝子を標的とするように設計されてもよい。増幅が使用されるある特定の例示的な実施形態では、一連の増幅プライマーが、リボソームRNA配列の隣接する定常領域及び可変内部領域によって各種を区別するように設計されたガイドRNAに設計され得る。ある特定の例示的な実施形態では、プライマー及びガイドRNAは、16Sサブユニット内で可変領域がそれぞれ保存されるように設計されてもよい。RecA遺伝子ファミリー、RNAポリメラーゼβサブユニットなどの種間または種のサブセット間で一意に変化する他の遺伝子またはゲノム領域も同様に使用してもよい。他の適切な系統学的マーカー、及びそれを同定する方法は、例えば、Wu et al.arXiv:1307.8690[q-bio.GN]で考察されている。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法を使用して、試料中の複数の微生物種を区別し得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、16S、23S、及び5Sサブユニットを含むリボソームRNA配列に基づき得る。関連するrRNA配列を同定する方法は、米国特許出願公開第2017/0029872号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ガイドRNAのセットが、各々の種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計され得る。ガイドRNAはまた、属、科、目、綱、門、もしくは界、またはそれらの組み合わせで微生物を区別するRNA遺伝子を標的とするように設計されてもよい。増幅が使用されるある特定の例示的な実施形態では、一連の増幅プライマーが、リボソームRNA配列の隣接する定常領域及び可変内部領域によって各種を区別するように設計されたガイドRNAに設計され得る。ある特定の例示的な実施形態では、プライマー及びガイドRNAは、16Sサブユニット内で可変領域がそれぞれ保存されるように設計されてもよい。RecA遺伝子ファミリー、RNAポリメラーゼβサブユニットなどの種間または種のサブセット間で一意に変化する他の遺伝子またはゲノム領域も同様に使用してもよい。他の適切な系統学的マーカー、及びそれを同定する方法は、例えば、Wu et al.arXiv:1307.8690[q-bio.GN]で考察されている。
ある特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、複数の系統学的及び/または表現型レベルにわたって微生物を同時にスクリーニングするように設計される。例えば、この方法または診断は、異なるガイドRNAを伴う複数のCRISPR系の使用を含んでもよい。ガイドRNAの第1のセットは、例えば、マイコバクテリア、グラム陽性菌、及びグラム陰性菌を区別し得る。これらの一般的なクラスは、さらに細分化され得る。例えば、ガイドRNAは、グラム陰性菌内で腸溶性と非腸溶性を区別する方法または診断で設計及び使用され得る。ガイドRNAの第2のセットは、微生物を属または種レベルで区別するように設計され得る。したがって、これらのクラスの1つに該当する所定の試料で識別された細菌の種の各属で、グラム陽性、グラム陰性(さらに腸溶性と非腸溶性に分類)の全てのマイコバクテリアを識別するマトリックスを作成し得る。上記は、例示のみを目的としている。他の微生物の種類を分類するための他の手段も企図され、上記の一般的な構造に従う。
薬剤耐性のスクリーニング
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法は、目的の微生物遺伝子、例えば、抗生物質及び/または抗ウイルス耐性遺伝子をスクリーニングするために使用され得る。ガイドRNAは、公知の目的遺伝子を区別するように設計してもよい。次に、臨床試料を含む試料を、そのような遺伝子の検出のために、本明細書に開示される実施形態を使用してスクリーニングしてもよい。POCで薬剤耐性をスクリーニングする能力は、適切な治療計画を選択する上で非常に有益である。ある特定の例示的な実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、KPC、NDM1、CTX-M15、OXA-48を含むカルバペネマーゼである。他の抗生物質耐性遺伝子は公知であり、例えば包括的抗生物質耐性データベース(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)(Jia et al.「CARD 2017:expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database」,Nucleic Acids Research,45,D566-573)に見出され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法は、目的の微生物遺伝子、例えば、抗生物質及び/または抗ウイルス耐性遺伝子をスクリーニングするために使用され得る。ガイドRNAは、公知の目的遺伝子を区別するように設計してもよい。次に、臨床試料を含む試料を、そのような遺伝子の検出のために、本明細書に開示される実施形態を使用してスクリーニングしてもよい。POCで薬剤耐性をスクリーニングする能力は、適切な治療計画を選択する上で非常に有益である。ある特定の例示的な実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、KPC、NDM1、CTX-M15、OXA-48を含むカルバペネマーゼである。他の抗生物質耐性遺伝子は公知であり、例えば包括的抗生物質耐性データベース(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)(Jia et al.「CARD 2017:expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database」,Nucleic Acids Research,45,D566-573)に見出され得る。
リバビリンは、多くのRNAウイルスを攻撃する効果的な抗ウイルス剤である。いくつかの臨床的に重要なウイルスがリバビリン耐性を進化させており、これには口蹄疫ウイルス(Foot and Mouth Disease Virus)doi:10.1128/JVI.03594-13;ポリオウイルス(Pfeifer and Kirkegaard.PNAS,100(12):7289-7294,2003);及びC型肝炎ウイルス(Pfeiffer and Kirkegaard,J.Virol.79(4):2346-2355,2005)が挙げられる。いくつかの他の持続性RNAウイルス、例えば、肝炎及びHIVは、既存の抗ウイルス薬に対する耐性を進化させてきた:B型肝炎ウイルス(ラミブジン、テノフォビル、エンテカビル)doi:10/1002/hep22900;C型肝炎ウイルス(テラプレビル、BILN2061、ITMN-191、SCh6、ボセプレビル、AG-021541、ACH-806)doi:10.1002/hep.22549;及びHIV(多くの薬物耐性変異)hivb.standford.edu。本明細書に開示される実施形態は、とりわけそのようなバリアントを検出するために使用されてもよい。
薬物耐性の他に、LCMVにおける持続感染対急性感染(doi:10.1073/pnas.1019304108)、及びエボラ感染性の増大(Diehl et al.Cell.2016,167(4):1088-1098)など、本明細書に開示される実施形態で検出され得る臨床的に関連する多数の変異がある。
本明細書のいずれかに記載されるように、密接に関連する微生物種(例えば、所与の標的配列において単一のヌクレオチドの違いのみを有する)は、gRNAにおける合成ミスマッチの導入によって区別され得る。
セットカバーアプローチ
特定の実施形態では、例えば、規定された微生物のセット内の全ての微生物種を特定し得るガイドRNAのセットが設計される。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるガイドRNAを生成するための方法は、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/040316号に開示されている方法と比較され得る。WO2017040316に記載されているように、セットカバーソリューションは、標的配列全体または標的配列のセット、例えば、ゲノム配列のセットをカバーするために必要な最小数の標的配列プローブまたはガイドRNAを特定し得る。セットカバーアプローチは、通常20~50塩基対の範囲で、プライマー及び/またはマイクロアレイプローブを特定するために以前使用されていた。例えば、Pearson et al.,cs.virginia.edu/~robins/papers/primers_dam11_final.pdf.,Jabado et al.Nucleic Acids Res.2006 34(22):6605-11,Jabado et al.Nucleic Acids Res.2008,36(1):e3 doi10.1093/nar/gkm1106,Duitama et al.Nucleic Acids Res.2009,37(8):2483-2492,Phillippy et al.BMC Bioinformatics.2009,10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293を参照のこと。ただし、このようなアプローチでは、一般的に各プライマー/プローブをk-merとして扱うこと、完全一致を検索するか、またはサフィックス(suffix)アレイを使用して不正確な一致を可能にすることを含む。さらに、この方法は一般に、各入力配列が1つのプライマーまたはプローブによってのみ結合される必要があり、配列に沿ったこの結合の位置は無関係であるように、プライマーまたはプローブを選択することにより、ハイブリダイゼーションを検出するバイナリアプローチをとる。代替方法では、標的ゲノムを事前定義されたウィンドウに分割し、バイナリアプローチ下で各ウィンドウを個別の入力配列として効果的に処理し得る。すなわち、所定のプローブまたはガイドRNAが、各ウィンドウ内に結合し、いくつかのプローブまたはガイドRNAの状態によって、全てのウィンドウが結合される必要があるか否かを決定する。効果的には、これらのアプローチは、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を、入力配列全体または入力配列の事前定義されたウィンドウのいずれかとして扱い、その要素内でプローブまたはガイドRNAが結合することを開始する場合、その各要素は「カバーされている」と見なされる。これらのアプローチは、異なるプローブまたはガイドRNAの設計が、所定の標的配列をカバーし得る流動性を制限する。
特定の実施形態では、例えば、規定された微生物のセット内の全ての微生物種を特定し得るガイドRNAのセットが設計される。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるガイドRNAを生成するための方法は、参照により本明細書に組み込まれるWO2017/040316号に開示されている方法と比較され得る。WO2017040316に記載されているように、セットカバーソリューションは、標的配列全体または標的配列のセット、例えば、ゲノム配列のセットをカバーするために必要な最小数の標的配列プローブまたはガイドRNAを特定し得る。セットカバーアプローチは、通常20~50塩基対の範囲で、プライマー及び/またはマイクロアレイプローブを特定するために以前使用されていた。例えば、Pearson et al.,cs.virginia.edu/~robins/papers/primers_dam11_final.pdf.,Jabado et al.Nucleic Acids Res.2006 34(22):6605-11,Jabado et al.Nucleic Acids Res.2008,36(1):e3 doi10.1093/nar/gkm1106,Duitama et al.Nucleic Acids Res.2009,37(8):2483-2492,Phillippy et al.BMC Bioinformatics.2009,10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293を参照のこと。ただし、このようなアプローチでは、一般的に各プライマー/プローブをk-merとして扱うこと、完全一致を検索するか、またはサフィックス(suffix)アレイを使用して不正確な一致を可能にすることを含む。さらに、この方法は一般に、各入力配列が1つのプライマーまたはプローブによってのみ結合される必要があり、配列に沿ったこの結合の位置は無関係であるように、プライマーまたはプローブを選択することにより、ハイブリダイゼーションを検出するバイナリアプローチをとる。代替方法では、標的ゲノムを事前定義されたウィンドウに分割し、バイナリアプローチ下で各ウィンドウを個別の入力配列として効果的に処理し得る。すなわち、所定のプローブまたはガイドRNAが、各ウィンドウ内に結合し、いくつかのプローブまたはガイドRNAの状態によって、全てのウィンドウが結合される必要があるか否かを決定する。効果的には、これらのアプローチは、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を、入力配列全体または入力配列の事前定義されたウィンドウのいずれかとして扱い、その要素内でプローブまたはガイドRNAが結合することを開始する場合、その各要素は「カバーされている」と見なされる。これらのアプローチは、異なるプローブまたはガイドRNAの設計が、所定の標的配列をカバーし得る流動性を制限する。
対照的に、本明細書に開示される実施形態は、ハイブリッド選択配列決定に適した、例えば70bp~200bpの範囲のより長いプローブまたはガイドRNA長を検出することに関する。さらに、本明細書におけるWO2017/040316開示される方法は、大きい及び/または可変の標的配列セットにおける全ての種及び/または株配列の検出配列決定を同定及び促進し得る、プローブまたはガイドRNAセットを定義し得る汎標的配列アプローチを採用するために適用され得る。例えば、本明細書に開示される方法は、単一のアッセイにおいて所与のウイルスの全てのバリアント、または複数の異なるウイルスを特定するために使用され得る。さらに、本明細書で開示される方法は、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を、標的配列のヌクレオチドであるとして扱い、プローブまたはガイドRNAがその要素を含む標的ゲノムのいくつかのセグメントに結合する限り、各要素は「カバーされた」と見なす。これらのタイプのセットカバー方法は、以前の方法のバイナリアプローチの代わりに使用してもよく、本明細書に開示される方法は、あるプローブまたはガイドRNAが、標的配列にハイブリダイズし得る様式の、より良好なモデルである。所定のガイドRNA配列が所定のウィンドウに結合するかしないかを尋ねるだけでなく、そのようなアプローチを使用して、ハイブリダイゼーションパターン(すなわち、所定のプローブまたはガイドRNAが標的配列または標的配列に結合する場所)を検出し得、次いで、これらのハイブリダイゼーションパターンから、試料からの濃縮及び任意のかつ全ての標的配列の配列決定の両方を可能にするのに十分な程度に標的配列のセットをカバーするために必要なプローブまたはガイドRNAの最小数を決定する。これらのハイブリダイゼーションパターンは、損失関数を最小限に抑える、ある特定のパラメーターを定義することで決定され得、これにより、例えば、各種の多様性を反映するため、パラメーターが種ごとに変わることを可能にする方法で、同様に、以前にプローブまたはガイドRNAの設計状況で適用されていたようなセットカバーソリューションの簡単な適用を用いては達成できない計算効率の高い方法で、最小限のプローブまたはガイドRNAセットを特定し得る。
複数の転写物存在量を検出する能力は、特定の表現型を示す独特の微生物特徴の生成を可能にし得る。さまざまな機械学習技術を使用して、遺伝子特徴を導出し得る。したがって、CRISPR系のガイドRNAは、特定の表現型を検出するために、遺伝子特徴によって定義されたバイオマーカーの相対レベルを特定及び/または定量化するために使用してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、遺伝子特徴は、抗生物質に対する感受性、抗生物質に対する耐性、またはそれらの組み合わせを示す。
本発明の一態様では、方法は、1つ以上の病原体を検出することを含む。このようにして、個々の微生物による対象の感染間の識別を行ってもよい。いくつかの実施形態では、そのような識別は、特定の疾患、例えば、疾患の異なるバリアントの臨床医による検出または診断を可能にし得る。好ましくは、病原体配列は、病原体のゲノムまたはその断片である。この方法は、病原体の進化を決定することをさらに含んでもよい。病原体の進化を決定することは、病原体変異の特定、例えば、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド置換をさらに含んでもよい。後者の中には、非同義、同義、及び非コード置換がある。アウトブレイク中の変異は、非同義である場合がさらに多い。この方法は、上記のように分析された2つの病原体配列間の置換率を決定することをさらに含んでもよい。変異が有害であるか適応であるか否かは、機能分析が必要であるが、非同義変異の割合によって、この流行の継続的な進行が病原体適応の機会を与え、迅速な封じ込めの必要性を強調し得ることが示唆される。したがって、この方法は、ウイルス適応のリスクを評価することをさらに含み得、非同義変異の数が決定される(Gire,et al.,Science 345,1369,2014)。
微生物アウトブレイクのモニタリング
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCRISPR系またはその使用方法を使用して、病原体アウトブレイクの進展を決定し得る。この方法は、1人以上の対象由来の複数の試料から1つ以上の標的配列を検出することを含んでもよく、この標的配列は、アウトブレイクを引き起こしている微生物由来の配列である。そのような方法は、病原体伝染のパターン、または病原体によって引き起こされる疾患のアウトブレイクに関与する機序を決定することをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCRISPR系またはその使用方法を使用して、病原体アウトブレイクの進展を決定し得る。この方法は、1人以上の対象由来の複数の試料から1つ以上の標的配列を検出することを含んでもよく、この標的配列は、アウトブレイクを引き起こしている微生物由来の配列である。そのような方法は、病原体伝染のパターン、または病原体によって引き起こされる疾患のアウトブレイクに関与する機序を決定することをさらに含んでもよい。
病原体伝染のパターンは、病原体の天然のリザーバーからの継続的な新しい伝染、またはその天然のリザーバーからの単一の伝染に続く対象から対象への伝染(例えば、ヒトからヒトへの伝染)または両方の混合物をさらに含み得る。一実施形態では、病原体伝染は、細菌またはウイルス伝染であってもよく、そのような場合、標的配列は、好ましくは、微生物ゲノムまたはその断片である。一実施形態では、病原体伝染のパターンは、病原体伝染の初期パターン、すなわち病原体アウトブレイクの始まりである。アウトブレイクの開始時に病原体伝染のパターンを決定することにより、アウトブレイクを可能な限り早期に停止する可能性が高まり、それにより、地域的及び国際的な感染の可能性が減少する。
病原体伝染のパターンを決定することは、本明細書に記載の方法に従って病原体配列を検出することをさらに含み得る。病原体伝染のパターンを決定することは、対象間の病原体配列の共有宿主内変動を検出すること、及びその共有宿主内変動が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含み得る。観察された宿主内及び宿主間の変動のパターンは、伝染及び疫学に関する重要な洞察を提供する(Gire,et al.,2014)。
時間的パターンを示す対象間で共有される宿主内変動の検出は、複数の感染源からの対象感染(重複感染)、試料汚染再発性変異(変異を強化するために選択のバランスの有無)、または感染チェーンの初期の変異によって生じたわずかに異なるウイルスの同時伝達(Park,et al.,Cell 161(7):1516-1526,2015)により説明し得るため、対象間の(特にヒト間の)伝染リンクの指標である。対象間の共有宿主内変動の検出は、一般的な一塩基多型(SNP)の位置にある宿主内バリアントの検出をさらに含んでもよい。共通(SNP)位置にある宿主内バリアントの陽性検出は、宿主内バリアントの主な説明として、重複感染及び汚染を示している。重複感染及び汚染は、宿主間バリアントとして現れるSNP頻度に基づいて分離され得る(Park、et al.,2015)。それ以外の場合は、重複感染及び汚染を除外してもよい。この後者の場合、対象間の共有宿主内変動の検出は、同義及び非同義バリアントの頻度を評価すること、ならびに同義及び非同義バリアントの頻度を互いに比較することをさらに含み得る。非同義変異は、タンパク質のアミノ酸を変更する変異であり、自然淘汰の対象となる微生物の生物学的変化をもたらす可能性が高い。同義置換は、アミノ酸配列を変更しない。同義及び非同義のバリアントの等しい頻度によって、宿主内のバリアントが中立的に進化していることが示されている。同義と非同義のバリアントの頻度が異なる場合、宿主内のバリアントは、選択のバランスをとることによって維持される可能性がある。同義及び非同義のバリアントの頻度が低い場合、これは再発性突然変異の指標である。同義及び非同義のバリアントの頻度が高い場合、これは同時伝染を示している(Park,et al.,2015)。
エボラウイルスと同様に、ラッサウイルス(LASV)は、致死率の高い出血熱を引き起こし得る。Andersenらは、臨床及びげっ歯類のリザーバー試料からほぼ200のLASV配列のゲノムカタログを生成した(Andersen,et al.,Cell Volume 162,Issue 4,p738-750,13 August 2015)。Andersenらは、2013~2015年のEVDの流行は人から人への伝染によるものであるが、LASV感染は主にリザーバーから人への感染が原因であることが示されている。Andersenらは、西アフリカにおけるLASVの広がりを解明し、この移行には、LASVゲノムの量、致死率、コドン適応、及び翻訳効率の変化が伴うことを示す。この方法は、第1の病原体配列を第2の病原体配列と系統発生的に比較すること、及び第1の病原体配列と第2の病原体配列との間に系統発生的関連があるか否かを判定することをさらに含み得る。第2の病原体配列は、以前の参照配列であり得る。系統学的関連がある場合、この方法は、第1の病原体配列の系統を第2の病原体配列に根付かせることをさらに含み得る。したがって、第1の病原体配列の系統を構築することが可能である(Park,et al.,2015)。
この方法は、変異が有害であるか適応的であるかを決定することをさらに備み得る。有害な変異は、伝染障害のあるウイルス及び行き止まりの感染症の指標であるため、通常は個々の対象にのみ存在する。1つの個別の対象に固有の変異は、系統樹の外部分岐で発生する変異であるが、内部分岐の変異とは、複数の試料に(すなわち、複数の対象に)存在する変異である。非同義置換の割合が高いことは、系統樹の外部分岐の特徴である(Park,et al.,2015)。
系統樹の内部分岐において、選択は、有害な変異体をろ過するより多くの機会を有してきた。定義により、内部分岐は、複数の子孫系統を生成しているため、変異を含める可能性は低くなり、適応コストを伴う。したがって、非同義置換の割合が低いことは、内部分岐を示している(Park、et al.,2015)。
適合性への影響が少ない可能性が高い同義変異は、内部及び外部の分岐でより匹敵する頻度で発生した(Park, et al.,2015)。
ウイルスゲノムなどの配列決定された標的配列を分析することにより、2014年のエボラのアウトブレイク中などの流行エピソードの重症度の原因となる機序を発見することが可能である。例えば、Gireらは、2014年のアウトブレイクのゲノムと、以前のアウトブレイク由来の20のゲノム全てとの系統学的比較を行い、これによって、2014年の西アフリカウイルスが過去10年以内に中央アフリカから広まった可能性が高いことを示唆している。他のエボラウイルスゲノムからの分岐を使用して系統発生を探索することには問題があった(6、13)。ただし、最古のアウトブレイクでツリーを探索すると、試料の日付と根から先端までの距離との間に強い相関関係があり、1年あたり1部位あたりの置換率は8×10-4である(13)。これによって、最近の3つのアウトブレイクの系統全てが、ほぼ同時に2004年頃に共通の祖先から分岐したことが示唆されており、これによって、各アウトブレイクがその天然のリザーバー中の同じ遺伝子的に多様なウイルス集団由来の独立した人畜共通伝染病事象に相当するという仮説が支持される。彼らはまた、2014年のEBOVのアウトブレイクは、自然のリザーバーからの単一の伝染が原因で発生し得、その後、アウトブレイク中に人から人への伝染が発生する可能性があることも見出した。彼らの結果によってまた、シエラレオネ(Sierra Leon)での流行エピソードは、ほぼ同時期にギニア由来の2つの遺伝的に異なるウイルスの導入に起因し得ることも示唆された(Gire,et al.,2014)。
特にヒトからヒトへの伝染のおかげで、ラッサウイルスがその起源点からどのように広がったかを決定することも可能であった;そして、この広がりの歴史を400年前にさかのぼることさえ可能であった(Andersen、et al.,Cell 162(4):738-50,2015)。
2013~2015年のEBOVのアウトブレイク中に必要な作業及びアウトブレイクの場所で医療スタッフが遭遇する困難に関して、より一般的には、本発明の方法は、より少ない選択されたプローブを使用して配列決定を実行することを可能にし、その結果、配列決定を加速し得、試料の採取から結果の取得までに必要な時間を短縮する。さらに、キット及び系を現場で使用し得るように設計し得、その結果試料を国の別の地域または世界に送付または発送する必要なしに、患者の診断を容易に行い得る。
上記の任意の方法において、標的配列またはその断片の配列決定には、上記の任意の配列決定プロセスを使用してもよい。さらに、標的配列またはその断片の配列決定は、ほぼリアルタイムの配列決定であり得る。標的配列またはその断片の配列決定は、以前に記載された方法(Experimental Procedures:Matranga et al.,2014、及びGire,et al.,2014)に従って行ってもよい。標的配列またはその画分の配列決定は、複数の標的配列の並行配列決定をさらに含んでもよい。標的配列またはその画分の配列決定は、イルミナ(Illumina)配列決定を含んでもよい。
選択されたプローブのうち1つ以上にハイブリダイズする標的配列またはその断片の分析は、同定分析であり得、この標的配列またはその画分への選択されたプローブのハイブリダイゼーションは、試料内の標的配列の存在を示す。
現在、一次診断は、患者が有する症状に基づいている。ただし、さまざまな疾患が同一の症状を共有し得るので、その結果診断は、統計に大きく依存している。例えば、マラリアは、インフルエンザのような症状、すなわち頭痛、発熱、震え、関節痛、嘔吐、溶血性貧血、黄疸、尿中のヘモグロビン、網膜の損傷、及びけいれんを引き起こす。これらの症状はまた、敗血症、胃腸炎、ウイルス性疾患にもよく見られる。後者の中で、エボラ出血熱には次の症状がある:発熱、喉の痛み、筋肉痛、頭痛、嘔吐、下痢、発疹、肝臓及び腎臓の機能低下、内外の出血。
患者が例えば熱帯アフリカの医療施設で診られた場合、統計的にマラリアはアフリカのその地域内で最も可能性の高い疾患であるため、基本的な診断はマラリアと結論付けるであろう。その結果、患者は実際にはその疾患にかかっていない可能性があるにもかかわらず、マラリアの処置を受け、患者は正しく処置されないことになる。この正しい処置の欠如は、特に患者が発症した疾患が急速に進展する場合、生命を脅かす可能性がある。医療スタッフが患者に施された処置が効果的ではなく、正確な診断を受けて患者に適切な処置を施すことに気づくには、遅すぎる場合がある。
本発明の方法は、この状況に対する解決策を提供する。実際、ガイドRNAの数を劇的に減らし得るので、これにより単一チップ上で、各グループが1疾患に特異的であるグループに分割された選択されたプローブを提供することが可能になり、その結果複数の疾患、例えば、ウイルス感染が同時に診断され得る。本発明のおかげで、単一のチップで3つ以上の疾患、好ましくは4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20超える疾患を同時に、好ましくは所定の地理的領域の集団内で最も一般的に発生する疾患を診断し得る。選択されたプローブの各グループは、診断された疾患の1つに固有であるため、より正確な診断を実行でき、患者に間違った処置を施すリスクを軽減し得る。
他の場合では、ウイルス感染などの疾患は、症状なしで発生する場合もあるか、または症状を引き起こしたが、患者が医療スタッフに診られる前に消えていった。そのような場合、患者は医療援助を求めないか、または診察の日に症状がないせいで複雑になる。
本発明はまた、疾患を診断し、病原体を同定し、そして粗製の非精製試料中のmRNAなどの核酸の検出に基づいて処置を最適化する他の方法と組み合わせて使用されてもよい。
本発明の方法はまた、この状況に対処するための強力なツールを提供する。実際、選択されたガイドRNAの複数のグループ(各グループは特定の領域の母集団内で発生する最も一般的な疾患の1つに固有)が単一の診断に含まれるため、医療スタッフはチップを持った患者から取られた生物学的試料に接触するだけで済む。チップを読み取れば、患者が発症した疾患が明らかになる。
いくつかの場合において、患者は、特定の症状の診断のために医療スタッフに診られる。本発明の方法は、どの疾患がこれらの症状を引き起こすかを特定するだけでなく、同時に、患者が気づかなかった別の疾患に罹患しているか否かを決定することを可能にする。
アウトブレイクの機序を検索する場合、この情報は最も重要になる可能性がある。実際、同一のウイルスに感染した患者のグループは、対象間の感染経路を示唆する一時的なパターンも示す。
微生物の遺伝的摂動のスクリーニング
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるCRISPR系は、微生物の遺伝的摂動をスクリーニングするために使用され得る。そのような方法は、例えば、微生物経路及び機能ネットワークをマッピングするために有用であり得る。微生物細胞は、遺伝子改変され、異なる実験条件下でスクリーニングされる。上記のように、本明細書に開示される実施形態は、単一の試料中の複数の標的分子、または多重様式で単一の個々の個別のボリューム中の単一の標的をスクリーニングし得る。遺伝的に改変された微生物は、特定の微生物細胞または微生物細胞の集団によって運ばれる特定の遺伝子改変を同定する核酸バーコード配列を含むように改変されてもよい。バーコードは、識別子として使用されるヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、またはそれらの組み合わせ)の短い配列である。核酸バーコードは、4~100ヌクレオチドの長さを有してもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。バーコードで細胞を同定する方法は、当該技術分野で公知である。したがって、本明細書に記載されるCRISPRエフェクター系のガイドRNAは、バーコードを検出するために使用され得る。正の検出可能なシグナルの検出は、試料における特定の遺伝子改変の存在を示す。本明細書に開示される方法は、試験された実験条件下での遺伝子改変の効果を示す相補的な遺伝子型または表現型の読み出しを検出するための他の方法と組み合わせてもよい。スクリーニングされる遺伝的改変には、限定するものではないが、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、逆位、転座、転位、または1つ以上のヌクレオチド挿入、欠失、置換、変異、または追加(タンパク質の安定性または検出の変更などの機能的な結果を有するエピトープをコードする核酸の)が含まれ得る。同様に、本明細書に記載の方法は、遺伝子調節要素及び遺伝子発現モジュールの特定の配置の機能性をスクリーニングするために、合成生物学適用で使用されてもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるCRISPR系は、微生物の遺伝的摂動をスクリーニングするために使用され得る。そのような方法は、例えば、微生物経路及び機能ネットワークをマッピングするために有用であり得る。微生物細胞は、遺伝子改変され、異なる実験条件下でスクリーニングされる。上記のように、本明細書に開示される実施形態は、単一の試料中の複数の標的分子、または多重様式で単一の個々の個別のボリューム中の単一の標的をスクリーニングし得る。遺伝的に改変された微生物は、特定の微生物細胞または微生物細胞の集団によって運ばれる特定の遺伝子改変を同定する核酸バーコード配列を含むように改変されてもよい。バーコードは、識別子として使用されるヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、またはそれらの組み合わせ)の短い配列である。核酸バーコードは、4~100ヌクレオチドの長さを有してもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。バーコードで細胞を同定する方法は、当該技術分野で公知である。したがって、本明細書に記載されるCRISPRエフェクター系のガイドRNAは、バーコードを検出するために使用され得る。正の検出可能なシグナルの検出は、試料における特定の遺伝子改変の存在を示す。本明細書に開示される方法は、試験された実験条件下での遺伝子改変の効果を示す相補的な遺伝子型または表現型の読み出しを検出するための他の方法と組み合わせてもよい。スクリーニングされる遺伝的改変には、限定するものではないが、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、逆位、転座、転位、または1つ以上のヌクレオチド挿入、欠失、置換、変異、または追加(タンパク質の安定性または検出の変更などの機能的な結果を有するエピトープをコードする核酸の)が含まれ得る。同様に、本明細書に記載の方法は、遺伝子調節要素及び遺伝子発現モジュールの特定の配置の機能性をスクリーニングするために、合成生物学適用で使用されてもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、低次形態(hypomorph)をスクリーニングするために使用されてもよい。参照によって本明細書に組み込まれる、2016年11月4日に出願された「Multiplex High-Resolution Detection of Micro-organism Strains,Related Kits,Diagnostic Methods and Screening Assays」と題されたPCT/US2016/060730に開示される低次形態(hypomorph)の生成ならびに主要な細菌機能遺伝子の同定及び新しい抗生物質治療法の同定におけるそれらの使用。
異なる実験条件は、微生物細胞を異なる化学薬品、化学薬品の組み合わせ、異なる濃度の化学薬品または化学薬品の組み合わせ、化学薬品または化学薬品の組み合わせに対する異なる曝露時間、異なる物理的パラメーター、あるいはその両方を含んでもよい。ある特定の例示的な実施形態では、化学剤は抗生物質または抗ウイルス剤である。スクリーニングされる異なる物理的パラメーターとしては、異なる温度、大気圧、異なる大気圧及び非大気圧ガス濃度、異なるpHレベル、異なる培地組成、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。
環境試料のスクリーニング
本明細書に開示される方法はまた、標的核酸またはポリペプチドの存在を検出することにより、汚染物質について環境試料をスクリーニングするために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、微生物を検出する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のCRISPR系を試料に曝露すること;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の微生物特異的標的RNAまたは1つ以上のトリガーRNAへの結合を介してRNAエフェクタータンパク質を活性化し、その結果検出可能な正のシグナルを生成することを含む。正のシグナルが検出され得、これは試料中の1つ以上の微生物の存在を示す。いくつかの実施形態では、CRISPR系は、本明細書に記載されるように基材上にあってもよく、この基材は試料に曝され得る。他の実施形態では、同じCRISPR系、及び/または異なるCRISPR系を、基材上の複数の別個の場所に適用してもよい。さらなる実施形態では、異なるCRISPR系は、各場所で異なる微生物を検出し得る。上記でさらに詳細に説明したように、基材は、例えば、ペーパー基材、布基材、または可塑性ポリマーベースの基材を含むがこれらに限定されない可塑性材料基材であり得る。
本明細書に開示される方法はまた、標的核酸またはポリペプチドの存在を検出することにより、汚染物質について環境試料をスクリーニングするために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、微生物を検出する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のCRISPR系を試料に曝露すること;1つ以上のガイドRNAの1つ以上の微生物特異的標的RNAまたは1つ以上のトリガーRNAへの結合を介してRNAエフェクタータンパク質を活性化し、その結果検出可能な正のシグナルを生成することを含む。正のシグナルが検出され得、これは試料中の1つ以上の微生物の存在を示す。いくつかの実施形態では、CRISPR系は、本明細書に記載されるように基材上にあってもよく、この基材は試料に曝され得る。他の実施形態では、同じCRISPR系、及び/または異なるCRISPR系を、基材上の複数の別個の場所に適用してもよい。さらなる実施形態では、異なるCRISPR系は、各場所で異なる微生物を検出し得る。上記でさらに詳細に説明したように、基材は、例えば、ペーパー基材、布基材、または可塑性ポリマーベースの基材を含むがこれらに限定されない可塑性材料基材であり得る。
本発明によれば、基材は、サンプリングされる流体にその基材を一時的に浸漬することにより、試験される流体をその基材に適用することにより、または試験される表面を基材と接触させることにより、受動的に試料に曝され得る。試料を基質に導入する任意の手段を適宜使用してもよい。
本明細書に記載されるように、本発明で使用するための試料は、食品試料(新鮮な果物または野菜、肉)、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、大気もしくは他のガス試料への曝露、またはそれらの組み合わせなどの生物学的または環境的な試料であり得る。例えば、限定するものではないが、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含む任意の材料で作られた家庭用/商業用/産業用の表面を拭き取り、汚染物質を検査してもよい。土壌試料は、環境目的及び/またはヒト、動物、もしくは植物の病気の試験の両方のために、病原菌もしくは寄生生物、または他の微生物の存在について試験してもよい。淡水試料、廃水試料、または塩水試料などの水試料は、清浄度及び安全性、ならびに/または携帯性について評価され、例えば、Cryptosporidium parvum、Giardia lamblia、または他の微生物汚染の存在を検出し得る。さらなる実施形態では、生体試料は、限定するものではないが、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿膜腫、血清腫、膿、または皮膚のスワブまたは粘膜表面を含む表面に由来し得る。いくつかのある特定の実施形態では、環境試料または生物学的試料は、粗製試料であってもよく、そして/または1つ以上の標的分子は、方法の適用前に試料から精製または増幅されなくてもよい。微生物の同定は、任意の数の用途に有用及び/または必要であり得、したがって、当業者によって適切であると見なされる任意の供給源からの任意のタイプの試料が、本発明に従って使用され得る。
いくつかの実施形態では、レストランまたは他の食品提供業者における、E.coliなどの細菌による食品汚染;食品の表面をチェックすること;Salmonella、Campylobacter、またはE.coliなどの病原菌について水を試験すること;また、製造業者及び規制当局が食肉の純度を判断するために食品の品質をチェックすること;レジオネラなどの病原菌による空気汚染を特定すること;ビールがPediococcus及びLactobacillusなどの病原体によって汚染されているか、腐敗しているか否かをチェックすること;製造中の細菌または真菌による低温殺菌または非低温殺菌チーズの汚染である。
本発明による微生物は、病原性微生物、または食物もしくは消費製品の腐敗をもたらす微生物であり得る。病原性微生物は病原性であるか、さもなければヒト、動物、もしくは植物にとって望ましくない場合がある。ヒトまたは動物の目的では、微生物は疾患を引き起こすか、疾患につながる場合がある。本発明の動物または獣医への適用は、微生物に感染した動物を特定し得る。例えば、本発明の方法及び系は、ケンネルコフ(Kennel cough)、狂犬病ウイルス、及び糸状虫を含むがこれらに限定されない病原体を有するコンパニオンアニマルを同定し得る。他の実施形態では、本発明の方法及び系は、育種目的の血統試験に使用されてもよい。植物微生物は、植物への害もしくは病気、収量の減少、または色、味、粘稠度、臭気などの形質の変化を生じ得る場合がある。食品または消費可能な汚染の目的で、微生物は、食品または消費可能な製品の味、臭い、色、粘稠度、またはその他の商業的特性に悪影響を及ぼし得る。ある特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌種である。細菌は、低温菌、大腸菌群、乳酸菌、または胞子形成細菌であってもよい。ある特定の例示的な実施形態では、細菌は、疾患もしくは病気を引き起こすか、そうでなければ望ましくない産物もしくは形質をもたらす任意の細菌種であり得る。本発明による細菌は、ヒト、動物、または植物に対して病原性であり得る。
試料タイプ
本明細書に開示される方法での使用に適切な試料は、植物、動物、細菌などのような生物またはその一部から得られる任意の従来の生物学的試料を含む。特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒト対象などの動物対象から得られる。生物学的試料とは、任意の生きている生物、例としては、限定するものではないが、単細胞生物、例えば、細菌、酵母、原生動物、及びとりわけアメーバ、多細胞生物(植物または植物など)から取得、排泄、または分泌される任意の固体または液体の試料であり、例としては、健常もしくは見かけ上健常なヒト対象、または病原性細菌もしくはウイルスなどの病原性部生物による感染などを診断もしくは検討される状態もしくは疾患に罹患している、ヒト患者由来の試料が挙げられる。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、房水、もしくは硝子体液、または任意の体液、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍またはその他の感染もしくは炎症部位から得られた液体)、または関節から得られた液体(例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、もしくは敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節)、または皮膚のスワブまたは粘膜表面から得られる生物学的液であり得る。
本明細書に開示される方法での使用に適切な試料は、植物、動物、細菌などのような生物またはその一部から得られる任意の従来の生物学的試料を含む。特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒト対象などの動物対象から得られる。生物学的試料とは、任意の生きている生物、例としては、限定するものではないが、単細胞生物、例えば、細菌、酵母、原生動物、及びとりわけアメーバ、多細胞生物(植物または植物など)から取得、排泄、または分泌される任意の固体または液体の試料であり、例としては、健常もしくは見かけ上健常なヒト対象、または病原性細菌もしくはウイルスなどの病原性部生物による感染などを診断もしくは検討される状態もしくは疾患に罹患している、ヒト患者由来の試料が挙げられる。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、房水、もしくは硝子体液、または任意の体液、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍またはその他の感染もしくは炎症部位から得られた液体)、または関節から得られた液体(例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、もしくは敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節)、または皮膚のスワブまたは粘膜表面から得られる生物学的液であり得る。
試料はまた、任意の臓器または組織(腫瘍生検などの生検または剖検標本を含む)から得られた試料であってもよいし、または細胞(初代細胞または培養細胞のいずれか)または任意の細胞、組織もしくは臓器により馴化された培地を含んでもよい。例示的な試料としては、限定するものではないが、細胞、細胞溶解物、血液スメア、細胞遠心調製物、細胞学スメア、体液(例えば、血液、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、気管支肺胞洗浄液、精液など)、組織生検(例えば、腫瘍生検)、細針吸引、及び/または組織切片(例えば、クリオスタット組織切片及び/またはパラフィン包埋組織切片)が挙げられる。他の例では、試料は、循環腫瘍細胞を含む(これは細胞表面マーカーによって特定され得る)。特定の実施例では、試料は直接使用(例えば、新鮮または凍結)されてもよいし、使用前に、例えば固定(例えば、ホルマリンを使用)及び/またはワックスに埋め込むこと(例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料)により操作してもよい。対象から組織を得る任意の方法を利用してもよいこと、使用する方法の選択は、組織の種類、対象の年齢、または施術者が利用し得る手順などの様々な要因に依存することが理解されよう。そのような試料を取得するための標準的な技術は、当該技術分野で利用可能である。例えば、Schluger et al.,J.Exp.Med.176:1327-33(1992);Bigby et al.,Am.Rev.Respir.Dis.133:515-18(1986);Kovacs et al.,NEJM 318:589-93(1988)、及びOgnibene et al.,Am.Rev.Respir.Dis.129:929-32(1984)を参照のこと。
他の実施形態では、試料は、水、土壌などの環境試料であってもよいし、または工業用もしくは医療用表面などの表面であってもよい。いくつかの実施形態では、米国特許公開第2013/0190196号に開示されているような方法を、高度な感度及び特異性を有する粗細胞試料に直接由来する核酸特徴、具体的にはRNAレベルの検出に適用してもよい。目的の各病原体に特異的な配列は、目的の病原体由来のコード配列を、BLASTソフトウェアにより他の生物体における全てのコード配列と比較することにより、同定してもよく、または選択してもよい。
本開示のいくつかの実施形態は、臨床血液試料を首尾よく分画するための、当該技術分野で公知の手順及びアプローチの使用を含む。例えば、Han Wei Hour et al.,Microfluidic Devices for Blood Fractionation,Micromachines 2011,2,319-343に記載されている手順、Ali Asgar S.Bhagat et al.,Dean Flow Fractionation(DFF)Isolation of Circulating Tumor Cells(CTCs)from Blood,15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences,October 2-6,2011,Seattle,WA、及び、国際特許公開番号WO2011109762(その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。血液試料は通常、試験目的で試料サイズを増大するために培養物中で拡大される。本発明のいくつかの実施形態では、血液または他の生物学的試料は、培養における拡大の必要なしに、本明細書中に記載されるような方法において使用され得る。
さらに、本開示のいくつかの実施形態は、Han Wei Hour et al.,Pathogen Isolation from Whole Blood Using Spiral Microchannel,Case No.15995JR,Massachusetts Institute of Technology,manuscript in preparation(その開示がその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載のように、スパイラルマイクロチャネルを使用する全血からの病原体を首尾よく分離する当該分野で公知の手順及びアプローチの使用を含む。
本明細書に開示される実施形態の感度の増大により、ある特定の例示的な実施形態では、アッセイ及び方法は、粗試料、または検出される標的分子が試料からさらに分画または精製されない試料に対して実行され得る。
マラリアの検出及びモニタリング
マラリアは、Plasmodium寄生生物によって引き起こされる蚊媒介性の疾患状態である。この寄生生物は感染した雌性Anopheles蚊に刺されて人々に広がる。5つのPlasmodium種、すなわちPlasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariae、及びPlasmodium knowlesiがヒトのマラリアの原因となる。その中でも、世界保健機関(WHO)によれば、Plasmodium falciparum及びPlasmodium vivaxが最大の脅威の原因である。P.falciparumは、アフリカ大陸で最も蔓延しているマラリア原虫であり、世界中で最も多くのマラリア関連死の原因となっている。P.vivaxは、サハラ以南のアフリカ以外のほとんどの国で主要なマラリア原虫である。
マラリアは、Plasmodium寄生生物によって引き起こされる蚊媒介性の疾患状態である。この寄生生物は感染した雌性Anopheles蚊に刺されて人々に広がる。5つのPlasmodium種、すなわちPlasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariae、及びPlasmodium knowlesiがヒトのマラリアの原因となる。その中でも、世界保健機関(WHO)によれば、Plasmodium falciparum及びPlasmodium vivaxが最大の脅威の原因である。P.falciparumは、アフリカ大陸で最も蔓延しているマラリア原虫であり、世界中で最も多くのマラリア関連死の原因となっている。P.vivaxは、サハラ以南のアフリカ以外のほとんどの国で主要なマラリア原虫である。
2015年には、91の国及び地域がマラリア伝染を継続していた。最新のWHOの推定によれば、2015年には2億1,200万のマラリアの症例があり、429000人が死亡している。マラリアの感染率が高い地域では、5歳未満の子供が特に感染し、病気にかかり、死にやすく、マラリアによる全死亡の3分の2超(70%)がこの年齢層で発生している。2010年~2015年の間に、5歳未満のマラリアによる死亡率は世界的に29%低下した。しかし、マラリアは依然として5歳未満の子供の主要な死亡原因であり、2分ごとに1人の子供の命を奪っている。
WHOにより記載されているように、マラリアは急性熱性疾患である。免疫のない人では、感染性の蚊に刺されてから7日以上経過すると症状が現れる。第1の症状である発熱、頭痛、悪寒、及び嘔吐は軽度であり得、マラリアとして認識するのは難しい場合もあるが、24時間以内に処置しない場合、P.falciparumマラリアは深刻な疾患に進行し、死に至る場合が多い。
重度のマラリアの子供は、以下の症状の1つ以上を高頻度に発症する:重度の貧血、代謝性アシドーシスに関連する呼吸窮迫、または脳マラリア。成人では、複数臓器の関与も頻繁に見られる。マラリアの流行地域では、人々は部分的な免疫を生じる場合があり、無症候性の感染を引き起こす可能性がある。
迅速かつ効率的な診断試験の開発は、公衆衛生にとって非常に重要である。実際に、マラリアの早期診断及び処置は、疾患を減らし、死を防ぐだけでなく、マラリア伝染の減少にも貢献している。WHOの勧告によれば、マラリアが疑われる全ての症例は、寄生生物ベースの診断試験(特に迅速診断テストを使用)を使用して、処置を施す前に確認する必要がある(2015年4月に発行された「マラリアの治療に関するWHOガイドライン(WHO Guidelines for the treatment of malaria)」第3版を参照のこと)。
抗マラリア療法に対する耐性は、治療戦略を激減させる重大な健康問題を表す。実際、WHOのウェブサイトで報告されているように、クロロキン及びスルファドキシン/ピリメタミン(SP)などの以前の世代の医薬に対するP.falciparumの耐性は、1950年代と1960年代に蔓延し、マラリア対策の労力を無効にさせ、子供の生存率を後退させた。したがって、WHOは、抗マラリア薬耐性の定期的なモニタリングを推奨している。実際、正確な診断は、不適切な治療を回避し、抗マラリア薬に対する耐性の拡大を限定し得る。
この文脈において、2015年5月に世界保健総会(World Healt Assembly)によって採択された2016年~2030年のマラリアのためのWHOグローバル技術戦略(WHO Global Technical Strategy for Malaria)は、全てのマラリア流行国に技術的枠組みを提供する。これは、マラリアの抑制と撲滅に向けて取り組む地域及び国別プログラムを指導及び支援することを目的としている。この戦略は、以下を含む野心的だが達成可能なグローバルな目標を設定する。
●2030年までにマラリア症例の発生率を少なくとも90%削減する。
●マラリアによる死亡率を2030年までに少なくとも90%削減する。
●2030年までに少なくとも35か国でマラリアを撲滅する。
●マラリアのない全ての国でのマラリアの再発を防止する。
●2030年までにマラリア症例の発生率を少なくとも90%削減する。
●マラリアによる死亡率を2030年までに少なくとも90%削減する。
●2030年までに少なくとも35か国でマラリアを撲滅する。
●マラリアのない全ての国でのマラリアの再発を防止する。
この戦略は、2年間にわたる広範な協議プロセスの結果であり、70の加盟国から400人を超える技術専門家が参加した。これは、3つの主要な軸に基づいている。
●マラリアの予防、診断、及び処置への普遍的なアクセスを確保すること、
●マラリアのない状態の解消及び達成に向けた取り組みを加速すること、ならびに
●マラリアのサーベイランスを中心的な介入に変換すること。
●マラリアの予防、診断、及び処置への普遍的なアクセスを確保すること、
●マラリアのない状態の解消及び達成に向けた取り組みを加速すること、ならびに
●マラリアのサーベイランスを中心的な介入に変換すること。
Plasmodiumに対する処置には、キニーネなどのアリール-アミノアルコール、またはクロロキン、アモジアキン、メフロキン、ピペラキン、ルメファントリン、プリマキンなどのキニーネ誘導体;アトバコンなどの親油性ヒドロキシナフトキノンアナログ;サルファ剤、スルファドキシン、ダプソン、及びピリメタミンなどの葉酸拮抗剤;プログアニル;アトバコン/プログアニルの組み合わせ;アテミシン薬;及びそれらの組み合わせが挙げられる。
蚊媒介性病原体の存在を診断する標的配列には、Plasmodium、特にヒトが罹患するPlasmodia種、例えば、Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariae、及びPlasmodium knowlesiの存在について診断的である配列を含み、そのゲノム由来の配列を含む。
Plasmodium、特にPlasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariae、及びPlasmodium knowlesiなどのヒトに罹患するPlasmodia種に対する治療に対する薬剤耐性をモニタリングするための診断的である標的配列。
さらなる標的配列には、Plasmodium寄生生物の必須の生物学的プロセスに関与するタンパク質、及び特に輸送体タンパク質、例えば、薬物/代謝産物輸送体ファミリー由来のタンパク質、ABC輸送体CサブファミリーまたはNa+/H+交換体、膜グルタチオンS-トランスフェラーゼなどの、基質転移に関与するATP結合カセット(ABC)タンパク質;ジヒドロプロテイン酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性またはジヒドロ葉酸レダクターゼ-チミジル酸シンターゼなどの葉酸経路に関与するタンパク質;ならびに、ミトコンドリア内膜、特にチトクロームb複合体を横切るプロトンの移動に関与するタンパク質をコードする標的分子/核酸分子を含む配列が挙げられる。追加の標的には、ヘムポリメラーゼをコードする遺伝子(複数可)も含まれ得る。
さらなる標的配列には、P.falciparumクロロキン耐性輸送体遺伝子(pfcrt)、P.falciparum多剤耐性輸送体1(pfmdr1)、P.falciparum多剤耐性関連タンパク質遺伝子(Pfmrp)、P.falciparum Na+/H+交換遺伝子(pfnhe)、P.falciparumエクスポートタンパク質1、P.falciparum Ca2+輸送ATPase 6(pfatp6)をコードする遺伝子;P.falciparumジヒドロプロテイン酸合成酵素(pfdhps)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性(pfdhpr)及びジヒドロ葉酸レダクターゼ-チミジル酸シンターゼ(pfdhfr)遺伝子、チトクロームb遺伝子、GTPシクロヒドロラーゼ及びKelch13(K13)遺伝子、ならびに他のPlasmodium種におけるそれらの機能的異種遺伝子から選択され得る必須の生物学的プロセスに関与するタンパク質をコードする標的分子/核酸分子が挙げられる。
現在の治療の標的であり、特定の耐性表現型に関連するタンパク質において、いくつかの変異、特に単一点変異が同定されている。したがって、本発明は、Plasmodiumなどの蚊媒介性寄生生物の様々な耐性表現型の検出を可能にする。
本発明は、標的核酸/分子における1つ以上の変異(複数可)、特に1つ以上の単一ヌクレオチド多型を検出することを可能にする。したがって、以下の変異のいずれか1つ、またはそれらのうちそれらの組み合わせを、薬剤耐性マーカーとして使用してもよく、本発明に従って検出し得る。
P.falciparum K13の単一点変異には、以下の位置252、441、446、449、458、493、539、543、553、561、568、574、578、580、675、476、469、481、522、537、538、579、584及び719ならびに特に変異E252Q、P441L、F446I、G449A、N458Y、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、V568G、P574L、A578S、C580Y、A675V、M476I;C469Y;A481V;S522C;N537I;N537D;G538V;M579I;D584V;及びH719Nの以下の単一点変異が含まれる。これらの変異は一般に、アルテミシンの薬剤耐性表現型と関連している(Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance(アルテミシニン及びアルテミシニンに基づく併用療法耐性),April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5)。
P.falciparumジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)(PfDHFR-TS、PFD0830w)において、重要な多型としては、ピリメタミンに対する耐性を調節する108、51、59及び164位、特に108D、164L、51I及び59Rにおける変異が挙げられる。他の多型としては、また、スルファドキシンへの耐性に関連する437G、581G、540E、436A及び613Sが挙げられる。追加で観察された変異としては、Ser108Asn、Asn51Ile、Cys59Arg、Ile164Leu、Cys50Arg、Ile164Leu、Asn188Lys、Ser189Arg及びVal213Ala、Ser108Thr及びAla16Valが挙げられる。変異Ser108Asn、Asn51Ile、Cys59Arg、Ile164Leu、Cys50Arg、Ile164Leuは、ピリメタミンベースの治療及び/またはクロログアニン-ダプソン併用療法の耐性に特に関連している。シクログアニル耐性は、Ser108Thr及びAla16Valの二重変異と関連しているようである。dhfrの増幅は、治療耐性、特にピリメタミン耐性にも高い関連性がある。
P.falciparumのジヒドロプロテイン酸合成酵素(DHPS)(PfDHPS、PF08_0095)では、重要な多型には、位置436、437、581及び613のSer436Ala/Phe、Ala437Gly、Lys540Glu、Ala581Gly及びAla613Thr/Serの変異が挙げられる。581位及び/または613位の多型もまた、スルファドキシン-ピリメタミン塩基療法に対する耐性と関連付けられている。
P.falciparumのクロロキン耐性輸送体(PfCRT)では、76位の多型、特に変異Lys76Thrは、クロロキンに対する耐性と関連している。さらなる多型には、Cys72Ser、Met74Ile、Asn75Glu、Ala220Ser、Gln271Glu、Asn326Ser、Ile356Thr及びArg371Ileが含まれ、これらはクロロキン耐性と関連している可能性がある。PfCRTはまた、残基S33、S411、及びT416でもリン酸化されており、これがタンパク質の輸送活性または特異性を調節している可能性がある。
P.falciparumの多剤耐性輸送体1(PfMDR1)(PFE1150w)では、86、184、1034、1042位の多型、特にAsn86Tyr、Tyr184-Phe、Ser1034Cys、Asn1042Asp及びAsp1246Tyrが同定されており、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、ハロファントリン、及びクロロキンに対する感受性に影響を与えることが報告されている。さらに、PfMDR1の増幅は、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、及びハロファントリンに対する感受性の低下と関連しており、PfMDR1の脱増幅は、クロロキン耐性の増大につながる。pfmdr1の増幅も検出される場合がある。PfMDR1のリン酸化状態も関連性が高いものである。
P.falciparum多剤耐性関連タンパク質(PfMRP)(遺伝子参照PFA0590w)では、191位及び/または437位の多型、例えばY191H及びA437Sが同定され、クロロキン耐性表現型と関連している。
P.falciparumのNA+/H+エンチャンジャー(PfNHE)(参照PF13_0019)において、マイクロサテライトms4670におけるDNNNDの反復の増大は、キニーネ耐性のマーカーであり得る。
シトクロムbe遺伝子(cytb、mal_mito_3)によってコードされるシトクロムbタンパク質のユビキノール結合部位を変化させる変異は、アトバコン耐性と関連している。26、268、276、133及び280位置の変異、特にTyr26Asn、Tyr268Ser、M1331及びG280Dは、アトバコン耐性と関連している場合がある。
例えば、P Vivaxでは、Pf MDR1の同族体であるPvMDR1の変異は、クロロキン耐性、特に変異Y976Fなどの976位の多型と関連づけられている。
上記の変異は、タンパク質配列に関して定義される。しかしながら、当業者は、核酸標的配列として同定されるべき、SNPSを含む対応する変異を決定し得る。
他の同定された薬物耐性マーカーは、例えば、“Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs(1996-2004)”;WHO;Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance(April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5)、“Drug-resistant malaria:molecular mechanisms and implications for public health”FEBS Lett.2011 Jun 6;585(11):1551-62.doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042.Epub 2011 Apr 23.Review.PubMed PMID:21530510(その内容が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるように、当該分野で公知である。
本発明に従って検出し得るポリペプチドに関しては、本明細書で言及した全ての遺伝子の遺伝子産物を標的として使用し得る。対応して、そのようなポリペプチドは、種の同定、分類及び/または薬剤耐性の検出に使用し得ることが企図される。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される系、デバイス、及び方法は、対象から得られる生体試料などの試料中の1つ以上の蚊媒介寄生生物の存在を検出することに関する。ある特定の例示的な実施形態では、寄生生物は、Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariaeまたはPlasmodium knowlesiという種から選択してもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、寄生生物種の迅速な特定、寄生生物及び寄生生物形態の存在(例えば、感染及び寄生生物の生活周期のさまざまな段階、例えば、外赤血球周期、赤血球周期、胞子形成周期;メロゾイト、スポロゾイト、シゾント、配偶子母細胞を含む寄生生物の形態に対応する)のモニタリング;ある特定の表現型(病原体の薬剤耐性など)の検出、疾患の進行及び/またはアウトブレークのモニタリング、及び治療(薬剤)スクリーニングを必要とする他の方法とともに(または組み合わせて)、他の方法での使用に適合させてもよい。さらに、マラリアの場合、感染性咬傷後、長期間が、すなわち、患者が症状を示さない長い潜伏期間が経過する可能性がある。同様に、予防的処置は症状の出現を遅らせ得、再発前に無症候性の長い期間が観察される場合もある。このような遅れは、誤診または診断の遅れを引き起こしやすく、治療の効果を損なう場合がある。
本明細書に開示される実施形態の迅速かつ高感度の診断能力、単一ヌクレオチドの相違までの寄生生物タイプの検出、及びPOCデバイスとして配備される能力のおかげで、本明細書に開示される実施形態は、処置の適切な経過の選択など、治療用ガイドとして使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、寄生生物の存在及び分類について環境試料(蚊の集団など)をスクリーニングするために使用されてもよい。実施形態はまた、蚊媒介性寄生生物及び他の蚊媒介性病原体を同時に検出するように改変されてもよい。場合によっては、マラリア及び他の蚊媒介性病原体が最初に同様の症状を示し得る。したがって、感染のタイプを迅速に区別する能力は、重要な処置の決定を導き得る。マラリアと関連して検出され得る他の蚊媒介性病原体としては、デング熱、西ナイルウイルス、チクングニア、黄熱病、フィラリア症、日本脳炎、セントルイス脳炎、西部ウマ脳炎、東部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎、ラクロス脳炎及びジカが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法は、試料中の複数の蚊媒介性寄生生物種を区別するために使用され得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、18S、16S、23S、及び5Sサブユニットを含むリボソームRNA配列に基づき得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、CYTBのようなミトコンドリア遺伝子などの、ゲノム中に複数のコピーで存在する遺伝子の配列に基づき得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、GAPDH、ヒストンH2B、エノラーゼ、またはLDHなどの高度に発現及び/または高度に保存されている遺伝子の配列に基づき得る。関連するrRNA配列を同定する方法は、米国特許出願公開第2017/0029872号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ガイドRNAのセットは、各種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計され得る。ガイドRNAはまた、属、科、目、綱、門、界のレベル、またはそれらの組み合わせで微生物を区別するRNA遺伝子を標的とするように設計されてもよい。増幅が使用されるある特定の例示的な実施形態では、一連の増幅プライマーは、リボソームRNA配列の隣接する定常領域及び可変内部領域によって各種を区別するように設計されたガイドRNAに設計され得る。ある特定の例示的な実施形態では、プライマー及びガイドRNAは、16Sサブユニット内の、それぞれ保存領域及び可変領域に対して設計されてもよい。種間または種のサブセット、例えば、RecA遺伝子ファミリー、RNAポリメラーゼβサブユニットなどの間で一意に変化する他の遺伝子またはゲノム領域も使用してもよい。他の適切な系統学的マーカー、及びそれを同定する方法は、例えば、Wu et al.arXiv:1307.8690[q-bio.GN]で考察されている。
ある特定の例示的な実施形態では、種の同定は、CYTBのようなミトコンドリア遺伝子などの、ゲノム内の複数のコピーに存在する遺伝子に基づいて実行してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、種同定は、GAPDH、ヒストンH2B、エノラーゼ、またはLDHなどの高度に発現されるか及び/または高度に保存された遺伝子に基づいて行い得る。
ある特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、複数の系統学的及び/または表現型レベルにわたって蚊媒介性寄生生物を同時にスクリーニングするように設計される。例えば、方法または診断は、異なるガイドRNAを伴う複数のCRISPR系の使用をさらに含んでもよい。ガイドRNAの第1のセットは、例えば、Plasmodium falciparumまたはPlasmodium vivaxを識別し得る。これらの一般的なクラスは、さらに細分化され得る。例えば、ガイドRNAは、一般に、または特定の薬物または薬物の組み合わせに関して、薬物耐性株を区別する方法または診断において設計及び使用され得る。ガイドRNAの第2のセットは、微生物を種レベルで区別するように設計してもよい。したがって、薬物耐性に従ってさらに分割された、全ての蚊媒介性寄生生物種または亜種を特定するマトリックスが生成され得る。上記は、例示のみを目的としている。他の種類の蚊媒介寄生生物を分類するための他の手段も考えられ、上記の一般的な構造に従う。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法を使用して、目的の蚊媒介性寄生生物遺伝子、例えば、薬物耐性遺伝子をスクリーニングしてもよい。ガイドRNAは、目的の公知の遺伝子を区別するように設計してもよい。次いで、試料(臨床試料を含む)を、1つ以上のそのような遺伝子の検出のために、本明細書に開示されている実施形態を使用してスクリーニングしてもよい。POCで薬剤耐性をスクリーニングする能力は、適切な治療計画を選択する上で非常に有益である。ある特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、輸送体タンパク質などのタンパク質、例えば、薬物/代謝産物輸送体ファミリー由来のタンパク質、ABC輸送体CサブファミリーまたはNa+/H+交換体などの、基質転移に関与するATP結合カセット(ABC)タンパク質;ジヒドロプロテイン酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性またはジヒドロ葉酸レダクターゼ-チミジル酸シンターゼなどの葉酸経路に関与するタンパク質;ならびに、ミトコンドリア内膜、特にチトクロームb複合体を横切るプロトンの移動に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。追加の標的としては、ヘムポリメラーゼをコードする遺伝子(複数可)も挙げられ得る。ある特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、P.falciparumのクロロキン耐性輸送体遺伝子(pfcrt)、P.falciparum多剤耐性輸送体1(pfmdr1)、P.falciparum多剤耐性関連タンパク質遺伝子(Pfmrp)、P.falciparum Na+/H+交換遺伝子(pfnhe)、P.falciparum Ca2+輸送ATPase 6(pfatp6)、P.falciparumジヒドロプロテイン酸合成酵素(pfdhps)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性(pfdhpr)及びジヒドロ葉酸レダクターゼ-チミジル酸シンターゼ(pfdhfr)遺伝子、チトクロームb遺伝子、GTPシクロヒドロラーゼ及びKelch13(K13)遺伝子、ならびに他のPlasmodium種におけるそれらの機能的異種遺伝子から選択される。他の同定された薬物耐性マーカーは、例えば、“Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs(1996-2004)”;WHO;Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance(April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5);“Drug-resistant malaria:molecular mechanisms and implications for public health”FEBS Lett.2011 Jun 6;585(11):1551-62.doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042.Epub 2011 Apr 23.Review.PubMed PMID:21530510(その内容が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されるように、当該分野で公知である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCRISPR系、検出系またはそれらの使用方法は、蚊媒介性寄生生物アウトブレイクの進展を決定するために使用され得る。この方法は、1人以上の対象由来の複数の試料から1つ以上の標的配列を検出することを含み得、ここでこの標的配列は、蚊媒介性寄生生物の蔓延またはアウトブレイクを引き起こすことに由来する配列である。そのような方法は、蚊媒介性寄生生物伝染のパターン、または蚊媒介性寄生生物によって引き起こされる疾患のアウトブレイクに関与する機序を決定することをさらに含み得る。この試料は、1人以上のヒトに由来してもよいし、及び/または1匹以上の蚊に由来してもよい。
病原体の伝染のパターンは、蚊媒介寄生生物の天然のリザーバーからの継続的な新しい伝染、もしくは天然のリザーバーからの単一の伝染に続く他の伝染(例えば、蚊を横切る)、またはその両方の混合を含んでもよい。一実施形態では、標的配列は、好ましくは、蚊媒介寄生生物ゲノムまたはその断片内の配列である。一実施形態では、蚊媒介性寄生生物伝染のパターンは、蚊媒介性寄生生物伝染の初期パターン、すなわち、蚊媒介性寄生生物のアウトブレイクの始まりでのパターンである。アウトブレイクの開始時に蚊が媒介する寄生生物の伝染のパターンを特定することにより、アウトブレイクを可能な限り早期に停止する可能性が高まり、それによって地域的及び国際的な感染の可能性が減少する。
蚊媒介寄生生物伝染のパターンを決定することは、本明細書に記載の方法に従って蚊媒介寄生生物配列を検出することを含んでもよい。病原体伝染のパターンを決定することは、対象間の蚊媒介寄生生物配列の共有宿主内変動を検出すること、及び共有宿主内変動が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含んでもよい。観察された宿主内及び宿主間変動のパターンによって、伝染及び疫学に関する重要な洞察が得られる(Gire,et al.,2014)。
本明細書に開示される他の試料タイプに加えて、試料は、1つ以上の蚊に由来する場合があり、例えば、試料は、蚊唾液をさらに含む場合がある。
バイオマーカー検出
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、バイオマーカー検出に使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、SNP検出及び/または遺伝子型決定のために使用され得る。本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、異常な遺伝子発現によって特徴付けられる任意の疾患状態または障害の検出のために使用され得る。異常な遺伝子発現としては、発現した遺伝子、発現の場所、発現レベルの異常が含まれる。他の疾患の中でも、心臓血管、免疫障害、及びがんに関連する複数の転写物またはタンパク質マーカーが検出され得る。ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される実施形態は、肝線維症及び拘束性/閉塞性肺疾患などの溶解を含む疾患の無細胞DNA検出に使用されてもよい。ある特定の例示的な実施形態では、この実施形態は、無細胞DNAの出生前検査のためのより迅速かつより持ち運びがしやすい検出のために利用され得る。本明細書に開示されている実施形態は、とりわけ、心血管の健康、脂質/代謝の特徴、民族特定、父子照合、ヒトID(例えば、SNP特徴の犯罪データベースへの容疑者の照合)に関連する異なるSNPのパネルをスクリーニングするために使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、がん腫瘍に関連する、及びがん腫瘍から放出される変異の無細胞DNA検出のためにも使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、例えば、所与の肉製品における異なる動物源の迅速な検出を提供することによって、肉の品質の検出のために使用され得る。本明細書に開示される実施形態は、GMOの検出またはDNAに関連する遺伝子編集にも使用され得る。本明細書の他のいずれかで説明されているように、密接に関連する遺伝子型/対立遺伝子またはバイオマーカー(例えば、所定の標的配列に単一のヌクレオチドの違いだけがある)を、gRNAに合成ミスマッチを導入することで区別し得る。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、バイオマーカー検出に使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、SNP検出及び/または遺伝子型決定のために使用され得る。本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、異常な遺伝子発現によって特徴付けられる任意の疾患状態または障害の検出のために使用され得る。異常な遺伝子発現としては、発現した遺伝子、発現の場所、発現レベルの異常が含まれる。他の疾患の中でも、心臓血管、免疫障害、及びがんに関連する複数の転写物またはタンパク質マーカーが検出され得る。ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される実施形態は、肝線維症及び拘束性/閉塞性肺疾患などの溶解を含む疾患の無細胞DNA検出に使用されてもよい。ある特定の例示的な実施形態では、この実施形態は、無細胞DNAの出生前検査のためのより迅速かつより持ち運びがしやすい検出のために利用され得る。本明細書に開示されている実施形態は、とりわけ、心血管の健康、脂質/代謝の特徴、民族特定、父子照合、ヒトID(例えば、SNP特徴の犯罪データベースへの容疑者の照合)に関連する異なるSNPのパネルをスクリーニングするために使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、がん腫瘍に関連する、及びがん腫瘍から放出される変異の無細胞DNA検出のためにも使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、例えば、所与の肉製品における異なる動物源の迅速な検出を提供することによって、肉の品質の検出のために使用され得る。本明細書に開示される実施形態は、GMOの検出またはDNAに関連する遺伝子編集にも使用され得る。本明細書の他のいずれかで説明されているように、密接に関連する遺伝子型/対立遺伝子またはバイオマーカー(例えば、所定の標的配列に単一のヌクレオチドの違いだけがある)を、gRNAに合成ミスマッチを導入することで区別し得る。
一態様では、本発明は、試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、この方法は以下を含む:
a)試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別容積に分配することであって、個別の容積は、本明細書に記載される本発明によるCRISPR系を含む、分配すること;
b)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすること;
c)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、このCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにRNAベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること;及び
d)検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の1つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
a)試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別容積に分配することであって、個別の容積は、本明細書に記載される本発明によるCRISPR系を含む、分配すること;
b)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすること;
c)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、このCRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにRNAベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること;及び
d)検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の1つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
バイオマーカーの試料タイプ
本明細書に記載のアッセイの感度は、標的核酸が希釈されているか、または試料材料が限定されている試料タイプを含む、多種多様な生物学的試料タイプにおける標的核酸の検出によく適している。バイオマーカーのスクリーニングは、唾液、尿、血液、糞便、喀痰、及び脳脊髄液を含むがこれらに限定されないいくつかの種類の試料に対して行い得る。本明細書に開示される実施形態はまた、遺伝子の上方調節及び/または下方調節を検出するためにも使用され得る。例えば、過剰発現された遺伝子のみがアッセイの検出限界閾値を超えて残るように、試料を連続的に希釈してもよい。
本明細書に記載のアッセイの感度は、標的核酸が希釈されているか、または試料材料が限定されている試料タイプを含む、多種多様な生物学的試料タイプにおける標的核酸の検出によく適している。バイオマーカーのスクリーニングは、唾液、尿、血液、糞便、喀痰、及び脳脊髄液を含むがこれらに限定されないいくつかの種類の試料に対して行い得る。本明細書に開示される実施形態はまた、遺伝子の上方調節及び/または下方調節を検出するためにも使用され得る。例えば、過剰発現された遺伝子のみがアッセイの検出限界閾値を超えて残るように、試料を連続的に希釈してもよい。
ある特定の実施形態では、本発明は、生体液(例えば、尿、血漿または血清、喀痰、脳脊髄液)の試料を入手し、DNAを抽出するステップを提供する。検出される変異ヌクレオチド配列は、より大きな分子の一部であってもよいし、または最初は別個の分子として存在してもよい。
ある特定の実施形態では、DNAは、がん患者の血漿/血清から単離される。比較のために、DNA試料が腫瘍組織から分離され、第2の試料は、同じ患者の非腫瘍組織(対照)、例えばリンパ球から分離され得る。非腫瘍性組織は、腫瘍性組織と同じタイプであってもよいし、または異なる臓器源に由来してもよい。ある特定の実施形態では、血液試料が収集され、血漿が遠心分離によって血球から直ちに分離される。血清はろ過され、DNA抽出まで凍結保存される。
ある特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、血液、血清、唾液、脳脊髄液、喀痰、または尿などの粗製または未処理の試料から直接検出される。ある特定の例示的な実施形態では、この標的核酸は無細胞DNAである。
循環腫瘍細胞
一実施形態では、循環細胞(例えば、循環腫瘍細胞(CTC))は、本発明を用いてアッセイされ得る。本明細書に記載されている方法のいずれかで使用するための循環腫瘍細胞(CTC)の分離を行ってもよい。本発明において使用され得る循環細胞の特異的かつ高感度な検出及び捕捉を達成する例示的な技術が記載されている(Mostert B,et al.,Circulating tumor cells(CTCs):detection methods and their clinical relevance in breast cancer.Cancer Treat Rev.2009;35:463-474、及びTalasaz AH,et al.,Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device.Proc Natl Acad Sci U S A.2009;106:3970-3975)。105~106個の末梢血単核細胞のバックグラウンドで1つだけのCTCが見つかる場合がある(Ross A A,et al.,Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques.Blood.1993,82:2605-2610)。CellSearch(登録商標)プラットフォームは、上皮細胞接着分子(EpCAM)に対する抗体でコーティングされた免疫磁気ビーズを使用して、EPCAMを発現する上皮細胞を濃縮した後、免疫染色を行ってサイトケラチン染色があることと白血球マーカーCD45が無いことを確認し、捕捉された細胞が上皮性腫瘍細胞であることを確認する(Momburg F,et al.,Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues.Cancer Res.1987;47:2883-2891、及びAllard WJ,et al.,Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.Clin Cancer Res.2004;10:6897-6904)。捕獲された細胞の数は、進行性疾患を有する乳癌、結腸直腸癌、及び前立腺癌の患者に予後的意義があることが前向きに証明されている(Cohen SJ,et al.,J Clin Oncol.2008;26:3213-3221;Cristofanilli M,et al.N Engl J Med.2004;351:781-791、Cristofanilli M,et al.,J Clin Oncol.2005;23:1420-1430、及びde Bono JS,et al.Clin Cancer Res.2008;14:6302-6309)。
一実施形態では、循環細胞(例えば、循環腫瘍細胞(CTC))は、本発明を用いてアッセイされ得る。本明細書に記載されている方法のいずれかで使用するための循環腫瘍細胞(CTC)の分離を行ってもよい。本発明において使用され得る循環細胞の特異的かつ高感度な検出及び捕捉を達成する例示的な技術が記載されている(Mostert B,et al.,Circulating tumor cells(CTCs):detection methods and their clinical relevance in breast cancer.Cancer Treat Rev.2009;35:463-474、及びTalasaz AH,et al.,Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device.Proc Natl Acad Sci U S A.2009;106:3970-3975)。105~106個の末梢血単核細胞のバックグラウンドで1つだけのCTCが見つかる場合がある(Ross A A,et al.,Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques.Blood.1993,82:2605-2610)。CellSearch(登録商標)プラットフォームは、上皮細胞接着分子(EpCAM)に対する抗体でコーティングされた免疫磁気ビーズを使用して、EPCAMを発現する上皮細胞を濃縮した後、免疫染色を行ってサイトケラチン染色があることと白血球マーカーCD45が無いことを確認し、捕捉された細胞が上皮性腫瘍細胞であることを確認する(Momburg F,et al.,Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues.Cancer Res.1987;47:2883-2891、及びAllard WJ,et al.,Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.Clin Cancer Res.2004;10:6897-6904)。捕獲された細胞の数は、進行性疾患を有する乳癌、結腸直腸癌、及び前立腺癌の患者に予後的意義があることが前向きに証明されている(Cohen SJ,et al.,J Clin Oncol.2008;26:3213-3221;Cristofanilli M,et al.N Engl J Med.2004;351:781-791、Cristofanilli M,et al.,J Clin Oncol.2005;23:1420-1430、及びde Bono JS,et al.Clin Cancer Res.2008;14:6302-6309)。
本発明はまた、CTC-チップ技術を用いたCTCの単離を提供する。CTC-Chipは、マイクロ流体ベースのCTC捕捉デバイスであり、CTCが結合する抗EpCAM抗体でコーティングされた数千のマイクロポストを含むチャンバを介して血液が流れる(Nagrath S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.Nature.2007;450:1235-1239)。CTC-Chipは、CellSearch(登録商標)系と比較して、CTCの数及び純度を有意に向上させ(Maheswaran S,et al.Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells,N Engl J Med.2008;359:366-377)、両方のプラットフォームとも下流の分子分析に使用され得る。
無細胞クロマチン
ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が、本発明に従って単離及び分析される。ヌクレオソームは、健康な個体(Stroun et al.,Annals of the New York Academy of Sciences 906:161-168(2000))、ならびに疾患状態に苦しむ個体の血清において検出され得る。さらに、ヌクレオソームの血清濃度は、がん及び自己免疫疾患などの良性及び悪性疾患に罹患している患者ではかなり高い(Holdenrieder et al(2001)Int J Cancer 95,1 14-120,Trejo-Becerril et al(2003)Int J Cancer 104,663-668、Kuroi et al 1999 Breast Cancer 6,361-364;Kuroi et al(2001)Int j Oncology 19,143-148、Amoura et al(1997)Arth Rheum 40,2217-2225、Williams et al(2001)J Rheumatol 28,81-94)。理論に拘束されるものではないが、腫瘍を有する患者における高濃度のヌクレオソームは、増殖中の腫瘍で自然発生するアポトーシスに由来する。血中を循環するヌクレオソームには、に改変されたヒストンが含まれている。例えば、米国特許公開第2005/0069931号(2005年3月31日)は、患者の血液または血清試料からヌクレオソームを単離して、診断/スクリーニングの目的で、付随するDNAの精製と分析を容易にするために、そのようなヒストン特異的抗体を使用する、疾患の診断指標としての特定のヒストンN末端改変に対する抗体の使用に関する。したがって、本発明は、例えば腫瘍変異を検出及びモニタリングするためにクロマチン結合DNAを使用し得る。改変されたヒストンに関連するDNAの同定は、疾患及び先天性欠損症の診断マーカーとして役立つ。
ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が、本発明に従って単離及び分析される。ヌクレオソームは、健康な個体(Stroun et al.,Annals of the New York Academy of Sciences 906:161-168(2000))、ならびに疾患状態に苦しむ個体の血清において検出され得る。さらに、ヌクレオソームの血清濃度は、がん及び自己免疫疾患などの良性及び悪性疾患に罹患している患者ではかなり高い(Holdenrieder et al(2001)Int J Cancer 95,1 14-120,Trejo-Becerril et al(2003)Int J Cancer 104,663-668、Kuroi et al 1999 Breast Cancer 6,361-364;Kuroi et al(2001)Int j Oncology 19,143-148、Amoura et al(1997)Arth Rheum 40,2217-2225、Williams et al(2001)J Rheumatol 28,81-94)。理論に拘束されるものではないが、腫瘍を有する患者における高濃度のヌクレオソームは、増殖中の腫瘍で自然発生するアポトーシスに由来する。血中を循環するヌクレオソームには、に改変されたヒストンが含まれている。例えば、米国特許公開第2005/0069931号(2005年3月31日)は、患者の血液または血清試料からヌクレオソームを単離して、診断/スクリーニングの目的で、付随するDNAの精製と分析を容易にするために、そのようなヒストン特異的抗体を使用する、疾患の診断指標としての特定のヒストンN末端改変に対する抗体の使用に関する。したがって、本発明は、例えば腫瘍変異を検出及びモニタリングするためにクロマチン結合DNAを使用し得る。改変されたヒストンに関連するDNAの同定は、疾患及び先天性欠損症の診断マーカーとして役立つ。
したがって、別の実施形態では、単離されたクロマチン断片は、循環クロマチン、好ましくは循環モノ及びオリゴヌクレオソームに由来する。単離されたクロマチン断片は、生物学的試料に由来し得る。生物学的試料は、それを必要とする対象または患者に由来し得る。生物学的試料は、血清、血漿、リンパ液、血液、血液画分、尿、滑液、髄液、唾液、循環腫瘍細胞または粘液であり得る。
無細胞DNA(cfDNA)
ある特定の実施形態では、本発明を使用して、無細胞DNA(cfDNA)を検出し得る。血漿または血清中の無細胞DNAは、非侵襲的な診断ツールとして使用され得る。例えば、無細胞胎児DNAは、互換性のあるRhD因子の試験、X連鎖遺伝性疾患の性別判定、単一遺伝子障害の試験、子癇前症の特定のために研究及び最適化されている。例えば、母体血漿中のcfDNAの胎児細胞分画の配列決定は、胎児染色体異数性に関連するコピー数の変化を検出するための信頼し得るアプローチである。別の例として、がん患者から分離されたcfDNAは、治療の決定に関連する主要な遺伝子の変異を検出するために使用されている。
ある特定の実施形態では、本発明を使用して、無細胞DNA(cfDNA)を検出し得る。血漿または血清中の無細胞DNAは、非侵襲的な診断ツールとして使用され得る。例えば、無細胞胎児DNAは、互換性のあるRhD因子の試験、X連鎖遺伝性疾患の性別判定、単一遺伝子障害の試験、子癇前症の特定のために研究及び最適化されている。例えば、母体血漿中のcfDNAの胎児細胞分画の配列決定は、胎児染色体異数性に関連するコピー数の変化を検出するための信頼し得るアプローチである。別の例として、がん患者から分離されたcfDNAは、治療の決定に関連する主要な遺伝子の変異を検出するために使用されている。
ある特定の例示的な実施形態では、本開示は、患者試料から直接cfDNAを検出することを提供する。ある他の例示的な実施形態では、本開示は、標的cfDNAを検出する前に、上記で開示された濃縮実施形態を使用して、cfDNAを濃縮することを提供する。
エキソソーム
一実施形態では、エキソソームを本発明でアッセイし得る。エキソソームは、RNAを含むことが示されている小さな細胞外小胞である。超遠心分離、ろ過、化学沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、及びマイクロ流体工学によるエキソソームの単離は、当該技術分野で公知である。一実施形態では、エキソソームは、エキソソームバイオマーカーを使用して精製される。生体試料からのエキソソームの単離及び精製は、任意の公知の方法によって行われ得る(例えば、WO2016172598A1を参照のこと)。
一実施形態では、エキソソームを本発明でアッセイし得る。エキソソームは、RNAを含むことが示されている小さな細胞外小胞である。超遠心分離、ろ過、化学沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、及びマイクロ流体工学によるエキソソームの単離は、当該技術分野で公知である。一実施形態では、エキソソームは、エキソソームバイオマーカーを使用して精製される。生体試料からのエキソソームの単離及び精製は、任意の公知の方法によって行われ得る(例えば、WO2016172598A1を参照のこと)。
SNP検出と遺伝子型決定
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、生物学的試料中の一塩基多型(SNP)の存在を検出するために使用され得る。SNPは、産科検査(例えば、性別の決定、胎児の欠陥)に関連している場合がある。それらは犯罪捜査に関連している場合がある。一実施形態では、犯罪捜査の容疑者が本発明によって特定され得る。理論に縛られないが、核酸ベースの法医学的証拠は、試験される試料が限定的であり得るので、容疑者または犠牲者の遺伝物質を検出するために利用可能な最も感度の高いアッセイを必要とする場合がある。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、生物学的試料中の一塩基多型(SNP)の存在を検出するために使用され得る。SNPは、産科検査(例えば、性別の決定、胎児の欠陥)に関連している場合がある。それらは犯罪捜査に関連している場合がある。一実施形態では、犯罪捜査の容疑者が本発明によって特定され得る。理論に縛られないが、核酸ベースの法医学的証拠は、試験される試料が限定的であり得るので、容疑者または犠牲者の遺伝物質を検出するために利用可能な最も感度の高いアッセイを必要とする場合がある。
他の実施形態では、疾患に関連するSNPが、本発明に包含される。疾患に関連するSNPは、当該技術分野で周知であり、当業者は本発明の方法を適用して適切なガイドRNAを設計し得る(例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn%5Dを参照のこと)。
一態様では、本発明は、以下を含む、SNP遺伝子型決定などの遺伝子型決定方法に関する:
a)試料または試料のセットを1つ以上の個体の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載される本発明によるCRISPR系を含む、分配すること;
b)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること;
c)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにRNAベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること;及び
d)検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の特定の遺伝子型に特徴的な1つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
a)試料または試料のセットを1つ以上の個体の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載される本発明によるCRISPR系を含む、分配すること;
b)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること;
c)1つ以上のガイドRNAの1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにRNAベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること;及び
d)検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の特定の遺伝子型に特徴的な1つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、(例えば、シグナル強度の比較により)1つ以上の標準シグナル、好ましくは、例えば図60の例示的な実施形態に示されるような合成標準シグナルと比較される。ある特定の実施形態では、標準は、特定の遺伝子型であるか、またはそれに対応する。ある特定の実施形態では、この標準は、特定のSNPまたは他の(単一の)ヌクレオチド変形を含む。ある特定の実施形態では、標準は(PCR増幅)遺伝子型標準である。ある特定の実施形態では、標準はDNAであるかまたはDNAを含む。ある特定の実施形態では、標準は、RNAであるか、またはRNAを含む。ある特定の実施形態では、標準は、DNAから転写されるRNAであるか、またはそのRNAを含む。ある特定の実施形態では、標準は、RNAから逆転写されるDNAであるか、またはそのDNAを含む。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、1つ以上の標準と比較され、そのそれぞれは、SNPまたは他の(単一の)ヌクレオチド変異などの公知の遺伝子型に対応する。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、1つ以上の標準シグナルと比較され、比較は、一元配置または二元配置分散分析などによるパラメトリックまたはノンパラメトリック統計分析などによる統計分析を含む。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルを、1つ以上の標準シグナルと比較し、検出可能なシグナルが(統計的に)標準から大きく逸脱しない場合、遺伝子型は上記標準に対応する遺伝子型として決定される。
他の実施形態では、本発明によって、緊急薬理ゲノミクスのための迅速な遺伝子型決定が可能になる。一実施形態では、救急治療室に運ばれた患者の遺伝子型を決定するために、シングルポイントオブケアアッセイを使用してもよい。患者は血栓を有する疑いがある場合があり、救急医は投与する抗凝血剤の投与量を決定する必要がある。例示的な実施形態では、本発明は、VKORC1、CYP2C9、及びCYP2C19などのマーカーの遺伝子型分類に基づいて、心筋梗塞または脳卒中治療中に抗凝血剤を投与するためのガイダンスを提供し得る。一実施形態では、抗凝血剤は、抗凝固剤ワルファリンである(Holford,NH(December 1986).“Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship”.Clinical Pharmacokinetics.Springer International Publishing.11(6):483-504)。血液凝固に関連する遺伝子は当該分野で公知である(例えば、US20060166239A1、Litin SC, Gastineau DA(1995)“Current concepts in anticoagulant therapy”.Mayo Clin.Proc.70(3):266-72、及びRusdiana et al.,Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1,CYP2C9,CYP2C19,and CYP4F2 in an Indonesian population.Eur J Clin Pharmacol.2013 Mar;69(3):395-405)。具体的には、VKORC1 1639(または3673)一塩基多型では、共通(「野生型」)G対立遺伝子が、A対立遺伝子に置き換わる。A対立遺伝子(または「Aハプロタイプ」)を有する人々は、G対立遺伝子(または「非Aハプロタイプ」)を有する人々よりも生成するVKORC1が少ない。これらのバリアントの有病率も人種によって異なり、白人の37%、アフリカ人の14%がA対立遺伝子を保有している。最終結果は、凝固因子の数が減少するため、凝固能力が低下する。
ある特定の例示的な実施形態では、患者におけるSNPを検出するための遺伝物質の利用可能性は、DNAまたはRNA試料の増幅なしにSNPを検出することを可能にする。遺伝子型決定の場合、試験された生体試料は簡単に入手し得る。ある特定の例示的な実施形態では、本発明のインキュベーション時間は短縮され得る。このアッセイは、酵素反応が起こるのに必要な期間で実施され得る。当業者は、5分で生化学反応を行い得る(例えば、5分のライゲーション)。本発明は、血液からDNAを得るために、自動化されたDNA抽出デバイスを使用し得る。次に、エフェクタータンパク質の標的分子を生成する反応にDNAを追加し得る。標的分子を生成するとすぐに、マスキング剤を切断し、シグナルを検出し得る。例示的な実施形態では、本発明は、薬物(例えば、抗凝血剤)を投与する前に遺伝子型を決定するためのPOC迅速診断を可能にする。増幅ステップを使用する場合、全ての反応は1つのステップのプロセスで同じ反応で発生する。好ましい実施形態では、POCアッセイは、1時間未満、好ましくは10分、20分、30分、40分、または50分で行い得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、長い非コードRNA(lncRNA)の存在または発現レベルを検出するために使用され得る。ある特定のlncRNAの発現は、疾患状態及び/または薬剤耐性と関連している。特に、ある特定のlncRNA(例えば、TCONS_00011252、NR_034078、TCONS_00010506、TCONS_00026344、TCONS_00015940、TCONS_00028298、TCONS_00026380、TCONS_0009861、TCONS_00026521、TCONS_00016127、NR_125939、NR_033834、TCONS_00021026、TCONS_00006579、NR_109890、及びNR_026873)は、黒色腫(例えば、結節性黒色腫、悪性黒子、黒子性悪性黒色腫、側黒斑性黒色腫、表層拡大、黒色腫、粘膜黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏黒色腫、及び軟部組織黒色腫)を処置するための1つ以上のBRAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、GDC-0879、PLX-4720、及びLGX818)に対する耐性など、がん処置に対する耐性に関連する。本明細書に記載されている様々な実施形態を使用したlncRNAの検出は、疾患の診断及び/または処置オプションの選択を容易にし得る。
一実施形態では、本発明は、特に治療の迅速な投与が処置の転帰にとって重要である状況において、DNAまたはRNA標的治療(例えば、CRISPR、TALE、ジンクフィンガータンパク質、RNAi)を導き得る。
LOH検出
がん細胞は、正常細胞と比較した場合、遺伝物質(DNA)の喪失を受ける。全てではないにしてもほとんど全てのがんが受ける遺伝物質のこの欠失は、「ヘテロ接合性の喪失(loss of heterozygosity)」(LOH)と呼ばれる。ヘテロ接合性の喪失(LOH)は、遺伝子全体及び周囲の染色体領域の喪失をもたらす、全体的な染色体イベントである。ヘテロ接合性の喪失は、がんでよく見られる現象であり、喪失した領域に機能的な腫瘍抑制遺伝子がないことを示している可能性がある。しかし、染色体対のもう一方の染色体には1つの機能的遺伝子が残っているため、消失してもサイレントであり得る。腫瘍抑制遺伝子の残りのコピーは、点突然変異によって不活性化され得、腫瘍抑制遺伝子の喪失につながる。がん細胞からの遺伝物質の喪失は、染色体上の特定の遺伝子座での細胞生存率または細胞増殖に不可欠な遺伝子の2つ以上の対立遺伝子の1つを選択的に喪失させ得る。
がん細胞は、正常細胞と比較した場合、遺伝物質(DNA)の喪失を受ける。全てではないにしてもほとんど全てのがんが受ける遺伝物質のこの欠失は、「ヘテロ接合性の喪失(loss of heterozygosity)」(LOH)と呼ばれる。ヘテロ接合性の喪失(LOH)は、遺伝子全体及び周囲の染色体領域の喪失をもたらす、全体的な染色体イベントである。ヘテロ接合性の喪失は、がんでよく見られる現象であり、喪失した領域に機能的な腫瘍抑制遺伝子がないことを示している可能性がある。しかし、染色体対のもう一方の染色体には1つの機能的遺伝子が残っているため、消失してもサイレントであり得る。腫瘍抑制遺伝子の残りのコピーは、点突然変異によって不活性化され得、腫瘍抑制遺伝子の喪失につながる。がん細胞からの遺伝物質の喪失は、染色体上の特定の遺伝子座での細胞生存率または細胞増殖に不可欠な遺伝子の2つ以上の対立遺伝子の1つを選択的に喪失させ得る。
「LOHマーカー」は、正常細胞と比較した場合にがんまたは他の疾患に関連する、マイクロサテライト遺伝子座、欠失、変更、または増幅由来のDNAである。LOHマーカーは、多くの場合、腫瘍抑制遺伝子または別の、通常は腫瘍関連の遺伝子の喪失に関連している。
「マイクロサテライト」という用語は、ヒトゲノムに広く分布しているDNAの短いリピート配列を指す。マイクロサテライトは、長さが2~5ヌクレオチドの範囲にあるタンデムに繰り返される(すなわち、隣接する)DNAモチーフの経路であり、通常5~50回繰り返される。例えば、配列TATATATATA(配列番号418)はジヌクレオチドマイクロサテライトであり、GTCGTCGTCGTCGTC(配列番号419)は、トリヌクレオチドマイクロサテライト(Aはアデニン、Gはグアニン、Cはシトシン、及びTはチミン)である。そのようなマイクロサテライトの繰り返しの長さにおける体細胞の変化は、腫瘍の特徴的な特徴を表すことが示されている。ガイドRNAは、そのようなマイクロサテライトを検出するように設計されてもよい。さらに、本発明は、検出可能なシグナルの定量に基づいて、リピート長の変化、ならびに増幅及び欠失を検出するために使用され得る。ある特定のマイクロサテライトは、遺伝子の調節性隣接領域もしくはイントロン領域、または遺伝子のコドンに直接配置されている。そのような場合のマイクロサテライト変異は、特に脆弱X症候群及びハンチントン病などのトリプレット拡大疾患において、表現型の変化及び疾患につながり得る。
特定の染色体領域でのヘテロ接合性(LOH)の頻繁な喪失は、多くの種類の悪性腫瘍で報告されている。特定の染色体領域での対立遺伝子の喪失は、さまざまな悪性腫瘍で観察される最も一般的な遺伝的変化であり、したがって、マイクロサテライト分析は、肺癌の痰及び膀胱癌の尿などの体液からの検体中のがん細胞のDNAを検出するために適用されている。(Rouleau,et al.Nature 363,515-521(1993)、及びLatif et al.Science 260,1317-1320(1993))。さらに、がん及び他のいくつかの疾患を有する個体の血漿中に、著しく増大した濃度の可溶性DNAが存在することが確立されており、無細胞血清または血漿がマイクロサテライト異常を有するがんDNAの検出に使用され得ることが示されている。(Kamp,et al.Science 264,436-440(1994)、及びSteck,et al.Nat Genet.15(4),356-362(1997))。2つのグループが、小細胞肺癌または頭頸部癌の限られた数の患者の血漿または血清におけるマイクロサテライトの変化を報告している。(Hahn,et al.Science 271,350-353(1996)、及びMiozzo,et al.Cancer Res.56,2285-2288(1996))。腫瘍及び黒色腫患者の血清におけるヘテロ接合性の喪失の検出も以前に示されている(例えば、米国特許番号US6465177B1を参照のこと)。
したがって、がんに罹患しているか、またはがんのリスクがある対象においてLOHマーカーを検出することは有利である。本発明は、腫瘍細胞におけるLOHを検出するために使用され得る。一実施形態では、循環腫瘍細胞を生物学的試料として使用し得る。好ましい実施形態では、血清または血漿から得られた無細胞DNAを使用して、LOHを非侵襲的に検出及び/またはモニタリングする。他の実施形態では、生物学的試料は、本明細書に記載されている任意の試料(例えば、膀胱癌の尿試料)であってもよい。理論に拘束されるものではないが、本発明を使用して、任意の従来の方法と比較して感度が改善されたLOHマーカーを検出し得、それにより変異の早期検出を提供する。一実施形態では、LOHは生物学的液中で検出され、LOHの存在はがんの発生に関連している。本明細書に記載される方法及び系は、がんに関連する特定の対立遺伝子のLOHを検出するための非侵襲的、迅速かつ正確な方法を提供することにより、PCRまたは組織生検などの従来の技術を大きく上回る進歩を表す。したがって、本発明は、ハイリスク集団をスクリーニングし、化学予防、化学療法、免疫療法または他の治療を受けているハイリスク患者をモニタリングするために使用され得る方法及び系を提供する。
本発明の方法は、血液などの体液からのDNA抽出のみを必要とするので、単一の患者に対していつでも、かつ繰り返して実施し得る。手術前または手術後;化学療法、放射線療法、遺伝子療法、または免疫療法などの処置前、処置中、及び処置後;または、疾患の進行、安定性、または再発の処置後の追跡検査中に血液を採取し、LOHをモニターしてもよい。理論に拘束されるものではないが、本発明の方法はまた、LOHマーカーが個々の患者の腫瘍に特異的であるため、その患者に特異的なLOHマーカーを用いて無症状の疾患の存在または再発を検出するために使用してもよい。この方法はまた、腫瘍特異的なLOHマーカーを使用して、複数の転移が存在するかを検出もし得る。
後成的な改変の検出
本発明では、がんまたはがんの進行を示すヒストンバリアント、DNA改変、及びヒストン改変を使用してもよい。例えば、米国特許公開20140206014は、がんの試料が、健康な対象と比較して、ヌクレオソームH2AZ、マクロH2A1.1、5-メチルシトシン、P-H2AX(Ser139)レベルを上昇させたことを記載している。個体におけるがん細胞の存在は、がん細胞のアポトーシスの増大の結果として、血中に、より高いレベルの無細胞ヌクレオソームを生成し得る。一実施形態では、H2B Ser 14(P)などのアポトーシスに関連するマークに対する抗体を使用して、アポトーシス性腫瘍細胞から放出された単一のヌクレオソームを同定し得る。したがって、腫瘍細胞から生じるDNAは、本発明に従って、高い感度及び正確性で有利に分析され得る。
本発明では、がんまたはがんの進行を示すヒストンバリアント、DNA改変、及びヒストン改変を使用してもよい。例えば、米国特許公開20140206014は、がんの試料が、健康な対象と比較して、ヌクレオソームH2AZ、マクロH2A1.1、5-メチルシトシン、P-H2AX(Ser139)レベルを上昇させたことを記載している。個体におけるがん細胞の存在は、がん細胞のアポトーシスの増大の結果として、血中に、より高いレベルの無細胞ヌクレオソームを生成し得る。一実施形態では、H2B Ser 14(P)などのアポトーシスに関連するマークに対する抗体を使用して、アポトーシス性腫瘍細胞から放出された単一のヌクレオソームを同定し得る。したがって、腫瘍細胞から生じるDNAは、本発明に従って、高い感度及び正確性で有利に分析され得る。
出産前スクリーニング
ある特定の実施形態では、本発明の方法及び系は、出生前スクリーニングで使用され得る。ある特定の実施形態では、無細胞DNAは、出生前スクリーニングの方法において使用される。ある特定の実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するDNAを、本発明を用いて検出され得る。好ましい実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するDNAの検出は、出生前スクリーニングのために使用される。ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が出生前スクリーニングの方法で使用される。
ある特定の実施形態では、本発明の方法及び系は、出生前スクリーニングで使用され得る。ある特定の実施形態では、無細胞DNAは、出生前スクリーニングの方法において使用される。ある特定の実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するDNAを、本発明を用いて検出され得る。好ましい実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するDNAの検出は、出生前スクリーニングのために使用される。ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が出生前スクリーニングの方法で使用される。
出生前診断または出生前スクリーニングは、胎児または胚が生まれる前に、それらの疾患または状態を検査することを指す。目的は、神経管欠損症、ダウン症候群、染色体異常、遺伝性障害、及び他の状態、例えば、二分脊椎、口蓋裂、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー及び脆弱性X症候群などの先天性欠損症を検出することである。スクリーニングはまた、出生前の性別の識別にも使用し得る。一般的な検査手順としては、羊水穿刺、頸部半透明(nuchal translucency)超音波を含む超音波検査、血清マーカー検査、または遺伝子スクリーニングが挙げられる。場合によっては、胎児が流産するか否かを判断するために試験を実施するが、医師及び患者はまた、リスクの高い妊娠を早期に診断して、赤ちゃんが適切なケアを受け得る専門治療(tertian)の病院で出産をスケジュールし得るようにすることも役立つと考えている。
母親の血液中に存在する胎児細胞があること、及びこれらの細胞が出生前のDNAに基づく診断のための胎児染色体の潜在的な供給源であることが認識されている。さらに、胎児DNAは、母体血中の総DNAの約2~10%の範囲である。現在利用可能な出生前遺伝子検査は、通常、侵襲的な手順を伴う。例えば、妊娠約10~12週間の妊婦に対して行われる絨毛膜絨毛サンプリング(CVS)、及び約14~16週間後に行われる羊水穿刺には、全て、胎児の染色体異常を検査するための試料を得るための侵襲的手順が含まれる。これらのサンプリング手順によって得られた胎児細胞は、通常、細胞遺伝学的または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)分析を使用して染色体異常について試験される。無細胞胎児DNAは、妊娠第6週という早い時期に妊婦の血漿及び血清に存在することが示されており、濃度は妊娠中に上昇し、分娩前にピークに達する。これらの細胞は妊娠の非常に早い段階で出現するため、正確で非侵襲的な妊娠初期試験の基礎を形成する可能性がある。理論に拘束されるものではないが、本発明は、少量の胎児DNAを検出する際に前例のない感度を提供する。理論に縛られることなく、通常、大量の母体DNAが目的の胎児DNAとともに同時に回収されるため、胎児DNAの定量化と変異検出の感度が低下する。本発明は、アッセイの予想外に高い感度によってそのような問題を克服する。
ヒストンのH3クラスは、以下の4つの異なるタンパク質型からなる:主要型、H3.1及びH3.2;交換型、H3.3;ならびに精巣特有のバリアント、H3t。H3.1及びH3.2は密接に関連しており、Ser96のみで異なり、H3.1は少なくとも5つのアミノ酸位置がH3.3と異なる。さらに、H3.1は、肝臓、腎臓、及び心臓などの成人組織での存在と比較して、胎児肝臓で非常に濃縮されている。成体のヒト組織では、H3.3バリアントは、H3.1バリアントよりも豊富であるが、胎児の肝臓ではその逆である。本発明は、これらの差異を使用して、胎児細胞及び母親細胞ならびに/または胎児核酸の両方を含む母親の生物学的試料中の胎児ヌクレオソーム及び胎児核酸を検出し得る。
1つの実施形態では、胎児ヌクレオソームは、血液から得られ得る。他の実施形態では、胎児ヌクレオソームは、子宮頸管粘液試料から得られる。ある特定の実施形態では、子宮頸管粘液試料は、妊娠の第2期の初期または妊娠の第1期の後半に妊婦から拭き取りまたは洗浄することによって得られる。粘液に閉じ込められたDNAを放出するために、試料をインキュベーターに入れてもよい。インキュベーターは37℃に設定され得る。試料は約15~30分間振とうしてもよい。粘液は、DNAを放出する目的でムチナーゼでさらに溶解されてもよい。また、試料は、当該技術分野で周知の化学処理などの条件に供して、アポトーシスを誘発して胎児ヌクレオソームを放出させてもよい。したがって、子宮頸管粘液試料を、アポトーシスを誘発する薬剤で処理して、それにより胎児ヌクレオソームが放出される。循環胎児DNAの濃縮については、米国特許公開番号20070243549及び20100240054を参照のこと。本発明は、ヌクレオソームまたはDNAのごく一部のみが胎児由来であり得る出生前スクリーニングに方法及び系を適用する場合に特に有利である。
本発明による出生前スクリーニングは、トリソミー13、トリソミー16、トリソミー18、クラインフェルター症候群(47、XXY)、(47、XYY)及び(47、XXX)、ターナー症候群、ダウン症候群(トリソミー21)、嚢胞性線維症、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、ポルフィリン症、脆弱X症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディジョージ症候群、及びウルフ・ヒルシュホルン症候群を含むがこれらに限定されない疾患に対するものであり得る。
本発明のいくつかのさらなる態様は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)のウェブサイトのトピックのサブセクション遺伝性障害(Genetic Disorders)(website at health.nih.gov/topic/Genetic Disorders)にさらに記載されている広範囲の遺伝病に関連する欠陥の診断、予後及び/または処置に関する。
がん及びがん薬物耐性検出
ある特定の実施形態では、本発明は、がんに関連する遺伝子及び変異を検出するために使用され得る。ある特定の実施形態では、耐性に関連する変異が検出される。耐性腫瘍細胞の増幅または腫瘍細胞のクローン集団における耐性変異の出現が、処置中に発生し得る(例えば、Burger JA,et al.,Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition.Nat Commun.2016 May 20;7:11589;Landau DA,et al.,Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse.Nature.2015 Oct 22;526(7574):525-30、Landau DA,et al.,Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications.Leukemia.2014 Jan;28(1):34-43、及びLandau DA,et al.,Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia.Cell.2013 Feb 14;152(4):714-26を参照のこと)。従って、このような変異の検出には高感度のアッセイが必要であり、モニタリングには繰り返しの生検が必要である。生検の繰り返しは不便で、侵襲的で、かつ費用がかかる。耐性変異は、当該技術分野で公知である従来の方法を使用して、血液試料または他の非侵襲的に収集された生体試料(例えば、血液、唾液、尿)で検出するのが難しい場合がある。耐性変異とは、化学療法、標的療法、または免疫療法に対する耐性に関連する変異を指し得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんに関連する遺伝子及び変異を検出するために使用され得る。ある特定の実施形態では、耐性に関連する変異が検出される。耐性腫瘍細胞の増幅または腫瘍細胞のクローン集団における耐性変異の出現が、処置中に発生し得る(例えば、Burger JA,et al.,Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition.Nat Commun.2016 May 20;7:11589;Landau DA,et al.,Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse.Nature.2015 Oct 22;526(7574):525-30、Landau DA,et al.,Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications.Leukemia.2014 Jan;28(1):34-43、及びLandau DA,et al.,Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia.Cell.2013 Feb 14;152(4):714-26を参照のこと)。従って、このような変異の検出には高感度のアッセイが必要であり、モニタリングには繰り返しの生検が必要である。生検の繰り返しは不便で、侵襲的で、かつ費用がかかる。耐性変異は、当該技術分野で公知である従来の方法を使用して、血液試料または他の非侵襲的に収集された生体試料(例えば、血液、唾液、尿)で検出するのが難しい場合がある。耐性変異とは、化学療法、標的療法、または免疫療法に対する耐性に関連する変異を指し得る。
ある特定の実施形態では、変異は、がんの進行を検出するために使用され得る個々のがんにおいて生じる。一実施形態では、腫瘍に対するT細胞の細胞溶解活性に関連する変異が特徴付けられており、本発明によって検出され得る(例えば、Rooney et al.,Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity,Cell.2015 January 15;160(1-2):48-61)。これらの変異の検出に基づいて、個別化された治療法を患者のために開発し得る(例えば、WO2016100975A1を参照のこと)。ある特定の実施形態では、細胞溶解活性に関連するがん特異的変異は、CASP8、B2M、PIK3CA、SMC1A、ARID5B、TET2、ALPK2、COL5A1、TP53、DNER、NCOR1、MORC4、CIC、IRF6、MYOCD、ANKLE1、CNKSR1、NF1、SOS1、ARID2、CUL4B、DDX3X、FUBP1、TCP11L2、HLA-A、BまたはC、CSNK2A1、MET、ASXL1、PD-L1、PD-L2、IDO1、IDO2、ALOX12B及びALOX15Bからなる群より選択される遺伝子中の変異、または染色体全体の事象を除き、次の染色体バンドのいずれかに影響を与えるコピー数の増大:6q16.1-q21、6q22.31-q24.1、6q25.1-q26、7p11.2-q11.1、8p23.1、8p11.23-p11.21(IDO1、IDO2を含む)、9p24.2-p23(PDL1、PDL2を含む)、10p15.3、10p15.1-p13、11p14.1、12p13.32-p13.2、17p13.1(ALOX12B、ALOX15Bを含む)、及び22q11.1-q11.21からなる群より選択される遺伝子中の変異であり得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療の過程の間及び治療が完了した後に、がん変異(例えば、耐性変異)を検出するために使用される。本発明の感度は、処置中に生じるクローン変異の非侵襲的検出を可能にし得、疾患の再発を検出するために使用され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、差示的に発現されるmiRNAのマイクロRNA(miRNA)及び/またはmiRNA特徴の検出は、がんの進行を検出またはモニタリングするか、及び/またはがん治療への薬物耐性を検出するために使用され得る。例として、Nadal et al.(Nature Scientific Reports,(2015)doi:10.1038/srep12464)は、非小細胞肺癌(NSCLC)を検出するために使用され得るmRNA特徴について説明している。
ある特定の例示的な実施形態では、細胞のクローン性亜集団における耐性変異の存在を、処置レジメンを決定する際に使用し得る。他の実施形態では、患者を治療するための個別化された治療は、一般的な腫瘍変異に基づいて投与され得る。ある特定の実施形態では、処置に応答して一般的な変異が生じ、薬物耐性をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明は、そのような薬物耐性変異を有する細胞の変異または増幅を獲得する細胞について患者をモニタリングする際に使用され得る。
様々な化学療法剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤などの標的療法による治療は、治療薬の活性に抵抗する標的分子に新しい変異をもたらす場合が多い。この耐性を克服するための複数の戦略が評価されており、これには、これらの変異の影響を受けない第2世代療法の開発、及び耐性変異の下流で作用する薬剤を含む多剤による処置が含まれる。例示的な実施形態では、ブルトンチロシンキナーゼ(BTK)を標的とし、CLL及び特定のリンパ腫に使用される分子であるイブルチニブに対する一般的な変異は、位置481でのシステインからセリンへの変化(BTK/C481S)である。上皮成長因子受容体(EGFR)のチロシンキナーゼドメインを標的とするエルロチニブは、肺癌の処置に一般的に使用され、耐性腫瘍が治療後に必ず発症する。耐性クローンに見られる一般的な変異は、790位のスレオニンからメチオニンへの変異である。
がん患者の集団間で共有される非サイレント変異及び本発明で検出され得る一般的な耐性変異は、当該技術分野で公知である(例えば、WO/2016/187508を参照のこと)。ある特定の実施形態では、薬物耐性変異は、イブルチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、トラスツズマブ、ベムラフェニブ、RAF/MEK、チェックポイント遮断療法、または抗エストロゲン療法による処置によって誘発され得る。ある特定の実施形態では、がん特異的変異は、プログラム死リガンド1(PD-L1)、アンドロゲン受容体(AR)、ブルトンチロシンキナーゼ(BTK)、上皮成長因子受容体(EGFR)、BCR-Abl、c-kit、PIK3CA、HER2、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEK1、MEK2、NRAS、RAC1、及びESR1からなる群より選択されるタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子に存在する。
免疫チェックポイントは、免疫反応を減速または停止し、免疫細胞の制御されない活性による過度の組織損傷を防ぐ抑制経路である。ある特定の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、プログラム死-1(PD-1またはCD279)遺伝子(PDCD1)である。他の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA-4)である。追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、BTLA、LAG3、ICOS、PDL1またはKIRなどのCD28及びCTLA4 Igスーパーファミリーの別のメンバーである。さらなる追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、CD40、OX40、CD137、GITR、CD27またはTIM-3などのTNFRスーパーファミリーのメンバーである。
最近、腫瘍及びそれらの微小環境における遺伝子発現は、単一細胞レベルで特徴付けられている(例えば、Tirosh et al.Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq.Science 352,189-196,doi:10.1126/science.aad0501(2016))、Tirosh et al.,Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.Nature.2016 Nov 10;539(7628):309-313.doi:10.1038/nature20123.Epub 2016 Nov 2、及びInternational patent publication serial number WO 2017004153 A1)。ある特定の実施形態では、遺伝子特徴が、本発明を使用して検出され得る。一実施形態では、補体遺伝子が、腫瘍微小環境でモニタリングまたは検出される。一実施形態では、MITF及びAXLプログラムがモニタリングまたは検出される。一実施形態では、腫瘍特異的幹細胞または前駆細胞の特徴が検出される。このような兆候は、免疫応答の状態及び腫瘍の状態を示す。ある特定の実施形態では、増殖、処置に対する耐性、及び免疫細胞の存在量に関する腫瘍の状態が検出され得る。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、特に疾患の再発または一般的な耐性変異の発生をモニタリングするために、腫瘍DNAなどの循環DNAのための低コストで迅速な多重がん検出パネルを提供する。
免疫療法の適用
本明細書に開示される実施形態はまた、さらなる免疫療法の状況において有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象における免疫応答を診断、予後診断及び/または病期分類する方法は、1つ以上のバイオマーカーの第1レベルの発現、活性及び/または機能を検出すること、及び検出レベルを対照レベルと比較することを含み、ここで検出されたレベルと対照レベルの差は、対象における免疫応答の存在を示す。
本明細書に開示される実施形態はまた、さらなる免疫療法の状況において有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象における免疫応答を診断、予後診断及び/または病期分類する方法は、1つ以上のバイオマーカーの第1レベルの発現、活性及び/または機能を検出すること、及び検出レベルを対照レベルと比較することを含み、ここで検出されたレベルと対照レベルの差は、対象における免疫応答の存在を示す。
ある特定の実施形態では、本発明を使用して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の機能不全または活性化を決定し得る。TILは、公知の方法を使用して腫瘍から分離し得る。TILを分析して、養子細胞移植療法に使用すべきかを判断し得る。さらに、キメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)を、機能障害または活性化の兆候について分析し得、その後対象に投与してもよい。機能不全及び活性化T細胞の例示的な特徴が説明されている(例えば、Singer M,et al.,Singer M,et al.,A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells.Cell.2016 Sep 8;166(6):1500-1511.e9.doi:10.1016/j.cell.2016.08.052を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、C2c2が、T細胞(例えば、CD8+及び/またはCD4+T細胞)などの免疫細胞のその状態を評価するために使用される。特に、T細胞の活性化及び/または機能不全は、例えば、1つ以上のT細胞状態に関連する遺伝子または遺伝子特徴に基づいて決定され得る。このようにして、c2c2を使用して、T細胞の1つ以上の亜集団の存在を決定してもよい。
いくつかの実施形態では、C2c2は、診断アッセイにおいて使用され得るか、または患者が免疫療法または別のタイプの療法を施すのに適しているかを決定する方法として使用され得る。例えば、遺伝子またはバイオマーカーの特徴の検出は、c2c2を介して実行され、患者が所定の処置に反応しているか、または患者が反応していない場合は、T細胞機能障害に起因し得るかを判断する。このような検出は、患者が受けるのに最も適した治療の種類に関して有益である。例えば、患者が免疫療法を受けるべきかである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される系及びアッセイは、治療(例えば、養子細胞移入(ACT)治療)に対する患者の応答が細胞機能障害に起因するものであるかを臨床医が識別することを可能にし、及び、もしそうであれば、バイオマーカー特徴全体の上方制御及び下方制御のレベルにより、問題に対処し得る。例えば、ACTを受けている患者が無反応である場合、ACTの一部として投与された細胞を、本明細書に開示されるアッセイによってアッセイして、細胞活性化及び/または機能不全の状態に関連することが公知のバイオマーカー特徴の発現の相対レベルを決定してもよい。特定の阻害性受容体または分子が、ACT細胞で上方制御される場合、患者はその受容体または分子の阻害剤で処置され得る。特定の刺激性受容体または分子がACT細胞で下方制御される場合、患者はその受容体または分子のアゴニストで治療され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系、方法、及びデバイスを使用して、特定の細胞型、細胞表現型、または細胞状態を識別する遺伝子特徴をスクリーニングしてもよい。同様に、圧縮センシングなどの方法を使用することにより、本明細書に開示される実施形態を使用して、トランスクリプトームを検出し得る。遺伝子発現データは高度に構造化されているため、一部の遺伝子の発現レベルで、他の遺伝子の発現レベルが予測される。遺伝子発現データが高度に構造化されているという知識により、この系の自由度の数が少ないという仮定が可能になり、相対的な遺伝子量の計算の基礎が希薄であるという仮定が可能になる。出願人はどの遺伝子が相互作用する可能性があるかについての特定の知識がなくても、アンダーサンプリングしながら非線形相互作用項を回復することが可能であるという生物学的に動機付けられたいくつかの仮定を立てることが可能である。特に、出願人らは、遺伝的相互作用が低ランク、希薄、またはこれらの組み合わせであると想定するならば、真の自由度数は完全な組み合わせ展開に比べて小さく、これにより出願人らは比較的少数の摂動を有する全非線形ランドスケープを推論することが可能である。これらの仮定を回避し、行列の完成及び圧縮センシングの分析理論を使用して、アンダーサンプリングされた組み合わせ摂動実験を設計してもよい。さらに、カーネル学習フレームワークを使用して、個々の相互作用係数を直接学習せずに組み合わせ摂動の予測関数を構築することにより、アンダーサンプリングを採用し得る。圧縮センシングは、包括的な遺伝子発現プロファイルを取得するために検出される標的転写物の最小数を特定する方法を提供する。圧縮センシングの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、2016年10月27日に提出されたPCT/US2016/059230「Systems and Methods for Determining Relative Abundances of Biomolecules」に開示されている。圧縮センシングのような方法を使用して最小転写産物標的セットを識別したら、対応するガイドRNAのセットを設計して、上記転写産物を検出してもよい。したがって、ある特定の例示的な実施形態では、細胞の遺伝子発現プロファイルを取得する方法は、本明細書で開示された実施形態を使用して、細胞または細胞集団の遺伝子発現プロファイルを提供する最小転写産物セットを検出することを含む。
遺伝子編集及び/またはオフ標的効果の検出
本明細書に開示される実施形態は、他の遺伝子編集ツールと組み合わせて使用して、所望の遺伝子編集が成功したことを確認するか、及び/または任意のオフ標的効果の存在を検出してもよい。編集されたセルは、1つ以上の標的遺伝子座への1つ以上のガイドを使用してスクリーニングされ得る。本明細書に開示される実施形態はCRISPR系を利用するので、治療用途も想定される。例えば、本明細書に開示される遺伝子型決定の実施形態は、適切な標的遺伝子座を選択するか、または標的編集が必要な細胞もしくは細胞集団を同定するために使用され得る。次に、同じまたは別個の系を使用して、編集効率を決定してもよい。以下の実施例に記載されるように、本明細書に開示される実施形態は、1週間程度で、合理化されたセラノスティックパイプラインを設計するために使用され得る。
本明細書に開示される実施形態は、他の遺伝子編集ツールと組み合わせて使用して、所望の遺伝子編集が成功したことを確認するか、及び/または任意のオフ標的効果の存在を検出してもよい。編集されたセルは、1つ以上の標的遺伝子座への1つ以上のガイドを使用してスクリーニングされ得る。本明細書に開示される実施形態はCRISPR系を利用するので、治療用途も想定される。例えば、本明細書に開示される遺伝子型決定の実施形態は、適切な標的遺伝子座を選択するか、または標的編集が必要な細胞もしくは細胞集団を同定するために使用され得る。次に、同じまたは別個の系を使用して、編集効率を決定してもよい。以下の実施例に記載されるように、本明細書に開示される実施形態は、1週間程度で、合理化されたセラノスティックパイプラインを設計するために使用され得る。
核酸タグ付きアイテムの検出
あるいは、本明細書に記載される実施形態は、核酸識別子を検出するために使用され得る。核酸識別子は、特定の物品を識別するために使用され得る非コーディング核酸である。DNA透かしなどの核酸識別子の例は、Heider及びBarnekow.“DNA watermarks:A proof of concept”BMC Molecular Biology 9:40(2008)に記載されている。核酸識別子はまた、核酸バーコードであってもよい。核酸ベースのバーコードは、標的分子及び/または標的核酸などの関連分子の識別子として使用されるヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、またはそれらの組み合わせ)の短い配列である。核酸バーコードは、少なくとも、例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、または100ヌクレオチドの長さを有し得、一本鎖形態であっても、または二本鎖形態であってもよい。1つ以上の核酸バーコードを、標的分子及び/または標的核酸に付着しても、または「タグ付け」してもよい。この付着は、直接的(例えば、標的分子へのバーコードの共有結合または非共有結合)または間接的(例えば、追加の分子、例えば、抗体(または他のタンパク質)などの特異的結合剤を介して)であっても、またはバーコード受信アダプター(または他の核酸分子)であってもよい。標的分子及び/または標的核酸は、核酸バーコードコンカテマーなどの複数の核酸バーコードで組み合わせて標識され得る。通常、核酸バーコードを使用して、標的分子及び/または標的核酸を、特定のコンパートメント(例えば、別個の容積)からのものであるか、特定の物理的特性(例えば、親和性、長さ、配列など)を有するか、または特定の処理条件を受けたものとして特定する。標的分子及び/または標的核酸を、複数の核酸バーコードと関連付けて、これら全ての機能(及びそれ以上)に関する情報を得てもよい。核酸バーコードの生成方法は、例えば、国際特許出願公開番号WO/2014/047561に開示されている。
あるいは、本明細書に記載される実施形態は、核酸識別子を検出するために使用され得る。核酸識別子は、特定の物品を識別するために使用され得る非コーディング核酸である。DNA透かしなどの核酸識別子の例は、Heider及びBarnekow.“DNA watermarks:A proof of concept”BMC Molecular Biology 9:40(2008)に記載されている。核酸識別子はまた、核酸バーコードであってもよい。核酸ベースのバーコードは、標的分子及び/または標的核酸などの関連分子の識別子として使用されるヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、またはそれらの組み合わせ)の短い配列である。核酸バーコードは、少なくとも、例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、または100ヌクレオチドの長さを有し得、一本鎖形態であっても、または二本鎖形態であってもよい。1つ以上の核酸バーコードを、標的分子及び/または標的核酸に付着しても、または「タグ付け」してもよい。この付着は、直接的(例えば、標的分子へのバーコードの共有結合または非共有結合)または間接的(例えば、追加の分子、例えば、抗体(または他のタンパク質)などの特異的結合剤を介して)であっても、またはバーコード受信アダプター(または他の核酸分子)であってもよい。標的分子及び/または標的核酸は、核酸バーコードコンカテマーなどの複数の核酸バーコードで組み合わせて標識され得る。通常、核酸バーコードを使用して、標的分子及び/または標的核酸を、特定のコンパートメント(例えば、別個の容積)からのものであるか、特定の物理的特性(例えば、親和性、長さ、配列など)を有するか、または特定の処理条件を受けたものとして特定する。標的分子及び/または標的核酸を、複数の核酸バーコードと関連付けて、これら全ての機能(及びそれ以上)に関する情報を得てもよい。核酸バーコードの生成方法は、例えば、国際特許出願公開番号WO/2014/047561に開示されている。
酵素
本出願は、C2c2のオルソログをさらに提供し、これは、それらをRNA切断及び検出の異なる適用にそれらを特に適したものにさせるロバストな活性を示す。これらの適用には、本明細書に記載されている適用が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、試験された他のものよりも強い活性を有することが実証されているオルソログは、生物体Leptotrichia wadeiから同定されたC2c2オルソログ(LwC2c2)である。したがって、本出願は目的の標的遺伝子座を改変するための方法を提供し、この方法は、C2c2エフェクタータンパク質、より具体的には本明細書に記載の活性が増大したC2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分を含む非天然に存在するかまたは操作された組成物を、上記遺伝子座に送達することを含む。ここで少なくとも1つ以上の核酸成分が操作されており、1つ以上の核酸成分が複合体を目的の標的に導き、エフェクタータンパク質が1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、この複合体が目的の標的遺伝子座に結合する。特定の実施形態では、目的の標的遺伝子座は、RNAを含む。本出願はさらに、RNA配列特異的干渉、RNA配列特異的遺伝子調節、RNAもしくはRNA産物のスクリーニング、またはlincRNAまたは非コードRNA、または核RNA、またはmRNA、変異原性、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、または育種における活性が増大したCc2エフェクタータンパク質の使用を提供する。
本出願は、C2c2のオルソログをさらに提供し、これは、それらをRNA切断及び検出の異なる適用にそれらを特に適したものにさせるロバストな活性を示す。これらの適用には、本明細書に記載されている適用が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、試験された他のものよりも強い活性を有することが実証されているオルソログは、生物体Leptotrichia wadeiから同定されたC2c2オルソログ(LwC2c2)である。したがって、本出願は目的の標的遺伝子座を改変するための方法を提供し、この方法は、C2c2エフェクタータンパク質、より具体的には本明細書に記載の活性が増大したC2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分を含む非天然に存在するかまたは操作された組成物を、上記遺伝子座に送達することを含む。ここで少なくとも1つ以上の核酸成分が操作されており、1つ以上の核酸成分が複合体を目的の標的に導き、エフェクタータンパク質が1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、この複合体が目的の標的遺伝子座に結合する。特定の実施形態では、目的の標的遺伝子座は、RNAを含む。本出願はさらに、RNA配列特異的干渉、RNA配列特異的遺伝子調節、RNAもしくはRNA産物のスクリーニング、またはlincRNAまたは非コードRNA、または核RNA、またはmRNA、変異原性、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、または育種における活性が増大したCc2エフェクタータンパク質の使用を提供する。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、それらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
実施例1-一般的なプロトコル
DNA及びRNAについてのC2c2診断試験を行う2つの方法が提供される。このプロトコルは、検出アプタマーの送達後、タンパク質検出バリアントでも使用してもよい。1つ目は、増幅及びC2c2検出が別々に行われる2段階反応である。2つ目は、全てが1つの反応で組み合わされ、これは2段階反応と呼ばれる。高濃度の試料では増幅が不要な場合があるので、増幅が組み込まれていない別のC2c2プロトコルを用意することを強く勧めるものである。
DNA及びRNAについてのC2c2診断試験を行う2つの方法が提供される。このプロトコルは、検出アプタマーの送達後、タンパク質検出バリアントでも使用してもよい。1つ目は、増幅及びC2c2検出が別々に行われる2段階反応である。2つ目は、全てが1つの反応で組み合わされ、これは2段階反応と呼ばれる。高濃度の試料では増幅が不要な場合があるので、増幅が組み込まれていない別のC2c2プロトコルを用意することを強く勧めるものである。
反応緩衝液は:40mMのTris-HCl、60mMのNaCl、pH7.3である。
この反応を37℃で20分~3時間行う。励起:485nM/20nM、発光:528nM/20nMで読み取る。単一分子の感度のシグナルは、20分で開始し検出される場合があるが、当然ながら反応時間が長いほど感度は高くなる。
2ステップの反応:
RPA増幅混合物
2ステップの反応:
RPA増幅混合物
この反応を一緒に混合し、次いで凍結乾燥酵素混合物の2~3本の管で再懸濁する。5μLの280mM MgAcをこの混合物に追加して反応を開始する。反応を10~20分間行う。各反応物は20μLなので、これは最大5つの反応に十分である。
反応緩衝液は:40mMのTris-HCl、60mMのNaCl、pH7.3である。
これを20分~3時間行う。単一分子の感度を確認するには、最小検出時間は約20分である。長時間反応させても感度が上がるだけである。
参照されるNEBキットは、HighScribe T7高収率キットである。緩衝液を再懸濁するには、1.5倍の濃度を使用し:凍結乾燥した基質の3つの管で59μLの緩衝液に再懸濁し、上記の混合物で使用する。各反応は20μLなので、5回の反応に十分である。この反応による単一分子の感受性は、30~40分という早い段階で観察されている。
実施例2-Leptotrichia Wadei由来のC2C2は、DNA及びRNAの高感度で特異的な検出を媒介する
迅速、安価、及び高感度の核酸検出は、ポイントオブケア病原体検出、遺伝子型決定、及び疾患モニタリングを補助し得る。RNAガイド付き、RNA標的化CRISPRエフェクターCas13a(以前はC2c2として知られていた)は、標的認識時に無差別なRNAse活性の「コラテラル効果」を示す。出願人は、Cas13aのコラテラル効果と等温増幅とを組み合わせて、CRISPRベースの診断(CRISPR-Dx)を確立し、DNAまたはRNAの迅速な検出と、アトモル感度及び単一塩基ミスマッチ特異性を得る。出願人は、このCas13aベースの分子検出プラットフォームを使用して、SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing(特定の高感度酵素レポーターアンロッキング))と呼んで、ジカウイルス及びデング熱ウイルスの特定の株を検出し、病原菌を識別し、ヒトDNAを遺伝子型決定し、無細胞腫瘍DNA変異を特定する。さらに、SHERLOCK反応試薬は、コールドチェーンの独立性及び長期保存のために凍結乾燥してもよく、フィールド適用用のペーパーに簡単に再構成し得る。
迅速、安価、及び高感度の核酸検出は、ポイントオブケア病原体検出、遺伝子型決定、及び疾患モニタリングを補助し得る。RNAガイド付き、RNA標的化CRISPRエフェクターCas13a(以前はC2c2として知られていた)は、標的認識時に無差別なRNAse活性の「コラテラル効果」を示す。出願人は、Cas13aのコラテラル効果と等温増幅とを組み合わせて、CRISPRベースの診断(CRISPR-Dx)を確立し、DNAまたはRNAの迅速な検出と、アトモル感度及び単一塩基ミスマッチ特異性を得る。出願人は、このCas13aベースの分子検出プラットフォームを使用して、SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing(特定の高感度酵素レポーターアンロッキング))と呼んで、ジカウイルス及びデング熱ウイルスの特定の株を検出し、病原菌を識別し、ヒトDNAを遺伝子型決定し、無細胞腫瘍DNA変異を特定する。さらに、SHERLOCK反応試薬は、コールドチェーンの独立性及び長期保存のために凍結乾燥してもよく、フィールド適用用のペーパーに簡単に再構成し得る。
ポータブルプラットフォーム上で高感度及び単一塩基特異性によって核酸を迅速に検出する能力は、疾患の診断及びモニタリング、疫学、及び一般的な実験室の作業に役立ち得る。核酸を検出する方法は存在するが(1~6)、感度、特異度、単純さ、コスト、及び速度の間でトレードオフがある。微生物のクラスター化された定期的に間隔を空けたショートパリンドロームリピート(Microbial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)及びCRISPR関連(CRISPR-Cas)適応免疫系には、CRISPRベースの診断(CRISPR-Dx)に活用し得るプログラム可能なエンドヌクレアーゼが含まれている。一部のCas酵素はDNAを標的にするが(7、8)、Cas13a(以前はC2c2として知られていた)(8)などのシングルエフェクターRNA誘導RNaseは、CRISPR RNA(crRNA)(9-11)で再プログラムして、特定のRNAセンシング用プラットフォームを提供し得る。RNA標的が認識されると、活性化されたCas13aは近くの非標的RNAの「コラテラル」的切断に関与する(10)。このcrRNAプログラムのコラテラル切断活性により、Cas13aは、プログラムされた細胞死(10)を誘発することにより、インビボで特定のRNAの存在を検出するか(10)、または標識されたRNAの非特異的分解により、インビトロで検出し得る(10、12)。ここでは出願人は、SHERLOCK(特定の高感度酵素レポーターのアンロック:Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)、核酸増幅に基づくアトモル感度を備えたインビトロ核酸検出プラットフォーム、及び標的のリアルタイム検出を可能にする3つのCas13aを介した市販のレポーターRNAのコラテラル切断(12)について説明する(図17)。
方法
発現のためのC2c2遺伝子座及びタンパク質のクローニング
細菌のインビボ効率アッセイのために、Laptotrichia wadeiのF0279及びLaptotrichia shahiiからのC2c2タンパク質を、哺乳動物発現用のコドン最適化遺伝子(Genscript、Jiangsu、China)として注文し、ベータ-ラクタマーゼ標的化または非標的化スペーサーのいずれかに隣接する対応するダイレクトリピートとともにpACYC184バックボーンにクローニングした。スペーサーの発現は、J23119プロモーターによって駆動された。
発現のためのC2c2遺伝子座及びタンパク質のクローニング
細菌のインビボ効率アッセイのために、Laptotrichia wadeiのF0279及びLaptotrichia shahiiからのC2c2タンパク質を、哺乳動物発現用のコドン最適化遺伝子(Genscript、Jiangsu、China)として注文し、ベータ-ラクタマーゼ標的化または非標的化スペーサーのいずれかに隣接する対応するダイレクトリピートとともにpACYC184バックボーンにクローニングした。スペーサーの発現は、J23119プロモーターによって駆動された。
タンパク質精製のために、哺乳動物のコドン最適化C2c2タンパク質を、タンパク質精製のために細菌発現ベクターにクローニングした(6x His/Twin Strep SUMO,Ilya Finkelsteinから贈呈されたpETベースの発現ベクター)。
細菌インビボ C2c2効率アッセイ
LwC2c2及びLshC2c2 インビボ効率プラスミド及び以前に記載されたベータ-ラクタマーゼプラスミド(Abudayyeh 2016)を、それぞれ90ng及び25ngで、NovaBlue Singlesコンピテント細胞(Millipore)に同時形質転換した。形質転換後、細胞の希釈物をアンピシリン及びクロラムフィコールLB-寒天プレート上にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。コロニーは翌日カウントした。
LwC2c2及びLshC2c2 インビボ効率プラスミド及び以前に記載されたベータ-ラクタマーゼプラスミド(Abudayyeh 2016)を、それぞれ90ng及び25ngで、NovaBlue Singlesコンピテント細胞(Millipore)に同時形質転換した。形質転換後、細胞の希釈物をアンピシリン及びクロラムフィコールLB-寒天プレート上にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。コロニーは翌日カウントした。
核酸標的及びcrRNA調製
核酸標的を、KAPA Hifiホットスタート(Kapa Biosystems)でPCR増幅し、ゲル抽出し、MinEluteゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesisキット(New England Biolabs)を使用して、精製したdsDNAをT7ポリメラーゼと30℃で一晩インキュベートし、MEGAclear Transcription Clean-upキット(Thermo Fisher)でRNAを精製した。
核酸標的を、KAPA Hifiホットスタート(Kapa Biosystems)でPCR増幅し、ゲル抽出し、MinEluteゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesisキット(New England Biolabs)を使用して、精製したdsDNAをT7ポリメラーゼと30℃で一晩インキュベートし、MEGAclear Transcription Clean-upキット(Thermo Fisher)でRNAを精製した。
crRNAの調製のために、構築物は、付加されたT7プロモーター配列を有するDNA(Integrated DNA Technologies)として注文した。crRNA DNAを、短いT7プライマー(最終濃度10μM)にアニーリングし、HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成キット(New England Biolabs)を使用して、T7ポリメラーゼと37℃で一晩インキュベートした。RNAXPクリーンビーズ(Beckman Coulter)を使用して、ビーズの反応容積に対する比率を2倍にして、イソプロパノール(Sigma)をさらに1.8倍に追加して、crRNAを精製した。
NASBA等温増幅
NASBA反応の詳細は、[Pardee 2016]に記載されている。総反応容量が20μLの場合、6.7μLの反応緩衝液(Life Sciences、NECB-24)、3.3μLのヌクレオチド混合物(Life Sciences,NECN-24)、0.5μLのヌクレアーゼ非含有水、0.4μLの12.5μM NASBAプライマー、0.1μLのRNase阻害剤(Roche、03335402001)及び4μLのRNAアンプリコン(または陰性対照の場合は水)を4℃で組み合わせし、65℃で2分間、次に41℃で10分間インキュベートした。5μLの酵素混合物(Life Sciences,NEC-1-24)を各反応に添加し、反応混合物を41℃で2時間インキュベートした。使用したNASBAプライマーは、5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3’(配列番号16)、及び5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3’(配列番号17)であり、下線部はT7プロモーター配列を示している。
NASBA反応の詳細は、[Pardee 2016]に記載されている。総反応容量が20μLの場合、6.7μLの反応緩衝液(Life Sciences、NECB-24)、3.3μLのヌクレオチド混合物(Life Sciences,NECN-24)、0.5μLのヌクレアーゼ非含有水、0.4μLの12.5μM NASBAプライマー、0.1μLのRNase阻害剤(Roche、03335402001)及び4μLのRNAアンプリコン(または陰性対照の場合は水)を4℃で組み合わせし、65℃で2分間、次に41℃で10分間インキュベートした。5μLの酵素混合物(Life Sciences,NEC-1-24)を各反応に添加し、反応混合物を41℃で2時間インキュベートした。使用したNASBAプライマーは、5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3’(配列番号16)、及び5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3’(配列番号17)であり、下線部はT7プロモーター配列を示している。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
アンプリコンのサイズ(100~140ntの間)、プライマーの融解温度(54℃~67℃の間)及びプライマーサイズ(30~35nt)を除いて、デフォルトパラメーターを使用してNCBI Primer blast(Ye et al.,BMC Bioinformaics 13,134(2012))を使用してRPAのプライマーを設計した。次いで、プライマーをDNA(Integrated DNA Technologies)として注文した。
アンプリコンのサイズ(100~140ntの間)、プライマーの融解温度(54℃~67℃の間)及びプライマーサイズ(30~35nt)を除いて、デフォルトパラメーターを使用してNCBI Primer blast(Ye et al.,BMC Bioinformaics 13,134(2012))を使用してRPAのプライマーを設計した。次いで、プライマーをDNA(Integrated DNA Technologies)として注文した。
実行されたRPA及びRT-RPA反応は、TwistAmp(登録商標)BasicまたはTwistAmp(登録商標)Basic RT(TwistDx)でそれぞれ指示されたとおりであったが、例外として、280mMのMgAcを入力鋳型の前に追加した。特に記載のない限り、反応は1μLの入力量で37℃で2時間実行した。
LwC2c2タンパク質精製
C2c2細菌発現ベクターを、Rosetta(商標)2(DE3)pLysS Singles Competent Cells(Millipore)に形質転換した。16mLのスターター培養物をTerrific Broth 4増殖培地(12 g/Lトリプトン、24g/L酵母抽出物、9.4g/LのK2HPO、2.2g/LのKH2PO4、Sigma)で増殖させ、(TB)を4LのTBに接種し、これをOD600が0.6になるまで37℃、300RPMでインキュベートした。この時点で、タンパク質発現は、IPTG(Sigma)の補充により最終濃度500μMまで誘導し、細胞はタンパク質発現のために18℃で16時間冷却した。次に、細胞を5200g、15分、4℃で遠心分離した。細胞ペレットを回収し、後で精製するために-80℃で保存した。
C2c2細菌発現ベクターを、Rosetta(商標)2(DE3)pLysS Singles Competent Cells(Millipore)に形質転換した。16mLのスターター培養物をTerrific Broth 4増殖培地(12 g/Lトリプトン、24g/L酵母抽出物、9.4g/LのK2HPO、2.2g/LのKH2PO4、Sigma)で増殖させ、(TB)を4LのTBに接種し、これをOD600が0.6になるまで37℃、300RPMでインキュベートした。この時点で、タンパク質発現は、IPTG(Sigma)の補充により最終濃度500μMまで誘導し、細胞はタンパク質発現のために18℃で16時間冷却した。次に、細胞を5200g、15分、4℃で遠心分離した。細胞ペレットを回収し、後で精製するために-80℃で保存した。
タンパク質精製の後続のステップは全て4℃で実行する。細胞ペレットを破砕し、プロテアーゼ阻害剤(Complete Ultra EDTA非含有錠剤)、リゾチーム、及びベンゾナーゼを添加した溶解緩衝液(20mM Tris-Hcl、500mM NaCl、1mM DTT、pH 8.0)に再懸濁した後、超音波処理(Sonifier 450、Branson,Danbury、CT)を、以下の条件すなわち振幅100、1秒オン、2秒オフ、合計超音波処理時間10分によって行った。溶解物を4℃、10,000gで1時間の遠心分離により清澄化し、その上清をStericup 0.22ミクロンフィルター(EMD Millipore)でろ過した。ろ過した上清を、StrepTactin Sepharose(GE)に供しし、回転させながら1時間インキュベートした後、タンパク質結合StrepTactin樹脂を溶解緩衝液で3回洗浄した。その樹脂を、SUMO消化緩衝液(30mM Tris-HCl、500mM NaCl 1mM DTT、0.15%Igepal(NP-40)、pH8.0)に、250単位のSUMOプロテアーゼ(ThermoFisher)とともに再懸濁し、4℃で一晩回転させながらインキュベートした。消化は、SDS-PAGE及びCommassie Blue染色により確認し、タンパク質溶出液を、樹脂をスピンダウンすることにより分離した。タンパク質を、FPLC(AKTA PURE、GE Healthcare Life Sciences)を介して5mL HiTrap SP HP陽イオン交換カラム(GE Healthcare Life Sciences)にロードし、溶出緩衝液(20mM Tris-HCl、1mM DTT、5%グリセロール、pH8.0)中で130mM~2MのNaClの塩濃度勾配で溶出した。。得られた画分を、LwC2c2の存在についてSDS-PAGEで試験し、タンパク質を含む画分をプールし、Centrifugal Filter Unitを介してS200緩衝液(10mM HEPES、1M NaCl、5mM MgCl2、2mM DTT、pH7.0)で1mLに濃縮した。濃縮されたタンパク質を、FPLCを介してゲルろ過カラム(Superdex(登録商標)200 Increase 10/300 GL,GE Healthcare Life Sciences)にロードした。ゲルろ過で得られた画分をSDS-PAGEで分析し、LwC2c2を含む画分をプールし、Storage Buffer(600mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.5、5%グリセロール、2mM DTT)に緩衝液交換し、-80Cで凍結保存した。
LwC2c2コラテラル検出
検出アッセイは、特に明記しない限り、ヌクレアーゼアッセイ緩衝液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH7.3)中で、45nMの精製LwC2c2、22.5nMのcrRNA、125nMの基質レポーター(Thermo Scientific RNAse Alert v2)、2μLのマウスRNase阻害剤、100ngのバックグラウンド全RNA、及びさまざまな量の入力核酸標的を用いて行いた。入力がRPA反応由来のT7プロモーターを含む増幅されたDNAである場合、上記のC2c2反応は、1mM ATP、1mM GTP、1mM UTP、1mM CTP及び0.6μLT7ポリメラーゼ混合物(NEB)を含むように変更された。反応を、5分ごとに測定される蛍光反応速度で、蛍光プレートリーダー(BioTek)を用いて、37℃で1~3時間(特に明記しない限り)進行させた。
検出アッセイは、特に明記しない限り、ヌクレアーゼアッセイ緩衝液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH7.3)中で、45nMの精製LwC2c2、22.5nMのcrRNA、125nMの基質レポーター(Thermo Scientific RNAse Alert v2)、2μLのマウスRNase阻害剤、100ngのバックグラウンド全RNA、及びさまざまな量の入力核酸標的を用いて行いた。入力がRPA反応由来のT7プロモーターを含む増幅されたDNAである場合、上記のC2c2反応は、1mM ATP、1mM GTP、1mM UTP、1mM CTP及び0.6μLT7ポリメラーゼ混合物(NEB)を含むように変更された。反応を、5分ごとに測定される蛍光反応速度で、蛍光プレートリーダー(BioTek)を用いて、37℃で1~3時間(特に明記しない限り)進行させた。
上記の反応条件をRPA増幅混合物と統合することにより、RPA-DNA増幅、DNAのRNAへのT7ポリメラーゼ変換、及びC2c2検出を組み合わせるワンポット反応を行った。簡単に言えば、50μLのワンポットアッセイでは、0.48μMフォワードプライマー、0.48μMリバースプライマー、1×RPA再水和緩衝液、さまざまな量のDNA入力、45nMのLwC2c2組換えタンパク質、22.5nMのcrRNA、250ngのバックグラウンド全RNA、200nM基質レポーター(RNaseアラートv2)、4μL RNaseインヒビター、2mM ATP、2mM GTP、2mM UTP、2mM CTP、1μLT7ポリメラーゼ混合物、5mM MgCl2、及び14mM MgAcから構成した。
TaqManプローブによる定量PCR(qPCR)分析
SHERLOCK定量化を他の確立された方法と比較するために、ssDNA1の希釈系列でのqPCRを実施した。TaqManプローブとプライマーセット(以下の配列)を、ssDNA1に対して設計し、IDTで合成した。アッセイを、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher)を使用して行い、Roche LightCycler 480で測定した。
