JP2021511795A - Ｃｒｉｓｐｒエフェクター系に基づく診断 - Google Patents

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Abstract

本明細書に開示された実施形態は、ＲＮＡ標的化エフェクターを利用して、アトモル感度のＣＲＩＳＰＲベースのロバストな診断を提供した。本明細書に開示されている実施形態は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を、同等のレベルの感度で検出し得、かつ単一塩基対の相違に基づいて非標的から標的を識別し得、かつ比色シフト及び／または蛍光シフトによる検出を含む。さらに本明細書に開示される実施形態は、便利な分布およびポイントオブケア（ＰＯＣ）アプリケーションのために凍結乾燥形式で調製され得る。このような実施形態は、例えば、ウイルス検出、細菌株分類、高感度遺伝子型判定、及び疾患関連無細胞ＤＮＡの検出など、ヒトの健康における複数のシナリオで有用である。【選択図】図１

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年１月２９日出願の米国仮出願第６２／６２３，５３１号の恩典を主張する。上記で特定した出願の全内容は、全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
電子的配列表への参照
電子的配列表（ＢＲＯＤ−２５０５ＷＰ．ＳＴ２５．ｔｘｔ”；サイズは２．７メガバイトであり、２０１９年１月２８日に作製された）の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の助成を受けた研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号ＭＨ１００７０６、及びＭＨ１１００４９、ならびに防衛威嚇緩和機関によって付与された認可番号ＨＤＴＲＡ１−１４−１−０００６の下で政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本明細書に開示される主題は、一般に、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系の使用に関連する迅速診断に関する。
核酸は、生物学的情報の普遍的な特徴である。ポータブルプラットフォームで、高感度で、かつ単一塩基の特異性を有する核酸を迅速に検出する能力は、多くの疾患の診断及びモニタリングに革命をもたらし、貴重な疫学情報を提供し、一般化可能な科学的ツールとして役立つことが可能となる。核酸を検出するための多くの方法が開発されているが（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｕｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．，２００６）、それらは必然的に感度、特異性、単純さ、速度の間のトレードオフに悩まされる。例えば、ｑＰＣＲアプローチは敏感であるが高価であり、複雑な機器に依存しており、使用できるのは実験室環境での高度な訓練を受けたオペレーターに限定されている。等温核酸増幅とポータブルプラットフォームを組み合わせた新しい方法（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）などの他のアプローチは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）環境で高い検出特異性を提供するが、感度が低いせいで、用途がやや限られている。核酸診断がさまざまなヘルスケアの適用にますます適切なものになると、低コストで高い特異性と感度を提供する検出技術は、臨床研究と基礎研究の両方の環境で非常に有用になる。
一態様では、本発明は、エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含む検出ＣＲＩＳＰＲ系と；酵素活性を有する四重鎖を含む核酸アプタマーとを備える、核酸検出系を提供する。いくつかの実施形態では、この酵素活性は、ペルオキシダーゼ活性であってもよい。いくつかの実施形態では、この系は、核酸増幅試薬をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、四重鎖の酵素活性は、試料中に色シグナルを生成する。いくつかの実施形態では、四重鎖の酵素活性の不活性化は、色シグナルの喪失をもたらし、色シグナルの喪失は、標的分子の存在を示す。
標的分子は標的ＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、この系は、標的ＤＮＡに結合し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ系のエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含んでもよい。１つ以上のＨＥＰＮドメインは、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含んでもよい。ＲｘｘｘＨモチーフは、Ｒ｛Ｎ ／ Ｈ／Ｋ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、またはＹであってもよく、Ｘ２は独立して、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬであってもよく、Ｘ３は独立してＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ２ｃ２は、Ｃａｓ１遺伝子の２０ｋｂ以内であってもよい。
Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａからなる群より選択される属の生物体に由来し得る。
Ｃ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質は、以下からなる群より選択される生物体に由来し得る：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ；ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０；ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１７９；［クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）］ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７（２番目のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）；Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９−０３１７；リステリア科細菌ＦＳＬ Ｍ６−０６３５；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ−１０１３−ｂ；Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ；［真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）］ｒｅｃｔａｌｅ；真正細菌科細菌ＣＨＫＣＩ００４；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．口頭分類８７９ ｓｔｒ．Ｆ０５５７；ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１４４；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ；Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ；Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＴＳＬ５−１；Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＯＲ３７；Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＹＡＢ３００１；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｈｕａｅ；ポルフィロモナダ科細菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｒｉｐａｒｉａ；及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