SHERLOCK定量化を他の確立された方法と比較するために、ssDNA1の希釈系列でのqPCRを実施した。TaqManプローブとプライマーセット(以下の配列)を、ssDNA1に対して設計し、IDTで合成した。アッセイを、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher)を使用して行い、Roche LightCycler 480で測定した。
SYBR Green IIによるリアルタイムRPA
SHERLOCK定量を他の確立された方法と比較するために、出願人は、ssDNA1の希釈系列でRPAを実行した。リアルタイムでDNAの蓄積を定量化するために、出願人は、上記の典型的なRPA反応混合物に、1x SYBR Green II(Thermo Fisher)を追加し、核酸の量と相関する蛍光シグナルを得る。反応は、蛍光反応速度を5分ごとに測定しながら、蛍光プレートリーダー(BioTek)上で37℃で1時間進行させた。
SHERLOCK定量を他の確立された方法と比較するために、出願人は、ssDNA1の希釈系列でRPAを実行した。リアルタイムでDNAの蓄積を定量化するために、出願人は、上記の典型的なRPA反応混合物に、1x SYBR Green II(Thermo Fisher)を追加し、核酸の量と相関する蛍光シグナルを得る。反応は、蛍光反応速度を5分ごとに測定しながら、蛍光プレートリーダー(BioTek)上で37℃で1時間進行させた。
レンチウイルスの調製及び処理
レンチウイルスの調製及び処理は、以前から公知の方法に基づいた。簡単に言えば、ジカ(Zika)またはデング(Dengue)のRNA断片、7.5μgのpsPAX2、及び2.5μgのpMD2.Gを含む10μgのpSB700誘導体を、HeBS-CaCl2方法を使用してHEK293FT細胞(Life Technologies、R7007)にトランスフェクトした。培地交換28時間後、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン及び4mMのGlutaMAX(ThermoFisher Scientific)を添加したDMEMで、0.45μmシリンジフィルターを使用して上清をろ過した。ViralBindレンチウイルス精製キット(Cell Biolabs、VPK-104)及びLenti-X Concentrator(Clontech,631231)を使用して、上清からレンチウイルスを精製及び調製した。ウイルス濃度は、QuickTiter Lentivirus Kit(Cell Biolabs,VPK-112)を使用して定量した。ウイルス試料を7%ヒト血清(Sigma、H4522)にスパイクし、95℃で2分間加熱し、RPAへの入力として使用した。
レンチウイルスの調製及び処理は、以前から公知の方法に基づいた。簡単に言えば、ジカ(Zika)またはデング(Dengue)のRNA断片、7.5μgのpsPAX2、及び2.5μgのpMD2.Gを含む10μgのpSB700誘導体を、HeBS-CaCl2方法を使用してHEK293FT細胞(Life Technologies、R7007)にトランスフェクトした。培地交換28時間後、10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン及び4mMのGlutaMAX(ThermoFisher Scientific)を添加したDMEMで、0.45μmシリンジフィルターを使用して上清をろ過した。ViralBindレンチウイルス精製キット(Cell Biolabs、VPK-104)及びLenti-X Concentrator(Clontech,631231)を使用して、上清からレンチウイルスを精製及び調製した。ウイルス濃度は、QuickTiter Lentivirus Kit(Cell Biolabs,VPK-112)を使用して定量した。ウイルス試料を7%ヒト血清(Sigma、H4522)にスパイクし、95℃で2分間加熱し、RPAへの入力として使用した。
ジカのヒト血清試料の分離及びcDNA精製
ジカ陽性の疑いのあるヒト血清または尿試料を、AVL緩衝液(Qiagen)で不活性化し、RNAの単離を、QIAampウイルスRNAミニキット(Qiagen)で達成した。ランダムプライマー、dNTP類、及び試料RNAを混合することによって、単離したRNAをcDNAに変換した後、70℃で7分間熱変性させた。次に変性RNAを、Superscript III(Invitrogen)で逆転写し、22~25℃で10分間、50℃で45分間、55℃で15分間、80℃で10分間インキュベートした。次に、cDNAを、RNAse H(New England Biolabs)と共に37℃で20分間インキュベートし、RNA:cDNAハイブリッドのRNAを破壊した。
ジカ陽性の疑いのあるヒト血清または尿試料を、AVL緩衝液(Qiagen)で不活性化し、RNAの単離を、QIAampウイルスRNAミニキット(Qiagen)で達成した。ランダムプライマー、dNTP類、及び試料RNAを混合することによって、単離したRNAをcDNAに変換した後、70℃で7分間熱変性させた。次に変性RNAを、Superscript III(Invitrogen)で逆転写し、22~25℃で10分間、50℃で45分間、55℃で15分間、80℃で10分間インキュベートした。次に、cDNAを、RNAse H(New England Biolabs)と共に37℃で20分間インキュベートし、RNA:cDNAハイブリッドのRNAを破壊した。
ヒト唾液からのゲノムDNA抽出
採取の30分前に飲食物を摂取することが制限された志願者から2mLの唾液を採取した。次に、キットのプロトコルで推奨されているように、QIAamp(登録商標)DNA Blood Mini Kit(Qiagen)を使用して試料を処理した。煮沸した唾液試料の場合、400μLのリン酸緩衝生理食塩水(Sigma)を、100μLのボランティアの唾液に加え、1800gで5分間遠心分離した。その上清をデカントし、ペレットを0.2%Triton X-100(Sigma)を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、95℃で5分間インキュベートした。1μLの試料をRPA反応への直接入力として使用した。
採取の30分前に飲食物を摂取することが制限された志願者から2mLの唾液を採取した。次に、キットのプロトコルで推奨されているように、QIAamp(登録商標)DNA Blood Mini Kit(Qiagen)を使用して試料を処理した。煮沸した唾液試料の場合、400μLのリン酸緩衝生理食塩水(Sigma)を、100μLのボランティアの唾液に加え、1800gで5分間遠心分離した。その上清をデカントし、ペレットを0.2%Triton X-100(Sigma)を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、95℃で5分間インキュベートした。1μLの試料をRPA反応への直接入力として使用した。
凍結乾燥とペーパーでの付着
ガラス繊維濾紙(Whatman,1827-021)を、90分間オートクレーブし(Consolidated Stills and Sterilizers,MKII)、5%ヌクレアーゼ非含有BSA(EMD Millipore,126609-10GM)で一晩ブロックした。ヌクレアーゼ非含有の水(Life Technologies,AM9932)でペーパーを1回すすいだ後、4%RNAsecureTM(Life Technologies,AM7006)と60℃で20分間インキュベートし、ヌクレアーゼ非含有の水でさらに3回すすいだ。処理したペーパーを、使用前にホットプレート(Cole-Parmer,IKA C-Mag HS7)上で80℃で20分間乾燥した。先に示した1.8μLのC2c2反応混合物を、黒い透明な底の384ウェルプレート(Corning、3544)に置いたディスク(2mm)に置いた。凍結乾燥試験では、反応混合物ディスクを含むプレートを、液体窒素で瞬間凍結し、Pardee et al(2)に記載されているように一晩凍結乾燥した。RPA試料を、ヌクレアーゼ非含有の水で1:10に希釈し、1.8μLの混合液をペーパーディスクにロードし、プレートリーダー(BioTek Neo)を使用して37℃でインキュベートした。
ガラス繊維濾紙(Whatman,1827-021)を、90分間オートクレーブし(Consolidated Stills and Sterilizers,MKII)、5%ヌクレアーゼ非含有BSA(EMD Millipore,126609-10GM)で一晩ブロックした。ヌクレアーゼ非含有の水(Life Technologies,AM9932)でペーパーを1回すすいだ後、4%RNAsecureTM(Life Technologies,AM7006)と60℃で20分間インキュベートし、ヌクレアーゼ非含有の水でさらに3回すすいだ。処理したペーパーを、使用前にホットプレート(Cole-Parmer,IKA C-Mag HS7)上で80℃で20分間乾燥した。先に示した1.8μLのC2c2反応混合物を、黒い透明な底の384ウェルプレート(Corning、3544)に置いたディスク(2mm)に置いた。凍結乾燥試験では、反応混合物ディスクを含むプレートを、液体窒素で瞬間凍結し、Pardee et al(2)に記載されているように一晩凍結乾燥した。RPA試料を、ヌクレアーゼ非含有の水で1:10に希釈し、1.8μLの混合液をペーパーディスクにロードし、プレートリーダー(BioTek Neo)を使用して37℃でインキュベートした。
細菌ゲノムDNA抽出
CRE検出を含む実験のために、細菌培養物を、溶原性ブロス(LB)で対数中期まで増殖させ、次いでペレット化し、Qiagen DNeasy Blood及びTissue Kitを使用して、必要に応じて、グラム陰性またはグラム陽性菌のいずれかの製造業者のプロトコルを使用して、gDNA抽出及び精製に供した。gDNAは、QubitフルオロメーターでのQuant-It dsDNAアッセイによって定量化し、その品質は、Nanodrop分光光度計で200-300nMの吸光度スペクトルを介して評価した。
CRE検出を含む実験のために、細菌培養物を、溶原性ブロス(LB)で対数中期まで増殖させ、次いでペレット化し、Qiagen DNeasy Blood及びTissue Kitを使用して、必要に応じて、グラム陰性またはグラム陽性菌のいずれかの製造業者のプロトコルを使用して、gDNA抽出及び精製に供した。gDNAは、QubitフルオロメーターでのQuant-It dsDNAアッセイによって定量化し、その品質は、Nanodrop分光光度計で200-300nMの吸光度スペクトルを介して評価した。
E.coliとP.aeruginosaとの間を区別する実験のために、細菌培養物を、Luria-Bertani(LB)ブロスで初期定常期まで増殖させた。E.coli及びP.aeruginosaの両方の1.0mLを、ポータブルPureLyse細菌gDNA抽出キット(Claremont BioSolutions)を使用して処理した。1X結合緩衝液を細菌培養液に添加した後、電池式の溶解カートリッジを3分間通過させた。洗浄溶液として0.5×の結合緩衝水溶液を使用した後、150μLの水で溶出した。
デジタルドロップレットPCR定量
図1Cで使用されるssDNA1及びssRNA1の標準希釈の濃度を確認するために、出願人は、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を行った。DNA定量化のために、ssDNA1配列を標的とするように設計されたPrimeTime qPCRプローブ/プライマーアッセイでddPCR Supermix for Probes(dUTPなし)を使用して液滴を作成した。RNA定量のために、ssRNA1配列を標的とするように設計されたPrimeTime qPCRプローブ/プライマーアッセイを備えた、プローブ用のワンステップRT-ddPCRキットを使用して、液滴を作成した。いずれの場合も、QX200液滴発生器(BioRad)を使用して液滴を生成し、PCRプレートに移した。キットのプロトコルに記載されているように、液滴ベースの増幅をサーモサイクラーで実行し、続いてQX200ドロップレットリーダーでの測定を介して核酸濃度を決定した。
図1Cで使用されるssDNA1及びssRNA1の標準希釈の濃度を確認するために、出願人は、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を行った。DNA定量化のために、ssDNA1配列を標的とするように設計されたPrimeTime qPCRプローブ/プライマーアッセイでddPCR Supermix for Probes(dUTPなし)を使用して液滴を作成した。RNA定量のために、ssRNA1配列を標的とするように設計されたPrimeTime qPCRプローブ/プライマーアッセイを備えた、プローブ用のワンステップRT-ddPCRキットを使用して、液滴を作成した。いずれの場合も、QX200液滴発生器(BioRad)を使用して液滴を生成し、PCRプレートに移した。キットのプロトコルに記載されているように、液滴ベースの増幅をサーモサイクラーで実行し、続いてQX200ドロップレットリーダーでの測定を介して核酸濃度を決定した。
ヒトの遺伝子型決定のための合成標準
ヒト試料の遺伝子型を正確に呼び出すための標準を作成するために、出願人は、SNP標的の周りにプライマーを設計して、2つのホモ接合遺伝子型のそれぞれを表すヒトゲノムDNAから約200bpの領域を増幅した。次に、ホモ接合型標準を、1:1の比率で混することによって、ヘテロ接合型標準を作成した。次に、これらの標準を、同等のゲノム濃度(約0.56fg/μL)に希釈し、実際のヒトの試料とともにSHERLOCKの入力として使用した。
ヒト試料の遺伝子型を正確に呼び出すための標準を作成するために、出願人は、SNP標的の周りにプライマーを設計して、2つのホモ接合遺伝子型のそれぞれを表すヒトゲノムDNAから約200bpの領域を増幅した。次に、ホモ接合型標準を、1:1の比率で混することによって、ヘテロ接合型標準を作成した。次に、これらの標準を、同等のゲノム濃度(約0.56fg/μL)に希釈し、実際のヒトの試料とともにSHERLOCKの入力として使用した。
腫瘍変異無細胞DNA(cfDNA)の検出
実際の患者のcfDNA試料をシミュレートする模擬cfDNA標準を、市販業者(Horizon Discovery Group)から購入した。これらの標準は、BRAF V600E及びEGFR L858R変異体の両方について、4つの対立遺伝子画分(100%WT及び0.1%、1%、及び5%変異体)として提供された。これらの標準の3μLを、SHERLOCKへの入力として提供した。
実際の患者のcfDNA試料をシミュレートする模擬cfDNA標準を、市販業者(Horizon Discovery Group)から購入した。これらの標準は、BRAF V600E及びEGFR L858R変異体の両方について、4つの対立遺伝子画分(100%WT及び0.1%、1%、及び5%変異体)として提供された。これらの標準の3μLを、SHERLOCKへの入力として提供した。
蛍光データの分析
バックグラウンドを差し引いた蛍光データを計算するために、試料の第1の蛍光を差し引いて、異なる条件間の比較を可能にした。バックグラウンド条件(入力なしまたはcrRNA条件なし)の蛍光を試料から差し引いて、バックグラウンドを差し引いた蛍光を生成した。
バックグラウンドを差し引いた蛍光データを計算するために、試料の第1の蛍光を差し引いて、異なる条件間の比較を可能にした。バックグラウンド条件(入力なしまたはcrRNA条件なし)の蛍光を試料から差し引いて、バックグラウンドを差し引いた蛍光を生成した。
SNPまたは系統の識別のためのガイド比を、各ガイドをガイド値の合計で除すことによって算出して、試料間の全体的な変動を調整した。以下のように、試料間の全体的な変動を調整するために、SNPまたは系統の識別のためのcrRNA比を計算した:
ここで、Ai及びBiは、所定の個体の対立遺伝子Aまたは対立遺伝子Bをそれぞれ検知する、crRNAの技術的な複製iのSHERLOCK強度値を指す。通常、アッセイには、crRNAごとに4つの技術的な複製があるため、m及びnは4に等しく、分母は所定のSNP遺伝子座及び個体の8つのcrRNA SHERLOCK強度値全ての合計に相当する。2つのcrRNAがあるため、個体の各crRNAの平均crRNA比率は、常に合計2になる。したがって、ホモ接合性の理想的な事例では、陽性対立遺伝子crRNAの平均crRNA比は2になり、陰性対立遺伝子crRNAの平均crRNA比はゼロになる。ヘテロ接合性の理想的な場合には、2つのcrRNAのそれぞれの平均crRNA比は1になる。
ここで、Ai及びBiは、所定の個体の対立遺伝子Aまたは対立遺伝子Bをそれぞれ検知する、crRNAの技術的な複製iのSHERLOCK強度値を指す。通常、アッセイには、crRNAごとに4つの技術的な複製があるため、m及びnは4に等しく、分母は所定のSNP遺伝子座及び個体の8つのcrRNA SHERLOCK強度値全ての合計に相当する。2つのcrRNAがあるため、個体の各crRNAの平均crRNA比率は、常に合計2になる。したがって、ホモ接合性の理想的な事例では、陽性対立遺伝子crRNAの平均crRNA比は2になり、陰性対立遺伝子crRNAの平均crRNA比はゼロになる。ヘテロ接合性の理想的な場合には、2つのcrRNAのそれぞれの平均crRNA比は1になる。
LwCas13aの切断要件の特徴付け。
プロトスペーサー隣接部位(PFS)は、Cas13aによるロバストなリボヌクレアーゼ活性に必要とされる標的部位の近くに存在する特定のモチーフである。PFSは、標的部位の3’末端に位置しており、以前はH(Gではなく)として本発明者らのグループによってLshCas13aに対して特徴付けされていた(1)。このモチーフはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、クラス2系を標的とするDNAの配列制限に似ているが、内因性の系でのCRISPR遺伝子座の自己標的化の防止には関与しないため、機能的に異なる。Cas13aの将来の構造研究により、Cas13a:crRNA標的複合体形成及び切断活性に対するPFSの重要性が明らかになる可能性が高い。
プロトスペーサー隣接部位(PFS)は、Cas13aによるロバストなリボヌクレアーゼ活性に必要とされる標的部位の近くに存在する特定のモチーフである。PFSは、標的部位の3’末端に位置しており、以前はH(Gではなく)として本発明者らのグループによってLshCas13aに対して特徴付けされていた(1)。このモチーフはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、クラス2系を標的とするDNAの配列制限に似ているが、内因性の系でのCRISPR遺伝子座の自己標的化の防止には関与しないため、機能的に異なる。Cas13aの将来の構造研究により、Cas13a:crRNA標的複合体形成及び切断活性に対するPFSの重要性が明らかになる可能性が高い。
出願人は、E.coli(図2D~E)から組換えLwCas13aタンパク質を精製し、各可能性のあるプロトスペーサー隣接部位(PFS)ヌクレオチド(A、U、CまたはG)で173nt ssRNAを切断するその能力をアッセイした。(図2F)。LshCas13aと同様に、LwCas13aは、A、U、またはCのPFSで標的を強力に切断可能であり、G PFSのssRNAでの活性はより低くなる。G PFSではssRNA1に対してより弱い活性が見られるが、G PFSモチーフでは2つの標的部位のロバストな検出が依然として見られる(表3;rs601338 crRNA及びジカの標的化crRNA 2)。H PFSは、あらゆる状況で必要とされるわけではない可能性が高く、多くの場合、G PFSで強力な切断またはコラテラル活性が達成され得る。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)及びその他の等温増幅戦略についての考察。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、3つの必須酵素、すなわちリコンビナーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB類)、及び鎖置換ポリメラーゼからなる等温増幅技術である。RPAは、酵素が全て37℃前後の一定温度で動作するため、温度調節を必要としないことにより、他の増幅戦略、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に存在する多くの技術的困難を克服する。RPAは、二本鎖鋳型の全体的な溶解及びプライマーアニーリングの温度サイクルを、インビボのDNA複製及び修復からヒントを得た酵素的アプローチに置き換える。リコンビナーゼ-プライマー複合体は、二本鎖DNAをスキャンし、相補的な部位での鎖交換を促進する。鎖の交換はSSBによって安定化され、プライマーが結合したままになる。リコンビナーゼの自発的な分解は、そのADP結合状態で発生し、鎖置換型ポリメラーゼがプライマーに侵入して伸長することを可能にし、ポイントオブケア及びフィールド設定で利用できない複雑な機器なしで増幅を可能にする。37~42℃の温度範囲でこのプロセスを周期的に繰り返すと、指数関数的にDNAが増幅される。公開された元の製剤では、鎖置換ポリメラーゼとしてBacillus subtilis Pol I(Bsu)を、リコンビナーゼとしてT4 uvsXを、及び一本鎖DNA結合タンパク質としてT4 gp32を使用している(2)が、この研究で使用されたTwistDxによって販売されている現在の製剤に何の成分があるかは不明確である。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、3つの必須酵素、すなわちリコンビナーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB類)、及び鎖置換ポリメラーゼからなる等温増幅技術である。RPAは、酵素が全て37℃前後の一定温度で動作するため、温度調節を必要としないことにより、他の増幅戦略、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に存在する多くの技術的困難を克服する。RPAは、二本鎖鋳型の全体的な溶解及びプライマーアニーリングの温度サイクルを、インビボのDNA複製及び修復からヒントを得た酵素的アプローチに置き換える。リコンビナーゼ-プライマー複合体は、二本鎖DNAをスキャンし、相補的な部位での鎖交換を促進する。鎖の交換はSSBによって安定化され、プライマーが結合したままになる。リコンビナーゼの自発的な分解は、そのADP結合状態で発生し、鎖置換型ポリメラーゼがプライマーに侵入して伸長することを可能にし、ポイントオブケア及びフィールド設定で利用できない複雑な機器なしで増幅を可能にする。37~42℃の温度範囲でこのプロセスを周期的に繰り返すと、指数関数的にDNAが増幅される。公開された元の製剤では、鎖置換ポリメラーゼとしてBacillus subtilis Pol I(Bsu)を、リコンビナーゼとしてT4 uvsXを、及び一本鎖DNA結合タンパク質としてT4 gp32を使用している(2)が、この研究で使用されたTwistDxによって販売されている現在の製剤に何の成分があるかは不明確である。
さらに、RPAには多くの制限がある:
1)Cas13aの検出は定量的であるが(図15)、リコンビナーゼが利用可能な全てのATPを使用すると、リアルタイムRPAは急速に飽和するため、リアルタイムのRPA定量は困難な場合がある。リアルタイムPCRは増幅をサイクルする能力のため定量的であるが、RPAには増幅率を厳密に制御する機序がない。利用可能なマグネシウムまたはプライマー濃度の低下、反応温度の低下、または非効率的なプライマーの設計など、ある特定の調整を行って増幅速度を低下させてもよい。図31、32、及び52などの定量的SHERLOCKのいくつかの事例が観察されるが、常にそうであるとは限らず、鋳型によって異なる場合がある。
2)RPA効率はプライマー設計に影響され得る。製造業者は通常、平均GC含有量(40-60%)で効率的なリコンビナーゼ結合を確保するために長いプライマーを設計すること、及び高感度のプライマー対を見つけるために最大100のプライマー対をスクリーニングすることを推奨している。SHERLOCKを使用して、単一分子の感度でのアトモルの試験を達成するには、設計するプライマー対は2つだけでよいことが出願人には判明した。このロバストネスは、アンプリコン増幅の非効率性を相殺する、構成的に活性なCas13aコラテラル活性によるシグナルの追加の増幅に起因する可能性がある。この品質は、図34の本発明者らの細菌病原体の同定にとって特に重要である。RPAに関与する融解ステップがないため、細菌ゲノムの16S rRNA遺伝子部位などの高度に構造化された領域の増幅で問題が発生した。したがって、プライマーの二次構造が問題になり、増幅効率、したがって感度が制限される。本明細書に開示されている実施形態は、これらのRPA特有の問題にもかかわらず、Cas13aからの追加のシグナル増幅という理由で成功すると考えられた。
3)効率的なRPAを実現するには、増幅配列の長さが短い(100~200bp)必要がある。ほとんどの適用では、これは重大な問題ではなく、おそらくさらに有利である(例えば、平均断片サイズが160bpのcfDNA検出)。例えば、細菌の検出にユニバーサルプライマーが必要で、識別用のSNPが広い領域に分散している場合など、大きいアンプリコンの長さが重要な場合がある。
1)Cas13aの検出は定量的であるが(図15)、リコンビナーゼが利用可能な全てのATPを使用すると、リアルタイムRPAは急速に飽和するため、リアルタイムのRPA定量は困難な場合がある。リアルタイムPCRは増幅をサイクルする能力のため定量的であるが、RPAには増幅率を厳密に制御する機序がない。利用可能なマグネシウムまたはプライマー濃度の低下、反応温度の低下、または非効率的なプライマーの設計など、ある特定の調整を行って増幅速度を低下させてもよい。図31、32、及び52などの定量的SHERLOCKのいくつかの事例が観察されるが、常にそうであるとは限らず、鋳型によって異なる場合がある。
2)RPA効率はプライマー設計に影響され得る。製造業者は通常、平均GC含有量(40-60%)で効率的なリコンビナーゼ結合を確保するために長いプライマーを設計すること、及び高感度のプライマー対を見つけるために最大100のプライマー対をスクリーニングすることを推奨している。SHERLOCKを使用して、単一分子の感度でのアトモルの試験を達成するには、設計するプライマー対は2つだけでよいことが出願人には判明した。このロバストネスは、アンプリコン増幅の非効率性を相殺する、構成的に活性なCas13aコラテラル活性によるシグナルの追加の増幅に起因する可能性がある。この品質は、図34の本発明者らの細菌病原体の同定にとって特に重要である。RPAに関与する融解ステップがないため、細菌ゲノムの16S rRNA遺伝子部位などの高度に構造化された領域の増幅で問題が発生した。したがって、プライマーの二次構造が問題になり、増幅効率、したがって感度が制限される。本明細書に開示されている実施形態は、これらのRPA特有の問題にもかかわらず、Cas13aからの追加のシグナル増幅という理由で成功すると考えられた。
3)効率的なRPAを実現するには、増幅配列の長さが短い(100~200bp)必要がある。ほとんどの適用では、これは重大な問題ではなく、おそらくさらに有利である(例えば、平均断片サイズが160bpのcfDNA検出)。例えば、細菌の検出にユニバーサルプライマーが必要で、識別用のSNPが広い領域に分散している場合など、大きいアンプリコンの長さが重要な場合がある。
SHERLOCKのモジュール性によって、任意の増幅技術、非等温アプローチでさえ、T7転写及びCas13a検出の前に使用することが可能になる。このモジュール性は、単一の反応におけるT7及びCas13aステップの互換性によって可能になり、T7プロモーターを有する任意の増幅DNA入力で検出を実行することを可能にする。RPAを使用する前に、核酸配列ベースの増幅(NASBA)(3、4)を検出アッセイで試みた(図10)。しかし、NASBAは、Cas13aの感度を大幅に改善しなかった(図11及び53)。検出前に使用し得るその他の増幅技術には、PCR、ループ媒介等温増幅(LAMP)(5)、鎖置換増幅(SDA)(6)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)(7)、及びニッキング酵素増幅反応(NEAR)(8)が挙げられる。等温技術を交換する能力により、SHERLOCKが任意の1つの増幅技術の特定の制限を克服することが可能になる。
操作されたミスマッチの設計。
出願人は、標的:crRNA二本鎖に2つ以上のミスマッチがある場合、LshCas13a標的切断が減少したが、単一のミスマッチにより比較的影響を受けないことを示し、これは出願人がLwCas13aコラテラル切断について確認した観察である(図36A)。crRNAスペーサー配列に追加の変異を導入することにより、追加のミスマッチ(合計2つのミスマッチ)を有する標的に対するコラテラルの切断を不安定化し、一方で単一のミスマッチのみが存在するため、オン標的のコラテラル切断を保持すると仮定した。特異性の増大を操作する可能性を試験するために、ssRNA1を標的とする複数のcrRNAを設計し、crRNAの長さ全体にミスマッチを含め(図36A)、オン標的コラテラル切断を最適化し、単一のミスマッチによって異なる標的のコラテラル切断を最小限に抑えた。これらのミスマッチはssRNA1のコラテラル切断を減少させなかったが、追加のミスマッチ(ssRNA2)を含む標的のシグナルが有意に減少したことが観察された。ssRNA1と2との間を最もよく区別する設計されたcrRNAには、ssRNA2ミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれ、事実上ハイブリダイズしたRNAに「バブル」または歪みが生じた。合成ミスマッチと標的に存在する追加のミスマッチ(すなわち、二重ミスマッチ)の調整によって引き起こされる感度の低下は、連続的または近傍のダブルミスマッチに対するLshCas13a及びLwCas13aの感度と一致し、単一ヌクレオチドの識別を可能にするcrRNAの合理的な設計の基礎を示す(図36B)。
出願人は、標的:crRNA二本鎖に2つ以上のミスマッチがある場合、LshCas13a標的切断が減少したが、単一のミスマッチにより比較的影響を受けないことを示し、これは出願人がLwCas13aコラテラル切断について確認した観察である(図36A)。crRNAスペーサー配列に追加の変異を導入することにより、追加のミスマッチ(合計2つのミスマッチ)を有する標的に対するコラテラルの切断を不安定化し、一方で単一のミスマッチのみが存在するため、オン標的のコラテラル切断を保持すると仮定した。特異性の増大を操作する可能性を試験するために、ssRNA1を標的とする複数のcrRNAを設計し、crRNAの長さ全体にミスマッチを含め(図36A)、オン標的コラテラル切断を最適化し、単一のミスマッチによって異なる標的のコラテラル切断を最小限に抑えた。これらのミスマッチはssRNA1のコラテラル切断を減少させなかったが、追加のミスマッチ(ssRNA2)を含む標的のシグナルが有意に減少したことが観察された。ssRNA1と2との間を最もよく区別する設計されたcrRNAには、ssRNA2ミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれ、事実上ハイブリダイズしたRNAに「バブル」または歪みが生じた。合成ミスマッチと標的に存在する追加のミスマッチ(すなわち、二重ミスマッチ)の調整によって引き起こされる感度の低下は、連続的または近傍のダブルミスマッチに対するLshCas13a及びLwCas13aの感度と一致し、単一ヌクレオチドの識別を可能にするcrRNAの合理的な設計の基礎を示す(図36B)。
ZIKV株とDENV株とのミスマッチ検出では、本発明者らの全長のcrRNAに2つのミスマッチが含まれていた(図37A、B)。菌株間の配列の相違が大きいため、2つのゲノム間で1ヌクレオチドの相違しかない28ntの連続ストレッチを見つけ得なかった。しかし、出願人はより短いcrRNAが依然として機能することを予測し、スペーサー配列に合成ミスマッチを含み、標的配列に1つのみミスマッチを含む2つのZIKV株の標的に対して、より短い23nt crRNAを設計した。これらのcrRNAは、依然としてアフリカとアメリカのZIKV株を区別し得た(図36C)。23nt及び20ntのcrRNAのその後の試験によって、スペーサー長の減少が活性を減少させるが、単一のミスマッチを区別する能力を維持または強化することが示されている(図57A~G)。単一ヌクレオチド変異の識別を容易にするために合成ミスマッチを導入し得る方法をよりよく理解するために、スペーサーの第1の7つの位置にわたって合成ミスマッチを3つの異なるスペーサー長(28、23、及び20nt)で並べた(図57A)。3番目の位置に変異がある標的では、LwCas13aは、スペーサーの位置5に合成ミスマッチがある場合に最大の特異性を示すが、より低いレベルのオン標的活性ではあるが、短いスペーサー長では特異性が向上する(図57B~G)。出願人は、また、標的の変異を3~6の位置にシフトし、変異周辺のスペーサーの合成ミスマッチを並べた(図58)。
合成標準を使用したSHERLOCKによる遺伝子型決定。
SNP遺伝子座のPCR増幅から作成された合成標準の評価により、遺伝子型の正確な同定が可能になる(図60A、B)。個体の試料のSHERLOCK結果と合成標準間の全ての比較を計算することにより(分散分析)、最も類似したSHERLOCK検出強度を有する合成標準を見つけることによって、各個体の遺伝子型を特定し得る(図60C、D)。このSHERLOCK遺伝子型決定アプローチは、任意のSNP遺伝子座に一般化され得る(図60E)。
SNP遺伝子座のPCR増幅から作成された合成標準の評価により、遺伝子型の正確な同定が可能になる(図60A、B)。個体の試料のSHERLOCK結果と合成標準間の全ての比較を計算することにより(分散分析)、最も類似したSHERLOCK検出強度を有する合成標準を見つけることによって、各個体の遺伝子型を特定し得る(図60C、D)。このSHERLOCK遺伝子型決定アプローチは、任意のSNP遺伝子座に一般化され得る(図60E)。
SHERLOCKは、手頃な価格で適応性のあるCRISPR-Dxプラットフォームである。
SHERLOCKの費用分析のために、無視し得る費用であると決定された試薬は省略し、crRNAの合成のためのDNA鋳型、RPAで使用されるプライマー、一般的な緩衝液(MgCl2、Tris HCl、グリセロール、NaCl、DTT)、ガラスマイクロファイバー濾紙、及びRNAsecure試薬を含めた。DNA鋳型の場合、IDTからのウルトラマー合成は、40のインビトロ転写反応(各約10,000反応に十分)の材料を約70ドルで提供し、crRNA合成に追加されるコストはごくわずかである。RPAプライマーの場合、30ntのDNAプライマーの25nモルのIDT合成を、約10ドルで購入し得、5000 SHERLOCK反応に十分な材料が提供される。ガラスマイクロファイバーペーパーは0.50ドル/シートで入手可能で、数百のSHERLOCK反応に十分である。4%のRNAsecure試薬のコストは7.20ドル/mLで、500の試験に十分である。
SHERLOCKの費用分析のために、無視し得る費用であると決定された試薬は省略し、crRNAの合成のためのDNA鋳型、RPAで使用されるプライマー、一般的な緩衝液(MgCl2、Tris HCl、グリセロール、NaCl、DTT)、ガラスマイクロファイバー濾紙、及びRNAsecure試薬を含めた。DNA鋳型の場合、IDTからのウルトラマー合成は、40のインビトロ転写反応(各約10,000反応に十分)の材料を約70ドルで提供し、crRNA合成に追加されるコストはごくわずかである。RPAプライマーの場合、30ntのDNAプライマーの25nモルのIDT合成を、約10ドルで購入し得、5000 SHERLOCK反応に十分な材料が提供される。ガラスマイクロファイバーペーパーは0.50ドル/シートで入手可能で、数百のSHERLOCK反応に十分である。4%のRNAsecure試薬のコストは7.20ドル/mLで、500の試験に十分である。
さらに、ペーパーベースのアッセイを除く全ての実験について、0.036ドル/反応という費用で、384ウェルプレートを使用した(Corning 3544)。無視し得るコストのため、これは全体的なコスト分析には含まれていない。さらに、SHERLOCK-POCは、ペーパーの上で簡単に実行し得るため、プラスチック容器を使用する必要はない。本明細書で使用したSHERLOCKの読み取り方法は、フィルターセットまたはモノクロメーターのいずれかを備えたプレートリーダーであった。設備投資として、リーダーの費用は計算に含まれておらず、これは、機器で実行される反応が増えるとコストが急激に減少し無視し得るほどであるためである。POC適用では、ハンドヘルド分光光度計(9)またはポータブル電子リーダー(4)など、より安価でポータブルな代替品を使用してもよく、これにより、計測の費用が200ドル未満に削減される。これらの携帯性の高いソリューションは、かさばる機器と比較して、速度及び読み取りの容易さを低下させるが、より幅広い用途を可能にする。
結果
本明細書に記載されるアッセイ及び系は、一般に、増幅及び検出の2段階プロセスをさらに含んでもよい。第1のステップでは、RNAまたはDNAのいずれかの核酸試料が、例えば等温増幅によって増幅される。第2のステップの間、増幅されたDNAをRNAに転写し、その後CRISPRエフェクター、例えば、C2c2及びプログラムされたcrRNAとインキュベートされて、標的核酸配列の存在を検出する。検出を可能にするために、消光されたフルオロフォアで標識されたレポーターRNAを反応に追加する。レポーターRNAのコラテラル切断により、フルオロフォアが消光しなくなり、核酸標的のリアルタイム検出が可能になる(図17A)。
本明細書に記載されるアッセイ及び系は、一般に、増幅及び検出の2段階プロセスをさらに含んでもよい。第1のステップでは、RNAまたはDNAのいずれかの核酸試料が、例えば等温増幅によって増幅される。第2のステップの間、増幅されたDNAをRNAに転写し、その後CRISPRエフェクター、例えば、C2c2及びプログラムされたcrRNAとインキュベートされて、標的核酸配列の存在を検出する。検出を可能にするために、消光されたフルオロフォアで標識されたレポーターRNAを反応に追加する。レポーターRNAのコラテラル切断により、フルオロフォアが消光しなくなり、核酸標的のリアルタイム検出が可能になる(図17A)。
ロバストなシグナル検出を達成するために、C2c2のオルソログを生物体Leptotrichia wadei(LwC2c2)から同定し、評価した。LwC2c2タンパク質の活性は、合成CRISPRアレイと共にE.coliで発現させ、それをプログラミングしてベータ-ラクタマーゼmRNA内の標的部位を切断し、アンピシリン選択下で細菌を死滅させることによって評価した(図2B)。LwC2c2遺伝子座では、LshC2c2遺伝子座よりも生存しているE.coliコロニーの数が少なく、これによってLwC2c2オルソログの切断活性が高いことが実証された(図2C)。次いで、ヒトコドン最適化LwC2c2タンパク質を、E.coli(図2D~E)から精製し、173ntのssRNAを切断するその能力を、異なるプロトスペーサー隣接部位(PFS)ヌクレオチドでアッセイした(図2F)。LwC2c2は、可能な4つのPFS標的のそれぞれを切断し得、G PFSを使用したssRNAでの活性はわずかに低かった。
LwC2c2 RNaseコラテラル活性のリアルタイム測定は、市販のRNA蛍光プレートリーダーを使用して測定した(図17A)。LwC2c2活性のベースライン感度を決定するために、LwC2c2を、ssRNA標的1(ssRNA1)及びssRNA標的内の部位に相補的なcrRNAと共に、RNAセンサープローブと共にインキュベートした(図18)。これにより、約50fMの感度が得られ(図27A)、これは、他の最近の核酸検出技術(Pardee et al.,2014)よりは感度が高いが、フェムトモルより低い検出性能を必要とする多くの診断適用には十分な感度ではない。(Barletta et al.,2004;Emmadi et al.,2011;Rissin et al.,2010;Song et al.,2013)。
感度を上げるために、LwC2c2とのインキュベーションの前に等温増幅ステップを追加した。LwC2c2媒介の検出と、以前に使用された等温増幅アプローチ、例えば、核酸配列ベースの増幅(NASBA)(Compton、1991;Pardee et al.,2016)を組み合わせると、感度がある程度向上した(図11)。代替の等温増幅アプローチである、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)(Piepenburg et al.,2006)を試験し、これは、2時間以内にDNAを指数関数的に増幅するために使用され得る。T7 RNAポリメラーゼプロモーターをRPAプライマーに追加することにより、増幅されたDNAをRNAに変換し、その後LwC2c2で検出し得る(図17)。したがって、ある特定の例示的な実施形態では、アッセイは、RPAによる増幅、DNAのRNAへのT7 RNAポリメラーゼ変換、及び消光したレポーターからの蛍光のC2c2アンロックによるRNAのその後の検出の組み合わせを含む。
ssRNA1の合成されたDNAバージョンについての例示的な方法を使用して、1反応あたり1~10分子の範囲のアトモル感度を達成することが可能であった(図27B、左)。検出の精度を検証するために、入力DNAの濃度をデジタルドロップレットPCRで確認し、検出可能な最低の標的濃度(2aM)が1マイクロリットルあたり1分子の濃度であることを確認した。逆転写ステップを追加することで、RPAはRNAをdsDNAフォームに増幅することも可能で、出願人は、ssRNA1でアトモル感度を達成することが可能になる(27B、右)。同様に、RNA標的の濃度は、デジタルドロップレットPCRによって確認された。POC診断テストとして機能する例示的な方法の実行可能性を評価するために、全ての構成要素(RPA、T7ポリメラーゼ増幅、及びLwC2c2検出)が単一の反応で機能する能力を試験し、アッセイのワンポットバージョンでのアトモル感度を確認した(図22)。
このアッセイでは、液体中またはペーパー上での高感度なウイルス検出が可能である。
次に、アッセイが、高感度を必要とし、携帯型診断から利益を得ることが可能な感染症の適用において有効であるかが決定された。モデル系での検出を試験するために、ジカウイルスゲノムのRNA断片と関連するフラビウイルスデング熱(Dejnirattisai et al.,2016)を保持するレンチウイルスを作製し、ウイルス粒子の数を定量化した(図31A)。偽ウイルスのレベルは2aMまで検出された。同時に、ジカとデング熱RNA断片を含むこれらのプロキシウイルスを明確に区別することも可能であった(図31B)。アッセイが凍結乾燥に適合して流通のコールドチェーンへの依存を取り除くかを決定するために、反応成分を凍結乾燥した。試料を使用して凍結乾燥した成分を再水和した後、20fMのssRNA1を検出した(図33A)。リソース不足及びPOC設定は、使いやすさのためにペーパーの試験から恩恵を受けるので、ガラス繊維ペーパーでのC2c2検出の活性も評価され、ペーパー点在のC2c2反応が標的検出が可能であることがわかった(図33B)。組み合わせて、凍結乾燥及びペーパースポッティングすると、C2c2検出反応はssRNA1を高感度で検出した(図33C)。溶液中のLwC2c2と凍結乾燥LwC2c2との間の合成ジカウイルスRNA断片の検出でも同様のレベルの感度が観察され、凍結乾燥SHERLOCKのロバストネス及び迅速なPOCジカウイルス診断の可能性が実証された(図33D~E)。この目的のために、アッセイのPOCバリアントの能力を試験して、ジカRNAをデングRNAから区別する能力を決定した(図31C)。ペーパースポッティング及び凍結乾燥により、読み取り値の絶対シグナルがわずかに減少したが、このアッセイはそれでも、デング制御配列によるモックウイルスの検出と比較して、20aM程度の低い濃度でニセのジカウイルスを有意に検出した(図31D)。
次に、アッセイが、高感度を必要とし、携帯型診断から利益を得ることが可能な感染症の適用において有効であるかが決定された。モデル系での検出を試験するために、ジカウイルスゲノムのRNA断片と関連するフラビウイルスデング熱(Dejnirattisai et al.,2016)を保持するレンチウイルスを作製し、ウイルス粒子の数を定量化した(図31A)。偽ウイルスのレベルは2aMまで検出された。同時に、ジカとデング熱RNA断片を含むこれらのプロキシウイルスを明確に区別することも可能であった(図31B)。アッセイが凍結乾燥に適合して流通のコールドチェーンへの依存を取り除くかを決定するために、反応成分を凍結乾燥した。試料を使用して凍結乾燥した成分を再水和した後、20fMのssRNA1を検出した(図33A)。リソース不足及びPOC設定は、使いやすさのためにペーパーの試験から恩恵を受けるので、ガラス繊維ペーパーでのC2c2検出の活性も評価され、ペーパー点在のC2c2反応が標的検出が可能であることがわかった(図33B)。組み合わせて、凍結乾燥及びペーパースポッティングすると、C2c2検出反応はssRNA1を高感度で検出した(図33C)。溶液中のLwC2c2と凍結乾燥LwC2c2との間の合成ジカウイルスRNA断片の検出でも同様のレベルの感度が観察され、凍結乾燥SHERLOCKのロバストネス及び迅速なPOCジカウイルス診断の可能性が実証された(図33D~E)。この目的のために、アッセイのPOCバリアントの能力を試験して、ジカRNAをデングRNAから区別する能力を決定した(図31C)。ペーパースポッティング及び凍結乾燥により、読み取り値の絶対シグナルがわずかに減少したが、このアッセイはそれでも、デング制御配列によるモックウイルスの検出と比較して、20aM程度の低い濃度でニセのジカウイルスを有意に検出した(図31D)。
ヒトでのジカウイルスRNAレベルは、患者の唾液では3×106コピー/mL(4.9fM)、及び患者の血清では7.2×105コピー/mL(1.2fM)程度に低いことが報告されている(Barzon et al.,2016;Gourinat et al.,2015;Lanciotti et al.,2008)。得られた患者の試料から、1.25×103コピー/mL(2.1aM)という低い濃度が観察された。アッセイが低力価の臨床分離株のジカウイルス検出が可能かを評価するために、ウイルスRNAを患者から抽出し、逆転写し、得られたcDNAをアッセイの入力として使用した(図32A)。ジカヒト血清試料の有意な検出は、1.25コピー/μL(2.1aM)まで低い濃度で観察された(図32B)。さらに、患者試料からのシグナルは、ジカウイルスRNAコピー数を予測するものであり、ウイルス負荷の予測に使用できた(図31F)。核酸精製が利用できない疾患の状況に対する幅広い適用性を試験するために、ヒト血清にスパイクされたssRNA1の検出を試験し、アッセイが2%未満の血清レベルで活性化されることが確認された(図33G)。
細菌の病原体の区別及び遺伝子の区別
このアッセイが細菌病原体を区別するために使用し得るかを決定するために、保存された隣接領域がユニバーサルRPAプライマーを細菌種全体で使用することを可能にし、可変内部領域が種の分化を可能にするので、16S V3領域を第1の標的として選択した。病原性株及び単離されたE.coli及びPseudomonas aeruginosa gDNAのために5つの可能な標的化crRNAのパネルを設計した(図34A)。このアッセイは、E.coliまたはP.aeruginosaのgDNAを区別し得、他の種のcrRNAのバックグラウンドシグナルが低いことを示した(図34A、B)。
このアッセイが細菌病原体を区別するために使用し得るかを決定するために、保存された隣接領域がユニバーサルRPAプライマーを細菌種全体で使用することを可能にし、可変内部領域が種の分化を可能にするので、16S V3領域を第1の標的として選択した。病原性株及び単離されたE.coli及びPseudomonas aeruginosa gDNAのために5つの可能な標的化crRNAのパネルを設計した(図34A)。このアッセイは、E.coliまたはP.aeruginosaのgDNAを区別し得、他の種のcrRNAのバックグラウンドシグナルが低いことを示した(図34A、B)。
アッセイはまた、抗生物質耐性遺伝子などの目的の細菌遺伝子を迅速に検出及び区別するように適合してもよい。カルバペネム耐性腸内細菌(CRE)は、重要な新たな公衆衛生上の課題である(Gupta et al.,2011)。カルバペネム耐性遺伝子を検出するアッセイの能力を評価し、この試験で異なるカルバペネム耐性遺伝子を区別し得るかを評価した。Klebsiella pneumoniaは、Klebsiella pneumoniaeカルバペネマーゼ(KPC)またはニューデリーメタロ-ベータ-ラクタマーゼ1(NDM-1)耐性遺伝子のいずれかを保有する臨床分離株から得られ、遺伝子間を区別するためにcrRNAを設計した。全てのCREは、これらの耐性遺伝子を欠く細菌に対して有意なシグナルを示し(図35A)、耐性のKPC株とNDM-1株との間を有意に区別し得た(図35B)。
CRISPR RNA誘導RNaseの単一塩基ミスマッチ特異性
LshC2c2などのある特定のCRISPR RNA誘導RNaseオルソログは、単一塩基のミスマッチを容易に区別できないことが示されている。(Abudayyeh et al.,2016)。本明細書に実証されているように、LwC2c2もこの特徴を共有している(図37A)。LwC2c2切断の特異性を高めるために、crRNA:標的二重鎖に合成ミスマッチを導入するための系を開発し、ミスマッチに対する全体的な感度を高め、単一塩基のミスマッチ感度を可能にした。標的1の複数のcrRNAを設計し、crRNAの長さ全体にわたってミスマッチを含め(図37A)、オン標的切断を最適化し、単一のミスマッチが異なる標的の切断が最小限に抑えるようにした。これらのミスマッチは、ssRNA標的1の切断効率を低下させず、追加のミスマッチを含む標的(ssRNA標的2)のシグナルを有意に減少させた。標的1と2を最もよく区別する設計されたcrRNAには、標的2のミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれており、実質的に「バブル」が生じていた。標的に存在する合成ミスマッチ及び追加のミスマッチ(すなわち、ダブルミスマッチ)の調整によって引き起こされる感度の損失は、連続または近くのダブルミスマッチに対するLshC2c2の感度と一致し(Abudayyeh et al.,2016)、単一ヌクレオチドの区別を可能にするcrRNAの合理的な設計のためのフォーマットを示す(図37B)。
LshC2c2などのある特定のCRISPR RNA誘導RNaseオルソログは、単一塩基のミスマッチを容易に区別できないことが示されている。(Abudayyeh et al.,2016)。本明細書に実証されているように、LwC2c2もこの特徴を共有している(図37A)。LwC2c2切断の特異性を高めるために、crRNA:標的二重鎖に合成ミスマッチを導入するための系を開発し、ミスマッチに対する全体的な感度を高め、単一塩基のミスマッチ感度を可能にした。標的1の複数のcrRNAを設計し、crRNAの長さ全体にわたってミスマッチを含め(図37A)、オン標的切断を最適化し、単一のミスマッチが異なる標的の切断が最小限に抑えるようにした。これらのミスマッチは、ssRNA標的1の切断効率を低下させず、追加のミスマッチを含む標的(ssRNA標的2)のシグナルを有意に減少させた。標的1と2を最もよく区別する設計されたcrRNAには、標的2のミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれており、実質的に「バブル」が生じていた。標的に存在する合成ミスマッチ及び追加のミスマッチ(すなわち、ダブルミスマッチ)の調整によって引き起こされる感度の損失は、連続または近くのダブルミスマッチに対するLshC2c2の感度と一致し(Abudayyeh et al.,2016)、単一ヌクレオチドの区別を可能にするcrRNAの合理的な設計のためのフォーマットを示す(図37B)。
C2c2が一塩基ミスマッチを認識するように操作され得ることを実証したので、この操作された特異性を使用して、密接に関連するウイルス病原体を区別し得るかを決定した。複数のcrRNAを、アフリカまたはアメリカのジカウイルス株(図37A)及びデングウイルスの1または3株(図37C)のいずれかを検出するように設計した。これらのcrRNAは、スペーサー配列に合成ミスマッチを含んでおり、この合成ミスマッチが原因でオン標的の株に二重化されたときに単一のバブルを形成した。しかし、合成ミスマッチスペーサーがオフ標的株に二重化される場合、合成ミスマッチとSNPミスマッチが原因で2つの気泡が形成される。合成ミスマッチcrRNAは、オフ標的の株よりも有意に高いシグナルでそれらの対応する株を検出し、ロバストな株の区別を可能にした(図37B、37D)。菌株間の大幅な配列類似性に起因して、真の単一ヌクレオチド株の区別を実証するために、2つのゲノム間に単一ヌクレオチドの相違のみがある28ntの連続ストレッチを見つけることは不可能であった。しかし、LshC2c2(Abudayyeh et al.,2016)と同様に、より短いcrRNAでも機能することが予測され、それに応じて、スペーサー配列に合成ミスマッチを、及び標的配列にミスマッチを1つだけ含む、2つのジカ株の標的に対して、より短い23nt crRNAを設計した。これらのcrRNAは依然として、高感度でアフリカとアメリカのジカ株を区別し得た(図36C)。
唾液から精製されたDNAを使用した迅速な遺伝子型決定
ヒト唾液からの迅速な遺伝子型決定は、緊急の薬理ゲノム状況において、または在宅診断のために有用であり得る。本明細書に開示される実施形態の遺伝子型決定の可能性を実証するために、5つの遺伝子座を選択して、23andMe遺伝子型決定データをゴールドスタンダードとして使用してC2c2検出を基準に応じて評価した(Eriksson et al.,2010)(図38A)。5つの遺伝子座は、スタチンまたはアセトアミノフェンなどの薬物に対する感受性、ノロウイルス感受性、及び心疾患のリスクを含む、広範な機能的関連にまたがっている(表15)。
ヒト唾液からの迅速な遺伝子型決定は、緊急の薬理ゲノム状況において、または在宅診断のために有用であり得る。本明細書に開示される実施形態の遺伝子型決定の可能性を実証するために、5つの遺伝子座を選択して、23andMe遺伝子型決定データをゴールドスタンダードとして使用してC2c2検出を基準に応じて評価した(Eriksson et al.,2010)(図38A)。5つの遺伝子座は、スタチンまたはアセトアミノフェンなどの薬物に対する感受性、ノロウイルス感受性、及び心疾患のリスクを含む、広範な機能的関連にまたがっている(表15)。
4人のヒト対象から唾液を収集し、簡単な市販のキットを使用して1時間未満でゲノムDNAを精製した。4人の対象は、5つの遺伝子座にわたって遺伝子型の多様なセットを持っており、遺伝子型決定のアッセイを基準により評価する十分に広い試料スペースが得られた。5つのSNP遺伝子座のそれぞれについて、RPAと適切なプライマーを使用して対象のゲノムDNAを増幅した後、LwC2c2及びcrRNA対(2つの可能な対立遺伝子の1つを特異的に検出するように設計された)で検出した(図38B)。アッセイは、高い有意性で対立遺伝子を区別し、ホモ接合型とヘテロ接合型の両方の遺伝子型を推定するのに十分に特異的であった。検出前に唾液でDNA抽出プロトコルが実行されたので、このアッセイを試験して、95℃に加熱された唾液を5分間加熱して、それ以上抽出することなくPOC遺伝子型決定をさらに実施し得るかを判断した。このアッセイは、唾液を5分間のみ加熱し、その後増幅及びC2c2検出が行われた2人の患者の遺伝子型を正しく決定し得た(図40B)。
低対立遺伝子画分におけるcfDNAのがん性変異の検出
アッセイは標的の単一ヌクレオチドの違いに対して高度に特異的であるため、アッセイが無細胞DNA(cfDNA)のがん変異を検出するのに十分な感度であるかを判断するための試験を考案した。cfDNA断片は、野生型cfDNA画分のわずかな割合(0.1%~5%)である(Bettegowda et al.,2014;Newman et al.,2014;Olmedillas Lopez et al.,2016;Qin et al.,2016)。cfDNA分野での重要な課題は、これらの変異を検出することである。なぜなら、これらの変異は、血液中のバックグラウンドで高レベルの非変異DNAが検出されるため、通常、発見が難しいためである(Bettegowda et al.,2014;Newman et al.,2014;Qin et al.,2016)。POCでのcfDNAがん試験は、がんの存在の定期的なスクリーニング、特に寛解についてリスクがある患者のスクリーニングにも役立つ。
アッセイは標的の単一ヌクレオチドの違いに対して高度に特異的であるため、アッセイが無細胞DNA(cfDNA)のがん変異を検出するのに十分な感度であるかを判断するための試験を考案した。cfDNA断片は、野生型cfDNA画分のわずかな割合(0.1%~5%)である(Bettegowda et al.,2014;Newman et al.,2014;Olmedillas Lopez et al.,2016;Qin et al.,2016)。cfDNA分野での重要な課題は、これらの変異を検出することである。なぜなら、これらの変異は、血液中のバックグラウンドで高レベルの非変異DNAが検出されるため、通常、発見が難しいためである(Bettegowda et al.,2014;Newman et al.,2014;Qin et al.,2016)。POCでのcfDNAがん試験は、がんの存在の定期的なスクリーニング、特に寛解についてリスクがある患者のスクリーニングにも役立つ。
野生型バックグラウンドで変異体DNAを検出するアッセイの能力は、crRNA標的部位に単一変異を有するssDNA1のバックグラウンドでdsDNA標的1を希釈することにより決定された(図41A~B)。LwC2c2は、dsDNA1をバックグラウンドdsDNAの0.1%の低レベルまで、及びdsDNA1のアトモル濃度内で検知できた。この結果により、バックグラウンド変異体dsDNA1のLwC2c2切断が、0.1%の対立遺伝子画分でオン標的のdsDNAを確実に検出し得るのに十分低いことが示されている。0.1%未満のレベルでは、バックグラウンド活性が問題である可能性が高く、正しい標的をさらに大幅に検出することを妨げる。
アッセイは、臨床的に適切な範囲の対立遺伝子画分を有する合成標的を検知し得たので、このアッセイがcfDNAにおけるがん変異を検出し得るかを評価した。EGFR L858R及びBRAF V600Eという2つの異なるがん変異に対するRPAプライマーを設計し、実際のヒトcfDNA試料に似た、5%、1%、及び0.1%という対立遺伝子画分を用いて市販のcfDNA標準を用いて試験した。変異体対立遺伝子を野生型対立遺伝子から区別し得る一対のcrRNAを使用して(図38C)、両方の突然変異遺伝子座について0.1%対立遺伝子画分の検出を達成した(図39A~B)。
考察
C2c2の天然特性を、等温増幅及び消光蛍光プローブと組み合わせることにより、本明細書に開示されるアッセイ及び系は、RNA及びDNAを検出するための多目的でロバストな方法として実証され、感染性疾患適用及び迅速な遺伝子型決定を含む様々な迅速診断に適している。本明細書に開示されているアッセイ及び系の主な利点は、新しいPOC試験を1試験あたりわずか0.6ドルで数日で再設計及び合成し得るということである。
C2c2の天然特性を、等温増幅及び消光蛍光プローブと組み合わせることにより、本明細書に開示されるアッセイ及び系は、RNA及びDNAを検出するための多目的でロバストな方法として実証され、感染性疾患適用及び迅速な遺伝子型決定を含む様々な迅速診断に適している。本明細書に開示されているアッセイ及び系の主な利点は、新しいPOC試験を1試験あたりわずか0.6ドルで数日で再設計及び合成し得るということである。
多くのヒト疾患の適用は、単一のミスマッチを検出する能力を必要とするため、crRNAのスペーサー配列に合成ミスマッチを導入することにより、crRNAを標的配列の単一のミスマッチに高度に特異的に操作するための合理的なアプローチを開発した。CRISPRエフェクターで特異性を達成するための他のアプローチは、何十ものガイド設計のスクリーニングベースの方法に依存している(Chavez et al.,2016)。設計されたミスマッチcrRNAを使用して、単一のミスマッチ、ヒト唾液gDNAからのSNPの迅速な遺伝子型決定、及びcfDNA試料でのがん変異の検出が異なる、現場でのジカ及びデング熱ウイルス株の識別が実証された。
アッセイプラットフォームの低コスト及び適応性により、(i)Taqmanなどの特定のqPCRアッセイの代わりの一般的なRNA/DNA定量化経験、(ii)マイクロアレイに似た迅速な多重化RNA発現検出、及び(iii)食品中の他の発生源からの核酸汚染の検出など、他の高感度検出適用を含む、さらなる適用に向く。さらに、C2c2は、細胞などの生物学的設定内での転写産物の検出に潜在的に使用してもよく、C2c2検出の非常に特異的な性質を考えれば、転写産物の対立遺伝子特異的発現または生細胞における疾患関連変異を追跡することが可能であり得る。アプタマーの幅広い利用可能性により、アプタマーによるタンパク質の検出を、RPAの潜在的な増幅部位の解明とそれに続くC2c2検出と組み合わせることにより、タンパク質を検知することも可能であり得る。
CRISPR-Cas13a/C2c2による核酸検出:アトモル感度と単一ヌクレオチド特異性
ロバストなシグナル検出を実現するために、出願人は、Leptotrichia wadei(LwCas13a)由来のCas13aのオルソログを特定した。これは、Leptotrichia shahii Cas13a(LshCas13a)(10)と比較してより大きなRNA誘導RNase活性を示す(図2、上記の「LwCas13aの切断要件の特徴付け」も参照のこと)。ssRNA標的1(ssRNA1)、crRNA、及びレポーター(消光された蛍光RNA)とインキュベートされたLwCas13aは(図18)(13)、検出感度が約50fM(図51、15)であり、多くの診断適用に感度十分ではない(12、14~16)。したがって、出願人は、Cas13aベースの検出を、さまざまな等温増幅ステップと組み合わせることを検討した(図10、11、53、16)(17、18)。検討された方法のうち、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)(18)が最大の感度をもたらし、T7転写と組み合わせて、増幅されたDNAをRNAに変換し、LwCas13aによるその後の検出に使用し得る(上記の「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)及びその他の等温増幅戦略についての考察」も参照のこと)。出願人は、RPAによる増幅、増幅されたDNAからRNAへのT7 RNAポリメラーゼの転写、ならびにCas13aコラテラルRNA切断媒介性のレポーターシグナルの放出による標的RNAの検出のこの組み合わせをSHERLOCKと呼ぶ。
ロバストなシグナル検出を実現するために、出願人は、Leptotrichia wadei(LwCas13a)由来のCas13aのオルソログを特定した。これは、Leptotrichia shahii Cas13a(LshCas13a)(10)と比較してより大きなRNA誘導RNase活性を示す(図2、上記の「LwCas13aの切断要件の特徴付け」も参照のこと)。ssRNA標的1(ssRNA1)、crRNA、及びレポーター(消光された蛍光RNA)とインキュベートされたLwCas13aは(図18)(13)、検出感度が約50fM(図51、15)であり、多くの診断適用に感度十分ではない(12、14~16)。したがって、出願人は、Cas13aベースの検出を、さまざまな等温増幅ステップと組み合わせることを検討した(図10、11、53、16)(17、18)。検討された方法のうち、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)(18)が最大の感度をもたらし、T7転写と組み合わせて、増幅されたDNAをRNAに変換し、LwCas13aによるその後の検出に使用し得る(上記の「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)及びその他の等温増幅戦略についての考察」も参照のこと)。出願人は、RPAによる増幅、増幅されたDNAからRNAへのT7 RNAポリメラーゼの転写、ならびにCas13aコラテラルRNA切断媒介性のレポーターシグナルの放出による標的RNAの検出のこの組み合わせをSHERLOCKと呼ぶ。
RNA(逆転写と組み合わせた場合)またはDNA標的の検出のためのSHERLOCKの感度を、出願人は最初に決定した。デジタルドロップレットPCR(ddPCR)によって確認されたように、RNAとDNAの両方で単一分子の感度を達成した(図27、51、54A、B)。単一の反応で全てのSHERLOCK構成要素を組み合わせると、アトモル感度が維持され、ポイントオブケア(POC)診断としてこのプラットフォームの実行可能性が実証された(図54C)。RPAだけでは低レベルの標的を検出するのに十分な感度がなかったのに対し、SHERLOCKには、2つの確立された高感度な核酸検出アプローチであるddPCR及び定量PCR(qPCR)と同様の感度レベルがあり、(図55A~D)。さらに、複製全体の変動係数で測定すると、SHERLOCKでは、ddPCR、qPCR、RPAよりも変動が少ないことが示される(図55E~F)。
次に、出願人は、SHERLOCKが、高感度を必要とする感染症用途に有効であるかを調べた。出願人は、ジカウイルス(ZIKV)または関連フラビウイルスデング熱(DENV)のいずれかのゲノム断片を保有するレンチウイルスを作製した(19)(図31A)。SHERLOCKは、2aMまで低いウイルス粒子を検出し、ZIKVとDENVとの間を区別できた(図31B)。現場でのSHERLOCKの可能性のある使用を調査するために、出願人は、Cas13acrRNA複合体を凍結乾燥し、その後再水和(20)すると、20fMの非増幅ssRNA1を検出し得ること(図33A)、及びガラス繊維ペーパーでも標的検出が可能であることを最初に実証した(図。33B)。SHERLOCKの他の構成要素も凍結乾燥に適している:RPAは、大気温で凍結乾燥試薬として提供され、出願人は、T7ポリメラーゼが凍結乾燥に耐えることを以前に実証した(2)。Cas13a検出反応の凍結乾燥及びペーパースポッティングを組み合わせると、水性反応と同等レベルの感度でssRNA1を検出し得る(図33C~E)。ペーパーのスポッティング及び凍結乾燥により、読み取りの絶対シグナルがわずかに減少したが、SHERLOCK(図31C)は、20aM程度の低濃度の偽ZIKVウイルスを容易に検出できた(図31D)。SHERLOCKは、力価が2×103コピー/mL(3.2aM)程度に低い臨床分離株(血清、尿、または唾液)でも、ZIKVを検出し得る(21)。患者の血清または尿試料から抽出され、cDNAに逆転写されたZIKV RNA(図32E及び図52A)は、1.25×103コピー/mL(2.1aM)までの濃度で検出でき、qPCRによって確認された(図32F及び52B)。さらに、患者試料からのシグナルは、ZIKV RNAコピー数を予測するものであり、ウイルスロードの予測に使用され得る(図33F)。核酸精製なしの試料検出をシミュレートするために、ヒト血清にスパイクされたssRNA1の検出を測定し、Cas13aが2%もの血清を含む反応でRNAを検出し得ることを見出した(図33G)。本明細書に開示される実施形態のもう1つの重要な疫学的適用は、細菌性病原体の特定及び特定の細菌性遺伝子の検出である。出願人は、保存された隣接領域がユニバーサルRPAプライマーを、細菌種全体で使用可能にさせる16S rRNA遺伝子V3領域を標的とし、この可変内部領域は、種の分化を可能にする。異なる病原性菌株ならびにE.coli及びPseudomonas aeruginosaから分離されたgDNAの5つの可能な標的化crRNAのパネル(図34A)では、SHERLOCKは、菌株を正しく遺伝子型決定し、低い交差反応性を示した(図34B)。さらに、出願人は、SHERLOCKを使用して、以下の2つの異なる耐性遺伝子を有するKlebsiella pneumoniaeの臨床分離株を区別し得た:Klebsiella pneumoniaeカルバペナマーゼ(KPC)及びニューデリーメタロ-ベータ-ラクタマーゼ1(NDM-1)(22)(図56)。
SHERLOCKの特異性を高めるために、出願人は、LwCas13aが単一塩基のミスマッチによって異なる標的を区別し得る、crRNA:標的二重鎖に合成ミスマッチを導入した(図36A、B;上記「操作されたミスマッチの設計」も参照のこと)。出願人は、スペーサー配列に合成ミスマッチのある複数のcrRNAを設計して、アフリカまたはアメリカのZIKV株(図37A)及びDENVの株1または3(図37C)を検出した。合成ミスマッチcrRNAは、オフ標的株よりも有意に高いシグナル(両側スチューデントt検定;p<0.01)で対応する株を検出し、単一のミスマッチに基づいてロバストな株識別を可能にした(図37B、D、36C)。さらなる特徴付けにより、変異がスペーサーの3位にあり、合成ミスマッチが5位にある場合、Cas13a検出がオン標的感度を維持しながら最大の特異性を達成することが明らかになった(図57及び58)。単一塩基の相違を検出する能力により、SHERLOCKを使用して迅速な遺伝子型決定を行う機会が開かれる。健康関連の単一ヌクレオチド多型(SNP)(表1)の範囲にまたがる5つの遺伝子座を選択し、これらのSNPのゴールドスタンダードとして23andMe遺伝子型決定データを使用してSHERLOCK検出を基準に従って評価した(23)(図38A)。目的の遺伝子座全体で多様な遺伝子型を有する4例のヒト対象から唾液を収集し、市販のカラム精製または5分間の直接加熱により、ゲノムDNAを抽出した(20)。SHERLOCKは、ホモ接合型とヘテロ接合型の両方の遺伝子型を推定するのに高い有意性及び十分な特異性で対立遺伝子を識別した(図38B、40、59、60;上記の「合成標準を使用したSHERLOCKによる遺伝子型決定」も参照のこと)。最後に、SHERLOCKが無細胞(cf)DNA画分で低頻度のがん変異を検出し得るか否かを調べたが、これは、患者の血液中の野生型DNAのレベルが高いせいで困難である(24~26)。出願人は、最初に、SHERLOCKが、ゲノムDNAのバックグラウンドで希釈されたアトモル濃度のssDNA1を検出し得ることを見出した(図61)。次に、SHERLOCKが一塩基多型(SNP)を含む対立遺伝子(図41A、B)を、臨床的に関連する範囲であるバックグラウンドDNAの0.1%という低いレベルでも検出し得ることも判明した。次に、SHERLOCKが0.1%という低い対立遺伝子画分を含むニセのcfDNA試料で、2つの異なるがん変異(EGFR L858R及びBRAF V600E)を検出し得ることを示した(図38、39)(20)。
SHERLOCKプラットフォームは、(i)TaqManなどの特定のqPCRアッセイの代わりの一般的なRNA/DNA定量、(ii)迅速な多重RNA発現検出、及び(iii)他の高感度検出用途、例えば、核酸混入の検出を含むさらなる用途に役立つ。さらに、Cas13aは、潜在的に生物学的設定内の転写物を検出し、転写物の対立遺伝子特異的発現または生細胞における疾患関連変異を追跡し得る。SHERLOCKは、感染症の適用及び敏感な遺伝子型決定などの迅速な診断に適している、RNA及びDNAを検出するための多用途でロバストな方法であることを示した。試験されたほとんどあらゆるcrRNAが高い感度及び特異性になったので、SHERLOCKペーパー試験は、1試験あたりわずか0.61ドルで、信頼性をもって、数日で再設計及び合成され得る(上記の「SHERLOCKは、手頃な価格で適応性のあるCRISPR-Dxプラットフォームである」も参照のこと)。これらの品質によって、CRISPR-Dxの力が際立ち、生物学的分子の迅速でロバストで高感度な検出のための新しい道が開かれる。
実施例3-直交の塩基優先性によるCas13bオルソログの特徴付け
出願人は、RNA誘導RNA標的化酵素の最近定義されたVI型 CRISPR-Cas13bファミリーの14個のオルソログを生化学的に特徴付けて、SHERLOCK検出技術を改善するための新しい候補を見つけた(図83A及び85)。出願人は、E.coliで14のCas13bオルソログを異種発現し、タンパク質をインビトロ RNase活性アッセイのために精製し得た(図86)。異なるCas13オルソログは、最適な切断活性のためのさまざまな塩基優先性を有している可能性があるため、出願人は、直交切断優先性を評価するために5つのAs、Gs、Cs、またはUsからなる蛍光RNaseホモポリマーセンサーを生成した。出願人は、各オルソログを、合成173nt ssRNA 1を標的とする同種のcrRNAとインキュベートし、ホモポリマー蛍光センサーを使用してコラテラル切断活性を測定した(図83B及び図87)。
出願人は、RNA誘導RNA標的化酵素の最近定義されたVI型 CRISPR-Cas13bファミリーの14個のオルソログを生化学的に特徴付けて、SHERLOCK検出技術を改善するための新しい候補を見つけた(図83A及び85)。出願人は、E.coliで14のCas13bオルソログを異種発現し、タンパク質をインビトロ RNase活性アッセイのために精製し得た(図86)。異なるCas13オルソログは、最適な切断活性のためのさまざまな塩基優先性を有している可能性があるため、出願人は、直交切断優先性を評価するために5つのAs、Gs、Cs、またはUsからなる蛍光RNaseホモポリマーセンサーを生成した。出願人は、各オルソログを、合成173nt ssRNA 1を標的とする同種のcrRNAとインキュベートし、ホモポリマー蛍光センサーを使用してコラテラル切断活性を測定した(図83B及び図87)。
実施例4-ライブラリーを使用したモチーフ検出スクリーニング
様々なCas13a及びCas13bオルソログの切断優先の多様性をさらに調査するために、出願人は、コラテラル活性に応答してエンドヌクレアーゼ活性に好ましいモチーフを特徴付けるためのライブラリーベースのアプローチを開発した。出願人は、一定のDNAハンドルに隣接した縮重6マーRNAレポーターを使用し、これにより、非切断配列の増幅及び読み出しが可能になった(図83C)。このライブラリーをコラテラル活性化Cas13酵素と一緒にインキュベートすると、検出可能な切断が生じ、標的RNAの追加に依存していた(図88)。枯渇したモチーフの配列決定により、消化時間の経過に伴うライブラリーのスキューの増大が明らかになり(図89A)、塩基優先性が示され、閾値比を超える配列を選択すると、酵素の切断に対応する数の豊富な配列が生成された(図89B))。濃縮されたモチーフの配列ロゴは、LwaCas13a及びCcaCas13bで観察されたU優先性、ならびにPsmCas13bのA優先性を再現した(図89C)。出願人はまた、独立した読み出しを可能にするために、1つのオルソログのみで切断を示す(ただし他ではない)複数の配列を決定した(図89D)。
様々なCas13a及びCas13bオルソログの切断優先の多様性をさらに調査するために、出願人は、コラテラル活性に応答してエンドヌクレアーゼ活性に好ましいモチーフを特徴付けるためのライブラリーベースのアプローチを開発した。出願人は、一定のDNAハンドルに隣接した縮重6マーRNAレポーターを使用し、これにより、非切断配列の増幅及び読み出しが可能になった(図83C)。このライブラリーをコラテラル活性化Cas13酵素と一緒にインキュベートすると、検出可能な切断が生じ、標的RNAの追加に依存していた(図88)。枯渇したモチーフの配列決定により、消化時間の経過に伴うライブラリーのスキューの増大が明らかになり(図89A)、塩基優先性が示され、閾値比を超える配列を選択すると、酵素の切断に対応する数の豊富な配列が生成された(図89B))。濃縮されたモチーフの配列ロゴは、LwaCas13a及びCcaCas13bで観察されたU優先性、ならびにPsmCas13bのA優先性を再現した(図89C)。出願人はまた、独立した読み出しを可能にするために、1つのオルソログのみで切断を示す(ただし他ではない)複数の配列を決定した(図89D)。
酵素優先性の特定のサブモチーフを理解するために、出願人は、単一塩基優先性の枯渇モチーフを分析し(図90A)、これは、試験されたホモポリマーモチーフ及び2塩基モチーフと一致した(図83C及び図90B)。これらの2つの塩基モチーフは、特にLwaCas13a及びPsmCas13bの場合、TA、GA、及びATの2塩基配列を優先する、より複雑な優先性が明らかになる。より高次のモチーフによってまた、さらなる優先性が明らかになった(図91及び92)。
出願人は、LwaCas13a、PsmCas13b、及びCcaCas13bのコラテラル優先性を、標的のインビトロ消化で確認した(図93)。PsmCas13bの弱い消化を改善するために、出願人は、緩衝液組成と酵素濃度を最適化した(図94A、B)。PsmCas13b及びCas13bオルソログで試験された他のジカチオンは大きな影響を有さなかった(図95A-F)。出願人はまた、PsmCas13bを2つのRNA標的について以前に特徴付けられたA優先性Cas13ファミリーメンバーと比較し、同等または改善された感度を発見した(図96A、B)。これらの結果から、出願人は、独立したレポーターとの別々の反応で、LwaCas13aとPsmCas13bの反応速度論を比較し、2つのチャネル間のクロストークのレベルが低いことを発見した(図83D)。
実施例5-LwaCas13a、PsmCas13b、及びCcaCas13bによる単一分子の検出
SHERLOCK技術の重要な特徴は、それがLwaCas13aコラテラルRNアーゼ活性による単一分子検出(2aMまたは1分子/μL)を可能にすることである。Cas13b酵素の感度を特徴付けるために、出願人は、PsmCas13b及びCcaCas13b(ウリジンを優先する別の高活性Cas13b酵素)を使用してSHERLOCKを実行した(図83E)。出願人は、LwaCas13a、PsmCas13b、及びCcaCas13bが、2つの異なるRNA標的、sRNA 1及び合成ジカ ssRNAの2aM検出を達成できることを発見した(図83E、97、及び98)。これら3つの酵素による標的化のロバストネスを調査するために、出願人はssRNA 1に等間隔で配置された11の異なるcrRNAを設計し、LwaCas13aが最も一貫してシグナル検出を達成し、一方でCcaCas13bとPsmcas13bが両方ともcrRNAからcrRNAへの検出においてはるかに多様性を示したことを見出した(図99)。検出に最適なcrRNAを特定するために、出願人は、PsmCas13b及びCcaCas13bのスペーサー長を34-12ntから変更し、CsCas13bが28ntのスペーサー長を超える同等の感度を有していたのに対し、PsmCas13bは30のスペーサー長でピーク感度を有したことを見出した(図100)。出願人はまた、検出限界が2aMを超えてプッシュされ、SHERLOCKへのより大きな試料量の入力を可能にするか否かを試験した。増幅前のRPAステップをスケールアップすることにより、出願人は、LwaCas13aとPsmCas13bの両方が200、20、及び2zMの入力試料に対して有意な検出シグナルを提供し、250μL及び540μLのボリューム入力を可能にすることを発見した。
SHERLOCK技術の重要な特徴は、それがLwaCas13aコラテラルRNアーゼ活性による単一分子検出(2aMまたは1分子/μL)を可能にすることである。Cas13b酵素の感度を特徴付けるために、出願人は、PsmCas13b及びCcaCas13b(ウリジンを優先する別の高活性Cas13b酵素)を使用してSHERLOCKを実行した(図83E)。出願人は、LwaCas13a、PsmCas13b、及びCcaCas13bが、2つの異なるRNA標的、sRNA 1及び合成ジカ ssRNAの2aM検出を達成できることを発見した(図83E、97、及び98)。これら3つの酵素による標的化のロバストネスを調査するために、出願人はssRNA 1に等間隔で配置された11の異なるcrRNAを設計し、LwaCas13aが最も一貫してシグナル検出を達成し、一方でCcaCas13bとPsmcas13bが両方ともcrRNAからcrRNAへの検出においてはるかに多様性を示したことを見出した(図99)。検出に最適なcrRNAを特定するために、出願人は、PsmCas13b及びCcaCas13bのスペーサー長を34-12ntから変更し、CsCas13bが28ntのスペーサー長を超える同等の感度を有していたのに対し、PsmCas13bは30のスペーサー長でピーク感度を有したことを見出した(図100)。出願人はまた、検出限界が2aMを超えてプッシュされ、SHERLOCKへのより大きな試料量の入力を可能にするか否かを試験した。増幅前のRPAステップをスケールアップすることにより、出願人は、LwaCas13aとPsmCas13bの両方が200、20、及び2zMの入力試料に対して有意な検出シグナルを提供し、250μL及び540μLのボリューム入力を可能にすることを発見した。
実施例6-RPAを使用した定量的SHERLOCK
SHERLOCKは、指数関数的増幅に依存しているので、核酸の正確な定量は困難な場合がある。出願人は、RPAステップの効率を下げると、入力量とSHERLOCK反応のシグナルとの間の相関が改善され得ると仮定した。出願人は、SHERLOCK検出の動態は、ある範囲の試料濃度にわたってプライマー濃度に非常に敏感であることを観察した(図101A~D)。出願人はプライマー濃度を希釈し、シグナルと定量の両方の精度を向上させた(図83G及び101E)。この観察は、プライマーダイマー形成の減少による可能性があり、飽和を防ぎながらより効果的な増幅が可能になる。120nMのプライマー濃度は、シグナルと入力の間に最大の相関を示した(図101F)。この精度は、アトモル範囲までの広範囲の濃度にわたって持続可能であった(図83H及び101G)。
SHERLOCKは、指数関数的増幅に依存しているので、核酸の正確な定量は困難な場合がある。出願人は、RPAステップの効率を下げると、入力量とSHERLOCK反応のシグナルとの間の相関が改善され得ると仮定した。出願人は、SHERLOCK検出の動態は、ある範囲の試料濃度にわたってプライマー濃度に非常に敏感であることを観察した(図101A~D)。出願人はプライマー濃度を希釈し、シグナルと定量の両方の精度を向上させた(図83G及び101E)。この観察は、プライマーダイマー形成の減少による可能性があり、飽和を防ぎながらより効果的な増幅が可能になる。120nMのプライマー濃度は、シグナルと入力の間に最大の相関を示した(図101F)。この精度は、アトモル範囲までの広範囲の濃度にわたって持続可能であった(図83H及び101G)。
実施例7-直交性Cas13オルソログを使用した2色の多重化
核酸診断の有利な特徴は、複数の試料入力を同時に検出する能力であり、これにより、多重化された検出パネル、または試料制御が可能になる。Cas13酵素の直交性塩基優先性によって、SHERLOCKを多重化する機会となる。出願人は、異なる塩基同一性とフルオロフォアカラーの蛍光ホモポリマーセンサーを介して、同じ反応で異なるCas13酵素のコラテラル活性をアッセイし得、複数の標的を同時に測定可能である(図84A)。この概念を実証するために、出願人はジカウイルスssRNAに対するLwaCas13a crRNAとデングウイルスssRNAに対するPsmCas13b crRNAを設計した。出願人は、同じ反応におけるCas13-crRNA複合体の両方のセットを用いたこのアッセイによって、ジカもしくはデングのRNA、または両方が反応に存在するか否かを識別し得ることを発見した(図84B)。出願人はまた、CcaCas13bとPsmCas13bの間の直交の優先性のおかげで、これらの2つの酵素がジカ及びデングの標的の多重化検出にも利用され得ることを見出した(図102)。出願人は、この概念を、多重化されたRPAプライマーとCas13-crRNA複合体の両方を含む、SHERLOCK反応全体に拡張することに成功した。出願人は、P.aeruginosaに対するLwaCas13a crRNA及びS.aureusに対するPsmCas13b crRNAを設計し、両方のDNA標的をアトモル範囲まで検出し得た(図84C)。同様に、PsmCas13bとLwaCas13aの両方を使用すると、出願人は、SHERLOCKを使用して、ジカ及びデングのRNAのアトモルの多重化検出を達成し得た(図103)。
核酸診断の有利な特徴は、複数の試料入力を同時に検出する能力であり、これにより、多重化された検出パネル、または試料制御が可能になる。Cas13酵素の直交性塩基優先性によって、SHERLOCKを多重化する機会となる。出願人は、異なる塩基同一性とフルオロフォアカラーの蛍光ホモポリマーセンサーを介して、同じ反応で異なるCas13酵素のコラテラル活性をアッセイし得、複数の標的を同時に測定可能である(図84A)。この概念を実証するために、出願人はジカウイルスssRNAに対するLwaCas13a crRNAとデングウイルスssRNAに対するPsmCas13b crRNAを設計した。出願人は、同じ反応におけるCas13-crRNA複合体の両方のセットを用いたこのアッセイによって、ジカもしくはデングのRNA、または両方が反応に存在するか否かを識別し得ることを発見した(図84B)。出願人はまた、CcaCas13bとPsmCas13bの間の直交の優先性のおかげで、これらの2つの酵素がジカ及びデングの標的の多重化検出にも利用され得ることを見出した(図102)。出願人は、この概念を、多重化されたRPAプライマーとCas13-crRNA複合体の両方を含む、SHERLOCK反応全体に拡張することに成功した。出願人は、P.aeruginosaに対するLwaCas13a crRNA及びS.aureusに対するPsmCas13b crRNAを設計し、両方のDNA標的をアトモル範囲まで検出し得た(図84C)。同様に、PsmCas13bとLwaCas13aの両方を使用すると、出願人は、SHERLOCKを使用して、ジカ及びデングのRNAのアトモルの多重化検出を達成し得た(図103)。
出願人は、LwaCas13aが単一ヌクレオチドバリアント検出を可能にすること、及びこれをヒト唾液からの迅速な遺伝子型判定に適用し得ることを示したが、検出には各々の対立遺伝子検知crRNAについて1つという、2つの別々の反応が必要であった。単一反応のSHERLOCK遺伝子型決定を可能にするために、出願人は、G-対立遺伝子に対するLwaCas13a crRNA及びrs601338 SNPのA-対立遺伝子に対するPsmCas13b crRNA(ノロウイルス耐性と関連する、アルファ(1,2)-フコシルトランスフェラーゼ FUT2遺伝子のバリアントである)を設計した。この単一試料の多重化アプローチを使用して、出願人は唾液を使用して4つの異なるヒト対象を正常に遺伝子型決定し、それらがホモ接合型かヘテロ接合型かを正確に識別することが可能であった。
酵素のCas13ファミリーの多様性の例をさらに示すために、出願人は、付随する診断及び治療自体の両方として機能するCas13を含む治療アプローチをシミュレートした。出願人は最近、プログラム可能なAからIへの置換のためのRNA編集(RNA Editing for Programmable A to I Replacement)(REPAIR)と呼ばれるシステムを使用する、遺伝子疾患の変異の修正に使用され得る転写産物のプログラム可能なRNA編集用のPspCas13bを開発した。診断は治療法と組み合わせて治療の決定を導くか、または治療の転帰をモニターする場合に非常に役立つので、出願人は、REPAIR治療の指針として遺伝子型判定に、及びまた治療の編集効率を追跡するために編集されたRNAの読み取りとしてもSHERLOCKを用い得ると考えた(図84E)。出願人は、大腸及び直腸のがんを含む遺伝性疾患である家族性腺腫性ポリポーシス1におけるAPC変異(APC:c.1262G>A)を修正するために、このセラノスティック概念を実証することを選択した。出願人は、APC遺伝子の健康及び変異体のcDNAを設計し、これらをHEK293FT細胞にトランスフェクトした。出願人は、これらの細胞からDNAを採取し、LwaCas13a及びPsmCas13bによる単一試料の多重化SHERLOCKを使用して、正しい試料の遺伝子型決定に成功した(図84F)。同時に、出願人は、REPAIR系用のガイドRNAを設計及びクローニングし、ガイドRNA及びdPspCas13b-ADAR2dd(E488Q)REPAIR系で病気の遺伝子型を有する細胞をトランスフェクトした。48時間後、出願人はRNAを収穫し、ここで出願人はSHERLOCKへの入力用に分割して編集結果を検出し、次世代シーケンシング(NGS)分析用に編集率を確認した。配列決定により、出願人はREPAIR系(図84G)で43%の編集を達成し、SHERLOCKでこれを、健常を感知するcrRNA(非標的化ガイドコントロール条件よりも高いシグナルを示した)、及び疾患を感知するcrRNA(シグナルの減少を示した)として検出し得た(図84H及び104)。全体的に、このアッセイの試薬の設計及び合成には3日かかり、遺伝子型決定には1日かかり、REPAIRによる修正及び編集速度の検知には3日かかり、セラノスティックスパイプラインの合計は7日間だけであった。
出願人は、Leptotrichia wadeiからのVI型 RNAガイドRNA標的化RNA標的化CRISPR-Cas13aオルソログを使用して、核酸の非常に高感度で特異的な検出を実証した。出願人はさらに、Cas13bファミリーの酵素が生化学的に活性であり、SHERLOCKによる核酸の多重化検出を可能にさせる固有の特性を有することを示した。Cas13b酵素の直交性塩基優先を特徴付けることにより、出願人は、LwaCas13aが認識しないPsmCas13bによって認識される蛍光RNAセンサーの特定の配列を発見した。出願人は、これらの塩基優先性を活用して、2つの異なる標的の試料内多重化検出を可能にし、この機能がウイルス株の識別及び個人の遺伝子型決定に役立つことを示すことができた。さらに、前増幅ステップの操作により、SHERLOCKを定量的にし得、入力核酸濃度または定量の概算が可能になる。出願人はさらに、直交性PsmCas13bが単一分子の検出が可能であること、及び容積を拡大することにより、出願人が最大0.5mLかつ最低2zMの濃度まで試料の検出を実行し得ることを示した。
SHERLOCKを用いた多重化検出は、複数の反応を空間的に実行することによって可能であるが、直交性塩基優先性を介した試料内多重化により、多くの標的を大規模にかつより安価に検出することが可能になる。出願人はここで2入力多重化を示したが、切断モチーフスクリーニングは追加の直交性切断センサーの設計を可能にする(図90)。LwaCas13aとCcaCas13bは、どちらも同じウリジンホモポリマーを切断し、したがって、ホモポリマーセンサーで測定すると直交性ではない(図83B)が、モチーフスクリーニングによって非常に固有の切断優先性が示された(図90)。追加のCas13a、Cas13b、及びCas13cオルソログをスクリーニングすることにより、多くのオルソログは、理論的には、スペクトル的に固有の蛍光センサーの数によってのみ制限される高度に多重化されたSHERLOCKを可能にし得る、固有の6マーのモチーフの優先性を明らかにする可能性が高い。高度に多重化されたSHERLOCKは、多くの技術的適用、特に、複雑な入力検知及び論理計算を含むものを可能にする。
視覚的な、より感度が高く、多重化された読み出しのためのCas13ベースの検出のこれらの追加の改良により、特に携帯可能で機器を使わない分析が必要な状況では、核酸検出の適用の増大が可能になる。迅速多重化遺伝子型決定では、薬理ゲノミクスの決定、現場での複数の作物特性の試験、または共存する病原体の存在の評価に関して情報提供可能である。迅速な等温読み取りにより、循環DNAなどの希少種であっても、電源またはポータブルリーダーが利用できない設定でのこの検出のアクセス性が増大する。改良されたCRISPRベースの核酸試験により、農業、病原体検出、及び慢性疾患における核酸の存在を理解しやすくなる。
実施例8-SHERLOCK比色検出
DNA四重鎖は、生体分子分析物検出に使用され得る(図107)。1つの例では、OTAアプタマー(青)がOTAを認識し、構造変化を引き起こして、四重鎖(赤)を露出して、ヘミンに結合するようにする。ヘミン四重鎖複合体にはペルオキシダーゼ活性があり、TMB基質を着色された形(通常は溶液中では青色)に酸化し得る。出願人は、Cas13が本明細書に記載されているコラテラル活性の一部として分解し得る、これらの四重鎖のRNA形態を作成した。分解は、RNAアプタマーの損失を引き起こし、これによって核酸標的の存在下で色シグナルの損失を引き起こす。以下に2つの設計例を示す。
DNA四重鎖は、生体分子分析物検出に使用され得る(図107)。1つの例では、OTAアプタマー(青)がOTAを認識し、構造変化を引き起こして、四重鎖(赤)を露出して、ヘミンに結合するようにする。ヘミン四重鎖複合体にはペルオキシダーゼ活性があり、TMB基質を着色された形(通常は溶液中では青色)に酸化し得る。出願人は、Cas13が本明細書に記載されているコラテラル活性の一部として分解し得る、これらの四重鎖のRNA形態を作成した。分解は、RNAアプタマーの損失を引き起こし、これによって核酸標的の存在下で色シグナルの損失を引き起こす。以下に2つの設計例を示す。
グアニンは、四重鎖構造を生成する主要な塩基対を形成し、これが次にヘミン分子に結合する。出願人らは、グアニンのセットがウリジン(太字で示されている)で隔てられており、グアニンがほとんど分解されていないことをジヌクレオチドデータが示すとおり、Cas13が四重鎖を分解可能にした。
出願人らは、2つの異なる濃度で2つのアプタマー設計を試験した(図108)。低い100nM濃度では発色には不十分であった。400nMの状態は色を形成した。この分析で一致した吸光度データも定量化した(図109)。具体的には、デザイン1はb9で最高の結果を出し、デザイン2はLwaで最高の結果を出した。
出願人は、比色変化の安定性をさらに試験した(図110)。Cas13の比色変化は1時間後も安定している。LwaCas13aの比色シグナルは1時間以上安定しているが、Cas13b9の色差はそれほど安定していない。出願人は、1時間後、基質の酸化に起因して色が現れ、色の違いが観察され得るので、100nMのアプタマー条件でもCas13b9で機能することを観察した。
出願人は、比色検出を蛍光検出と比較した(図111)。2aMの濃度は、両方の系で検出できたが、バックグラウンドでの蛍光の増大は、バックグラウンドでの比色検出の減少よりも少なかった。これによって、比色分析がより感度の高い結果を提供し得ることが示される。
比色アッセイは、本明細書に記載されるような診断アッセイとしての使用に適用可能である。一実施形態では、四重鎖は、試験試料及びCas13 SHERLOCK系とインキュベートされる。インキュベーション期間後、Cas13による標的配列の同定を可能にし、コラテラル活性によるアプタマーの分解のために、基質を追加してもよい。次いで、吸光度を測定してもよい。他の実施形態では、基質は、四重鎖及びCas13 SHERLOCK系を用いたアッセイに含まれる。
本発明の記載された方法、薬学的組成物、及びキットの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明を具体的な実施形態に関連して説明してきたが、更なる改変が可能であること、請求される本発明はそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解される。実際、当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、かつ本発明が関係する技術内の公知の慣習に含まれ、本書において前に記載されている重要な特徴に適用され得、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適合を範囲に含むことを意図している。
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110> The BROAD Institute, Inc.
Massachusetts Institute of Technology
The President and Fellows of Harvard College
Abudayyeh, Omar
Gootenberg, Jonathan
Zhang, Feng
<120> CRISPR Effector System Based Diagnostics
<130> BROD-2505WP
<150> US 62/623,531
<151> 2018-01-29
<160> 622
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 1
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Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
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Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
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Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
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Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
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Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
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Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
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Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
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Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
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Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
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Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
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485 490 495
Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
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Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
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Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
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675 680 685
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Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu
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Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu
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Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
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820 825 830
Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser
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Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
850 855 860
Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu
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Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
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Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp
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Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile
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Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu
965 970 975
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Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys
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Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly
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Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn
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Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg
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Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val
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Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly
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Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
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Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
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Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser
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Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser
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Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu
1370 1375 1380
Asn Thr Asn Asp Thr Leu Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala
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Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
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Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr
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Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Lys Ile Ile Glu Asn
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<210> 2
<211> 1197
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 2
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1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
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Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn
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Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
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Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu
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Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu
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<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
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Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe
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Lys Lys Asn Asp Lys Glu Ile Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Thr Leu Gln
260 265 270
Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu
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Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro
290 295 300
Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile
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Gln Arg Ile Leu Gln Glu Gly Lys Leu Ala Ser Tyr Glu Ile Glu Ser
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Thr Val Asn Ser Asn Ser Leu Gln Lys Ile Lys Ile Glu Glu Ala Phe
355 360 365
Ala Leu Lys Phe Ile Asn Ala Cys Leu Phe Ala Ser Asn Asn Leu Arg
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450 455 460
Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val
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Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser
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Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe
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Leu Tyr Gln Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Lys Ile Asn His Phe Glu
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<212> PRT
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Lys Arg Gly Leu Lys Lys Leu Leu Met Asn Ala Phe Asp Leu Pro Tyr
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Glu Asp Phe Tyr His Val Arg Ala Lys Ser Gln Val Ser Arg Ser Ile
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Ile Thr Val Ser Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gly Asn Lys Arg Ser Ala
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Glu Lys Glu Ala Phe Lys Lys Phe Leu Ser Asp Tyr Ala Ser Leu Asp
275 280 285
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Leu Tyr Phe Tyr Gly Ser Asp Asp Ser Lys Leu Ser Asp Val Asn Glu
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595 600 605
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<211> 1385
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<213> Clostridium aminophilum DSM10710
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Lys Gln Leu Val Asn Ala Ile Arg Ala Asn Ile Ile Gln Gln Gly Lys
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Arg Ile Lys Thr Asn Glu Ala Phe Val Leu Asn Leu Thr Gly Thr Cys
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Asn Asp Ile Leu Gly Lys Gly Asp Phe Ile Lys Ser Leu Leu Lys Asp
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Asn Thr Asn Ser Gln Leu Tyr Ser Phe Phe Phe Gly Glu Gly Leu Ser
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<213> Leptotrichia wadei F0279
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn
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Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn
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Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile
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Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala
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Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu
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Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys
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Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys
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20 25 30
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Gln Trp Ile Ser Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Arg Lys Pro Asp Ser Arg
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100 105 110
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115 120 125
Leu Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Glu Pro Gln Ala Phe His Gly Arg
130 135 140
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Ala Ala Leu Tyr Glu His Leu His Val Asp Glu Lys Arg Ile Asp Gly
165 170 175
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Ser Ala Ala Gln Ala Phe Asp Pro Pro Arg Gln Val Ser Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Lys Val Gly Phe Ala Leu Ala Glu His Leu Glu Arg Val
260 265 270
Thr Gly Ser Lys Arg Cys Ser Phe Asp Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Leu Ala Leu His Asp Glu Val Lys Lys Thr Tyr Lys Arg Leu Cys Ala
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Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
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<211> 1285
<212> PRT
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<400> 14
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Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
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435 440 445
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450 455 460
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Leu Lys Thr Gly Glu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Ala Ala Pro Phe Asp
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
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Asp Leu Thr Ala Leu Val Asn Arg Ala Arg Glu Met Met Ala Tyr
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Asp Arg Lys Arg Lys Asn Ala Val Pro Arg Ser Ile Leu Asp Met
1085 1090 1095
Leu Ala Arg Leu Gly Leu Thr Leu Lys Trp Gln Met Lys Asp His
1100 1105 1110
Leu Leu Gln Asp Ala Thr Ile Thr Gln Ala Ala Ile Lys His Leu
1115 1120 1125
Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
1130 1135 1140
Ala Arg Phe Ser Gln Asp Tyr Leu Gln Met Val Ala Ala Val Phe
1145 1150 1155
Asn Gly Ser Val Gln Asn Pro Lys Pro Arg Arg Arg Asp Asp Gly
1160 1165 1170
Asp Ala Trp His Lys Pro Pro Lys Pro Ala Thr Ala Gln Ser Gln
1175 1180 1185
Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
1190 1195 1200
Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
1205 1210 1215
Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
1220 1225 1230
Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
1235 1240 1245
Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg Arg Tyr Arg Phe Arg Val
1250 1255 1260
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<210> 15
<211> 1285
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE442
<400> 15
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Lys Glu Leu Pro Ala His Leu Ser Ser Asp Pro Lys Ala Leu Ile Gly
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Gln Trp Ile Ser Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Arg Lys Pro Asp Ser Arg
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Phe Asp Ala Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Phe Trp Lys Leu Val Ser
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Glu Ala Gly Leu Ala Gln Asp Ser Asp Tyr Asp Gln Phe Lys Arg Arg
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Leu His Pro Tyr Gly Asp Lys Phe Gln Pro Ala Asp Ser Gly Ala Lys
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Leu Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Glu Pro Gln Ala Phe His Gly Arg
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Trp Tyr Gly Ala Met Ser Lys Arg Gly Asn Asp Ala Lys Glu Leu Ala
145 150 155 160
Ala Ala Leu Tyr Glu His Leu His Val Asp Glu Lys Arg Ile Asp Gly
165 170 175
Gln Pro Lys Arg Asn Pro Lys Thr Asp Lys Phe Ala Pro Gly Leu Val
180 185 190
Val Ala Arg Ala Leu Gly Ile Glu Ser Ser Val Leu Pro Arg Gly Met
195 200 205
Ala Arg Leu Ala Arg Asn Trp Gly Glu Glu Glu Ile Gln Thr Tyr Phe
210 215 220
Val Val Asp Val Ala Ala Ser Val Lys Glu Val Ala Lys Ala Ala Val
225 230 235 240
Ser Ala Ala Gln Ala Phe Asp Pro Pro Arg Gln Val Ser Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Lys Val Gly Phe Ala Leu Ala Glu His Leu Glu Arg Val
260 265 270
Thr Gly Ser Lys Arg Cys Ser Phe Asp Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Leu Ala Leu His Asp Glu Val Lys Lys Thr Tyr Lys Arg Leu Cys Ala
290 295 300
Arg Gly Lys Asn Ala Ala Arg Ala Phe Pro Ala Asp Lys Thr Glu Leu
305 310 315 320
Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
325 330 335
Val Arg Met Gly Arg Val Ser Glu Tyr Arg Gly Gln Gln Ala Gly Asp
340 345 350
Leu Ala Gln Ser His Tyr Trp Thr Ser Ala Gly Gln Thr Glu Ile Lys
355 360 365
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385 390 395 400
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Gly Tyr Val His Gly Leu Arg Asp Thr Arg Lys His Ala Phe Ala Thr
580 585 590
Lys Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Arg Glu Leu Asp Asp Pro Ala Thr
595 600 605
Lys Ala Arg Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Gly Pro Phe Arg
610 615 620
Ala Tyr Ala Ser Gly Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ala
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675 680 685
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740 745 750
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755 760 765
Ala Ala Leu Tyr Leu Val Met His Phe Val Pro Ala Ser Asp Val Ser
770 775 780
Asn Leu Leu His Gln Leu Arg Lys Trp Glu Ala Leu Gln Gly Lys Tyr
785 790 795 800
Glu Leu Val Gln Asp Gly Asp Ala Thr Asp Gln Ala Asp Ala Arg Arg
805 810 815
Glu Ala Leu Asp Leu Val Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Val Leu Phe
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
Arg Gly Leu Arg Gln Ile Ala Arg Tyr Asn His Met Ala Val Leu Ser
900 905 910
Asp Leu Phe Ala Lys His Lys Val Arg Asp Glu Glu Val Ala Arg Leu
915 920 925
Ala Glu Ile Glu Asp Glu Thr Gln Glu Lys Ser Gln Ile Val Ala Ala
930 935 940
Gln Glu Leu Arg Thr Asp Leu His Asp Lys Val Met Lys Cys His Pro
945 950 955 960
Lys Thr Ile Ser Pro Glu Glu Arg Gln Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Lys
965 970 975
Thr Ile Glu Glu His Arg Phe Leu Val Gly Arg Val Tyr Leu Gly Asp
980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
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1070 1075 1080
Asp Arg Lys Arg Lys Asn Ala Val Pro Arg Ser Ile Leu Asp Met
1085 1090 1095
Leu Ala Arg Leu Gly Leu Thr Leu Lys Trp Gln Met Lys Asp His
1100 1105 1110
Leu Leu Gln Asp Ala Thr Ile Thr Gln Ala Ala Ile Lys His Leu
1115 1120 1125
Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
1130 1135 1140
Ala Arg Phe Ser Gln Asp Tyr Leu Gln Met Val Ala Ala Val Phe
1145 1150 1155
Asn Gly Ser Val Gln Asn Pro Lys Pro Arg Arg Arg Asp Asp Gly
1160 1165 1170
Asp Ala Trp His Lys Pro Pro Lys Pro Ala Thr Ala Gln Ser Gln
1175 1180 1185
Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
1190 1195 1200
Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
1205 1210 1215
Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
1220 1225 1230
Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
1235 1240 1245
Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg Arg Tyr Arg Phe Arg Val
1250 1255 1260
Glu Ile Tyr Val Pro Pro Lys Ser Asn Thr Ser Lys Leu Asn Ala
1265 1270 1275
Ala Asp Leu Val Arg Ile Asp
1280 1285
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 19
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 20
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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aaugaug 67
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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caaguac 67
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cugaaag 67
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cugaaag 67
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accucaucgc cuuccucccc gcugaaag 28
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cuuaaag 67
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gugaaag 67
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auaacag 67
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<223> Synthetic
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aauccau 67
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<213> Artificial Sequence
<220>
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aauccau 67
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aauccau 67
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
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<212> RNA
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aauccau 67
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aauccau 67
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uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
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<223> Synthetic
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uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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aauccau 67
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uagauuggug uucuaccaag uaauccau 28
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aauccau 67
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<223> Synthetic
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uagauugcag uucuaccaag uaauccau 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauugcucu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 89
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 89
uagauugcuc uucuaccaag uaauccau 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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gcuguuc 67
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 92
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauuguucau gaugccagcu 60
gcuguuc 67
<210> 93
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
<400> 93
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 94
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguacuucau gaugccagcu 60
gccguuc 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 95
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 96
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 96
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gccguuc 67
<210> 97
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 97
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 98
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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uugaugu 67
<210> 99
<211> 28
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 99
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 100
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 100
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg guaaaauccc uucuggugug 60
uugaugu 67
<210> 101
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 101
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 102
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 102
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuaauccc uucuggugug 60
uuuaugu 67
<210> 103
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 103
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 104
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 104
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg ggaaaauccc uucuggugug 60
uuuaugu 67
<210> 105
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 105
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 106
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 106
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauacuucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 107
ggauacuuca ugaugccagc ugc 23
<210> 108
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 108
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauuguucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 109
ggauuguuca ugaugccagc ugc 23
<210> 110
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 110
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguacuucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 111
ggguacuuca ugaugccagc ugc 23
<210> 112
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 113
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
ggguuguuca ugaugccagc ugc 23
<210> 114
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 114
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu acuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
<210> 115
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 115
uacuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
<210> 116
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu auuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
<210> 117
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 117
uauuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
<210> 118
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
<210> 119
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
gacagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
<210> 120
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg auagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
<210> 121
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
gauagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
<210> 122
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ccgacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
<210> 123
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 123
accgacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
<210> 124
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cugacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
<210> 125
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
acugacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
<210> 126
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 126
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uacaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 127
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
cuacaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
<210> 128
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 128
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ugcaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 129
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
cugcaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
<210> 130
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 130
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 131
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 131
gagagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 132
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 132
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aaagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 133
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 133
gaaagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 134
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc caggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 135
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 136
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ccggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 137
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 138
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu caguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 139
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 140
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cuguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 141
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 142
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(44)
<223> N represents any nucleotide
<400> 142
gcaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 143
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(44)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 143
cgaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 144
<211> 70
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
uacccgggga uccucuagaa auauggauua cuugguagaa cagcaaucua cucgaccugc 60
aggcaugcaa 70
<210> 145
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 145
gcaaggggac naaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 146
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 146
tagattgctg 10
<210> 147
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
aagattgctg 10
<210> 148
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
ttgattgctg 10
<210> 149
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
tacattgctg 10
<210> 150
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
tagtttgctg 10
<210> 151
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
tagaatgctg 10
<210> 152
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
tagatagctg 10
<210> 153
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 153
tagattcctg 10
<210> 154
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
tagattggtg 10
<210> 155
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
tagattgcag 10
<210> 156
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
tagattgctc 10
<210> 157
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
cagcaatcta 10
<210> 158
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
cagcaatgta 10
<210> 159
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
cagctatgta 10
<210> 160
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 160
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 161
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 162
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 163
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 164
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 164
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa ccccguugug gauggaau 58
<210> 165
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 165
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 166
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 166
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 167
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 167
ggauacuuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 168
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 168
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa cccuguugug gauggaau 58
<210> 169
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 169
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 170
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 170
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 171
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 171
aaaugcugcu ggacaacauc aacacaccag aagggauuau accagcucuc uuugaacc 58
<210> 172
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 172
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 173
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 173
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 174
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp
<400> 174
aaaugcuccu ugacaacaua aacacaccag aagggauuau cccagcccuc uuugagcc 58
<210> 175
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 175
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 176
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 176
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 177
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 177
caccgcagca ugucaagauc acagauuuug ggcgggcca 39
<210> 178
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 178
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 179
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 179
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 180
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 180
caguaaaaau aggugauuuu ggucuagcua cagagaaau 39
<210> 181
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 181
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 182
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 182
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..()
<223> 3ThioM3-D
<400> 183
ttataactat tcctaaaaaa aaaaa 25
<210> 184
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5ThioMC6-D
<400> 184
aaaaaaaaaa ctcccctaat aacaat 26
<210> 185
<211> 45
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 185
ggguaggaau aguuauaauu ucccuuuccc auuguuauua gggag 45
<210> 186
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 187
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 187
ggttggtagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 188
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 188
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gttcatggtc atattggt 48
<210> 189
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 189
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gtgtggttgg ttcatggtca tattggt 57
<210> 190
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 190
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactac c 31
<210> 191
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 191
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuac 64
<210> 192
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 192
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaaag agagcaauuc gagacuacca 60
acca 64
<210> 193
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 193
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagac uaccaaccac agagacugug 60
guug 64
<210> 194
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 194
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta gatcgcatag tctcgaattg ctctctttca ctggcc 106
<210> 195
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 195
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta g 71
<210> 196
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 196
atcgcatagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 197
gaaattaata cgactcacta tagggatcgc aagcatatca ttgcgcttgc 50
<210> 198
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 198
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactat g 31
<210> 199
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 199
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuau 64
<210> 200
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 200
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagag caauucgaga cuaugcgauc 60
uaac 64
<210> 201
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 201
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacacua ugcgaucuaa ccguacagua 60
uuuu 64
<210> 202
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 202
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 203
ggttggtagt ctcgaattgc tctct 25
<210> 204
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 204
Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 205
Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro
1 5 10 15
<210> 206
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 206
Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Met Leu Tyr Ser Met Arg Asn Ser Ser Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 207
Ile Phe Arg Asn Glu Ile Asp His Phe His Tyr Phe Tyr Asp Arg
1 5 10 15
<210> 208
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 208
Leu Thr Asp Leu Lys Asp Val Ile Tyr Ser Met Arg Asn Asp Ser Phe
1 5 10 15
His Tyr
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 209
Glu Leu Arg Asn Tyr Ile Glu His Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe
1 5 10 15
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 210
Ala Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Glu Thr Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 211
Asp Val Arg Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Thr Ser
1 5 10 15
<210> 212
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 212
Ile Trp Ala Leu Arg Gly Ser Val Gln Gln Ile Arg Asn Glu Ile Phe
1 5 10 15
His Ser
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 213
Lys Ile Arg Asn Gln Thr Ala His Leu Ser Val Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
<210> 214
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 214
Leu Trp Ala Ile Arg Gly Ala Val Gln Arg Val Arg Asn Gln Ile Phe
1 5 10 15
His Gln
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 215
Glu Ile Arg Asn Asn Ile Ala His Leu His Val Leu Arg Asn Asp
1 5 10 15
<210> 216
<211> 18
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 216
Leu Trp Gly Ile Arg Gly Ala Val Gln Gln Ile Arg Asn Asn Val Asn
1 5 10 15
His Tyr
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 217
Asp Ile Arg Asn His Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Thr Lys Asp
1 5 10 15
<210> 218
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 218
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 219
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 220
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 220
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 221
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 222
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 222
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 223
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 224
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus SB 1003
<400> 224
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 225
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R12
<400> 226
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 227
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R121
<400> 227
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 228
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE442
<400> 228
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE-442
<400> 229
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 230
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 230
Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val
1 5 10 15
His Phe
<210> 231
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 231
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 232
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 232
Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile Ile
1 5 10 15
His Leu
<210> 233
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 233
Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn Tyr Leu Asn Gly Gln
1 5 10 15
<210> 234
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 234
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 235
uagaaugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 236
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUAGCUGUUCUACCAAGUAA
<400> 236
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 237
uagauagcug uucuaccaag uaa 23
<210> 238
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 238
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 239
uagauuccug uucuaccaag uaa 23
<210> 240
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 240
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaag 59
<210> 241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 241
aagauugcug uucuaccaag 20
<210> 242
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 242
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaag 59
<210> 243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 243
uugauugcug uucuaccaag 20
<210> 244
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 244
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaag 59
<210> 245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 245
uaguuugcug uucuaccaag 20
<210> 246
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 246
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaag 59
<210> 247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 247
uagaaugcug uucuaccaag 20
<210> 248
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 248
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaag 59
<210> 249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 249
uagauagcug uucuaccaag 20
<210> 250
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 250
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaag 59
<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UAGAUUCCUGUUCUACCAAG
<400> 251
uagauuccug uucuaccaag 20
<210> 252
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 252
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 253
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 253
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 254
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 254
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 255
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Seqeunce
<220>
<223> Synthetic
<400> 255
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 256
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 256
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uugauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 257
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 257
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 258
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 258
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uaguuugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 259
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 259
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 260
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 260
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagaaugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 261
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 261
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 262
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 262
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagauagcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 263
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 263
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 264
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 264
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cuagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 265
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 265
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 266
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 266
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca gaagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 267
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 267
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 268
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 268
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guugauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 269
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 269
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 270
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 270
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guaguuugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 271
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 271
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 272
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 272
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagaaugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 273
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 273
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 274
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 274
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagauagcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 275
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 275
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 276
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 276
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acuagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 277
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 277
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 278
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 278
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agaagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 279
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 279
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 280
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 280
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguugauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 281
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 281
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 282
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 282
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguaguuugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 283
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 283
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 284
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 284
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagaaugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 285
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 285
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 286
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 286
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagauagc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 287
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 287
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 288
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 288
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 289
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 289
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuagucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 290
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 290
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuaaucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 291
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 291
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuauucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 292
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 292
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 293
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 293
gagtacgtcc gcttcaccgg ctacccctgc tcctggacct tctaccacca cctccgccag 60
gagatcctcc aggagttcac cctgcacgac cacgtgcggg aggaggccca gaagttcctg 120
cggggcctgc aggtgaacgg gagccggccg ggcacctttg taggggtcca tgttcgccga 180
ggggactat 189
<210> 294
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 294
agcuggagug uuguuuggua ugggcaaagg gaugccauuc uacgcauggg acuuuggagu 60
cccgcugcua augauagguu gcuacucaca auuaacaccc cugacccuaa uaguggccau 120
cauuuugcuc guggcgcacu acauguacuu gaucccaggg cugcaggcag cagcugcgcg 180
ugcugcccag aagagaacgg cagcuggcau caugaagaac ccuguugugg auggaauagu 240
ggugacugac auugacacaa ugacaauuga cccccaagug gagaaaaaga ugggacaggu 300
gcuacucaua gcaguagccg ucuccagcgc caua 334
<210> 295
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 295
ggcagcuaua uugaugggac uugacaaggg auggccaaua ucgaagaugg acauaggagu 60
uccacuucuc gccuuagggu gcuauuccca ggugaaccca uugacacuga cagcggcggu 120
guugauguua guggcucauu augccauaau uggaccagga cugcaagcaa aggccacuag 180
agaagcucaa aaaaggacag cggccggaau aaugaaaaau ccaaccguag acgggauugu 240
ugcaauagac uuggauccug ugguuuauga uacaaaauuu gaaaaacagc uaggccaaau 300
aauguuacug auacuuugua caucacagau ccuc 334
<210> 296
<211> 337
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 296
gggagcugga guguuguuug guaugggcaa agggaugcca uucuacgcau gggacuuugg 60
agucccgcug cuaaugauag guugcuacuc acaauuaaca ccccugaccc uaauaguggc 120
caucauuuug cucguggcgc acuacaugua cuugauccca gggcugcagg cagcagcugc 180
gcgugcugcc cagaagagaa cggcagcugg caucaugaag aacccuguug uggauggaau 240
aguggugacu gacauugaca caaugacaau ugacccccaa guggagaaaa agaugggaca 300
ggugcuacuc auagcaguag ccgucuccag cgccaua 337
<210> 297
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 297
gggaaccuug auaguggcua ucauucugcu uguggcacac uauauguacu ugaucccagg 60
ccuacaggca gcagcagcgc gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa 120
ucccguugug gauggaauag ugguaacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 298
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 298
ggggacccua auaguggcca ucauuuugcu cguggcgcac uacauguacu ugaucccagg 60
gcugcaggca gcagcugcgc gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa 120
cccuguugug gauggaauag uggugacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 299
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 299
gggaguacau auucaggggc caaccucuca acaaugacga agaccaugcu cacuggacag 60
aagcaaaaau gcugcuggac aacaucaaca caccagaagg gauuauacca gcucucuuug 120
aaccagaaag ggagaaguca gccgccauag acggugaaua ccgccugaag ggu 173
<210> 300
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 300
gggaguacau uuacauggga cagccuucaa acaacgauga ggaucacgcu cauuggacag 60
aagcaaaaau gcuccuugac aacauaaaca caccagaagg gauuauccca gcccucuuug 120
agccggagag aggaaaaagu gcagcaauag acggggaaua cagacugcgg ggu 173
<210> 301
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 301
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 302
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 302
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcua uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 303
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 303
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 304
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 304
aagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 305
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 305
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 306
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 306
uugauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 307
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 307
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 308
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 308
uaguuugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 309
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptorichia buccalis C-1013-b
<400> 309
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly
405 410 415
Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn
420 425 430
Lys Lys Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp
435 440 445
Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile
450 455 460
Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe Asn Leu
465 470 475 480
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
565 570 575
Pro Lys Thr Asn Asp Asp Asn Lys Thr Lys Glu Ile Ile Asp Ala Gln
580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
595 600 605
Met Ser Asn Asn Gly Asn Phe Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ile Ile Glu
610 615 620
Leu Asn Lys Asn Asp Lys Arg Asn Leu Lys Thr Gly Phe Tyr Lys Leu
625 630 635 640
Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
Phe Met Thr Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Ile
690 695 700
Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
705 710 715 720
Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
725 730 735
Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
740 745 750
Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
755 760 765
Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
805 810 815
Glu Ala Asp Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Gly Asn Lys Val
820 825 830
Lys Asp Asn Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe
835 840 845
Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys
850 855 860
Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
885 890 895
Ile Glu Lys Asn His Lys Met Gln Glu Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala
900 905 910
Arg Pro Arg Lys Asp Glu Lys Phe Thr Asp Glu Asp Tyr Glu Ser Tyr
915 920 925
Lys Gln Ala Ile Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys
930 935 940
Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
945 950 955 960
Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
965 970 975
Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn Gln Tyr Ile Glu Glu Ile
980 985 990
Phe Asn Phe Glu Asn Lys Lys Asn Val Lys Tyr Lys Gly Gly Gln Ile
995 1000 1005
Val Glu Lys Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Leu His Gln Asn Asp
1010 1015 1020
Glu Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu
1025 1030 1035
Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His
1040 1045 1050
Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn
1070 1075 1080
Ala Val Met Lys Ser Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe
1085 1090 1095
Val Ala Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln
1100 1105 1110
Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys
1115 1120 1125
Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu
1130 1135 1140
Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met Glu Glu Lys Lys Ser Glu
1145 1150 1155
Asn
<210> 310
<211> 1285
<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 310
Met Lys Leu Thr Arg Arg Arg Ile Ser Gly Asn Ser Val Asp Gln Lys
1 5 10 15
Ile Thr Ala Ala Phe Tyr Arg Asp Met Ser Gln Gly Leu Leu Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Glu Asp Asn Asp Cys Thr Asp Lys Val Ile Glu Ser Met Asp
35 40 45
Phe Glu Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ile Leu Lys Asn Gly Glu Asp Asp
50 55 60
Lys Asn Pro Phe Tyr Met Phe Val Lys Gly Leu Val Gly Ser Asn Asp
65 70 75 80
Lys Ile Val Cys Glu Pro Ile Asp Val Asp Ser Asp Pro Asp Asn Leu
85 90 95
Asp Ile Leu Ile Asn Lys Asn Leu Thr Gly Phe Gly Arg Asn Leu Lys
100 105 110
Ala Pro Asp Ser Asn Asp Thr Leu Glu Asn Leu Ile Arg Lys Ile Gln
115 120 125
Ala Gly Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Pro Glu Leu Lys Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Met Ile Gln Lys Asp Ile Val Asn Arg Lys Glu Gln Leu Leu Lys
145 150 155 160
Ser Ile Lys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Ser Leu Glu Gly Ser Lys Leu
165 170 175
Val Pro Ser Thr Lys Lys Met Lys Trp Leu Phe Lys Leu Ile Asp Val
180 185 190
Pro Asn Lys Thr Phe Asn Glu Lys Met Leu Glu Lys Tyr Trp Glu Ile
195 200 205
Tyr Asp Tyr Asp Lys Leu Lys Ala Asn Ile Thr Asn Arg Leu Asp Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Lys Ala Arg Ser Ile Ser Arg Ala Val Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Arg Glu Tyr His Lys Asn Leu Arg Thr Asn Tyr Asn Arg Phe Val Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Pro Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gly Gly Ser Ala Lys Tyr
260 265 270
Asn Pro Asp Lys Glu Glu Phe Leu Leu Phe Leu Lys Glu Val Glu Gln
275 280 285
Tyr Phe Lys Lys Tyr Phe Pro Val Lys Ser Lys His Ser Asn Lys Ser
290 295 300
Lys Asp Lys Ser Leu Val Asp Lys Tyr Lys Asn Tyr Cys Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Val Val Lys Lys Glu Val Asn Arg Ser Ile Ile Asn Gln Leu Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ile Gln Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Asn Asp
340 345 350
Thr Trp Gln Glu Asp Phe Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Tyr Ile Gln
355 360 365
Val Glu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Val Met Thr Ser Leu Ser Trp Gly
370 375 380
Ile Asn Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ile Asp Asp Ser Asn Thr Val Lys
385 390 395 400
Phe Asp Asp Ile Thr Thr Lys Lys Ala Lys Glu Ala Ile Glu Ser Asn
405 410 415
Tyr Phe Asn Lys Leu Arg Thr Cys Ser Arg Met Gln Asp His Phe Lys
420 425 430
Glu Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Val Tyr Val Lys Asp Lys Lys Asp
435 440 445
Arg Pro Asp Asp Asp Ile Glu Asn Leu Ile Val Leu Val Lys Asn Ala
450 455 460
Ile Glu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Asn Arg Thr Phe His Phe Lys Glu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ser Gly
485 490 495
Gln Asn Lys Ile Asp Tyr Ser Val Ala Ala Glu Phe Ile Lys Arg Asp
500 505 510
Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val Phe Arg Glu Gln Ile Arg Ser Leu Gly
515 520 525
Ile Ala Glu Tyr Tyr Lys Ala Asp Met Ile Ser Asp Cys Phe Lys Thr
530 535 540
Cys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Tyr Ser Pro Lys Asn Ser Leu Met Pro
545 550 555 560
Ala Phe Lys Asn Val Tyr Lys Arg Gly Ala Asn Leu Asn Lys Ala Tyr
565 570 575
Ile Arg Asp Lys Gly Pro Lys Glu Thr Gly Asp Gln Gly Gln Asn Ser
580 585 590
Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Glu Leu Thr Trp Tyr Ile Glu Val
595 600 605
Lys Asn Asn Asp Gln Ser Tyr Asn Ala Tyr Lys Asn Leu Leu Gln Leu
610 615 620
Ile Tyr Tyr His Ala Phe Leu Pro Glu Val Arg Glu Asn Glu Ala Leu
625 630 635 640
Ile Thr Asp Phe Ile Asn Arg Thr Lys Glu Trp Asn Arg Lys Glu Thr
645 650 655
Glu Glu Arg Leu Asn Thr Lys Asn Asn Lys Lys His Lys Asn Phe Asp
660 665 670
Glu Asn Asp Asp Ile Thr Val Asn Thr Tyr Arg Tyr Glu Ser Ile Pro
675 680 685
Asp Tyr Gln Gly Glu Ser Leu Asp Asp Tyr Leu Lys Val Leu Gln Arg
690 695 700
Lys Gln Met Ala Arg Ala Lys Glu Val Asn Glu Lys Glu Glu Gly Asn
705 710 715 720
Asn Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Arg Asp Val Val Val Trp Ala Phe Gly
725 730 735
Ala Tyr Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Glu Leu Gln Pro
740 745 750
Pro Leu Ser Lys Glu Asn Ile Gly Leu Asn Asp Thr Leu Lys Glu Leu
755 760 765
Phe Pro Glu Glu Lys Val Lys Ser Pro Phe Asn Ile Lys Cys Arg Phe
770 775 780
Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Asp Asn Thr
785 790 795 800
Ser Ala Glu Ala Val Lys Thr Asp Gly Lys Glu Asp Glu Lys Asp Lys
805 810 815
Lys Asn Ile Lys Arg Lys Asp Leu Leu Cys Phe Tyr Leu Phe Leu Arg
820 825 830
Leu Leu Asp Glu Asn Glu Ile Cys Lys Leu Gln His Gln Phe Ile Lys
835 840 845
Tyr Arg Cys Ser Leu Lys Glu Arg Arg Phe Pro Gly Asn Arg Thr Lys
850 855 860
Leu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Met Glu
865 870 875 880
Leu Val Arg Phe Thr Met Pro Ser Ile Pro Glu Ile Ser Ala Lys Ala
885 890 895
Glu Ser Gly Tyr Asp Thr Met Ile Lys Lys Tyr Phe Lys Asp Phe Ile
900 905 910
Glu Lys Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Thr Ser Asn Leu Tyr Tyr His
915 920 925
Ser Asp Ser Lys Thr Pro Val Thr Arg Lys Tyr Met Ala Leu Leu Met
930 935 940
Arg Ser Ala Pro Leu His Leu Tyr Lys Asp Ile Phe Lys Gly Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Ile Thr Lys Lys Glu Cys Leu Glu Tyr Ile Lys Leu Ser Asn Ile
965 970 975
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Arg Phe Glu Ala Ile Phe Asn Asn Asn Asp Asp Asn Asn Asp Gly
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<210> 313
<211> 1334
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium NK4A144
<400> 313
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Gly Ser Leu Arg Ser Tyr Ile Gln Tyr Ala Glu Asp Ile Glu Arg Arg
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<210> 321
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<212> PRT
<213> Bacterioides ihuae
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<213> Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA
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<213> Insolitispirillum peregrinum
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<400> 325
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1 5 10 15
Gly Lys Leu Xaa Lys Xaa Val Asn Glu Arg Asn Arg Xaa Ala Lys Arg
20 25 30
Leu Ser Asn Xaa Leu Asx Lys Tyr Ile Xaa Xaa Ile Asp Lys Ile Xaa
35 40 45
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50 55 60
Lys Leu Asn Gln Xaa Xaa Xaa Asx Xaa Leu Xaa Lys Ala Xaa Xaa Asp
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Leu Xaa Lys Ile Glu Ser Xaa Lys Tyr Ser Tyr Gln Lys Xaa
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Xaa Leu Asp Pro Arg Met Glu Xaa Leu Ala
165 170 175
Lys Leu Arg Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Xaa
180 185 190
Ile Xaa Xaa Glu Glu Glu Xaa Asn Val Xaa Xaa His Lys Xaa Leu Lys
195 200 205
Glu Asn His Pro Asp Phe Val Glu Xaa Xaa Xaa Asn Lys Glu Asn Ala
210 215 220
Glu Leu Asn Xaa Tyr Ala Ile Glu Xaa Lys Lys Xaa Leu Lys Tyr Tyr
225 230 235 240
Phe Pro Xaa Lys Xaa Ala Lys Asn Ser Asn Asp Lys Ile Phe Glu Lys
245 250 255
Gln Glu Leu Lys Lys Xaa Trp Ile His Gln Xaa Glu Asn Ala Val Glu
260 265 270
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275 280 285
Tyr Leu Ala Glu Leu Trp Lys Ile Arg Ile Asn Glu Ile Phe Ile Lys
290 295 300
Tyr Ile Xaa Val Gly Lys Ala Val Ala Xaa Phe Ala Leu Arg Asn Xaa
305 310 315 320
Xaa Lys Asx Glu Asn Asp Ile Leu Gly Gly Lys Ile Xaa Lys Lys Leu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Gly Ala Ser Asn Trp Asp Xaa Phe Leu Phe Phe His Phe Ala Thr
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Val Arg Xaa Asx Phe Pro Gln Asn Leu Leu Lys Lys Phe Asn Asp Glu
465 470 475 480
Lys Asp Asp Glu Ala Tyr Ser Ala Xaa Tyr Tyr Leu Leu Lys Glu Ile
485 490 495
Tyr Tyr Asn Xaa Phe Leu Pro Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Xaa Phe Phe
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Glu Glu Lys Glu Xaa Asp Phe Ile Lys Phe Leu Leu Gln Ile Phe Xaa
565 570 575
Lys Gly Phe Asp Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Xaa Xaa Phe Ile Leu Lys
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Leu Gly Xaa Phe Xaa Ser Tyr Leu Lys Leu Leu Asp Asp Ile Glu Leu
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Arg Ala Leu Arg Asn Glu Asn Ile Lys Tyr Gln Ser Ser Asn Xaa Glu
645 650 655
Lys Glu Val Leu Glu Xaa Cys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Ser Leu
660 665 670
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675 680 685
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Xaa Lys Ser Leu Ile Asn Ile Leu Leu
930 935 940
Arg His Gly Met Val Leu Lys Phe Lys Phe Gly Thr Asp Lys Lys Ser
945 950 955 960
Val Xaa Ile Arg Ser Xaa Lys Lys Ile Xaa His Leu Lys Ser Ile Ala
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<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 326
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Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
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50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
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130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
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370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
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Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
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420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
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Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
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Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp
1010 1015 1020
Gly Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp
1025 1030 1035
Phe Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys
1040 1045 1050
Tyr Glu Glu Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser
1055 1060 1065
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
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1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
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Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 327
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 327
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1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
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Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
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Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
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65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
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Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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675 680 685
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Lys Thr Lys Pro Lys Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Lys
740 745 750
His Arg Glu Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
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Lys Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu
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Asn Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu
835 840 845
Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met
850 855 860
Glu Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr
885 890 895
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915 920 925
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930 935 940
Phe Thr Val Tyr Ile Glu Glu Lys Gly Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser
965 970 975
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Asn Asp Val Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His
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Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asn Thr Ser Glu Glu Lys Gly Leu
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1100 1105 1110
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<210> 328
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 328
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1 5 10 15
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
325 330 335
Ile Phe Ser Asp Asp Tyr Asn Ala Glu Glu Glu Pro Phe Lys Asn Thr
340 345 350
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro His Tyr His Leu Glu Asn Glu Lys Ile Gly Ile Lys Phe Cys Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Gly Arg Ser Lys Phe Asn Leu Gly Thr Gln Phe Thr Ala Glu Ala Phe
485 490 495
Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu
500 505 510
Thr Lys Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Ser Ala Asp Lys Val Glu Gly Ile
515 520 525
Ile Arg Lys Glu Ile Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala
530 535 540
Asn Asn Glu Ile Asn Ser Ile Ala Asp Leu Thr Arg Arg Leu Gln Asn
545 550 555 560
Thr Asn Ile Leu Gln Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Ser Ile Leu
565 570 575
Lys Gly Arg Gln Lys Asp Met Gly Lys Glu Ala Glu Arg Lys Ile Gly
580 585 590
Glu Met Ile Asp Asp Thr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Leu Cys Lys Gln
595 600 605
Thr Asn Gln Lys Ile Arg Ile Gly Lys Arg Asn Ala Gly Leu Leu Lys
610 615 620
Ser Gly Lys Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln
625 630 635 640
Pro Val Gln Lys Asp Gln Asn Asn Ile Pro Ile Asn Asn Ser Lys Ala
645 650 655
Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly
660 665 670
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675 680 685
Gly Asn Asp Asn Pro His Pro Phe Leu Ala Glu Thr Gln Trp Glu His
690 695 700
Gln Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Arg Lys
705 710 715 720
Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Pro Gln Asn Trp Lys Gln Tyr Gln His
725 730 735
Phe Leu Ile Leu Lys Val Gln Lys Thr Asn Arg Asn Thr Leu Val Thr
740 745 750
Gly Trp Lys Asn Ser Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Gln Pro
755 760 765
Ile Arg Glu Trp Phe Glu Lys His Asn Asn Ser Lys Arg Ile Tyr Asp
770 775 780
Gln Ile Leu Ser Phe Asp Arg Val Gly Phe Val Ala Lys Ala Ile Pro
785 790 795 800
Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Asn Val Gln Pro Phe Tyr Asp
805 810 815
Tyr Pro Phe Asn Ile Gly Asn Arg Leu Lys Pro Lys Lys Arg Gln Phe
820 825 830
Leu Asp Lys Lys Glu Arg Val Glu Leu Trp Gln Lys Asn Lys Glu Leu
835 840 845
Phe Lys Asn Tyr Pro Ser Glu Lys Lys Lys Thr Asp Leu Ala Tyr Leu
850 855 860
Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys
865 870 875 880
Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Met Phe Lys Glu Leu Phe Asn Met
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
Asn Ile Leu Lys Glu Arg Pro Leu Ala Thr Phe Tyr Ile Glu Glu Thr
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Lys Tyr Gln Thr Thr Arg Ile Ser Ile Phe Glu Met Thr Leu Gly
1010 1015 1020
Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Pro Thr Asp
1025 1030 1035
Ser Phe Arg Asn Met Leu Glu Arg Trp Leu Gln Cys Lys Ala Asn
1040 1045 1050
Arg Pro Glu Leu Lys Asn Tyr Val Asn Ser Leu Ile Ala Val Arg
1055 1060 1065
Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Ala Thr Leu
1070 1075 1080
Phe Ala Glu Val Lys Lys Phe Thr Leu Phe Pro Ser Val Asp Thr
1085 1090 1095
Lys Lys Ile Glu Leu Asn Ile Ala Pro Gln Leu Leu Glu Ile Val
1100 1105 1110
Gly Lys Ala Ile Lys Glu Ile Glu Lys Ser Glu Asn Lys Asn
1115 1120 1125
<210> 329
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 329
Met Asn Thr Val Pro Ala Ser Glu Asn Lys Gly Gln Ser Arg Thr Val
1 5 10 15
Glu Asp Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Leu Tyr Leu Asn Leu Ala Arg Glu
20 25 30
Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
50 55 60
Leu Ser Val Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
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His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
145 150 155 160
Gln Ser Arg Phe Ala Val Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
165 170 175
Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
180 185 190
Leu Thr Val Ser Gly Phe Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
195 200 205
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210 215 220
Asp Glu Asn Trp Ala Arg Ala Val His Glu Thr Phe Cys Asp Leu Cys
225 230 235 240
Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
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Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
260 265 270
Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
275 280 285
Asp Glu Asn Ser Met Asn Asn Leu Ser Glu Asn Ser Leu Asp Glu Glu
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Ser Arg Leu Leu Trp Asp Gly Ser Ser Asp Trp Ala Glu Ala Leu Thr
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Lys Arg Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Leu Met Leu Arg Phe
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Ile Glu Glu Met Asp Leu Leu Lys Gly Ile Arg Phe Arg Val Asp Leu
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355 360 365
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385 390 395 400
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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565 570 575
Tyr Val Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys Arg Leu Arg Leu Arg Lys Phe
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Glu Leu Leu Lys Val Lys Asp Gly Lys Lys Lys Trp Asn Glu Ala Phe
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Lys Asp Trp Trp Ser Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Met Gln Pro Phe Tyr
785 790 795 800
Gly Leu Arg Arg Glu Leu Asn Ile His Gly Lys Ser Val Ser Tyr Ile
805 810 815
Pro Ser Asp Gly Lys Lys Phe Ala Asp Cys Tyr Thr His Leu Met Glu
820 825 830
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835 840 845
Val Pro Pro Asp Leu Ala Ala Asp Ile Lys Arg Ser Phe His Arg Ala
850 855 860
Val Asn Glu Arg Glu Phe Met Leu Arg Leu Val Gln Glu Asp Asp Arg
865 870 875 880
Leu Met Leu Met Ala Ile Asn Lys Met Met Thr Asp Arg Glu Glu Asp
885 890 895
Ile Leu Pro Gly Leu Lys Asn Ile Asp Ser Ile Leu Asp Glu Glu Asn
900 905 910
Gln Phe Ser Leu Ala Val His Ala Lys Val Leu Glu Lys Glu Gly Glu
915 920 925
Gly Gly Asp Asn Ser Leu Ser Leu Val Pro Ala Thr Ile Glu Ile Lys
930 935 940
Ser Lys Arg Lys Asp Trp Ser Lys Tyr Ile Arg Tyr Arg Tyr Asp Arg
945 950 955 960
Arg Val Pro Gly Leu Met Ser His Phe Pro Glu His Lys Ala Thr Leu
965 970 975
Asp Glu Val Lys Thr Leu Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Cys Arg Ile Lys
980 985 990
Ile Phe Asp Trp Ala Phe Ala Leu Glu Gly Ala Ile Met Ser Asp Arg
995 1000 1005
Asp Leu Lys Pro Tyr Leu His Glu Ser Ser Ser Arg Glu Gly Lys
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Leu Ile Tyr Arg Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Ser Ile Glu Gly
1070 1075 1080
Ser Ser Ala Lys Asp Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser
1085 1090 1095
Leu Trp Lys Lys Tyr Glu Met Ile Ile Arg Lys Ile Leu Pro Ile
1100 1105 1110
Leu Asp Pro Glu Asn Arg Phe Phe Gly Lys Leu Leu Asn Asn Met
1115 1120 1125
Ser Gln Pro Ile Asn Asp Leu
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<211> 1115
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<213> Bacterioides pyogenes
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115 120 125
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Lys Val Lys Asp Gly Lys Val Met Lys Thr Phe Val Glu Tyr Asp Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ser Asp Phe Gly Leu Leu Tyr Phe Cys Val Leu Phe Leu Ser Lys
290 295 300
Pro Tyr Ala Lys Leu Phe Ile Asp Glu Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ser
305 310 315 320
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325 330 335
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Gln Glu Val Ala Asp Lys Arg Met Asp Lys Trp Gly Asp Leu Ile Gln
465 470 475 480
Lys Arg Glu Glu Arg Ser Val Lys Leu Glu His Glu Glu Leu Tyr Ile
485 490 495
Asn Leu Asp Gln Phe Leu Glu Asp Thr Ala Asp Ser Thr Pro Tyr Val
500 505 510
Thr Asp Arg Arg Pro Ala Tyr Asn Ile His Ala Asn Arg Ile Gly Leu
515 520 525
Tyr Trp Glu Asp Ser Gln Asn Pro Lys Gln Tyr Lys Val Phe Asp Glu
530 535 540
Asn Gly Met Tyr Ile Pro Glu Leu Val Val Thr Glu Asp Lys Lys Ala
545 550 555 560
Pro Ile Lys Met Pro Ala Pro Arg Cys Ala Leu Ser Val Tyr Asp Leu
565 570 575
Pro Ala Met Leu Phe Tyr Glu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Asp Asn Glu
580 585 590
Phe Pro Ser Ala Glu Gln Val Ile Ile Glu Tyr Glu Asp Asp Tyr Arg
595 600 605
Lys Phe Phe Lys Ala Val Ala Glu Gly Lys Leu Lys Pro Phe Lys Arg
610 615 620
Pro Lys Glu Phe Arg Asp Phe Leu Lys Lys Glu Tyr Pro Lys Leu Arg
625 630 635 640
Met Ala Asp Ile Pro Lys Lys Leu Gln Leu Phe Leu Cys Ser His Gly
645 650 655
Leu Cys Tyr Asn Asn Lys Pro Glu Thr Val Tyr Glu Arg Leu Asp Arg
660 665 670
Leu Thr Leu Gln His Leu Glu Glu Arg Glu Leu His Ile Gln Asn Arg
675 680 685
Leu Glu His Tyr Gln Lys Asp Arg Asp Met Ile Gly Asn Lys Asp Asn
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Asp Lys Glu Lys Gly His Asp Lys Leu Thr Gly Leu Asn Tyr Asn Val
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Leu Thr Ala Tyr Leu Ala Thr Tyr Gly His Pro Gln Val Pro Glu Glu
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Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Ile Gln Ser Leu Ser Ser Asn Pro Ser
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835 840 845
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1310 1315 1320
<210> 334
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemeralla anatipesifer
<400> 334
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1 5 10 15
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Leu Ser Arg Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn
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Ala Glu Thr Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser
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Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
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885 890 895
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900 905 910
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1085 1090 1095
<210> 335
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<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 335
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485 490 495
Arg Asn Ile Phe Lys Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn
500 505 510
Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Asp Lys Gly Ile Pro Lys
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Lys Glu Lys
565 570 575
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580 585 590
Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp Glu Glu Cys Asn Asn Ile Leu Thr
660 665 670
Phe Tyr Tyr Ser Tyr Leu Thr Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu
675 680 685
Lys Pro Glu Asp Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu
690 695 700
Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe
705 710 715 720
Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
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740 745 750
Arg Val Gly Leu Val Thr Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Glu Glu
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785 790 795 800
Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
805 810 815
Ile Glu Leu Trp Asp Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Glu
820 825 830
Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
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Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
Leu Arg Leu Asn Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn
900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
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930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
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1100 1105 1110
Lys Lys Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120
<210> 336
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 336
Met Glu Asp Lys Pro Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His
1 5 10 15
Asn Val Tyr Leu Thr Val Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Asp Leu Glu
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100 105 110
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Phe Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Gln Asp Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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405 410 415
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420 425 430
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565 570 575
Ile Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Asp Leu Leu Lys Gly His Gln
580 585 590
Arg Asp Met Leu Lys Ala Val Glu Gln Lys Lys Ala Met Leu Ile Lys
595 600 605
Asp Thr Glu Arg Arg Leu Lys Leu Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gln Glu
610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
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740 745 750
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755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
Trp Phe Asn Glu His Lys Thr Ile Val Asp Ile Ser Asp Cys Asp Ile
785 790 795 800
Phe Lys Asn Arg Val Gly Gln Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Phe Phe
805 810 815
Asp Lys Lys Phe Lys Asp His Ser Gln Pro Phe Tyr Arg Tyr Asp Phe
820 825 830
Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
850 855 860
Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
1010 1015 1020
Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
1025 1030 1035
Ile Asp Ile Phe Gln Gln Thr Leu Gly Leu Glu Ala Gln Leu Leu
1040 1045 1050
Asp Lys Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu
1055 1060 1065
Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1085 1090 1095
Gln Tyr Pro Asp Ser Lys Lys Ile Ala Phe Arg Arg Ile Arg Lys
1100 1105 1110
Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 337
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 337
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
Tyr Gln His Leu Ser Thr Thr Gln Gln Asn Ser Phe Ile Glu Asp Trp
355 360 365
Asn Glu Tyr Tyr Lys Asp Tyr Glu Asp Asp Val Glu Thr Asp Asp Leu
370 375 380
Ser Arg Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Arg Phe
385 390 395 400
Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asp Tyr Val His Asp Arg Arg Thr
420 425 430
Lys Gln Leu Gly Lys Val Glu Ser Asp Arg Ile Ile Lys Glu Lys Val
435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
465 470 475 480
Thr Leu Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Pro Lys Glu His Thr Leu
485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
500 505 510
Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
515 520 525
Arg Lys Ser Leu Asn Pro Lys Glu Arg Ser Ala Thr Lys Ala Ser Lys
530 535 540
Tyr Asp Ile Ile Thr Gln Ile Ile Glu Ala Asn Asp Asn Val Lys Ser
545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
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705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
Val Lys Asn Ser Ile Gly Thr Pro Gln Phe Lys Thr Val Arg Lys Glu
785 790 795 800
Cys Phe Thr Phe Leu Lys Lys Ser Asn Tyr Thr Val Val Ser Leu Asp
805 810 815
Lys Gln Val Glu Arg Ile Leu Ser Met Pro Leu Phe Ile Glu Arg Gly
820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
835 840 845
His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
Lys Asn Asp Val Phe Thr Leu Met Met Val Asn Tyr Met Leu Glu Glu
900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
915 920 925
Gln Thr Lys Glu Glu Arg Ile Val Asn Lys Gln Val Ala Lys Asp Thr
930 935 940
Gln Glu Arg Asn Lys Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Val Val Asp Leu Gln
945 950 955 960
Leu Cys Asp Gly Leu Val His Ile Asp Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile
965 970 975
Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
980 985 990
Thr Tyr Gln Ser Asp Ile Val Trp Ser Ala Tyr Leu Ser Asn Glu Val
995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr
1010 1015 1020
Glu Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile
1025 1030 1035
Glu Cys Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys
1040 1045 1050
Gln Ser Gly Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu
1055 1060 1065
Leu Pro Ile Gly Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr
1070 1075 1080
Asp Val Lys Phe Lys Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Gly Gln Ala
1085 1090 1095
Gly Glu Val Glu Gln Asp Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn
1100 1105 1110
Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe
1115 1120 1125
Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala
1130 1135 1140
Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser Ile Lys Glu Lys Tyr Ala
1145 1150 1155
Asn
<210> 338
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 338
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
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420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Asn Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Ser Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asp Val Asn Lys Pro
785 790 795 800
Lys Glu Glu Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg Ile Glu Leu Trp Asp
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
850 855 860
Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
865 870 875 880
Ile Asp Glu Leu Asn Ile Lys Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp
885 890 895
Ile Asn Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg
900 905 910
Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr Lys Val Asn Lys Gly
915 920 925
Gly Tyr Ile Ile Lys Asn Lys Pro Leu His Thr Ile Tyr Ile Lys Glu
930 935 940
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
945 950 955 960
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Lys Thr Pro Ser Glu
965 970 975
Ala Glu Ser Glu Ser Asn Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
980 985 990
Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Ala Arg Leu Asp Ile Ile Glu Asp Met Leu
995 1000 1005
Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr
1010 1015 1020
Asp Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly Trp Leu Glu Leu Lys Gly
1025 1030 1035
Glu Ala Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr
1040 1045 1050
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser
1070 1075 1080
Asn Ile Ile Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys
1085 1090 1095
Glu Glu Val Ser Lys Ala Ala Lys Lys Ile Gln Asn Glu Glu Asp
1100 1105 1110
Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
1115 1120
<210> 339
<211> 1199
<212> PRT
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 339
Met Lys Asn Ile Gln Arg Leu Gly Lys Gly Asn Glu Phe Ser Pro Phe
1 5 10 15
Lys Lys Glu Asp Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ile Thr Arg Phe Gly Ile
35 40 45
Val Ile Thr Asp Glu Asn Lys Lys Pro Lys Glu Thr Phe Gly Glu Lys
50 55 60
Ile Leu Asn Glu Ile Phe Lys Lys Asp Ile Ser Ile Val Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Trp Val Asn Ile Phe Ala Asp Tyr Phe Pro Phe Thr Lys Tyr Leu
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Glu Glu Met Gln Phe Lys Asn Arg Val Ile Cys Phe
100 105 110
Arg Asp Val Met Lys Glu Leu Leu Lys Thr Val Glu Ala Leu Arg Asn
115 120 125
Phe Tyr Thr His Tyr Asp His Glu Pro Ile Lys Ile Glu Asp Arg Val
130 135 140
Phe Tyr Phe Leu Asp Lys Val Leu Leu Asp Val Ser Leu Thr Val Lys
145 150 155 160
Asn Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu Phe Leu Asn Gln His
165 170 175
Ile Gly Glu Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys Gln Arg Lys Asp Tyr Leu
180 185 190
Val Gly Lys Gly Lys Arg Ile Asp Lys Glu Ser Glu Ile Ile Asn Gly
195 200 205
Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Asp Phe Ile Cys Lys Arg Glu Lys Gln
210 215 220
Asp Asp Lys Glu Asn His Asn Ser Val Glu Lys Ile Leu Cys Asn Lys
225 230 235 240
Glu Pro Gln Asn Lys Lys Gln Lys Ser Ser Ala Thr Val Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Ser Lys Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Ser Phe Pro Asn Arg
260 265 270
Glu Asn Asp Lys His Cys Leu Glu Val Pro Ile Ser Gln Lys Gly Ile
275 280 285
Val Phe Leu Leu Ser Phe Phe Leu Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Ala Leu
290 295 300
Thr Ser Asn Ile Lys Gly Phe Lys Ala Lys Ile Thr Lys Glu Glu Pro
305 310 315 320
Val Thr Tyr Asp Lys Asn Ser Ile Arg Tyr Met Ala Thr His Arg Met
325 330 335
Phe Ser Phe Leu Ala Tyr Lys Gly Leu Lys Arg Lys Ile Arg Thr Ser
340 345 350
Glu Ile Asn Tyr Asn Glu Asp Gly Gln Ala Ser Ser Thr Tyr Glu Lys
355 360 365
Glu Thr Leu Met Leu Gln Met Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Pro Asp
370 375 380
Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr Met
405 410 415
Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp
420 425 430
Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln Phe
435 440 445
Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu Cys Asp Lys
450 455 460
Arg Thr Lys Gln Ile Cys Asp Thr Thr Thr Glu Arg Glu Val Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu Asn Lys Lys Ala
485 490 495
Ile Phe Leu Asn Glu Arg Glu Glu Ile Lys Gly Trp Glu Val Phe Pro
500 505 510
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515 520 525
Asp Phe Pro Ile Val Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys Gln Pro Val
530 535 540
Ser Asn Lys Ile Gly Ile Arg Val Lys Ile Ala Asp Glu Leu Gln Arg
545 550 555 560
Glu Ile Asp Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys Leu Arg Asn Pro Lys Asn
565 570 575
Arg Lys Ala Asn Gln Asp Glu Lys Gln Lys Glu Arg Leu Val Asn Glu
580 585 590
Ile Val Ser Thr Asn Ser Asn Glu Gln Gly Glu Pro Val Val Phe Ile
595 600 605
Gly Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Val Leu
610 615 620
Tyr Glu Phe Leu Ile Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ala Leu Glu Thr Lys
625 630 635 640
Ile Val Glu Lys Ile Glu Thr Gln Ile Lys Gln Ile Ile Gly Lys Asp
645 650 655
Ala Thr Thr Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Thr Asn Ala Asn Ser Asn Ser
660 665 670
Ile Asn Arg Glu Lys Leu Leu Arg Asp Leu Glu Gln Glu Gln Gln Ile
675 680 685
Leu Lys Thr Leu Leu Glu Glu Gln Gln Gln Arg Glu Lys Asp Lys Lys
690 695 700
Asp Lys Lys Ser Lys Arg Lys His Glu Leu Tyr Pro Ser Glu Lys Gly
705 710 715 720
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys
725 730 735
Ala Phe Lys Glu Gln Trp Arg Gly Tyr His His Ser Leu Leu Gln Lys
740 745 750
Tyr Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Ser Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
755 760 765
Pro Lys Glu Val Phe Lys His Phe Pro Phe Lys Leu Lys Gly Tyr Phe
770 775 780
Gln Gln Gln Tyr Leu Asn Gln Phe Tyr Thr Asp Tyr Leu Lys Arg Arg
785 790 795 800
Leu Ser Tyr Val Asn Glu Leu Leu Leu Asn Ile Gln Asn Phe Lys Asn
805 810 815
Asp Lys Asp Ala Leu Lys Ala Thr Glu Lys Glu Cys Phe Lys Phe Phe
820 825 830
Arg Lys Gln Asn Tyr Ile Ile Asn Pro Ile Asn Ile Gln Ile Gln Ser
835 840 845
Ile Leu Val Tyr Pro Ile Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Asp Glu Lys
850 855 860
Pro Thr Met Ile Asp Arg Glu Lys Phe Lys Glu Asn Lys Asp Thr Glu
865 870 875 880
Leu Ala Asp Trp Phe Met His Tyr Lys Asn Tyr Lys Glu Asp Asn Tyr
885 890 895
Gln Lys Phe Tyr Ala Tyr Pro Leu Glu Lys Val Glu Glu Lys Glu Lys
900 905 910
Phe Lys Arg Asn Lys Gln Ile Asn Lys Gln Lys Lys Asn Asp Val Tyr
915 920 925
Thr Leu Met Met Val Glu Tyr Ile Ile Gln Lys Ile Phe Gly Asp Lys
930 935 940
Phe Val Glu Glu Asn Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Phe Gln Ser Lys
945 950 955 960
Ala Glu Arg Gln Gln Asn Asn Thr His Ala Ala Thr Thr Gln Glu Arg
965 970 975
Asn Leu Asn Gly Ile Leu Asn Gln Pro Lys Asp Ile Lys Ile Gln Gly
980 985 990
Lys Ile Thr Val Lys Gly Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly Asn Phe Arg
995 1000 1005
Lys Tyr Glu Ile Asp Gln Arg Val Asn Thr Phe Leu Asp Tyr Glu
1010 1015 1020
Pro Arg Lys Glu Trp Met Ala Tyr Leu Pro Asn Asp Trp Lys Glu
1025 1030 1035
Lys Glu Lys Gln Gly Gln Leu Pro Pro Asn Asn Val Ile Asp Arg
1040 1045 1050
Gln Ile Ser Lys Tyr Glu Thr Val Arg Ser Lys Ile Leu Leu Lys
1055 1060 1065
Asp Val Gln Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Glu Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Glu His Arg His Asp Leu Lys Gln Gly Lys Tyr Tyr Asn Phe Lys
1085 1090 1095
Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly Leu Leu Arg Gln Leu Lys Asn Glu Asn
1100 1105 1110
Val Glu Asn Tyr Lys Val Phe Lys Leu Asn Thr Asn Pro Glu Lys
1115 1120 1125
Val Asn Ile Thr Gln Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln
1130 1135 1140
Lys Ala Phe Val Leu Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn
1145 1150 1155
Gln Leu Pro Lys Lys Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr
1160 1165 1170
Gly Lys Ile Glu Lys Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu
1175 1180 1185
Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1190 1195
<210> 340
<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 340
Met Thr Glu Gln Ser Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
50 55 60
Lys Asn Phe Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Ile Asp His Glu His Asn Asp Glu Val
180 185 190
Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Gly Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Met Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Asp Asp Arg Ala Cys Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Met Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Ser Gln Thr Ser Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Met Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Arg Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Ile Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Met Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Ala Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Glu Arg Leu Thr Pro
660 665 670
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675 680 685
Leu His Glu Thr Arg Trp Glu Ser His Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
690 695 700
Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ile Gly Arg
705 710 715 720
Ser Asp Arg Val Glu Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
725 730 735
Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Gly Glu Phe His Leu
740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly His Asp Glu Val Ala Ser Tyr Lys Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Cys Glu Asp Arg Val Gln Pro
785 790 795 800
Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
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Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Glu Glu Trp Glu Arg Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser Tyr Ser Ala Ala Arg
835 840 845
Arg Ile Glu Asp Ala Phe Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn
850 855 860
Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
865 870 875 880
Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Arg Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
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930 935 940
Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
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Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
His Lys Glu Glu Ala Pro Leu Ala Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp
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Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu
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Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr
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Leu Arg Leu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Arg Tyr Pro His Leu Pro
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Leu Ala Lys Trp Pro Glu Leu His Gly Lys Val Arg Leu Leu Ile
1100 1105 1110
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Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile Ala His Arg Leu
1145 1150 1155
Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val Glu Arg Ile Ile
1160 1165 1170
Gln Ala
1175
<210> 341
<211> 1090
<212> PRT
<213> Prevotella sp. P5-125
<400> 341
Met Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Val Met Ala Met Leu Asn Ala Gln Thr Val Leu Asp His Ile
20 25 30
Gln Lys Val Ala Asp Ile Glu Gly Glu Gln Asn Glu Asn Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Trp Phe His Pro Val Met Ser His Leu Tyr Asn Ala Lys Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Lys Gln Pro Glu Lys Thr Met Phe Ile Ile Glu Arg Leu Gln
65 70 75 80
Ser Tyr Phe Pro Phe Leu Lys Ile Met Ala Glu Asn Gln Arg Glu Tyr
85 90 95
Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp
100 105 110
Ile Phe Glu Val Leu Lys Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Met Tyr Arg
115 120 125
Asp Leu Thr Asn His Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gly
130 135 140
Cys Glu Phe Leu Thr Ser Thr Glu Gln Pro Leu Ser Gly Met Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Thr Val Ala Leu Arg Asn Met Asn Glu Arg Tyr Gly Tyr
165 170 175
Lys Thr Glu Asp Leu Ala Phe Ile Gln Asp Lys Arg Phe Lys Phe Val
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Lys Asp Ala Tyr Gly Lys Lys Lys Ser Gln Val Asn Thr Gly Phe Phe
195 200 205
Leu Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu
210 215 220
Ser Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn
245 250 255
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260 265 270
Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
Ser Val Ala Met Asp Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Cys Pro Asp Glu
290 295 300
Leu Phe Thr Thr Leu Ser Ala Glu Lys Gln Ser Arg Phe Arg Ile Ile
305 310 315 320
Ser Asp Asp His Asn Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Ser Asp Arg Phe
325 330 335
Val Pro Leu Leu Leu Gln Tyr Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Phe Asp His
340 345 350
Ile Arg Phe His Val Asn Met Gly Lys Leu Arg Tyr Leu Leu Lys Ala
355 360 365
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370 375 380
Pro Leu Asn Gly Phe Gly Arg Leu Glu Glu Ala Glu Thr Met Arg Lys
385 390 395 400
Gln Glu Asn Gly Thr Phe Gly Asn Ser Gly Ile Arg Ile Arg Asp Phe
405 410 415
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420 425 430
Val Asp Thr Tyr Thr His Tyr Ile Leu Glu Asn Asn Lys Val Glu Met
435 440 445
Phe Ile Asn Asp Lys Glu Asp Ser Ala Pro Leu Leu Pro Val Ile Glu
450 455 460
Asp Asp Arg Tyr Val Val Lys Thr Ile Pro Ser Cys Arg Met Ser Thr
465 470 475 480
Leu Glu Ile Pro Ala Met Ala Phe His Met Phe Leu Phe Gly Ser Lys
485 490 495
Lys Thr Glu Lys Leu Ile Val Asp Val His Asn Arg Tyr Lys Arg Leu
500 505 510
Phe Gln Ala Met Gln Lys Glu Glu Val Thr Ala Glu Asn Ile Ala Ser
515 520 525
Phe Gly Ile Ala Glu Ser Asp Leu Pro Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile
530 535 540
Ser Gly Asn Ala His Gly Lys Asp Val Asp Ala Phe Ile Arg Leu Thr
545 550 555 560
Val Asp Asp Met Leu Thr Asp Thr Glu Arg Arg Ile Lys Arg Phe Lys
565 570 575
Asp Asp Arg Lys Ser Ile Arg Ser Ala Asp Asn Lys Met Gly Lys Arg
580 585 590
Gly Phe Lys Gln Ile Ser Thr Gly Lys Leu Ala Asp Phe Leu Ala Lys
595 600 605
Asp Ile Val Leu Phe Gln Pro Ser Val Asn Asp Gly Glu Asn Lys Ile
610 615 620
Thr Gly Leu Asn Tyr Arg Ile Met Gln Ser Ala Ile Ala Val Tyr Asp
625 630 635 640
Ser Gly Asp Asp Tyr Glu Ala Lys Gln Gln Phe Lys Leu Met Phe Glu
645 650 655
Lys Ala Arg Leu Ile Gly Lys Gly Thr Thr Glu Pro His Pro Phe Leu
660 665 670
Tyr Lys Val Phe Ala Arg Ser Ile Pro Ala Asn Ala Val Glu Phe Tyr
675 680 685
Glu Arg Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Phe Tyr Leu Thr Gly Leu Ser Asn
690 695 700
Glu Ile Lys Lys Gly Asn Arg Val Asp Val Pro Phe Ile Arg Arg Asp
705 710 715 720
Gln Asn Lys Trp Lys Thr Pro Ala Met Lys Thr Leu Gly Arg Ile Tyr
725 730 735
Ser Glu Asp Leu Pro Val Glu Leu Pro Arg Gln Met Phe Asp Asn Glu
740 745 750
Ile Lys Ser His Leu Lys Ser Leu Pro Gln Met Glu Gly Ile Asp Phe
755 760 765
Asn Asn Ala Asn Val Thr Tyr Leu Ile Ala Glu Tyr Met Lys Arg Val
770 775 780
Leu Asp Asp Asp Phe Gln Thr Phe Tyr Gln Trp Asn Arg Asn Tyr Arg
785 790 795 800
Tyr Met Asp Met Leu Lys Gly Glu Tyr Asp Arg Lys Gly Ser Leu Gln
805 810 815
His Cys Phe Thr Ser Val Glu Glu Arg Glu Gly Leu Trp Lys Glu Arg
820 825 830
Ala Ser Arg Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gln Ala Ser Asn Lys Ile Arg
835 840 845
Ser Asn Arg Gln Met Arg Asn Ala Ser Ser Glu Glu Ile Glu Thr Ile
850 855 860
Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
865 870 875 880
Lys Val Ile Arg Arg Tyr Arg Val Gln Asp Ala Leu Leu Phe Leu Leu
885 890 895
Ala Lys Lys Thr Leu Thr Glu Leu Ala Asp Phe Asp Gly Glu Arg Phe
900 905 910
Lys Leu Lys Glu Ile Met Pro Asp Ala Glu Lys Gly Ile Leu Ser Glu
915 920 925
Ile Met Pro Met Ser Phe Thr Phe Glu Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Thr
930 935 940
Ile Thr Ser Glu Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
945 950 955 960
Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
965 970 975
Asp Ile Val Ser Lys Glu Asp Ile Met Glu Glu Phe Asn Lys Tyr Asp
980 985 990
Gln Cys Arg Pro Glu Ile Ser Ser Ile Val Phe Asn Leu Glu Lys Trp
995 1000 1005
Ala Phe Asp Thr Tyr Pro Glu Leu Ser Ala Arg Val Asp Arg Glu
1010 1015 1020
Glu Lys Val Asp Phe Lys Ser Ile Leu Lys Ile Leu Leu Asn Asn
1025 1030 1035
Lys Asn Ile Asn Lys Glu Gln Ser Asp Ile Leu Arg Lys Ile Arg
1040 1045 1050
Asn Ala Phe Asp His Asn Asn Tyr Pro Asp Lys Gly Val Val Glu
1055 1060 1065
Ile Lys Ala Leu Pro Glu Ile Ala Met Ser Ile Lys Lys Ala Phe
1070 1075 1080
Gly Glu Tyr Ala Ile Met Lys
1085 1090
<210> 342
<211> 1150
<212> PRT
<213> Flavobacterium branchiphilum
<400> 342
Met Glu Asn Leu Asn Lys Ile Leu Asp Lys Glu Asn Glu Ile Cys Ile
1 5 10 15
Ser Lys Ile Phe Asn Thr Lys Gly Ile Ala Ala Pro Ile Thr Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Asp Asn Ile Lys Ser Lys Gln Lys Asn Asp Leu Asn Lys Glu
35 40 45
Ala Arg Leu His Tyr Phe Ser Ile Gly His Ser Phe Lys Gln Ile Asp
50 55 60
Thr Lys Lys Val Phe Asp Tyr Val Leu Ile Glu Glu Leu Lys Asp Glu
65 70 75 80
Lys Pro Leu Lys Phe Ile Thr Leu Gln Lys Asp Phe Phe Thr Lys Glu
85 90 95
Phe Ser Ile Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ser Ile Arg Asn Ile Asn
100 105 110
Asn His Tyr Val His Asn Phe Asn Asp Ile Asn Leu Asn Lys Ile Asp
115 120 125
Ser Asn Val Phe His Phe Leu Lys Glu Ser Phe Glu Leu Ala Ile Ile
130 135 140
Glu Lys Tyr Tyr Lys Val Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Phe Leu Lys Glu Leu Phe Ile Lys Asp Glu Asn Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Asn Tyr Phe Thr Asn Leu Ser Lys Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Ile
180 185 190
Leu Thr Phe Thr Ile Thr Glu Asn Lys Ile Trp Asn Ile Asn Asn Glu
195 200 205
His Asn Ile Leu Asn Ile Glu Lys Gly Lys Tyr Leu Thr Phe Glu Ala
210 215 220
Met Leu Phe Leu Ile Thr Ile Phe Leu Tyr Lys Asn Glu Ala Asn His
225 230 235 240
Leu Leu Pro Lys Leu Tyr Asp Phe Lys Asn Asn Lys Ser Lys Gln Glu
245 250 255
Leu Phe Thr Phe Phe Ser Lys Lys Phe Thr Ser Gln Asp Ile Asp Ala
260 265 270
Glu Glu Gly His Leu Ile Lys Phe Arg Asp Met Ile Gln Tyr Leu Asn
275 280 285
His Tyr Pro Thr Ala Trp Asn Asn Asp Leu Lys Leu Glu Ser Glu Asn
290 295 300
Lys Asn Lys Ile Met Thr Thr Lys Leu Ile Asp Ser Ile Ile Glu Phe
305 310 315 320
Glu Leu Asn Ser Asn Tyr Pro Ser Phe Ala Thr Asp Ile Gln Phe Lys
325 330 335
Lys Glu Ala Lys Ala Phe Leu Phe Ala Ser Asn Lys Lys Arg Asn Gln
340 345 350
Thr Ser Phe Ser Asn Lys Ser Tyr Asn Glu Glu Ile Arg His Asn Pro
355 360 365
His Ile Lys Gln Tyr Arg Asp Glu Ile Ala Ser Ala Leu Thr Pro Ile
370 375 380
Ser Phe Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Ile Phe Val Lys Lys His
385 390 395 400
Val Leu Glu Glu Tyr Phe Pro Asn Ser Ile Gly Tyr Glu Lys Phe Leu
405 410 415
Glu Tyr Asn Asp Phe Thr Glu Lys Glu Lys Glu Asp Phe Gly Leu Lys
420 425 430
Leu Tyr Ser Asn Pro Lys Thr Asn Lys Leu Ile Glu Arg Ile Asp Asn
435 440 445
His Lys Leu Val Lys Ser His Gly Arg Asn Gln Asp Arg Phe Met Asp
450 455 460
Phe Ser Met Arg Phe Leu Ala Glu Asn Asn Tyr Phe Gly Lys Asp Ala
465 470 475 480
Phe Phe Lys Cys Tyr Lys Phe Tyr Asp Thr Gln Glu Gln Asp Glu Phe
485 490 495
Leu Gln Ser Asn Glu Asn Asn Asp Asp Val Lys Phe His Lys Gly Lys
500 505 510
Val Thr Thr Tyr Ile Lys Tyr Glu Glu His Leu Lys Asn Tyr Ser Tyr
515 520 525
Trp Asp Cys Pro Phe Val Glu Glu Asn Asn Ser Met Ser Val Lys Ile
530 535 540
Ser Ile Gly Ser Glu Glu Lys Ile Leu Lys Ile Gln Arg Asn Leu Met
545 550 555 560
Ile Tyr Phe Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Asn Glu Asn Val Glu Asn Gln
565 570 575
Gly Tyr Lys Leu Val Asn Asn Tyr Tyr Arg Glu Leu Lys Lys Asp Val
580 585 590
Glu Glu Ser Ile Ala Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asp Phe
595 600 605
Lys Ser Lys Tyr Lys Lys Ile Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Asn Tyr
610 615 620
Ala Pro Ala Lys Gln Asp Lys Ala Pro Glu Asn Ala Phe Glu Thr Leu
625 630 635 640
Leu Lys Lys Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Lys
645 650 655
Lys Ala Glu His Glu Lys Asn Lys Glu Asp Phe Val Lys Arg Asn Lys
660 665 670
Gly Lys Gln Phe Lys Leu His Phe Ile Arg Lys Ala Cys Gln Met Met
675 680 685
Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Asn Thr Leu Lys Glu Gly Asn Ala Ala Phe
690 695 700
Glu Lys Lys Asp Pro Val Ile Glu Lys Arg Lys Asn Lys Glu His Glu
705 710 715 720
Phe Gly His His Lys Asn Leu Asn Ile Thr Arg Glu Glu Phe Asn Asp
725 730 735
Tyr Cys Lys Trp Met Phe Ala Phe Asn Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Lys
740 745 750
Tyr Leu Arg Asp Leu Phe Ser Glu Lys His Phe Phe Asp Asn Gln Glu
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Asp Lys Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asn Asn Val Ile Gln Tyr Lys Ser
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850 855 860
Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
865 870 875 880
Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
900 905 910
Thr Ser Lys Ile Ile Leu Thr Ile Asn Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Lys
915 920 925
Ile Ser Val Pro Phe Asn Lys Leu Glu Arg Tyr Thr Glu Met Ile Ala
930 935 940
Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
945 950 955 960
Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu Ile Ile Ile Lys Asn Asp Leu Glu Ile Glu Asp Ile Asn Thr
980 985 990
Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
995 1000 1005
Met Glu Leu Glu Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Asp Lys Cys Ile Leu
1010 1015 1020
Ser Lys Asn Tyr Ile Asp Asn Ser Glu Ile Pro Ser Leu Lys Gln
1025 1030 1035
Phe Ser Lys Val Trp Ile Lys Glu Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn
1040 1045 1050
Tyr Arg Asn Ile Ala Cys His Phe His Leu Pro Leu Leu Glu Thr
1055 1060 1065
Phe Asp Asn Leu Leu Leu Asn Val Glu Gln Lys Phe Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Glu Leu Gln Asn Val Ser Thr Ile Asn Asp Leu Ser Lys Pro Gln
1085 1090 1095
Glu Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Ile Lys Phe Lys His Asn Asn Phe
1100 1105 1110
Tyr Leu Asn Leu Phe Asn Lys Asn Glu Ser Lys Thr Ile Lys Asn
1115 1120 1125
Asp Lys Glu Val Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln Lys Phe Ile Asn
1130 1135 1140
Gln Val Ile Leu Lys Lys Lys
1145 1150
<210> 343
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 343
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
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Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
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Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
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435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
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Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
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Thr Leu Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Pro Lys Glu His Thr Leu
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Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
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Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
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Arg Lys Ser Leu Asn Pro Lys Glu Arg Ser Ala Thr Lys Ala Ser Lys
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Tyr Asp Ile Ile Thr Gln Ile Ile Glu Ala Asn Asp Asn Val Lys Ser
545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
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Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
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Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
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Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
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Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
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Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
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<213> Flavobacterium columnare
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Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser His Ser Ala Ala Arg
835 840 845
Arg Ile Lys Asp Ala Phe Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn
850 855 860
Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
865 870 875 880
Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Lys Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
900 905 910
Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
Asp Ile Ile Thr Trp Met Met Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys
930 935 940
Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
945 950 955 960
Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
His Lys Glu Glu Ala Pro Leu Ala Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp
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Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp
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Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu
1025 1030 1035
Ala Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
1040 1045 1050
Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr
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Leu Arg Leu Glu Glu Ser Leu Leu Ser Arg Tyr Pro His Leu Pro
1070 1075 1080
Asp Glu Ser Phe Arg Glu Met Leu Glu Ser Trp Ser Asp Pro Leu
1085 1090 1095
Leu Ala Lys Trp Pro Glu Leu His Gly Lys Val Arg Leu Leu Ile
1100 1105 1110
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
1115 1120 1125
Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp Pro Ser Ser Pro
1130 1135 1140
Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile Ala His Arg Leu
1145 1150 1155
Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val Glu Arg Ile Ile
1160 1165 1170
Gln Ala
1175
<210> 347
<211> 1132
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 347
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Lys Glu Ser Thr Asn Met Leu Asp Asn
1 5 10 15
Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr
20 25 30
Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn Lys Lys
35 40 45
Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala Ile Lys
50 55 60
Thr His Trp Glu Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Glu Arg Leu
65 70 75 80
Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln Ala
100 105 110
Lys Ala Gln Ser Phe Asp Ser Leu Lys His Cys Leu Phe Leu Phe Leu
115 120 125
Glu Lys Leu Gln Glu Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys Lys Met
145 150 155 160
Tyr Asn Ile Phe Asp Asp Asn Ile Gln Leu Val Ile Lys Asp Tyr Gln
165 170 175
His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg
180 185 190
Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys Gly Asn
195 200 205
Ile Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys
210 215 220
Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn
225 230 235 240
Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg
245 250 255
Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp
260 265 270
Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu
275 280 285
Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val Pro Phe
290 295 300
Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn
305 310 315 320
Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
325 330 335
Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu
340 345 350
Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
355 360 365
Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln
370 375 380
Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Thr Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys
385 390 395 400
Asp Phe Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Glu Glu Pro Tyr Ile Ser Glu Thr
405 410 415
Ala Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg
420 425 430
Asn Asp Asn Asp Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu Asn
435 440 445
Asn Glu Lys Arg Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu Ala
450 455 460
Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
465 470 475 480
Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile Val
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
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820 825 830
Tyr Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Val Lys Ser Lys Lys Leu Thr
835 840 845
Asp Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp
850 855 860
Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val
865 870 875 880
Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu Gly
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg
965 970 975
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980 985 990
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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Glu Thr Lys Glu
1130
<210> 348
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<212> PRT
<213> Prevotella intermedia 17
<400> 348
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100 105 110
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115 120 125
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Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys
195 200 205
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Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln
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275 280 285
Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val
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Pro Phe Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe
305 310 315 320
Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu
325 330 335
Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile
340 345 350
Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly
355 360 365
Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg
370 375 380
Ile Gln Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Thr Asp Glu Trp Lys Ala Ile
385 390 395 400
Val Lys Asp Phe Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Glu Glu Pro Tyr Ile Ser
405 410 415
Glu Thr Ala Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg
420 425 430
Phe Arg Asn Asp Asn Asp Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly
435 440 445
Glu Asn Asn Glu Lys Arg Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Gln Ala
450 455 460
Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr
465 470 475 480
Leu Leu Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser
485 490 495
Ile Val Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Ile Tyr Lys Leu
500 505 510
Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Asp Asp Leu Glu
515 520 525
Lys Tyr Cys Glu Asp Lys Gly Ile Pro Lys Arg His Leu Pro Lys Gln
530 535 540
Met Val Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Ala Glu Glu Ala
545 550 555 560
Lys Arg Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp Thr Lys Lys Leu Leu Ala
565 570 575
Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Gly Glu Ile Glu Asp Gly Gly Arg Asn
580 585 590
Ile Arg Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp
595 600 605
Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu
610 615 620
Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ser
625 630 635 640
Leu Ala Leu Tyr Asn Lys Glu Glu Lys Pro Thr Arg Tyr Phe Arg Gln
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690 695 700
Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro Lys Thr Asn Arg Glu
705 710 715 720
Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile
725 730 735
Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys Arg His Gln Asn Asp Ser
740 745 750
Glu Glu Tyr Glu Lys Val Glu Thr Leu Asp Arg Val Gly Leu Val Thr
755 760 765
Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Lys Glu Asp Ser Lys Asp Lys Glu
770 775 780
Glu Tyr Leu Lys Lys Asp Ala Gln Lys Glu Ile Asn Asn Cys Val Gln
785 790 795 800
Pro Phe Tyr Gly Phe Pro Tyr Asn Val Gly Asn Ile His Lys Pro Asp
805 810 815
Glu Lys Asp Phe Leu Pro Ser Glu Glu Arg Lys Lys Leu Trp Gly Asp
820 825 830
Lys Lys Tyr Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Val Lys Ser Lys Lys
835 840 845
Leu Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Phe Gln
850 855 860
Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp
865 870 875 880
Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val
885 890 895
Glu Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile
900 905 910
Asp Thr Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg Val
915 920 925
Met Pro Met Gln Leu Pro Val Thr Val Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His
930 935 940
Asn Ile Val Lys Asp Arg Pro Leu His Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr
945 950 955 960
Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Glu Thr
980 985 990
Glu Leu Lys Ser Asn Pro Ile Ser Lys Ser Leu Val Glu Tyr Glu Leu
995 1000 1005
Gly Glu Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu Thr Ile Lys Asp Met Leu
1010 1015 1020
Leu Leu Glu Glu Thr Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Thr Leu Pro Thr
1025 1030 1035
Asp Asn Phe Ser Asp Met Leu Asn Gly Trp Leu Glu Gly Lys Asp
1040 1045 1050
Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Val
1055 1060 1065
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn
1070 1075 1080
Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala
1085 1090 1095
Asp Thr Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys
1100 1105 1110
Asp Lys Thr His Lys Ile Ile Lys Arg Ile Ile Glu Ile Glu Lys
1115 1120 1125
Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1130
<210> 349
<211> 1133
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 349
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Ser Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn Lys
35 40 45
Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala Ile
50 55 60
Lys Thr His Trp Glu Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Glu Arg
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Ser Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln
100 105 110
Ala Lys Ala Gln Ser Phe Asp Ser Leu Lys His Cys Leu Phe Leu Phe
115 120 125
Leu Glu Lys Leu Gln Glu Thr Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys Lys
145 150 155 160
Met Tyr Asn Ile Phe Asp Asp Asn Ile Gln Leu Val Ile Lys Asp Tyr
165 170 175
Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp
180 185 190
Arg Thr Glu Glu Asp Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Arg Asn Lys Lys Gly
195 200 205
Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu
210 215 220
Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp
225 230 235 240
Asn Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser
245 250 255
Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser
275 280 285
Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro
290 295 300
Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys
305 310 315 320
Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg
325 330 335
Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp
340 345 350
Leu Gly Thr Phe His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln
355 360 365
Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile
370 375 380
Gln Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val
385 390 395 400
Lys Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Asn Glu Arg Tyr Ile Ser Glu
405 410 415
Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe
420 425 430
Arg Asn Asp Asn Asp Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu
435 440 445
Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu
450 455 460
Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu
465 470 475 480
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile
485 490 495
Val Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Met Tyr Lys Leu Tyr
500 505 510
Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys
515 520 525
Tyr Cys Glu Asp Lys Gly Ile Pro Lys Arg His Leu Pro Lys Gln Met
530 535 540
Val Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Val Lys Glu Ala Lys
545 550 555 560
Arg Lys Gln Arg Lys Met Val Lys Asp Thr Glu Lys Leu Leu Ala Ala
565 570 575
Leu Glu Lys Gln Thr Gln Glu Lys Thr Glu Asp Gly Gly Arg Asn Ile
580 585 590
Arg Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Asn Leu Ile Asn Ser Ser Asn Pro His Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys
660 665 670
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675 680 685
Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys
690 695 700
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705 710 715 720
Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe
725 730 735
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740 745 750
Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ala Leu Asp Arg Val Gly Leu Val Thr Lys
755 760 765
Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Lys Glu Asp Ser Lys Asp Lys Glu Glu
770 775 780
Asp Leu Lys Lys Asp Ala Gln Lys Glu Ile Asn Asn Cys Val Gln Pro
785 790 795 800
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Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Val Lys Ser Lys Lys Leu
835 840 845
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850 855 860
Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile
865 870 875 880
Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu
885 890 895
Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp
900 905 910
Thr Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg Val Met
915 920 925
Pro Met Gln Leu Pro Val Thr Val Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His Asn
930 935 940
Ile Val Lys Asp Arg Pro Leu His Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr Lys
945 950 955 960
Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg
965 970 975
Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Glu Ala Glu
980 985 990
Leu Lys Ser Asn Pro Ile Ser Lys Ser Leu Val Glu Tyr Glu Leu Gly
995 1000 1005
Glu Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu Thr Ile Lys Asp Met Leu Leu
1010 1015 1020
Leu Glu Glu Thr Leu Ile Glu Lys Tyr Lys Asn Leu Pro Thr Asp
1025 1030 1035
Asn Phe Ser Asp Met Leu Asn Gly Trp Leu Glu Gly Lys Asp Glu
1040 1045 1050
Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Val Ala
1055 1060 1065
Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg
1070 1075 1080
Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp
1085 1090 1095
Thr Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp
1100 1105 1110
Lys Thr His Lys Ile Ile Lys Arg Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro
1115 1120 1125
Ile Glu Thr Lys Glu
1130
<210> 350
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae ATCC 33574
<400> 350
Met Gln Lys Gln Asp Lys Leu Phe Val Asp Arg Lys Lys Asn Ala Ile
1 5 10 15
Phe Ala Phe Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Met Glu Asn Lys Glu Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Ile Tyr Tyr Glu Leu Thr Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr Thr Thr Ile Asn His Ile Asn
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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Ala Tyr Glu Met Thr Asn Ser Lys Ser Pro Asn Asn Lys Glu Gln Arg
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Glu Lys Glu Gln Ser Glu Ala Leu Ser Leu Asn Asn Leu Lys Asn Val
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Leu Phe Ile Phe Leu Glu Lys Leu Gln Val Leu Arg Asn Tyr Tyr Ser
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Leu Leu Lys Asn Met Tyr Lys Val Phe Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
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Lys Arg Asp Tyr Met His His Glu Asn Ile Asp Met Gln Arg Asp Phe
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Thr His Leu Asn Arg Lys Lys Gln Val Gly Arg Thr Lys Asn Ile Ile
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Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
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Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
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Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
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<212> PRT
<213> Myoides odoratimim
<400> 353
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<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 354
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<400> 355
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<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 356
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180 185 190
Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
195 200 205
Glu Gln Ala Ser Gly Met Leu Ser Arg Ile Arg Gly Phe Lys Arg Thr
210 215 220
Asp Glu Asn Trp Ala Arg Ala Val His Glu Thr Phe Cys Asp Leu Cys
225 230 235 240
Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
260 265 270
Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
275 280 285
Asp Glu Asn Ser Met Asn Asn Leu Ser Glu Asn Ser Leu Asn Glu Glu
290 295 300
Ser Arg Leu Leu Trp Asp Gly Ser Ser Asp Trp Ala Glu Ala Leu Thr
305 310 315 320
Lys Arg Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Leu Met Leu Arg Phe
325 330 335
Ile Glu Glu Met Asp Leu Leu Lys Gly Ile Arg Phe Arg Val Asp Leu
340 345 350
Gly Glu Ile Glu Leu Asp Ser Tyr Ser Lys Lys Val Gly Arg Asn Gly
355 360 365
Glu Tyr Asp Arg Thr Ile Thr Asp His Ala Leu Ala Phe Gly Lys Leu
370 375 380
Ser Asp Phe Gln Asn Glu Glu Glu Val Ser Arg Met Ile Ser Gly Glu
385 390 395 400
Ala Ser Tyr Pro Val Arg Phe Ser Leu Phe Ala Pro Arg Tyr Ala Ile
405 410 415
Tyr Asp Asn Lys Ile Gly Tyr Cys His Thr Ser Asp Pro Val Tyr Pro
420 425 430
Lys Ser Lys Thr Gly Glu Lys Arg Ala Leu Ser Asn Pro Arg Ser Met
435 440 445
Gly Phe Ile Ser Val His Asp Leu Arg Lys Leu Leu Leu Met Glu Leu
450 455 460
Leu Cys Glu Gly Ser Phe Ser Arg Met Gln Ser Asp Phe Leu Arg Lys
465 470 475 480
Ala Asn Arg Ile Leu Asp Glu Thr Ala Glu Gly Lys Leu Gln Phe Ser
485 490 495
Ala Leu Phe Pro Glu Met Arg His Arg Phe Ile Pro Pro Gln Asn Pro
500 505 510
Lys Ser Lys Asp Arg Arg Glu Lys Ala Glu Thr Thr Leu Glu Lys Tyr
515 520 525
Lys Gln Glu Ile Lys Gly Arg Lys Asp Lys Leu Asn Ser Gln Leu Leu
530 535 540
Ser Ala Phe Asp Met Asp Gln Arg Gln Leu Pro Ser Arg Leu Leu Asp
545 550 555 560
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565 570 575
Tyr Val Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys Arg Leu Arg Leu Gln Lys Phe
580 585 590
Arg Lys Asp Gly Asp Gly Lys Ala Arg Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Leu Ala Gln Tyr Ala Gly Glu Glu Asn Arg His Gln Phe Arg Ala
645 650 655
Ile Val Ala Glu Leu Arg Leu Leu Asp Pro Ser Ser Gly His Pro Phe
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Lys Asp Trp Trp Ser Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Met Gln Pro Phe Tyr
785 790 795 800
Gly Leu Arg Arg Glu Leu Asn Ile His Gly Lys Ser Val Ser Tyr Ile
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Val Pro Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Ile Lys Arg Ser Phe His Arg Ala
850 855 860
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865 870 875 880
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
Ser Gly Glu His Ser Thr Leu Val Lys Met Leu Val Glu Lys Lys
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1070 1075 1080
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Ser Gln Pro Ile Asn Asp Leu
1130 1135
<210> 361
<211> 1125
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia ZT
<400> 361
Met Lys Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Glu Ser Thr Asn Met Leu
1 5 10 15
Asp Asn Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Val Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn
35 40 45
Lys Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala
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Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys
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115 120 125
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165 170 175
Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu
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195 200 205
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210 215 220
Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Thr Gly Phe Lys Asp Asn
225 230 235 240
Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Arg Arg
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Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
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Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
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Ala Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Lys Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg
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770 775 780
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835 840 845
Arg Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu
865 870 875 880
Leu Ile Asp Lys Met Lys Val Glu Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Gln
885 890 895
Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys
900 905 910
Asn Asn Ile Leu Asn Arg Ile Met Pro Met Gln Leu Pro Val Thr Val
915 920 925
Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His Asn Ile Val Lys Asp Arg Pro Leu His
930 935 940
Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn
945 950 955 960
Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe
965 970 975
Val Asp Thr Ser Ser Lys Ala Glu Leu Lys Asp Lys Pro Ile Ser Lys
980 985 990
Ser Val Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu
995 1000 1005
Thr Ile Lys Asp Met Leu Leu Leu Glu Lys Thr Leu Ile Lys Lys
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp Ile Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp
1085 1090 1095
Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Ile Ile Lys Lys
1100 1105 1110
Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
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<212> PRT
<213> Bacterioides bacterium
<400> 362
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1 5 10 15
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Asn Asn Ile Glu Gln Ile Ile Glu Glu Phe Arg Ile Arg Leu Ser Leu
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Lys Asp Glu Lys Asn Ile Lys Glu Ile Ile Asn Asn Tyr Phe Thr Asp
50 55 60
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Lys Ile Asp Ser Glu Leu Lys Leu Asn Phe Ser Ile Ser Gly Leu
245 250 255
Val Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu Gln Phe
260 265 270
Lys Ser Asn Leu Glu Gly Phe Lys Gly Lys Val Ile Gly Glu Asn Gly
275 280 285
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290 295 300
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Leu Asn Lys Val Pro His Glu Val Tyr Gln Thr Leu Ser Lys Glu Gln
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
Asn Pro Ala Lys Lys Arg Asn Thr Arg Lys Ser Lys Glu Glu Ile Ile
515 520 525
Lys Ile Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Asn Ile Lys Tyr Gly Asp Pro Thr
530 535 540
Ala Leu Leu Ser Ser Asn Glu Leu Pro Ala Leu Ile Tyr Glu Leu Leu
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565 570 575
Ile Val Asn Gln Tyr Lys Thr Ile Ala Gly Phe Glu Lys Gly Gln Asn
580 585 590
Leu Ser Asn Ser Leu Ile Thr Lys Lys Leu Lys Lys Ser Glu Pro Asn
595 600 605
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Leu Glu Ile Thr Glu Asn Lys Leu Asn Ile Ile Lys Asn Asn Arg Ala
625 630 635 640
Glu Phe Arg Thr Gly Ala Lys Arg Lys His Ile Phe Tyr Ser Lys Glu
645 650 655
Leu Gly Gln Glu Ala Thr Trp Ile Ala Tyr Asp Leu Lys Arg Phe Met
660 665 670
Pro Glu Ala Ser Arg Lys Glu Trp Lys Gly Phe His His Ser Glu Leu
675 680 685
Gln Lys Phe Leu Ala Phe Tyr Asp Arg Asn Lys Asn Asp Ala Lys Ala
690 695 700
Leu Leu Asn Met Phe Trp Asn Phe Asp Asn Asp Gln Leu Ile Gly Asn
705 710 715 720
Asp Leu Asn Ser Ala Phe Arg Glu Phe His Phe Asp Lys Phe Tyr Glu
725 730 735
Lys Tyr Leu Ile Lys Arg Asp Glu Ile Leu Glu Gly Phe Lys Ser Phe
740 745 750
Ile Ser Asn Phe Lys Asp Glu Pro Lys Leu Leu Lys Lys Gly Ile Lys
755 760 765
Asp Ile Tyr Arg Val Phe Asp Lys Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Ser Thr
770 775 780
Asn Ala Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ser Lys Pro Ile Cys Leu Pro Arg
785 790 795 800
Gly Ile Phe Asp Asn Lys Pro Thr Tyr Ile Glu Gly Val Lys Val Glu
805 810 815
Ser Asn Ser Ala Leu Phe Ala Asp Trp Tyr Gln Tyr Thr Tyr Ser Asp
820 825 830
Lys His Glu Phe Gln Ser Phe Tyr Asp Met Pro Arg Asp Tyr Lys Glu
835 840 845
Gln Phe Glu Lys Phe Glu Leu Asn Asn Ile Lys Ser Ile Gln Asn Lys
850 855 860
Lys Asn Leu Asn Lys Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Phe Arg Tyr Lys Gln
865 870 875 880
Asp Leu Lys Ile Lys Gln Ile Lys Ser Gln Asp Leu Phe Ile Lys Leu
885 890 895
Met Val Asp Glu Leu Phe Asn Val Val Phe Lys Asn Asn Ile Glu Leu
900 905 910
Asn Leu Lys Lys Leu Tyr Gln Thr Ser Asp Glu Arg Phe Lys Asn Gln
915 920 925
Leu Ile Ala Asp Val Gln Lys Asn Arg Glu Lys Gly Asp Thr Ser Asp
930 935 940
Asn Lys Met Asn Glu Asn Phe Ile Trp Asn Met Thr Ile Pro Leu Ser
945 950 955 960
Leu Cys Asn Gly Gln Ile Glu Glu Pro Lys Val Lys Leu Lys Asp Ile
965 970 975
Gly Lys Phe Arg Lys Leu Glu Thr Asp Asp Lys Val Ile Gln Leu Leu
980 985 990
Glu Tyr Asp Lys Ser Lys Val Trp Lys Lys Leu Glu Ile Glu Asp Glu
995 1000 1005
Leu Glu Asn Met Pro Asn Ser Tyr Glu Arg Ile Arg Arg Glu Lys
1010 1015 1020
Leu Leu Lys Gly Ile Gln Glu Phe Glu His Phe Leu Leu Glu Lys
1025 1030 1035
Glu Lys Phe Asp Gly Ile Asn His Pro Lys His Phe Glu Gln Asp
1040 1045 1050
Leu Asn Pro Asn Phe Lys Thr Tyr Val Ile Asn Gly Val Leu Arg
1055 1060 1065
Lys Asn Ser Lys Leu Asn Tyr Thr Glu Ile Asp Lys Leu Leu Asp
1070 1075 1080
Leu Glu His Ile Ser Ile Lys Asp Ile Glu Thr Ser Ala Lys Glu
1085 1090 1095
Ile His Leu Ala Tyr Phe Leu Ile His Val Arg Asn Lys Phe Gly
1100 1105 1110
His Asn Gln Leu Pro Lys Leu Glu Ala Phe Glu Leu Met Lys Lys
1115 1120 1125
Tyr Tyr Lys Lys Asn Asn Glu Glu Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe His
1130 1135 1140
Lys Val Ser Ser Gln Ile Val Asn Glu Phe Lys Asn Ser Leu Glu
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Lys His Ser
1160
<210> 363
<211> 1165
<212> PRT
<213> Chryseobacterium jejuense
<400> 363
Met Glu Lys Thr Gln Thr Gly Leu Gly Ile Tyr Tyr Asp His Thr Lys
1 5 10 15
Leu Gln Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Phe Asn Leu Ala Gln Asn
20 25 30
Asn Ile Asp Asn Val Ile Lys Ala Phe Ile Ile Lys Phe Phe Pro Glu
35 40 45
Arg Lys Asp Lys Asp Ile Asn Ile Ala Gln Phe Leu Asp Ile Cys Phe
50 55 60
Lys Asp Asn Asp Ala Asp Ser Asp Phe Gln Lys Lys Asn Lys Phe Leu
65 70 75 80
Arg Ile His Phe Pro Val Ile Gly Phe Leu Thr Ser Asp Asn Asp Lys
85 90 95
Ala Gly Phe Lys Lys Lys Phe Ala Leu Leu Leu Lys Thr Ile Ser Glu
100 105 110
Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr Tyr His Lys Ser Ile Glu Phe Pro
115 120 125
Ser Glu Leu Phe Glu Leu Leu Asp Asp Ile Phe Val Lys Thr Thr Ser
130 135 140
Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Lys Asp Asp Lys Thr Gln Gln Leu Leu
145 150 155 160
Asn Lys Asn Leu Ser Glu Glu Tyr Asp Ile Arg Tyr Gln Gln Gln Ile
165 170 175
Glu Arg Leu Lys Glu Leu Lys Ala Gln Gly Lys Arg Val Ser Leu Thr
180 185 190
Asp Glu Thr Ala Ile Arg Asn Gly Val Phe Asn Ala Ala Phe Asn His
195 200 205
Leu Ile Tyr Arg Asp Gly Glu Asn Val Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Gln
210 215 220
Ser Ser Tyr Ser Glu Pro Asp Pro Ala Glu Asn Gly Ile Ser Leu Ser
225 230 235 240
Gln Asn Ser Ile Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Glu Arg Lys Glu
245 250 255
Thr Glu Asp Leu Lys Ser Arg Val Lys Gly Phe Lys Ala Lys Ile Ile
260 265 270
Lys Gln Gly Glu Glu Gln Ile Ser Gly Leu Lys Phe Met Ala Thr His
275 280 285
Trp Val Phe Ser Tyr Leu Cys Phe Lys Gly Ile Lys Gln Lys Leu Ser
290 295 300
Thr Glu Phe His Glu Glu Thr Leu Leu Ile Gln Ile Ile Asp Glu Leu
305 310 315 320
Ser Lys Val Pro Asp Glu Val Tyr Ser Ala Phe Asp Ser Lys Thr Lys
325 330 335
Glu Lys Phe Leu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Lys Glu Gly Asn Ala
340 345 350
Asp Leu Ser Leu Glu Asp Ser Lys Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys
355 360 365
Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu
370 375 380
Tyr Leu Ser Ser Thr Ser Leu Lys Phe Gln Val His Val Gly Asn Tyr
385 390 395 400
Val His Asp Arg Arg Val Lys His Ile Asn Gly Thr Gly Phe Gln Thr
405 410 415
Glu Arg Ile Val Lys Asp Arg Ile Lys Val Phe Gly Arg Leu Ser Asn
420 425 430
Ile Ser Asn Leu Lys Ala Asp Tyr Ile Lys Glu Gln Leu Glu Leu Pro
435 440 445
Asn Asp Ser Asn Gly Trp Glu Ile Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Ile Phe
450 455 460
Ile Asp Asn Asn Val Pro Ile His Val Leu Ala Asp Glu Ala Thr Lys
465 470 475 480
Lys Gly Ile Glu Leu Phe Lys Asp Lys Arg Arg Lys Glu Gln Pro Glu
485 490 495
Glu Leu Gln Lys Arg Lys Gly Lys Ile Ser Lys Tyr Asn Ile Val Ser
500 505 510
Met Ile Tyr Lys Glu Ala Lys Gly Lys Asp Lys Leu Arg Ile Asp Glu
515 520 525
Pro Leu Ala Leu Leu Ser Leu Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Tyr Gln
530 535 540
Ile Leu Glu Lys Gly Ala Thr Pro Lys Asp Ile Glu Leu Ile Ile Lys
545 550 555 560
Asn Lys Leu Thr Glu Arg Phe Glu Lys Ile Lys Asn Tyr Asp Pro Glu
565 570 575
Thr Pro Ala Pro Ala Ser Gln Ile Ser Lys Arg Leu Arg Asn Asn Thr
580 585 590
Thr Ala Lys Gly Gln Glu Ala Leu Asn Ala Glu Lys Leu Ser Leu Leu
595 600 605
Ile Glu Arg Glu Ile Glu Asn Thr Glu Thr Lys Leu Ser Ser Ile Glu
610 615 620
Glu Lys Arg Leu Lys Ala Lys Lys Glu Gln Arg Arg Asn Thr Pro Gln
625 630 635 640
Arg Ser Ile Phe Ser Asn Ser Asp Leu Gly Arg Ile Ala Ala Trp Leu
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Ala Asp Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Ala Glu Gln Arg Lys Asn Trp
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Lys Gly Tyr Gln His Ser Gln Leu Gln Gln Ser Leu Ala Tyr Phe Glu
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Lys Arg Pro Gln Glu Ala Phe Leu Leu Leu Lys Glu Gly Trp Asp Thr
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Ser Asp Gly Ser Ser Tyr Trp Asn Asn Trp Val Met Asn Ser Phe Leu
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Glu Asn Asn His Phe Glu Lys Phe Tyr Lys Asn Tyr Leu Met Lys Arg
725 730 735
Val Lys Tyr Phe Ser Glu Leu Ala Gly Asn Ile Lys Gln His Thr His
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Leu Phe Pro Lys Arg His Tyr Ile Leu Lys Asp Leu Glu Thr Glu Lys
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Asn Asn Pro Thr Phe Ile Lys Gly Val Lys Val Thr Glu Asn Pro Glu
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Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Tyr Asp Ser Asp Thr Ala Glu Asn Gly Ile Ser Ile Ser Gln Ser
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595 600 605
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660 665 670
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675 680 685
Leu Leu Gln Ala Gly Trp Asp Phe Ser Asp Gly Ser Ser Phe Trp Asn
690 695 700
Gly Trp Val Met Asn Ser Phe Ala Arg Asp Asn Thr Phe Asp Gly Phe
705 710 715 720
Tyr Glu Ser Tyr Leu Asn Gly Arg Met Lys Tyr Phe Leu Arg Leu Ala
725 730 735
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740 745 750
Ile Lys Gln Gln Met Pro Lys Gly Leu Phe Asp Arg Arg Leu Tyr Met
755 760 765
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770 775 780
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<212> PRT
<213> Prevotella buccae
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275 280 285
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740 745 750
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755 760 765
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785 790 795 800
Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Asn Val Gln Pro Phe Tyr Asp
805 810 815
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820 825 830
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945 950 955 960
Glu Thr Lys Val Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Val Leu Ala Lys Asp
965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Leu Ser Phe Ala Glu Thr Thr Asp Ile Asp
980 985 990
Leu Glu Lys Asn Pro Ile Thr Lys Leu Ser Val Asp His Glu Leu Ile
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Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Tyr Pro Thr Leu Pro Thr Asp
1025 1030 1035
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Gly Lys Ala Ile Lys Glu Ile Glu Lys Ser Glu Asn Lys Asn
1115 1120 1125
<210> 367
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 367
Met Asn Thr Val Pro Ala Ser Glu Asn Lys Gly Gln Ser Arg Thr Val
1 5 10 15
Glu Asp Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Leu Tyr Leu Asn Leu Ala Arg Glu
20 25 30
Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
50 55 60
Leu Ser Val Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
85 90 95
His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
145 150 155 160
Gln Ser Arg Phe Ala Asp Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
165 170 175
Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
180 185 190
Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
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210 215 220
Asp Glu Asn Trp Ala Arg Ala Val His Glu Thr Phe Cys Asp Leu Cys
225 230 235 240
Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
245 250 255
Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
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Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
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465 470 475 480
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<210> 368
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 368
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1 5 10 15
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
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Gln Ala
1175
<210> 369
<211> 1125
<212> PRT
<213> Prevotella pallens
<400> 369
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115 120 125
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Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
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<210> 370
<211> 1157
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 370
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50 55 60
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
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Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val His Lys Glu Gln Ala Pro Leu Ala
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<213> Paludibacter propionicigenes
<400> 374
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965 970 975
Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
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Lys Asp Lys Thr Gln Val
1175
<210> 377
<211> 1145
<212> PRT
<213> Psychroflexus torquis
<400> 377
Met Glu Ser Ile Ile Gly Leu Gly Leu Ser Phe Asn Pro Tyr Lys Thr
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Leu Val Ile Arg Lys Thr Asp Glu Leu Arg Glu Lys Lys Lys Thr Asn
180 185 190
Pro Lys Ile Gln His Thr Asp Ser Ser Gln Ile Lys Asn Ser Ile Phe
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Asn Asp Ala Phe Gln Gly Leu Leu Tyr Glu Asp Lys Gly Asn Asn Lys
210 215 220
Lys Thr Gln Val Ser His Arg Ala Lys Thr Arg Leu Asn Pro Lys Asp
225 230 235 240
Ile His Lys Gln Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ile Pro Leu Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Leu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu
260 265 270
Asp Phe Lys Ser Asn Ile Lys Gly Phe Lys Gly Lys Val Val Lys Asp
275 280 285
Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Tyr Met Ala Thr His Arg Val Tyr Ser
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Ile Leu Ala Phe Lys Gly Leu Lys Tyr Arg Ile Lys Thr Asp Thr Phe
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340 345 350
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Asn Leu Glu Asn Ser Arg Val Val His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr
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Asn Leu Lys Lys His Phe Phe Ser Gln Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr
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<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 378
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<212> PRT
<213> Prevotella pleuritidis
<400> 379
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 380
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435 440 445
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450 455 460
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Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
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Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
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Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
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Gln Ser Arg Phe Ala Asp Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
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Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
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Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
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Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
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Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
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<213> Prevotella pleuritidis
<400> 386
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 387
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Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
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325 330 335
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355 360 365
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Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
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Phe Lys Gly Gly Thr Gly Pro Tyr Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
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Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
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435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Cys Ala Gln Asp
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<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 401
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Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Ser Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Ala Arg Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Met Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Ser Gln Thr Thr Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Met Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Leu Lys
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Ile Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
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645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Lys Arg Leu Thr Pro
660 665 670
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675 680 685
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Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ile Gly Arg
705 710 715 720
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740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly Tyr Asp Glu Val Gly Ser Tyr Arg Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Cys Glu Asp Arg Val Gln Pro
785 790 795 800
Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
805 810 815
Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Glu Glu Trp Glu Arg Gly
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Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser His Ser Ala Ala Arg
835 840 845
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850 855 860
Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
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Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Lys Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
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Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr
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Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val Glu Arg Ile Ile
1160 1165 1170
Gln Val
1175
<210> 402
<211> 1145
<212> PRT
<213> Chryseobacterium sp. YR477
<400> 402
Met Glu Thr Gln Thr Ile Gly His Gly Ile Ala Tyr Asp His Ser Lys
1 5 10 15
Ile Gln Asp Lys His Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Glu Asn
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Asn Ile Lys Ala Val Leu Lys Ala Phe Ser Glu Lys Phe Asn Val Gly
35 40 45
Asn Val Asp Val Lys Gln Phe Ala Asp Val Ser Leu Lys Asp Asn Leu
50 55 60
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Pro Val Val Asp Phe Ile Asn Ile Pro Asn Asn Arg Ala Lys Phe Arg
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115 120 125
Ile Leu Leu Asp Asp Ile Phe Ala Arg Thr Ala Lys Glu Val Arg Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Glu Glu Leu Gln Lys Gly Tyr Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Ser Phe Glu Ser Ala Glu Asn Gly Ile Glu Ile Ser Gln Ser Gly Leu
225 230 235 240
Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Lys Arg Lys Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
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725 730 735
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755 760 765
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
Leu Ile Ala Glu Asn Leu Phe Gln Lys Val Phe Lys Tyr Ser Ala Lys
885 890 895
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915 920 925
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Lys Lys Gly Gln Ile Ile Glu Asn Ala Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly
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Lys Leu Asn Val Leu Ser Leu Asp Asp Lys Val Gln Thr Leu Leu Ser
965 970 975
Tyr Asp Asp Ala Lys Pro Trp Ser Lys Ile Ala Leu Glu Asn Glu Phe
980 985 990
Ser Ile Gly Glu Asn Ser Tyr Glu Val Ile Arg Arg Glu Lys Leu Phe
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Lys Glu Ile Gln Gln Phe Glu Ser Glu Ile Leu Phe Arg Ser Gly
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1070 1075 1080
Glu Leu Val Gln Leu Ala Phe Leu Val Thr Ala Ile Arg Asn Lys
1085 1090 1095
Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ala Lys Glu Phe Tyr Phe Tyr Ile
1100 1105 1110
Arg Ala Lys Tyr Gly Phe Ala Asp Glu Pro Ser Val Ala Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Tyr Ala Ile Asn Glu Phe Lys Lys Val
1130 1135 1140
Met Ile
1145
<210> 403
<211> 948
<212> PRT
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 403
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Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Arg
115 120 125
Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu Leu Ser Arg
130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn Lys Lys His
145 150 155 160
Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu Gln
165 170 175
Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr
180 185 190
Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
195 200 205
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210 215 220
Ile Gly Asp Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr Leu Leu Ser
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340 345 350
Arg His Ile Gln Arg Ile Tyr Lys Asp Phe Glu Glu Glu Arg Ile Asn
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile Ala Glu Thr
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Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser Ser Pro Lys
420 425 430
Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val Leu Ala Asp
435 440 445
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450 455 460
Gln Asn Gln Pro Ile Lys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Phe Trp
465 470 475 480
Phe Ile Arg Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Asn Arg Leu
485 490 495
Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr Asn Pro His
500 505 510
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515 520 525
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595 600 605
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Leu Trp Leu Met Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asn His Phe Lys Glu Leu
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Gln Glu Ala Asp Ala Lys Leu Asn Pro Leu Asn Gln Thr Leu Pro Met
740 745 750
Val Leu Pro Val Lys Val Tyr Pro Ala Thr Ala Phe Gly Glu Val Gln
755 760 765
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Lys Ala Leu Lys Met Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg
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Ala Leu Leu Glu Glu Trp Lys Lys Glu Tyr Ala Ala Ser Ser Met Val
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885 890 895
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900 905 910
Leu Phe Thr Val Ala Gln Pro Thr Thr Glu Glu Lys Asp Gly Leu Gly
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Ile Ala Glu Ala Leu Leu Lys Val Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val
930 935 940
Lys Ser Gln Ile
945
<210> 404
<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 404
Met Thr Glu Gln Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Ala His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
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165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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Pro Lys Leu Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
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Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Thr
325 330 335
Glu Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
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435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln Leu Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Ala Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Phe Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Glu Arg Leu Thr Pro
660 665 670
Tyr Phe Arg Gln Met Asn Leu Thr Gly Gly Asn Asn Pro His Pro Phe
675 680 685
Leu His Glu Thr Arg Trp Glu Ser His Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
690 695 700
Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gln Ser Ile Gly Arg
705 710 715 720
Ser Asp Arg Glu Glu Asn His Arg Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
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Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Ser Glu Phe His Leu
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Ser Asp Pro Leu Leu Asp Lys Trp Pro Asp Leu Gln Arg Glu Val
1040 1045 1050
Trp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr
1055 1060 1065
Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp
1070 1075 1080
Pro Ser Ser Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile
1085 1090 1095
Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Met Ala
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Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1115
<210> 408
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 408
Met Asn Thr Val Pro Ala Ser Glu Asn Lys Gly Gln Ser Arg Thr Val
1 5 10 15
Glu Asp Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Leu Tyr Leu Asn Leu Ala Arg Glu
20 25 30
Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
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Leu Ser Val Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
85 90 95
His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
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Gln Ser Arg Phe Ala Asp Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
165 170 175
Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
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Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
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Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
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Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
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Ser Arg Leu Leu Trp Asp Gly Ser Ser Asp Trp Ala Glu Ala Leu Thr
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Lys Arg Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Leu Met Leu Arg Phe
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Gly Glu Ile Glu Leu Asp Ser Tyr Ser Lys Lys Val Gly Arg Asn Gly
355 360 365
Glu Tyr Asp Arg Thr Ile Thr Asp His Ala Leu Ala Phe Gly Lys Leu
370 375 380
Ser Asp Phe Gln Asn Glu Glu Glu Val Ser Arg Met Ile Ser Gly Glu
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435 440 445
Gly Phe Ile Ser Val His Asp Leu Arg Lys Leu Leu Leu Met Glu Leu
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465 470 475 480
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485 490 495
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Arg Met Lys Glu Gln Asn Asp Leu Gln Asp Trp Ile Arg Asn Lys Gln
740 745 750
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Glu Leu Leu Lys Val Lys Asp Gly Lys Lys Lys Trp Asn Glu Ala Phe
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1070 1075 1080
Ser Ser Ala Lys Asp Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser
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Leu Trp Lys Lys Tyr Glu Met Ile Ile Arg Lys Ile Leu Pro Ile
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<212> PRT
<213> Rimerella anatipestifer
<400> 409
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<213> Flavobacterium columnare
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355 360 365
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Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
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Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
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420 425 430
Ile Gln Phe Asp Ser Glu Arg Ile Ile Lys Lys Glu Ile His Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Leu Gly Leu Val Thr Glu Tyr Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys
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Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
500 505 510
Gln Asn Arg Lys Arg Asn Leu Thr Phe Glu Lys Tyr Asn Lys Glu Gln
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Ser Lys Asp Ala Ile Ile Ala Met Leu Gln Lys Glu Ile Gly Val Lys
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Pro Ser Met Leu Tyr Glu Val Ile Val Lys Asp Ile Lys Gly Ala Glu
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595 600 605
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Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Ile Gln Lys Glu Leu Ala
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Leu Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Val Lys Gln His Glu Ile Glu Val
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Asn Asn Tyr Asn Arg Asn Lys Asn Thr Tyr Lys Phe Lys Asn Gln Pro
660 665 670
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675 680 685
Arg Asn Glu Ile Gly Gln Glu Ala Asn Trp Leu Ala Ser Asp Leu Ile
690 695 700
His Phe Met Lys Asn Lys Ser Leu Trp Lys Gly Tyr Met His Asn Glu
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740 745 750
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Tyr Lys Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Asp Phe Leu Asn Thr Glu Ser
770 775 780
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Lys Glu Leu Ser Lys Arg Leu Asn Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
805 810 815
Arg Gln Phe Ile Ile Lys Glu Leu Glu Glu Lys Lys Asn Asn Leu Tyr
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850 855 860
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Pro Asp Lys Ile Glu Asn Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Lys Asn Leu Arg
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Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
980 985 990
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Lys Leu Leu Lys Gln Val Gln Glu Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
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1070 1075 1080
Tyr Ile Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asn Glu Ser Glu Ile Ile Asn
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Leu Glu Asn Ile Asp Ile Glu Ile Leu Ile Lys Tyr Tyr Asp Tyr
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<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 411
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Tyr Ser His His Ser His Lys Lys Pro Asp Ala Glu Lys Asp Ile Phe
145 150 155 160
Lys His Leu Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu
165 170 175
Asp Tyr Lys Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Gln Asp Phe Ala His
180 185 190
Leu Asn Arg Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asp Arg
195 200 205
Tyr Arg Phe Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
210 215 220
Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Ser Glu Lys Met Thr
245 250 255
Thr Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu
260 265 270
Glu Ser Arg Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu
275 280 285
Leu Ser Arg Tyr Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asp
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Lys Lys Arg Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu
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Glu Glu Gln Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
325 330 335
Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys
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Leu Glu Val Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Gln Tyr Pro Tyr Asn
450 455 460
Ser Asp Phe Val Ala His Ala Phe Ile Ser Val His Glu Leu Leu Pro
465 470 475 480
Leu Met Phe Tyr Gln His Leu Thr Gly Lys Ser Glu Asp Leu Leu Lys
485 490 495
Glu Thr Val Arg His Ile Gln Arg Ile Tyr Lys Asp Phe Glu Glu Glu
500 505 510
Arg Ile Asn Thr Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Asn Gln Gly Arg Leu
515 520 525
Pro Leu Gly Ala Phe Pro Lys Gln Met Leu Gly Leu Leu Gln Asn Lys
530 535 540
Gln Pro Asp Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile
545 550 555 560
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser
565 570 575
Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
580 585 590
Leu Ala Asp Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala
595 600 605
Tyr Asp Ala Gln Asn Gln Pro Ile Glu Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr
610 615 620
Glu Phe Gln Leu Ile Gln Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys
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Asn Arg Leu Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr
645 650 655
Asn Pro His Pro Phe Leu Asn Lys Phe Asn Trp Lys Ala Cys Arg Asn
660 665 670
Leu Val Asp Phe Tyr Gln Gln Tyr Leu Glu Gln Arg Glu Lys Phe Leu
675 680 685
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690 695 700
Leu Lys Ile Pro Lys Glu Asn Arg Lys Asn Leu Val Lys Gly Trp Glu
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Gln Gly Gly Ile Ser Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Ala Ile Arg
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Ile Lys Lys His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu
755 760 765
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<400> 412
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500 505 510
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515 520 525
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Leu Arg Arg Pro Ser Ile Thr Pro Gln Asp Ile Glu Asp Arg Met Val
545 550 555 560
Glu Lys Leu Tyr Glu Arg Phe Gln Ile Ile Arg Asp Tyr Lys Pro Gly
565 570 575
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595 600 605
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<223> synthetic
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<223> Synthetic
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<211> 22
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<220>
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<400> 420
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<210> 421
<211> 21
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<220>
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<211> 28
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<220>
<223> Synthetic primer
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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000
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<212> RNA
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<211> 17
<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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aagauugcug uucuacc 17
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 432
uugauugcug uucuacc 17
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<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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uaguuugcug uucuacc 17
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<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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uagaaugcug uucuacc 17
<210> 435
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 435
uagauagcug uucuacc 17
<210> 436
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 436
uagauuccug uucuacc 17
<210> 437
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 437
auggauuacu ugguagaaca gaaucuacuc 30
<210> 438
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 438
auggauuacu ugguagaaca gaauguacuc 30
<210> 439
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 439
aagauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 440
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 440
uugauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 441
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 441
uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 442
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 442
uagaaugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 443
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 443
uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 444
uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 445
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 445
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 446
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 446
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 447
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 447
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
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<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 448
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 449
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 449
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 450
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 450
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 451
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 451
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 452
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 452
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 453
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 453
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 454
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 454
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 455
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 455
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 456
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 456
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 457
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 457
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 458
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 458
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 459
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 459
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 460
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 460
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 461
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 461
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 462
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 462
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 463
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum target
<400> 463
gaaattaata cgactcacta tagggttatt gcaattatta atcttgaacg aggaatg 57
<210> 464
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 464
gaaattaata cgactcacta taggggattg acagattaat agctctttct tgatttc 57
<210> 465
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 465
atttttcttg tccaaacaat tcatcatatc tt 32
<210> 466
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 466
ttcaatttca aataagaata tagtgtactc gc 32
<210> 467
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 467
gaaattaata cgactcacta tagggttctt attagcagaa caaagaagtt taacaac 57
<210> 468
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 468
gaaattaata cgactcacta tagggatttt atgcaatgtt aaaaactgtt ccaagta 57
<210> 469
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 469
taattgacat ccaatccata ataaagcata ga 32
<210> 470
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 470
gaattatagt tgttaaactt ctttgttctg ct 32
<210> 471
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 471
cctagtaagc atgattcatc agattgtggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 472
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 472
ggatggtgat gcatggccgt ttttagttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 473
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P falciparum
<400> 473
caatttaaaa tgatttttgg tgctagaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 474
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 474
gctggtttag taattgtatt attatcatgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 475
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 475
tacttggtag aacagcaatc tactcgacct gcaggcatgc aagcttggcg taatcatggt 60
catagctgtt tcctgtgttt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 120
aaag 124
<210> 476
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 476
atgaaccatc ttgtcgttag atgagctgga cgtccgtacg ttcgaaccgc attagtacca 60
gtatcgacaa aggacacaaa taggcgagtg ttaaggtgtg ttgtatgctc ggccttcgta 120
ttta 124
<210> 477
<211> 1389
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 477
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp
485 490 495
Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
565 570 575
Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile
580 585 590
Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
595 600 605
Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile
610 615 620
Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
625 630 635 640
Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
645 650 655
Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
660 665 670
Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro
675 680 685
Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn
690 695 700
Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu
705 710 715 720
Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu
725 730 735
Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu
740 745 750
Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
755 760 765
Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr
770 775 780
Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
785 790 795 800
Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys
805 810 815
Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile
820 825 830
Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser
835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
850 855 860
Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu
865 870 875 880
Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp
885 890 895
Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
900 905 910
Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn
915 920 925
Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp
930 935 940
Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile
945 950 955 960
Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu
965 970 975
Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys
980 985 990
Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser
995 1000 1005
Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys
1010 1015 1020
Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu
1025 1030 1035
Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys
1040 1045 1050
Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly
1055 1060 1065
Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile
1070 1075 1080
Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn
1085 1090 1095
Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn
1100 1105 1110
Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys
1115 1120 1125
Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn
1130 1135 1140
Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg
1145 1150 1155
Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr
1160 1165 1170
Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val
1190 1195 1200
Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn
1205 1210 1215
Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly
1220 1225 1230
Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu
1250 1255 1260
Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg
1265 1270 1275
Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
1280 1285 1290
Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser
1295 1300 1305
Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu
1310 1315 1320
Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys
1325 1330 1335
Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met
1340 1345 1350
Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser
1355 1360 1365
Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu
1370 1375 1380
Asn Thr Asn Asp Thr Leu
1385
<210> 478
<211> 1276
<212> PRT
<213> Blautia sp.Marseille-P2398 (C2-29)
<400> 478
Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Val Lys Ser Gly Ile Asp Gln Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln Arg Gly Met Leu Tyr Lys Gln Pro Gln Lys Lys Tyr
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Leu Glu Glu His Val Arg Asn Leu Ser Arg Lys Ala
35 40 45
Lys Ala Leu Tyr Gln Val Phe Pro Val Ser Gly Asn Ser Lys Met Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Gln Ile Ile Asn Ser Phe Ile Lys Asn Ile Leu Leu Arg
65 70 75 80
Leu Asp Ser Gly Lys Thr Ser Glu Glu Ile Val Gly Tyr Ile Asn Thr
85 90 95
Tyr Ser Val Ala Ser Gln Ile Ser Gly Asp His Ile Gln Glu Leu Val
100 105 110
Asp Gln His Leu Lys Glu Ser Leu Arg Lys Tyr Thr Cys Val Gly Asp
115 120 125
Lys Arg Ile Tyr Val Pro Asp Ile Ile Val Ala Leu Leu Lys Ser Lys
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Thr Leu Gln Tyr Asp Asn Ser Glu Leu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Asp Phe Ile Arg Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Gln
165 170 175
Ile Val His Ser Ile Glu Asn Asn Ser Thr Pro Leu Arg Ile Ala Glu
180 185 190
Ile Asn Gly Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ala Asn Val Asp Asn Pro Lys
195 200 205
Lys Ser Tyr Ile Phe Glu Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ser Asp Pro
210 215 220
Lys Gly Gln Glu Ser Leu Leu Gln His Met Arg Tyr Leu Ile Leu Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
Glu Ala Trp Asn Phe Gly Ser Ile Val Met Asp Asn Glu Gln Leu Phe
260 265 270
Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
Gln Ile Glu Glu Gly Arg Gln Ser Lys Asp Thr Ala Lys Val Lys Lys
290 295 300
Asn Lys Ser Lys Tyr Arg Met Leu Gly Asp Lys Ile Glu His Ser Ile
305 310 315 320
Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
325 330 335
Glu Lys Asp Ile Pro Trp Ile Lys Tyr Ile Ser Asp His Val Met Ser
340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
355 360 365
Tyr Leu Ala Lys Asn Thr Trp Asn Thr Trp Ile Ser Phe Ile Ala Met
370 375 380
Lys Tyr Val Asp Met Gly Lys Gly Val Tyr His Phe Ala Met Ser Asp
385 390 395 400
Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Phe Ser Asp Gly Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
Ala Glu Asp Asp Leu His Arg Ser Met Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Ala
435 440 445
Val Asn Asn Phe Ala Arg Ala Ile Cys Ser Asp Glu Phe Arg Lys Lys
450 455 460
Asn Arg Lys Glu Asp Val Leu Thr Val Gly Leu Asp Glu Ile Pro Leu
465 470 475 480
Tyr Asp Asn Val Lys Arg Lys Leu Leu Gln Tyr Phe Gly Gly Ala Ser
485 490 495
Asn Trp Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asp Asp Lys Asp Leu Val
500 505 510
Ala Cys Ile Lys Glu Asn Leu Tyr Val Ala Arg Asn Val Asn Phe His
515 520 525
Phe Ala Gly Ser Glu Lys Val Gln Lys Lys Gln Asp Asp Ile Leu Glu
530 535 540
Glu Ile Val Arg Lys Glu Thr Arg Asp Ile Gly Lys His Tyr Arg Lys
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ser Asn Asn Val Ala Val Phe Tyr Cys Asp Glu Asp Ile
565 570 575
Ile Lys Leu Met Asn His Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Pro Tyr Gln Ala
580 585 590
Gln Ile Pro Ser Tyr Asn Lys Val Ile Ser Lys Thr Tyr Leu Pro Asp
595 600 605
Leu Ile Phe Met Leu Leu Lys Gly Lys Asn Arg Thr Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Pro Ser Ile Met Asn Met Phe Arg Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Tyr Asn Asp Phe Leu Gln Ala Ser Asn Leu Lys Glu Met
645 650 655
Phe Cys Glu Gly Leu Lys Asn Asn Val Lys Asn Lys Lys Ser Glu Lys
660 665 670
Pro Tyr Gln Asn Phe Met Arg Arg Phe Glu Glu Leu Glu Asn Met Gly
675 680 685
Met Asp Phe Gly Glu Ile Cys Gln Gln Ile Met Thr Asp Tyr Glu Gln
690 695 700
Gln Asn Lys Gln Lys Lys Lys Thr Ala Thr Ala Val Met Ser Glu Lys
705 710 715 720
Asp Lys Lys Ile Arg Thr Leu Asp Asn Asp Thr Gln Lys Tyr Lys His
725 730 735
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<223> Porphyromonas gingivalis
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<210> 500
<211> 1119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Porphyromonas gingivalis
<400> 500
Met Thr Glu Gln Asn Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Asn Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Cys Gly Asn Asn Asp Asn Pro Phe Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Arg Glu Gly Lys Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Ala Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Ser Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Thr
325 330 335
Glu Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Thr Gln Thr Thr Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Ala Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Gly Glu Ile Asp Thr Leu Asp
530 535 540
Arg Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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705 710 715 720
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725 730 735
Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Ser Glu Phe His Leu
740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly Tyr Asp Glu Val Gly Ser Tyr Lys Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
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Phe Tyr Asp Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
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Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Lys Arg Ala Glu Glu Trp Glu Ser Gly
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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Trp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr
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Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp
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Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella intermedia
<400> 501
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Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
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Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
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210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
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275 280 285
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325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
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450 455 460
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
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705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
850 855 860
Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
865 870 875 880
Ile Asp Glu Leu Asn Ile Lys Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp
885 890 895
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900 905 910
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Gly Tyr Ile Ile Lys Asn Lys Pro Leu His Thr Ile Tyr Ile Lys Glu
930 935 940
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
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Ala Glu Ser Glu Ser Asn Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
980 985 990
Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Ala Arg Leu Asp Ile Ile Glu Asp Met Leu
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Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr
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Asp Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly Trp Leu Glu Leu Lys Gly
1025 1030 1035
Glu Ala Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr
1040 1045 1050
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
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Glu Asn Leu Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser
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Asn Ile Ile Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys
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Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
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<211> 1124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella aurantiaca
<400> 502
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1 5 10 15
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50 55 60
Asn Lys Asp Leu Asn Gln Lys Ala Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Gly Phe Lys Asp Asn Leu Glu Asn Lys Lys Lys Met Thr
225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu
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Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
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Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
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Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys
325 330 335
Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr
340 345 350
Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys
355 360 365
Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro
370 375 380
Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser
385 390 395 400
Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn
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Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Gly Asn Lys Glu Ile Trp Pro
420 425 430
Ser Leu Lys Thr Asn Asp Glu Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu
435 440 445
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485 490 495
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580 585 590
Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp
595 600 605
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Phe Tyr Tyr Ser Tyr Leu Thr Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu
675 680 685
Lys Pro Glu Asp Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu
690 695 700
Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe
705 710 715 720
Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
725 730 735
Arg His Gln Asn Asn Ser Lys Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ala Leu Asp
740 745 750
Arg Val Gly Leu Val Thr Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Glu Glu
755 760 765
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945 950 955 960
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella pallens
<400> 503
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Lys Asp Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His
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Asn Val Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Gly Glu Gly
35 40 45
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50 55 60
Glu Ile Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile
65 70 75 80
Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Val Thr Thr Tyr Gln Arg Asn Ser Ala
85 90 95
Asp Thr Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ala Ser Ile Gln Leu Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile
165 170 175
Lys Thr Glu Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys
180 185 190
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195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
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290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Ala Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
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450 455 460
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Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
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Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Asn Val Gln Thr Lys Asp Trp Met
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Ile Phe Ser Asp Asp Tyr Asp Ala Glu Glu Glu Pro Phe Lys Asn Thr
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Ile Arg Lys Glu Ile Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala
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1130
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella intermedia
<400> 513
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Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp
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Asn Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> Prevotella falsenii
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Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
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Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
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Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
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<223> Porphyromonas gingivalis
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<220>
<223> Psychroflexus torquis
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145 150 155 160
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Lys Gly Ile Pro Lys Ser Leu Phe Ala Asp Thr Asn Val Arg Val Asn
595 600 605
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<223> Porphyromonas gulae
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355 360 365
Met Glu Leu Tyr Asn Leu Leu Asp Lys Asn Ala Gly Gln Pro Phe Phe
370 375 380
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Val Arg Val Arg Arg Ile Gln Lys Glu Ile Asn Gly Tyr Gly Arg Met
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Ile Asn Phe Lys Leu Leu Asn Asp Ile Glu Ile Ser Ala Leu Phe Lys
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Lys Ala Lys Glu Val Leu Gly His Tyr Asn Leu Leu Ala Glu Gln Lys
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Glu Asn Leu Glu Phe Lys Lys Leu Ile Asp Glu His Phe Val Asn Ala
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Lys Lys Arg Leu Glu Arg Asn Ile Lys Lys Ser Lys Lys Leu Glu Lys
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275 280 285
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305 310 315 320
Asn Ile Ala Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Cys Ser Lys Met Glu Glu
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Val Gln Leu Asp Lys Met Ile Gly Asp Ser Phe Phe His Lys Ile Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cetobacterium sp, ZOR0034
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Tyr Gln Lys Gln Gly Gly Val Asp Thr Phe Asn Leu Lys Thr Ile Ile
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Ile Ser Ile Thr Lys Lys Asp Lys Val Leu Lys Lys Glu Ile Arg Lys
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Tyr Ser Leu Glu Leu Tyr Phe Lys Asn Glu Lys Lys Asp Thr Val Val
100 105 110
Ala Lys Val Thr Asp Leu Leu Lys Ala Pro Asp Lys Ile Glu Gly Glu
115 120 125
Arg Asn His Leu Arg Lys Leu Ser Ser Ser Thr Glu Arg Lys Leu Leu
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Ser Lys Thr Leu Cys Lys Asn Tyr Ser Glu Ile Ser Lys Thr Pro Ile
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165 170 175
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195 200 205
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<220>
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Trp Leu Leu Pro Glu Thr Lys Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Leu Leu
595 600 605
Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Tyr Glu Leu Lys Gly Asp Phe Leu Gly Phe
610 615 620
Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp Ile Lys Asn Val Asp Phe Ile Asp Glu
625 630 635 640
Asn Gln Asn Asn Ile Gln Val Ser Gln Thr Val Glu Lys Gln Glu Asp
645 650 655
Tyr Phe Tyr His Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Lys Tyr
660 665 670
Glu Ile Val Lys Tyr Ser Ile Val Pro Asn Glu Lys Leu Lys Gln Tyr
675 680 685
Phe Glu Asp Leu Gly Ile Asp Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Ser Val Glu
690 695 700
Ser Gly Glu Lys Trp Leu Gly Glu Asn Leu Gly Ile Asp Ile Lys Tyr
705 710 715 720
Leu Thr Val Glu Gln Lys Ser Glu Val Ser Glu Glu Lys Asn Lys Lys
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Val Ser Leu Lys Asn Asn Gly Met Phe Asn Lys Thr Ile Leu Leu Phe
740 745 750
Val Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ala Phe Lys Leu Phe Asn Asp Ile Glu
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770 775 780
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Ser Phe Ser Pro Glu Ile Ala Tyr Leu Arg Asn Phe Leu Ser His Leu
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Asn Tyr Ser Lys Phe Leu Asp Asn Phe Met Lys Ile Asn Thr Asn Lys
850 855 860
Ser Asp Glu Asn Lys Glu Val Leu Ile Pro Ser Ile Lys Ile Gln Lys
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Met Ile Gln Phe Ile Glu Lys Cys Asn Leu Gln Asn Gln Ile Asp Phe
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900 905 910
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915 920 925
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1070 1075 1080
Asn Lys Ile Phe Ile Ser Lys Asn Gly Lys Glu Ile Thr Ile Gln
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1100 1105 1110
Leu Lys Ile Ser Ser Asn Gly Lys Ile Ile Ser Leu Ile Pro His
1115 1120 1125
Tyr Ser Tyr Ser Ile Asp Val Lys Tyr
1130 1135
<210> 578
<211> 1158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusobacterium varium
<400> 578
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Ile Ser Asn Tyr Asp Met Lys Gly Ile Lys Glu Leu Lys Val Arg Tyr
20 25 30
Arg Lys Gln Ala Gln Leu Asp Thr Phe Ile Leu Gln Thr Thr Leu Asp
35 40 45
Lys Ser Asn Asn Ser Ile Leu Ile Asn Asp Phe Arg Val Lys Ala Arg
50 55 60
Glu Lys Tyr Arg Tyr Ser Phe Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Lys Phe Ser
65 70 75 80
Val Pro Ser Asn Ser Ile Ile Val Thr Lys Ile Asp Asn Ala Ala Pro
85 90 95
Glu Lys Ser Lys Glu Ile Arg Lys Tyr Lys Ile Thr Leu Gly Ile Asp
100 105 110
Glu Lys Cys Lys Thr Gly Ser Met Ile Thr Ala Ala Ile Glu Asp Leu
115 120 125
Leu Glu Asp Asp Arg Val Arg Glu Gly Ile Arg Asn Pro Arg Arg Lys
130 135 140
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145 150 155 160
Tyr Ala Gln Ile Thr Gln Cys Pro Val Glu Glu Ile Asp Ala Val Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Val Lys Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Asn Met Leu Leu
180 185 190
Phe Phe Ala Leu Ile Asn Asp Phe Leu Cys Lys Asn Leu Lys Asn Glu
195 200 205
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210 215 220
Asn Lys Lys Ile Asp Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Ile Leu Val Ala Gln
225 230 235 240
Ile Lys Glu Tyr Phe Thr Lys Glu Ile Glu Asn Tyr Asn Asn Arg Ile
245 250 255
Asp Asn Ile Ile Asp Lys Lys Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Glu Glu Lys
260 265 270
Glu Glu Ser Glu Lys Asn Lys Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Leu Glu
275 280 285
Ser Gln Lys Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu Glu Ile Lys Ala Asp Val
290 295 300
Ile Lys Ile Ile Lys Ile Phe Ser Asp Leu Arg His Ser Leu Met His
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Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Asn Glu
325 330 335
Glu Leu Ala Glu Leu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Lys Asn Leu Thr Leu
340 345 350
Leu Arg Gln Met Lys Ile Glu Asn Lys Thr Asn Tyr Leu Glu Gly Asp
355 360 365
Glu Lys Phe Asn Ile Leu Gly Lys Asp Val Arg Ala Lys Asn Ala Leu
370 375 380
Gly His Tyr Asp Leu Leu Val Glu Gln Lys Asn Gly Phe Asn Asn Phe
385 390 395 400
Ile Asn Ser Phe Phe Val Gln Asp Gly Thr Glu Asn Leu Glu Phe Lys
405 410 415
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Asp Ile Lys Asn Cys Lys Glu Ser Val Lys Lys Leu Glu Lys Lys Leu
435 440 445
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Lys Gln Lys Lys Leu Lys Glu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Lys Met Lys
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Gln His Tyr Lys Arg Leu Asn Cys Ala Tyr Val Trp Asp Ile His Ser
485 490 495
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595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
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Glu Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Gly Val Leu Lys Thr Ala Val Asn Gly
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<210> 579
<211> 1385
<212> PRT
<213> Leptotrichia sp oral taxon
<400> 579
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Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
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435 440 445
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450 455 460
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530 535 540
Phe Asn Leu Asn Gly Gln Lys Ile Thr Leu Lys Glu Lys Val Pro Ser
545 550 555 560
Phe Lys Leu Asn Ile Leu Lys Lys Leu Asn Phe Ile Asn Asn Glu Asn
565 570 575
Asn Ile Asp Glu Lys Leu Ser His Phe Tyr Ser Phe Gln Lys Glu Gly
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595 600 605
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Asp Val Ile Phe Glu Gly Lys Val Asp Ile Ile Asn Lys Ile Asn Ser
645 650 655
Leu Lys Ile Gly Glu Tyr Lys Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Ser Phe Ser
660 665 670
Lys Ile Val Leu Glu Ile Thr Arg Lys Phe Arg Glu Ile Asn Lys Asp
675 680 685
Lys Leu Phe Asp Ile Glu Ser Glu Lys Ile Ile Leu Asn Ala Val Lys
690 695 700
Tyr Val Asn Lys Ile Leu Tyr Glu Lys Ile Thr Ser Asn Glu Glu Asn
705 710 715 720
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725 730 735
Lys Lys Glu Asn Lys Asn Leu Leu Ser Ile Glu Glu Tyr Tyr Lys Asn
740 745 750
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755 760 765
Gln Asn Lys Val Thr Asn Ala Tyr Leu Glu Tyr Leu Glu Asn Thr Phe
770 775 780
Thr Glu Ile Ile Asp Phe Ser Lys Phe Asn Leu Asn Tyr Asp Glu Ile
785 790 795 800
Lys Thr Lys Ile Glu Glu Arg Lys Asp Asn Lys Ser Lys Ile Ile Ile
805 810 815
Asp Ser Ile Ser Thr Asn Ile Asn Ile Thr Asn Asp Ile Glu Tyr Ile
820 825 830
Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser Asn Thr Tyr Ile Asn Lys Ile
835 840 845
Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val Trp Leu Glu Lys Gln Asn Gly
850 855 860
Thr Lys Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Ile Ile Ser Ile Leu Asp Glu Val
865 870 875 880
Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
885 890 895
Leu Lys Asn Ala Ile Ile Asp Ala Lys Ile Val Glu Asn Asp Glu Thr
900 905 910
Tyr Ile Lys Asn Tyr Ile Phe Glu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Lys Lys
915 920 925
Arg Leu Phe Cys Glu Glu Leu Val Asp Lys Glu Asp Ile Arg Lys Ile
930 935 940
Phe Glu Asp Glu Asn Phe Lys Phe Lys Ser Phe Ile Lys Lys Asn Glu
945 950 955 960
Ile Gly Asn Phe Lys Ile Asn Phe Gly Ile Leu Ser Asn Leu Glu Cys
965 970 975
Asn Ser Glu Val Glu Ala Lys Lys Ile Ile Gly Lys Asn Ser Lys Lys
980 985 990
Leu Glu Ser Phe Ile Gln Asn Ile Ile Asp Glu Tyr Lys Ser Asn Ile
995 1000 1005
Arg Thr Leu Phe Ser Ser Glu Phe Leu Glu Lys Tyr Lys Glu Glu
1010 1015 1020
Ile Asp Asn Leu Val Glu Asp Thr Glu Ser Glu Asn Lys Asn Lys
1025 1030 1035
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1085 1090 1095
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1130 1135 1140
Ser Phe Gly Glu Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Lys Val Ser Glu Tyr
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1310 1315 1320
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Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu Asn Thr Asn Asp
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Thr Leu
1385
<210> 580
<211> 1389
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 580
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
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Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
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Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
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Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
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Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
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Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
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275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
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Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile
610 615 620
Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
625 630 635 640
Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
645 650 655
Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
660 665 670
Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro
675 680 685
Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn
690 695 700
Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu
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Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu
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Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu
740 745 750
Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
755 760 765
Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr
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Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
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Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys
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Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile
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Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser
835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
850 855 860
Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu
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Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp
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Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
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Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn
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Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile
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<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln
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<213> Listeria seeligeri
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485 490 495
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Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe
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<213> Lachnospiraceae bacterium
<400> 583
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Asn Met Ile His Asp Phe His Lys Gln Glu Asp Leu Ile Arg Glu Tyr
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Lys Leu Phe Ala Lys Lys Glu Met Lys Phe Ser Leu Gly Ser Gln Val
545 550 555 560
Val Ala Phe Ala Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Val Lys Lys Gly His Ser
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Tyr Gln Thr Ala Thr Glu Gly Thr Ala Asn Tyr Leu Gly Leu Ser Tyr
580 585 590
Tyr Asn Arg Tyr Glu Leu Lys Glu Glu Ser Phe Gln Ala Gln Tyr Tyr
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Leu Leu Lys Leu Ile Tyr Gln Tyr Val Phe Leu Pro Asn Phe Ser Gln
610 615 620
Gly Asn Ser Pro Ala Phe Arg Glu Thr Val Lys Ala Ile Leu Arg Ile
625 630 635 640
Asn Lys Asp Glu Ala Arg Lys Lys Met Lys Lys Asn Lys Lys Phe Leu
645 650 655
Arg Lys Tyr Ala Phe Glu Gln Val Arg Glu Met Glu Phe Lys Glu Thr
660 665 670
Pro Asp Gln Tyr Met Ser Tyr Leu Gln Ser Glu Met Arg Glu Glu Lys
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Val Arg Lys Ala Glu Lys Asn Asp Lys Gly Phe Glu Lys Asn Ile Thr
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1010 1015 1020
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115 120 125
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Met Leu Val Phe Thr Asn
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<213> Paludibacter propionicigenes
<400> 588
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Lys Leu Ile Tyr Asn Asn Leu Phe Leu Pro Gly Phe Thr Thr Asp Arg
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Lys Leu Asn Glu Val Pro Thr Lys Lys Ile Lys Glu Ile Tyr Asp Ile
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<211> 970
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis
<400> 589
Met Leu Ala Leu Leu His Gln Glu Val Pro Ser Gln Lys Leu His Asn
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195 200 205
Ala Arg Ala Asp Phe Leu Lys Lys Glu Leu Ile Glu Ser Thr Val Glu
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275 280 285
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Gly Phe Asp Ser His Met Arg Ser Ala Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn
565 570 575
Pro Arg Asn Gln Gly Leu Glu Gln Ser Glu Ile Glu Glu Met Ser Phe
580 585 590
Asp Ile Lys Val Glu Pro Ser Phe Leu Lys Asn Lys Asp Asp Tyr Ile
595 600 605
Ala Phe Trp Thr Phe Cys Lys Met Leu Asp Ala Arg His Leu Ser Glu
610 615 620
Leu Arg Asn Glu Met Ile Lys Tyr Asp Gly His Leu Thr Gly Glu Gln
625 630 635 640
Glu Ile Ile Gly Leu Ala Leu Leu Gly Val Asp Ser Arg Glu Asn Asp
645 650 655
Trp Lys Gln Phe Phe Ser Ser Glu Arg Glu Tyr Glu Lys Ile Met Lys
660 665 670
Gly Tyr Val Gly Glu Glu Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Tyr Arg Gln Ser
675 680 685
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740 745 750
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Lys Glu Cys Cys Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Asn Trp His Lys Asn Lys
770 775 780
Thr Thr Leu Val Tyr Val Asn Glu Leu His His Leu Leu Ile Glu Ile
785 790 795 800
Leu Gly Arg Tyr Val Gly Tyr Val Ala Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gln
805 810 815
Cys Met Ala Asn Gln Tyr Phe Lys His Ser Gly Ile Thr Glu Arg Val
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Phe Leu Lys Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Lys Asn Ala Arg Asn
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Leu Tyr Leu Ser Glu Arg Leu Arg Glu Ile Phe Lys Tyr Asp Arg Lys
885 890 895
Leu Lys Asn Ala Val Ser Lys Ser Leu Ile Asp Ile Leu Asp Arg His
900 905 910
Gly Met Ser Val Val Phe Ala Asn Leu Lys Glu Asn Lys His Arg Leu
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305 310 315 320
Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
325 330 335
Val Arg Met Gly Arg Val Ser Glu Tyr Arg Gly Gln Gln Ala Gly Asp
340 345 350
Leu Ala Gln Ser His Tyr Trp Thr Ser Ala Gly Gln Thr Glu Ile Lys
355 360 365
Glu Ser Glu Ile Phe Val Arg Leu Trp Val Gly Ala Phe Ala Leu Ala
370 375 380
Gly Arg Ser Met Lys Ala Trp Ile Asp Pro Met Gly Lys Ile Val Asn
385 390 395 400
Thr Glu Lys Asn Asp Arg Asp Leu Thr Ala Ala Val Asn Ile Arg Gln
405 410 415
Val Ile Ser Asn Lys Glu Met Val Ala Glu Ala Met Ala Arg Arg Gly
420 425 430
Ile Tyr Phe Gly Glu Thr Pro Glu Leu Asp Arg Leu Gly Ala Glu Gly
435 440 445
Asn Glu Gly Phe Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg
450 455 460
Asn Gln Thr Phe His Leu Gly Ala Arg Ala Gly Phe Leu Lys Glu Ile
465 470 475 480
Arg Lys Glu Leu Glu Lys Thr Arg Trp Gly Lys Ala Lys Glu Ala Glu
485 490 495
His Val Val Leu Thr Asp Lys Thr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ile Ile
500 505 510
Asp Asn Asp Ala Lys Ala Leu Gly Ala Arg Leu Leu Ala Asp Leu Ser
515 520 525
Gly Ala Phe Val Ala His Tyr Ala Ser Lys Glu His Phe Ser Thr Leu
530 535 540
Tyr Ser Glu Ile Val Lys Ala Val Lys Asp Ala Pro Glu Val Ser Ser
545 550 555 560
Gly Leu Pro Arg Leu Lys Leu Leu Leu Lys Arg Ala Asp Gly Val Arg
565 570 575
Gly Tyr Val His Gly Leu Arg Asp Thr Arg Lys His Ala Phe Ala Thr
580 585 590
Lys Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Arg Glu Leu Asp Asp Pro Ala Thr
595 600 605
Lys Ala Arg Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Gly Pro Phe Arg
610 615 620
Ala Tyr Ala Ser Gly Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ala
625 630 635 640
Arg Ala Lys Glu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Gln Ser Val Asn Val Thr
645 650 655
Lys Ala Tyr Ser Asp Val Met Glu Gly Arg Ser Ser Arg Leu Arg Pro
660 665 670
Pro Asn Asp Gly Glu Thr Leu Arg Glu Tyr Leu Ser Ala Leu Thr Gly
675 680 685
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690 695 700
Glu Asn Ala Arg Lys Gln Ala Glu Phe Ile Glu Asn Tyr Arg Arg Asp
705 710 715 720
Met Leu Ala Phe Met Phe Glu Asp Tyr Ile Arg Ala Lys Gly Phe Asp
725 730 735
Trp Ile Leu Lys Ile Glu Pro Gly Ala Thr Ala Met Thr Arg Ala Pro
740 745 750
Val Leu Pro Glu Pro Ile Asp Thr Arg Gly Gln Tyr Glu His Trp Gln
755 760 765
Ala Ala Leu Tyr Leu Val Met His Phe Val Pro Ala Ser Asp Val Ser
770 775 780
Asn Leu Leu His Gln Leu Arg Lys Trp Glu Ala Leu Gln Gly Lys Tyr
785 790 795 800
Glu Leu Val Gln Asp Gly Asp Ala Thr Asp Gln Ala Asp Ala Arg Arg
805 810 815
Glu Ala Leu Asp Leu Val Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Val Leu Phe
820 825 830
Leu Lys Thr Gly Glu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Ala Ala Pro Phe Asp
835 840 845
Leu Lys Pro Phe Arg Ala Leu Phe Ala Asn Pro Ala Thr Phe Asp Arg
850 855 860
Leu Phe Met Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Pro Ala Glu Asp Asp Pro
865 870 875 880
Glu Gly Asp Gly Ala Ser Glu Pro Glu Leu Arg Val Ala Arg Thr Leu
885 890 895
Arg Gly Leu Arg Gln Ile Ala Arg Tyr Asn His Met Ala Val Leu Ser
900 905 910
Asp Leu Phe Ala Lys His Lys Val Arg Asp Glu Glu Val Ala Arg Leu
915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
Thr Ile Glu Glu His Arg Phe Leu Val Gly Arg Val Tyr Leu Gly Asp
980 985 990
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1010 1015 1020
Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
1025 1030 1035
Ile Ala Gly Ala Ala Asn Thr Asp Ala Arg Thr Gln Thr Arg Lys
1040 1045 1050
Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala Asp Gly Thr Pro
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Asp Arg Lys Arg Lys Asn Ala Val Pro Arg Ser Ile Leu Asp Met
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Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
1130 1135 1140
Ala Arg Phe Ser Gln Asp Tyr Leu Gln Met Val Ala Ala Val Phe
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Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
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Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
1220 1225 1230
Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
1235 1240 1245
Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg Arg Tyr Arg Phe Arg Val
1250 1255 1260
Glu Ile Tyr Val Pro Pro Lys Ser Asn Thr Ser Lys Leu Asn Ala
1265 1270 1275
Ala Asp Leu Val Arg Ile Asp
1280 1285
<210> 594
<211> 1285
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 594
Met Gln Ile Gly Lys Val Gln Gly Arg Thr Ile Ser Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Leu Lys Arg Lys Ile Ser Thr Asp Gly Lys Asn Arg
20 25 30
Lys Glu Leu Pro Ala His Leu Ser Ser Asp Pro Lys Ala Leu Ile Gly
35 40 45
Gln Trp Ile Ser Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Arg Lys Pro Asp Ser Arg
50 55 60
Lys Ser Asp Gly Lys Ala Ile His Ser Pro Thr Pro Ser Lys Met Gln
65 70 75 80
Phe Asp Ala Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Phe Trp Lys Leu Val Ser
85 90 95
Glu Ala Gly Leu Ala Gln Asp Ser Asp Tyr Asp Gln Phe Lys Arg Arg
100 105 110
Leu His Pro Tyr Gly Asp Lys Phe Gln Pro Ala Asp Ser Gly Ala Lys
115 120 125
Leu Lys Phe Glu Ala Asp Pro Pro Glu Pro Gln Ala Phe His Gly Arg
130 135 140
Trp Tyr Gly Ala Met Ser Lys Arg Gly Asn Asp Ala Lys Glu Leu Ala
145 150 155 160
Ala Ala Leu Tyr Glu His Leu His Val Asp Glu Lys Arg Ile Asp Gly
165 170 175
Gln Pro Lys Arg Asn Pro Lys Thr Asp Lys Phe Ala Pro Gly Leu Val
180 185 190
Val Ala Arg Ala Leu Gly Ile Glu Ser Ser Val Leu Pro Arg Gly Met
195 200 205
Ala Arg Leu Ala Arg Asn Trp Gly Glu Glu Glu Ile Gln Thr Tyr Phe
210 215 220
Val Val Asp Val Ala Ala Ser Val Lys Glu Val Ala Lys Ala Ala Val
225 230 235 240
Ser Ala Ala Gln Ala Phe Asp Pro Pro Arg Gln Val Ser Gly Arg Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Lys Val Gly Phe Ala Leu Ala Glu His Leu Glu Arg Val
260 265 270
Thr Gly Ser Lys Arg Cys Ser Phe Asp Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Leu Ala Leu His Asp Glu Val Lys Lys Thr Tyr Lys Arg Leu Cys Ala
290 295 300
Arg Gly Lys Asn Ala Ala Arg Ala Phe Pro Ala Asp Lys Thr Glu Leu
305 310 315 320
Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
325 330 335
Val Arg Met Gly Arg Val Ser Glu Tyr Arg Gly Gln Gln Ala Gly Asp
340 345 350
Leu Ala Gln Ser His Tyr Trp Thr Ser Ala Gly Gln Thr Glu Ile Lys
355 360 365
Glu Ser Glu Ile Phe Val Arg Leu Trp Val Gly Ala Phe Ala Leu Ala
370 375 380
Gly Arg Ser Met Lys Ala Trp Ile Asp Pro Met Gly Lys Ile Val Asn
385 390 395 400
Thr Glu Lys Asn Asp Arg Asp Leu Thr Ala Ala Val Asn Ile Arg Gln
405 410 415
Val Ile Ser Asn Lys Glu Met Val Ala Glu Ala Met Ala Arg Arg Gly
420 425 430
Ile Tyr Phe Gly Glu Thr Pro Glu Leu Asp Arg Leu Gly Ala Glu Gly
435 440 445
Asn Glu Gly Phe Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg
450 455 460
Asn Gln Thr Phe His Leu Gly Ala Arg Ala Gly Phe Leu Lys Glu Ile
465 470 475 480
Arg Lys Glu Leu Glu Lys Thr Arg Trp Gly Lys Ala Lys Glu Ala Glu
485 490 495
His Val Val Leu Thr Asp Lys Thr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ile Ile
500 505 510
Asp Asn Asp Ala Lys Ala Leu Gly Ala Arg Leu Leu Ala Asp Leu Ser
515 520 525
Gly Ala Phe Val Ala His Tyr Ala Ser Lys Glu His Phe Ser Thr Leu
530 535 540
Tyr Ser Glu Ile Val Lys Ala Val Lys Asp Ala Pro Glu Val Ser Ser
545 550 555 560
Gly Leu Pro Arg Leu Lys Leu Leu Leu Lys Arg Ala Asp Gly Val Arg
565 570 575
Gly Tyr Val His Gly Leu Arg Asp Thr Arg Lys His Ala Phe Ala Thr
580 585 590
Lys Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Arg Glu Leu Asp Asp Pro Ala Thr
595 600 605
Lys Ala Arg Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Gly Pro Phe Arg
610 615 620
Ala Tyr Ala Ser Gly Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ala
625 630 635 640
Arg Ala Lys Glu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Gln Ser Val Asn Val Thr
645 650 655
Lys Ala Tyr Ser Asp Val Met Glu Gly Arg Ser Ser Arg Leu Arg Pro
660 665 670
Pro Asn Asp Gly Glu Thr Leu Arg Glu Tyr Leu Ser Ala Leu Thr Gly
675 680 685
Glu Thr Ala Thr Glu Phe Arg Val Gln Ile Gly Tyr Glu Ser Asp Ser
690 695 700
Glu Asn Ala Arg Lys Gln Ala Glu Phe Ile Glu Asn Tyr Arg Arg Asp
705 710 715 720
Met Leu Ala Phe Met Phe Glu Asp Tyr Ile Arg Ala Lys Gly Phe Asp
725 730 735
Trp Ile Leu Lys Ile Glu Pro Gly Ala Thr Ala Met Thr Arg Ala Pro
740 745 750
Val Leu Pro Glu Pro Ile Asp Thr Arg Gly Gln Tyr Glu His Trp Gln
755 760 765
Ala Ala Leu Tyr Leu Val Met His Phe Val Pro Ala Ser Asp Val Ser
770 775 780
Asn Leu Leu His Gln Leu Arg Lys Trp Glu Ala Leu Gln Gly Lys Tyr
785 790 795 800
Glu Leu Val Gln Asp Gly Asp Ala Thr Asp Gln Ala Asp Ala Arg Arg
805 810 815
Glu Ala Leu Asp Leu Val Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Val Leu Phe
820 825 830
Leu Lys Thr Gly Glu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Ala Ala Pro Phe Asp
835 840 845
Leu Lys Pro Phe Arg Ala Leu Phe Ala Asn Pro Ala Thr Phe Asp Arg
850 855 860
Leu Phe Met Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Pro Ala Glu Asp Asp Pro
865 870 875 880
Glu Gly Asp Gly Ala Ser Glu Pro Glu Leu Arg Val Ala Arg Thr Leu
885 890 895
Arg Gly Leu Arg Gln Ile Ala Arg Tyr Asn His Met Ala Val Leu Ser
900 905 910
Asp Leu Phe Ala Lys His Lys Val Arg Asp Glu Glu Val Ala Arg Leu
915 920 925
Ala Glu Ile Glu Asp Glu Thr Gln Glu Lys Ser Gln Ile Val Ala Ala
930 935 940
Gln Glu Leu Arg Thr Asp Leu His Asp Lys Val Met Lys Cys His Pro
945 950 955 960
Lys Thr Ile Ser Pro Glu Glu Arg Gln Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Lys
965 970 975
Thr Ile Glu Glu His Arg Phe Leu Val Gly Arg Val Tyr Leu Gly Asp
980 985 990
His Leu Arg Leu His Arg Leu Met Met Asp Val Ile Gly Arg Leu Ile
995 1000 1005
Asp Tyr Ala Gly Ala Tyr Glu Arg Asp Thr Gly Thr Phe Leu Ile
1010 1015 1020
Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
1025 1030 1035
Ile Ala Gly Ala Ala Asn Thr Asp Ala Arg Thr Gln Thr Arg Lys
1040 1045 1050
Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala Asp Gly Thr Pro
1055 1060 1065
Asp Leu Thr Ala Leu Val Asn Arg Ala Arg Glu Met Met Ala Tyr
1070 1075 1080
Asp Arg Lys Arg Lys Asn Ala Val Pro Arg Ser Ile Leu Asp Met
1085 1090 1095
Leu Ala Arg Leu Gly Leu Thr Leu Lys Trp Gln Met Lys Asp His
1100 1105 1110
Leu Leu Gln Asp Ala Thr Ile Thr Gln Ala Ala Ile Lys His Leu
1115 1120 1125
Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
1130 1135 1140
Ala Arg Phe Ser Gln Asp Tyr Leu Gln Met Val Ala Ala Val Phe
1145 1150 1155
Asn Gly Ser Val Gln Asn Pro Lys Pro Arg Arg Arg Asp Asp Gly
1160 1165 1170
Asp Ala Trp His Lys Pro Pro Lys Pro Ala Thr Ala Gln Ser Gln
1175 1180 1185
Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
1190 1195 1200
Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
1205 1210 1215
Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
1220 1225 1230
Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
1235 1240 1245
Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg Arg Tyr Arg Phe Arg Val
1250 1255 1260
Glu Ile Tyr Val Pro Pro Lys Ser Asn Thr Ser Lys Leu Asn Ala
1265 1270 1275
Ala Asp Leu Val Arg Ile Asp
1280 1285
<210> 595
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptotrichia buccalis
<400> 595
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly
405 410 415
Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn
420 425 430
Lys Lys Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp
435 440 445
Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile
450 455 460
Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe Asn Leu
465 470 475 480
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
565 570 575
Pro Lys Thr Asn Asp Asp Asn Lys Thr Lys Glu Ile Ile Asp Ala Gln
580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
595 600 605
Met Ser Asn Asn Gly Asn Phe Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ile Ile Glu
610 615 620
Leu Asn Lys Asn Asp Lys Arg Asn Leu Lys Thr Gly Phe Tyr Lys Leu
625 630 635 640
Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
Phe Met Thr Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Ile
690 695 700
Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
705 710 715 720
Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
725 730 735
Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
740 745 750
Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
755 760 765
Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
805 810 815
Glu Ala Asp Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Gly Asn Lys Val
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Lys Asp Asn Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe
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Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys
850 855 860
Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
885 890 895
Ile Glu Lys Asn His Lys Met Gln Glu Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala
900 905 910
Arg Pro Arg Lys Asp Glu Lys Phe Thr Asp Glu Asp Tyr Glu Ser Tyr
915 920 925
Lys Gln Ala Ile Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys
930 935 940
Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
945 950 955 960
Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
965 970 975
Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn Gln Tyr Ile Glu Glu Ile
980 985 990
Phe Asn Phe Glu Asn Lys Lys Asn Val Lys Tyr Lys Gly Gly Gln Ile
995 1000 1005
Val Glu Lys Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Leu His Gln Asn Asp
1010 1015 1020
Glu Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu
1025 1030 1035
Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His
1040 1045 1050
Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn
1070 1075 1080
Ala Val Met Lys Ser Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe
1085 1090 1095
Val Ala Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln
1100 1105 1110
Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys
1115 1120 1125
Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu
1130 1135 1140
Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met Glu Glu Lys Lys Ser Glu
1145 1150 1155
Asn
<210> 596
<211> 1285
<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 596
Met Lys Leu Thr Arg Arg Arg Ile Ser Gly Asn Ser Val Asp Gln Lys
1 5 10 15
Ile Thr Ala Ala Phe Tyr Arg Asp Met Ser Gln Gly Leu Leu Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Glu Asp Asn Asp Cys Thr Asp Lys Val Ile Glu Ser Met Asp
35 40 45
Phe Glu Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ile Leu Lys Asn Gly Glu Asp Asp
50 55 60
Lys Asn Pro Phe Tyr Met Phe Val Lys Gly Leu Val Gly Ser Asn Asp
65 70 75 80
Lys Ile Val Cys Glu Pro Ile Asp Val Asp Ser Asp Pro Asp Asn Leu
85 90 95
Asp Ile Leu Ile Asn Lys Asn Leu Thr Gly Phe Gly Arg Asn Leu Lys
100 105 110
Ala Pro Asp Ser Asn Asp Thr Leu Glu Asn Leu Ile Arg Lys Ile Gln
115 120 125
Ala Gly Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Pro Glu Leu Lys Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Met Ile Gln Lys Asp Ile Val Asn Arg Lys Glu Gln Leu Leu Lys
145 150 155 160
Ser Ile Lys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Ser Leu Glu Gly Ser Lys Leu
165 170 175
Val Pro Ser Thr Lys Lys Met Lys Trp Leu Phe Lys Leu Ile Asp Val
180 185 190
Pro Asn Lys Thr Phe Asn Glu Lys Met Leu Glu Lys Tyr Trp Glu Ile
195 200 205
Tyr Asp Tyr Asp Lys Leu Lys Ala Asn Ile Thr Asn Arg Leu Asp Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Lys Ala Arg Ser Ile Ser Arg Ala Val Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Arg Glu Tyr His Lys Asn Leu Arg Thr Asn Tyr Asn Arg Phe Val Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Pro Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gly Gly Ser Ala Lys Tyr
260 265 270
Asn Pro Asp Lys Glu Glu Phe Leu Leu Phe Leu Lys Glu Val Glu Gln
275 280 285
Tyr Phe Lys Lys Tyr Phe Pro Val Lys Ser Lys His Ser Asn Lys Ser
290 295 300
Lys Asp Lys Ser Leu Val Asp Lys Tyr Lys Asn Tyr Cys Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Val Val Lys Lys Glu Val Asn Arg Ser Ile Ile Asn Gln Leu Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ile Gln Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Asn Asp
340 345 350
Thr Trp Gln Glu Asp Phe Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Tyr Ile Gln
355 360 365
Val Glu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Val Met Thr Ser Leu Ser Trp Gly
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Ile Asn Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ile Asp Asp Ser Asn Thr Val Lys
385 390 395 400
Phe Asp Asp Ile Thr Thr Lys Lys Ala Lys Glu Ala Ile Glu Ser Asn
405 410 415
Tyr Phe Asn Lys Leu Arg Thr Cys Ser Arg Met Gln Asp His Phe Lys
420 425 430
Glu Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Val Tyr Val Lys Asp Lys Lys Asp
435 440 445
Arg Pro Asp Asp Asp Ile Glu Asn Leu Ile Val Leu Val Lys Asn Ala
450 455 460
Ile Glu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Asn Arg Thr Phe His Phe Lys Glu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ser Gly
485 490 495
Gln Asn Lys Ile Asp Tyr Ser Val Ala Ala Glu Phe Ile Lys Arg Asp
500 505 510
Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val Phe Arg Glu Gln Ile Arg Ser Leu Gly
515 520 525
Ile Ala Glu Tyr Tyr Lys Ala Asp Met Ile Ser Asp Cys Phe Lys Thr
530 535 540
Cys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Tyr Ser Pro Lys Asn Ser Leu Met Pro
545 550 555 560
Ala Phe Lys Asn Val Tyr Lys Arg Gly Ala Asn Leu Asn Lys Ala Tyr
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Ile Arg Asp Lys Gly Pro Lys Glu Thr Gly Asp Gln Gly Gln Asn Ser
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Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Glu Leu Thr Trp Tyr Ile Glu Val
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820 825 830
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Leu Val Arg Phe Thr Met Pro Ser Ile Pro Glu Ile Ser Ala Lys Ala
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915 920 925
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<213> Eubacterium rectale
<400> 597
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Met Lys Asn Tyr Lys Trp Arg Glu Ala Cys Ser Lys Tyr Val Glu Ser
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435 440 445
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Phe Lys Thr Ala Leu Val Asn Asp Glu Lys Trp Asn Thr Glu Leu Phe
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850 855 860
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885 890 895
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Phe Ala Ala Asp His Ile Leu Arg Asp Ile Val Glu Pro Val Ser Lys
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980 985 990
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Leu Tyr Gln Ile Ile Gly Met Tyr Val Asn Gly Val Thr Val Tyr
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1130 1135 1140
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Asn Gly Ile Asp His Phe Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Tyr Arg Ser
1160 1165 1170
Met Leu Ser Ile Tyr Ser Glu Val Phe Asp Arg Phe Phe Thr Tyr
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1190 1195 1200
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Ile Arg Lys Ile Leu Tyr Tyr Ala Glu Asn Glu Glu Asp Asn Leu
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Lys Asn Asn Asn Glu Arg Leu Ser Tyr Asn Pro Phe Ala Asn Leu
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Asn Phe Lys Leu Ser Asn
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<212> PRT
<213> Eubacteriaceae bacterium
<400> 598
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Lys Lys Asn Ile Ser Ala Asp Asp Glu Arg Gln Ile Lys Gln Leu Met
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225 230 235 240
Lys Ile Ser Asn Val Gly Lys Lys Thr Lys Thr Lys Gln Lys Glu Lys
245 250 255
Ala Gly Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ile Asp Glu Asn
260 265 270
Ser Arg Met Glu Tyr Leu Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Asp Thr Tyr
275 280 285
Phe Ala Ala Pro Ser Ser Tyr Ile Lys Gly Ala Ala Val Ser Leu Pro
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Ala Ala Lys Lys Val Asn Ile Asn Phe Val Glu Ile Pro Glu Ser Leu
325 330 335
Leu Asn Ala Glu Gln Asn Asn Asn Lys Ile Asn Lys Val Glu Gln Glu
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355 360 365
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Leu Asn Leu Leu Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr
435 440 445
His Phe Ala Leu Asp Asp Ile Trp Lys Ala Asp Ile Trp Lys Asp Ala
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Ser Asp Lys Asn Ser Gly Lys Ile Asn Asp Leu Thr Leu Lys Gly Ile
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530 535 540
Glu Ile Leu Ser Ala Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Arg Ser Leu Trp
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Lys Phe Leu Asp Asp Leu Lys Arg Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Asn Glu
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595 600 605
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Ala Leu Phe Glu Lys Ala Val Lys Ala Leu Lys Gly Ala Asp Lys Lys
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740 745 750
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Leu Ala Leu Tyr Gly Glu Ile Phe Asp Arg Phe Phe Thr Tyr Asp
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Leu Arg His Asn Val Ile Ile Lys Pro Ile Ile Ser Lys Asp Lys
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
Gly Glu Arg Lys Ile Asp Ala Lys Asn Arg Leu Tyr Leu Glu Thr
1280 1285 1290
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1295 1300 1305
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1310 1315 1320
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Gly Ile Lys Leu Glu
1370
<210> 599
<211> 1276
<212> PRT
<213> Blautia sp.
<400> 599
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225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
Glu Ala Trp Asn Phe Gly Ser Ile Val Met Asp Asn Glu Gln Leu Phe
260 265 270
Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
Gln Ile Glu Glu Gly Arg Gln Ser Lys Asp Thr Ala Lys Val Lys Lys
290 295 300
Asn Lys Ser Lys Tyr Arg Met Leu Gly Asp Lys Ile Glu His Ser Ile
305 310 315 320
Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
325 330 335
Glu Lys Asp Ile Pro Trp Ile Lys Tyr Ile Ser Asp His Val Met Ser
340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
355 360 365
Tyr Leu Ala Lys Asn Thr Trp Asn Thr Trp Ile Ser Phe Ile Ala Met
370 375 380
Lys Tyr Val Asp Met Gly Lys Gly Val Tyr His Phe Ala Met Ser Asp
385 390 395 400
Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Phe Ser Asp Gly Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
Ala Glu Asp Asp Leu His Arg Ser Met Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Ala
435 440 445
Val Asn Asn Phe Ala Arg Ala Ile Cys Ser Asp Glu Phe Arg Lys Lys
450 455 460
Asn Arg Lys Glu Asp Val Leu Thr Val Gly Leu Asp Glu Ile Pro Leu
465 470 475 480
Tyr Asp Asn Val Lys Arg Lys Leu Leu Gln Tyr Phe Gly Gly Ala Ser
485 490 495
Asn Trp Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asp Asp Lys Asp Leu Val
500 505 510
Ala Cys Ile Lys Glu Asn Leu Tyr Val Ala Arg Asn Val Asn Phe His
515 520 525
Phe Ala Gly Ser Glu Lys Val Gln Lys Lys Gln Asp Asp Ile Leu Glu
530 535 540
Glu Ile Val Arg Lys Glu Thr Arg Asp Ile Gly Lys His Tyr Arg Lys
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ser Asn Asn Val Ala Val Phe Tyr Cys Asp Glu Asp Ile
565 570 575
Ile Lys Leu Met Asn His Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Pro Tyr Gln Ala
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Gln Ile Pro Ser Tyr Asn Lys Val Ile Ser Lys Thr Tyr Leu Pro Asp
595 600 605
Leu Ile Phe Met Leu Leu Lys Gly Lys Asn Arg Thr Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Pro Ser Ile Met Asn Met Phe Arg Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Tyr Asn Asp Phe Leu Gln Ala Ser Asn Leu Lys Glu Met
645 650 655
Phe Cys Glu Gly Leu Lys Asn Asn Val Lys Asn Lys Lys Ser Glu Lys
660 665 670
Pro Tyr Gln Asn Phe Met Arg Arg Phe Glu Glu Leu Glu Asn Met Gly
675 680 685
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705 710 715 720
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Leu Asn Gln Tyr Ser Asp Cys Ser Glu Leu Ile Leu Lys Asp Ser Leu
785 790 795 800
Ala Ala Ala Trp Tyr Val Val Ala His Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu
805 810 815
Asn His Leu Ile Gly Asp Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Ser Asp
820 825 830
Ile Asp Arg Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asn Pro Val Ser Glu Ser Thr
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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<210> 600
<211> 1385
<212> PRT
<213> Leptotrichia sp.
<400> 600
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Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
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Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
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435 440 445
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660 665 670
Lys Ile Val Leu Glu Ile Thr Arg Lys Phe Arg Glu Ile Asn Lys Asp
675 680 685
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690 695 700
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725 730 735
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Thr Lys Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Ile Ile Ser Ile Leu Asp Glu Val
865 870 875 880
Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
885 890 895
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900 905 910
Tyr Ile Lys Asn Tyr Ile Phe Glu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Lys Lys
915 920 925
Arg Leu Phe Cys Glu Glu Leu Val Asp Lys Glu Asp Ile Arg Lys Ile
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965 970 975
Asn Ser Glu Val Glu Ala Lys Lys Ile Ile Gly Lys Asn Ser Lys Lys
980 985 990
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Thr Lys Ile Leu Phe Asp Asp Asp Ile Lys Lys Asn Lys Ile Ser
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1130 1135 1140
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1160 1165 1170
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1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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1220 1225 1230
Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Phe
1235 1240 1245
Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu Ser Glu Asn Ser
1250 1255 1260
Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser
1265 1270 1275
His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp Tyr Ser Ile Ala
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1295 1300 1305
Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu Val Phe Lys Lys
1310 1315 1320
Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Lys Phe Arg Leu
1325 1330 1335
Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met Lys Pro Lys Lys
1340 1345 1350
Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser Asp Tyr Ile Lys
1355 1360 1365
Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu Asn Thr Asn Asp
1370 1375 1380
Thr Leu
1385
<210> 601
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 601
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1 5 10 15
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Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
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Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
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Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
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Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
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660 665 670
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Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
690 695 700
Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
705 710 715 720
Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
725 730 735
Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Gln Tyr Glu Lys Val Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His
1085 1090 1095
Leu Ile Glu Glu Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile
1100 1105 1110
Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn
1115 1120 1125
Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys
1130 1135 1140
Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu Asp Val Asn Ile Asn Gln
1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys
1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
1205 1210 1215
Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 602
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 602
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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Ile Leu Gln Lys His Tyr Thr Glu Asn Ser Asp Leu Gln Asn Ala Leu
885 890 895
Ser Gln Asp Val Pro Val Lys Leu Asn Pro Thr Cys Asn Ala Ala Tyr
900 905 910
Leu Ile Thr Leu Phe Tyr Gln Thr Val Leu Lys Asp Asn Ala Gln Pro
915 920 925
Phe Tyr Leu Ser Asp Lys Thr Tyr Thr Arg Asn Lys Asp Gly Glu Lys
930 935 940
Ala Glu Ser Phe Ser Phe Lys Arg Ala Tyr Glu Leu Phe Ser Val Leu
945 950 955 960
Asn Asn Asn Lys Lys Asp Thr Phe Pro Phe Glu Met Ile Pro Leu Phe
965 970 975
Leu Thr Ser Asp Glu Ile Gln Glu Arg Leu Ser Ala Lys Leu Leu Asp
980 985 990
Gly Asp Gly Asn Pro Val Pro Glu Val Gly Glu Lys Gly Lys Pro Ala
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Thr Asp Ser Gln Gly Asn Thr Ile Trp Lys Arg Arg Ile Tyr Ser
1010 1015 1020
Glu Val Asp Asp Tyr Ala Glu Lys Leu Thr Asp Arg Asp Met Lys
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Ile Ser Phe Lys Gly Glu Trp Glu Lys Leu Pro Arg Trp Lys Gln
1040 1045 1050
Asp Lys Ile Ile Lys Arg Arg Asp Glu Thr Arg Arg Gln Met Arg
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1070 1075 1080
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Leu Phe Leu Leu Ala Glu Lys Met Phe Thr Asn Ile Ile Ser Glu
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Gln Ser Ser Glu Phe Asn Trp Lys Gln Met Arg Leu Ser Lys Val
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Arg Leu Met Ser Leu Leu Asn Asn Ile Val Glu Thr Leu Lys Pro
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1190 1195 1200
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Ile Gln Ser Ile Glu Asn Leu Ile Ile Thr Asn Asn Ala Val Leu
1220 1225 1230
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Lys Arg Asn Asn Phe Ala Ser Leu Leu Glu Leu Ile Asn Gln Leu
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Ile Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Ser Tyr Asn Ile Asp Phe Ser
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Leu Ile Lys Asp Val Lys His Leu Pro Glu Val Ala Lys Gly Ile
1295 1300 1305
Leu Gln His Leu Gln Ser Met Leu Gly Val Glu Ile Thr Lys
1310 1315 1320
<210> 606
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 606
Met Glu Lys Pro Leu Leu Pro Asn Val Tyr Thr Leu Lys His Lys Phe
1 5 10 15
Phe Trp Gly Ala Phe Leu Asn Ile Ala Arg His Asn Ala Phe Ile Thr
20 25 30
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35 40 45
Asp Lys Ile Val Asp Val Val Cys Glu Thr Trp Asn Asn Ile Leu Asn
50 55 60
Asn Asp His Asp Leu Leu Lys Lys Ser Gln Leu Thr Glu Leu Ile Leu
65 70 75 80
Lys His Phe Pro Phe Leu Thr Ala Met Cys Tyr His Pro Pro Lys Lys
85 90 95
Glu Gly Lys Lys Lys Gly His Gln Lys Glu Gln Gln Lys Glu Lys Glu
100 105 110
Ser Glu Ala Gln Ser Gln Ala Glu Ala Leu Asn Pro Ser Lys Leu Ile
115 120 125
Glu Ala Leu Glu Ile Leu Val Asn Gln Leu His Ser Leu Arg Asn Tyr
130 135 140
Tyr Ser His Tyr Lys His Lys Lys Pro Asp Ala Glu Lys Asp Ile Phe
145 150 155 160
Lys His Leu Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr
245 250 255
Thr Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu
260 265 270
Glu Ser Arg Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu
275 280 285
Leu Ser Arg Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn
290 295 300
Lys Lys His Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu
305 310 315 320
Glu Glu Gln Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
325 330 335
Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
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Lys Glu Leu Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala
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885 890 895
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900 905 910
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Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ile Lys Glu Glu Asn Asp
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Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val Lys Ser Gln Ile
1085 1090 1095
<210> 607
<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 607
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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595 600 605
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705 710 715 720
Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
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Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
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Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Lys Glu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
Leu Arg Leu Asn Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn
900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
Glu Ile Asp Asp Ser His Lys Ile Val Lys Asp Lys Pro Leu His Thr
930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
Lys Thr Asn Ser Glu Ala Glu Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Arg Ile Glu Ile
995 1000 1005
Ile Gln Asp Met Leu Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ile Asn Lys Tyr
1010 1015 1020
Lys Asp Leu Pro Thr Asn Lys Phe Ser Glu Met Leu Asn Ser Trp
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Leu Glu Gly Lys Asp Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Tyr Pro Met His Asn Lys Ile Glu Phe Ala Asn Ile Lys Pro Phe
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Ser Leu Tyr Thr Ala Asn Asn Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile
1085 1090 1095
Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile
1100 1105 1110
Lys Lys Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120
<210> 608
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 608
Met Glu Asp Lys Pro Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His
1 5 10 15
Asn Val Tyr Leu Thr Val Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Asp Leu Glu
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Thr Ile Asp Lys Asp Lys Arg Ser Thr Ser Thr Ser Asn Asp Ser Leu
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Leu Thr Pro Ala Ala Gln Asn Lys Phe Lys Val Pro Glu Lys Ser Ser
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355 360 365
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Tyr His Phe Ala Ile Cys Lys Lys Gln Ile Gly Asp Lys Lys Glu Val
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405 410 415
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Ile Gly Ile Lys Ile Phe Asp Gly Asp Thr Ala Val Asp Thr Asp Ile
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Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
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660 665 670
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675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
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Asn Glu Leu Gln Pro Gln Asn Trp Ala Ser Asp Asn Tyr Phe Leu Leu
740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
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770 775 780
Trp Phe Asn Glu His Lys Thr Ile Val Asp Ile Ser Asp Cys Asp Ile
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Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
1010 1015 1020
Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
1025 1030 1035
Ile Asp Ile Phe Gln Gln Thr Leu Gly Leu Glu Ala Gln Leu Leu
1040 1045 1050
Asp Lys Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu
1055 1060 1065
Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1085 1090 1095
Gln Tyr Pro Asp Ser Lys Lys Ile Ala Phe Arg Arg Ile Arg Lys
1100 1105 1110
Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 609
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 609
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
His Tyr His Leu Glu Asn Lys Lys Ile Gly Ile Ala Phe Lys Asn His
420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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1025 1030 1035
Glu Ala Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr
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Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
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1070 1075 1080
Asn Ile Ile Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys
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Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
1115 1120
<210> 610
<211> 1199
<212> PRT
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 610
Met Lys Asn Ile Gln Arg Leu Gly Lys Gly Asn Glu Phe Ser Pro Phe
1 5 10 15
Lys Lys Glu Asp Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ile Thr Arg Phe Gly Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Val Thr Tyr Asp Lys Asn Ser Ile Arg Tyr Met Ala Thr His Arg Met
325 330 335
Phe Ser Phe Leu Ala Tyr Lys Gly Leu Lys Arg Lys Ile Arg Thr Ser
340 345 350
Glu Ile Asn Tyr Asn Glu Asp Gly Gln Ala Ser Ser Thr Tyr Glu Lys
355 360 365
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385 390 395 400
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Lys Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu Asn Lys Lys Ala
485 490 495
Ile Phe Leu Asn Glu Arg Glu Glu Ile Lys Gly Trp Glu Val Phe Pro
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
Ile Val Glu Lys Ile Glu Thr Gln Ile Lys Gln Ile Ile Gly Lys Asp
645 650 655
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660 665 670
Ile Asn Arg Glu Lys Leu Leu Arg Asp Leu Glu Gln Glu Gln Gln Ile
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690 695 700
Asp Lys Lys Ser Lys Arg Lys His Glu Leu Tyr Pro Ser Glu Lys Gly
705 710 715 720
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys
725 730 735
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740 745 750
Tyr Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Ser Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Leu Ser Tyr Val Asn Glu Leu Leu Leu Asn Ile Gln Asn Phe Lys Asn
805 810 815
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820 825 830
Arg Lys Gln Asn Tyr Ile Ile Asn Pro Ile Asn Ile Gln Ile Gln Ser
835 840 845
Ile Leu Val Tyr Pro Ile Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Asp Glu Lys
850 855 860
Pro Thr Met Ile Asp Arg Glu Lys Phe Lys Glu Asn Lys Asp Thr Glu
865 870 875 880
Leu Ala Asp Trp Phe Met His Tyr Lys Asn Tyr Lys Glu Asp Asn Tyr
885 890 895
Gln Lys Phe Tyr Ala Tyr Pro Leu Glu Lys Val Glu Glu Lys Glu Lys
900 905 910
Phe Lys Arg Asn Lys Gln Ile Asn Lys Gln Lys Lys Asn Asp Val Tyr
915 920 925
Thr Leu Met Met Val Glu Tyr Ile Ile Gln Lys Ile Phe Gly Asp Lys
930 935 940
Phe Val Glu Glu Asn Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Phe Gln Ser Lys
945 950 955 960
Ala Glu Arg Gln Gln Asn Asn Thr His Ala Ala Thr Thr Gln Glu Arg
965 970 975
Asn Leu Asn Gly Ile Leu Asn Gln Pro Lys Asp Ile Lys Ile Gln Gly
980 985 990
Lys Ile Thr Val Lys Gly Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly Asn Phe Arg
995 1000 1005
Lys Tyr Glu Ile Asp Gln Arg Val Asn Thr Phe Leu Asp Tyr Glu
1010 1015 1020
Pro Arg Lys Glu Trp Met Ala Tyr Leu Pro Asn Asp Trp Lys Glu
1025 1030 1035
Lys Glu Lys Gln Gly Gln Leu Pro Pro Asn Asn Val Ile Asp Arg
1040 1045 1050
Gln Ile Ser Lys Tyr Glu Thr Val Arg Ser Lys Ile Leu Leu Lys
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Asp Val Gln Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Glu Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Glu His Arg His Asp Leu Lys Gln Gly Lys Tyr Tyr Asn Phe Lys
1085 1090 1095
Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly Leu Leu Arg Gln Leu Lys Asn Glu Asn
1100 1105 1110
Val Glu Asn Tyr Lys Val Phe Lys Leu Asn Thr Asn Pro Glu Lys
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Val Asn Ile Thr Gln Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln
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Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1190 1195
<210> 611
<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 611
Met Thr Glu Gln Ser Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
50 55 60
Lys Asn Phe Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Ile Asp His Glu His Asn Asp Glu Val
180 185 190
Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Gly Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Met Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Asp Asp Arg Ala Cys Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Met Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Ser Gln Thr Ser Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Met Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Arg Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Ile Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Met Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Ala Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Glu Arg Leu Thr Pro
660 665 670
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675 680 685
Leu His Glu Thr Arg Trp Glu Ser His Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
690 695 700
Arg Ser Tyr Leu Arg Ala Arg Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ile Gly Arg
705 710 715 720
Ser Asp Arg Val Glu Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
725 730 735
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740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly His Asp Glu Val Ala Ser Tyr Lys Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Cys Glu Asp Arg Val Gln Pro
785 790 795 800
Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
805 810 815
Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Glu Glu Trp Glu Arg Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ser Tyr Ser Ala Ala Arg
835 840 845
Arg Ile Glu Asp Ala Phe Ala Gly Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn
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Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
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Phe Glu Ser Lys Leu Lys Val Arg Ala Asp Arg Ile Asn Leu Ala Lys
885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
900 905 910
Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
Asp Ile Ile Thr Trp Met Met Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys
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Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
945 950 955 960
Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
His Lys Glu Glu Ala Pro Leu Ala Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp
995 1000 1005
Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp
1010 1015 1020
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu
1025 1030 1035
Ala Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
1040 1045 1050
Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Val Phe Glu Leu Thr
1055 1060 1065
Leu Arg Leu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Arg Tyr Pro His Leu Pro
1070 1075 1080
Asp Glu Ser Phe Arg Glu Met Leu Glu Ser Trp Ser Asp Pro Leu
1085 1090 1095
Leu Ala Lys Trp Pro Glu Leu His Gly Lys Val Arg Leu Leu Ile
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Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile Ala His Arg Leu
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Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val Glu Arg Ile Ile
1160 1165 1170
Gln Ala
1175
<210> 612
<211> 1090
<212> PRT
<213> Prevotella sp.
<400> 612
Met Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Ser Val Met Ala Met Leu Asn Ala Gln Thr Val Leu Asp His Ile
20 25 30
Gln Lys Val Ala Asp Ile Glu Gly Glu Gln Asn Glu Asn Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Trp Phe His Pro Val Met Ser His Leu Tyr Asn Ala Lys Asn Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp
100 105 110
Ile Phe Glu Val Leu Lys Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Met Tyr Arg
115 120 125
Asp Leu Thr Asn His Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gly
130 135 140
Cys Glu Phe Leu Thr Ser Thr Glu Gln Pro Leu Ser Gly Met Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Thr Val Ala Leu Arg Asn Met Asn Glu Arg Tyr Gly Tyr
165 170 175
Lys Thr Glu Asp Leu Ala Phe Ile Gln Asp Lys Arg Phe Lys Phe Val
180 185 190
Lys Asp Ala Tyr Gly Lys Lys Lys Ser Gln Val Asn Thr Gly Phe Phe
195 200 205
Leu Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu
210 215 220
Ser Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn
245 250 255
Ala Gln Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ile Ile Arg Ser Phe Gly Ile Asn
260 265 270
Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
Ser Val Ala Met Asp Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Cys Pro Asp Glu
290 295 300
Leu Phe Thr Thr Leu Ser Ala Glu Lys Gln Ser Arg Phe Arg Ile Ile
305 310 315 320
Ser Asp Asp His Asn Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Ser Asp Arg Phe
325 330 335
Val Pro Leu Leu Leu Gln Tyr Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Phe Asp His
340 345 350
Ile Arg Phe His Val Asn Met Gly Lys Leu Arg Tyr Leu Leu Lys Ala
355 360 365
Asp Lys Thr Cys Ile Asp Gly Gln Thr Arg Val Arg Val Ile Glu Gln
370 375 380
Pro Leu Asn Gly Phe Gly Arg Leu Glu Glu Ala Glu Thr Met Arg Lys
385 390 395 400
Gln Glu Asn Gly Thr Phe Gly Asn Ser Gly Ile Arg Ile Arg Asp Phe
405 410 415
Glu Asn Met Lys Arg Asp Asp Ala Asn Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr Ile
420 425 430
Val Asp Thr Tyr Thr His Tyr Ile Leu Glu Asn Asn Lys Val Glu Met
435 440 445
Phe Ile Asn Asp Lys Glu Asp Ser Ala Pro Leu Leu Pro Val Ile Glu
450 455 460
Asp Asp Arg Tyr Val Val Lys Thr Ile Pro Ser Cys Arg Met Ser Thr
465 470 475 480
Leu Glu Ile Pro Ala Met Ala Phe His Met Phe Leu Phe Gly Ser Lys
485 490 495
Lys Thr Glu Lys Leu Ile Val Asp Val His Asn Arg Tyr Lys Arg Leu
500 505 510
Phe Gln Ala Met Gln Lys Glu Glu Val Thr Ala Glu Asn Ile Ala Ser
515 520 525
Phe Gly Ile Ala Glu Ser Asp Leu Pro Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile
530 535 540
Ser Gly Asn Ala His Gly Lys Asp Val Asp Ala Phe Ile Arg Leu Thr
545 550 555 560
Val Asp Asp Met Leu Thr Asp Thr Glu Arg Arg Ile Lys Arg Phe Lys
565 570 575
Asp Asp Arg Lys Ser Ile Arg Ser Ala Asp Asn Lys Met Gly Lys Arg
580 585 590
Gly Phe Lys Gln Ile Ser Thr Gly Lys Leu Ala Asp Phe Leu Ala Lys
595 600 605
Asp Ile Val Leu Phe Gln Pro Ser Val Asn Asp Gly Glu Asn Lys Ile
610 615 620
Thr Gly Leu Asn Tyr Arg Ile Met Gln Ser Ala Ile Ala Val Tyr Asp
625 630 635 640
Ser Gly Asp Asp Tyr Glu Ala Lys Gln Gln Phe Lys Leu Met Phe Glu
645 650 655
Lys Ala Arg Leu Ile Gly Lys Gly Thr Thr Glu Pro His Pro Phe Leu
660 665 670
Tyr Lys Val Phe Ala Arg Ser Ile Pro Ala Asn Ala Val Glu Phe Tyr
675 680 685
Glu Arg Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Phe Tyr Leu Thr Gly Leu Ser Asn
690 695 700
Glu Ile Lys Lys Gly Asn Arg Val Asp Val Pro Phe Ile Arg Arg Asp
705 710 715 720
Gln Asn Lys Trp Lys Thr Pro Ala Met Lys Thr Leu Gly Arg Ile Tyr
725 730 735
Ser Glu Asp Leu Pro Val Glu Leu Pro Arg Gln Met Phe Asp Asn Glu
740 745 750
Ile Lys Ser His Leu Lys Ser Leu Pro Gln Met Glu Gly Ile Asp Phe
755 760 765
Asn Asn Ala Asn Val Thr Tyr Leu Ile Ala Glu Tyr Met Lys Arg Val
770 775 780
Leu Asp Asp Asp Phe Gln Thr Phe Tyr Gln Trp Asn Arg Asn Tyr Arg
785 790 795 800
Tyr Met Asp Met Leu Lys Gly Glu Tyr Asp Arg Lys Gly Ser Leu Gln
805 810 815
His Cys Phe Thr Ser Val Glu Glu Arg Glu Gly Leu Trp Lys Glu Arg
820 825 830
Ala Ser Arg Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gln Ala Ser Asn Lys Ile Arg
835 840 845
Ser Asn Arg Gln Met Arg Asn Ala Ser Ser Glu Glu Ile Glu Thr Ile
850 855 860
Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
865 870 875 880
Lys Val Ile Arg Arg Tyr Arg Val Gln Asp Ala Leu Leu Phe Leu Leu
885 890 895
Ala Lys Lys Thr Leu Thr Glu Leu Ala Asp Phe Asp Gly Glu Arg Phe
900 905 910
Lys Leu Lys Glu Ile Met Pro Asp Ala Glu Lys Gly Ile Leu Ser Glu
915 920 925
Ile Met Pro Met Ser Phe Thr Phe Glu Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Thr
930 935 940
Ile Thr Ser Glu Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
945 950 955 960
Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
965 970 975
Asp Ile Val Ser Lys Glu Asp Ile Met Glu Glu Phe Asn Lys Tyr Asp
980 985 990
Gln Cys Arg Pro Glu Ile Ser Ser Ile Val Phe Asn Leu Glu Lys Trp
995 1000 1005
Ala Phe Asp Thr Tyr Pro Glu Leu Ser Ala Arg Val Asp Arg Glu
1010 1015 1020
Glu Lys Val Asp Phe Lys Ser Ile Leu Lys Ile Leu Leu Asn Asn
1025 1030 1035
Lys Asn Ile Asn Lys Glu Gln Ser Asp Ile Leu Arg Lys Ile Arg
1040 1045 1050
Asn Ala Phe Asp His Asn Asn Tyr Pro Asp Lys Gly Val Val Glu
1055 1060 1065
Ile Lys Ala Leu Pro Glu Ile Ala Met Ser Ile Lys Lys Ala Phe
1070 1075 1080
Gly Glu Tyr Ala Ile Met Lys
1085 1090
<210> 613
<211> 1150
<212> PRT
<213> Flavobacterium branchiophilum
<400> 613
Met Glu Asn Leu Asn Lys Ile Leu Asp Lys Glu Asn Glu Ile Cys Ile
1 5 10 15
Ser Lys Ile Phe Asn Thr Lys Gly Ile Ala Ala Pro Ile Thr Glu Lys
20 25 30
Ala Leu Asp Asn Ile Lys Ser Lys Gln Lys Asn Asp Leu Asn Lys Glu
35 40 45
Ala Arg Leu His Tyr Phe Ser Ile Gly His Ser Phe Lys Gln Ile Asp
50 55 60
Thr Lys Lys Val Phe Asp Tyr Val Leu Ile Glu Glu Leu Lys Asp Glu
65 70 75 80
Lys Pro Leu Lys Phe Ile Thr Leu Gln Lys Asp Phe Phe Thr Lys Glu
85 90 95
Phe Ser Ile Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ser Ile Arg Asn Ile Asn
100 105 110
Asn His Tyr Val His Asn Phe Asn Asp Ile Asn Leu Asn Lys Ile Asp
115 120 125
Ser Asn Val Phe His Phe Leu Lys Glu Ser Phe Glu Leu Ala Ile Ile
130 135 140
Glu Lys Tyr Tyr Lys Val Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Phe Leu Lys Glu Leu Phe Ile Lys Asp Glu Asn Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Asn Tyr Phe Thr Asn Leu Ser Lys Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Ile
180 185 190
Leu Thr Phe Thr Ile Thr Glu Asn Lys Ile Trp Asn Ile Asn Asn Glu
195 200 205
His Asn Ile Leu Asn Ile Glu Lys Gly Lys Tyr Leu Thr Phe Glu Ala
210 215 220
Met Leu Phe Leu Ile Thr Ile Phe Leu Tyr Lys Asn Glu Ala Asn His
225 230 235 240
Leu Leu Pro Lys Leu Tyr Asp Phe Lys Asn Asn Lys Ser Lys Gln Glu
245 250 255
Leu Phe Thr Phe Phe Ser Lys Lys Phe Thr Ser Gln Asp Ile Asp Ala
260 265 270
Glu Glu Gly His Leu Ile Lys Phe Arg Asp Met Ile Gln Tyr Leu Asn
275 280 285
His Tyr Pro Thr Ala Trp Asn Asn Asp Leu Lys Leu Glu Ser Glu Asn
290 295 300
Lys Asn Lys Ile Met Thr Thr Lys Leu Ile Asp Ser Ile Ile Glu Phe
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Glu Leu Asn Ser Asn Tyr Pro Ser Phe Ala Thr Asp Ile Gln Phe Lys
325 330 335
Lys Glu Ala Lys Ala Phe Leu Phe Ala Ser Asn Lys Lys Arg Asn Gln
340 345 350
Thr Ser Phe Ser Asn Lys Ser Tyr Asn Glu Glu Ile Arg His Asn Pro
355 360 365
His Ile Lys Gln Tyr Arg Asp Glu Ile Ala Ser Ala Leu Thr Pro Ile
370 375 380
Ser Phe Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Ile Phe Val Lys Lys His
385 390 395 400
Val Leu Glu Glu Tyr Phe Pro Asn Ser Ile Gly Tyr Glu Lys Phe Leu
405 410 415
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420 425 430
Leu Tyr Ser Asn Pro Lys Thr Asn Lys Leu Ile Glu Arg Ile Asp Asn
435 440 445
His Lys Leu Val Lys Ser His Gly Arg Asn Gln Asp Arg Phe Met Asp
450 455 460
Phe Ser Met Arg Phe Leu Ala Glu Asn Asn Tyr Phe Gly Lys Asp Ala
465 470 475 480
Phe Phe Lys Cys Tyr Lys Phe Tyr Asp Thr Gln Glu Gln Asp Glu Phe
485 490 495
Leu Gln Ser Asn Glu Asn Asn Asp Asp Val Lys Phe His Lys Gly Lys
500 505 510
Val Thr Thr Tyr Ile Lys Tyr Glu Glu His Leu Lys Asn Tyr Ser Tyr
515 520 525
Trp Asp Cys Pro Phe Val Glu Glu Asn Asn Ser Met Ser Val Lys Ile
530 535 540
Ser Ile Gly Ser Glu Glu Lys Ile Leu Lys Ile Gln Arg Asn Leu Met
545 550 555 560
Ile Tyr Phe Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Asn Glu Asn Val Glu Asn Gln
565 570 575
Gly Tyr Lys Leu Val Asn Asn Tyr Tyr Arg Glu Leu Lys Lys Asp Val
580 585 590
Glu Glu Ser Ile Ala Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asp Phe
595 600 605
Lys Ser Lys Tyr Lys Lys Ile Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Asn Tyr
610 615 620
Ala Pro Ala Lys Gln Asp Lys Ala Pro Glu Asn Ala Phe Glu Thr Leu
625 630 635 640
Leu Lys Lys Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Lys
645 650 655
Lys Ala Glu His Glu Lys Asn Lys Glu Asp Phe Val Lys Arg Asn Lys
660 665 670
Gly Lys Gln Phe Lys Leu His Phe Ile Arg Lys Ala Cys Gln Met Met
675 680 685
Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Asn Thr Leu Lys Glu Gly Asn Ala Ala Phe
690 695 700
Glu Lys Lys Asp Pro Val Ile Glu Lys Arg Lys Asn Lys Glu His Glu
705 710 715 720
Phe Gly His His Lys Asn Leu Asn Ile Thr Arg Glu Glu Phe Asn Asp
725 730 735
Tyr Cys Lys Trp Met Phe Ala Phe Asn Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Lys
740 745 750
Tyr Leu Arg Asp Leu Phe Ser Glu Lys His Phe Phe Asp Asn Gln Glu
755 760 765
Tyr Lys Asn Leu Phe Glu Ser Ser Val Asn Leu Glu Ala Phe Tyr Ala
770 775 780
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785 790 795 800
Asn Asn Glu Asn Arg Tyr Thr Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Ile Leu
805 810 815
Gln Lys Gln Val Phe Ile Asn Val Tyr His Phe Ser Lys Tyr Leu Ile
820 825 830
Asp Lys Asn Leu Leu Asn Ser Glu Asn Asn Val Ile Gln Tyr Lys Ser
835 840 845
Leu Glu Asn Val Glu Tyr Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Phe Gln Ser Lys
850 855 860
Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
865 870 875 880
Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
900 905 910
Thr Ser Lys Ile Ile Leu Thr Ile Asn Asp Ala Asn Thr Pro Tyr Lys
915 920 925
Ile Ser Val Pro Phe Asn Lys Leu Glu Arg Tyr Thr Glu Met Ile Ala
930 935 940
Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
945 950 955 960
Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu Ile Ile Ile Lys Asn Asp Leu Glu Ile Glu Asp Ile Asn Thr
980 985 990
Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
995 1000 1005
Met Glu Leu Glu Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Asp Lys Cys Ile Leu
1010 1015 1020
Ser Lys Asn Tyr Ile Asp Asn Ser Glu Ile Pro Ser Leu Lys Gln
1025 1030 1035
Phe Ser Lys Val Trp Ile Lys Glu Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn
1040 1045 1050
Tyr Arg Asn Ile Ala Cys His Phe His Leu Pro Leu Leu Glu Thr
1055 1060 1065
Phe Asp Asn Leu Leu Leu Asn Val Glu Gln Lys Phe Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Glu Leu Gln Asn Val Ser Thr Ile Asn Asp Leu Ser Lys Pro Gln
1085 1090 1095
Glu Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Ile Lys Phe Lys His Asn Asn Phe
1100 1105 1110
Tyr Leu Asn Leu Phe Asn Lys Asn Glu Ser Lys Thr Ile Lys Asn
1115 1120 1125
Asp Lys Glu Val Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln Lys Phe Ile Asn
1130 1135 1140
Gln Val Ile Leu Lys Lys Lys
1145 1150
<210> 614
<211> 1119
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 614
Met Thr Glu Gln Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Ala His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Lys Tyr Gly Asn Asn Asp Asn Pro Phe Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Arg Glu Gly Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Ala Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Ser Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Thr
325 330 335
Glu Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Thr Gln Thr Thr Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Ala Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
Glu Leu Asp Ala Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Val Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Glu Lys Glu Arg Leu Thr Pro
660 665 670
Tyr Phe Arg Gln Met Asn Leu Thr Gly Gly Asn Asn Pro His Pro Phe
675 680 685
Leu His Glu Thr Arg Trp Glu Ser His Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
690 695 700
Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Arg Lys Ala Phe Leu Gln Ser Ile Gly Arg
705 710 715 720
Ser Asp Arg Val Glu Asn His Arg Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
725 730 735
Thr Asp Arg Gln Thr Leu Val Ala Gly Trp Lys Gly Glu Phe His Leu
740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
755 760 765
Gly Tyr Asp Glu Val Gly Ser Tyr Lys Glu Val Gly Phe Met Ala Lys
770 775 780
Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Ser Lys Asp Arg Val Gln Pro
785 790 795 800
Phe Tyr Asp Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
805 810 815
Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Lys Arg Ala Glu Glu Trp Glu Ser Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Leu Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala
835 840 845
Lys Glu His Pro Tyr His Asp Phe Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg
850 855 860
Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln Asp Ile Ile Thr Trp Met Met Cys
865 870 875 880
Arg Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr
885 890 895
Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Thr Asp Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu
900 905 910
Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr
915 920 925
Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val His Lys Glu Gln Ala Pro Leu Ala
930 935 940
Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn
945 950 955 960
Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe
965 970 975
Val Asp Thr Gly Ala Leu Ala Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Ala
995 1000 1005
Phe Glu Gln Thr Leu Glu Leu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Arg Tyr
1010 1015 1020
Pro His Leu Pro Asp Lys Asn Phe Arg Lys Met Leu Glu Ser Trp
1025 1030 1035
Ser Asp Pro Leu Leu Asp Lys Trp Pro Asp Leu His Gly Asn Val
1040 1045 1050
Arg Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr
1055 1060 1065
Pro Met Tyr Asp Glu Thr Leu Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp
1070 1075 1080
Pro Ser Ser Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile
1085 1090 1095
Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Met Val
1100 1105 1110
Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1115
<210> 615
<211> 1132
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 615
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Lys Glu Ser Thr Asn Met Leu Asp Asn
1 5 10 15
Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr
20 25 30
Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn Lys Lys
35 40 45
Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala Ile Lys
50 55 60
Thr His Trp Glu Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Glu Arg Leu
65 70 75 80
Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln Ala
100 105 110
Lys Ala Gln Ser Phe Asp Ser Leu Lys His Cys Leu Phe Leu Phe Leu
115 120 125
Glu Lys Leu Gln Glu Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys Lys Met
145 150 155 160
Tyr Asn Ile Phe Asp Asp Asn Ile Gln Leu Val Ile Lys Asp Tyr Gln
165 170 175
His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg
180 185 190
Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys Gly Asn
195 200 205
Ile Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys
210 215 220
Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn
225 230 235 240
Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg
245 250 255
Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp
260 265 270
Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu
275 280 285
Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val Pro Phe
290 295 300
Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn
305 310 315 320
Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
325 330 335
Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu
340 345 350
Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
355 360 365
Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln
370 375 380
Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Thr Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys
385 390 395 400
Asp Phe Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Glu Glu Pro Tyr Ile Ser Glu Thr
405 410 415
Ala Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg
420 425 430
Asn Asp Asn Asp Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu Asn
435 440 445
Asn Glu Lys Arg Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu Ala
450 455 460
Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
465 470 475 480
Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile Val
485 490 495
Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Ile Tyr Lys Leu Tyr Asp
500 505 510
Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr
515 520 525
Cys Glu Asp Lys Gly Ile Pro Lys Arg His Leu Pro Lys Gln Met Val
530 535 540
Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys Asp Met Ala Glu Glu Ala Lys Arg
545 550 555 560
Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu
565 570 575
Glu Lys Gln Thr Gln Gly Glu Ile Glu Asp Gly Gly Arg Asn Ile Arg
580 585 590
Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Asn Asn
610 615 620
Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ser Leu Ala
625 630 635 640
Leu Tyr Asn Lys Glu Glu Lys Pro Thr Arg Tyr Phe Arg Gln Val Asn
645 650 655
Leu Ile Asn Ser Ser Asn Pro His Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp
660 665 670
Glu Glu Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Ser Tyr Leu Thr Lys
675 680 685
Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn
690 695 700
Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu
705 710 715 720
Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr
725 730 735
Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys Arg His Gln Asn Asp Ser Glu Glu
740 745 750
Tyr Glu Lys Val Glu Thr Leu Asp Arg Val Gly Leu Val Thr Lys Val
755 760 765
Ile Pro Leu Phe Phe Lys Lys Glu Asp Ser Lys Asp Lys Glu Glu Tyr
770 775 780
Leu Lys Lys Asp Ala Gln Lys Glu Ile Asn Asn Cys Val Gln Pro Phe
785 790 795 800
Tyr Gly Phe Pro Tyr Asn Val Gly Asn Ile His Lys Pro Asp Glu Lys
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Asp Phe Leu Pro Ser Glu Glu Arg Lys Lys Leu Trp Gly Asp Lys Lys
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Tyr Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Val Lys Ser Lys Lys Leu Thr
835 840 845
Asp Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp
850 855 860
Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val
865 870 875 880
Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu Gly
885 890 895
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290 295 300
Leu Cys Glu Gln Lys Asn Gly Phe Asn Lys Phe Ile Asn Asp Phe Phe
305 310 315 320
Val Ser Asp Gly Glu Glu Asn Thr Val Phe Lys Gln Ile Ile Asn Glu
325 330 335
Lys Phe Gln Ser Glu Met Glu Phe Leu Glu Lys Arg Ile Ser Glu Ser
340 345 350
Glu Lys Lys Asn Glu Lys Leu Lys Lys Lys Phe Asp Ser Met Lys Ala
355 360 365
His Phe His Asn Ile Asn Ser Glu Asp Thr Lys Glu Ala Tyr Phe Trp
370 375 380
Asp Ile His Ser Ser Ser Asn Tyr Lys Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Lys
385 390 395 400
Asn Leu Val Asn Glu Tyr Thr Glu Leu Leu Gly Ser Ser Lys Glu Lys
405 410 415
Lys Leu Leu Arg Glu Glu Ile Thr Gln Ile Asn Arg Lys Leu Leu Lys
420 425 430
Leu Lys Gln Glu Met Glu Glu Ile Thr Lys Lys Asn Ser Leu Phe Arg
435 440 445
Leu Glu Tyr Lys Met Lys Ile Ala Phe Gly Phe Leu Phe Cys Glu Phe
450 455 460
Asp Gly Asn Ile Ser Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Ala Ser Asn Gln
465 470 475 480
Glu Lys Ile Ile Gln Tyr His Lys Asn Gly Glu Lys Tyr Leu Thr Tyr
485 490 495
Phe Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Phe Asn Leu Glu Lys Met Gln
500 505 510
Lys Ile Ile Gln Lys Thr Glu Glu Glu Asp Trp Leu Leu Pro Glu Thr
515 520 525
Lys Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Leu Leu Thr Tyr Leu Leu Leu Pro
530 535 540
Tyr Glu Leu Lys Gly Asp Phe Leu Gly Phe Val Lys Lys His Tyr Tyr
545 550 555 560
Asp Ile Lys Asn Val Asp Phe Met Asp Glu Asn Gln Asn Asn Ile Gln
565 570 575
Val Ser Gln Thr Val Glu Lys Gln Glu Asp Tyr Phe Tyr His Lys Ile
580 585 590
Arg Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Lys Tyr Glu Ile Val Lys Tyr Ser
595 600 605
Ile Val Pro Asn Glu Lys Leu Lys Gln Tyr Phe Glu Asp Leu Gly Ile
610 615 620
Asp Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Ser Val Glu Ser Gly Glu Lys Trp Leu
625 630 635 640
Gly Glu Asn Leu Gly Ile Asp Ile Lys Tyr Leu Thr Val Glu Gln Lys
645 650 655
Ser Glu Val Ser Glu Glu Lys Ile Lys Lys Phe Leu
660 665
<210> 620
<211> 1121
<212> PRT
<213> Fusobacterium perfoetens
<400> 620
Met Gly Lys Pro Asn Arg Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ile Ile Ser Asn
1 5 10 15
Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Lys Glu Val Lys Val Arg Tyr Asn Lys Gln
20 25 30
Ala Gln Leu Asp Thr Phe Leu Ile Lys Ser Glu Leu Lys Asp Gly Lys
35 40 45
Phe Ile Leu Tyr Ser Ile Val Asp Lys Ala Arg Glu Lys Tyr Arg Tyr
50 55 60
Ser Phe Glu Ile Asp Lys Thr Asn Ile Asn Lys Asn Glu Ile Leu Ile
65 70 75 80
Ile Lys Lys Asp Ile Tyr Ser Asn Lys Glu Asp Lys Val Ile Arg Lys
85 90 95
Tyr Ile Leu Ser Phe Glu Val Ser Glu Lys Asn Asp Arg Thr Ile Val
100 105 110
Thr Lys Ile Lys Asp Cys Leu Glu Thr Gln Lys Lys Glu Lys Phe Glu
115 120 125
Arg Glu Asn Thr Arg Arg Leu Ile Ser Glu Thr Glu Arg Lys Leu Leu
130 135 140
Ser Glu Glu Thr Gln Lys Thr Tyr Ser Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Asp Ser Val Lys Ile Tyr Lys Ile Lys Arg Tyr Leu Ala
165 170 175
Tyr Arg Ser Asn Met Leu Leu Phe Phe Ser Leu Ile Asn Asp Ile Phe
180 185 190
Val Lys Gly Val Val Lys Asp Asn Gly Glu Glu Val Gly Glu Ile Trp
195 200 205
Arg Ile Ile Asp Ser Lys Glu Ile Asp Glu Lys Lys Thr Tyr Asp Leu
210 215 220
Leu Val Glu Asn Phe Lys Lys Arg Met Ser Gln Glu Phe Ile Asn Tyr
225 230 235 240
Lys Gln Ser Ile Glu Asn Lys Ile Glu Lys Asn Thr Asn Lys Ile Lys
245 250 255
Glu Ile Glu Gln Lys Leu Lys Lys Glu Lys Tyr Lys Lys Glu Ile Asn
260 265 270
Arg Leu Lys Lys Gln Leu Ile Glu Leu Asn Arg Glu Asn Asp Leu Leu
275 280 285
Glu Lys Asp Lys Ile Glu Leu Ser Asp Glu Glu Ile Arg Glu Asp Ile
290 295 300
Glu Lys Ile Leu Lys Ile Tyr Ser Asp Leu Arg His Lys Leu Met His
305 310 315 320
Tyr Asn Tyr Gln Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Ile Ser
325 330 335
Lys Glu Lys Asn Glu Asp Val Asn Leu Thr Glu Leu Leu Asp Leu Asn
340 345 350
Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Val Arg Gln Leu Lys Leu Glu Asn Lys
355 360 365
Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Glu Asp Lys Ile Thr Val Leu Gly Val Ser
370 375 380
Asp Ser Ala Ile Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Leu Cys Glu Gln
385 390 395 400
Lys Asn Gly Phe Asn Asn Phe Ile Asn Ser Phe Phe Ser Asn Asp Gly
405 410 415
Glu Glu Asn Lys Ser Phe Lys Glu Lys Ile Asn Leu Ser Leu Glu Lys
420 425 430
Glu Ile Glu Ile Met Glu Lys Glu Thr Asn Glu Lys Ile Lys Glu Ile
435 440 445
Asn Lys Asn Glu Leu Gln Leu Met Lys Glu Gln Lys Glu Leu Gly Thr
450 455 460
Ala Tyr Val Leu Asp Ile His Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Ile Ser His
465 470 475 480
Asn Glu Arg Asn Lys Asn Val Lys Leu Gln Asn Asp Ile Met Asn Gly
485 490 495
Asn Arg Asp Lys Asn Ala Leu Asp Lys Ile Asn Lys Lys Leu Val Glu
500 505 510
Leu Lys Ile Lys Met Asp Lys Ile Thr Lys Arg Asn Ser Ile Leu Arg
515 520 525
Leu Lys Tyr Lys Leu Gln Val Ala Tyr Gly Phe Leu Met Glu Glu Tyr
530 535 540
Lys Gly Asn Ile Lys Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Ile Ser Lys Glu
545 550 555 560
Lys Ile Lys Ser Tyr Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Glu Val Lys
565 570 575
Ser Glu Lys Lys Tyr Ile Thr Lys Ile Leu Asn Ser Ile Glu Asp Ile
580 585 590
His Asn Ile Thr Trp Leu Lys Asn Gln Glu Glu Asn Asn Leu Phe Lys
595 600 605
Phe Tyr Val Leu Thr Tyr Ile Leu Leu Pro Phe Glu Phe Arg Gly Asp
610 615 620
Phe Leu Gly Phe Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp Ile Lys Asn Val Glu
625 630 635 640
Phe Leu Asp Glu Asn Asn Asp Arg Leu Thr Pro Glu Gln Leu Glu Lys
645 650 655
Met Lys Asn Asp Ser Phe Phe Asn Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn
660 665 670
Ser Lys Lys Tyr Asp Ile Leu Lys Glu Ser Ile Leu Thr Ser Glu Arg
675 680 685
Ile Gly Lys Tyr Phe Ser Leu Leu Asn Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Glu
690 695 700
Tyr Gly Gly Glu Glu Asn Arg Gly Ile Phe Asn Lys Asn Ile Ile Ile
705 710 715 720
Pro Ile Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Val Leu Lys Leu Tyr Asn Asp Val
725 730 735
Glu Leu Ala Met Leu Leu Thr Leu Ser Glu Ser Asp Glu Lys Asp Ile
740 745 750
Asn Lys Ile Lys Glu Leu Val Thr Leu Lys Glu Lys Val Ser Pro Lys
755 760 765
Lys Ile Asp Tyr Glu Lys Lys Tyr Lys Phe Ser Val Leu Leu Asp Cys
770 775 780
Phe Asn Arg Ile Ile Asn Leu Gly Lys Lys Asp Phe Leu Ala Ser Glu
785 790 795 800
Glu Val Lys Glu Val Ala Lys Thr Phe Thr Asn Leu Ala Tyr Leu Arg
805 810 815
Asn Lys Ile Cys His Leu Asn Tyr Ser Lys Phe Ile Asp Asp Leu Leu
820 825 830
Thr Ile Asp Thr Asn Lys Ser Thr Thr Asp Ser Glu Gly Lys Leu Leu
835 840 845
Ile Asn Asp Arg Ile Arg Lys Leu Ile Lys Phe Ile Arg Glu Asn Asn
850 855 860
Gln Lys Met Asn Ile Ser Ile Asp Tyr Asn Tyr Ile Asn Asp Tyr Tyr
865 870 875 880
Met Lys Lys Glu Lys Phe Ile Phe Gly Gln Arg Lys Gln Ala Lys Thr
885 890 895
Ile Ile Asp Ser Gly Lys Lys Ala Asn Lys Arg Asn Lys Ala Glu Glu
900 905 910
Leu Leu Lys Met Tyr Arg Val Lys Lys Glu Asn Ile Asn Leu Ile Tyr
915 920 925
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930 935 940
Leu Asp Lys Lys Leu Leu Lys Asp Ile Asp Phe Thr Asp Val Lys Ile
945 950 955 960
Lys Asn Lys Ser Phe Phe Glu Leu Lys Asn Asp Val Lys Glu Val Ala
965 970 975
Asn Ile Lys Gln Ala Leu Gln Lys His Ser Ser Glu Leu Ile Gly Ile
980 985 990
Tyr Lys Lys Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Arg Ser Ile Val Ser Lys
995 1000 1005
Leu Ile Tyr Asp Glu Glu Lys Val Leu Ser Ile Ile Ile Tyr Asp
1010 1015 1020
Lys Thr Asn Lys Lys Tyr Glu Asp Phe Leu Leu Glu Ile Arg Arg
1025 1030 1035
Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Gln Phe Leu Ile Asp Glu Lys Lys
1040 1045 1050
Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Thr Lys Glu Lys Lys
1055 1060 1065
Lys Val Val Val Lys Ile Gln Asn Asn Ser Glu Leu Val Ser Glu
1070 1075 1080
Pro Arg Ile Ile Lys Asn Lys Asp Lys Lys Lys Ala Lys Thr Pro
1085 1090 1095
Glu Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Leu Asp Leu Thr Asn His Tyr
1100 1105 1110
Cys Phe Asn Leu Lys Ile Thr Leu
1115 1120
<210> 621
<211> 897
<212> PRT
<213> Fusobacterium ulcerans
<400> 621
Met Glu Asn Lys Gly Asn Asn Lys Lys Ile Asp Phe Asp Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Ile Leu Val Ala Gln Ile Lys Glu Tyr Phe Thr Lys Glu Ile Glu
20 25 30
Asn Tyr Asn Asn Arg Ile Asp Asn Ile Ile Asp Lys Lys Glu Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Ser Glu Lys Lys Glu Glu Ser Glu Lys Asn Lys Lys Leu Glu
50 55 60
Glu Leu Asn Lys Leu Lys Ser Gln Lys Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Asp Val Ile Lys Ile Ile Lys Ile Phe Ser Asp Leu
85 90 95
Arg His Ser Leu Met His Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Glu Asn Leu Phe
100 105 110
Glu Asn Lys Lys Asn Glu Glu Leu Ala Glu Leu Leu Asn Leu Asn Leu
115 120 125
Phe Lys Asn Leu Thr Leu Leu Arg Gln Met Lys Ile Glu Asn Lys Thr
130 135 140
Asn Tyr Leu Glu Gly Arg Glu Glu Phe Asn Ile Ile Gly Lys Asn Ile
145 150 155 160
Lys Ala Lys Glu Val Leu Gly His Tyr Asn Leu Leu Ala Glu Gln Lys
165 170 175
Asn Gly Phe Asn Asn Phe Ile Asn Ser Phe Phe Val Gln Asp Gly Thr
180 185 190
Glu Asn Leu Glu Phe Lys Lys Leu Ile Asp Glu His Phe Val Asn Ala
195 200 205
Lys Lys Arg Leu Glu Arg Asn Ile Lys Lys Ser Lys Lys Leu Glu Lys
210 215 220
Glu Leu Glu Lys Met Glu Gln His Tyr Gln Arg Leu Asn Cys Ala Tyr
225 230 235 240
Val Trp Asp Ile His Thr Ser Thr Thr Tyr Lys Lys Leu Tyr Asn Lys
245 250 255
Arg Lys Ser Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ile Asn Glu Ile Lys
260 265 270
Asp Lys Glu Val Ile Thr Ala Ile Asn Val Glu Leu Leu Arg Ile Lys
275 280 285
Lys Glu Met Glu Glu Ile Thr Lys Ser Asn Ser Leu Phe Arg Leu Lys
290 295 300
Tyr Lys Met Gln Ile Ala Tyr Ala Phe Leu Glu Ile Glu Phe Gly Gly
305 310 315 320
Asn Ile Ala Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Cys Ser Lys Met Glu Glu
325 330 335
Val Gln Lys Tyr Leu Lys Lys Gly Val Lys Tyr Leu Lys Tyr Tyr Lys
340 345 350
Asp Lys Glu Ala Gln Lys Asn Tyr Glu Phe Pro Phe Glu Glu Ile Phe
355 360 365
Glu Asn Lys Asp Thr His Asn Glu Glu Trp Leu Glu Asn Thr Ser Glu
370 375 380
Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Ile Leu Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Met
385 390 395 400
Glu Phe Lys Gly Asp Phe Leu Gly Val Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp
405 410 415
Ile Lys Asn Val Asp Phe Thr Asp Glu Ser Glu Lys Glu Leu Ser Gln
420 425 430
Val Gln Leu Asp Lys Met Ile Gly Asp Ser Phe Phe His Lys Ile Arg
435 440 445
Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Arg Tyr Glu Ile Ile Lys Tyr Ser Ile
450 455 460
Leu Thr Ser Asp Glu Ile Lys Arg Tyr Phe Arg Leu Leu Glu Leu Asp
465 470 475 480
Val Pro Tyr Phe Glu Tyr Glu Lys Gly Thr Asp Glu Ile Gly Ile Phe
485 490 495
Asn Lys Asn Ile Ile Leu Thr Ile Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ile Phe
500 505 510
Arg Leu Tyr Asn Asp Leu Glu Ile His Gly Leu Phe Asn Ile Ser Ser
515 520 525
Asp Leu Asp Lys Ile Leu Arg Asp Leu Lys Ser Tyr Gly Asn Lys Asn
530 535 540
Ile Asn Phe Arg Glu Phe Leu Tyr Val Ile Lys Gln Asn Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ser Thr Glu Glu Glu Tyr Arg Lys Ile Trp Glu Asn Leu Glu Ala Lys
565 570 575
Tyr Leu Arg Leu His Leu Leu Thr Pro Glu Lys Glu Glu Ile Lys Thr
580 585 590
Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Lys Leu Asn Glu Ile Ser Asn Leu Arg
595 600 605
Asn Gly Ile Cys His Leu Asn Tyr Lys Glu Ile Ile Glu Glu Ile Leu
610 615 620
Lys Thr Glu Ile Ser Glu Lys Asn Lys Glu Ala Thr Leu Asn Glu Lys
625 630 635 640
Ile Arg Lys Val Ile Asn Phe Ile Lys Glu Asn Glu Leu Asp Lys Val
645 650 655
Glu Leu Gly Phe Asn Phe Ile Asn Asp Phe Phe Met Lys Lys Glu Gln
660 665 670
Phe Met Phe Gly Gln Ile Lys Gln Val Lys Glu Gly Asn Ser Asp Ser
675 680 685
Ile Thr Thr Glu Arg Glu Arg Lys Glu Lys Asn Asn Lys Lys Leu Lys
690 695 700
Glu Thr Tyr Glu Leu Asn Cys Asp Asn Leu Ser Glu Phe Tyr Glu Thr
705 710 715 720
Ser Asn Asn Leu Arg Glu Arg Ala Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Asp
725 730 735
Ser Ala Phe Leu Lys Lys Ile Gly Leu Tyr Lys Val Lys Asn Asn Lys
740 745 750
Val Asn Ser Lys Val Lys Asp Glu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Ile Lys
755 760 765
Arg Lys Leu Leu Lys Asp Ser Ser Asp Ile Met Gly Met Tyr Lys Ala
770 775 780
Glu Val Val Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Leu Ile Phe Lys His
785 790 795 800
Asp Glu Glu Lys Arg Ile Tyr Val Thr Val Tyr Asp Thr Ser Lys Ala
805 810 815
Val Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Ile Leu Val Lys Arg Asn Asn Ser
820 825 830
Lys Glu Glu Tyr Phe Phe Glu Asp Asn Asn Lys Lys Tyr Val Thr Glu
835 840 845
Tyr Tyr Thr Leu Glu Ile Thr Glu Thr Asn Glu Leu Lys Val Ile Pro
850 855 860
Ala Lys Lys Leu Glu Gly Lys Glu Phe Lys Thr Glu Lys Asn Lys Glu
865 870 875 880
Asn Lys Leu Met Leu Asn Asn His Tyr Cys Phe Asn Val Lys Ile Ile
885 890 895
Tyr
<210> 622
<211> 1111
<212> PRT
<213> Anaerosalibacter sp.