特定の実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｌ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９であっても、またはＬ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸アプタマーは、オクラトキシンＡ（ＯＴＡ）を認識し得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、（合成）ミスマッチを含む対応する標的分子に結合するように設計されてもよい。このミスマッチは、上記標的分子におけるＳＮＰまたは他の一塩基変異の上流であっても、または下流であってもよい。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計される。１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断となる１つ以上の標的分子に結合するように設計され得る。いくつかの実施形態では、疾患状態はがんであり得る。いくつかの実施形態では、疾患状態は自己免疫疾患であり得る。いくつかの実施形態では、疾患状態は感染症であり得る。感染は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物によって引き起こされ得る。
特定の実施形態では、感染症はウイルス感染症であってもよい。ウイルス感染は、ＤＮＡウイルスによって生じる。ＤＮＡウイルスは、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、シカウダウイルス科、クラバウイルス科、コルチコウイルス科、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科、イリドウイルス科、マセイレウイルス科（Ｍａｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ）、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘及び天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスであり得る。
ウイルス感染は、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、もしくはそれらの組み合わせによって引き起こされ得る。
ウイルス感染は、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニウイルス科、オルソミクソウイルス科、もしくはデルタウイルスによって引き起こされ得る。
ウイルス感染は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスによって引き起こされ得る。
いくつかの実施形態では、感染症は細菌感染症である。細菌感染を引き起こす細菌は、アシネトバクター種、アクチノバシラス種、アクチノミセス種、アクチノマイセート種、アクチノマイセス種、アエロコッカス種、アエロモナス種、アナプラズマ種、アルカリゲネス種、バチルス種、バクテリオデス種、バルトネラ種、ビフィドバクテリウム種、ボルデテラ種、ボレリア種、ブルセラ種、バークホルデリア種、カンピロバクター種、カプノサイトファガ種、クラミジア種、シトロバクター種、コクシエラ種、コリネバクテリウム種、クロストリジウム種、エイケネラ種、エンテロバクター種、エシェリキア種、エンテロコッカス種、エールリヒア種、表皮菌種、エリシュペロトリクス種、ユーバクテリウム種、フランシセラ種、フソバクテリウム種、ガルドネレラ種、ゲメラ種、ヘモフィルス種、ヘリコバクター種、キンゲラ種、クレブシエラ種、ラクトバシラス種、ラクトコッカス種、リステリア種、レプトスピラ種、レジオネラ種、レプトスピラ種、ロイコノストック種、マンハイミア種、ミクロスポラム種、ミクロコッカス種、モラクセラ種、モルガネル種、モビランカス種、ミクロコッカス種、マイコバクテリウム種、マイコプラズマ種、ノカルジア種、ナイセリア種、パスツレラ種、ペディオコッカス種、ペプトストレプトコッカス種、ピチロスポラム種、プレシオモナス種、プレボテラ種、ポルフィロモナス種、プロテウス種、プロビデンシア種、シュードモナス種、プロピオニバクテリウム種、ロドコッカス種、リケッチア種、ロドコッカス種、セラチア種、ステノトロフォモナス種、サルモネラ種、セラチア種、シゲラ種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、スピリルム種、ストレプトバシラス種、トレポネーマ種、トロフェリマ種、トリコフィトン（白癬菌）種、ウレアプラズマ種、ベイロネラ種、ビブリオ種、エルシニア種、キサントモナス種、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、感染症は真菌によって引き起こされ得る。真菌は、アスペルギルス、ブラストミセス、カンジダ症、コクシジオミコーシス、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉ，ｓｐ．Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．（例えば、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ（例えば、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、Ｍｕｃｒｏｙｍｃｏｓｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、真菌性眼感染症白癬、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ハンゼヌラ種、カンジダ種、クルイウェロマイセス種、デバリオマイセス種、ピチア種、ペニシリウム種、クラドスポリウム種、ビソクラミス種またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、感染は原生動物によって引き起こされ得る。原生動物は、ユーグレノゾア、ヘテロロボセア、ディプロモナジダ、アメーボエゾア、割球、アピコンプレクサ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
感染症は、寄生生物によって引き起こされる可能性がある。寄生生物は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ、Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、ｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ分子を増幅するための試薬は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ＰＣＲ、複数置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または分岐増幅法（ＲＡＭ）を含む。
この系は、濃縮ＣＲＩＳＰＲ系をさらに含んでもよく、この濃縮ＣＲＩＳＰＲ系は、検出ＣＲＩＳＰＲ系による検出の前に、対応する標的分子と結合するように設計される。濃縮ＣＲＩＳＰＲ系は、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含んでもよい。触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性なＣ２ｃ２であり得る。
濃縮ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、タグをさらに含んでもよく、このタグを使用して、濃縮ＣＲＩＳＰＲエフェクター系をプルダウンするか、または濃縮ＣＲＩＳＰＲ系を固体基材に結合する。いくつかの実施形態では、固体基材はフローセルであってよい。
別の態様では、本発明は、１つ以上の個々の別個のボリュームを含む診断デバイスを提供し、各々の個々の別個のボリュームは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含む。
いくつかの実施形態では、各個別のボリュームは、核酸増幅試薬をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的ＤＮＡであってもよく、この個々の個別のボリュームは、標的ＤＮＡに結合し、かつＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態では、個々の個別のボリュームは液滴であってもよい。いくつかの実施形態では、この個々の個別のボリュームは固体基材上に定義される。いくつかの実施形態では、この個々の個別のボリュームはマイクロウェルである。いくつかの実施形態では、この個々の個別ボリュームは基材上に定義されたスポットである。いくつかの実施形態では、この基材は、可塑性材料基材であり得る。いくつかの実施形態では、この可塑性材料基材は、紙基材であっても、または可塑性ポリマーベースの基材であってよい。
さらに別の態様では、本発明は、試料中の標的の核酸を検出するための方法を提供し、この方法は以下を含む：試料または試料のセットを、１つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含むこと；１つ以上の標的分子への１つ以上のガイドＲＮＡの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすること；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると四重鎖を含むＲＮＡアプタマーの改変を生じ、その結果四重鎖の酵素活性が不活性化されることと；酵素活性を検出することであって、この閾値未満の検出が、試料中の１つ以上の標的分子の存在を示すこと。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＮＡポリメラーゼ部位を含むプライマーを用いて標的ＤＮＡを結合することをさらに含み得る。
この方法は、試料ＲＮＡまたはトリガーＲＮＡを増幅することをさらに含み得る。ＲＮＡの増幅は、ＮＡＳＢＡによる増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの増幅は、ＲＰＡによる増幅を含み得る。
この試料は、生物学的試料であっても、または環境試料であってもよい。
この生物学的試料とは、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の分泌体液、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症部位の任意の他の部位から得られた液体）、または関節（例えば、正常な関節またはリウマチ関節炎、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎などの疾患に罹患した関節）から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであり得る。
環境試料は、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られてもよい。
１つ以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計され得る。１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断となる１つ以上の標的分子に結合するように設計され得る。
１つ以上のガイドＲＮＡは、無細胞核酸に結合するように設計され得る。
いくつかの実施形態において、疾患状態とは、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患であり得る。
さらに別の態様では、本発明は、試料を本明細書に記載の核酸検出系と接触させること、及び上記接触した試料を側方流動イムノクロマトグラフィーアッセイに適用することを含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。
Ｃ２ｃ２ベースのＣＲＩＳＰＲエフェクター系の例の概略図である。 （Ａ）Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ２遺伝子座の概略図を提供する。ＬｗＣ２ｃ２及びＬｓｈＣ２ｃ２系の代表的なｃｒＲＮＡ構造を示す。（配列番号１４２及び１４３）。（Ｂ）Ｃ２ｃ２活性のインビボ細菌アッセイの概略図である。プロトスペーサーを、アンピシリン耐性プラスミドのベータ−ラクタマーゼ遺伝子の上流にクローニングし、この構築物を、標的化スペーサーまたは非標的化スペーサーと組み合わせてＣ２ｃ２を発現するＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。成功した形質転換体を、活性を定量化するためにカウントする。（Ｃ）ＬｗＣ２ｃ２及びＬｓｈＣ２ｃ２のインビボ活性の定量。（ｎ＝２の生物学的複製；バーは平均±標準誤差を表す）（Ｄ）ＬｗＣ２ｃ２の最終サイズ排除ゲルろ過。（Ｅ）ＬｗＣ２ｃ２段階的精製のクーマシーブルー染色アクリルアミドゲル。（Ｆ）様々なＰＦＳ標的に対するＬｗＣ２ｃ２の活性。ＬｗＣ２ｃ２は、スペーサーに隣接する可変３’ＰＦＳの蛍光ＲＮＡを標的とし、反応産物を変性ゲルで可視化した。ＬｗＣ２ｃ２は、Ｇ ＰＦＳよりもわずかに優先性を示す。 １μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、及び１ｎｇの標的を用いる異なる希釈で、４つの異なる量のタンパク質／ｃｒＲＮＡ（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）を用い、ｃｒＲＮＡの２つのプール、ｃｒＲＮＡなしの条件、技術的な複製物で、（９６＋４８）＊２＝２８８反応において、５分間隔で３時間にわたって測定した、ある例のマスキング構築物の検出を示す。 １μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、及び１ｎｇの標的を用いる異なる希釈で、４つの異なる量のタンパク質／ｃｒＲＮＡ（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）を用い、ｃｒＲＮＡの２つのプール、ｃｒＲＮＡなしの条件、技術的な複製物で、（９６＋４８）＊２＝２８８反応において、５分間隔で３時間にわたって測定した、ある例のマスキング構築物の検出を示す。 １μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、及び１ｎｇの標的を用いる異なる希釈で、４つの異なる量のタンパク質／ｃｒＲＮＡ（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）を用い、ｃｒＲＮＡの２つのプール、ｃｒＲＮＡなしの条件、技術的な複製物で、（９６＋４８）＊２＝２８８反応において、５分間隔で３時間にわたって測定した、ある例のマスキング構築物の検出を示す。 １μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、及び１ｎｇの標的を用いる異なる希釈で、４つの異なる量のタンパク質／ｃｒＲＮＡ（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）を用い、ｃｒＲＮＡの２つのプール、ｃｒＲＮＡなしの条件、技術的な複製物で、（９６＋４８）＊２＝２８８反応において、５分間隔で３時間にわたって測定した、ある例のマスキング構築物の検出を示す。 特定の例示的な実施形態による、マスキング構築物及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を使用する例示的な検出スキームの概略図を提供する。 ガイドＲＮＡの異なるプールを使用して標的を検出した場合の蛍光の経時変化を示す一連のグラフを示す。 ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のさまざまな濃度での標的ＲＮＡの異なる希釈にわたって検出された正規化された蛍光を示すグラフを示す。 ＮＡＳＢＡ増幅反応の一般的なステップを示す概略図である。 ３つの異なるプライマーセットを使用してＮＡＳＢＡによって増幅され、次いで消光された蛍光プローブを使用してＣ２ｃ２コラテラル検出に供された、核酸標的ｓｓＲＮＡ１の検出を示すグラフを示す（ｎ＝２技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。 レンチウイルス標的ＲＮＡの存在を検出するためにコラテラル効果が使用され得ることを示すグラフを示す。 コラテラル効果及びＮＡＳＢＡがａＭ濃度で種を検出し得ることを示すグラフを示す。 コラテラル効果及びＮＡＳＢＡが低濃度試料を迅速に識別することを実証するグラフを示す。 特定の時点での正規化された蛍光が試料入力濃度の予測となることを示す。増幅なしのＣａｓ１３ａ検出からの蛍光測定は、入力ＲＮＡ濃度と相関している（ｎ＝２の生物学的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。 反応に関与する成分を示す、ＲＰＡ反応の略図を示す。 ＳＨＥＲＬＯＣＫの概略図であり、ＲＰＡまたはＲＴ−ＲＰＡステップを適宜組み込んで、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の両方の検出を示している概略図を示す。標的ＲＮＡが認識されると、コラテラル効果により、Ｃ２ｃ２が切断レポーターを切断し、蛍光が発生する。単一分子量のＲＮＡまたはＤＮＡは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を介してＤＮＡに増幅され、転写されてＲＮＡを生成し、これが次にＣ２ｃ２によって検出される。 Ｃ２ｃ２コラテラル検出を介して検出されたｓｓＲＮＡ標的の概略図を示す（配列番号１４４及び１４５）。 ＲＰＡを使用した単一分子ＤＮＡ検出を示す一連のグラフを示す（すなわち、Ｃ２ｃ２追加から１５分以内）。 Ｔ７ポリメラーゼをＲＰＡ反応に混合することがＤＮＡ検出に悪影響を与えることを実証する一連のグラフを示す。 ポリメラーゼをＲＰＡ反応に混合してもＤＮＡ検出に悪影響を及ぼさないことを実証する一連のグラフを示す。 ＲＰＡ、Ｔ７転写、及びＣ２ｃ２検出反応が適合しており、同時にインキュベートされた場合に単一分子検出を達成することを実証するグラフを示す（ｎ＝２の技術的複製、バーは、平均±標準誤差を表す）。 迅速ＲＰＡ−ＲＮＡ時間インキュベーションの有効性を示す一連のグラフを示す。 Ｔ７ポリメラーゼ量の増大がＲＰＡ−ＲＮＡの感度を増大させることを示す一連のグラフを示す。 １．５倍酵素によるワンポット反応を使用したＲＰＡ−ＤＮＡ検出アッセイからの結果を実証している一連のグラフを示す。単一分子（２ａＭ）の検出が、３０分という早い段階で達成された。 ＲＰＡ−ＤＮＡワンポット反応が、入力濃度と比較して蛍光の定量的な減少を示すことを実証している一連のグラフを示す。近似曲線は、標的入力濃度と出力蛍光との間の関係を明らかにしている。 （Ａ）増幅なしのＲＮＡのＣ２ｃ２検出が、５０ｆＭまで低下した濃度でｓｓＲＮＡ標的を検出し得ること（ｎ＝２技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）、及び（Ｂ）ＲＰＡ−Ｃ２ｃ２反応が、単一分子ＤＮＡ検出を検出し得ること（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）を実証している一連のグラフを実証している一連のグラフを示す。 ある特定の例示的な実施形態に従って生成されたＣ２ｃ２シグナルが、ペーパー基材上の２０ｐＭの標的を検出し得ることを実証している一連のグラフを示す。 特異的なＲＮＡｓｅ阻害剤がペーパー上のバックグラウンドシグナルを取り除き得ることを示すグラフを示す。 ガラス繊維基材上のある特定の例示的な実施形態による系を使用した検出を示す一連のグラフである。 （Ａ）ある特定の例示的な実施形態によるジカＲＮＡ検出の概略図を提供する一連のグラフを示す。レンチウイルスは、Ｃ２ｃ２コラテラル検出の標的となるジカＲＮＡまたは相同デングＲＮＡ画分と一緒にパッケージ化された。４８時間後に培地を回収し、熱溶解、ＲＴ−ＲＰＡ、及びＣ２ｃ２検出に供した。（Ｂ）ＲＴ−ＲＡＰ−Ｃ２ｃ２検出によって、ジカレンチウイルス粒子の高感度検出が可能である（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｃ）ある特定の例示的な実施形態による、ペーパー上で凍結乾燥されたＣ２ｃ２を使用するジカＲＮＡ検出の概略図である。（Ｄ）ペーパーベースのアッセイによって、ジカレンチウイルス粒子の高感度検出が可能である（ｎ−４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＊＊：ｐ＜０．０１、バーは、平均±標準誤差を表す）。 ヒト血清から単離されたジカＲＮＡのＣ２ｃ２検出の略図を実証している一連のグラフを示す（Ａ）。血清中のジカＲＮＡを、逆転写、ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解、ｃＤＮＡのＲＰＡ、及びＣ２ｃ２検出に供する。（Ｂ）Ｃ２ｃ２は、ヒトジカ血清試料の高感度検出が可能である。示されているジカＲＮＡの濃度は、ｑＰＣＲによって検証した（ｎ＝４の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。 凍結乾燥したＣ２ｃ２が低フェムトモル範囲のｓｓＲＮＡ１を高感度で検出し得ることを実証している一連のグラフを示す（Ａ）。Ｃ２ｃ２は、ペーパー上で、２００ｐＭの液体形態（Ｂ）または凍結乾燥形態（Ｃ）のｓｓＲＮＡ１標的を迅速に検出することができる。この反応により、溶液（Ｄ）（ｎ＝３）及び凍結乾燥形態（Ｅ）（ｎ＝３）の合成ジカＲＮＡ画分の高感度検出が可能である。（Ｆ）入力濃度と検出された蛍光との間に有意な相関関係を示す、ヒトジカｃＤＮＡ検出の定量曲線である。（Ｇ）さまざまな量のヒト血清の存在下で行われたｓｓＲＮＡ１のＣ２ｃ２検出（特に明記されていない限り、ｎ＝２の技術的複製。バーは平均±標準誤差を表す）である。 （Ａ）ユニバーサルＶ３ ＲＰＡプライマーセットを使用した細菌ゲノムからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＣ２ｃ２検出の概略図、及びある特定の例示的な実施形態により実施したアッセイを使用してＥ．ｃｏｌｉ（Ｂ）またはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｃ）のｇＤＮＡの高感度かつ特異的な検出を実現する能力（ｎ＝４の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。