<400> 622
Met Lys Ser Gly Arg Arg Glu Lys Ala Lys Ser Asn Lys Ser Ser Ile
1 5 10 15
Val Arg Val Ile Ile Ser Asn Phe Asp Asp Lys Gln Val Lys Glu Ile
20 25 30
Lys Val Leu Tyr Thr Lys Gln Gly Gly Ile Asp Val Ile Lys Phe Lys
35 40 45
Ser Thr Glu Lys Asp Glu Lys Gly Arg Met Lys Phe Asn Phe Asp Cys
50 55 60
Ala Tyr Asn Arg Leu Glu Glu Glu Glu Phe Asn Ser Phe Gly Gly Lys
65 70 75 80
Gly Lys Gln Ser Phe Phe Val Thr Thr Asn Glu Asp Leu Thr Glu Leu
85 90 95
His Val Thr Lys Arg His Lys Thr Thr Gly Glu Ile Ile Lys Asp Tyr
100 105 110
Thr Ile Gln Gly Lys Tyr Thr Pro Ile Lys Gln Asp Arg Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Ser Ile Thr Asp Asn Lys Asp His Phe Asp Ser Asn Asp Leu
130 135 140
Gly Asp Lys Ile Arg Leu Ser Arg Ser Leu Thr Gln Tyr Thr Asn Arg
145 150 155 160
Ile Leu Leu Asp Ala Asp Val Met Lys Asn Tyr Arg Glu Ile Val Cys
165 170 175
Ser Asp Ser Glu Lys Val Asp Glu Thr Ile Asn Ile Asp Ser Gln Glu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ile Asn Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Asn Met Ile Ile
195 200 205
Tyr Tyr Gln Met Ile Asn Asn Phe Leu Leu His Tyr Asp Gly Glu Glu
210 215 220
Asp Lys Gly Gly Asn Asp Ser Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ile Trp Lys
225 230 235 240
Tyr Glu Asn Lys Lys Asn Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Arg Ser
245 250 255
Tyr Lys Ser Ile Glu Lys Ser Ile Asn Gln Tyr Ile Leu Asn His Asn
260 265 270
Thr Glu Val Glu Ser Gly Asp Lys Glu Lys Lys Ile Asp Ile Ser Glu
275 280 285
Glu Arg Ile Lys Glu Asp Leu Lys Lys Thr Phe Ile Leu Phe Ser Arg
290 295 300
Leu Arg His Tyr Met Val His Tyr Asn Tyr Lys Phe Tyr Glu Asn Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Gly Lys Asn Phe Ile Ile Tyr Asn Lys Asp Lys Ser Lys Ser
325 330 335
Arg Arg Phe Ser Glu Leu Leu Asp Leu Asn Ile Phe Lys Glu Leu Ser
340 345 350
Lys Ile Lys Leu Val Lys Asn Arg Ala Val Ser Asn Tyr Leu Asp Lys
355 360 365
Lys Thr Thr Ile His Val Leu Asn Lys Asn Ile Asn Ala Ile Lys Leu
370 375 380
Leu Asp Ile Tyr Arg Asp Ile Cys Glu Thr Lys Asn Gly Phe Asn Asn
385 390 395 400
Phe Ile Asn Asn Met Met Thr Ile Ser Gly Glu Glu Asp Lys Glu Tyr
405 410 415
Lys Glu Met Val Thr Lys His Phe Asn Glu Asn Met Asn Lys Leu Ser
420 425 430
Ile Tyr Leu Glu Asn Phe Lys Lys His Ser Asp Phe Lys Thr Asn Asn
435 440 445
Lys Lys Lys Glu Thr Tyr Asn Leu Leu Lys Gln Glu Leu Asp Glu Gln
450 455 460
Lys Lys Leu Arg Leu Trp Phe Asn Ala Pro Tyr Val Tyr Asp Ile His
465 470 475 480
Ser Ser Lys Lys Tyr Lys Glu Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Tyr Val
485 490 495
Asp Ile His Ser Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asn Asn Asp Asn Lys
500 505 510
Lys Lys Leu Asn Glu Ile Asn Val Lys Leu Cys Glu Leu Asn Thr Glu
515 520 525
Met Lys Glu Met Thr Lys Leu Asn Ser Lys Tyr Arg Leu Gln Tyr Lys
530 535 540
Leu Gln Leu Ala Phe Gly Phe Ile Leu Glu Glu Phe Asn Leu Asp Ile
545 550 555 560
Asp Lys Phe Val Ser Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Leu Thr Ile Ser
565 570 575
Lys Phe Met Glu Lys Arg Glu Thr Tyr Leu Ser Lys Ser Leu Asp Arg
580 585 590
Arg Asp Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ile Lys Asp Tyr Lys Phe Arg Asp
595 600 605
Thr Glu Asp Ile Phe Cys Ser Asp Arg Glu Asn Asn Leu Val Lys Leu
610 615 620
Tyr Ile Leu Met Tyr Ile Leu Leu Pro Val Glu Ile Arg Gly Asp Phe
625 630 635 640
Leu Gly Phe Val Lys Lys Asn Tyr Tyr Asp Leu Lys His Val Asp Phe
645 650 655
Ile Asp Lys Arg Asn Asn Asp Asn Lys Asp Thr Phe Phe His Asp Leu
660 665 670
Arg Leu Phe Glu Lys Asn Val Lys Arg Leu Glu Val Thr Ser Tyr Ser
675 680 685
Leu Ser Asp Gly Phe Leu Gly Lys Lys Ser Arg Glu Lys Phe Gly Lys
690 695 700
Glu Leu Glu Lys Phe Ile Tyr Lys Asn Val Ser Ile Ala Leu Pro Thr
705 710 715 720
Asn Ile Asp Ile Lys Glu Phe Asn Lys Ser Leu Val Leu Pro Met Met
725 730 735
Lys Asn Tyr Gln Ile Ile Phe Lys Leu Leu Asn Asp Ile Glu Ile Ser
740 745 750
Ala Leu Phe Leu Ile Ala Lys Lys Glu Gly Asn Glu Gly Ser Ile Thr
755 760 765
Phe Lys Lys Val Ile Asp Lys Val Arg Lys Glu Asp Met Asn Gly Asn
770 775 780
Ile Asn Phe Ser Gln Val Met Lys Met Ala Leu Asn Glu Lys Val Asn
785 790 795 800
Cys Gln Ile Arg Asn Ser Ile Ala His Ile Asn Met Lys Gln Leu Tyr
805 810 815
Ile Glu Pro Leu Asn Ile Tyr Ile Asn Asn Asn Gln Asn Lys Lys Thr
820 825 830
Ile Ser Glu Gln Met Glu Glu Ile Ile Asp Ile Cys Ile Thr Lys Gly
835 840 845
Leu Thr Gly Lys Glu Leu Asn Lys Asn Ile Ile Asn Asp Tyr Tyr Met
850 855 860
Lys Lys Glu Lys Leu Val Phe Asn Leu Lys Leu Arg Lys Arg Asn Asn
865 870 875 880
Leu Val Ser Ile Asp Ala Gln Gln Lys Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile
885 890 895
Leu Asn Lys Tyr Asp Leu Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Leu Asn Ile Lys
900 905 910
Glu Ile Ile Leu Lys Val Asn Asp Leu Asn Asn Lys Gln Lys Leu Leu
915 920 925
Lys Glu Thr Thr Glu Gly Glu Ser Asn Tyr Lys Asn Ala Leu Ser Lys
930 935 940
Asp Ile Leu Leu Leu Asn Gly Ile Ile Arg Lys Asn Ile Asn Phe Lys
945 950 955 960
Ile Lys Glu Met Ile Leu Gly Ile Ile Gln Gln Asn Glu Tyr Arg Tyr
965 970 975
Val Asn Ile Asn Ile Tyr Asp Lys Ile Arg Lys Glu Asp His Asn Ile
980 985 990
Asp Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr Ile Glu Ile Ser Cys Tyr Glu Asn
995 1000 1005
Lys Ser Asn Glu Ser Thr Asp Glu Arg Ile Asn Phe Lys Ile Lys
1010 1015 1020
Tyr Met Asp Leu Lys Val Lys Asn Glu Leu Leu Val Pro Ser Cys
1025 1030 1035
Tyr Glu Asp Ile Tyr Ile Lys Lys Lys Ile Asp Leu Glu Ile Arg
1040 1045 1050
Tyr Ile Glu Asn Cys Lys Val Val Tyr Ile Asp Ile Tyr Tyr Lys
1055 1060 1065
Lys Tyr Asn Ile Asn Leu Glu Phe Asp Gly Lys Thr Leu Phe Val
1070 1075 1080
Lys Phe Asn Lys Asp Val Lys Lys Asn Asn Gln Lys Val Asn Leu
1085 1090 1095
Glu Ser Asn Tyr Ile Gln Asn Ile Lys Phe Ile Val Ser
1100 1105 1110
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110> The BROAD Institute, Inc.
Massachusetts Institute of Technology
The President and Fellows of Harvard College
Abudayyeh, Omar
Gootenberg, Jonathan
Zhang, Feng
<120> CRISPR Effector System Based Diagnostics
<130> BROD-2505WP
<150> US 62/623,531
<151> 2018-01-29
<160> 622
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 1
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp
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Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
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Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile
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Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
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Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
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Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
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Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
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835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
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1085 1090 1095
Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn
1100 1105 1110
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Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg
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Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
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Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met
1340 1345 1350
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<210> 2
<211> 1197
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 2
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Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
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Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
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435 440 445
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp
565 570 575
Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe
660 665 670
Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn
675 680 685
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770 775 780
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835 840 845
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850 855 860
Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile
865 870 875 880
Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu
885 890 895
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1130 1135 1140
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<211> 1120
<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
<400> 3
Met Trp Ile Ser Ile Lys Thr Leu Ile His His Leu Gly Val Leu Phe
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Phe Cys Asp Tyr Met Tyr Asn Arg Arg Glu Lys Lys Ile Ile Glu Val
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Ile Ser Arg Asp Lys Asn Gly Gly Lys Leu Val Tyr Glu Asn Glu Met
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Ser Val Val Asn Lys Thr Ile Cys Arg Pro Glu Gln Lys Gln Met
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Lys Lys Leu Val His Gly Leu Leu Gln Glu Asn Ser Gln Glu Lys Ile
100 105 110
Lys Val Ser Asp Val Thr Lys Leu Asn Ile Ser Asn Phe Leu Asn His
115 120 125
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Ser Glu Glu Tyr Arg Ile Glu Ile Asn Leu Ser Gln Leu Leu Glu Asp
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Ser Leu Lys Lys Gln Gln Gly Thr Phe Ile Cys Trp Glu Ser Phe Ser
165 170 175
Lys Asp Met Glu Leu Tyr Ile Asn Trp Ala Glu Asn Tyr Ile Ser Ser
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Gln Leu Glu Lys Leu Thr Ser Ala Leu Lys Ala Thr Phe Lys Glu Ala
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Asn His Glu Arg Gln Ile Ile Glu Glu Leu Lys Glu Asn Ser Glu Leu
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Asn Gln Phe Asn Ile Glu Ile Arg Lys His Leu Glu Thr Tyr Phe Pro
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Ile Lys Lys Thr Asn Arg Lys Val Gly Asp Ile Arg Asn Leu Glu Ile
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
Phe Lys Val Lys Lys Ser Lys Ile Ile Asn Gly Lys Thr Lys Asp Val
465 470 475 480
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485 490 495
Ser Glu Leu Asp Ser Val Pro Glu Leu Ile Ile Asn Lys Met Glu Ser
500 505 510
Ser Lys Ile Leu Asp Tyr Tyr Ser Ser Asp Gln Leu Asn Gln Val Phe
515 520 525
Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe
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595 600 605
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<210> 4
<211> 1340
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 4
Met Gln Ile Ser Lys Val Asn His Lys His Val Ala Val Gly Gln Lys
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Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr Asn Tyr Ala Met
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Lys Glu Leu Ser Ser Pro Gly Asp Ile Glu Pro Gly Lys Ile Asp Asp
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Ser Tyr Ile Asn Gly Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Glu Ile Ile Lys Ala
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Glu Glu Ser Leu Gln Arg Asp Ile Ser Met Asn Val Val Phe Ala Thr
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Asn Tyr Leu Ala Cys Ala Thr Val Asp Thr Asp Lys Asp Phe Leu Leu
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Phe Ser Lys Glu Asp Ile Arg Ser Cys Thr Lys Lys Asp Gly Asn Leu
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Glu Ser Arg Lys Ser Thr Ala Glu Ile Leu Arg Leu Lys Lys Ala Ser
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Phe Asn Lys Ser Phe His Ser Lys Thr Ile Asn Ser Gln Lys Glu Asn
50 55 60
Lys Asn Ala Thr Ile Lys Lys Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Gln Ile Phe
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Glu Lys Leu Val Gly Val Asp Thr Asn Lys Asn Ile Arg Lys Pro Lys
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Met Ser Leu Thr Asp Leu Lys Asp Leu Pro Lys Lys Asp Leu Ala Leu
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Phe Ile Lys Arg Lys Phe Lys Asn Asp Asp Ile Val Glu Ile Lys Asn
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Leu Asp Leu Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Val Pro Gly
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545 550 555 560
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Arg Ala Asn Leu Ile Gln Phe Ile Ser Ser Lys Arg Asn Tyr Tyr
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Asn Phe Val Leu Arg Leu Asn Lys Asn Arg Gln Gln Asp Ala Lys Ala
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<211> 1051
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSLM6-0645
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Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
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Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
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Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
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Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
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Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
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Leu Lys Pro Phe Arg Ala Leu Phe Ala Asn Pro Ala Thr Phe Asp Arg
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Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
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Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
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Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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cugaaag 67
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<220>
<223> Synthetic
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gugaaag 67
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gcuguuc 67
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uuuaugu 67
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gc 62
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<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu auuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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uauuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
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<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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auccuau 67
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<223> Synthetic
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<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg auagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
gauagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
<210> 122
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ccgacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cugacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
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<211> 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic
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acugacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ccgccag 67
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<223> Synthetic
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cuacaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
<400> 128
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ugcaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 129
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
cugcaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
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<223> Synthetic
<400> 131
gagagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 132
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 132
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aaagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 133
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 133
gaaagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 134
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc caggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 135
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 136
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ccggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 137
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 138
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu caguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 139
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 140
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cuguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 141
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 142
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(44)
<223> N represents any nucleotide
<400> 142
gcaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 143
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(44)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 143
cgaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 144
<211> 70
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
uacccgggga uccucuagaa auauggauua cuugguagaa cagcaaucua cucgaccugc 60
aggcaugcaa 70
<210> 145
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 145
gcaaggggac naaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 146
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 146
tagattgctg 10
<210> 147
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
aagattgctg 10
<210> 148
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
ttgattgctg 10
<210> 149
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
tacattgctg 10
<210> 150
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
tagtttgctg 10
<210> 151
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
tagaatgctg 10
<210> 152
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
tagatagctg 10
<210> 153
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 153
tagattcctg 10
<210> 154
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
tagattggtg 10
<210> 155
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
tagattgcag 10
<210> 156
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
tagattgctc 10
<210> 157
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
cagcaatcta 10
<210> 158
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
cagcaatgta 10
<210> 159
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
cagctatgta 10
<210> 160
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 160
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 161
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 162
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 163
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 164
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 164
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa ccccguugug gauggaau 58
<210> 165
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 165
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 166
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 166
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 167
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 167
ggauacuuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 168
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 168
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa cccuguugug gauggaau 58
<210> 169
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 169
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 170
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 170
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 171
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 171
aaaugcugcu ggacaacauc aacacaccag aagggauuau accagcucuc uuugaacc 58
<210> 172
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 172
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 173
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 173
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 174
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp
<400> 174
aaaugcuccu ugacaacaua aacacaccag aagggauuau cccagcccuc uuugagcc 58
<210> 175
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 175
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 176
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 176
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 177
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 177
caccgcagca ugucaagauc acagauuuug ggcgggcca 39
<210> 178
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 178
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 179
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 179
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 180
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 180
caguaaaaau aggugauuuu ggucuagcua cagagaaau 39
<210> 181
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 181
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 182
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 182
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..()
<223> 3ThioM3-D
<400> 183
ttataactat tcctaaaaaa aaaaa 25
<210> 184
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5ThioMC6-D
<400> 184
aaaaaaaaaa ctcccctaat aacaat 26
<210> 185
<211> 45
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 185
ggguaggaau aguuauaauu ucccuuuccc auuguuauua gggag 45
<210> 186
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 187
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 187
ggttggtagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 188
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 188
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gttcatggtc atattggt 48
<210> 189
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 189
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gtgtggttgg ttcatggtca tattggt 57
<210> 190
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 190
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactac c 31
<210> 191
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 191
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuac 64
<210> 192
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 192
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaaag agagcaauuc gagacuacca 60
acca 64
<210> 193
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 193
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagac uaccaaccac agagacugug 60
guug 64
<210> 194
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 194
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta gatcgcatag tctcgaattg ctctctttca ctggcc 106
<210> 195
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 195
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta g 71
<210> 196
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 196
atcgcatagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 197
gaaattaata cgactcacta tagggatcgc aagcatatca ttgcgcttgc 50
<210> 198
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 198
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactat g 31
<210> 199
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 199
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuau 64
<210> 200
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 200
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagag caauucgaga cuaugcgauc 60
uaac 64
<210> 201
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 201
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacacua ugcgaucuaa ccguacagua 60
uuuu 64
<210> 202
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 202
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 203
ggttggtagt ctcgaattgc tctct 25
<210> 204
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 204
Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 205
Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro
1 5 10 15
<210> 206
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 206
Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Met Leu Tyr Ser Met Arg Asn Ser Ser Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 207
Ile Phe Arg Asn Glu Ile Asp His Phe His Tyr Phe Tyr Asp Arg
1 5 10 15
<210> 208
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 208
Leu Thr Asp Leu Lys Asp Val Ile Tyr Ser Met Arg Asn Asp Ser Phe
1 5 10 15
His Tyr
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 209
Glu Leu Arg Asn Tyr Ile Glu His Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe
1 5 10 15
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 210
Ala Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Glu Thr Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 211
Asp Val Arg Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Thr Ser
1 5 10 15
<210> 212
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 212
Ile Trp Ala Leu Arg Gly Ser Val Gln Gln Ile Arg Asn Glu Ile Phe
1 5 10 15
His Ser
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 213
Lys Ile Arg Asn Gln Thr Ala His Leu Ser Val Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
<210> 214
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 214
Leu Trp Ala Ile Arg Gly Ala Val Gln Arg Val Arg Asn Gln Ile Phe
1 5 10 15
His Gln
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 215
Glu Ile Arg Asn Asn Ile Ala His Leu His Val Leu Arg Asn Asp
1 5 10 15
<210> 216
<211> 18
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 216
Leu Trp Gly Ile Arg Gly Ala Val Gln Gln Ile Arg Asn Asn Val Asn
1 5 10 15
His Tyr
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 217
Asp Ile Arg Asn His Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Thr Lys Asp
1 5 10 15
<210> 218
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 218
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 219
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 220
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 220
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 221
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 222
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 222
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 223
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 224
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus SB 1003
<400> 224
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 225
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R12
<400> 226
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 227
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R121
<400> 227
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 228
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE442
<400> 228
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE-442
<400> 229
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 230
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 230
Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val
1 5 10 15
His Phe
<210> 231
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 231
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 232
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 232
Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile Ile
1 5 10 15
His Leu
<210> 233
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 233
Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn Tyr Leu Asn Gly Gln
1 5 10 15
<210> 234
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 234
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 235
uagaaugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 236
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUAGCUGUUCUACCAAGUAA
<400> 236
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 237
uagauagcug uucuaccaag uaa 23
<210> 238
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 238
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 239
uagauuccug uucuaccaag uaa 23
<210> 240
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 240
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaag 59
<210> 241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 241
aagauugcug uucuaccaag 20
<210> 242
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 242
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaag 59
<210> 243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 243
uugauugcug uucuaccaag 20
<210> 244
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 244
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaag 59
<210> 245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 245
uaguuugcug uucuaccaag 20
<210> 246
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 246
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaag 59
<210> 247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 247
uagaaugcug uucuaccaag 20
<210> 248
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 248
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaag 59
<210> 249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 249
uagauagcug uucuaccaag 20
<210> 250
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 250
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaag 59
<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UAGAUUCCUGUUCUACCAAG
<400> 251
uagauuccug uucuaccaag 20
<210> 252
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 252
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 253
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 253
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 254
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 254
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 255
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Seqeunce
<220>
<223> Synthetic
<400> 255
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 256
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 256
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uugauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 257
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 257
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 258
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 258
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uaguuugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 259
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 259
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 260
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 260
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagaaugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 261
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 261
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 262
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 262
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagauagcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 263
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 263
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 264
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 264
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cuagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 265
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 265
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 266
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 266
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca gaagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 267
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 267
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 268
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 268
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guugauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 269
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 269
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 270
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 270
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guaguuugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 271
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 271
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 272
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 272
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagaaugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 273
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 273
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 274
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 274
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagauagcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 275
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 275
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 276
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 276
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acuagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 277
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 277
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 278
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 278
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agaagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 279
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 279
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 280
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 280
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguugauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 281
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 281
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 282
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 282
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguaguuugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 283
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 283
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 284
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 284
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagaaugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 285
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 285
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 286
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 286
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagauagc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 287
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 287
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 288
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 288
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 289
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 289
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuagucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 290
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 290
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuaaucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 291
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 291
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuauucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 292
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 292
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 293
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 293
gagtacgtcc gcttcaccgg ctacccctgc tcctggacct tctaccacca cctccgccag 60
gagatcctcc aggagttcac cctgcacgac cacgtgcggg aggaggccca gaagttcctg 120
cggggcctgc aggtgaacgg gagccggccg ggcacctttg taggggtcca tgttcgccga 180
ggggactat 189
<210> 294
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 294
agcuggagug uuguuuggua ugggcaaagg gaugccauuc uacgcauggg acuuuggagu 60
cccgcugcua augauagguu gcuacucaca auuaacaccc cugacccuaa uaguggccau 120
cauuuugcuc guggcgcacu acauguacuu gaucccaggg cugcaggcag cagcugcgcg 180
ugcugcccag aagagaacgg cagcuggcau caugaagaac ccuguugugg auggaauagu 240
ggugacugac auugacacaa ugacaauuga cccccaagug gagaaaaaga ugggacaggu 300
gcuacucaua gcaguagccg ucuccagcgc caua 334
<210> 295
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 295
ggcagcuaua uugaugggac uugacaaggg auggccaaua ucgaagaugg acauaggagu 60
uccacuucuc gccuuagggu gcuauuccca ggugaaccca uugacacuga cagcggcggu 120
guugauguua guggcucauu augccauaau uggaccagga cugcaagcaa aggccacuag 180
agaagcucaa aaaaggacag cggccggaau aaugaaaaau ccaaccguag acgggauugu 240
ugcaauagac uuggauccug ugguuuauga uacaaaauuu gaaaaacagc uaggccaaau 300
aauguuacug auacuuugua caucacagau ccuc 334
<210> 296
<211> 337
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 296
gggagcugga guguuguuug guaugggcaa agggaugcca uucuacgcau gggacuuugg 60
agucccgcug cuaaugauag guugcuacuc acaauuaaca ccccugaccc uaauaguggc 120
caucauuuug cucguggcgc acuacaugua cuugauccca gggcugcagg cagcagcugc 180
gcgugcugcc cagaagagaa cggcagcugg caucaugaag aacccuguug uggauggaau 240
aguggugacu gacauugaca caaugacaau ugacccccaa guggagaaaa agaugggaca 300
ggugcuacuc auagcaguag ccgucuccag cgccaua 337
<210> 297
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 297
gggaaccuug auaguggcua ucauucugcu uguggcacac uauauguacu ugaucccagg 60
ccuacaggca gcagcagcgc gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa 120
ucccguugug gauggaauag ugguaacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 298
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 298
ggggacccua auaguggcca ucauuuugcu cguggcgcac uacauguacu ugaucccagg 60
gcugcaggca gcagcugcgc gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa 120
cccuguugug gauggaauag uggugacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 299
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 299
gggaguacau auucaggggc caaccucuca acaaugacga agaccaugcu cacuggacag 60
aagcaaaaau gcugcuggac aacaucaaca caccagaagg gauuauacca gcucucuuug 120
aaccagaaag ggagaaguca gccgccauag acggugaaua ccgccugaag ggu 173
<210> 300
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 300
gggaguacau uuacauggga cagccuucaa acaacgauga ggaucacgcu cauuggacag 60
aagcaaaaau gcuccuugac aacauaaaca caccagaagg gauuauccca gcccucuuug 120
agccggagag aggaaaaagu gcagcaauag acggggaaua cagacugcgg ggu 173
<210> 301
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 301
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 302
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 302
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcua uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
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<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 303
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 304
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 304
aagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 305
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 305
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 306
uugauugcug uucuaccaag uaa 23
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<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 307
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 308
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 308
uaguuugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 309
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptorichia buccalis C-1013-b
<400> 309
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
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Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
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515 520 525
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Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
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Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
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Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
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Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
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Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
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Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
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Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
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Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
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Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
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Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
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915 920 925
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Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
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Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
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Glu Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu
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Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His
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Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Ala Val Met Lys Ser Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe
1085 1090 1095
Val Ala Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln
1100 1105 1110
Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys
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Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu
1130 1135 1140
Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met Glu Glu Lys Lys Ser Glu
1145 1150 1155
Asn
<210> 310
<211> 1285
<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 310
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1 5 10 15
Ile Thr Ala Ala Phe Tyr Arg Asp Met Ser Gln Gly Leu Leu Tyr Tyr
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Asp Ser Glu Asp Asn Asp Cys Thr Asp Lys Val Ile Glu Ser Met Asp
35 40 45
Phe Glu Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ile Leu Lys Asn Gly Glu Asp Asp
50 55 60
Lys Asn Pro Phe Tyr Met Phe Val Lys Gly Leu Val Gly Ser Asn Asp
65 70 75 80
Lys Ile Val Cys Glu Pro Ile Asp Val Asp Ser Asp Pro Asp Asn Leu
85 90 95
Asp Ile Leu Ile Asn Lys Asn Leu Thr Gly Phe Gly Arg Asn Leu Lys
100 105 110
Ala Pro Asp Ser Asn Asp Thr Leu Glu Asn Leu Ile Arg Lys Ile Gln
115 120 125
Ala Gly Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Pro Glu Leu Lys Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Met Ile Gln Lys Asp Ile Val Asn Arg Lys Glu Gln Leu Leu Lys
145 150 155 160
Ser Ile Lys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Ser Leu Glu Gly Ser Lys Leu
165 170 175
Val Pro Ser Thr Lys Lys Met Lys Trp Leu Phe Lys Leu Ile Asp Val
180 185 190
Pro Asn Lys Thr Phe Asn Glu Lys Met Leu Glu Lys Tyr Trp Glu Ile
195 200 205
Tyr Asp Tyr Asp Lys Leu Lys Ala Asn Ile Thr Asn Arg Leu Asp Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Lys Ala Arg Ser Ile Ser Arg Ala Val Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Arg Glu Tyr His Lys Asn Leu Arg Thr Asn Tyr Asn Arg Phe Val Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Pro Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gly Gly Ser Ala Lys Tyr
260 265 270
Asn Pro Asp Lys Glu Glu Phe Leu Leu Phe Leu Lys Glu Val Glu Gln
275 280 285
Tyr Phe Lys Lys Tyr Phe Pro Val Lys Ser Lys His Ser Asn Lys Ser
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Lys Asp Lys Ser Leu Val Asp Lys Tyr Lys Asn Tyr Cys Ser Tyr Lys
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Val Val Lys Lys Glu Val Asn Arg Ser Ile Ile Asn Gln Leu Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ile Gln Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Asn Asp
340 345 350
Thr Trp Gln Glu Asp Phe Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Tyr Ile Gln
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Val Glu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Val Met Thr Ser Leu Ser Trp Gly
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Ile Asn Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ile Asp Asp Ser Asn Thr Val Lys
385 390 395 400
Phe Asp Asp Ile Thr Thr Lys Lys Ala Lys Glu Ala Ile Glu Ser Asn
405 410 415
Tyr Phe Asn Lys Leu Arg Thr Cys Ser Arg Met Gln Asp His Phe Lys
420 425 430
Glu Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Val Tyr Val Lys Asp Lys Lys Asp
435 440 445
Arg Pro Asp Asp Asp Ile Glu Asn Leu Ile Val Leu Val Lys Asn Ala
450 455 460
Ile Glu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Asn Arg Thr Phe His Phe Lys Glu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ser Gly
485 490 495
Gln Asn Lys Ile Asp Tyr Ser Val Ala Ala Glu Phe Ile Lys Arg Asp
500 505 510
Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val Phe Arg Glu Gln Ile Arg Ser Leu Gly
515 520 525
Ile Ala Glu Tyr Tyr Lys Ala Asp Met Ile Ser Asp Cys Phe Lys Thr
530 535 540
Cys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Tyr Ser Pro Lys Asn Ser Leu Met Pro
545 550 555 560
Ala Phe Lys Asn Val Tyr Lys Arg Gly Ala Asn Leu Asn Lys Ala Tyr
565 570 575
Ile Arg Asp Lys Gly Pro Lys Glu Thr Gly Asp Gln Gly Gln Asn Ser
580 585 590
Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Glu Leu Thr Trp Tyr Ile Glu Val
595 600 605
Lys Asn Asn Asp Gln Ser Tyr Asn Ala Tyr Lys Asn Leu Leu Gln Leu
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Ile Tyr Tyr His Ala Phe Leu Pro Glu Val Arg Glu Asn Glu Ala Leu
625 630 635 640
Ile Thr Asp Phe Ile Asn Arg Thr Lys Glu Trp Asn Arg Lys Glu Thr
645 650 655
Glu Glu Arg Leu Asn Thr Lys Asn Asn Lys Lys His Lys Asn Phe Asp
660 665 670
Glu Asn Asp Asp Ile Thr Val Asn Thr Tyr Arg Tyr Glu Ser Ile Pro
675 680 685
Asp Tyr Gln Gly Glu Ser Leu Asp Asp Tyr Leu Lys Val Leu Gln Arg
690 695 700
Lys Gln Met Ala Arg Ala Lys Glu Val Asn Glu Lys Glu Glu Gly Asn
705 710 715 720
Asn Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Arg Asp Val Val Val Trp Ala Phe Gly
725 730 735
Ala Tyr Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Glu Leu Gln Pro
740 745 750
Pro Leu Ser Lys Glu Asn Ile Gly Leu Asn Asp Thr Leu Lys Glu Leu
755 760 765
Phe Pro Glu Glu Lys Val Lys Ser Pro Phe Asn Ile Lys Cys Arg Phe
770 775 780
Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Asp Asn Thr
785 790 795 800
Ser Ala Glu Ala Val Lys Thr Asp Gly Lys Glu Asp Glu Lys Asp Lys
805 810 815
Lys Asn Ile Lys Arg Lys Asp Leu Leu Cys Phe Tyr Leu Phe Leu Arg
820 825 830
Leu Leu Asp Glu Asn Glu Ile Cys Lys Leu Gln His Gln Phe Ile Lys
835 840 845
Tyr Arg Cys Ser Leu Lys Glu Arg Arg Phe Pro Gly Asn Arg Thr Lys
850 855 860
Leu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Met Glu
865 870 875 880
Leu Val Arg Phe Thr Met Pro Ser Ile Pro Glu Ile Ser Ala Lys Ala
885 890 895
Glu Ser Gly Tyr Asp Thr Met Ile Lys Lys Tyr Phe Lys Asp Phe Ile
900 905 910
Glu Lys Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Thr Ser Asn Leu Tyr Tyr His
915 920 925
Ser Asp Ser Lys Thr Pro Val Thr Arg Lys Tyr Met Ala Leu Leu Met
930 935 940
Arg Ser Ala Pro Leu His Leu Tyr Lys Asp Ile Phe Lys Gly Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Ile Thr Lys Lys Glu Cys Leu Glu Tyr Ile Lys Leu Ser Asn Ile
965 970 975
Ile Lys Asp Tyr Gln Asn Ser Leu Asn Glu Leu His Glu Gln Leu Glu
980 985 990
Arg Ile Lys Leu Lys Ser Glu Lys Gln Asn Gly Lys Asp Ser Leu Tyr
995 1000 1005
Leu Asp Lys Lys Asp Phe Tyr Lys Val Lys Glu Tyr Val Glu Asn
1010 1015 1020
Leu Glu Gln Val Ala Arg Tyr Lys His Leu Gln His Lys Ile Asn
1025 1030 1035
Phe Glu Ser Leu Tyr Arg Ile Phe Arg Ile His Val Asp Ile Ala
1040 1045 1050
Ala Arg Met Val Gly Tyr Thr Gln Asp Trp Glu Arg Asp Met His
1055 1060 1065
Phe Leu Phe Lys Ala Leu Val Tyr Asn Gly Val Leu Glu Glu Arg
1070 1075 1080
Arg Phe Glu Ala Ile Phe Asn Asn Asn Asp Asp Asn Asn Asp Gly
1085 1090 1095
Arg Ile Val Lys Lys Ile Gln Asn Asn Leu Asn Asn Lys Asn Arg
1100 1105 1110
Glu Leu Val Ser Met Leu Cys Trp Asn Lys Lys Leu Asn Lys Asn
1115 1120 1125
Glu Phe Gly Ala Ile Ile Trp Lys Arg Asn Pro Ile Ala His Leu
1130 1135 1140
Asn His Phe Thr Gln Thr Glu Gln Asn Ser Lys Ser Ser Leu Glu
1145 1150 1155
Ser Leu Ile Asn Ser Leu Arg Ile Leu Leu Ala Tyr Asp Arg Lys
1160 1165 1170
Arg Gln Asn Ala Val Thr Lys Thr Ile Asn Asp Leu Leu Leu Asn
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Asp Tyr His Ile Arg Ile Lys Trp Glu Gly Arg Val Asp Glu Gly
1190 1195 1200
Gln Ile Tyr Phe Asn Ile Lys Glu Lys Glu Asp Ile Glu Asn Glu
1205 1210 1215
Pro Ile Ile His Leu Lys His Leu His Lys Lys Asp Cys Tyr Ile
1220 1225 1230
Tyr Lys Asn Ser Tyr Met Phe Asp Lys Gln Lys Glu Trp Ile Cys
1235 1240 1245
Asn Gly Ile Lys Glu Glu Val Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Lys Cys
1250 1255 1260
Ile Gly Asn Leu Phe Lys Phe Asp Tyr Glu Asp Lys Asn Lys Ser
1265 1270 1275
Ser Ala Asn Pro Lys His Thr
1280 1285
<210> 311
<211> 1344
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 311
Met Leu Arg Arg Asp Lys Glu Val Lys Lys Leu Tyr Asn Val Phe Asn
1 5 10 15
Gln Ile Gln Val Gly Thr Lys Pro Lys Lys Trp Asn Asn Asp Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Pro Glu Glu Asn Glu Arg Arg Ala Gln Gln Lys Asn Ile Lys
35 40 45
Met Lys Asn Tyr Lys Trp Arg Glu Ala Cys Ser Lys Tyr Val Glu Ser
50 55 60
Ser Gln Arg Ile Ile Asn Asp Val Ile Phe Tyr Ser Tyr Arg Lys Ala
65 70 75 80
Lys Asn Lys Leu Arg Tyr Met Arg Lys Asn Glu Asp Ile Leu Lys Lys
85 90 95
Met Gln Glu Ala Glu Lys Leu Ser Lys Phe Ser Gly Gly Lys Leu Glu
100 105 110
Asp Phe Val Ala Tyr Thr Leu Arg Lys Ser Leu Val Val Ser Lys Tyr
115 120 125
Asp Thr Gln Glu Phe Asp Ser Leu Ala Ala Met Val Val Phe Leu Glu
130 135 140
Cys Ile Gly Lys Asn Asn Ile Ser Asp His Glu Arg Glu Ile Val Cys
145 150 155 160
Lys Leu Leu Glu Leu Ile Arg Lys Asp Phe Ser Lys Leu Asp Pro Asn
165 170 175
Val Lys Gly Ser Gln Gly Ala Asn Ile Val Arg Ser Val Arg Asn Gln
180 185 190
Asn Met Ile Val Gln Pro Gln Gly Asp Arg Phe Leu Phe Pro Gln Val
195 200 205
Tyr Ala Lys Glu Asn Glu Thr Val Thr Asn Lys Asn Val Glu Lys Glu
210 215 220
Gly Leu Asn Glu Phe Leu Leu Asn Tyr Ala Asn Leu Asp Asp Glu Lys
225 230 235 240
Arg Ala Glu Ser Leu Arg Lys Leu Arg Arg Ile Leu Asp Val Tyr Phe
245 250 255
Ser Ala Pro Asn His Tyr Glu Lys Asp Met Asp Ile Thr Leu Ser Asp
260 265 270
Asn Ile Glu Lys Glu Lys Phe Asn Val Trp Glu Lys His Glu Cys Gly
275 280 285
Lys Lys Glu Thr Gly Leu Phe Val Asp Ile Pro Asp Val Leu Met Glu
290 295 300
Ala Glu Ala Glu Asn Ile Lys Leu Asp Ala Val Val Glu Lys Arg Glu
305 310 315 320
Arg Lys Val Leu Asn Asp Arg Val Arg Lys Gln Asn Ile Ile Cys Tyr
325 330 335
Arg Tyr Thr Arg Ala Val Val Glu Lys Tyr Asn Ser Asn Glu Pro Leu
340 345 350
Phe Phe Glu Asn Asn Ala Ile Asn Gln Tyr Trp Ile His His Ile Glu
355 360 365
Asn Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Asn Cys Lys Ala Gly Lys Leu Phe
370 375 380
Lys Leu Arg Lys Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Val Trp Lys Asp Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr Asn
405 410 415
Phe Ala Leu Asp Asp Ile Trp Lys Asp Lys Lys Asn Lys Glu Leu Gly
420 425 430
Ile Val Asp Glu Arg Ile Arg Asn Gly Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Glu
435 440 445
Met Ile Lys Ala His Glu Asn Leu Gln Arg Glu Leu Ala Val Asp Ile
450 455 460
Ala Phe Ser Val Asn Asn Leu Ala Arg Ala Val Cys Asp Met Ser Asn
465 470 475 480
Leu Gly Asn Lys Glu Ser Asp Phe Leu Leu Trp Lys Arg Asn Asp Ile
485 490 495
Ala Asp Lys Leu Lys Asn Lys Asp Asp Met Ala Ser Val Ser Ala Val
500 505 510
Leu Gln Phe Phe Gly Gly Lys Ser Ser Trp Asp Ile Asn Ile Phe Lys
515 520 525
Asp Ala Tyr Lys Gly Lys Lys Lys Tyr Asn Tyr Glu Val Arg Phe Ile
530 535 540
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Gly Lys Ile Phe Glu Arg Glu Thr Glu Phe Cys Leu Asn Val Glu Lys
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Asp Arg Phe Tyr Ser Asn Asn Leu Tyr Met Phe Tyr Gln Val Ser Glu
595 600 605
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Glu Tyr Ile Thr Asn Val Leu Gly Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr Asp Ala
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660 665 670
Ile Tyr Tyr Asn Ser Phe Leu Gln Ser Asp Arg Ala Leu Gln Leu Phe
675 680 685
Glu Lys Ser Val Lys Thr Leu Ser Trp Asp Asp Lys Lys Gln Gln Arg
690 695 700
Ala Val Asp Asn Phe Lys Asp His Phe Ser Asp Ile Lys Ser Ala Cys
705 710 715 720
Thr Ser Leu Ala Gln Val Cys Gln Ile Tyr Met Thr Glu Tyr Asn Gln
725 730 735
Gln Asn Asn Gln Ile Lys Lys Val Arg Ser Ser Asn Asp Ser Ile Phe
740 745 750
Asp Gln Pro Val Tyr Gln His Tyr Lys Val Leu Leu Lys Lys Ala Ile
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Ala Asn Ala Phe Ala Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Lys Asp Leu Phe Gly
770 775 780
Phe Ile Gly Lys Pro Phe Lys Ala Asn Glu Ile Arg Glu Ile Asp Lys
785 790 795 800
Glu Gln Phe Leu Pro Asp Trp Thr Ser Arg Lys Tyr Glu Ala Leu Cys
805 810 815
Ile Glu Val Ser Gly Ser Gln Glu Leu Gln Lys Trp Tyr Ile Val Gly
820 825 830
Lys Phe Leu Asn Ala Arg Ser Leu Asn Leu Met Val Gly Ser Met Arg
835 840 845
Ser Tyr Ile Gln Tyr Val Thr Asp Ile Lys Arg Arg Ala Ala Ser Ile
850 855 860
Gly Asn Glu Leu His Val Ser Val His Asp Val Glu Lys Val Glu Lys
865 870 875 880
Trp Val Gln Val Ile Glu Val Cys Ser Leu Leu Ala Ser Arg Thr Ser
885 890 895
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Phe Ala Ala Asp His Ile Leu Arg Asp Ile Val Glu Pro Val Ser Lys
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Asp Asn Ile Glu Glu Phe Tyr Ser Gln Lys Ala Glu Ile Ala Tyr Cys
980 985 990
Lys Ile Lys Gly Lys Glu Ile Thr Ala Glu Glu Gln Lys Ala Val Leu
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<213> Lachnospiraceae bacterium NK4A144
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Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Glu Phe Phe Asp Arg Phe Phe Thr
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Gln Ile Glu Ile Ser Glu Gln Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Met
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Phe Lys Leu Asp Asp Lys Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys Phe Pro
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<213> Demequina aurantiaca
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Ser Lys Ala Phe Asp Ser Ser Lys Leu Asp Thr Lys Ser Val Gly
1310 1315 1320
Asn Asn Leu Ser Asp Asn Pro Val Leu Lys Gln Phe Leu Ser Glu
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Ser Lys Lys Lys Arg
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<400> 319
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Leu Asp Ser Gly Lys Thr Ser Glu Glu Ile Val Gly Tyr Ile Asn Thr
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Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
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340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
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370 375 380
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Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
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435 440 445
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<213> Bacterioides ihuae
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115 120 125
Pro Lys Leu Arg Asn Glu Phe Thr Phe Lys Asp Val Asn Lys Gln Val
130 135 140
Val Lys Leu Asn Leu Pro Lys Val Leu Val Glu Tyr Ser Lys Lys Asn
145 150 155 160
Asp Pro Thr Leu Phe Leu Ala Tyr Gln Gln Trp Ile Ala Ala Tyr Leu
165 170 175
Lys Asn Lys Lys Gly His Ile Lys Lys Ser Ile Leu Asn Asn Arg Val
180 185 190
Val Ile Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ser Lys Arg Lys Gln Ala
195 200 205
Leu Glu Leu Trp Gly Glu Glu Tyr Glu Thr Asn Gln Arg Ile Ala Leu
210 215 220
Glu Ser Tyr His Thr Ser Tyr Asn Ile Gly Glu Leu Val Thr Leu Leu
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Pro Asn Pro Glu Glu Tyr Val Ser Asp Lys Gly Glu Ile Arg Pro Ala
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Phe His Tyr Lys Leu Lys Asn Val Leu Gln Met His Gln Ser Thr Val
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Phe Gly Thr Asn Glu Ile Leu Cys Ile Asn Pro Ile Phe Asn Glu Asn
275 280 285
Arg Ala Asn Ile Gln Leu Ser Ala Tyr Asn Leu Glu Val Val Lys Tyr
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Phe Glu His Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Lys Lys Lys Asn Leu Ser Leu
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Ser Tyr Asn Phe Ala Ile Asp Ile Ile Glu Leu Cys Leu Leu Thr Val
770 775 780
Asp Arg Val Glu Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Lys Glu Gln Thr Glu Leu
785 790 795 800
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<213> Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA
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<400> 325
Met Lys Ile Ser Lys Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Lys Lys Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly Lys Leu Xaa Lys Xaa Val Asn Glu Arg Asn Arg Xaa Ala Lys Arg
20 25 30
Leu Ser Asn Xaa Leu Asx Lys Tyr Ile Xaa Xaa Ile Asp Lys Ile Xaa
35 40 45
Lys Lys Glu Xaa Xaa Lys Lys Phe Xaa Ala Xaa Glu Glu Ile Thr Leu
50 55 60
Lys Leu Asn Gln Xaa Xaa Xaa Asx Xaa Leu Xaa Lys Ala Xaa Xaa Asp
65 70 75 80
Leu Arg Lys Asp Asn Xaa Tyr Ser Xaa Xaa Lys Lys Ile Leu His Asn
85 90 95
Glu Asp Ile Asn Xaa Glu Glu Xaa Glu Leu Leu Ile Asn Asp Xaa Leu
100 105 110
Glu Lys Leu Xaa Lys Ile Glu Ser Xaa Lys Tyr Ser Tyr Gln Lys Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Met Ser Val Gln Glu His Ser Lys Lys Ser Ile
130 135 140
Xaa Arg Ile Xaa Glu Ser Ala Lys Arg Asn Lys Glu Ala Leu Asp Lys
145 150 155 160
Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Xaa Leu Asp Pro Arg Met Glu Xaa Leu Ala
165 170 175
Lys Leu Arg Lys Leu Leu Glu Leu Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Xaa
180 185 190
Ile Xaa Xaa Glu Glu Glu Xaa Asn Val Xaa Xaa His Lys Xaa Leu Lys
195 200 205
Glu Asn His Pro Asp Phe Val Glu Xaa Xaa Xaa Asn Lys Glu Asn Ala
210 215 220
Glu Leu Asn Xaa Tyr Ala Ile Glu Xaa Lys Lys Xaa Leu Lys Tyr Tyr
225 230 235 240
Phe Pro Xaa Lys Xaa Ala Lys Asn Ser Asn Asp Lys Ile Phe Glu Lys
245 250 255
Gln Glu Leu Lys Lys Xaa Trp Ile His Gln Xaa Glu Asn Ala Val Glu
260 265 270
Arg Ile Leu Leu Xaa Xaa Gly Lys Val Xaa Tyr Lys Leu Gln Xaa Gly
275 280 285
Tyr Leu Ala Glu Leu Trp Lys Ile Arg Ile Asn Glu Ile Phe Ile Lys
290 295 300
Tyr Ile Xaa Val Gly Lys Ala Val Ala Xaa Phe Ala Leu Arg Asn Xaa
305 310 315 320
Xaa Lys Asx Glu Asn Asp Ile Leu Gly Gly Lys Ile Xaa Lys Lys Leu
325 330 335
Asn Gly Ile Thr Ser Phe Xaa Tyr Glu Lys Ile Lys Ala Glu Glu Ile
340 345 350
Leu Gln Arg Glu Xaa Ala Val Glu Val Ala Phe Ala Ala Asn Xaa Leu
355 360 365
Tyr Ala Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Arg Xaa Ser Ile Leu Gln Phe Phe
370 375 380
Gly Gly Ala Ser Asn Trp Asp Xaa Phe Leu Phe Phe His Phe Ala Thr
385 390 395 400
Ser Xaa Ile Ser Asp Lys Lys Trp Asn Ala Glu Leu Ile Xaa Xaa Lys
405 410 415
Lys Xaa Gly Leu Val Ile Arg Glu Lys Leu Tyr Ser Asn Asn Val Ala
420 425 430
Met Phe Tyr Ser Lys Asp Asp Leu Glu Lys Leu Leu Asn Xaa Leu Xaa
435 440 445
Xaa Phe Xaa Leu Arg Ala Ser Gln Val Pro Ser Phe Lys Lys Val Tyr
450 455 460
Val Arg Xaa Asx Phe Pro Gln Asn Leu Leu Lys Lys Phe Asn Asp Glu
465 470 475 480
Lys Asp Asp Glu Ala Tyr Ser Ala Xaa Tyr Tyr Leu Leu Lys Glu Ile
485 490 495
Tyr Tyr Asn Xaa Phe Leu Pro Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Xaa Phe Phe
500 505 510
Phe Xaa Val Lys Asn Leu Val Leu Lys Ala Asn Lys Asp Lys Phe Xaa
515 520 525
Xaa Ala Phe Xaa Asp Ile Arg Glu Met Asn Xaa Gly Ser Pro Ile Glu
530 535 540
Tyr Leu Xaa Xaa Thr Gln Xaa Asn Xaa Xaa Asn Glu Gly Arg Lys Lys
545 550 555 560
Glu Glu Lys Glu Xaa Asp Phe Ile Lys Phe Leu Leu Gln Ile Phe Xaa
565 570 575
Lys Gly Phe Asp Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Xaa Xaa Phe Ile Leu Lys
580 585 590
Phe Ile Pro Glu Pro Thr Glu Xaa Ile Glu Ile Xaa Xaa Glu Leu Gln
595 600 605
Ala Trp Tyr Ile Val Gly Lys Phe Leu Asn Ala Arg Lys Xaa Asn Leu
610 615 620
Leu Gly Xaa Phe Xaa Ser Tyr Leu Lys Leu Leu Asp Asp Ile Glu Leu
625 630 635 640
Arg Ala Leu Arg Asn Glu Asn Ile Lys Tyr Gln Ser Ser Asn Xaa Glu
645 650 655
Lys Glu Val Leu Glu Xaa Cys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Ser Leu
660 665 670
Asp Leu Asn Asp Tyr Phe Asx Asp Glu Xaa Asp Phe Ala Xaa Tyr Xaa
675 680 685
Gly Lys Xaa Leu Asp Phe Glu Lys Lys Xaa Met Lys Asp Leu Ala Glu
690 695 700
Leu Xaa Pro Tyr Asp Gln Asn Asp Gly Glu Asn Pro Ile Val Asn Arg
705 710 715 720
Asn Ile Xaa Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Thr Leu Asn Leu Leu Glu Lys
725 730 735
Xaa Xaa Asp Lys Val Ser Glu Lys Glu Ile Lys Glu Tyr Tyr Glu Leu
740 745 750
Lys Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Xaa Xaa Lys Gly Glu Glu Leu His Glu
755 760 765
Glu Trp Xaa Gln Xaa Lys Asn Arg Val Glu Xaa Arg Asp Ile Leu Glu
770 775 780
Tyr Xaa Glu Glu Leu Xaa Gly Gln Ile Ile Asn Tyr Asn Xaa Leu Xaa
785 790 795 800
Asn Lys Val Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Leu His Tyr Leu Leu Leu
805 810 815
Asp Ile Leu Gly Arg Leu Val Gly Tyr Thr Gly Ile Trp Glu Arg Asp
820 825 830
Ala Xaa Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Met Tyr Xaa Asn Gly Leu Pro Glu
835 840 845
Tyr Ile Xaa Xaa Lys Lys Asn Asp Lys Tyr Lys Asp Gly Gln Ile Val
850 855 860
Gly Xaa Lys Ile Asn Xaa Phe Lys Xaa Asp Lys Lys Xaa Leu Tyr Asn
865 870 875 880
Ala Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Xaa Asn Glu His Lys Asn Ile Xaa
885 890 895
Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Ser Lys Ala Glu Ser
900 905 910
Ser Leu Leu Xaa Tyr Ser Glu Asn Leu Arg Xaa Leu Phe Ser Tyr Asp
915 920 925
Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Xaa Lys Ser Leu Ile Asn Ile Leu Leu
930 935 940
Arg His Gly Met Val Leu Lys Phe Lys Phe Gly Thr Asp Lys Lys Ser
945 950 955 960
Val Xaa Ile Arg Ser Xaa Lys Lys Ile Xaa His Leu Lys Ser Ile Ala
965 970 975
Lys Lys Leu Tyr Tyr Pro Glu Val Xaa Val Ser Lys Glu Tyr Cys Lys
980 985 990
Leu Val Lys Xaa Leu Leu Lys Tyr Lys
995 1000
<210> 326
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 326
Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe
1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu
465 470 475 480
Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu
485 490 495
Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val
500 505 510
Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys
515 520 525
Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln
530 535 540
Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys
545 550 555 560
Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile
565 570 575
Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr
595 600 605
Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys
610 615 620
Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys
625 630 635 640
Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp
645 650 655
Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
675 680 685
Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
690 695 700
Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
705 710 715 720
Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
725 730 735
Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp
1010 1015 1020
Gly Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp
1025 1030 1035
Phe Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys
1040 1045 1050
Tyr Glu Glu Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser
1055 1060 1065
Lys Glu Glu Glu Asn Tyr Pro Tyr Val Val Glu Arg Glu Ile Glu
1070 1075 1080
Gln Tyr Glu Lys Val Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His
1085 1090 1095
Leu Ile Glu Glu Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile
1100 1105 1110
Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn
1115 1120 1125
Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys
1130 1135 1140
Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu Asp Val Asn Ile Asn Gln
1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys
1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
1205 1210 1215
Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 327
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 327
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Arg Lys Phe Val Lys Thr Phe Asn Ser Phe Glu Thr
385 390 395 400
Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
405 410 415
Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Asp Asn Asp Lys Ile Trp
420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
450 455 460
Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
465 470 475 480
Asn Asp Asn Glu Ile Glu Thr Lys Lys Lys Glu Asn Lys Asn Asp Lys
485 490 495
Gln Glu Lys His Lys Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asn Lys Ile Thr Glu
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Thr Phe Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser Ile
515 520 525
Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
545 550 555 560
Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
Val Glu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu
610 615 620
Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Lys Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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Asp Lys Lys Ile Gly Asp Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr
370 375 380
Leu Leu Ser Phe Gly Arg Leu Gln Asp Phe Thr Glu Ile Asn Arg Pro
385 390 395 400
Gln Glu Trp Lys Ala Leu Thr Lys Asp Leu Asp Tyr Lys Glu Thr Ser
405 410 415
Asn Gln Pro Phe Ile Ser Lys Thr Thr Pro His Tyr His Ile Thr Asp
420 425 430
Asn Lys Ile Gly Phe Arg Leu Gly Thr Ser Lys Glu Leu Tyr Pro Ser
435 440 445
Leu Glu Ile Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Lys Tyr Pro Tyr Asn
450 455 460
Ser Gly Phe Val Ala His Ala Phe Ile Ser Val His Glu Leu Leu Pro
465 470 475 480
Leu Met Phe Tyr Gln His Leu Thr Gly Lys Ser Glu Asp Leu Leu Lys
485 490 495
Glu Thr Val Arg His Ile Gln Arg Ile Tyr Lys Asp Phe Glu Glu Glu
500 505 510
Arg Ile Asn Thr Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Asn Gln Gly Arg Leu
515 520 525
Pro Leu Gly Ala Phe Pro Lys Gln Met Leu Gly Leu Leu Gln Asn Lys
530 535 540
Gln Pro Asp Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile
545 550 555 560
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser
565 570 575
Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
580 585 590
Leu Ala Asp Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala
595 600 605
Tyr Asp Ala Gln Asn Gln Pro Ile Lys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr
610 615 620
Glu Phe Trp Phe Ile Arg Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys
625 630 635 640
Asn Arg Leu Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr
645 650 655
Asn Pro His Pro Phe Leu Asn Lys Phe Asn Trp Lys Ala Cys Arg Asn
660 665 670
Leu Val Asp Phe Tyr Gln Gln Tyr Leu Glu Gln Arg Glu Lys Phe Leu
675 680 685
Glu Ala Ile Lys Asn Gln Pro Trp Glu Pro Tyr Gln Tyr Cys Leu Leu
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Leu Lys Ile Pro Lys Glu Asn Arg Lys Asn Leu Val Lys Gly Trp Glu
705 710 715 720
Gln Gly Gly Ile Ser Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Ala Ile Arg
725 730 735
Glu Thr Leu Ser Glu Asp Leu Met Leu Ser Lys Pro Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Ile Lys Lys His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu
755 760 765
Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
770 775 780
Ser Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Ala Pro Leu Leu Lys Arg Glu Glu His
785 790 795 800
Tyr Glu Tyr Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln
805 810 815
Arg Leu Glu Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr
820 825 830
Lys Arg Trp Gln His Leu Glu Lys Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Asn Gln
835 840 845
Asp Val Met Leu Trp Leu Met Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asn His Phe
850 855 860
Lys Glu Leu Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala
865 870 875 880
Val Asn Val Gln Glu Ala Asp Ala Lys Leu Asn Pro Leu Asn Gln Thr
885 890 895
Leu Pro Met Val Leu Pro Val Lys Val Tyr Pro Ala Thr Ala Phe Gly
900 905 910
Glu Val Gln Tyr His Lys Thr Pro Ile Arg Thr Val Tyr Ile Arg Glu
915 920 925
Glu His Thr Lys Ala Leu Lys Met Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
930 935 940
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ile Lys Glu Glu Asn Asp
945 950 955 960
Thr Gln Lys His Pro Ile Ser Gln Leu Arg Leu Arg Arg Glu Leu Glu
965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
Ser Ser Met Val Thr Asp Glu His Ile Ala Phe Ile Ala Ser Val
1025 1030 1035
Arg Asn Ala Phe Cys His Asn Gln Tyr Pro Phe Tyr Lys Glu Ala
1040 1045 1050
Leu His Ala Pro Ile Pro Leu Phe Thr Val Ala Gln Pro Thr Thr
1055 1060 1065
Glu Glu Lys Asp Gly Leu Gly Ile Ala Glu Ala Leu Leu Lys Val
1070 1075 1080
Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val Lys Ser Gln Ile
1085 1090 1095
<210> 335
<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 335
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Ile Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Glu Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Asp Asn Asp Glu Lys Val Leu Asp Ile Lys Thr Leu Trp Gln Lys Gly
50 55 60
Asn Lys Asp Leu Asn Gln Lys Ala Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys
65 70 75 80
His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp
85 90 95
Lys Lys Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu
100 105 110
Ser Leu Lys Asp Cys Leu Phe Leu Phe Leu Asp Lys Leu Gln Glu Ala
115 120 125
Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser Glu Phe Ser Lys Glu Pro
130 135 140
Glu Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gln Leu Val Ile Asn Asp Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys Tyr
180 185 190
Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Gly Phe Lys Asp Asn Leu Glu Asn Lys Lys Lys Met Thr
225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu
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Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
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Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Asn
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305 310 315 320
Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys
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Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr
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Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys
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485 490 495
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500 505 510
Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Asp Lys Gly Ile Pro Lys
515 520 525
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530 535 540
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Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Lys Glu Lys
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595 600 605
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850 855 860
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885 890 895
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915 920 925
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945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
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1040 1045 1050
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1100 1105 1110
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1115 1120
<210> 336
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 336
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1 5 10 15
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100 105 110
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Asn Thr Ser Phe Ser His Leu Ile Tyr Lys Asp Glu Gln Gly Lys Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Arg Tyr Pro Phe Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ile Asn Ala
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Gln Asp Ser
245 250 255
Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Pro Gly Phe Lys Lys Ala Ser Glu Asn
260 265 270
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Val Arg His Gln Asn Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Phe Phe Asp
355 360 365
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485 490 495
Thr Leu Thr Pro Gly Phe Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Val His Glu
500 505 510
Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Gln Leu Leu Leu Cys Glu Gly Met
515 520 525
Leu Lys Thr Asp Ala Gly Asn Ala Val Glu Lys Val Leu Ile Asp Thr
530 535 540
Arg Asn Ala Ile Phe Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Val Gln Glu Lys Ile
545 550 555 560
Asn Thr Ile Thr Asp Leu Glu Asn Tyr Leu Gln Asp Lys Pro Ile Leu
565 570 575
Ile Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Asp Leu Leu Lys Gly His Gln
580 585 590
Arg Asp Met Leu Lys Ala Val Glu Gln Lys Lys Ala Met Leu Ile Lys
595 600 605
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610 615 620
Thr Asp Val Ala Ala Lys Asn Thr Gly Thr Leu Leu Lys Asn Gly Gln
625 630 635 640
Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
645 650 655
Arg Asp Lys Glu Gly Asn Pro Ile Asn Cys Ser Lys Ala Asn Ser Thr
660 665 670
Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Ala Thr Asp Ser
675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
725 730 735
Asn Glu Leu Gln Pro Gln Asn Trp Ala Ser Asp Asn Tyr Phe Leu Leu
740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
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785 790 795 800
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Asp Lys Lys Phe Lys Asp His Ser Gln Pro Phe Tyr Arg Tyr Asp Phe
820 825 830
Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
850 855 860
Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
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Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
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Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
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Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
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Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 337
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 337
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
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Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
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Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
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485 490 495
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Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Thr
705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
Val Lys Asn Ser Ile Gly Thr Pro Gln Phe Lys Thr Val Arg Lys Glu
785 790 795 800
Cys Phe Thr Phe Leu Lys Lys Ser Asn Tyr Thr Val Val Ser Leu Asp
805 810 815
Lys Gln Val Glu Arg Ile Leu Ser Met Pro Leu Phe Ile Glu Arg Gly
820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
835 840 845
His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
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Leu Cys Asp Gly Leu Val His Ile Asp Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile
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Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
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Asn
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<213> Prevotella intermedia
<400> 338
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
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Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
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275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
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<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 339
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Ile Asn Arg Glu Lys Leu Leu Arg Asp Leu Glu Gln Glu Gln Gln Ile
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Asp Lys Lys Ser Lys Arg Lys His Glu Leu Tyr Pro Ser Glu Lys Gly
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850 855 860
Pro Thr Met Ile Asp Arg Glu Lys Phe Lys Glu Asn Lys Asp Thr Glu
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Leu Ala Asp Trp Phe Met His Tyr Lys Asn Tyr Lys Glu Asp Asn Tyr
885 890 895
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Phe Lys Arg Asn Lys Gln Ile Asn Lys Gln Lys Lys Asn Asp Val Tyr
915 920 925
Thr Leu Met Met Val Glu Tyr Ile Ile Gln Lys Ile Phe Gly Asp Lys
930 935 940
Phe Val Glu Glu Asn Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Phe Gln Ser Lys
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965 970 975
Asn Leu Asn Gly Ile Leu Asn Gln Pro Lys Asp Ile Lys Ile Gln Gly
980 985 990
Lys Ile Thr Val Lys Gly Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly Asn Phe Arg
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Lys Glu Lys Gln Gly Gln Leu Pro Pro Asn Asn Val Ile Asp Arg
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Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 340
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Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
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Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
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Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
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Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
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Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
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Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
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Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
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Gly Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
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Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Met Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
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Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Asp Asp Arg Ala Cys Phe
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Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Met Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
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Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Ser Gln Thr Ser Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Met Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
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Ser Ala Glu Arg Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
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Ser Asp Arg Val Glu Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Lys Glu Pro Lys
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Lys Lys Lys Ile Glu Gln Leu Leu Arg Asp Leu Ser Leu Trp Glu Ala
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Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
915 920 925
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Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr Leu Tyr Leu Lys Asp Ile Arg Pro
945 950 955 960
Asn Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asn Val Leu Asn Arg Val Lys Pro
965 970 975
Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
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995 1000 1005
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<213> Prevotella sp. P5-125
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Gln Lys Val Ala Asp Ile Glu Gly Glu Gln Asn Glu Asn Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Trp Phe His Pro Val Met Ser His Leu Tyr Asn Ala Lys Asn Gly
50 55 60
Tyr Asp Lys Gln Pro Glu Lys Thr Met Phe Ile Ile Glu Arg Leu Gln
65 70 75 80
Ser Tyr Phe Pro Phe Leu Lys Ile Met Ala Glu Asn Gln Arg Glu Tyr
85 90 95
Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp
100 105 110
Ile Phe Glu Val Leu Lys Arg Ala Phe Gly Val Leu Lys Met Tyr Arg
115 120 125
Asp Leu Thr Asn His Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gly
130 135 140
Cys Glu Phe Leu Thr Ser Thr Glu Gln Pro Leu Ser Gly Met Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Thr Val Ala Leu Arg Asn Met Asn Glu Arg Tyr Gly Tyr
165 170 175
Lys Thr Glu Asp Leu Ala Phe Ile Gln Asp Lys Arg Phe Lys Phe Val
180 185 190
Lys Asp Ala Tyr Gly Lys Lys Lys Ser Gln Val Asn Thr Gly Phe Phe
195 200 205
Leu Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu
210 215 220
Ser Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn
245 250 255
Ala Gln Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ile Ile Arg Ser Phe Gly Ile Asn
260 265 270
Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
Ser Val Ala Met Asp Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Cys Pro Asp Glu
290 295 300
Leu Phe Thr Thr Leu Ser Ala Glu Lys Gln Ser Arg Phe Arg Ile Ile
305 310 315 320
Ser Asp Asp His Asn Glu Val Leu Met Lys Arg Ser Ser Asp Arg Phe
325 330 335
Val Pro Leu Leu Leu Gln Tyr Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Phe Asp His
340 345 350
Ile Arg Phe His Val Asn Met Gly Lys Leu Arg Tyr Leu Leu Lys Ala
355 360 365
Asp Lys Thr Cys Ile Asp Gly Gln Thr Arg Val Arg Val Ile Glu Gln
370 375 380
Pro Leu Asn Gly Phe Gly Arg Leu Glu Glu Ala Glu Thr Met Arg Lys
385 390 395 400
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420 425 430
Val Asp Thr Tyr Thr His Tyr Ile Leu Glu Asn Asn Lys Val Glu Met
435 440 445
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Asp Asp Arg Tyr Val Val Lys Thr Ile Pro Ser Cys Arg Met Ser Thr
465 470 475 480
Leu Glu Ile Pro Ala Met Ala Phe His Met Phe Leu Phe Gly Ser Lys
485 490 495
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Phe Gln Ala Met Gln Lys Glu Glu Val Thr Ala Glu Asn Ile Ala Ser
515 520 525
Phe Gly Ile Ala Glu Ser Asp Leu Pro Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile
530 535 540
Ser Gly Asn Ala His Gly Lys Asp Val Asp Ala Phe Ile Arg Leu Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ser Gly Asp Asp Tyr Glu Ala Lys Gln Gln Phe Lys Leu Met Phe Glu
645 650 655
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675 680 685
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Glu Ile Lys Lys Gly Asn Arg Val Asp Val Pro Phe Ile Arg Arg Asp
705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Ala Ser Arg Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gln Ala Ser Asn Lys Ile Arg
835 840 845
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850 855 860
Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
865 870 875 880
Lys Val Ile Arg Arg Tyr Arg Val Gln Asp Ala Leu Leu Phe Leu Leu
885 890 895
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900 905 910
Lys Leu Lys Glu Ile Met Pro Asp Ala Glu Lys Gly Ile Leu Ser Glu
915 920 925
Ile Met Pro Met Ser Phe Thr Phe Glu Lys Gly Gly Lys Lys Tyr Thr
930 935 940
Ile Thr Ser Glu Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
945 950 955 960
Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
965 970 975
Asp Ile Val Ser Lys Glu Asp Ile Met Glu Glu Phe Asn Lys Tyr Asp
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Gln Cys Arg Pro Glu Ile Ser Ser Ile Val Phe Asn Leu Glu Lys Trp
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Lys Asn Ile Asn Lys Glu Gln Ser Asp Ile Leu Arg Lys Ile Arg
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Asn Ala Phe Asp His Asn Asn Tyr Pro Asp Lys Gly Val Val Glu
1055 1060 1065
Ile Lys Ala Leu Pro Glu Ile Ala Met Ser Ile Lys Lys Ala Phe
1070 1075 1080
Gly Glu Tyr Ala Ile Met Lys
1085 1090
<210> 342
<211> 1150
<212> PRT
<213> Flavobacterium branchiphilum
<400> 342
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ala Arg Leu His Tyr Phe Ser Ile Gly His Ser Phe Lys Gln Ile Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Pro Leu Lys Phe Ile Thr Leu Gln Lys Asp Phe Phe Thr Lys Glu
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Phe Ser Ile Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ser Ile Arg Asn Ile Asn
100 105 110
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115 120 125
Ser Asn Val Phe His Phe Leu Lys Glu Ser Phe Glu Leu Ala Ile Ile
130 135 140
Glu Lys Tyr Tyr Lys Val Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Glu Ile
145 150 155 160
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210 215 220
Met Leu Phe Leu Ile Thr Ile Phe Leu Tyr Lys Asn Glu Ala Asn His
225 230 235 240
Leu Leu Pro Lys Leu Tyr Asp Phe Lys Asn Asn Lys Ser Lys Gln Glu
245 250 255
Leu Phe Thr Phe Phe Ser Lys Lys Phe Thr Ser Gln Asp Ile Asp Ala
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Glu Leu Asn Ser Asn Tyr Pro Ser Phe Ala Thr Asp Ile Gln Phe Lys
325 330 335
Lys Glu Ala Lys Ala Phe Leu Phe Ala Ser Asn Lys Lys Arg Asn Gln
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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660 665 670
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675 680 685
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Tyr Leu Arg Asp Leu Phe Ser Glu Lys His Phe Phe Asp Asn Gln Glu
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Tyr Lys Asn Leu Phe Glu Ser Ser Val Asn Leu Glu Ala Phe Tyr Ala
770 775 780
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850 855 860
Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
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Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
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Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
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Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
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Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
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1010 1015 1020
Ser Lys Asn Tyr Ile Asp Asn Ser Glu Ile Pro Ser Leu Lys Gln
1025 1030 1035
Phe Ser Lys Val Trp Ile Lys Glu Asn Glu Asn Glu Ile Ile Asn
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Asp Lys Glu Val Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln Lys Phe Ile Asn
1130 1135 1140
Gln Val Ile Leu Lys Lys Lys
1145 1150
<210> 343
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 343
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
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100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
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Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
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195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
Tyr Gln His Leu Ser Thr Thr Gln Gln Asn Ser Phe Ile Glu Asp Trp
355 360 365
Asn Glu Tyr Tyr Lys Asp Tyr Glu Asp Asp Val Glu Thr Asp Asp Leu
370 375 380
Ser Arg Val Thr His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Arg Phe
385 390 395 400
Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asp Tyr Val His Asp Arg Arg Thr
420 425 430
Lys Gln Leu Gly Lys Val Glu Ser Asp Arg Ile Ile Lys Glu Lys Val
435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
465 470 475 480
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485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
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Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
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545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Ile
705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
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His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
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Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
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900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
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980 985 990
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995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr
1010 1015 1020
Glu Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile
1025 1030 1035
Glu Cys Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys
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Gln Ser Gly Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu
1055 1060 1065
Leu Pro Ile Gly Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr
1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Gly Glu Val Glu Gln Asp Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn
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Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe
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Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala
1130 1135 1140
Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser Ile Lys Glu Lys Tyr Ala
1145 1150 1155
Asn
<210> 344
<211> 1214
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 344
Met Ser Ser Lys Asn Glu Ser Tyr Asn Lys Gln Lys Thr Phe Asn His
1 5 10 15
Tyr Lys Gln Glu Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Asn Ala
20 25 30
Asp Asp Asn Leu Arg Gln Val Gly Lys Glu Phe Lys Thr Arg Ile Asn
35 40 45
Phe Asn His Asn Asn Asn Glu Leu Ala Ser Val Phe Lys Asp Tyr Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Phe Pro Val Leu Glu Arg Ile Gln Lys His Thr Asn His