Ｅｃ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｐ：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｔ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。 Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの４つの異なる臨床分離株からの２つの異なるカルバペネム耐性遺伝子（ＫＰＣ及びＮＤＭ−１）の検出（Ａ）、及びカルバペネム耐性遺伝子の検出（Ｂ）（パートＡ）は、ＫＰＣとＮＤＭ−１のｃｒＲＮＡアッセイの間のシグナルの比率として正規化される（ｎ＝２の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）ことを実証している一連のグラフを示す。 Ｃ２ｃ２は単一のミスマッチに敏感ではないが、追加のミスマッチを有するｃｒＲＮＡをロードした場合、標的の単一ヌクレオチドの相違を区別し得ることを実証している（Ａ）一連のグラフを示す。ｓｓＲＮＡ標的１〜３は、１１個のｃｒＲＮＡで検出され、１０個のスペーサーがｃｒＲＮＡのさまざまな位置に合成ミスマッチを含んでいた。ミスマッチのスペーサーは、標的１の切断の減少を示さなかったが、ミスマッチ標的２及び３の切断の阻害を示した（配列番号１４６〜１５９）。（Ｂ）合成ミスマッチのある単一塩基特異的スペーサーの合理的な設計のプロセスを示す概略図である。合成ミスマッチは、目的のＳＮＰまたは塩基（配列番号１６０〜１６４）の近くに配置される。（Ｃ）株ＳＮＰの非常に特異的な検出により、短縮された（２３ヌクレオチド）ｃｒＲＮＡを使用したＣ２ｃ２検出を使用して、１ヌクレオチドだけ異なるジカのアフリカとアメリカのＲＮＡ標的の相違を区別し得る（ｎ＝２の技術的複製、片側スチューデントｔ検定、＊：ｐ＜０．０５；＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。 以下を示す一連のグラフを示す：（Ａ）ジカ株の標的領域の模式図、及び検出に使用されるｃｒＲＮＡ配列（配列番号１６５〜１７０）。標的のＳＮＰは、赤または青で強調表示され、ガイド配列の合成のミスマッチは赤で表示される。（Ｂ）ＳＮＰ株の非常に特異的な検出により、ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用してジカのアフリカとアメリカのＲＮＡ標的の識別が可能になる（ｎ＝２の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）（配列番号１７１〜１７６）。（Ｃ）デング熱株標的領域及び検出に使用されるｃｒＲＮＡ配列の概略図。標的のＳＮＰは、赤または青で強調表示され、ガイド配列の合成のミスマッチは赤で表示される。（Ｄ）ＳＮＰ株の特異性の高い検出により、ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用したデング１株と３株の間のＲＮＡ標的の識別が可能になる（ｎ＝２技術的複製、両側スチューデントｔ検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１：バーは平均±標準誤差を表す）。 Ｃ２ｃ２で検出されたヒトＳＮＰの位置を示す（Ａ）サーコスプロットを示す一連のグラフを示す。（Ｂ）ある特定の例示的な実施形態に従って行われたアッセイは、ヒトＳＮＰを区別し得る。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ヒトゲノムの４つの異なるＳＮＰ部位で４つの異なる個体を正しく遺伝子型決定し得る。各個体の遺伝子型及び対立遺伝子検知ｃｒＲＮＡの識別は、各プロットの下に注釈が付けられている（ｎ＝４の技術的複製；両側スチューデントｔ検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｃ）ある特定の例示的な実施形態によるｃｆＤＮＡの検出（がんの変異の無細胞ＤＮＡ検出など）のプロセスの概略図である。（Ｄ）ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅを検出するためのｃｒＲＮＡ配列の例である（配列番号１７７〜１８２）。無細胞ＤＮＡのがんの変異を分析した２つのゲノム遺伝子座の配列である。ＳＮＰが青で強調表示されている標的ゲノム配列、及び赤で着色された合成ミスマッチのある変異／野生型検知ｃｒＲＮＡ配列が示されている。 Ｃ２ｃ２がＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ（Ａ）またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（Ｂ）マイナー対立遺伝子由来の偽無細胞ＤＮＡ試料中で変異マイナー対立遺伝子を検出し得ることを実証している一連のグラフを示す（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、バーは±標準誤差を表す）。 アッセイが、ｒｓ５０８２で遺伝子型を識別し得ること（Ａ）を実証している一連のグラフを示す（ｎ＝４の技術的複製、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｂ）アッセイが、遠心分離、変性、煮沸した唾液に直接由来するｇＤＮＡのｒｓ６０１３３８にある遺伝子型を、識別し得ることを実証している一連のグラフを示す（ｎ＝３の技術的複製、＊、ｐ＜０．０５、バーは平均±標準誤差を表す）。 （Ａ）単一のミスマッチのみがｓｓＤＮＡ１とは異なる標的のバックグラウンドでｓｓＤＮＡ１に対して実行される例示的な実施形態の概略図を提供する。（Ｂ）アッセイは、ミスマッチのバックグラウンド（ｓｓＤＮＡからの単一のミスマッチのみが異なる標的）の存在下でｓｓＤＮＡ１の単一ヌクレオチド特異性検出を実現する。さまざまな濃度の標的ＤＮＡが、１つのミスマッチを有する過剰なバックグラウンドＤＮＡと組み合わされ、アッセイによって検出された。 異なる色素Ｃｙ５を有するマスキング構築物もまた効果的な検出を可能にすることを示すグラフである。 金ナノ粒子比色分析に基づくアッセイの概略図である。ＡｕＮＰは、ＤＮＡリンカーとＲＮＡ架橋との組み合わせを使用して凝集される。ＲＮａｓｅ活性を加えると、ｓｓＲＮＡ架橋が切断され、ＡｕＮＰが放出され、特徴的な色が赤にシフトされる。 ５２０ｎｍでの分散したナノ粒子の色のシフトを検出する能力を示すグラフである。ナノ粒子は、図４３に示す例示的な実施形態に基づいており、これは、さまざまな濃度でＲＮａｓｅ Ａを追加して分散させた。 ＲＮａｓｅ比色試験が定量的であることを示す一連のグラフである。 分散したナノ粒子の色のシフトが視覚的に検出可能であることを示すマイクロウェルプレートの写真である。 比色シフトがペーパーの基材上に見えることを実証している写真である。この試験は、ガラス繊維９３４−ＡＨで３７℃で１０分間実行された。 タンパク質または小分子の検出のためのある特定の例示的な実施形態による、コンフォメーションスイッチングアプタマーの概略図である（Ａ）。ライゲーションされた産物（Ｂ）は、ＲＮＡ標的化エフェクターの完全な標的として使用され、ＲＮＡ標的化エフェクターは、ライゲーションされていない入力産物（配列番号２０２及び４２４）を検出し得ない。 アプタマーベースのライゲーションがＲＰＡ検出可能な基質を作り出し得ることを示すゲルの画像である。アプタマーを様々なレベルのトロンビンとインキュベートし、次にプローブとライゲーションした。ライゲーションされた構築物を、３分間のＲＰＡ反応の鋳型として使用した。５００ｎＭのトロンビンは、バックグラウンドよりも大幅に高いレベルの増幅標的を有する。 選択されたＣ２ｃ２オルソログのＨＥＰＮドメインのアミノ酸配列（配列番号２０４〜２３３）を示す。 ＲＰＡ増幅によるＲＮＡのＣａｓ１３ａ検出（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）は、Ｃａｓ１３ａのみよりも感度が高く、約２ａＭまで低下した濃度でｓｓＲＮＡ標的を検出し得る（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。 Ｃａｓ１３ａ検出は、ウイルス性及び細菌性病原体を検出するために使用され得る。（Ａ）ヒトの臨床試料から分離されたＺＩＫＶ ＲＮＡのＳＨＥＲＬＯＣＫ検出の概略図。（Ｂ）ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ヒトＺＩＫＶ陽性血清（Ｓ）または尿（Ｕ）試料の高感度検出が可能である。示されたＺＩＫＶ ＲＮＡのおおよその濃度は、ｑＰＣＲによって決定した（ｎ＝４の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す、ｎ．ｄ．：検出されず）。 ＮＡＳＢＡによるｓｓＲＮＡ１の検出とプライマーセット２（図１１の）及びＳＨＥＲＬＯＣＫとの比較（ｎ＝２の技術的な複製、バーは平均±標準誤差を表す）。 ＲＰＡ及び単一反応ＳＨＥＲＬＯＣＫによる核酸増幅である。（Ａ）図１Ｃで使用した希釈用のｓｓＲＮＡ１のデジタルドロップレットＰＣＲ定量である。ｄｄＰＣＲの結果に基づいて調整された希釈液の濃度を、棒グラフの上に示す。（Ｂ）図１Ｄで使用した希釈用のｓｓＤＮＡ１のデジタルドロップレットＰＣＲ定量である。ｄｄＰＣＲの結果に基づいて調整された希釈液の濃度を、棒グラフの上に示す。（Ｃ）ＲＰＡ、Ｔ７転写、及びＣａｓ１３ａ検出反応は一緒に使用でき、同時にインキュベートした場合にＤＮＡ ２の単一分子検出を実現する（ｎ＝３技術的複製、両側スチューデントｔ検定、ｎｓ：有意ではない；＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す）。 ＳＨＥＲＬＯＣＫ及び他の高感度な核酸検出ツールの比較。（Ａ）デジタルドロップレットＰＣＲによるｓｓＤＮＡ１希釈系列の検出分析である（ｎ＝４の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、ｎｓ：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、赤い線は平均を表し、バーは平均±標準誤差を表す。測定されたコピー／μＬが１０−１未満の試料は示していない）。（Ｂ）定量ＰＣＲによるｓｓＤＮＡ１希釈系列の検出分析である（ｎ＝１６の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、ｎｓ：有意ではない、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、赤線は平均を表し、バーは平均±標準誤差試料を表す。相対シグナルが１０−１０未満の試料は示していない）。（Ｃ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩを用いるＲＰＡを使用したｓｓＤＮＡ１希釈系列の検出分析である（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；赤い線は平均を示し、バーは平均±標準誤差を示す。相対シグナルが１００未満の試料は示していない）。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用したｓｓＤＮＡ１希釈系列の検出分析である（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、赤い線は平均を表し、バーは、平均±標準誤差を示す。相対シグナルが１００未満の試料は示していない）。（Ｅ）４種類の検出方法に対する一連のｓｓＤＮＡ１希釈の変動係数（％）である。（Ｆ）４種類の検出方法の６ｅ２、６ｅ１、６ｅ０、及び６ｅ−１ ｓｓＤＮＡ１希釈液の平均変動係数（バーは平均±標準誤差を表す）。 臨床細菌分離株におけるカルバぺネム耐性の検出である。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの５つの臨床分離株及びＥ．ｃｏｌｉ対照由来の２つの異なるカルバペネム耐性遺伝子（ＫＰＣ及びＮＤＭ−１）の検出である（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、バーは平均±標準誤差を表す。ｎ．ｄ．：検出されない）。 短縮されたスペーサーと標的配列内の単一のミスマッチに対するＬｗＣａｓ１３ａの感度の特徴付けである。（Ａ）（Ｂ−Ｇ）で使用される短縮されたスペーサーｃｒＲＮＡ（配列番号４２５〜４３６）の配列である。また、ｓｓＲＮＡ１と２の配列も示されており、ｓｓＲＮＡ２は、赤で強調表示されている単一の塩基対が異なる。合成ミスマッチを含むｃｒＲＮＡは、ミスマッチの位置が赤く表示されている。（Ｂ）１から７の位置に合成ミスマッチがある２８ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１及び２のコラテラル切断活性である（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比である。特異性比は、オン標的のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）コラテラル切断のオフ標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）コラテラル切断に対する比率として計算される（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均値±標準誤差を示す）。（Ｄ）１から７の位置に合成ミスマッチがある２３ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１及び２のコラテラル切断活性である（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比である。特異性比は、オン標的のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）コラテラル切断のオフ標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）コラテラル切断に対する比率として計算される（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均値±標準誤差を示す）。（Ｆ）１から７の位置に合成ミスマッチがある２０ｎｔスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１及び２のコラテラル切断活性（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比である。特異性比は、オン標的のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）コラテラル切断のオフ標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）コラテラル切断に対する比率として計算される（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均値±標準誤差を示す）。 標的配列の変異に対する理想的な合成ミスマッチの位置の特定である。（Ａ）ｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２との間の変異を検出するための理想的な合成ミスマッチ位置を評価するための配列である（配列番号４３７〜４６２）。各標的で、色付き（赤）の位置に合成ミスマッチがあるｃｒＲＮＡを試験する。合成ミスマッチｃｒＲＮＡの各セットは、変異の位置がスペーサーの配列に対して位置がシフトするように設計されている。スペーサーは、変異がスペーサー内の３、４、５、及び６の位置で評価されるように設計されている。（Ｂ）さまざまな位置に合成ミスマッチがあるｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１及び２のコラテラル切断活性。