85 90 95
Asn Phe Glu Gln Thr Arg Glu Ile Phe Glu Leu Leu Leu Asp Thr Ile
100 105 110
Lys Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His His Tyr His Lys Pro Ile Thr
115 120 125
Ile Asn Pro Lys Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Asp Thr Leu Leu Asp Val
130 135 140
Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
145 150 155 160
Leu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gln Leu Lys Asn Gln
165 170 175
Lys Arg Glu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Glu Glu Asn
180 185 190
Leu Glu Asn Ala Val Phe Asn His Cys Leu Ile Pro Phe Leu Glu Glu
195 200 205
Asn Lys Thr Asp Asp Lys Gln Asn Lys Thr Val Ser Leu Arg Lys Tyr
210 215 220
Arg Lys Ser Lys Pro Asn Glu Glu Thr Ser Ile Thr Leu Thr Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Phe Phe Leu His Arg Lys Glu Phe Gln
245 250 255
Val Phe Thr Ser Gly Leu Glu Arg Phe Lys Ala Lys Val Asn Thr Ile
260 265 270
Lys Glu Glu Glu Ile Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ile Val Tyr Met Ile
275 280 285
Thr His Trp Ser Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Lys Gly Leu Lys His Arg
290 295 300
Ile Lys Thr Asp Gln Gly Val Ser Thr Leu Glu Gln Asn Asn Thr Thr
305 310 315 320
His Ser Leu Thr Asn Thr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Leu Thr Gln Ile
325 330 335
Val Asp Tyr Leu Ser Lys Val Pro Asn Glu Ile Tyr Glu Thr Leu Ser
340 345 350
Glu Lys Gln Gln Lys Glu Phe Glu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Arg
355 360 365
Glu Asn Pro Glu Asn Glu Asp Ser Thr Phe Ser Ser Ile Val Ser His
370 375 380
Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
385 390 395 400
Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
405 410 415
Asn Phe Gly Asp Tyr Ile Lys Asp Arg Gln Lys Lys Ile Leu Glu Ser
420 425 430
Ile Gln Phe Asp Ser Glu Arg Ile Ile Lys Lys Glu Ile His Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Tyr Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys
450 455 460
Glu Thr Ser Asn Ile Asp Leu Ser Arg Phe Pro Leu Phe Pro Asn Pro
465 470 475 480
Ser Tyr Val Met Ala Asn Asn Asn Ile Pro Phe Tyr Ile Asp Ser Arg
485 490 495
Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
500 505 510
Gln Asn Lys Lys Arg Asn Leu Thr Phe Glu Lys Tyr Asn Lys Glu Gln
515 520 525
Ser Lys Asp Ala Ile Ile Ala Met Leu Gln Lys Glu Ile Gly Val Lys
530 535 540
Asp Leu Gln Gln Arg Ser Thr Ile Gly Leu Leu Ser Cys Asn Glu Leu
545 550 555 560
Pro Ser Met Leu Tyr Glu Val Ile Val Lys Asp Ile Lys Gly Ala Glu
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Leu Glu Asn Lys Ile Ala Gln Lys Ile Arg Glu Gln Tyr Gln Ser Ile
580 585 590
Arg Asp Phe Thr Leu Asp Ser Pro Gln Lys Asp Asn Ile Pro Thr Thr
595 600 605
Leu Ile Lys Thr Ile Asn Thr Asp Ser Ser Val Thr Phe Glu Asn Gln
610 615 620
Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Leu Gln Lys Glu Leu Thr
625 630 635 640
Leu Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Val Lys Glu His Glu Ile Glu Val
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Asp Asn Tyr Asn Arg Asn Lys Asn Thr Tyr Lys Phe Lys Asn Gln Pro
660 665 670
Lys Asn Lys Val Asp Asp Lys Lys Leu Gln Arg Lys Tyr Val Phe Tyr
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Lys Gly Leu Lys Asn Leu Phe Leu Lys His Gly Asn Phe Ile Asp Phe
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<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 345
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
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210 215 220
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Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
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Pro Arg Gln Met Ile Ala Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Val Ala Asp Trp Leu
610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
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885 890 895
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 347
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100 105 110
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Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
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610 615 620
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Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu Gly
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Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp Thr
900 905 910
Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro
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Met Gln Leu Pro Val Thr Val Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His Asn Ile
930 935 940
Val Lys Asp Arg Pro Leu His Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr Lys Thr
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Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg
965 970 975
Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Glu Thr Glu Leu
980 985 990
Lys Ser Asn Pro Ile Ser Lys Ser Leu Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu
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1040 1045 1050
Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Val Ala Val
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1070 1075 1080
Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp Thr
1085 1090 1095
Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys
1100 1105 1110
Thr His Lys Ile Ile Lys Arg Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile
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Glu Thr Lys Glu
1130
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<212> PRT
<213> Prevotella intermedia 17
<400> 348
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115 120 125
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Tyr Ser Glu Ser Thr Lys Glu Pro Met Leu Glu Lys Glu Leu Leu Lys
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165 170 175
Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu
180 185 190
Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Tyr Phe Thr Thr Asn Lys Lys
195 200 205
Gly Asn Ile Thr Ala Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu
210 215 220
Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys
225 230 235 240
Asp Asn Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg
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Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln
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Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys
275 280 285
Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val
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405 410 415
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435 440 445
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Ile Arg Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp
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Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
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<213> Prevotella intermedia
<400> 349
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485 490 495
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580 585 590
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915 920 925
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<212> PRT
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<400> 350
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Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
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Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe
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885 890 895
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945 950 955 960
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965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ala Glu Thr Thr Asp Leu Asn
980 985 990
Leu Glu Glu His Pro Ile Ser Lys Leu Ser Val Asp Leu Glu Leu Ile
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1115 1120 1125
<210> 351
<211> 1125
<212> PRT
<213> Prevotella pallens
<400> 351
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50 55 60
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100 105 110
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180 185 190
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Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
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<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 354
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Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
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Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
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Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
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Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
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Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
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Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
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Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
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Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
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965 970 975
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1025 1030 1035
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Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 355
<211> 1150
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 355
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Tyr Val Phe Asp Ala Ala Leu Gln Met Val Lys Asp Asp Asn Arg
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Leu Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Lys
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<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 356
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645 650 655
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675 680 685
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885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Lys Glu His Pro Tyr Leu Asp Phe
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
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Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
980 985 990
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995 1000 1005
Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp
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1175
<210> 357
<211> 1115
<212> PRT
<213> Bacteroides pyrogenes
<400> 357
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Ser Arg Ala Thr Gly Phe Lys Ser Thr Lys Glu Lys Gly Phe Leu Ala
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Arg Arg His Leu Asp Ser Ile Ile Arg Glu Leu Arg Leu Lys Asp Thr
675 680 685
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Ile Cys Arg Leu Leu Lys Asp Lys Ile Gly Lys Glu Pro Ser Gly Lys
785 790 795 800
Leu Lys Trp Asn Glu Met Phe Lys Leu Tyr Trp Asp Lys Glu Phe Pro
805 810 815
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Ser Ser Lys Glu Lys Ser Lys Leu Gln Val Glu Asp Leu Thr Leu Ser
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Val Arg Arg Val Phe Lys Arg Ala Ile Asn Glu Lys Glu Tyr Gln Leu
885 890 895
Arg Leu Leu Cys Glu Asp Asp Arg Leu Leu Phe Met Ala Val Arg Asp
900 905 910
Leu Tyr Asp Trp Lys Glu Ala Gln Leu Asp Leu Asp Lys Ile Asp Asn
915 920 925
Met Leu Gly Glu Pro Val Ser Val Ser Gln Val Ile Gln Leu Glu Gly
930 935 940
Gly Gln Pro Asp Ala Val Ile Lys Ala Glu Cys Lys Leu Lys Asp Val
945 950 955 960
Ser Lys Leu Met Arg Tyr Cys Tyr Asp Gly Arg Val Lys Gly Leu Met
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Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Tyr Arg Lys Lys Phe Asn Val Pro Phe
290 295 300
Asp Ser Ala Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn
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Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr
325 330 335
Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu
340 345 350
Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
355 360 365
Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln
370 375 380
Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro Asp Glu Trp Lys Ala Leu Val Lys
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Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Asn Glu Arg Tyr Ile Ser Glu Thr
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Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg
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Asn Gly Asn Lys Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu Asn
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Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Pro Tyr Gln Ala Glu Ala
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Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
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Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile Val
485 490 495
Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Met Tyr Lys Leu Tyr Asp
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Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Gly Asp Leu Glu Lys Tyr
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Ala Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Lys Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg
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Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
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930 935 940
Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn
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Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe
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Val Asp Thr Ser Ser Lys Ala Glu Leu Lys Asp Lys Pro Ile Ser Lys
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Ser Val Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu
995 1000 1005
Thr Ile Lys Asp Met Leu Leu Leu Glu Lys Thr Leu Ile Lys Lys
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Asp Val Lys Leu Leu Val Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
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Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro
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<211> 1156
<212> PRT
<213> Chryseobacterium carnipullorum
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Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Lys Ser Arg Ile Arg Gly Phe Lys Ala Lys Ile Val Arg Asp Gly Glu
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Lys Asp Arg Ile Lys Val Phe Gly Lys Leu Ser Glu Ile Ser Ser Leu
420 425 430
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435 440 445
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515 520 525
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Glu Glu Ile Glu Leu Ile Ile Lys Glu Lys Leu Asp Ser His Phe Glu
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580 585 590
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595 600 605
Glu Ala Lys Phe Ala Leu Leu Ala Lys Asn Arg Lys Glu Leu Lys Glu
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Lys Phe Arg Gly Lys Pro Leu Arg Gln Thr Ile Phe Ser Asn Met Glu
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Leu Gly Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ala Asp Asp Ile Lys Arg Phe Met
645 650 655
Pro Asp Ile Leu Arg Lys Asn Trp Lys Gly Tyr Gln His Asn Gln Leu
660 665 670
Gln Gln Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Arg Pro Lys Glu Ala Phe Thr
675 680 685
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Leu Glu Asn Leu Glu Thr Glu Lys Asn Lys Ile Leu Ser Lys Pro Leu
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Ser Thr Asn Pro Val Lys Arg Thr Leu Thr Tyr Asp Asp Leu Ala Lys
995 1000 1005
Ile Asp Gly His Leu Ile Ser Lys Ser Ile Lys Phe Thr Asn Val
1010 1015 1020
Thr Leu Glu Leu Glu Arg Tyr Phe Ile Phe Lys Glu Ser Leu Ile
1025 1030 1035
Val Lys Lys Gly Asn Asn Ile Asp Phe Lys Tyr Ile Lys Gly Leu
1040 1045 1050
Arg Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Lys Lys Lys Asn Glu Gly Ile Arg
1055 1060 1065
Asn Lys Ala Phe His Phe Gly Ile Pro Asp Ser Lys Ser Tyr Asp
1070 1075 1080
Gln Leu Ile Arg Asp Ala Glu Val Met Phe Ile Ala Asn Glu Val
1085 1090 1095
Lys Pro Thr His Ala Thr Lys Tyr Thr Asp Leu Asn Lys Gln Leu
1100 1105 1110
His Thr Val Cys Asp Lys Leu Met Glu Thr Val His Asn Asp Tyr
1115 1120 1125
Phe Ser Lys Glu Gly Asp Gly Lys Lys Lys Arg Glu Ala Ala Gly
1130 1135 1140
Gln Lys Tyr Phe Glu Asn Ile Ile Ser Ala Lys
1145 1150
<210> 375
<211> 1119
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 375
Met Thr Glu Gln Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Ala His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly Asn Asn Asp Asn Pro Phe Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Arg Glu Gly Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Thr Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Ser Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Glu Asp Thr Asp Gly Ala
325 330 335
Glu Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Ala Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Phe Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ala His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Ser Ala Glu Arg Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
530 535 540
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545 550 555 560
Pro Arg Gln Met Ile Gly Ile Leu Ser Gln Glu His Lys Asp Met Glu
565 570 575
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580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
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610 615 620
Val Arg Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly
625 630 635 640
Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
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Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Lys Arg Ala Glu Glu Trp Glu Ser Gly
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850 855 860
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Gly Asp Leu Met Glu Glu Asn Lys Val Glu Gly Leu Asp Thr Gly Thr
885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
Thr Val Tyr Ile Glu Glu Arg Asp Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn
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Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe
965 970 975
Val Asp Thr Gly Ala Leu Ala Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Ala
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Pro His Leu Pro Asp Lys Asn Phe Arg Lys Met Leu Glu Ser Trp
1025 1030 1035
Ser Asp Pro Leu Leu Asp Lys Trp Pro Asp Leu His Arg Lys Val
1040 1045 1050
Arg Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr
1055 1060 1065
Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp
1070 1075 1080
Pro Ser Phe Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile
1085 1090 1095
Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val
1100 1105 1110
Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1115
<210> 376
<211> 1179
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 376
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Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
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100 105 110
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245 250 255
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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565 570 575
Leu Glu Asn Lys Ile Ala Gln Lys Ile Arg Glu Gln Tyr Gln Ser Ile
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Ile Gln Lys Glu Leu Thr
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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Leu Gln Ser Phe Leu Ala Phe Phe Glu Asp Lys Lys Asn Asp Cys Ile
725 730 735
Ala Leu Leu Glu Thr Val Phe Asn Leu Lys Glu Asp Cys Ile Leu Thr
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Tyr Lys Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Asp Phe Leu Asn Thr Glu Ser
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785 790 795 800
Lys Glu Leu Ser Lys Arg Phe Lys Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
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820 825 830
Ala Asp Ala Ile Asn Leu Ser Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Pro Thr
835 840 845
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850 855 860
Val Ala Ser Tyr Gln Tyr Asn Asn Tyr Gln Ser Phe Tyr Glu Leu Thr
865 870 875 880
Pro Asp Ile Val Glu Arg Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Lys Asn Leu Arg
885 890 895
Ala Ile Asn Lys Val Lys Ile Gln Asp Tyr Tyr Leu Lys Leu Met Val
900 905 910
Asp Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Phe Asn Gln Pro Leu Asp Lys Ser Leu
915 920 925
Ser Asp Phe Tyr Val Ser Lys Ala Glu Arg Glu Lys Ile Lys Ala Asp
930 935 940
Ala Lys Ala Tyr Gln Lys Arg Asn Asp Ser Ser Leu Trp Asn Lys Val
945 950 955 960
Ile His Leu Ser Leu Gln Asn Asn Arg Ile Thr Ala Asn Pro Lys Leu
965 970 975
Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
980 985 990
Thr Leu Leu Thr Tyr Asp Asp Arg Thr Trp Thr Tyr Ala Leu Gln Lys
995 1000 1005
Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asn Asp Tyr Lys Glu Leu His Tyr Thr
1010 1015 1020
Ala Leu Asn Met Glu Leu Gln Glu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Lys
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Ile Leu Glu Asn Glu Asp Asp Leu Asp Lys Leu Pro Glu Lys Val
1085 1090 1095
Glu Ala Met Arg Glu Leu Asp Glu Thr Ile Thr Asn Pro Ile Ile
1100 1105 1110
Lys Lys Ala Ile Val Leu Ile Ile Ile Arg Asn Lys Met Ala His
1115 1120 1125
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
Val Phe Glu Thr Ile Thr Lys Glu Leu Trp Glu Asn Lys Glu Lys
1160 1165 1170
Lys Asp Lys Thr Gln Val
1175
<210> 377
<211> 1145
<212> PRT
<213> Psychroflexus torquis
<400> 377
Met Glu Ser Ile Ile Gly Leu Gly Leu Ser Phe Asn Pro Tyr Lys Thr
1 5 10 15
Ala Asp Lys His Tyr Phe Gly Ser Phe Leu Asn Leu Val Glu Asn Asn
20 25 30
Leu Asn Ala Val Phe Ala Glu Phe Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Lys Ala
35 40 45
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50 55 60
Met Ser Ile Val Asp Tyr Glu Lys Lys Ile Ser Ile Leu Asn Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Ile Ile Asp Phe Leu Asp Asp Glu Leu Glu Asn Asn Leu Asn
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Ile Glu Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His Phe Tyr His Asp Pro Ile
115 120 125
Thr Phe Glu Asp Asn Lys Glu Pro Leu Leu Glu Leu Leu Asp Glu Val
130 135 140
Leu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Val Lys Lys Lys Tyr Leu Lys Thr Asp
145 150 155 160
Lys Thr Lys Glu Ile Leu Lys Asp Ser Leu Arg Glu Glu Met Asp Leu
165 170 175
Leu Val Ile Arg Lys Thr Asp Glu Leu Arg Glu Lys Lys Lys Thr Asn
180 185 190
Pro Lys Ile Gln His Thr Asp Ser Ser Gln Ile Lys Asn Ser Ile Phe
195 200 205
Asn Asp Ala Phe Gln Gly Leu Leu Tyr Glu Asp Lys Gly Asn Asn Lys
210 215 220
Lys Thr Gln Val Ser His Arg Ala Lys Thr Arg Leu Asn Pro Lys Asp
225 230 235 240
Ile His Lys Gln Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ile Pro Leu Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Leu Phe Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu
260 265 270
Asp Phe Lys Ser Asn Ile Lys Gly Phe Lys Gly Lys Val Val Lys Asp
275 280 285
Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Tyr Met Ala Thr His Arg Val Tyr Ser
290 295 300
Ile Leu Ala Phe Lys Gly Leu Lys Tyr Arg Ile Lys Thr Asp Thr Phe
305 310 315 320
Ser Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val
325 330 335
Pro Asp Cys Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Thr Lys Gln Lys Asp Phe
340 345 350
Ile Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Phe Lys Asp Asn Glu Glu Asn Thr Glu
355 360 365
Asn Leu Glu Asn Ser Arg Val Val His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr
370 375 380
Glu Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala
385 390 395 400
Asn Phe Lys Thr Leu Lys Phe Gln Val Phe Met Gly Tyr Tyr Ile His
405 410 415
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420 425 430
Thr Val Lys Glu Lys Ile Asn Val Phe Gly Lys Leu Ser Lys Met Asp
435 440 445
Asn Leu Lys Lys His Phe Phe Ser Gln Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr
450 455 460
Asp Trp Glu Phe Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Asn Phe Leu Thr Gln Ala
465 470 475 480
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485 490 495
Gln Gln Ile Ile Lys Glu Lys Asp Ala Ile Lys Ala Glu Val Asn Gln
500 505 510
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515 520 525
Lys Ile Leu Lys Thr Tyr Glu Asp Phe His Gln Gly Asp Pro Thr Ala
530 535 540
Ile Leu Ser Leu Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu His Leu Phe Leu Val
545 550 555 560
Lys Pro Asn Asn Lys Thr Gly Gln Gln Ile Glu Asn Ile Ile Arg Ile
565 570 575
Lys Ile Glu Lys Gln Phe Lys Ala Ile Asn His Pro Ser Lys Asn Asn
580 585 590
Lys Gly Ile Pro Lys Ser Leu Phe Ala Asp Thr Asn Val Arg Val Asn
595 600 605
Ala Ile Lys Leu Lys Lys Asp Leu Glu Ala Glu Leu Asp Met Leu Asn
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Lys Lys His Ile Ala Phe Lys Glu Asn Gln Lys Ala Ser Ser Asn Tyr
625 630 635 640
Asp Lys Leu Leu Lys Glu His Gln Phe Thr Pro Lys Asn Lys Arg Pro
645 650 655
Glu Leu Arg Lys Tyr Val Phe Tyr Lys Ser Glu Lys Gly Glu Glu Ala
660 665 670
Thr Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys Asp Phe Lys
675 680 685
Thr Lys Trp Lys Gly Cys Gln His Ser Glu Leu Gln Arg Lys Leu Ala
690 695 700
Phe Tyr Asp Arg His Thr Lys Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Ser Gly
705 710 715 720
Cys Glu Phe Asp His Ser Leu Leu Asp Ile Asn Ala Tyr Phe Gln Lys
725 730 735
Asp Asn Phe Glu Asp Phe Phe Ser Lys Tyr Leu Glu Asn Arg Ile Glu
740 745 750
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755 760 765
Thr Pro Leu Lys Gly Val Phe Lys Asn Cys Phe Lys Phe Leu Lys Arg
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785 790 795 800
Ala Lys Pro Thr Phe Leu Pro Arg Gly Val Phe Asp Glu Arg Pro Thr
805 810 815
Met Lys Lys Gly Lys Asn Pro Leu Lys Asp Lys Asn Glu Phe Ala Glu
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835 840 845
Ala Glu Glu Tyr Arg Met Arg Asp Ala Asp Phe Lys Lys Asn Ala Val
850 855 860
Ile Lys Lys Gln Lys Leu Lys Asp Phe Tyr Thr Leu Gln Met Val Asn
865 870 875 880
Tyr Leu Leu Lys Glu Val Phe Gly Lys Asp Glu Met Asn Leu Gln Leu
885 890 895
Ser Glu Leu Phe Gln Thr Arg Gln Glu Arg Leu Lys Leu Gln Gly Ile
900 905 910
Ala Lys Lys Gln Met Asn Lys Glu Thr Gly Asp Ser Ser Glu Asn Thr
915 920 925
Arg Asn Gln Thr Tyr Ile Trp Asn Lys Asp Val Pro Val Ser Phe Phe
930 935 940
Asn Gly Lys Val Thr Ile Asp Lys Val Lys Leu Lys Asn Ile Gly Lys
945 950 955 960
Tyr Lys Arg Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Val Lys Thr Phe Ile Gly Tyr
965 970 975
Glu Val Asp Glu Lys Trp Met Met Tyr Leu Pro His Asn Trp Lys Asp
980 985 990
Arg Tyr Ser Val Lys Pro Ile Asn Val Ile Asp Leu Gln Ile Gln Glu
995 1000 1005
Tyr Glu Glu Ile Arg Ser His Glu Leu Leu Lys Glu Ile Gln Asn
1010 1015 1020
Leu Glu Gln Tyr Ile Tyr Asp His Thr Thr Asp Lys Asn Ile Leu
1025 1030 1035
Leu Gln Asp Gly Asn Pro Asn Phe Lys Met Tyr Val Leu Asn Gly
1040 1045 1050
Leu Leu Ile Gly Ile Lys Gln Val Asn Ile Pro Asp Phe Ile Val
1055 1060 1065
Leu Lys Gln Asn Thr Asn Phe Asp Lys Ile Asp Phe Thr Gly Ile
1070 1075 1080
Ala Ser Cys Ser Glu Leu Glu Lys Lys Thr Ile Ile Leu Ile Ala
1085 1090 1095
Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Asn Lys Met Ile
1100 1105 1110
Tyr Asp Leu Ala Asn Glu Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Glu Thr
1115 1120 1125
Tyr Ala Asn Tyr Tyr Leu Lys Val Leu Lys Lys Met Ile Ser Asp
1130 1135 1140
Leu Ala
1145
<210> 378
<211> 948
<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 378
Met Phe Phe Ser Phe His Asn Ala Gln Arg Val Ile Phe Lys His Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
20 25 30
Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Arg Asp Phe Ala His Leu Asn Arg
35 40 45
Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asn Arg Tyr Arg Phe
50 55 60
Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Thr Asn
65 70 75 80
Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys Lys Val Ser
85 90 95
Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr Thr Glu Val
100 105 110
Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Arg
115 120 125
Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu Leu Ser Arg
130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn Lys Lys His
145 150 155 160
Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu Gln
165 170 175
Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr
180 185 190
Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
195 200 205
Phe Gln Val Asp Leu Gly Thr Tyr His Tyr Cys Ile Tyr Asp Lys Lys
210 215 220
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225 230 235 240
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Lys Lys Asp Ala Ile Trp Ala Gln Thr Lys Ile Lys Gly Phe Lys Asp
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Asn Arg Glu Asn Lys Gln Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser
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Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp
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<213> Porphyromonas gulae
<400> 388
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<210> 392
<211> 1119
<212> PRT
<213> Poprhyromonas gulae
<400> 392
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1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Phe Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Glu Val
180 185 190
Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Gly Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Pro Tyr Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Ala Cys Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Leu Lys
530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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705 710 715 720
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755 760 765
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770 775 780
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835 840 845
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850 855 860
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Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Trp Lys Tyr Asp
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Glu Arg Ile Ile Gln Ala
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 393
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65 70 75 80
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245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Gly Pro Tyr Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
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Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
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Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
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885 890 895
Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Gln Glu His Pro Tyr His Asp Phe
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
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Met Arg Leu Pro Val Val Val Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Gly His Val
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Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ser Phe Val Lys Asp Arg
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Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Gly Gly Leu Ala
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Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu
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Ala
<210> 394
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 394
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Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
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Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
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Leu Ser Ile Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
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100 105 110
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115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Lys Val Ser Pro Asp
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Gly Glu Ile Glu Leu Asp Ser Tyr Ser Lys Lys Val Gly Arg Asn Gly
355 360 365
Glu Tyr Asp Arg Thr Ile Thr Asp His Ala Leu Ala Phe Gly Lys Leu
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435 440 445
Gly Phe Ile Ser Val His Asp Leu Arg Lys Leu Leu Leu Met Glu Leu
450 455 460
Leu Cys Glu Gly Ser Phe Ser Arg Met Gln Ser Asp Phe Leu Arg Lys
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1130 1135
<210> 395
<211> 1218
<212> PRT
<213> Capnocytophaga cynodegmi
<400> 395
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165 170 175
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180 185 190
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245 250 255
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Ile Thr Ser Gly Gly Met Lys Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Phe Phe Val
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Leu Ala Ser Asp Lys Arg Ile Gly Asn Leu Leu Glu Leu Val Gly Ser
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355 360 365
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<400> 402
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Ser Glu Glu Leu Gln Lys Gly Tyr Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys
165 170 175
Glu Leu Asn Arg Leu Gly Lys Lys Val Asn Ile His Asp Gln Leu Gly
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Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala Lys Glu His Pro Tyr Leu Asp Phe
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<210> 409
<211> 950
<212> PRT
<213> Rimerella anatipestifer
<400> 409
Met Phe Phe Ser Phe His Asn Ala Gln Arg Val Ile Phe Lys His Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
20 25 30
Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Arg Asp Phe Ala His Leu Asn Arg
35 40 45
Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asn Arg Tyr Arg Phe
50 55 60
Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Thr Asn
65 70 75 80
Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys Lys Val Ser
85 90 95
Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Ser Glu Lys Met Thr Thr Glu Val
100 105 110
Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Arg
115 120 125
Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu Leu Ser Arg
130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Lys Asp Lys Lys Cys
145 150 155 160
Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu Gln
165 170 175
Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr
180 185 190
Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
195 200 205
Phe Gln Val Asp Leu Gly Thr Tyr His Tyr Cys Ile Tyr Asp Lys Lys
210 215 220
Ile Gly Tyr Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr Leu Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gly Arg Leu Gln Asp Phe Thr Glu Ile Asn Arg Pro Gln Glu Trp
245 250 255
Lys Ala Leu Thr Lys Asp Leu Asp Tyr Asn Glu Thr Ser Asn Gln Pro
260 265 270
Phe Ile Ser Lys Thr Thr Pro His Tyr His Ile Thr Asp Asn Lys Ile
275 280 285
Gly Phe Arg Leu Arg Thr Ser Lys Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Glu Val
290 295 300
Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Lys Tyr Pro Tyr Asn Ser Asp Phe
305 310 315 320
Val Ala His Ala Phe Ile Ser Ile Ser Val His Glu Leu Leu Pro Leu
325 330 335
Met Phe Tyr Gln His Leu Thr Gly Lys Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu
340 345 350
Thr Val Arg His Ile Gln Arg Ile Tyr Lys Asp Phe Glu Glu Glu Arg
355 360 365
Ile Asn Thr Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Asn Gln Gly Arg Leu Pro
370 375 380
Leu Gly Ala Phe Pro Lys Gln Met Leu Gly Leu Leu Gln Asn Lys Gln
385 390 395 400
Pro Asp Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile Ala
405 410 415
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420 425 430
Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val Leu
435 440 445
Ala Asp Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Val Tyr
450 455 460
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465 470 475 480
Ser Arg Leu Ile Arg Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Asn
485 490 495
Arg Leu Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr Asn
500 505 510
Pro His Pro Phe Leu Asn Lys Phe Asn Trp Lys Ala Cys Arg Asn Leu
515 520 525
Val Asp Phe Tyr Gln Gln Tyr Leu Glu Gln Arg Glu Lys Phe Leu Glu
530 535 540
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545 550 555 560
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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850 855 860
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865 870 875 880
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<210> 410
<211> 1213
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 410
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1 5 10 15
Tyr Lys Gln Glu Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Asn Ala
20 25 30
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35 40 45
Phe Asn His Asn Asn Asn Glu Leu Ala Ser Val Phe Lys Asp Tyr Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Phe Pro Val Leu Glu Arg Ile Gln Lys His Thr Asn His
85 90 95
Asn Phe Glu Gln Thr Arg Glu Ile Phe Glu Leu Leu Leu Asp Thr Ile
100 105 110
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115 120 125
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Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
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Asn Asn Tyr Asn Arg Asn Lys Asn Thr Tyr Lys Phe Lys Asn Gln Pro
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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Leu Glu Asn Ile Asp Ile Glu Ile Leu Ile Lys Tyr Tyr Asp Tyr
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Leu Ala Thr Arg Phe Val Pro Lys Lys Glu Glu Glu Tyr Phe Ala
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<210> 411
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 411
Met Glu Lys Pro Leu Pro Pro Asn Val Tyr Thr Leu Lys His Lys Phe
1 5 10 15
Phe Trp Gly Ala Phe Leu Asn Ile Ala Arg His Asn Ala Phe Ile Thr
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Asn Asp His Asp Leu Leu Lys Lys Ser Gln Leu Thr Glu Leu Ile Leu
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Lys His Phe Pro Phe Leu Ala Ala Met Cys Tyr His Pro Pro Lys Lys
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Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Lys Glu Gln Gln Lys Glu Lys Glu
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Asn Glu Ala Gln Ser Gln Ala Glu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Leu Ile
115 120 125
Lys Val Leu Lys Thr Leu Val Lys Gln Leu Arg Thr Leu Arg Asn Tyr
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Lys His Leu Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu
165 170 175
Asp Tyr Lys Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Gln Asp Phe Ala His
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Leu Asn Arg Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asp Arg
195 200 205
Tyr Arg Phe Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
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Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Ser Glu Lys Met Thr
245 250 255
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Glu Ser Arg Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu
275 280 285
Leu Ser Arg Tyr Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asp
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Glu Glu Gln Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
325 330 335
Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys
340 345 350
Ser Ile Arg Phe Gln Val Asp Leu Gly Thr Tyr His Tyr Cys Ile Tyr
355 360 365
Asp Lys Lys Ile Gly Asp Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr
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Leu Leu Ser Phe Gly Arg Leu Gln Asp Phe Thr Glu Ile Asn Arg Pro
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Leu Glu Val Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Gln Tyr Pro Tyr Asn
450 455 460
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Leu Met Phe Tyr Gln His Leu Thr Gly Lys Ser Glu Asp Leu Leu Lys
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Arg Ile Asn Thr Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Asn Gln Gly Arg Leu
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Pro Leu Gly Ala Phe Pro Lys Gln Met Leu Gly Leu Leu Gln Asn Lys
530 535 540
Gln Pro Asp Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile
545 550 555 560
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser
565 570 575
Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
580 585 590
Leu Ala Asp Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala
595 600 605
Tyr Asp Ala Gln Asn Gln Pro Ile Glu Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr
610 615 620
Glu Phe Gln Leu Ile Gln Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys
625 630 635 640
Asn Arg Leu Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr
645 650 655
Asn Pro His Pro Phe Leu Asn Lys Phe Asn Trp Lys Ala Cys Arg Asn
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Leu Lys Ile Pro Lys Glu Asn Arg Lys Asn Leu Val Lys Gly Trp Glu
705 710 715 720
Gln Gly Gly Ile Ser Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Ala Ile Arg
725 730 735
Glu Thr Leu Ser Lys Asp Leu Thr Leu Ser Lys Pro Ile Arg Lys Glu
740 745 750
Ile Lys Lys His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu
755 760 765
Tyr Phe Arg Glu Lys Tyr Gln Asp Asp His Gln Ser Phe Tyr Asp Leu
770 775 780
Pro Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Ala Ser Pro Leu Pro Lys Lys Glu His
785 790 795 800
Tyr Glu Tyr Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Leu Gln
805 810 815
Arg Leu Glu Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr
820 825 830
Lys Arg Trp Gln His Leu Glu Lys Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Asn Gln
835 840 845
Asp Val Met Leu Trp Leu Met Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asn His Phe
850 855 860
Lys Glu Leu Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala
865 870 875 880
Val Asn Val Gln Glu Ala Asp Ala Lys Leu Asn Pro Leu Asn Gln Thr
885 890 895
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Ile Tyr Gln Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Lys Glu Thr Leu Asn Leu
980 985 990
Glu Glu Lys Leu Leu Lys Lys His Thr Ser Leu Ser Ser Val Glu Asn
995 1000 1005
Lys Phe Arg Ile Leu Leu Glu Glu Trp Lys Lys Glu Tyr Ala Ala
1010 1015 1020
Ser Ser Met Val Thr Asp Glu His Ile Ala Phe Ile Ala Ser Val
1025 1030 1035
Arg Asn Ala Phe Cys His Asn Gln Tyr Pro Phe Tyr Glu Glu Ala
1040 1045 1050
Leu His Ala Pro Ile Pro Leu Phe Thr Val Ala Gln Gln Thr Thr
1055 1060 1065
Glu Glu Lys Asp Gly Leu Gly Ile Ala Glu Ala Leu Leu Arg Val
1070 1075 1080
Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val Lys Ser Gln Ile
1085 1090 1095
<210> 412
<211> 1149
<212> PRT
<213> Sinomicrobium oceani
<400> 412
Met Glu Ser Thr Thr Thr Leu Gly Leu His Leu Lys Tyr Gln His Asp
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Leu Phe Glu Asp Lys His Tyr Phe Gly Gly Gly Val Asn Leu Ala Val
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Gln Asn Ile Glu Ser Ile Phe Gln Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Gly Ile
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Tyr Lys Leu Arg His Phe Tyr Thr His Tyr Tyr His Ser Pro Ile Lys
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Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Thr Cys Leu Asn Glu Leu Phe Val Ala Val
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Ala Ile Gln Val Lys Lys His Lys Met Lys Ser Asp Lys Thr Arg Gln
145 150 155 160
Leu Leu Asn Lys Asn Leu His Gln Leu Leu Gln Gln Leu Ile Glu Gln
165 170 175
Lys Arg Glu Lys Leu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Glu Lys Val Ser
180 185 190
Leu Asp Thr Lys Ser Ile Glu Asn Ala Val Leu Asn Asp Ala Phe Val
195 200 205
His Leu Leu Asp Lys Asp Glu Asn Ile Arg Leu Asn Tyr Ser Ser Arg
210 215 220
Leu Ser Glu Asp Ile Ile Thr Lys Asn Gly Ile Thr Leu Ser Ile Ser
225 230 235 240
Gly Leu Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Leu Gln Arg Lys Glu Ala Glu
245 250 255
Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Gly Phe Lys Gly Lys Gly Asn Glu Leu
260 265 270
Arg Phe Met Ala Thr His Trp Val Phe Ser Tyr Leu Asn Val Lys Arg
275 280 285
Ile Lys His Arg Leu Asn Thr Asp Phe Gln Lys Glu Thr Leu Leu Ile
290 295 300
Gln Ile Ala Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asp Glu Val Tyr Lys Thr
305 310 315 320
Leu Asp His Glu Asn Arg Ser Lys Phe Leu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Val His Leu Gly Asn Tyr Ile His Asp Arg Arg Asp Lys Val Ile Asp
385 390 395 400
Gly Thr Asn Phe Ile Thr Asn Arg Val Ile Lys Glu Pro Ile Lys Val
405 410 415
Phe Gly Lys Leu Ser His Val Ser Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Met Glu
420 425 430
Ser Leu Ser Arg Glu His Lys Asn Gly Trp Asp Val Phe Pro Asn Pro
435 440 445
Ser Tyr Asn Phe Val Gly His Asn Ile Pro Ile Phe Ile Asn Leu Arg
450 455 460
Ser Ala Ser Ser Lys Gly Lys Glu Leu Tyr Arg Asp Leu Met Lys Ile
465 470 475 480
Lys Ser Glu Lys Lys Lys Lys Ser Arg Glu Glu Gly Ile Pro Met Glu
485 490 495
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500 505 510
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Leu Ala Met Leu Ser Leu Asn Glu Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Leu
530 535 540
Leu Arg Arg Pro Ser Ile Thr Pro Gln Asp Ile Glu Asp Arg Met Val
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Glu Lys Leu Tyr Glu Arg Phe Gln Ile Ile Arg Asp Tyr Lys Pro Gly
565 570 575
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580 585 590
Asn Ser Thr Arg Leu Asp Gly Lys Lys Leu Leu Arg Ala Ile Gln Thr
595 600 605
Glu Thr Arg Asn Ala Arg Glu Lys Leu His Thr Leu Glu Glu Asn Lys
610 615 620
Ala Leu Gln Lys Asn Arg Lys Arg Arg Thr Val Tyr Thr Thr Arg Glu
625 630 635 640
Gln Gly Arg Glu Ala Ser Trp Leu Ala Gln Asp Leu Lys Arg Phe Met
645 650 655
Pro Ile Ala Ser Arg Lys Glu Trp Arg Gly Tyr His His Ser Gln Leu
660 665 670
Gln Gln Ile Leu Ala Phe Tyr Asp Gln Asn Pro Lys Gln Pro Leu Glu
675 680 685
Leu Leu Glu Gln Phe Trp Asp Leu Lys Glu Asp Thr Tyr Val Trp Asn
690 695 700
Ser Trp Ile His Lys Ser Leu Ser Gln His Asn Gly Phe Val Pro Met
705 710 715 720
Tyr Glu Gly Tyr Leu Lys Gly Arg Leu Gly Tyr Tyr Lys Lys Leu Glu
725 730 735
Ser Asp Ile Ile Gly Phe Leu Glu Glu His Lys Val Leu Lys Arg Tyr
740 745 750
Tyr Thr Gln Gln His Leu Asn Val Ile Phe Arg Glu Arg Leu Tyr Phe
755 760 765
Ile Lys Thr Glu Thr Lys Gln Lys Leu Glu Leu Leu Ala Arg Pro Leu
770 775 780
Val Phe Pro Arg Gly Ile Phe Asp Asp Lys Pro Thr Phe Val Gln Asp
785 790 795 800
Lys Lys Val Val Asp His Pro Glu Leu Phe Ala Asp Trp Tyr Val Tyr
805 810 815
Ser Tyr Lys Asp Asp His Ser Phe Gln Glu Phe Tyr His Tyr Lys Arg
820 825 830
Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Glu Thr Glu Leu Ser Trp Asp Ile Asp Phe
835 840 845
Lys Asp Asn Lys Arg Gln Leu Asn Pro Ser Glu Gln Met Asp Leu Phe
850 855 860
Arg Met Lys Trp Asp Leu Lys Ile Lys Lys Ile Lys Ile Gln Asp Ile
865 870 875 880
Phe Leu Lys Ile Val Ala Glu Asp Ile Tyr Leu Lys Ile Phe Gly His
885 890 895
Lys Ile Pro Leu Ser Leu Ser Asp Phe Tyr Ile Ser Arg Gln Glu Arg
900 905 910
Leu Thr Leu Asp Glu Gln Ala Val Ala Gln Ser Met Arg Leu Pro Gly
915 920 925
Asp Thr Ser Glu Asn Gln Ile Lys Glu Ser Asn Leu Trp Gln Thr Thr
930 935 940
Val Pro Tyr Glu Lys Glu Gln Ile Arg Glu Pro Lys Ile Lys Leu Lys
945 950 955 960
Asp Ile Gly Lys Phe Lys Tyr Phe Leu Gln Gln Gln Lys Val Leu Asn
965 970 975
Leu Leu Lys Tyr Asp Pro Gln His Val Trp Thr Lys Ala Glu Leu Glu
980 985 990
Glu Glu Leu Tyr Ile Gly Lys His Ser Tyr Glu Val Val Arg Arg Glu
995 1000 1005
Met Leu Leu Gln Lys Cys His Gln Leu Glu Lys His Ile Leu Glu
1010 1015 1020
Gln Phe Arg Phe Asp Gly Ser Asn His Pro Arg Glu Leu Glu Gln
1025 1030 1035
Gly Asn His Pro Asn Phe Lys Met Tyr Ile Val Asn Gly Ile Leu
1040 1045 1050
Thr Lys Arg Gly Glu Leu Glu Ile Glu Ala Glu Asn Trp Trp Leu
1055 1060 1065
Glu Leu Gly Asn Ser Lys Asn Ser Leu Asp Lys Val Glu Val Glu
1070 1075 1080
Leu Leu Thr Met Lys Thr Ile Pro Glu Gln Lys Ala Phe Leu Leu
1085 1090 1095
Ile Leu Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ala Asp
1100 1105 1110
Asn Tyr Phe His Tyr Ala Ser Asn Leu Met Asn Leu Lys Lys Ser
1115 1120 1125
Asp Thr Tyr Ser Leu Phe Trp Phe Thr Val Ala Asp Thr Ile Val
1130 1135 1140
Gln Glu Phe Met Ser Leu
1145
<210> 413
<211> 1133
<212> PRT
<213> Richenbachiella agariperforans
<400> 413
Met Lys Thr Asn Pro Leu Ile Ala Ser Ser Gly Glu Lys Pro Asn Tyr
1 5 10 15
Lys Lys Phe Asn Thr Glu Ser Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ile Phe Gln
20 25 30
Asn Lys Gly Ser Ile Ala Pro Ile Ala Glu Lys Ala Cys Lys Asn Phe
35 40 45
Glu Ile Lys Ser Lys Ser Pro Val Asn Arg Asp Gly Arg Leu His Tyr
50 55 60
Phe Ser Val Gly His Ala Phe Lys Asn Ile Asp Ser Lys Asn Val Phe
65 70 75 80
Arg Tyr Glu Leu Asp Glu Ser Gln Met Asp Met Lys Pro Thr Gln Phe
85 90 95
Leu Ala Leu Gln Lys Glu Phe Phe Asp Phe Gln Gly Ala Leu Asn Gly
100 105 110
Leu Leu Lys His Ile Arg Asn Val Asn Ser His Tyr Val His Thr Phe
115 120 125
Glu Lys Leu Glu Ile Gln Ser Ile Asn Gln Lys Leu Ile Thr Phe Leu
130 135 140
Ile Glu Ala Phe Glu Leu Ala Val Ile His Ser Tyr Leu Asn Glu Glu
145 150 155 160
Glu Leu Ser Tyr Glu Ala Tyr Lys Asp Asp Pro Gln Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Leu Val Gln Phe Leu Cys Asp Lys Phe Tyr Pro Asn Lys Glu His Glu
180 185 190
Val Glu Glu Arg Lys Thr Ile Leu Ala Lys Asn Lys Arg Gln Ala Leu
195 200 205
Glu His Leu Leu Phe Ile Glu Val Thr Ser Asp Ile Asp Trp Lys Leu
210 215 220
Phe Glu Lys His Lys Val Phe Thr Ile Ser Asn Gly Lys Tyr Leu Ser
225 230 235 240
Phe His Ala Cys Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Leu Tyr Lys Ser Glu
245 250 255
Ala Asn Gln Leu Ile Ser Lys Ile Lys Gly Phe Lys Arg Asn Asp Asp
260 265 270
Asn Gln Tyr Arg Ser Lys Arg Gln Ile Phe Thr Phe Phe Ser Lys Lys
275 280 285
Phe Thr Ser Gln Asp Val Asn Ser Glu Glu Gln His Leu Val Lys Phe
290 295 300
Arg Asp Val Ile Gln Tyr Leu Asn His Tyr Pro Ser Ala Trp Asn Lys
305 310 315 320
His Leu Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Pro Gln Met Thr Asp Lys Leu Met
325 330 335
Arg Tyr Ile Val Glu Ala Glu Ile Tyr Arg Ser Phe Pro Asp Gln Thr
340 345 350
Asp Asn His Arg Phe Leu Leu Phe Ala Ile Arg Glu Phe Phe Gly Gln
355 360 365
Ser Cys Leu Asp Thr Trp Thr Gly Asn Thr Pro Ile Asn Phe Ser Asn
370 375 380
Gln Glu Gln Lys Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Asn Thr Ser Ala Glu Ile
385 390 395 400
Lys Asp Ile Glu Thr Lys Leu Lys Ala Leu Val Leu Lys Gly Pro Leu
405 410 415
Asn Phe Lys Glu Lys Lys Glu Gln Asn Arg Leu Glu Lys Asp Leu Arg
420 425 430
Arg Glu Lys Lys Glu Gln Pro Thr Asn Arg Val Lys Glu Lys Leu Leu
435 440 445
Thr Arg Ile Gln His Asn Met Leu Tyr Val Ser Tyr Gly Arg Asn Gln
450 455 460
Asp Arg Phe Met Asp Phe Ala Ala Arg Phe Leu Ala Glu Thr Asp Tyr
465 470 475 480
Phe Gly Lys Asp Ala Lys Phe Lys Met Tyr Gln Phe Tyr Thr Ser Asp
485 490 495
Glu Gln Arg Asp His Leu Lys Glu Gln Lys Lys Glu Leu Pro Lys Lys
500 505 510
Glu Phe Glu Lys Leu Lys Tyr His Gln Ser Lys Leu Val Asp Tyr Phe
515 520 525
Thr Tyr Ala Glu Gln Gln Ala Arg Tyr Pro Asp Trp Asp Thr Pro Phe
530 535 540
Val Val Glu Asn Asn Ala Ile Gln Ile Lys Val Thr Leu Phe Asn Gly
545 550 555 560
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565 570 575
Glu Asp Ala Leu Tyr Ser Glu Lys Arg Glu Asn Ala Gly Lys Gly Leu
580 585 590
Ile Ser Gly Tyr Phe Val His His Gln Lys Glu Leu Lys Asp Gln Leu
595 600 605
Asp Ile Leu Glu Lys Glu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Gln Lys Arg Glu
610 615 620
Phe Lys Lys Leu Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Arg Tyr Ser Pro Ala
625 630 635 640
Gln Ile Asn Asp Thr Thr Glu Trp Asn Pro Met Glu Val Ile Leu Glu
645 650 655
Glu Ala Lys Ala Gln Glu Gln Arg Tyr Gln Leu Leu Leu Glu Lys Ala
660 665 670
Ile Leu His Gln Thr Glu Glu Asp Phe Leu Lys Arg Asn Lys Gly Lys
675 680 685
Gln Phe Lys Leu Arg Phe Val Arg Lys Ala Trp His Leu Met Tyr Leu
690 695 700
Lys Glu Leu Tyr Met Asn Lys Val Ala Glu His Gly His His Lys Ser
705 710 715 720
Phe His Ile Thr Lys Glu Glu Phe Asn Asp Phe Cys Arg Trp Met Phe
725 730 735
Ala Phe Asp Glu Val Pro Lys Tyr Lys Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Phe
740 745 750
Ser Gln Lys Gly Phe Phe Asn Asn Ala Glu Phe Lys Asp Leu Ile Glu
755 760 765
Ser Ser Thr Ser Leu Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Lys Gln Arg Phe
770 775 780
Glu Gly Trp Ser Lys Asp Leu Thr Lys Gln Ser Asp Glu Asn Lys Tyr
785 790 795 800
Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Ser Met Leu Lys Asp Asp Met Leu Tyr Val
805 810 815
Asn Ile Ser His Phe Ile Ser Tyr Leu Glu Ser Lys Gly Lys Ile Asn
820 825 830
Arg Asn Ala His Gly His Ile Ala Tyr Lys Ala Leu Asn Asn Val Pro
835 840 845
His Leu Ile Glu Glu Tyr Tyr Tyr Lys Asp Arg Leu Ala Pro Glu Glu
850 855 860
Tyr Lys Ser His Gly Lys Leu Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Val Lys Leu
865 870 875 880
Glu Asp Ala Leu Leu Tyr Glu Met Ala Met His Tyr Leu Ser Leu Glu
885 890 895
Pro Ala Leu Val Pro Lys Val Lys Thr Lys Val Lys Asp Ile Leu Ser
900 905 910
Ser Asn Ile Ala Phe Asp Ile Lys Asp Ala Ala Gly His His Leu Tyr
915 920 925
His Leu Leu Ile Pro Phe His Lys Ile Asp Ser Phe Val Ala Leu Ile
930 935 940
Asn His Gln Ser Gln Gln Glu Lys Asp Pro Asp Lys Thr Ser Phe Leu
945 950 955 960
Ala Lys Ile Gln Pro Tyr Leu Glu Lys Val Lys Asn Ser Lys Asp Leu
965 970 975
Lys Ala Val Tyr His Tyr Tyr Lys Asp Thr Pro His Thr Leu Arg Tyr
980 985 990
Glu Asp Leu Asn Met Ile His Ser His Ile Val Ser Gln Ser Val Gln
995 1000 1005
Phe Thr Lys Val Ala Leu Lys Leu Glu Glu Tyr Phe Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Lys Ser Ile Thr Leu Gln Ile Ala Arg Gln Ile Ser Tyr Ser Glu
1025 1030 1035
Ile Ala Asp Leu Ser Asn Tyr Phe Thr Asp Glu Val Arg Asn Thr
1040 1045 1050
Ala Phe His Phe Asp Val Pro Glu Thr Ala Tyr Ser Met Ile Leu
1055 1060 1065
Gln Gly Ile Glu Ser Glu Phe Leu Asp Arg Glu Ile Lys Pro Gln
1070 1075 1080
Lys Pro Lys Ser Leu Ser Glu Leu Ser Thr Gln Gln Val Ser Val
1085 1090 1095
Cys Thr Ala Phe Leu Glu Thr Leu His Asn Asn Leu Phe Asp Arg
1100 1105 1110
Lys Asp Asp Lys Lys Glu Arg Leu Ser Lys Ala Arg Glu Arg Tyr
1115 1120 1125
Phe Glu Gln Ile Asn
1130
<210> 414
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> RNA aptamer
<400> 414
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<210> 415
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic G-quadraplex
<400> 415
gggtagggcg ggttggga 18
<210> 416
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5Biosg
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 3IAbRQSp
<400> 416
ucucguacgu uc 12
<210> 417
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic tag
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5Biosg
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 3IAbRQSp
<400> 417
ucucguacgu ucucucguac guuc 24
<210> 418
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 418
tatatatata 10
<210> 419
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 419
gtcgtcgtcg tcgtc 15
<210> 420
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 420
gtggaattgt gagcggataa ac 22
<210> 421
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 421
aacagcaatc tactcgacct g 21
<210> 422
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 56-FAM fluorophore
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> internal ZEN quencher
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3IABkFQ quencher
<400> 422
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<210> 423
<400> 423
000
<210> 424
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 424
ggttggtagt ctcgaattgc tctct 25
<210> 425
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 425
gcaaggggac uaaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 426
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 426
uagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 427
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 427
uagauugcug uucuaccaag 20
<210> 428
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 428
auggauuacu ugguagaaca gcaaucua 28
<210> 429
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sytthetic
<400> 429
auggauuacu ugguagaaca gcaaugua 28
<210> 430
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 430
uagauugcug uucuacc 17
<210> 431
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 431
aagauugcug uucuacc 17
<210> 432
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 432
uugauugcug uucuacc 17
<210> 433
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 433
uaguuugcug uucuacc 17
<210> 434
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 434
uagaaugcug uucuacc 17
<210> 435
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 435
uagauagcug uucuacc 17
<210> 436
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 436
uagauuccug uucuacc 17
<210> 437
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 437
auggauuacu ugguagaaca gaaucuacuc 30
<210> 438
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 438
auggauuacu ugguagaaca gaauguacuc 30
<210> 439
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 439
aagauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 440
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 440
uugauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 441
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 441
uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 442
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 442
uagaaugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 443
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 443
uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 444
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 444
uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 445
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 445
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 446
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 446
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 447
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 447
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 448
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 448
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 449
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 449
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 450
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 450
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 451
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 451
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 452
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 452
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 453
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 453
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 454
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 454
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 455
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 455
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 456
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 456
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 457
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 457
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 458
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 458
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 459
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 459
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 460
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 460
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 461
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 461
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 462
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 462
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 463
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum target
<400> 463
gaaattaata cgactcacta tagggttatt gcaattatta atcttgaacg aggaatg 57
<210> 464
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 464
gaaattaata cgactcacta taggggattg acagattaat agctctttct tgatttc 57
<210> 465
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 465
atttttcttg tccaaacaat tcatcatatc tt 32
<210> 466
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 466
ttcaatttca aataagaata tagtgtactc gc 32
<210> 467
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 467
gaaattaata cgactcacta tagggttctt attagcagaa caaagaagtt taacaac 57
<210> 468
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 468
gaaattaata cgactcacta tagggatttt atgcaatgtt aaaaactgtt ccaagta 57
<210> 469
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 469
taattgacat ccaatccata ataaagcata ga 32
<210> 470
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 470
gaattatagt tgttaaactt ctttgttctg ct 32
<210> 471
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 471
cctagtaagc atgattcatc agattgtggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 472
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 472
ggatggtgat gcatggccgt ttttagttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 473
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P falciparum
<400> 473
caatttaaaa tgatttttgg tgctagaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 474
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 474
gctggtttag taattgtatt attatcatgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
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<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 475
tacttggtag aacagcaatc tactcgacct gcaggcatgc aagcttggcg taatcatggt 60
catagctgtt tcctgtgttt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 120
aaag 124
<210> 476
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 476
atgaaccatc ttgtcgttag atgagctgga cgtccgtacg ttcgaaccgc attagtacca 60
gtatcgacaa aggacacaaa taggcgagtg ttaaggtgtg ttgtatgctc ggccttcgta 120
ttta 124
<210> 477
<211> 1389
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 477
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp
485 490 495
Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
565 570 575
Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile
580 585 590
Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
595 600 605
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Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
625 630 635 640
Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
645 650 655
Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
660 665 670
Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro
675 680 685
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Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu
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Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu
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Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu
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Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
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Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr
770 775 780
Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
785 790 795 800
Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys
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Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile
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Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser
835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
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Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu
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Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp
885 890 895
Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
900 905 910
Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn
915 920 925
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Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile
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Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu
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980 985 990
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Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys
1010 1015 1020
Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu
1025 1030 1035
Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys
1040 1045 1050
Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly
1055 1060 1065
Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile
1070 1075 1080
Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn
1085 1090 1095
Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn
1100 1105 1110
Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys
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Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn
1130 1135 1140
Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg
1145 1150 1155
Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr
1160 1165 1170
Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val
1190 1195 1200
Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn
1205 1210 1215
Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly
1220 1225 1230
Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu
1250 1255 1260
Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg
1265 1270 1275
Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
1280 1285 1290
Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser
1295 1300 1305
Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu
1310 1315 1320
Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys
1325 1330 1335
Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met
1340 1345 1350
Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser
1355 1360 1365
Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu
1370 1375 1380
Asn Thr Asn Asp Thr Leu
1385
<210> 478
<211> 1276
<212> PRT
<213> Blautia sp.Marseille-P2398 (C2-29)
<400> 478
Met Lys Ile Ser Lys Val Asp His Val Lys Ser Gly Ile Asp Gln Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln Arg Gly Met Leu Tyr Lys Gln Pro Gln Lys Lys Tyr
20 25 30
Glu Gly Lys Gln Leu Glu Glu His Val Arg Asn Leu Ser Arg Lys Ala
35 40 45
Lys Ala Leu Tyr Gln Val Phe Pro Val Ser Gly Asn Ser Lys Met Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Gln Ile Ile Asn Ser Phe Ile Lys Asn Ile Leu Leu Arg
65 70 75 80
Leu Asp Ser Gly Lys Thr Ser Glu Glu Ile Val Gly Tyr Ile Asn Thr
85 90 95
Tyr Ser Val Ala Ser Gln Ile Ser Gly Asp His Ile Gln Glu Leu Val
100 105 110
Asp Gln His Leu Lys Glu Ser Leu Arg Lys Tyr Thr Cys Val Gly Asp
115 120 125
Lys Arg Ile Tyr Val Pro Asp Ile Ile Val Ala Leu Leu Lys Ser Lys
130 135 140
Phe Asn Ser Glu Thr Leu Gln Tyr Asp Asn Ser Glu Leu Lys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Asp Phe Ile Arg Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Gln
165 170 175
Ile Val His Ser Ile Glu Asn Asn Ser Thr Pro Leu Arg Ile Ala Glu
180 185 190
Ile Asn Gly Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ala Asn Val Asp Asn Pro Lys
195 200 205
Lys Ser Tyr Ile Phe Glu Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ser Asp Pro
210 215 220
Lys Gly Gln Glu Ser Leu Leu Gln His Met Arg Tyr Leu Ile Leu Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
Glu Ala Trp Asn Phe Gly Ser Ile Val Met Asp Asn Glu Gln Leu Phe
260 265 270
Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
Gln Ile Glu Glu Gly Arg Gln Ser Lys Asp Thr Ala Lys Val Lys Lys
290 295 300
Asn Lys Ser Lys Tyr Arg Met Leu Gly Asp Lys Ile Glu His Ser Ile
305 310 315 320
Asn Glu Ser Val Val Lys His Tyr Gln Glu Ala Cys Lys Ala Val Glu
325 330 335
Glu Lys Asp Ile Pro Trp Ile Lys Tyr Ile Ser Asp His Val Met Ser
340 345 350
Val Tyr Ser Ser Lys Asn Arg Val Asp Leu Asp Lys Leu Ser Leu Pro
355 360 365
Tyr Leu Ala Lys Asn Thr Trp Asn Thr Trp Ile Ser Phe Ile Ala Met
370 375 380
Lys Tyr Val Asp Met Gly Lys Gly Val Tyr His Phe Ala Met Ser Asp
385 390 395 400
Val Asp Lys Val Gly Lys Gln Asp Asn Leu Ile Ile Gly Gln Ile Asp
405 410 415
Pro Lys Phe Ser Asp Gly Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Ile Lys
420 425 430
Ala Glu Asp Asp Leu His Arg Ser Met Ser Gly Tyr Ile Ala Phe Ala
435 440 445
Val Asn Asn Phe Ala Arg Ala Ile Cys Ser Asp Glu Phe Arg Lys Lys
450 455 460
Asn Arg Lys Glu Asp Val Leu Thr Val Gly Leu Asp Glu Ile Pro Leu
465 470 475 480
Tyr Asp Asn Val Lys Arg Lys Leu Leu Gln Tyr Phe Gly Gly Ala Ser
485 490 495
Asn Trp Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ile Ile Asp Asp Lys Asp Leu Val
500 505 510
Ala Cys Ile Lys Glu Asn Leu Tyr Val Ala Arg Asn Val Asn Phe His
515 520 525
Phe Ala Gly Ser Glu Lys Val Gln Lys Lys Gln Asp Asp Ile Leu Glu
530 535 540
Glu Ile Val Arg Lys Glu Thr Arg Asp Ile Gly Lys His Tyr Arg Lys
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ser Asn Asn Val Ala Val Phe Tyr Cys Asp Glu Asp Ile
565 570 575
Ile Lys Leu Met Asn His Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Pro Tyr Gln Ala
580 585 590
Gln Ile Pro Ser Tyr Asn Lys Val Ile Ser Lys Thr Tyr Leu Pro Asp
595 600 605
Leu Ile Phe Met Leu Leu Lys Gly Lys Asn Arg Thr Lys Ile Ser Asp
610 615 620
Pro Ser Ile Met Asn Met Phe Arg Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Tyr Tyr Asn Asp Phe Leu Gln Ala Ser Asn Leu Lys Glu Met
645 650 655
Phe Cys Glu Gly Leu Lys Asn Asn Val Lys Asn Lys Lys Ser Glu Lys
660 665 670
Pro Tyr Gln Asn Phe Met Arg Arg Phe Glu Glu Leu Glu Asn Met Gly
675 680 685
Met Asp Phe Gly Glu Ile Cys Gln Gln Ile Met Thr Asp Tyr Glu Gln
690 695 700
Gln Asn Lys Gln Lys Lys Lys Thr Ala Thr Ala Val Met Ser Glu Lys
705 710 715 720
Asp Lys Lys Ile Arg Thr Leu Asp Asn Asp Thr Gln Lys Tyr Lys His
725 730 735
Phe Arg Thr Leu Leu Tyr Ile Gly Leu Arg Glu Ala Phe Ile Ile Tyr
740 745 750
Leu Lys Asp Glu Lys Asn Lys Glu Trp Tyr Glu Phe Leu Arg Glu Pro
755 760 765
Val Lys Arg Glu Gln Pro Glu Glu Lys Glu Phe Val Asn Lys Trp Lys
770 775 780
Leu Asn Gln Tyr Ser Asp Cys Ser Glu Leu Ile Leu Lys Asp Ser Leu
785 790 795 800
Ala Ala Ala Trp Tyr Val Val Ala His Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu
805 810 815
Asn His Leu Ile Gly Asp Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Ser Asp
820 825 830
Ile Asp Arg Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asn Pro Val Ser Glu Ser Thr
835 840 845
Glu Ile Gln Ile Glu Arg Tyr Arg Lys Ile Leu Arg Val Leu Glu Phe
850 855 860
Ala Lys Phe Phe Cys Gly Gln Ile Thr Asn Val Leu Thr Asp Tyr Tyr
865 870 875 880
Gln Asp Glu Asn Asp Phe Ser Thr His Val Gly His Tyr Val Lys Phe
885 890 895
Glu Lys Lys Asn Met Glu Pro Ala His Ala Leu Gln Ala Phe Ser Asn
900 905 910
Ser Leu Tyr Ala Cys Gly Lys Glu Lys Lys Lys Ala Gly Phe Tyr Tyr
915 920 925
Asp Gly Met Asn Pro Ile Val Asn Arg Asn Ile Thr Leu Ala Ser Met
930 935 940
Tyr Gly Asn Lys Lys Leu Leu Glu Asn Ala Met Asn Pro Val Thr Glu
945 950 955 960
Gln Asp Ile Arg Lys Tyr Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Asp Ser Val
965 970 975
Leu Lys Asn Gly Ala Val Cys Lys Ser Glu Asp Glu Gln Lys Asn Leu
980 985 990
Arg His Phe Gln Asn Leu Lys Asn Arg Ile Glu Leu Val Asp Val Leu
995 1000 1005
Thr Leu Ser Glu Leu Val Asn Asp Leu Val Ala Gln Leu Ile Gly
1010 1015 1020
Trp Val Tyr Ile Arg Glu Arg Asp Met Met Tyr Leu Gln Leu Gly
1025 1030 1035
Leu His Tyr Ile Lys Leu Tyr Phe Thr Asp Ser Val Ala Glu Asp
1040 1045 1050
Ser Tyr Leu Arg Thr Leu Asp Leu Glu Glu Gly Ser Ile Ala Asp
1055 1060 1065
Gly Ala Val Leu Tyr Gln Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Asn Leu
1070 1075 1080
Pro Met Tyr Val Lys Pro Asn Lys Ser Ser Val Tyr Cys Lys Lys
1085 1090 1095
His Val Asn Ser Val Ala Thr Lys Phe Asp Ile Phe Glu Lys Glu
1100 1105 1110
Tyr Cys Asn Gly Asp Glu Thr Val Ile Glu Asn Gly Leu Arg Leu
1115 1120 1125
Phe Glu Asn Ile Asn Leu His Lys Asp Met Val Lys Phe Arg Asp
1130 1135 1140
Tyr Leu Ala His Phe Lys Tyr Phe Ala Lys Leu Asp Glu Ser Ile
1145 1150 1155
Leu Glu Leu Tyr Ser Lys Ala Tyr Asp Phe Phe Phe Ser Tyr Asn
1160 1165 1170
Ile Lys Leu Lys Lys Ser Val Ser Tyr Val Leu Thr Asn Val Leu
1175 1180 1185
Leu Ser Tyr Phe Ile Asn Ala Lys Leu Ser Phe Ser Thr Tyr Lys
1190 1195 1200
Ser Ser Gly Asn Lys Thr Val Gln His Arg Thr Thr Lys Ile Ser
1205 1210 1215
Val Val Ala Gln Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Lys Leu Arg Ser Ile
1220 1225 1230
Val Lys Asn Lys Asn Gly Val Glu Ser Ile Glu Asn Asp Asp Arg
1235 1240 1245
Arg Cys Glu Val Val Asn Ile Ala Ala Arg Asp Lys Glu Phe Val
1250 1255 1260
Asp Glu Val Cys Asn Val Ile Asn Tyr Asn Ser Asp Lys
1265 1270 1275
<210> 479
<211> 948
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Riemerella anatipestifer
<400> 479
Met Phe Phe Ser Phe His Asn Ala Gln Arg Val Ile Phe Lys His Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
20 25 30
Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Arg Asp Phe Ala His Leu Asn Arg
35 40 45
Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asn Arg Tyr Arg Phe
50 55 60
Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Thr Asn
65 70 75 80
Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys Lys Val Ser
85 90 95
Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr Thr Glu Val
100 105 110
Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Arg
115 120 125
Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu Leu Ser Arg
130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn Lys Lys His
145 150 155 160
Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu Gln
165 170 175
Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr
180 185 190
Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
195 200 205
Phe Gln Val Asp Leu Gly Thr Tyr His Tyr Cys Ile Tyr Asp Lys Lys
210 215 220
Ile Gly Asp Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr Leu Leu Ser
225 230 235 240
Phe Gly Arg Leu Gln Asp Phe Thr Glu Ile Asn Arg Pro Gln Glu Trp
245 250 255
Lys Ala Leu Thr Lys Asp Leu Asp Tyr Lys Glu Thr Ser Asn Gln Pro
260 265 270
Phe Ile Ser Lys Thr Thr Pro His Tyr His Ile Thr Asp Asn Lys Ile
275 280 285
Gly Phe Arg Leu Gly Thr Ser Lys Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Glu Ile
290 295 300
Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Lys Tyr Pro Tyr Asn Ser Gly Phe
305 310 315 320
Val Ala His Ala Phe Ile Ser Val His Glu Leu Leu Pro Leu Met Phe
325 330 335
Tyr Gln His Leu Thr Gly Lys Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu Thr Val
340 345 350
Arg His Ile Gln Arg Ile Tyr Lys Asp Phe Glu Glu Glu Arg Ile Asn
355 360 365
Thr Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Asn Gln Gly Arg Leu Pro Leu Gly
370 375 380
Ala Phe Pro Lys Gln Met Leu Gly Leu Leu Gln Asn Lys Gln Pro Asp
385 390 395 400
Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile Ala Glu Thr
405 410 415
Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser Ser Pro Lys
420 425 430
Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val Leu Ala Asp
435 440 445
Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Tyr Asp Ala
450 455 460
Gln Asn Gln Pro Ile Lys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Phe Trp
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Phe Ile Arg Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Asn Arg Leu
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Glu Gly Tyr Phe Lys Gln Thr Asn Leu Ile Gly Asn Thr Asn Pro His
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515 520 525
Phe Tyr Gln Gln Tyr Leu Glu Gln Arg Glu Lys Phe Leu Glu Ala Ile
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Lys His Gln Pro Trp Glu Pro Tyr Gln Tyr Cys Leu Leu Leu Lys Val
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565 570 575
Ile Ser Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Ala Ile Arg Glu Thr Leu
580 585 590
Ser Lys Asp Leu Thr Leu Ser Lys Pro Ile Arg Lys Glu Ile Lys Lys
595 600 605
His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu Tyr Phe Lys
610 615 620
Glu Lys Tyr Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Tyr Asn Leu Ser Tyr Lys
625 630 635 640
Leu Glu Ala Lys Ala Pro Leu Leu Lys Lys Glu Glu His Tyr Glu Tyr
645 650 655
Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln Arg Leu Glu
660 665 670
Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr Lys Arg Trp
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100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
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Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
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305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
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Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
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545 550 555 560
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella aurantiaca
<400> 502
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Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
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Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
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980 985 990
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Lys Asp Leu Pro Thr Asn Lys Phe Ser Glu Met Leu Asn Ser Trp
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Leu Glu Gly Lys Asp Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp
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Ser Leu Tyr Thr Ala Asn Asn Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile
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Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella pallens
<400> 503
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
Ala Ser Ile Gln Leu Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile
165 170 175
Lys Thr Glu Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
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Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
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Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
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340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
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Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
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420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
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Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
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485 490 495
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595 600 605
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Leu Asn Asn Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe Tyr
675 680 685
Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys Pro
690 695 700
Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro Lys
705 710 715 720
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725 730 735
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu His
740 745 750
Arg Lys Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val Ala
755 760 765
Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val Gln
770 775 780
Pro Phe Tyr Asn Tyr Leu Phe Asn Val Gly Asn Ile Asn Lys Pro Asp
785 790 795 800
Glu Lys Asn Phe Leu Asn Cys Glu Glu Arg Arg Glu Leu Leu Arg Lys
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Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu Asn
820 825 830
Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu
835 840 845
Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met Glu
850 855 860
Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile Tyr
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Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr Glu
885 890 895
Glu Lys Asn Gly Glu Glu Lys Ile Ile Lys Glu Lys Asn Asn Ile Leu
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945 950 955 960
Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser Phe
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980 985 990
Ser Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ile Glu
995 1000 1005
Ile Ile Lys Asp Met Leu Ala Leu Glu Glu Thr Leu Ile Asp Lys
1010 1015 1020
Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly
1025 1030 1035
Trp Leu Lys Leu Lys Asp Glu Pro Asp Lys Ala Ser Phe Gln Asn
1040 1045 1050
Asp Val Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1055 1060 1065
Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro
1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Thr Ile Glu Lys
1100 1105 1110
Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120 1125
<210> 504
<211> 1125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella intermedia ZT
<400> 504
Met Lys Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Glu Ser Thr Asn Met Leu
1 5 10 15
Asp Asn Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
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Val Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn
35 40 45
Lys Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala
50 55 60
Ile Lys Thr His Trp Glu Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Glu
65 70 75 80
Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala
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Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp Lys Glu Glu Val Lys Gln Glu Lys
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165 170 175
Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu
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Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn
195 200 205
Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys
210 215 220
Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Thr Gly Phe Lys Asp Asn
225 230 235 240
Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Arg Arg
245 250 255
Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp
260 265 270
Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu
275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro Asp Glu Trp Lys Ala Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Asn Glu Arg Tyr Ile Ser Glu Thr
405 410 415
Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg
420 425 430
Asn Gly Asn Lys Glu Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu Asn
435 440 445
Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Pro Tyr Gln Ala Glu Ala
450 455 460
Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
465 470 475 480
Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile Val
485 490 495
Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Met Tyr Lys Leu Tyr Asp
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Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Gly Asp Leu Glu Lys Tyr
515 520 525
Cys Glu Asp Lys Gly Ile Pro Lys Arg His Leu Pro Lys Gln Met Val
530 535 540
Ala Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Lys Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg
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Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu
565 570 575
Glu Lys Gln Thr Gln Glu Glu Ile Glu Asp Gly Gly Arg Asn Ile Arg
580 585 590
Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
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Leu Tyr Asn Lys Glu Glu Lys Pro Thr Arg Tyr Phe Arg Gln Val Asn
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Leu Ile Asn Ser Ser Asn Pro His Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp
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Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella pallens
<400> 505
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165 170 175
Lys Thr Glu Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
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210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
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Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
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Asp Arg Lys Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
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595 600 605
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Phe Leu Lys Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella buccae
<400> 507
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Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
275 280 285
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Gln Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr
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Ser Phe Arg Asn Met Leu Glu Arg Trp Leu Gln Cys Lys Ala Asn
1040 1045 1050
Arg Pro Glu Leu Lys Asn Tyr Val Asn Ser Leu Ile Ala Val Arg
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355 360 365
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<213> Artificial Sequence
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<223> Porphyromonas gingivalis
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65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella saccharolytica
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<223> Chryseobacterium carnipullorum
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130 135 140
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145 150 155 160
Ala Glu Glu Leu Asp Ile Arg Tyr Lys Gln Gln Leu Glu Arg Leu Lys
165 170 175
Glu Leu Lys Glu Gln Gly Lys Asn Ile Asp Leu Arg Asp Glu Ala Gly
180 185 190
Ile Arg Asn Gly Val Leu Asn Ala Ala Phe Asn His Leu Ile Tyr Lys
195 200 205
Glu Gly Glu Ile Ala Lys Pro Thr Leu Ser Tyr Ser Ser Phe Tyr Tyr
210 215 220
Gly Ala Asp Ser Ala Glu Asn Gly Ile Thr Ile Ser Gln Ser Gly Leu
225 230 235 240
Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Lys Ser Arg Ile Arg Gly Phe Lys Ala Lys Ile Val Arg Asp Gly Glu
260 265 270
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275 280 285
Tyr Leu Ser Phe Lys Gly Met Lys Gln Arg Leu Ser Thr Asp Phe His
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Glu Glu Thr Leu Leu Ile Gln Ile Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
305 310 315 320
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Ile Lys Tyr Lys Glu Leu Tyr Ser Glu Arg Lys Asn Leu Ile Glu Gln
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Glu Lys Leu Ser Ser Lys Glu Phe Lys Lys Gly Ala Phe Tyr Arg Thr
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Ile Ile Lys Lys Leu Gln Gln Glu Arg Ile Lys Glu Leu Ser Glu Lys
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675 680 685
Ile Asp Ile Lys Tyr Leu Thr Val Glu Gln Lys Ser Glu Val Ser Glu
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Glu Lys Asn Lys Lys Val Ser Leu Lys Asn Asn Gly Met Phe Asn Lys
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Gly Lys Gln Leu Asn Phe Gly Gln Leu Leu Tyr Val Val Tyr Glu Val
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Leu Val Lys Asn Lys Asp Leu Asp Lys Ile Leu Ser Lys Lys Ile Asp
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Tyr Arg Lys Asp Lys Ser Phe Ser Pro Glu Ile Ala Tyr Leu Arg Asn
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Phe Leu Ser His Leu Asn Tyr Ser Lys Phe Leu Asp Asn Phe Met Lys
820 825 830
Ile Asn Thr Asn Lys Ser Asp Glu Asn Lys Glu Val Leu Ile Pro Ser
835 840 845
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245 250 255
Lys Glu Phe Lys Lys Gly Ala Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Lys Lys Leu
260 265 270
Gln Gln Glu Arg Ile Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ser Leu Thr Glu Asp
275 280 285
Cys Glu Lys Ile Ile Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Arg His Ser Leu Met
290 295 300
His Tyr Asp Tyr Gln Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Asn
305 310 315 320
Asp Asp Leu Met Lys Asp Leu Asn Leu Asp Leu Phe Lys Ser Leu Pro
325 330 335
Leu Ile Arg Lys Met Lys Leu Asn Asn Lys Val Asn Tyr Leu Glu Asp
340 345 350
Gly Asp Thr Leu Phe Val Leu Gln Lys Thr Lys Lys Ala Lys Thr Leu
355 360 365
Tyr Gln Ile Tyr Asp Ala Leu Cys Glu Gln Lys Asn Gly Phe Asn Lys
370 375 380
Phe Ile Asn Asp Phe Phe Val Ser Asp Gly Glu Glu Asn Thr Val Phe
385 390 395 400
Lys Gln Ile Ile Asn Glu Lys Phe Gln Ser Glu Met Glu Phe Leu Glu
405 410 415
Lys Arg Ile Ser Glu Ser Glu Lys Lys Asn Glu Lys Leu Lys Lys Lys
420 425 430
Leu Asp Ser Met Lys Ala His Phe Arg Asn Ile Asn Ser Glu Asp Thr
435 440 445
Lys Glu Ala Tyr Phe Trp Asp Ile His Ser Ser Arg Asn Tyr Lys Thr
450 455 460