スペーサー：標的二重鎖領域内の位置３、４、５、または６のいずれかに変異を有するｃｒＲＮＡの４つのセットがある（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｃ）（図５８Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比である。特異性比は、オン標的のＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）コラテラル切断とオフ標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）コラテラル切断の比率として計算される（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均値±標準誤差を表す）。 追加の遺伝子座でのＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定、及び煮沸した唾液からの直接的な遺伝子型決定である。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、遠心分離、変性、及び煮沸した唾液に直接由来するゲノムＤＮＡのｒｓ６０１３３８ ＳＮＰ部位にある遺伝子型の間を、識別し得る（ｎ＝４の技術的複製、両側スチューデントｔ検定、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．００１、バーは平均±標準誤差を表す）。 ヒトＳＮＰを正確に遺伝子型決定するための合成遺伝子型決定標準の開発である。（Ａ）ＰＣＲ増幅された遺伝子型標準と比較した４人の個体それぞれのｒｓ６０１３３８ ＳＮＰ部位でのＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定である（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｂ）ＰＣＲ増幅遺伝子型標準と比較した４人の個体それぞれのｒｓ４３６３６５７ ＳＮＰ部位でのＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定である（ｎ＝４の技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｃ）各個体のＳＨＥＲＬＯＣＫ結果とｒｓ６０１３３８ ＳＮＰ部位の合成標準間との間の計算されたｐ値のヒートマップである。ヒートマップは、対立遺伝子を検知するｃｒＲＮＡごとに示される。ヒートマップのカラーマップは、無意味（ｐ＞０．０５）が赤で有意（ｐ＜０．０５）が青になるようにスケーリングされる（ｎ＝４の技術的複製、一元配置分散分析）。（Ｄ）各個体のＳＨＥＲＬＯＣＫ結果とｒｓ４３６３６５７ ＳＮＰ部位の合成標準間の計算されたｐ値のヒートマップである。ヒートマップは、対立遺伝子を検知するｃｒＲＮＡごとに示す。ヒートマップのカラーマップは、無意味（ｐ＞０．０５）が赤で有意（ｐ＜０．０５）が青になるようにスケーリングされる（ｎ＝４の技術的複製、一元配置分散分析）。（Ｅ）ＳＨＥＲＬＯＣＫ遺伝子型決定のｐ値ヒートマップ結果を理解するためのガイドである。遺伝子型決定は、個体と対立遺伝子との合成標準の間のｐ値＞０．０５に相当する対立遺伝子を選択することによって容易に呼び出され得る。赤いブロックは、合成標準と個体のＳＨＥＲＬＯＣＫ結果との間の有意でない相違、したがって遺伝子型陽性の結果に相当する。青ブロックは、合成標準と個体のＳＨＥＲＬＯＣＫ結果との間の有意な相違、したがって遺伝子型陰性の結果に相当する。 ミスマッチしたバックグラウンド標的のごく一部としてのｓｓＤＮＡ１の検出である。ヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドでのｓｓＤＮＡ１の希釈系列のＳＨＥＲＬＯＣＫ検出である。検出されるｓｓＤＮＡ１標的とバックグラウンドのゲノムＤＮＡとの間に配列の類似性があってはならないことに注意のこと（ｎ＝２技術的複製、バーは平均±標準誤差を表す）。 ジカウイルス患者の尿（図６２Ａ）または血清（図６２Ｂ）の試料を、９５℃（尿）または６５℃（血清）で５分間熱失活させた。例示的な実施形態に従って、１マイクロリットルの不活性化尿または血清を、２時間のＲＰＡ反応のための入力として使用し、その後、３時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を続けた。エラーバーは、検出反応のｎ＝４の技術的複製に基づいて１標準偏差を示す。 ジカウイルス患者の尿試料を９５℃で５分間熱失活させた。例示的な実施形態に従って、１マイクロリットルの失活尿を、３０分のＲＰＡ反応の入力として使用し、その後、３時間（図６３Ａ）または１時間（図６３Ｂ）Ｃ２ｃ２／Ｃａｓ１３検出反応を続けた。エラーバーは、検出反応のｎ＝４の技術的複製に基づいて１標準偏差を示す。 ジカウイルス患者の尿試料を、９５℃で５分間熱不活化した。１マイクロリットルの不活化尿を、２０分のＲＰＡ反応の入力として使用し、その後１時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を続けた。健康なヒトの尿を陰性対照として使用した。エラーバーは、ｎ＝４の技術的な複製または検出反応に基づいて１標準偏差を示す。 ジカウイルス患者の尿試料は９５℃で５分間熱失活した。１マイクロリットルの失活した尿を、２０分のＲＰＡ反応の入力として使用し、その後、ガイドＲＮＡの存在下、または非存在下で１時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を続けた。データ（棒グラフ（図６５Ａ）及び散布図（図６５Ｂ））は、ガイドを含む検出反応からガイドなし検出反応の平均蛍光値を差し引くことにより、正規化する。健康なヒトの尿を陰性対照として使用した。エラーバーは、検出反応のｎ＝４の技術的複製に基づいて１標準偏差を示す。 例示的な実施形態による、４つの異なるガイドＲＮＡ設計による２つのマラリア特異的標的の検出を示す（配列番号４６３〜４７４）。 異なるＣａｓ１３ｂオルソログの編集優先性を示すグラフを示す。凡例については、表３を参照のこと。 異なる編集優先性の異なるＣａｓ１３ｂオルソログを使用したマルチプレックスアッセイの概略図（左）、ならびにＣａｓ１３ｂ１０及びＣａｓ１３ｂ５を使用したこのようなアッセイの実現可能性を実証するデータ（右）を示す。 Ｃａｓ１３ｂ５（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＡ２１０６）及びＣａｓ１３ｂ９（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）オルソログとの二重多重化を示すグラフを示す。エフェクタータンパク質とガイド配列の両方が、同じ反応に含まれており、異なる蛍光読み出し（ポリＵ ５３０ｎｍ及びポリＡ ４８５ｎｍ）を使用して、同じ反応で二重多重化が可能であった。 図６９と同じものを、ただし、この例では、Ｃａｓ１３ａ（Ｌｅｐｔｏｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ ＬｗａＣａｓ１３ａ）オルソログとＣａｓ１３ｂオルソログ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＡ２０１６、Ｃａｓ１３ｂ５）を使用して示す。 ある特定の例示的な実施形態に従う、標的化のロバスト性を決定するために、複数のガイド配列を用いて標的配列をタイリングする方法を示す（配列番号４７５及び４７６）。 ハイブリッド連鎖反応（ＨＣＲ）ゲルを示しており、このゲルは、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質を使用して、開始因子、例えば、本明細書に記載のマスキング構築物に組み込まれた開始因子のロックを解除し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を活性化し得ることを示している。 