Lys Tyr Asn Glu Arg Lys Asn Leu Val Asn Glu Tyr Thr Glu Leu Leu
465 470 475 480
Gly Ser Ser Lys Glu Lys Lys Leu Leu Arg Glu Glu Ile Thr Lys Ile
485 490 495
Asn Arg Gln Leu Leu Lys Leu Lys Gln Glu Met Glu Glu Ile Thr Lys
500 505 510
Lys Asn Ser Leu Phe Arg Leu Glu Tyr Lys Met Lys Ile Ala Phe Gly
515 520 525
Phe Leu Phe Cys Glu Phe Asp Gly Asn Ile Ser Lys Phe Lys Asp Glu
530 535 540
Phe Asp Ala Ser Asn Gln Glu Lys Ile Ile Gln Tyr His Lys Asn Gly
545 550 555 560
Glu Lys Tyr Leu Thr Ser Phe Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Phe
565 570 575
Asn Leu Glu Lys Met Gln Lys Ile Ile Gln Lys Thr Glu Glu Glu Asp
580 585 590
Trp Leu Leu Pro Glu Thr Lys Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Leu Leu
595 600 605
Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Tyr Glu Leu Lys Gly Asp Phe Leu Gly Phe
610 615 620
Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp Ile Lys Asn Val Asp Phe Ile Asp Glu
625 630 635 640
Asn Gln Asn Asn Ile Gln Val Ser Gln Thr Val Glu Lys Gln Glu Asp
645 650 655
Tyr Phe Tyr His Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Lys Tyr
660 665 670
Glu Ile Val Lys Tyr Ser Ile Val Pro Asn Glu Lys Leu Lys Gln Tyr
675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Gly Met Phe Asn Lys Thr Ile Leu Leu Phe Val Phe Lys Tyr Tyr Gln
725 730 735
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740 745 750
Leu Arg Glu Lys Ser Gly Lys Pro Leu Glu Ile Phe Arg Lys Glu Leu
755 760 765
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770 775 780
Val Val Tyr Glu Val Leu Val Lys Asn Lys Asp Leu Asp Lys Ile Leu
785 790 795 800
Ser Lys Lys Ile Asp Tyr Arg Lys Asp Lys Ser Phe Ser Pro Glu Ile
805 810 815
Ala Tyr Leu Arg Asn Phe Leu Ser His Leu Asn Tyr Ser Lys Phe Leu
820 825 830
Asp Asn Phe Met Lys Ile Asn Thr Asn Lys Ser Asp Glu Asn Lys Glu
835 840 845
Val Leu Ile Pro Ser Ile Lys Ile Gln Lys Met Ile Gln Phe Ile Glu
850 855 860
Lys Cys Asn Leu Gln Asn Gln Ile Asp Phe Asp Phe Asn Phe Val Asn
865 870 875 880
Asp Phe Tyr Met Arg Lys Glu Lys Met Phe Phe Ile Gln Leu Lys Gln
885 890 895
Ile Phe Pro Asp Ile Asn Ser Thr Glu Lys Gln Lys Met Asn Glu Lys
900 905 910
Glu Glu Ile Leu Arg Asn Arg Tyr His Leu Thr Asp Lys Lys Asn Glu
915 920 925
Gln Ile Lys Asp Glu His Glu Ala Gln Ser Gln Leu Tyr Glu Lys Ile
930 935 940
Leu Ser Leu Gln Lys Ile Tyr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Phe Tyr Gly
945 950 955 960
Arg Leu Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Leu Glu Lys Gln Gly Lys Lys
965 970 975
Lys Leu Ser Met Glu Glu Ile Lys Asp Lys Ile Ala Gly Asp Ile Ser
980 985 990
Asp Leu Leu Gly Ile Leu Lys Lys Glu Ile Thr Arg Asp Ile Lys Asp
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Leu Ser Phe Tyr Asn His Gln Asp Lys Lys Lys Glu Glu Ser Ile
1025 1030 1035
Arg Val Phe Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ser Asp Asn Phe Lys Phe
1040 1045 1050
Glu Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ser Asn Lys Ile Phe Ile Ser Lys
1055 1060 1065
Asn Gly Lys Glu Ile Thr Ile Gln Cys Cys Asp Lys Val Leu Glu
1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Lys Ile Ile Ser Leu Ile Pro His Tyr Ser Tyr Ser Ile Asp Val
1100 1105 1110
Lys Tyr
1115
<210> 576
<211> 1121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusobacterium perfoetens
<400> 576
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Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Lys Glu Val Lys Val Arg Tyr Asn Lys Gln
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Ile Lys Lys Asp Ile Tyr Ser Asn Lys Glu Asp Lys Val Ile Arg Lys
85 90 95
Tyr Ile Leu Ser Phe Glu Val Ser Glu Lys Asn Asp Arg Thr Ile Val
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Arg Glu Asn Thr Arg Arg Leu Ile Ser Glu Thr Glu Arg Lys Leu Leu
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Ser Glu Glu Thr Gln Lys Thr Tyr Ser Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro
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165 170 175
Tyr Arg Ser Asn Met Leu Leu Phe Phe Ser Leu Ile Asn Asp Ile Phe
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225 230 235 240
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245 250 255
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Arg Leu Lys Lys Gln Leu Ile Glu Leu Asn Arg Glu Asn Asp Leu Leu
275 280 285
Glu Lys Asp Lys Ile Glu Leu Ser Asp Glu Glu Ile Arg Glu Asp Ile
290 295 300
Glu Lys Ile Leu Lys Ile Tyr Ser Asp Leu Arg His Lys Leu Met His
305 310 315 320
Tyr Asn Tyr Gln Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Ile Ser
325 330 335
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340 345 350
Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Val Arg Gln Leu Lys Leu Glu Asn Lys
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500 505 510
Leu Lys Ile Lys Met Asp Lys Ile Thr Lys Arg Asn Ser Ile Leu Arg
515 520 525
Leu Lys Tyr Lys Leu Gln Val Ala Tyr Gly Phe Leu Met Glu Glu Tyr
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Lys Gly Asn Ile Lys Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Ile Ser Lys Glu
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Lys Ile Lys Ser Tyr Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Glu Val Lys
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580 585 590
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835 840 845
Ile Asn Asp Arg Ile Arg Lys Leu Ile Lys Phe Ile Arg Glu Asn Asn
850 855 860
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865 870 875 880
Met Lys Lys Glu Lys Phe Ile Phe Gly Gln Arg Lys Gln Ala Lys Thr
885 890 895
Ile Ile Asp Ser Gly Lys Lys Ala Asn Lys Arg Asn Lys Ala Glu Glu
900 905 910
Leu Leu Lys Met Tyr Arg Val Lys Lys Glu Asn Ile Asn Leu Ile Tyr
915 920 925
Glu Leu Ser Lys Lys Leu Asn Glu Leu Thr Lys Ser Glu Leu Phe Leu
930 935 940
Leu Asp Lys Lys Leu Leu Lys Asp Ile Asp Phe Thr Asp Val Lys Ile
945 950 955 960
Lys Asn Lys Ser Phe Phe Glu Leu Lys Asn Asp Val Lys Glu Val Ala
965 970 975
Asn Ile Lys Gln Ala Leu Gln Lys His Ser Ser Glu Leu Ile Gly Ile
980 985 990
Tyr Lys Lys Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Arg Ser Ile Val Ser Lys
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1010 1015 1020
Lys Thr Asn Lys Lys Tyr Glu Asp Phe Leu Leu Glu Ile Arg Arg
1025 1030 1035
Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Gln Phe Leu Ile Asp Glu Lys Lys
1040 1045 1050
Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Thr Lys Glu Lys Lys
1055 1060 1065
Lys Val Val Val Lys Ile Gln Asn Asn Ser Glu Leu Val Ser Glu
1070 1075 1080
Pro Arg Ile Ile Lys Asn Lys Asp Lys Lys Lys Ala Lys Thr Pro
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Glu Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Leu Asp Leu Thr Asn His Tyr
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<210> 577
<211> 1137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusobacterium necrophorum
<400> 577
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Asn Lys Ser Ser Val Glu Ile Val Lys Lys Asp Ile Phe Ser Gln Thr
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Leu Ala Asn Cys Pro Met Glu Glu Val Asp Ser Ile Lys Ile Tyr Lys
165 170 175
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180 185 190
Ser Ile Asn Ser Phe Leu Cys Glu Gly Ile Lys Gly Lys Asp Asn Glu
195 200 205
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210 215 220
Val Arg Glu Asn Phe Lys Asn Lys Leu Ile Gln Ser Thr Glu Asn Tyr
225 230 235 240
Asn Ser Ser Leu Lys Asn Gln Ile Glu Glu Lys Glu Lys Leu Leu Arg
245 250 255
Lys Glu Phe Lys Lys Gly Ala Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Lys Lys Leu
260 265 270
Gln Gln Glu Arg Ile Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ser Leu Thr Glu Asp
275 280 285
Cys Glu Lys Ile Ile Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Arg His Ser Leu Met
290 295 300
His Tyr Asp Tyr Gln Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Asn
305 310 315 320
Asp Asp Leu Met Lys Asp Leu Asn Leu Asp Leu Phe Lys Ser Leu Pro
325 330 335
Leu Ile Arg Lys Met Lys Leu Asn Asn Lys Val Asn Tyr Leu Glu Asp
340 345 350
Gly Asp Thr Leu Phe Val Leu Gln Lys Thr Lys Lys Ala Lys Thr Leu
355 360 365
Tyr Gln Ile Tyr Asp Ala Leu Cys Glu Gln Lys Asn Gly Phe Asn Lys
370 375 380
Phe Ile Asn Asp Phe Phe Val Ser Asp Gly Glu Glu Asn Thr Val Phe
385 390 395 400
Lys Gln Ile Ile Asn Glu Lys Phe Gln Ser Glu Met Glu Phe Leu Glu
405 410 415
Lys Arg Ile Ser Glu Ser Glu Lys Lys Asn Glu Lys Leu Lys Lys Lys
420 425 430
Leu Asp Ser Met Lys Ala His Phe Arg Asn Ile Asn Ser Glu Asp Thr
435 440 445
Lys Glu Ala Tyr Phe Trp Asp Ile His Ser Ser Arg Asn Tyr Lys Thr
450 455 460
Lys Tyr Asn Glu Arg Lys Asn Leu Val Asn Glu Tyr Thr Glu Leu Leu
465 470 475 480
Gly Ser Ser Lys Glu Lys Lys Leu Leu Arg Glu Glu Ile Thr Lys Ile
485 490 495
Asn Arg Gln Leu Leu Lys Leu Lys Gln Glu Met Glu Glu Ile Thr Lys
500 505 510
Lys Asn Ser Leu Phe Arg Leu Glu Tyr Lys Met Lys Ile Ala Phe Gly
515 520 525
Phe Leu Phe Cys Glu Phe Asp Gly Asn Ile Ser Lys Phe Lys Asp Glu
530 535 540
Phe Asp Ala Ser Asn Gln Glu Lys Ile Ile Gln Tyr His Lys Asn Gly
545 550 555 560
Glu Lys Tyr Leu Thr Ser Phe Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Phe
565 570 575
Asn Leu Glu Lys Met Gln Lys Ile Ile Gln Lys Thr Glu Glu Glu Asp
580 585 590
Trp Leu Leu Pro Glu Thr Lys Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Leu Leu
595 600 605
Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Tyr Glu Leu Lys Gly Asp Phe Leu Gly Phe
610 615 620
Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp Ile Lys Asn Val Asp Phe Ile Asp Glu
625 630 635 640
Asn Gln Asn Asn Ile Gln Val Ser Gln Thr Val Glu Lys Gln Glu Asp
645 650 655
Tyr Phe Tyr His Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Lys Tyr
660 665 670
Glu Ile Val Lys Tyr Ser Ile Val Pro Asn Glu Lys Leu Lys Gln Tyr
675 680 685
Phe Glu Asp Leu Gly Ile Asp Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Ser Val Glu
690 695 700
Ser Gly Glu Lys Trp Leu Gly Glu Asn Leu Gly Ile Asp Ile Lys Tyr
705 710 715 720
Leu Thr Val Glu Gln Lys Ser Glu Val Ser Glu Glu Lys Asn Lys Lys
725 730 735
Val Ser Leu Lys Asn Asn Gly Met Phe Asn Lys Thr Ile Leu Leu Phe
740 745 750
Val Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ala Phe Lys Leu Phe Asn Asp Ile Glu
755 760 765
Leu Tyr Ser Leu Phe Phe Leu Arg Glu Lys Ser Gly Lys Pro Leu Glu
770 775 780
Ile Phe Arg Lys Glu Leu Glu Ser Lys Met Lys Asp Gly Tyr Leu Asn
785 790 795 800
Phe Gly Gln Leu Leu Tyr Val Val Tyr Glu Val Leu Val Lys Asn Lys
805 810 815
Asp Leu Asp Lys Ile Leu Ser Lys Lys Ile Asp Tyr Arg Lys Asp Lys
820 825 830
Ser Phe Ser Pro Glu Ile Ala Tyr Leu Arg Asn Phe Leu Ser His Leu
835 840 845
Asn Tyr Ser Lys Phe Leu Asp Asn Phe Met Lys Ile Asn Thr Asn Lys
850 855 860
Ser Asp Glu Asn Lys Glu Val Leu Ile Pro Ser Ile Lys Ile Gln Lys
865 870 875 880
Met Ile Gln Phe Ile Glu Lys Cys Asn Leu Gln Asn Gln Ile Asp Phe
885 890 895
Asp Phe Asn Phe Val Asn Asp Phe Tyr Met Arg Lys Glu Lys Met Phe
900 905 910
Phe Ile Gln Leu Lys Gln Ile Phe Pro Asp Ile Asn Ser Thr Glu Lys
915 920 925
Gln Lys Met Asn Glu Lys Glu Glu Ile Leu Arg Asn Arg Tyr His Leu
930 935 940
Thr Asp Lys Lys Asn Glu Gln Ile Lys Asp Glu His Glu Ala Gln Ser
945 950 955 960
Gln Leu Tyr Glu Lys Ile Leu Ser Leu Gln Lys Ile Tyr Ser Ser Asp
965 970 975
Lys Asn Asn Phe Tyr Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Leu
980 985 990
Glu Lys Gln Gly Lys Lys Lys Leu Ser Met Glu Glu Ile Lys Asp Lys
995 1000 1005
Ile Ala Gly Asp Ile Ser Asp Leu Leu Gly Ile Leu Lys Lys Glu
1010 1015 1020
Ile Thr Arg Asp Ile Lys Asp Lys Leu Thr Glu Lys Phe Arg Tyr
1025 1030 1035
Cys Glu Glu Lys Leu Leu Asn Leu Ser Phe Tyr Asn His Gln Asp
1040 1045 1050
Lys Lys Lys Glu Glu Ser Ile Arg Val Phe Leu Ile Arg Asp Lys
1055 1060 1065
Asn Ser Asp Asn Phe Lys Phe Glu Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ser
1070 1075 1080
Asn Lys Ile Phe Ile Ser Lys Asn Gly Lys Glu Ile Thr Ile Gln
1085 1090 1095
Cys Cys Asp Lys Val Leu Glu Thr Leu Ile Ile Glu Lys Asn Thr
1100 1105 1110
Leu Lys Ile Ser Ser Asn Gly Lys Ile Ile Ser Leu Ile Pro His
1115 1120 1125
Tyr Ser Tyr Ser Ile Asp Val Lys Tyr
1130 1135
<210> 578
<211> 1158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusobacterium varium
<400> 578
Met Glu Asn Lys Asn Lys Pro Asn Arg Gly Ser Ile Val Arg Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ser Asn Tyr Asp Met Lys Gly Ile Lys Glu Leu Lys Val Arg Tyr
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Arg Lys Gln Ala Gln Leu Asp Thr Phe Ile Leu Gln Thr Thr Leu Asp
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Lys Ser Asn Asn Ser Ile Leu Ile Asn Asp Phe Arg Val Lys Ala Arg
50 55 60
Glu Lys Tyr Arg Tyr Ser Phe Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Lys Phe Ser
65 70 75 80
Val Pro Ser Asn Ser Ile Ile Val Thr Lys Ile Asp Asn Ala Ala Pro
85 90 95
Glu Lys Ser Lys Glu Ile Arg Lys Tyr Lys Ile Thr Leu Gly Ile Asp
100 105 110
Glu Lys Cys Lys Thr Gly Ser Met Ile Thr Ala Ala Ile Glu Asp Leu
115 120 125
Leu Glu Asp Asp Arg Val Arg Glu Gly Ile Arg Asn Pro Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ser Lys Thr Glu Arg Lys Leu Ile Thr Glu Ser Ile Cys His Asn
145 150 155 160
Tyr Ala Gln Ile Thr Gln Cys Pro Val Glu Glu Ile Asp Ala Val Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Val Lys Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Asn Met Leu Leu
180 185 190
Phe Phe Ala Leu Ile Asn Asp Phe Leu Cys Lys Asn Leu Lys Asn Glu
195 200 205
Lys Gly Glu Lys Ile Asn Glu Ile Trp Glu Met Glu Asn Lys Gly Asn
210 215 220
Asn Lys Lys Ile Asp Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Ile Leu Val Ala Gln
225 230 235 240
Ile Lys Glu Tyr Phe Thr Lys Glu Ile Glu Asn Tyr Asn Asn Arg Ile
245 250 255
Asp Asn Ile Ile Asp Lys Lys Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Glu Glu Lys
260 265 270
Glu Glu Ser Glu Lys Asn Lys Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Leu Glu
275 280 285
Ser Gln Lys Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu Glu Ile Lys Ala Asp Val
290 295 300
Ile Lys Ile Ile Lys Ile Phe Ser Asp Leu Arg His Ser Leu Met His
305 310 315 320
Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Asn Glu
325 330 335
Glu Leu Ala Glu Leu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Lys Asn Leu Thr Leu
340 345 350
Leu Arg Gln Met Lys Ile Glu Asn Lys Thr Asn Tyr Leu Glu Gly Asp
355 360 365
Glu Lys Phe Asn Ile Leu Gly Lys Asp Val Arg Ala Lys Asn Ala Leu
370 375 380
Gly His Tyr Asp Leu Leu Val Glu Gln Lys Asn Gly Phe Asn Asn Phe
385 390 395 400
Ile Asn Ser Phe Phe Val Gln Asp Gly Thr Glu Asn Leu Glu Phe Lys
405 410 415
Lys Phe Ile Asp Glu Asn Phe Ile Lys Ala Gln Lys Glu Leu Glu Glu
420 425 430
Asp Ile Lys Asn Cys Lys Glu Ser Val Lys Lys Leu Glu Lys Lys Leu
435 440 445
Lys Glu Asn Pro Lys Lys Ser Glu Asp Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys
450 455 460
Lys Gln Lys Lys Leu Lys Glu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Lys Met Lys
465 470 475 480
Gln His Tyr Lys Arg Leu Asn Cys Ala Tyr Val Trp Asp Ile His Ser
485 490 495
Ser Thr Val Tyr Lys Lys Leu Tyr Asn Glu Arg Lys Asn Leu Ile Glu
500 505 510
Lys Tyr Asn Lys Gln Leu Asn Gly Leu Gln Asp Lys Asn Ala Ile Thr
515 520 525
Gly Ile Asn Ala Gln Leu Leu Arg Ile Lys Lys Glu Met Glu Glu Ile
530 535 540
Thr Lys Ser Asn Ser Leu Phe Arg Leu Lys Tyr Lys Met Gln Ile Ala
545 550 555 560
Tyr Ala Phe Leu Glu Met Glu Tyr Glu Gly Asn Ile Ala Lys Phe Lys
565 570 575
Asn Glu Phe Asp Cys Ser Lys Thr Glu Lys Ile Gln Glu Trp Leu Glu
580 585 590
Lys Ser Glu Glu Tyr Leu Asn Tyr Cys Met Glu Lys Glu Glu Asp Gly
595 600 605
Lys Asn Tyr Lys Phe His Phe Lys Glu Ile Ser Glu Ile Lys Asp Thr
610 615 620
His Asn Glu Glu Trp Leu Glu Asn Thr Ser Glu Asn Asn Leu Phe Lys
625 630 635 640
Phe Tyr Ile Leu Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Met Glu Phe Lys Gly Asp
645 650 655
Phe Leu Gly Val Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp Ile Lys Asn Val Asp
660 665 670
Phe Thr Asp Glu Ser Glu Lys Glu Leu Ser Gln Glu Gln Ile Asp Lys
675 680 685
Met Ile Gly Asp Ser Phe Phe His Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn
690 695 700
Thr Lys Arg Tyr Glu Ile Ile Lys Tyr Ser Ile Leu Thr Ser Asp Glu
705 710 715 720
Ile Lys Lys Tyr Phe Glu Leu Leu Glu Leu Lys Val Pro Tyr Leu Glu
725 730 735
Tyr Lys Gly Ile Asp Glu Ile Gly Ile Phe Asn Lys Asn Ile Ile Leu
740 745 750
Pro Ile Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ile Phe Arg Leu Tyr Asn Asp Leu
755 760 765
Glu Ile His Gly Leu Phe Asn Val Ser Phe Asp Ile Asn Lys Ile Leu
770 775 780
Ser Asp Leu Lys Ser Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Asn Phe Arg Glu Phe
785 790 795 800
Leu Tyr Val Ile Lys Gln Asn Asn Asn Ser Ser Thr Glu Glu Glu Tyr
805 810 815
Gln Lys Ile Trp Glu Lys Leu Glu Ser Lys Tyr Leu Lys Glu Pro Leu
820 825 830
Leu Thr Pro Glu Lys Lys Glu Ile Asn Lys Lys Thr Glu Lys Glu Leu
835 840 845
Lys Lys Leu Asp Gly Ile Ser Phe Leu Arg Asn Lys Ile Ser His Leu
850 855 860
Glu Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Gly Val Leu Lys Thr Ala Val Asn Gly
865 870 875 880
Glu Asn Lys Lys Thr Ser Glu Thr Asn Ala Asp Lys Val Phe Leu Asn
885 890 895
Glu Lys Ile Lys Lys Ile Ile Asn Phe Ile Lys Glu Asn Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ile Glu Leu Gly Phe Asn Phe Ile Asn Asp Phe Phe Met Lys Lys
915 920 925
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Asp Ser Ile Thr Thr Glu Arg Lys Arg Lys Glu Glu Asn Asn Lys Arg
945 950 955 960
Leu Lys Ile Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Ser Lys Ile Tyr
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Leu Glu Gly Lys Glu Phe Lys Thr Glu Lys Lys Glu Glu Asn Lys
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Leu Met Leu Asn Asn His Tyr Cys Phe Asn Val Lys Ile Ile Tyr
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<210> 579
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<212> PRT
<213> Leptotrichia sp oral taxon
<400> 579
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Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Gly Glu Phe Val Asn Tyr Lys Lys Asn
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Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Glu Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
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Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
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Leu Lys Ile Gly Glu Tyr Lys Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Ser Phe Ser
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Thr Lys Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Ile Ile Ser Ile Leu Asp Glu Val
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Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
885 890 895
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Tyr Ile Lys Asn Tyr Ile Phe Glu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Lys Lys
915 920 925
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Ile Asp Asn Leu Val Glu Asp Thr Glu Ser Glu Asn Lys Asn Lys
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Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn Ile Gln Asn Glu Asn Tyr Ser
1130 1135 1140
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Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr Leu Asn Lys Ile
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Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Phe
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser
1265 1270 1275
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Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Lys Phe Arg Leu
1325 1330 1335
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Thr Leu
1385
<210> 580
<211> 1389
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 580
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Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
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Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
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Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
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Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
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Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
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435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
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545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
565 570 575
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580 585 590
Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
595 600 605
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835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
850 855 860
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865 870 875 880
Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp
885 890 895
Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
900 905 910
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Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu
965 970 975
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Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu
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Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn
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Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu
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Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn
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Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu
1250 1255 1260
Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg
1265 1270 1275
Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
1280 1285 1290
Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser
1295 1300 1305
Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu
1310 1315 1320
Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys
1325 1330 1335
Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met
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1370 1375 1380
Asn Thr Asn Asp Thr Leu
1385
<210> 581
<211> 1197
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 581
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Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
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Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu
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Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
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180 185 190
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225 230 235 240
Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile
245 250 255
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275 280 285
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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580 585 590
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<213> Lachnospiraceae bacterium
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<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes
<400> 588
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Ile Ala Phe Trp Ile Phe Cys Lys Met Leu Asp Ala Arg His Leu Ser
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740 745 750
Lys Gly Tyr Val Val Glu Glu Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Tyr Arg Gln
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785 790 795 800
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1040 1045 1050
<210> 591
<211> 1152
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 591
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Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu
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Thr Gly Ser Lys Arg Cys Ser Phe Asp Pro Ala Ala Gly Pro Ser Val
275 280 285
Leu Ala Leu His Asp Glu Val Lys Lys Thr Tyr Lys Arg Leu Cys Ala
290 295 300
Arg Gly Lys Asn Ala Ala Arg Ala Phe Pro Ala Asp Lys Thr Glu Leu
305 310 315 320
Leu Ala Leu Met Arg His Thr His Glu Asn Arg Val Arg Asn Gln Met
325 330 335
Val Arg Met Gly Arg Val Ser Glu Tyr Arg Gly Gln Gln Ala Gly Asp
340 345 350
Leu Ala Gln Ser His Tyr Trp Thr Ser Ala Gly Gln Thr Glu Ile Lys
355 360 365
Glu Ser Glu Ile Phe Val Arg Leu Trp Val Gly Ala Phe Ala Leu Ala
370 375 380
Gly Arg Ser Met Lys Ala Trp Ile Asp Pro Met Gly Lys Ile Val Asn
385 390 395 400
Thr Glu Lys Asn Asp Arg Asp Leu Thr Ala Ala Val Asn Ile Arg Gln
405 410 415
Val Ile Ser Asn Lys Glu Met Val Ala Glu Ala Met Ala Arg Arg Gly
420 425 430
Ile Tyr Phe Gly Glu Thr Pro Glu Leu Asp Arg Leu Gly Ala Glu Gly
435 440 445
Asn Glu Gly Phe Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg
450 455 460
Asn Gln Thr Phe His Leu Gly Ala Arg Ala Gly Phe Leu Lys Glu Ile
465 470 475 480
Arg Lys Glu Leu Glu Lys Thr Arg Trp Gly Lys Ala Lys Glu Ala Glu
485 490 495
His Val Val Leu Thr Asp Lys Thr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ile Ile
500 505 510
Asp Asn Asp Ala Lys Ala Leu Gly Ala Arg Leu Leu Ala Asp Leu Ser
515 520 525
Gly Ala Phe Val Ala His Tyr Ala Ser Lys Glu His Phe Ser Thr Leu
530 535 540
Tyr Ser Glu Ile Val Lys Ala Val Lys Asp Ala Pro Glu Val Ser Ser
545 550 555 560
Gly Leu Pro Arg Leu Lys Leu Leu Leu Lys Arg Ala Asp Gly Val Arg
565 570 575
Gly Tyr Val His Gly Leu Arg Asp Thr Arg Lys His Ala Phe Ala Thr
580 585 590
Lys Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Arg Glu Leu Asp Asp Pro Ala Thr
595 600 605
Lys Ala Arg Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Asp Gly Pro Phe Arg
610 615 620
Ala Tyr Ala Ser Gly Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ala
625 630 635 640
Arg Ala Lys Glu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Gln Ser Val Asn Val Thr
645 650 655
Lys Ala Tyr Ser Asp Val Met Glu Gly Arg Ser Ser Arg Leu Arg Pro
660 665 670
Pro Asn Asp Gly Glu Thr Leu Arg Glu Tyr Leu Ser Ala Leu Thr Gly
675 680 685
Glu Thr Ala Thr Glu Phe Arg Val Gln Ile Gly Tyr Glu Ser Asp Ser
690 695 700
Glu Asn Ala Arg Lys Gln Ala Glu Phe Ile Glu Asn Tyr Arg Arg Asp
705 710 715 720
Met Leu Ala Phe Met Phe Glu Asp Tyr Ile Arg Ala Lys Gly Phe Asp
725 730 735
Trp Ile Leu Lys Ile Glu Pro Gly Ala Thr Ala Met Thr Arg Ala Pro
740 745 750
Val Leu Pro Glu Pro Ile Asp Thr Arg Gly Gln Tyr Glu His Trp Gln
755 760 765
Ala Ala Leu Tyr Leu Val Met His Phe Val Pro Ala Ser Asp Val Ser
770 775 780
Asn Leu Leu His Gln Leu Arg Lys Trp Glu Ala Leu Gln Gly Lys Tyr
785 790 795 800
Glu Leu Val Gln Asp Gly Asp Ala Thr Asp Gln Ala Asp Ala Arg Arg
805 810 815
Glu Ala Leu Asp Leu Val Lys Arg Phe Arg Asp Val Leu Val Leu Phe
820 825 830
Leu Lys Thr Gly Glu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Ala Ala Pro Phe Asp
835 840 845
Leu Lys Pro Phe Arg Ala Leu Phe Ala Asn Pro Ala Thr Phe Asp Arg
850 855 860
Leu Phe Met Ala Thr Pro Thr Thr Ala Arg Pro Ala Glu Asp Asp Pro
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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1010 1015 1020
Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
1025 1030 1035
Ile Ala Gly Ala Ala Asn Thr Asp Ala Arg Thr Gln Thr Arg Lys
1040 1045 1050
Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala Asp Gly Thr Pro
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Leu Ala Arg Leu Gly Leu Thr Leu Lys Trp Gln Met Lys Asp His
1100 1105 1110
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Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
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Pro Asp Gln Lys Pro Pro Asn Lys Ala Pro Ser Ala Gly Ser Arg
1190 1195 1200
Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
1205 1210 1215
Lys Val Ile Asp Thr Gly Ser Leu Gly Phe Leu Ala Val Glu Gly
1220 1225 1230
Val Ala Gly Asn Ile Gly Leu His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Ile
1235 1240 1245
Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg Arg Tyr Arg Phe Arg Val
1250 1255 1260
Glu Ile Tyr Val Pro Pro Lys Ser Asn Thr Ser Lys Leu Asn Ala
1265 1270 1275
Ala Asp Leu Val Arg Ile Asp
1280 1285
<210> 595
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptotrichia buccalis
<400> 595
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
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Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
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Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
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625 630 635 640
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645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
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690 695 700
Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
705 710 715 720
Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
725 730 735
Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
740 745 750
Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
755 760 765
Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
805 810 815
Glu Ala Asp Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Gly Asn Lys Val
820 825 830
Lys Asp Asn Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe
835 840 845
Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys
850 855 860
Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
885 890 895
Ile Glu Lys Asn His Lys Met Gln Glu Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala
900 905 910
Arg Pro Arg Lys Asp Glu Lys Phe Thr Asp Glu Asp Tyr Glu Ser Tyr
915 920 925
Lys Gln Ala Ile Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys
930 935 940
Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
945 950 955 960
Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
965 970 975
Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn Gln Tyr Ile Glu Glu Ile
980 985 990
Phe Asn Phe Glu Asn Lys Lys Asn Val Lys Tyr Lys Gly Gly Gln Ile
995 1000 1005
Val Glu Lys Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Leu His Gln Asn Asp
1010 1015 1020
Glu Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu
1025 1030 1035
Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His
1040 1045 1050
Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn
1070 1075 1080
Ala Val Met Lys Ser Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe
1085 1090 1095
Val Ala Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln
1100 1105 1110
Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys
1115 1120 1125
Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu
1130 1135 1140
Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met Glu Glu Lys Lys Ser Glu
1145 1150 1155
Asn
<210> 596
<211> 1285
<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 596
Met Lys Leu Thr Arg Arg Arg Ile Ser Gly Asn Ser Val Asp Gln Lys
1 5 10 15
Ile Thr Ala Ala Phe Tyr Arg Asp Met Ser Gln Gly Leu Leu Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ser Glu Asp Asn Asp Cys Thr Asp Lys Val Ile Glu Ser Met Asp
35 40 45
Phe Glu Arg Ser Trp Arg Gly Arg Ile Leu Lys Asn Gly Glu Asp Asp
50 55 60
Lys Asn Pro Phe Tyr Met Phe Val Lys Gly Leu Val Gly Ser Asn Asp
65 70 75 80
Lys Ile Val Cys Glu Pro Ile Asp Val Asp Ser Asp Pro Asp Asn Leu
85 90 95
Asp Ile Leu Ile Asn Lys Asn Leu Thr Gly Phe Gly Arg Asn Leu Lys
100 105 110
Ala Pro Asp Ser Asn Asp Thr Leu Glu Asn Leu Ile Arg Lys Ile Gln
115 120 125
Ala Gly Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Pro Glu Leu Lys Lys Ile Lys
130 135 140
Glu Met Ile Gln Lys Asp Ile Val Asn Arg Lys Glu Gln Leu Leu Lys
145 150 155 160
Ser Ile Lys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Ser Leu Glu Gly Ser Lys Leu
165 170 175
Val Pro Ser Thr Lys Lys Met Lys Trp Leu Phe Lys Leu Ile Asp Val
180 185 190
Pro Asn Lys Thr Phe Asn Glu Lys Met Leu Glu Lys Tyr Trp Glu Ile
195 200 205
Tyr Asp Tyr Asp Lys Leu Lys Ala Asn Ile Thr Asn Arg Leu Asp Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Lys Ala Arg Ser Ile Ser Arg Ala Val Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Arg Glu Tyr His Lys Asn Leu Arg Thr Asn Tyr Asn Arg Phe Val Ser
245 250 255
Gly Asp Arg Pro Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gly Gly Ser Ala Lys Tyr
260 265 270
Asn Pro Asp Lys Glu Glu Phe Leu Leu Phe Leu Lys Glu Val Glu Gln
275 280 285
Tyr Phe Lys Lys Tyr Phe Pro Val Lys Ser Lys His Ser Asn Lys Ser
290 295 300
Lys Asp Lys Ser Leu Val Asp Lys Tyr Lys Asn Tyr Cys Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Val Val Lys Lys Glu Val Asn Arg Ser Ile Ile Asn Gln Leu Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ile Gln Gln Gly Lys Leu Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Asn Asp
340 345 350
Thr Trp Gln Glu Asp Phe Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Tyr Ile Gln
355 360 365
Val Glu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Val Met Thr Ser Leu Ser Trp Gly
370 375 380
Ile Asn Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ile Asp Asp Ser Asn Thr Val Lys
385 390 395 400
Phe Asp Asp Ile Thr Thr Lys Lys Ala Lys Glu Ala Ile Glu Ser Asn
405 410 415
Tyr Phe Asn Lys Leu Arg Thr Cys Ser Arg Met Gln Asp His Phe Lys
420 425 430
Glu Lys Leu Ala Phe Phe Tyr Pro Val Tyr Val Lys Asp Lys Lys Asp
435 440 445
Arg Pro Asp Asp Asp Ile Glu Asn Leu Ile Val Leu Val Lys Asn Ala
450 455 460
Ile Glu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Asn Arg Thr Phe His Phe Lys Glu
465 470 475 480
Ser Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ser Gly
485 490 495
Gln Asn Lys Ile Asp Tyr Ser Val Ala Ala Glu Phe Ile Lys Arg Asp
500 505 510
Ile Glu Asn Leu Tyr Asp Val Phe Arg Glu Gln Ile Arg Ser Leu Gly
515 520 525
Ile Ala Glu Tyr Tyr Lys Ala Asp Met Ile Ser Asp Cys Phe Lys Thr
530 535 540
Cys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Tyr Ser Pro Lys Asn Ser Leu Met Pro
545 550 555 560
Ala Phe Lys Asn Val Tyr Lys Arg Gly Ala Asn Leu Asn Lys Ala Tyr
565 570 575
Ile Arg Asp Lys Gly Pro Lys Glu Thr Gly Asp Gln Gly Gln Asn Ser
580 585 590
Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Glu Leu Thr Trp Tyr Ile Glu Val
595 600 605
Lys Asn Asn Asp Gln Ser Tyr Asn Ala Tyr Lys Asn Leu Leu Gln Leu
610 615 620
Ile Tyr Tyr His Ala Phe Leu Pro Glu Val Arg Glu Asn Glu Ala Leu
625 630 635 640
Ile Thr Asp Phe Ile Asn Arg Thr Lys Glu Trp Asn Arg Lys Glu Thr
645 650 655
Glu Glu Arg Leu Asn Thr Lys Asn Asn Lys Lys His Lys Asn Phe Asp
660 665 670
Glu Asn Asp Asp Ile Thr Val Asn Thr Tyr Arg Tyr Glu Ser Ile Pro
675 680 685
Asp Tyr Gln Gly Glu Ser Leu Asp Asp Tyr Leu Lys Val Leu Gln Arg
690 695 700
Lys Gln Met Ala Arg Ala Lys Glu Val Asn Glu Lys Glu Glu Gly Asn
705 710 715 720
Asn Asn Tyr Ile Gln Phe Ile Arg Asp Val Val Val Trp Ala Phe Gly
725 730 735
Ala Tyr Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Asn Glu Leu Gln Pro
740 745 750
Pro Leu Ser Lys Glu Asn Ile Gly Leu Asn Asp Thr Leu Lys Glu Leu
755 760 765
Phe Pro Glu Glu Lys Val Lys Ser Pro Phe Asn Ile Lys Cys Arg Phe
770 775 780
Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Asp Asn Thr
785 790 795 800
Ser Ala Glu Ala Val Lys Thr Asp Gly Lys Glu Asp Glu Lys Asp Lys
805 810 815
Lys Asn Ile Lys Arg Lys Asp Leu Leu Cys Phe Tyr Leu Phe Leu Arg
820 825 830
Leu Leu Asp Glu Asn Glu Ile Cys Lys Leu Gln His Gln Phe Ile Lys
835 840 845
Tyr Arg Cys Ser Leu Lys Glu Arg Arg Phe Pro Gly Asn Arg Thr Lys
850 855 860
Leu Glu Lys Glu Thr Glu Leu Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Met Glu
865 870 875 880
Leu Val Arg Phe Thr Met Pro Ser Ile Pro Glu Ile Ser Ala Lys Ala
885 890 895
Glu Ser Gly Tyr Asp Thr Met Ile Lys Lys Tyr Phe Lys Asp Phe Ile
900 905 910
Glu Lys Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Thr Ser Asn Leu Tyr Tyr His
915 920 925
Ser Asp Ser Lys Thr Pro Val Thr Arg Lys Tyr Met Ala Leu Leu Met
930 935 940
Arg Ser Ala Pro Leu His Leu Tyr Lys Asp Ile Phe Lys Gly Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Ile Thr Lys Lys Glu Cys Leu Glu Tyr Ile Lys Leu Ser Asn Ile
965 970 975
Ile Lys Asp Tyr Gln Asn Ser Leu Asn Glu Leu His Glu Gln Leu Glu
980 985 990
Arg Ile Lys Leu Lys Ser Glu Lys Gln Asn Gly Lys Asp Ser Leu Tyr
995 1000 1005
Leu Asp Lys Lys Asp Phe Tyr Lys Val Lys Glu Tyr Val Glu Asn
1010 1015 1020
Leu Glu Gln Val Ala Arg Tyr Lys His Leu Gln His Lys Ile Asn
1025 1030 1035
Phe Glu Ser Leu Tyr Arg Ile Phe Arg Ile His Val Asp Ile Ala
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Ala Arg Met Val Gly Tyr Thr Gln Asp Trp Glu Arg Asp Met His
1055 1060 1065
Phe Leu Phe Lys Ala Leu Val Tyr Asn Gly Val Leu Glu Glu Arg
1070 1075 1080
Arg Phe Glu Ala Ile Phe Asn Asn Asn Asp Asp Asn Asn Asp Gly
1085 1090 1095
Arg Ile Val Lys Lys Ile Gln Asn Asn Leu Asn Asn Lys Asn Arg
1100 1105 1110
Glu Leu Val Ser Met Leu Cys Trp Asn Lys Lys Leu Asn Lys Asn
1115 1120 1125
Glu Phe Gly Ala Ile Ile Trp Lys Arg Asn Pro Ile Ala His Leu
1130 1135 1140
Asn His Phe Thr Gln Thr Glu Gln Asn Ser Lys Ser Ser Leu Glu
1145 1150 1155
Ser Leu Ile Asn Ser Leu Arg Ile Leu Leu Ala Tyr Asp Arg Lys
1160 1165 1170
Arg Gln Asn Ala Val Thr Lys Thr Ile Asn Asp Leu Leu Leu Asn
1175 1180 1185
Asp Tyr His Ile Arg Ile Lys Trp Glu Gly Arg Val Asp Glu Gly
1190 1195 1200
Gln Ile Tyr Phe Asn Ile Lys Glu Lys Glu Asp Ile Glu Asn Glu
1205 1210 1215
Pro Ile Ile His Leu Lys His Leu His Lys Lys Asp Cys Tyr Ile
1220 1225 1230
Tyr Lys Asn Ser Tyr Met Phe Asp Lys Gln Lys Glu Trp Ile Cys
1235 1240 1245
Asn Gly Ile Lys Glu Glu Val Tyr Asp Lys Ser Ile Leu Lys Cys
1250 1255 1260
Ile Gly Asn Leu Phe Lys Phe Asp Tyr Glu Asp Lys Asn Lys Ser
1265 1270 1275
Ser Ala Asn Pro Lys His Thr
1280 1285
<210> 597
<211> 1344
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 597
Met Leu Arg Arg Asp Lys Glu Val Lys Lys Leu Tyr Asn Val Phe Asn
1 5 10 15
Gln Ile Gln Val Gly Thr Lys Pro Lys Lys Trp Asn Asn Asp Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Pro Glu Glu Asn Glu Arg Arg Ala Gln Gln Lys Asn Ile Lys
35 40 45
Met Lys Asn Tyr Lys Trp Arg Glu Ala Cys Ser Lys Tyr Val Glu Ser
50 55 60
Ser Gln Arg Ile Ile Asn Asp Val Ile Phe Tyr Ser Tyr Arg Lys Ala
65 70 75 80
Lys Asn Lys Leu Arg Tyr Met Arg Lys Asn Glu Asp Ile Leu Lys Lys
85 90 95
Met Gln Glu Ala Glu Lys Leu Ser Lys Phe Ser Gly Gly Lys Leu Glu
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115 120 125
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Cys Ile Gly Lys Asn Asn Ile Ser Asp His Glu Arg Glu Ile Val Cys
145 150 155 160
Lys Leu Leu Glu Leu Ile Arg Lys Asp Phe Ser Lys Leu Asp Pro Asn
165 170 175
Val Lys Gly Ser Gln Gly Ala Asn Ile Val Arg Ser Val Arg Asn Gln
180 185 190
Asn Met Ile Val Gln Pro Gln Gly Asp Arg Phe Leu Phe Pro Gln Val
195 200 205
Tyr Ala Lys Glu Asn Glu Thr Val Thr Asn Lys Asn Val Glu Lys Glu
210 215 220
Gly Leu Asn Glu Phe Leu Leu Asn Tyr Ala Asn Leu Asp Asp Glu Lys
225 230 235 240
Arg Ala Glu Ser Leu Arg Lys Leu Arg Arg Ile Leu Asp Val Tyr Phe
245 250 255
Ser Ala Pro Asn His Tyr Glu Lys Asp Met Asp Ile Thr Leu Ser Asp
260 265 270
Asn Ile Glu Lys Glu Lys Phe Asn Val Trp Glu Lys His Glu Cys Gly
275 280 285
Lys Lys Glu Thr Gly Leu Phe Val Asp Ile Pro Asp Val Leu Met Glu
290 295 300
Ala Glu Ala Glu Asn Ile Lys Leu Asp Ala Val Val Glu Lys Arg Glu
305 310 315 320
Arg Lys Val Leu Asn Asp Arg Val Arg Lys Gln Asn Ile Ile Cys Tyr
325 330 335
Arg Tyr Thr Arg Ala Val Val Glu Lys Tyr Asn Ser Asn Glu Pro Leu
340 345 350
Phe Phe Glu Asn Asn Ala Ile Asn Gln Tyr Trp Ile His His Ile Glu
355 360 365
Asn Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Asn Cys Lys Ala Gly Lys Leu Phe
370 375 380
Lys Leu Arg Lys Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Val Trp Lys Asp Ala Ile
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Asn Leu Ile Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr Asn
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Phe Ala Leu Asp Asp Ile Trp Lys Asp Lys Lys Asn Lys Glu Leu Gly
420 425 430
Ile Val Asp Glu Arg Ile Arg Asn Gly Ile Thr Ser Phe Asp Tyr Glu
435 440 445
Met Ile Lys Ala His Glu Asn Leu Gln Arg Glu Leu Ala Val Asp Ile
450 455 460
Ala Phe Ser Val Asn Asn Leu Ala Arg Ala Val Cys Asp Met Ser Asn
465 470 475 480
Leu Gly Asn Lys Glu Ser Asp Phe Leu Leu Trp Lys Arg Asn Asp Ile
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Ala Asp Lys Leu Lys Asn Lys Asp Asp Met Ala Ser Val Ser Ala Val
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Leu Gln Phe Phe Gly Gly Lys Ser Ser Trp Asp Ile Asn Ile Phe Lys
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Asp Ala Tyr Lys Gly Lys Lys Lys Tyr Asn Tyr Glu Val Arg Phe Ile
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Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Asn Phe His
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Gly Lys Ile Phe Glu Arg Glu Thr Glu Phe Cys Leu Asn Val Glu Lys
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Asp Arg Phe Tyr Ser Asn Asn Leu Tyr Met Phe Tyr Gln Val Ser Glu
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770 775 780
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Lys Phe Leu Asn Ala Arg Ser Leu Asn Leu Met Val Gly Ser Met Arg
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Lys Gly Gln Glu Ser Leu Leu Gln His Met Arg Tyr Leu Ile Leu Leu
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Tyr Leu Tyr Gly Pro Asp Lys Ile Thr Asp Asp Tyr Cys Glu Glu Ile
245 250 255
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Ser Glu Glu Ala Ser Met Leu Ile Gln Asp Arg Ile Tyr Val Asn Gln
275 280 285
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<213> Leptotrichia sp.
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Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asn Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Met
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Ser Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Glu Asn Lys Lys Met Phe Val Glu Lys Ile Leu Asn Thr Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Val Asp Phe Ile Val Lys Glu Leu Lys Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Phe Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Asn Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asn Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Asn Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Val
485 490 495
Lys Met Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Lys Glu Lys Val Thr Asp Phe Phe Gly
530 535 540
Phe Asn Leu Asn Gly Gln Lys Ile Thr Leu Lys Glu Lys Val Pro Ser
545 550 555 560
Phe Lys Leu Asn Ile Leu Lys Lys Leu Asn Phe Ile Asn Asn Glu Asn
565 570 575
Asn Ile Asp Glu Lys Leu Ser His Phe Tyr Ser Phe Gln Lys Glu Gly
580 585 590
Tyr Leu Leu Arg Asn Lys Ile Leu His Asn Ser Tyr Gly Asn Ile Gln
595 600 605
Glu Thr Lys Asn Leu Lys Gly Glu Tyr Glu Asn Val Glu Lys Leu Ile
610 615 620
Lys Glu Leu Lys Val Ser Asp Glu Glu Ile Ser Lys Ser Leu Ser Leu
625 630 635 640
Asp Val Ile Phe Glu Gly Lys Val Asp Ile Ile Asn Lys Ile Asn Ser
645 650 655
Leu Lys Ile Gly Glu Tyr Lys Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Ser Phe Ser
660 665 670
Lys Ile Val Leu Glu Ile Thr Arg Lys Phe Arg Glu Ile Asn Lys Asp
675 680 685
Lys Leu Phe Asp Ile Glu Ser Glu Lys Ile Ile Leu Asn Ala Val Lys
690 695 700
Tyr Val Asn Lys Ile Leu Tyr Glu Lys Ile Thr Ser Asn Glu Glu Asn
705 710 715 720
Glu Phe Leu Lys Thr Leu Pro Asp Lys Leu Val Lys Lys Ser Asn Asn
725 730 735
Lys Lys Glu Asn Lys Asn Leu Leu Ser Ile Glu Glu Tyr Tyr Lys Asn
740 745 750
Ala Gln Val Ser Ser Ser Lys Gly Asp Lys Lys Ala Ile Lys Lys Tyr
755 760 765
Gln Asn Lys Val Thr Asn Ala Tyr Leu Glu Tyr Leu Glu Asn Thr Phe
770 775 780
Thr Glu Ile Ile Asp Phe Ser Lys Phe Asn Leu Asn Tyr Asp Glu Ile
785 790 795 800
Lys Thr Lys Ile Glu Glu Arg Lys Asp Asn Lys Ser Lys Ile Ile Ile
805 810 815
Asp Ser Ile Ser Thr Asn Ile Asn Ile Thr Asn Asp Ile Glu Tyr Ile
820 825 830
Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser Asn Thr Tyr Ile Asn Lys Ile
835 840 845
Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val Trp Leu Glu Lys Gln Asn Gly
850 855 860
Thr Lys Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Ile Ile Ser Ile Leu Asp Glu Val
865 870 875 880
Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
885 890 895
Leu Lys Asn Ala Ile Ile Asp Ala Lys Ile Val Glu Asn Asp Glu Thr
900 905 910
Tyr Ile Lys Asn Tyr Ile Phe Glu Ser Asn Glu Glu Lys Leu Lys Lys
915 920 925
Arg Leu Phe Cys Glu Glu Leu Val Asp Lys Glu Asp Ile Arg Lys Ile
930 935 940
Phe Glu Asp Glu Asn Phe Lys Phe Lys Ser Phe Ile Lys Lys Asn Glu
945 950 955 960
Ile Gly Asn Phe Lys Ile Asn Phe Gly Ile Leu Ser Asn Leu Glu Cys
965 970 975
Asn Ser Glu Val Glu Ala Lys Lys Ile Ile Gly Lys Asn Ser Lys Lys
980 985 990
Leu Glu Ser Phe Ile Gln Asn Ile Ile Asp Glu Tyr Lys Ser Asn Ile
995 1000 1005
Arg Thr Leu Phe Ser Ser Glu Phe Leu Glu Lys Tyr Lys Glu Glu
1010 1015 1020
Ile Asp Asn Leu Val Glu Asp Thr Glu Ser Glu Asn Lys Asn Lys
1025 1030 1035
Phe Glu Lys Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu His Lys Asn Glu Leu Tyr
1040 1045 1050
Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly Asn Pro Asn Phe
1055 1060 1065
Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Ile Lys Asn Val Asp
1070 1075 1080
Thr Lys Ile Leu Phe Asp Asp Asp Ile Lys Lys Asn Lys Ile Ser
1085 1090 1095
Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly
1100 1105 1110
Tyr Ser Asn Asp Tyr Lys Ala Lys Tyr Val Asn Lys Leu Lys Glu
1115 1120 1125
Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn Ile Gln Asn Glu Asn Tyr Ser
1130 1135 1140
Ser Phe Gly Glu Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Lys Val Ser Glu Tyr
1145 1150 1155
Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr Leu Asn Lys Ile
1160 1165 1170
Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu Ala Ile Gln Met
1175 1180 1185
Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val Asn Gly Leu Arg
1190 1195 1200
Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn Thr Gly Ile Ser
1205 1210 1215
Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly Phe Tyr Thr Thr
1220 1225 1230
Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser Tyr Lys Lys Phe
1235 1240 1245
Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu Ser Glu Asn Ser
1250 1255 1260
Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser
1265 1270 1275
His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp Tyr Ser Ile Ala
1280 1285 1290
Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser Tyr Ser Thr Arg
1295 1300 1305
Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu Val Phe Lys Lys
1310 1315 1320
Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Lys Phe Arg Leu
1325 1330 1335
Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met Lys Pro Lys Lys
1340 1345 1350
Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser Asp Tyr Ile Lys
1355 1360 1365
Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu Asn Thr Asn Asp
1370 1375 1380
Thr Leu
1385
<210> 601
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 601
Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe
1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu
465 470 475 480
Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu
485 490 495
Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val
500 505 510
Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys
515 520 525
Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln
530 535 540
Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys
545 550 555 560
Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile
565 570 575
Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr
595 600 605
Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys
610 615 620
Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys
625 630 635 640
Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp
645 650 655
Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
675 680 685
Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
690 695 700
Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
705 710 715 720
Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
725 730 735
Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp
1010 1015 1020
Gly Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp
1025 1030 1035
Phe Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys
1040 1045 1050
Tyr Glu Glu Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser
1055 1060 1065
Lys Glu Glu Glu Asn Tyr Pro Tyr Val Val Glu Arg Glu Ile Glu
1070 1075 1080
Gln Tyr Glu Lys Val Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His
1085 1090 1095
Leu Ile Glu Glu Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile
1100 1105 1110
Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn
1115 1120 1125
Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys
1130 1135 1140
Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu Asp Val Asn Ile Asn Gln
1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys
1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
1205 1210 1215
Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 602
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 602
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Arg Lys Phe Val Lys Thr Phe Asn Ser Phe Glu Thr
385 390 395 400
Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
405 410 415
Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Asp Asn Asp Lys Ile Trp
420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
450 455 460
Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
465 470 475 480
Asn Asp Asn Glu Ile Glu Thr Lys Lys Lys Glu Asn Lys Asn Asp Lys
485 490 495
Gln Glu Lys His Lys Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asn Lys Ile Thr Glu
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Thr Phe Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser Ile
515 520 525
Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
545 550 555 560
Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
Val Glu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu
610 615 620
Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Lys Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Lys Pro Lys Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Lys
740 745 750
His Arg Glu Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr His Phe Asn Val Gly Asn Ile Asn Lys Pro
785 790 795 800
Asp Glu Lys Asn Phe Leu Asn Cys Glu Glu Arg Arg Glu Leu Leu Arg
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu
820 825 830
Asn Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu
835 840 845
Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met
850 855 860
Glu Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr
885 890 895
Glu Glu Lys Asn Gly Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Lys Asn Asn Ile
900 905 910
Leu Asn Arg Ile Met Pro Met Arg Leu Pro Ile Lys Val Tyr Gly Arg
915 920 925
Glu Asn Phe Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Ile Arg Arg Asn Thr Phe
930 935 940
Phe Thr Val Tyr Ile Glu Glu Lys Gly Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser
965 970 975
Phe Val Lys Thr Pro Ser Lys Ala Glu Ser Lys Ser Asn Thr Ile Ser
980 985 990
Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ile
995 1000 1005
Glu Ile Ile Lys Asp Met Leu Ala Leu Glu Lys Thr Leu Ile Asp
1010 1015 1020
Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asn Phe Asn Lys Met Leu Thr
1025 1030 1035
Asp Trp Leu Glu Leu Lys Gly Glu Pro Asp Lys Ala Ser Phe Gln
1040 1045 1050
Asn Asp Val Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His
1055 1060 1065
Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn
1070 1075 1080
Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asn Thr Ser Glu Glu Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gly Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Thr Ile Glu
1100 1105 1110
Lys Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120 1125
<210> 603
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 603
Met Gln Lys Gln Asp Lys Leu Phe Val Asp Arg Lys Lys Asn Ala Ile
1 5 10 15
Phe Ala Phe Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Met Glu Asn Lys Glu Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Ile Tyr Tyr Glu Leu Thr Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr Thr Thr Ile Asn His Ile Asn
50 55 60
Arg Arg Leu Glu Ile Ala Glu Leu Lys Asp Asp Gly Tyr Met Met Gly
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu Gln Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys Val
85 90 95
Arg Leu Arg Asp Leu Ile Met Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Met Thr Asn Ser Lys Ser Pro Asn Asn Lys Glu Gln Arg
115 120 125
Glu Lys Glu Gln Ser Glu Ala Leu Ser Leu Asn Asn Leu Lys Asn Val
130 135 140
Leu Phe Ile Phe Leu Glu Lys Leu Gln Val Leu Arg Asn Tyr Tyr Ser
145 150 155 160
His Tyr Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Lys Pro Ile Phe Glu Thr Ser
165 170 175
Leu Leu Lys Asn Met Tyr Lys Val Phe Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
180 185 190
Lys Arg Asp Tyr Met His His Glu Asn Ile Asp Met Gln Arg Asp Phe
195 200 205
Thr His Leu Asn Arg Lys Lys Gln Val Gly Arg Thr Lys Asn Ile Ile
210 215 220
Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Asn Val Gln Thr Lys Asp Trp Met
290 295 300
Gln Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr
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<213> Riemerella anatipestifer
<400> 606
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Ser Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Ala Pro Leu Leu Lys Arg Glu Glu His
785 790 795 800
Tyr Glu Tyr Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln
805 810 815
Arg Leu Glu Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr
820 825 830
Lys Arg Trp Gln His Leu Glu Lys Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Asn Gln
835 840 845
Asp Val Met Leu Trp Leu Met Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asn His Phe
850 855 860
Lys Glu Leu Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala
865 870 875 880
Val Asn Val Gln Glu Ala Asp Ala Lys Leu Asn Pro Leu Asn Gln Thr
885 890 895
Leu Pro Met Val Leu Pro Val Lys Val Tyr Pro Ala Thr Ala Phe Gly
900 905 910
Glu Val Gln Tyr His Lys Thr Pro Ile Arg Thr Val Tyr Ile Arg Glu
915 920 925
Glu His Thr Lys Ala Leu Lys Met Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
930 935 940
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ile Lys Glu Glu Asn Asp
945 950 955 960
Thr Gln Lys His Pro Ile Ser Gln Leu Arg Leu Arg Arg Glu Leu Glu
965 970 975
Ile Tyr Gln Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Lys Glu Thr Leu Ser Leu
980 985 990
Glu Glu Lys Leu Leu Asn Lys His Thr Ser Leu Ser Ser Leu Glu Asn
995 1000 1005
Glu Phe Arg Ala Leu Leu Glu Glu Trp Lys Lys Glu Tyr Ala Ala
1010 1015 1020
Ser Ser Met Val Thr Asp Glu His Ile Ala Phe Ile Ala Ser Val
1025 1030 1035
Arg Asn Ala Phe Cys His Asn Gln Tyr Pro Phe Tyr Lys Glu Ala
1040 1045 1050
Leu His Ala Pro Ile Pro Leu Phe Thr Val Ala Gln Pro Thr Thr
1055 1060 1065
Glu Glu Lys Asp Gly Leu Gly Ile Ala Glu Ala Leu Leu Lys Val
1070 1075 1080
Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val Lys Ser Gln Ile
1085 1090 1095
<210> 607
<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 607
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Ile Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Glu Ile Arg Glu Ile
35 40 45
Asp Asn Asp Glu Lys Val Leu Asp Ile Lys Thr Leu Trp Gln Lys Gly
50 55 60
Asn Lys Asp Leu Asn Gln Lys Ala Arg Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys
65 70 75 80
His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile Tyr Thr Lys Asn Lys Glu Asp
85 90 95
Lys Lys Glu Val Lys Gln Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu
100 105 110
Ser Leu Lys Asp Cys Leu Phe Leu Phe Leu Asp Lys Leu Gln Glu Ala
115 120 125
Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr Ser Glu Phe Ser Lys Glu Pro
130 135 140
Glu Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Asn Ile Gln Leu Val Ile Asn Asp Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys Tyr
180 185 190
Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Gly Phe Lys Asp Asn Leu Glu Asn Lys Lys Lys Met Thr
225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu
260 265 270
Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
275 280 285
Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Asn
290 295 300
Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg
305 310 315 320
Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys
325 330 335
Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr
340 345 350
Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys
355 360 365
Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Ala Lys Gln Asn Arg Pro
370 375 380
Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser
385 390 395 400
Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn
405 410 415
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420 425 430
Ser Leu Lys Thr Asn Asp Glu Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu
435 440 445
Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu
450 455 460
Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Lys Glu Lys Pro Asn Asn
465 470 475 480
Asp Glu Ile Asn Ala Ser Ile Val Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile
485 490 495
Arg Asn Ile Phe Lys Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn
500 505 510
Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Asp Lys Gly Ile Pro Lys
515 520 525
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530 535 540
Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp
545 550 555 560
Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Lys Glu Lys
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580 585 590
Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp
595 600 605
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Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
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Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
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Ile Glu Leu Trp Asp Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Glu
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Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Lys Glu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
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900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
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930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
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Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
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1100 1105 1110
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1115 1120
<210> 608
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 608
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Thr Asp Val Ala Ala Lys Asn Thr Gly Thr Leu Leu Lys Asn Gly Gln
625 630 635 640
Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
645 650 655
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660 665 670
Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Ala Thr Asp Ser
675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
725 730 735
Asn Glu Leu Gln Pro Gln Asn Trp Ala Ser Asp Asn Tyr Phe Leu Leu
740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
Trp Phe Asn Glu His Lys Thr Ile Val Asp Ile Ser Asp Cys Asp Ile
785 790 795 800
Phe Lys Asn Arg Val Gly Gln Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Phe Phe
805 810 815
Asp Lys Lys Phe Lys Asp His Ser Gln Pro Phe Tyr Arg Tyr Asp Phe
820 825 830
Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
850 855 860
Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
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965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
1010 1015 1020
Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
Asp Lys Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu
1055 1060 1065
Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 609
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 609
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
His Tyr His Leu Glu Asn Lys Lys Ile Gly Ile Ala Phe Lys Asn His
420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Asn Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Ser Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asp Val Asn Lys Pro
785 790 795 800
Lys Glu Glu Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg Ile Glu Leu Trp Asp
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
850 855 860
Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
865 870 875 880
Ile Asp Glu Leu Asn Ile Lys Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp
885 890 895
Ile Asn Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg
900 905 910
Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr Lys Val Asn Lys Gly
915 920 925
Gly Tyr Ile Ile Lys Asn Lys Pro Leu His Thr Ile Tyr Ile Lys Glu
930 935 940
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
945 950 955 960
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Lys Thr Pro Ser Glu
965 970 975
Ala Glu Ser Glu Ser Asn Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
980 985 990
Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Ala Arg Leu Asp Ile Ile Glu Asp Met Leu
995 1000 1005
Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr
1010 1015 1020
Asp Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly Trp Leu Glu Leu Lys Gly
1025 1030 1035
Glu Ala Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr
1040 1045 1050
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser
1070 1075 1080
Asn Ile Ile Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys
1085 1090 1095
Glu Glu Val Ser Lys Ala Ala Lys Lys Ile Gln Asn Glu Glu Asp
1100 1105 1110
Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
1115 1120
<210> 610
<211> 1199
<212> PRT
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 610
Met Lys Asn Ile Gln Arg Leu Gly Lys Gly Asn Glu Phe Ser Pro Phe
1 5 10 15
Lys Lys Glu Asp Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ile Thr Arg Phe Gly Ile
35 40 45
Val Ile Thr Asp Glu Asn Lys Lys Pro Lys Glu Thr Phe Gly Glu Lys
50 55 60
Ile Leu Asn Glu Ile Phe Lys Lys Asp Ile Ser Ile Val Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Trp Val Asn Ile Phe Ala Asp Tyr Phe Pro Phe Thr Lys Tyr Leu
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Glu Glu Met Gln Phe Lys Asn Arg Val Ile Cys Phe
100 105 110
Arg Asp Val Met Lys Glu Leu Leu Lys Thr Val Glu Ala Leu Arg Asn
115 120 125
Phe Tyr Thr His Tyr Asp His Glu Pro Ile Lys Ile Glu Asp Arg Val
130 135 140
Phe Tyr Phe Leu Asp Lys Val Leu Leu Asp Val Ser Leu Thr Val Lys
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Asn Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu Phe Leu Asn Gln His
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Ile Gly Glu Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys Gln Arg Lys Asp Tyr Leu
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Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Asp Phe Ile Cys Lys Arg Glu Lys Gln
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Asp Asp Lys Glu Asn His Asn Ser Val Glu Lys Ile Leu Cys Asn Lys
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260 265 270
Glu Asn Asp Lys His Cys Leu Glu Val Pro Ile Ser Gln Lys Gly Ile
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<400> 612
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130 135 140
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Ser Ile Gly Ser Glu Glu Lys Ile Leu Lys Ile Gln Arg Asn Leu Met
545 550 555 560
Ile Tyr Phe Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Asn Glu Asn Val Glu Asn Gln
565 570 575
Gly Tyr Lys Leu Val Asn Asn Tyr Tyr Arg Glu Leu Lys Lys Asp Val
580 585 590
Glu Glu Ser Ile Ala Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asp Phe
595 600 605
Lys Ser Lys Tyr Lys Lys Ile Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Asn Tyr
610 615 620
Ala Pro Ala Lys Gln Asp Lys Ala Pro Glu Asn Ala Phe Glu Thr Leu
625 630 635 640
Leu Lys Lys Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Lys
645 650 655
Lys Ala Glu His Glu Lys Asn Lys Glu Asp Phe Val Lys Arg Asn Lys
660 665 670
Gly Lys Gln Phe Lys Leu His Phe Ile Arg Lys Ala Cys Gln Met Met
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Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Asn Thr Leu Lys Glu Gly Asn Ala Ala Phe
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Glu Lys Lys Asp Pro Val Ile Glu Lys Arg Lys Asn Lys Glu His Glu
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Phe Gly His His Lys Asn Leu Asn Ile Thr Arg Glu Glu Phe Asn Asp
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Tyr Cys Lys Trp Met Phe Ala Phe Asn Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Lys
740 745 750
Tyr Leu Arg Asp Leu Phe Ser Glu Lys His Phe Phe Asp Asn Gln Glu
755 760 765
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850 855 860
Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
865 870 875 880
Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
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Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
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Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu Ile Ile Ile Lys Asn Asp Leu Glu Ile Glu Asp Ile Asn Thr
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Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
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<210> 614
<211> 1119
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 614
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1 5 10 15
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Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
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180 185 190
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Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
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595 600 605
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<213> Prevotella intermedia
<400> 615
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485 490 495
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530 535 540
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595 600 605
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610 615 620
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Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val
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Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Val Glu Gly
885 890 895
Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp Thr
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<211> 1115
<212> PRT
<213> Fusobacterium necrophorum
<400> 616
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Leu Ala Asn Cys Pro Met Glu Glu Val Asp Ser Ile Lys Ile Tyr Lys
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Ser Ile Asn Ser Phe Leu Cys Glu Gly Ile Lys Gly Lys Asp Asn Glu
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Lys Cys Asn Leu Gln Asn Gln Ile Asp Phe Asp Phe Asn Phe Val Asn
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Asp Phe Tyr Met Arg Lys Glu Lys Met Phe Phe Ile Gln Leu Lys Gln
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Ile Phe Pro Asp Ile Asn Ser Thr Glu Lys Gln Lys Met Asn Glu Lys
900 905 910
Glu Glu Ile Leu Arg Asn Arg Tyr His Leu Thr Asp Lys Lys Asn Glu
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Gln Ile Lys Asp Glu His Glu Ala Gln Ser Gln Leu Tyr Glu Lys Ile
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Leu Ser Leu Gln Lys Ile Tyr Ser Ser Asp Lys Asn Asn Phe Tyr Gly
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Arg Leu Lys Glu Glu Lys Leu Leu Phe Leu Glu Lys Gln Gly Lys Lys
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Lys Leu Ser Met Glu Glu Ile Lys Asp Lys Ile Ala Gly Asp Ile Ser
980 985 990
Asp Leu Leu Gly Ile Leu Lys Lys Glu Ile Thr Arg Asp Ile Lys Asp
995 1000 1005
Lys Leu Thr Glu Lys Phe Arg Tyr Cys Glu Glu Lys Leu Leu Asn
1010 1015 1020
Leu Ser Phe Tyr Asn His Gln Asp Lys Lys Lys Glu Glu Ser Ile
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Gln Lys Met Asn Ile Ser Ile Asp Tyr Asn Tyr Ile Asn Asp Tyr Tyr
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Met Lys Lys Glu Lys Phe Ile Phe Gly Gln Arg Lys Gln Ala Lys Thr
885 890 895
Ile Ile Asp Ser Gly Lys Lys Ala Asn Lys Arg Asn Lys Ala Glu Glu
900 905 910
Leu Leu Lys Met Tyr Arg Val Lys Lys Glu Asn Ile Asn Leu Ile Tyr
915 920 925
Glu Leu Ser Lys Lys Leu Asn Glu Leu Thr Lys Ser Glu Leu Phe Leu
930 935 940
Leu Asp Lys Lys Leu Leu Lys Asp Ile Asp Phe Thr Asp Val Lys Ile
945 950 955 960
Lys Asn Lys Ser Phe Phe Glu Leu Lys Asn Asp Val Lys Glu Val Ala
965 970 975
Asn Ile Lys Gln Ala Leu Gln Lys His Ser Ser Glu Leu Ile Gly Ile
980 985 990
Tyr Lys Lys Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Arg Ser Ile Val Ser Lys
995 1000 1005
Leu Ile Tyr Asp Glu Glu Lys Val Leu Ser Ile Ile Ile Tyr Asp
1010 1015 1020
Lys Thr Asn Lys Lys Tyr Glu Asp Phe Leu Leu Glu Ile Arg Arg
1025 1030 1035
Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Gln Phe Leu Ile Asp Glu Lys Lys
1040 1045 1050
Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Thr Lys Glu Lys Lys
1055 1060 1065
Lys Val Val Val Lys Ile Gln Asn Asn Ser Glu Leu Val Ser Glu
1070 1075 1080
Pro Arg Ile Ile Lys Asn Lys Asp Lys Lys Lys Ala Lys Thr Pro
1085 1090 1095
Glu Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Leu Asp Leu Thr Asn His Tyr
1100 1105 1110
Cys Phe Asn Leu Lys Ile Thr Leu
1115 1120
<210> 621
<211> 897
<212> PRT
<213> Fusobacterium ulcerans
<400> 621
Met Glu Asn Lys Gly Asn Asn Lys Lys Ile Asp Phe Asp Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Ile Leu Val Ala Gln Ile Lys Glu Tyr Phe Thr Lys Glu Ile Glu
20 25 30
Asn Tyr Asn Asn Arg Ile Asp Asn Ile Ile Asp Lys Lys Glu Leu Leu
35 40 45
Lys Tyr Ser Glu Lys Lys Glu Glu Ser Glu Lys Asn Lys Lys Leu Glu
50 55 60
Glu Leu Asn Lys Leu Lys Ser Gln Lys Leu Lys Ile Leu Thr Asp Glu
65 70 75 80
Glu Ile Lys Ala Asp Val Ile Lys Ile Ile Lys Ile Phe Ser Asp Leu
85 90 95
Arg His Ser Leu Met His Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Glu Asn Leu Phe
100 105 110
Glu Asn Lys Lys Asn Glu Glu Leu Ala Glu Leu Leu Asn Leu Asn Leu
115 120 125
Phe Lys Asn Leu Thr Leu Leu Arg Gln Met Lys Ile Glu Asn Lys Thr
130 135 140
Asn Tyr Leu Glu Gly Arg Glu Glu Phe Asn Ile Ile Gly Lys Asn Ile
145 150 155 160
Lys Ala Lys Glu Val Leu Gly His Tyr Asn Leu Leu Ala Glu Gln Lys
165 170 175
Asn Gly Phe Asn Asn Phe Ile Asn Ser Phe Phe Val Gln Asp Gly Thr
180 185 190
Glu Asn Leu Glu Phe Lys Lys Leu Ile Asp Glu His Phe Val Asn Ala
195 200 205
Lys Lys Arg Leu Glu Arg Asn Ile Lys Lys Ser Lys Lys Leu Glu Lys
210 215 220
Glu Leu Glu Lys Met Glu Gln His Tyr Gln Arg Leu Asn Cys Ala Tyr
225 230 235 240
Val Trp Asp Ile His Thr Ser Thr Thr Tyr Lys Lys Leu Tyr Asn Lys
245 250 255
Arg Lys Ser Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ile Asn Glu Ile Lys
260 265 270
Asp Lys Glu Val Ile Thr Ala Ile Asn Val Glu Leu Leu Arg Ile Lys
275 280 285
Lys Glu Met Glu Glu Ile Thr Lys Ser Asn Ser Leu Phe Arg Leu Lys
290 295 300
Tyr Lys Met Gln Ile Ala Tyr Ala Phe Leu Glu Ile Glu Phe Gly Gly
305 310 315 320
Asn Ile Ala Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Cys Ser Lys Met Glu Glu
325 330 335
Val Gln Lys Tyr Leu Lys Lys Gly Val Lys Tyr Leu Lys Tyr Tyr Lys
340 345 350
Asp Lys Glu Ala Gln Lys Asn Tyr Glu Phe Pro Phe Glu Glu Ile Phe
355 360 365
Glu Asn Lys Asp Thr His Asn Glu Glu Trp Leu Glu Asn Thr Ser Glu
370 375 380
Asn Asn Leu Phe Lys Phe Tyr Ile Leu Thr Tyr Leu Leu Leu Pro Met
385 390 395 400
Glu Phe Lys Gly Asp Phe Leu Gly Val Val Lys Lys His Tyr Tyr Asp
405 410 415
Ile Lys Asn Val Asp Phe Thr Asp Glu Ser Glu Lys Glu Leu Ser Gln
420 425 430
Val Gln Leu Asp Lys Met Ile Gly Asp Ser Phe Phe His Lys Ile Arg
435 440 445
Leu Phe Glu Lys Asn Thr Lys Arg Tyr Glu Ile Ile Lys Tyr Ser Ile
450 455 460
Leu Thr Ser Asp Glu Ile Lys Arg Tyr Phe Arg Leu Leu Glu Leu Asp
465 470 475 480
Val Pro Tyr Phe Glu Tyr Glu Lys Gly Thr Asp Glu Ile Gly Ile Phe
485 490 495
Asn Lys Asn Ile Ile Leu Thr Ile Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ile Phe
500 505 510
Arg Leu Tyr Asn Asp Leu Glu Ile His Gly Leu Phe Asn Ile Ser Ser
515 520 525
Asp Leu Asp Lys Ile Leu Arg Asp Leu Lys Ser Tyr Gly Asn Lys Asn
530 535 540
Ile Asn Phe Arg Glu Phe Leu Tyr Val Ile Lys Gln Asn Asn Asn Ser
545 550 555 560
Ser Thr Glu Glu Glu Tyr Arg Lys Ile Trp Glu Asn Leu Glu Ala Lys
565 570 575
Tyr Leu Arg Leu His Leu Leu Thr Pro Glu Lys Glu Glu Ile Lys Thr
580 585 590
Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Lys Leu Asn Glu Ile Ser Asn Leu Arg
595 600 605
Asn Gly Ile Cys His Leu Asn Tyr Lys Glu Ile Ile Glu Glu Ile Leu
610 615 620
Lys Thr Glu Ile Ser Glu Lys Asn Lys Glu Ala Thr Leu Asn Glu Lys
625 630 635 640
Ile Arg Lys Val Ile Asn Phe Ile Lys Glu Asn Glu Leu Asp Lys Val
645 650 655
Glu Leu Gly Phe Asn Phe Ile Asn Asp Phe Phe Met Lys Lys Glu Gln
660 665 670
Phe Met Phe Gly Gln Ile Lys Gln Val Lys Glu Gly Asn Ser Asp Ser
675 680 685
Ile Thr Thr Glu Arg Glu Arg Lys Glu Lys Asn Asn Lys Lys Leu Lys
690 695 700
Glu Thr Tyr Glu Leu Asn Cys Asp Asn Leu Ser Glu Phe Tyr Glu Thr
705 710 715 720
Ser Asn Asn Leu Arg Glu Arg Ala Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Asp
725 730 735
Ser Ala Phe Leu Lys Lys Ile Gly Leu Tyr Lys Val Lys Asn Asn Lys
740 745 750
Val Asn Ser Lys Val Lys Asp Glu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Ile Lys
755 760 765
Arg Lys Leu Leu Lys Asp Ser Ser Asp Ile Met Gly Met Tyr Lys Ala
770 775 780
Glu Val Val Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Leu Ile Phe Lys His
785 790 795 800
Asp Glu Glu Lys Arg Ile Tyr Val Thr Val Tyr Asp Thr Ser Lys Ala
805 810 815
Val Pro Glu Asn Ile Ser Lys Glu Ile Leu Val Lys Arg Asn Asn Ser
820 825 830
Lys Glu Glu Tyr Phe Phe Glu Asp Asn Asn Lys Lys Tyr Val Thr Glu
835 840 845
Tyr Tyr Thr Leu Glu Ile Thr Glu Thr Asn Glu Leu Lys Val Ile Pro
850 855 860
Ala Lys Lys Leu Glu Gly Lys Glu Phe Lys Thr Glu Lys Asn Lys Glu
865 870 875 880
Asn Lys Leu Met Leu Asn Asn His Tyr Cys Phe Asn Val Lys Ile Ile
885 890 895
Tyr
<210> 622
<211> 1111
<212> PRT
<213> Anaerosalibacter sp.
<400> 622
Met Lys Ser Gly Arg Arg Glu Lys Ala Lys Ser Asn Lys Ser Ser Ile
1 5 10 15
Val Arg Val Ile Ile Ser Asn Phe Asp Asp Lys Gln Val Lys Glu Ile
20 25 30
Lys Val Leu Tyr Thr Lys Gln Gly Gly Ile Asp Val Ile Lys Phe Lys
35 40 45
Ser Thr Glu Lys Asp Glu Lys Gly Arg Met Lys Phe Asn Phe Asp Cys
50 55 60
Ala Tyr Asn Arg Leu Glu Glu Glu Glu Phe Asn Ser Phe Gly Gly Lys
65 70 75 80
Gly Lys Gln Ser Phe Phe Val Thr Thr Asn Glu Asp Leu Thr Glu Leu
85 90 95
His Val Thr Lys Arg His Lys Thr Thr Gly Glu Ile Ile Lys Asp Tyr
100 105 110
Thr Ile Gln Gly Lys Tyr Thr Pro Ile Lys Gln Asp Arg Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Ser Ile Thr Asp Asn Lys Asp His Phe Asp Ser Asn Asp Leu
130 135 140
Gly Asp Lys Ile Arg Leu Ser Arg Ser Leu Thr Gln Tyr Thr Asn Arg
145 150 155 160
Ile Leu Leu Asp Ala Asp Val Met Lys Asn Tyr Arg Glu Ile Val Cys
165 170 175
Ser Asp Ser Glu Lys Val Asp Glu Thr Ile Asn Ile Asp Ser Gln Glu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ile Asn Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Asn Met Ile Ile
195 200 205
Tyr Tyr Gln Met Ile Asn Asn Phe Leu Leu His Tyr Asp Gly Glu Glu
210 215 220
Asp Lys Gly Gly Asn Asp Ser Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ile Trp Lys
225 230 235 240
Tyr Glu Asn Lys Lys Asn Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Arg Ser
245 250 255
Tyr Lys Ser Ile Glu Lys Ser Ile Asn Gln Tyr Ile Leu Asn His Asn
260 265 270
Thr Glu Val Glu Ser Gly Asp Lys Glu Lys Lys Ile Asp Ile Ser Glu
275 280 285
Glu Arg Ile Lys Glu Asp Leu Lys Lys Thr Phe Ile Leu Phe Ser Arg
290 295 300
Leu Arg His Tyr Met Val His Tyr Asn Tyr Lys Phe Tyr Glu Asn Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Gly Lys Asn Phe Ile Ile Tyr Asn Lys Asp Lys Ser Lys Ser
325 330 335
Arg Arg Phe Ser Glu Leu Leu Asp Leu Asn Ile Phe Lys Glu Leu Ser
340 345 350
Lys Ile Lys Leu Val Lys Asn Arg Ala Val Ser Asn Tyr Leu Asp Lys
355 360 365
Lys Thr Thr Ile His Val Leu Asn Lys Asn Ile Asn Ala Ile Lys Leu
370 375 380
Leu Asp Ile Tyr Arg Asp Ile Cys Glu Thr Lys Asn Gly Phe Asn Asn
385 390 395 400
Phe Ile Asn Asn Met Met Thr Ile Ser Gly Glu Glu Asp Lys Glu Tyr
405 410 415
Lys Glu Met Val Thr Lys His Phe Asn Glu Asn Met Asn Lys Leu Ser
420 425 430
Ile Tyr Leu Glu Asn Phe Lys Lys His Ser Asp Phe Lys Thr Asn Asn
435 440 445
Lys Lys Lys Glu Thr Tyr Asn Leu Leu Lys Gln Glu Leu Asp Glu Gln
450 455 460
Lys Lys Leu Arg Leu Trp Phe Asn Ala Pro Tyr Val Tyr Asp Ile His
465 470 475 480
Ser Ser Lys Lys Tyr Lys Glu Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Tyr Val
485 490 495
Asp Ile His Ser Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asn Asn Asp Asn Lys
500 505 510
Lys Lys Leu Asn Glu Ile Asn Val Lys Leu Cys Glu Leu Asn Thr Glu
515 520 525
Met Lys Glu Met Thr Lys Leu Asn Ser Lys Tyr Arg Leu Gln Tyr Lys
530 535 540
Leu Gln Leu Ala Phe Gly Phe Ile Leu Glu Glu Phe Asn Leu Asp Ile
545 550 555 560
Asp Lys Phe Val Ser Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Leu Thr Ile Ser
565 570 575
Lys Phe Met Glu Lys Arg Glu Thr Tyr Leu Ser Lys Ser Leu Asp Arg
580 585 590
Arg Asp Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ile Lys Asp Tyr Lys Phe Arg Asp
595 600 605
Thr Glu Asp Ile Phe Cys Ser Asp Arg Glu Asn Asn Leu Val Lys Leu
610 615 620
Tyr Ile Leu Met Tyr Ile Leu Leu Pro Val Glu Ile Arg Gly Asp Phe
625 630 635 640
Leu Gly Phe Val Lys Lys Asn Tyr Tyr Asp Leu Lys His Val Asp Phe
645 650 655
Ile Asp Lys Arg Asn Asn Asp Asn Lys Asp Thr Phe Phe His Asp Leu
660 665 670
Arg Leu Phe Glu Lys Asn Val Lys Arg Leu Glu Val Thr Ser Tyr Ser
675 680 685
Leu Ser Asp Gly Phe Leu Gly Lys Lys Ser Arg Glu Lys Phe Gly Lys
690 695 700
Glu Leu Glu Lys Phe Ile Tyr Lys Asn Val Ser Ile Ala Leu Pro Thr
705 710 715 720
Asn Ile Asp Ile Lys Glu Phe Asn Lys Ser Leu Val Leu Pro Met Met
725 730 735
Lys Asn Tyr Gln Ile Ile Phe Lys Leu Leu Asn Asp Ile Glu Ile Ser
740 745 750
Ala Leu Phe Leu Ile Ala Lys Lys Glu Gly Asn Glu Gly Ser Ile Thr
755 760 765
Phe Lys Lys Val Ile Asp Lys Val Arg Lys Glu Asp Met Asn Gly Asn
770 775 780
Ile Asn Phe Ser Gln Val Met Lys Met Ala Leu Asn Glu Lys Val Asn
785 790 795 800
Cys Gln Ile Arg Asn Ser Ile Ala His Ile Asn Met Lys Gln Leu Tyr
805 810 815
Ile Glu Pro Leu Asn Ile Tyr Ile Asn Asn Asn Gln Asn Lys Lys Thr
820 825 830
Ile Ser Glu Gln Met Glu Glu Ile Ile Asp Ile Cys Ile Thr Lys Gly
835 840 845
Leu Thr Gly Lys Glu Leu Asn Lys Asn Ile Ile Asn Asp Tyr Tyr Met
850 855 860
Lys Lys Glu Lys Leu Val Phe Asn Leu Lys Leu Arg Lys Arg Asn Asn
865 870 875 880
Leu Val Ser Ile Asp Ala Gln Gln Lys Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile
885 890 895
Leu Asn Lys Tyr Asp Leu Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Leu Asn Ile Lys
900 905 910
Glu Ile Ile Leu Lys Val Asn Asp Leu Asn Asn Lys Gln Lys Leu Leu
915 920 925
Lys Glu Thr Thr Glu Gly Glu Ser Asn Tyr Lys Asn Ala Leu Ser Lys
930 935 940
Asp Ile Leu Leu Leu Asn Gly Ile Ile Arg Lys Asn Ile Asn Phe Lys
945 950 955 960
Ile Lys Glu Met Ile Leu Gly Ile Ile Gln Gln Asn Glu Tyr Arg Tyr
965 970 975
Val Asn Ile Asn Ile Tyr Asp Lys Ile Arg Lys Glu Asp His Asn Ile
980 985 990
Asp Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr Ile Glu Ile Ser Cys Tyr Glu Asn
995 1000 1005
Lys Ser Asn Glu Ser Thr Asp Glu Arg Ile Asn Phe Lys Ile Lys
1010 1015 1020
Tyr Met Asp Leu Lys Val Lys Asn Glu Leu Leu Val Pro Ser Cys
1025 1030 1035
Tyr Glu Asp Ile Tyr Ile Lys Lys Lys Ile Asp Leu Glu Ile Arg
1040 1045 1050
Tyr Ile Glu Asn Cys Lys Val Val Tyr Ile Asp Ile Tyr Tyr Lys
1055 1060 1065
Lys Tyr Asn Ile Asn Leu Glu Phe Asp Gly Lys Thr Leu Phe Val
1070 1075 1080
Lys Phe Asn Lys Asp Val Lys Lys Asn Asn Gln Lys Val Asn Leu
1085 1090 1095
Glu Ser Asn Tyr Ile Gln Asn Ile Lys Phe Ile Val Ser
1100 1105 1110
Claims (68)
- 核酸検出系であって:
エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAを含む検出CRISPR系と;
酵素活性を有する四重鎖を含む核酸アプタマーと、を含む前記核酸検出系。 - 前記酵素活性がペルオキシダーゼ活性である、請求項1に記載の系。
- 核酸増幅試薬をさらに含む、請求項1または2に記載の系。
- 前記標的分子が標的DNAであり、前記系が、標的DNAと結合し、かつRNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含む、請求項1に記載の系。
- 前記CRISPR系のエフェクタータンパク質がRNA標的化エフェクタータンパク質である、請求項1~4のいずれか1項に記載の系。
- 前記RNA標的化エフェクタータンパク質が、1つ以上のHEPNドメインを含む、請求項5に記載の系。
- 前記1つ以上のHEPNドメインがRxxxxHモチーフ配列を含む、請求項6に記載の系。
- 前記RxxxHモチーフがR{N/H/K]X1X2X3H配列を含む、請求項7に記載の系。
- X1がR、S、D、E、Q、N、G、またはYであり、かつX2が独立してI、S、T、V、またはLであり、かつX3が独立してL、F、N、Y、V、I、S、D、E、またはAである、請求項8に記載の系。
- 前記CRISPR RNA標的化エフェクタータンパク質がC2c2である、請求項1~9のいずれか1項に記載の系。
- 前記CRISPR RNA標的化エフェクタータンパク質がC2c2である、請求項6に記載の系。
- 前記C2c2がCas1遺伝子の20kb内である、請求項11に記載の系。
- 前記C2c2エフェクタータンパク質が、Leptotrichia、Listeria、Corynebacter、Sutterella、Legionella、Treponema、Filifactor、Eubacterium、Streptococcus、Lactobacillus、Mycoplasma、Bacteroides、Flaviivola、Flavobacterium、Sphaerochaeta、Azospirillum、Gluconacetobacter、Neisseria、Roseburia、Parvibaculum、Staphylococcus、Nitratifractor、Mycoplasma、Campylobacter、及びLachnospiraからなる群より選択される属の生物体由来である、請求項12に記載の系。
- 請求項13に記載の系であって、前記C2c2またはCas13bエフェクタータンパク質が:Leptotrichia shahii;Leptotrichia wadei(Lw2);Listeria seeligeri;Lachnospiraceae bacterium MA2020;Lachnospiraceae bacterium NK4A179;[Clostridium]aminophilum DSM 10710;Carnobacterium gallinarum DSM 4847;Carnobacterium gallinarum DSM 4847(第2のCRISPR遺伝子座);Paludibacter propionicigenes WB4;Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317;Listeriaceae bacterium FSL M6-0635;Leptotrichia wadei F0279;Rhodobacter capsulatus SB 1003;Rhodobacter capsulatus R121;Rhodobacter capsulatus DE442;Leptotrichia buccalis C-1013-b;Herbinix hemicellulosilytica;[Eubacterium]rectale;Eubacteriaceae bacterium CHKCI004;Blautia sp.Marseille-P2398;Leptotrichia sp.oral taxon 879 str.F0557;Lachnospiraceae bacterium NK4A144;Chloroflexus aggregans;Demequina aurantiaca;Thalassospira sp.TSL5-1;Pseudobutyrivibrio sp.OR37;Butyrivibrio sp.YAB3001;Blautia sp.Marseille-P2398;Leptotrichia sp.Marseille-P3007;Bacteroides ihuae;Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA;Listeria riparia;及びInsolitispirillum peregrinumからなる群より選択される生物体由来である、前記系。
- 前記C2c2エフェクタータンパク質が、L.wadei F0279またはL.wadei F0279(Lw2)C2c2エフェクタータンパク質である、請求項14に記載の系。
- 前記RNA-アプタマーがオクラトキシンA(OTA)を認識する、請求項1~15のいずれか1項に記載の系。
- 対応する標的分子に結合するように設計された前記1つ以上のガイドRNAが(合成)ミスマッチを含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の系。
- 前記ミスマッチが、前記標的分子におけるSNPまたは他の単一ヌクレオチド変異の上流または下流にある、請求項17に記載の系。
- 前記1つ以上のガイドRNAが、標的RNAもしくはDNA、またはRNA転写物のスプライスバリアントにおける単一ヌクレオチド多型を検出するように設計されている、請求項1~18のいずれか1項に記載の系。
- 前記1つ以上のガイドRNAが、疾患状態の診断用である1つ以上の標的分子に結合するように設計されている、請求項1~19のいずれか1項に記載の系。
- 前記疾患状態ががんである、請求項20に記載の系。
- 前記疾患状態が自己免疫疾患である、請求項21に記載の系。
- 前記疾患状態が、感染症である、請求項20に記載の系。
- 前記感染症が、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物によって引き起こされる、請求項23に記載の系。
- 前記感染症がウイルス感染症である、請求項24に記載の系。
- 前記ウイルス感染がDNAウイルスによって引き起こされる、請求項25に記載の系。
- 前記DNAウイルスが、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科(ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む)、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科(アフリカ豚コレラウイルスを含む)、バキュロウイルス科、Cicaudaviridae、Clavaviridae、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、Hytrosaviridae、イリドウイルス科、Maseilleviridae、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科(Phycodnaviridae)、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科(シミアンウイルス40、JCウイルス、BKウイルスを含む)、ポックスウイルス科(牛痘及び天然痘を含む)、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスである、請求項26に記載の系。
- 前記ウイルス感染が、二本鎖RNAウイルス、プラスセンスRNAウイルス、マイナスセンスRNAウイルス、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせによって生じる、請求項25に記載の系。
- 前記ウイルス感染症が、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニウイルス科、オルソミクソウイルス科、もしくはデルタウイルスによって引き起こされる、請求項28に記載の系。
- 前記ウイルス感染症が、コロナウイルス、SARS、ポリオウイルス、ライノウイルス、A型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはD型肝炎ウイルスによって引き起こされる、請求項29に記載の系。
- 前記感染症が細菌感染症である、請求項24に記載の系。
- 上記細菌感染を引き起こす細菌が、Acinetobacter種、Actinobacillus種、Actinomycetes種、Actinomyces種、Aerococcus種、Aeromonas種、Anaplasma種、Alcaligenes種、Bacillus種、Bacteriodes種、Bartonella種、Bifidobacterium種、Bordetella種、Borrelia種、Brucella種、Burkholderia種、Campylobacter種、Capnocytophaga種、Chlamydia種、Citrobacter種、Coxiella種、Corynbacterium種、Clostridium種、Eikenella種、Enterobacter種、Escherichia種、Enterococcus種、Ehlichia種、Epidermophyton種、Erysipelothrix種、Eubacterium種、Francisella種、Fusobacterium種、Gardnerella種、Gemella種、Haemophilus種、Helicobacter種、Kingella種、Klebsiella種、Lactobacillus種、Lactococcus種、Listeria種、Leptospira種、Legionella種、Leptospira種、Leuconostoc種、Mannheimia種、Microsporum種、Micrococcus種、Moraxella種、Morganell種、Mobiluncus種、Micrococcus種、Mycobacterium種、Mycoplasm種、Nocardia種、Neisseria種、Pasteurelaa種、Pediococcus種、Peptostreptococcus種、Pityrosporum種、Plesiomonas種、Prevotella種、Porphyromonas種、Proteus種、Providencia種、Pseudomonas種、Propionibacteriums種、Rhodococcus種、Rickettsia種、Rhodococcus種、Serratia種、Stenotrophomonas種、Salmonella種、Serratia種、Shigella種、Staphylococcus種、Streptococcus種、Spirillum種、Streptobacillus種、Treponema種、Tropheryma種、Trichophyton種、Ureaplasma種、Veillonella種、Vibrio種、Yersinia種、Xanthomonas種、またはそれらの組み合わせである、請求項31に記載の系。
- 上記感染症が真菌によって引き起こされる、請求項24に記載の系。
- 上記真菌が、Aspergillus、Blastomyces、Candidiasis、Coccidiodomycosis、Cryptococcus neoformans、Cryptococcus gatti、sp.Histoplasma sp.(例えば、Histoplasma capsulatum)、Pneumocystis sp.(例えば、Pneumocystis jirovecii)、Stachybotrys(例えば、Stachybotrys chartarum)、Mucroymcosis、Sporothrix、真菌眼感染白癬、Exserohilum、Cladosporium、Geotrichum、Saccharomyces、Hansenula種、Candida種、Kluyverommyces種、Debaryomyces種、Pichia種、Penicillium種、Cladosporium種、Byssochlamys種またはそれらの組み合わせである、請求項33に記載の系。
- 上記感染症が原生動物によって引き起こされる、請求項24に記載の系。
- 上記原生動物がEuglenozoa、Heterolobosea、Diplomonadida、Amoebozoa、Blastocystic、Apicomplexa、またはそれらの組み合わせである、請求項35に記載の系。
- 上記感染症が寄生生物によって引き起こされる、請求項24に記載の系。
- 上記寄生生物が、Trypanosoma cruzi(シャーガス病)、T.brucei gambiense、T.brucei rhodesiense、Leishmania braziliensis、L.infantum、L.mexicana、L.major、L.tropica、L.donovani、Naegleria fowleri、Giardia intestinalis(G.lamblia、G.duodenalis)、canthamoeba castellanii、Balamuthia madrillaris、Entamoeba histolytica、Blastocystic hominis、Babesia microti、Cryptosporidium parvum、Cyclospora cayetanensis、Plasmodium falciparum、P.vivax、P.ovale、P.malariae、及びToxoplasma gondii、またはそれらの組み合わせである、請求項37に記載の系。
- 標的RNA分子を増幅するための前記試薬が、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)、ループ媒介等温増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、ニッキング酵素増幅反応(NEAR)、PCR、複数置換増幅(MDA)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、または分岐増幅法(RAM)を含む、請求項1~38のいずれか1項に記載の系。
- 濃縮CRISPR系をさらに含み、前記濃縮CRISPR系が、検出CRISPR系による検出の前に対応する標的分子に結合するように設計されている、請求項1~39のいずれか1項に記載の系。
- 前記濃縮CRISPR系が、触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質を含む、請求項40に記載の系。
- 前記触媒的に不活性なCRISPRエフェクタータンパク質が、触媒的に不活性なC2c2である、請求項41に記載の系。
- 前記濃縮CRISPRエフェクタータンパク質がタグをさらに含み、前記タグを使用して、濃縮CRISPRエフェクター系をプルダウンするか、または前記濃縮CRISPR系を固体基板に結合する、請求項40~42のいずれか1項に記載の系。
- 前記固体基質がフローセルである、請求項43に記載の系。
- 各個々の個別のボリュームが、請求項1~44のいずれか1項に記載のCRISPR系を含む、1つ以上の個々の個別のボリュームを含む診断デバイス。
- 各個々の個別のボリュームが、核酸増幅試薬をさらに含む、請求項45に記載のデバイス。
- 前記標的分子が標的DNAであり、かつ前記個々の個別のボリュームが、標的DNAに結合し、かつRNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含む、請求項45に記載のデバイス。
- 前記個々の個別のボリュームが液滴である、請求項45~47のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記個々の個別ボリュームが固体基板上に定義されている、請求項45~48のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記個々の個別のボリュームがマイクロウェルである、請求項49に記載のデバイス。
- 前記個々の個別のボリュームが、基板上に定義されたスポットである、請求項45~47のいずれか1項に記載の診断デバイス。
- 前記基板が可塑性材料基板である、請求項51に記載のデバイス。
- 前記可塑性材料の基板が紙の基板または可塑性ポリマーベースの基板である、請求項52に記載のデバイス。
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって:
試料または試料のセットを1つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、前記個々の個別ボリュームは請求項1~44のいずれか1項に記載のCRISPR系を含むことと;
1つ以上の標的分子への前記1つ以上のガイドRNAの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすることと;
前記1つ以上のガイドRNAの前記1つ以上の標的分子への結合を介してCRISPRエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここで、前記CRISPRエフェクタータンパク質を活性化すると、四重鎖を含むRNAアプタマーが改変され、その結果前記四重鎖の前記酵素活性が不活性化されることと;
前記酵素活性を検出することであって、ここで、閾値未満の検出は、前記試料中の1つ以上の標的分子の存在を示すことと、を含む、前記方法。 - 前記標的分子が標的DNAであり、前記方法が、前記標的DNAを、RNAポリメラーゼ部位を含むプライマーと結合させることをさらに含む、請求項54に記載の方法。
- 試料試料RNAまたは前記トリガーRNAを増幅することをさらに含む、請求項54~55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAを増幅することが、NASBAによる増幅を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記RNAを増幅することがRPAによる増幅を含む、請求項56に記載の方法。
- 前記試料が生物学的試料または環境試料である、請求項54~58のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料が、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体の分泌物、浸出液、滲出液(例えば、膿瘍または感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られた液体)、または関節(例えば、正常な関節または疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎に罹患した関節)から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブである、請求項59に記載の方法。
- 前記環境試料が、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られる、請求項59に記載の方法。
- 前記1つ以上のガイドRNAが、標的RNAもしくはDNA、またはRNA転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計されている、請求項54~61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のガイドRNAが、疾患状態について診断的である1つ以上の標的分子に結合するように設計されている、請求項54~62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のガイドRNAが、無細胞核酸に結合するように設計されている、請求項54~63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記病状が、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患である、請求項63記載の方法。
- 試料中の標的核酸を検出する方法であって:
試料を請求項1~44のいずれか1項に記載の核酸検出系と接触させること;及び
前記接触した試料を側方流動イムノクロマトグラフアッセイに適用することを、含む、前記方法。 - 前記四重鎖の前記酵素活性が、前記試料中で色シグナルを生じる、請求項54に記載の方法。
- 前記四重鎖の前記酵素活性の前記不活性化が、前記標的分子の存在の指標である、色シグナルの喪失を生じる、請求項67に記載の方法。
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