複雑な溶解物中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを検出する能力を示すデータを提供する。 ある特定の例示的な実施形態による、ある特定のＣａｓ１３オルソログのイオン優先性を示すデータを示す。全ての標的濃度は、２０ｎＭ入力で、イオン濃度は（１ｍＭ及び１０ｍＭ）であった。 Ｃａｓ１３ｂ１２が切断に対して１ｍＭ硫酸亜鉛を優先性であることを示すデータを示す。 緩衝液の最適化がポリＡレポーターのＣａｓ１３ｂ５のシグナル対ノイズ比を増大させ得ることを示すデータを提供する。古い緩衝液は、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、６０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ ７．３を含む。新しい緩衝液は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、６ｍＭのＭｇＣｌ２及び６０ｍＭのＮａＣｌを含む。 ＶＩ型−Ａ／Ｃ Ｃｒｉｓｐｒ系及びＶＩ型−Ｂ１及びＢ２系の模式図、ならびに代表的なＣａｓ１３ｂオルソログの系統樹を示す。 さまざまなＣａｓ１３ｂオルソログの異なるヌクレオチドにおける相対切断活性であって、ＬｗＣａｓ１３ａと比較したものを示す。 さまざまな例のＣａｓ１３オルソログの相対感度を示すグラフを示す。 例示的な実施形態を使用して、ゼプトモル（ｚＭ）レベルの検出を達成する能力を示すグラフを示す。 異なる編集優先性及びポリＮベースのマスキング構築物を有するＣａｓ１３オルソログを使用したマルチプレックスアッセイの概略図を提供する。結果を、（Ｂ、Ｄ）グラフ及び（Ｃ）ヒートマップフォーマットに示す。 ＺＩＫＡ ＲＮＡのプライマー最適化実験の結果（Ａ〜Ｃ）、ジカＲＮＡの検出（Ｄ）、及びある範囲の条件でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの検出（Ｅ、Ｆ）を示すデータを提供する。 ＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的化酵素のＣａｓ１３ｂファミリーの生化学的特性、ならびに増大した感度及び定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫを示す。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３遺伝子座及びｃｒＲＮＡ構造の概略図。（Ｂ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵ塩基の六量体ホモポリマーからなるセンサープローブを用いた、ｓｓＲＮＡ １を標的とする１５のＣａｓ１３ｂオルソログの塩基優先性のヒートマップ。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂの切断モチーフ優先性発見スクリーニング及び好ましい２塩基モチーフの概略図。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇モチーフ全体での各２塩基のカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）の値がＬｗａＣａｓ１３ａ状態で１．０を超えるか、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ状態で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値において、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。（Ｄ）Ｕ６またはＡ６センサープローブのいずれかを用いてｓｓＲＮＡ １を標的とするＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＬｗａＣａｓ１３ａの直交性塩基優先性。（Ｅ）デングｓｓＲＮＡ標的を標的とするＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを用いた単一分子ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。（Ｆ）ｓｓＲＮＡ標的１を標的とする感度の増大のための大きな反応容積におけるＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを用いた単一分子ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。（Ｇ）様々なＲＰＡプライマー濃度でのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ合成ＤＮＡの定量。（Ｈ）Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの合成ＤＮＡ濃度と検出された蛍光との相関。 直交Ｃａｓ１３酵素による試料内多重化ＳＨＥＲＬＯＣＫを示す。（Ａ）直交Ｃａｓ１３酵素を使用した試料内多重化の概略図。（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂのコラテラル活性を伴う２０ｎＭのジカ（Ｚｉｋａ）及びデング（Ｄｅｎｇｕｅ）の合成ＲＮＡの試料内多重化検出。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを用いた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓサーモヌクレアーゼ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアシルトランスフェラーゼ合成標的の漸減濃度での、試料内多重化ＲＰＡ及びコラテラル検出。（Ｄ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＣｃａＣａｓ１３ｂを用いたｒｓ６０１３３８でのヒト試料による多重遺伝子型決定。（Ｅ）疾患対立遺伝子の検出、ＲＥＰＡＩＲによる修正、及びＲＥＰＡＩＲ修正の評価のためのセラノスティックタイムラインの概略図。（Ｆ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを用いた健常シミュレーション及び疾患シミュレーション試料からのＡＰＣ対立遺伝子の試料内多重化検出。（Ｇ）標的ＡＰＣ変異でのＲＥＰＡＩＲ編集効率の定量。（Ｈ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを用いたＲＥＰＡＩＲ標的化及び非標的化試料からのＡＰＣ対立遺伝子の試料内多重化検出。 精製され、インビトロコラテラル活性について評価された１５のＣａｓ１３ｂオルソログのツリーを提供する。Ｃａｓ１３ｂ遺伝子（青）、Ｃｓｘ２７／Ｃｓｘ２８遺伝子（赤／黄色）、及びＣＲＩＳＰＲアレイ（灰色）が示される。 Ｃａｓ１３オルソログのタンパク質精製を示す。（Ａ）この研究で使用したＣａｓ１３ｂ、ＬｗＣａｓ１３ａ及びＬｂａＣａｓ１３ａのサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム。測定されたＵＶ吸光度（ｍＡＵ）を、溶出容量（ｍｌ）に対して示す。（Ｂ）精製されたＣａｓ１３ｂオルソログのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。１４個のＣａｓ１３ｂオルソログが左から右にロードされる。左側にタンパク質ラダーを示す。（Ｃ）ＬｂａＣａｓ１３ａ希釈液（右）及びＢＳＡ標準滴定（左）の最終ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ＢＳＡの５つの希釈液及びＬｂａＣａｓ１３の２つを示す。 Ｃａｓ１３ｂオルソログコラテラル切断の塩基優先性を示すグラフを示す。（Ａ）６ヌクレオチド長のホモポリマーアデニンセンサーを使用した、ｓｓＲＮＡ １を標的とする１４のＣａｓ１３ｂオルソログの切断活性。（Ｂ）６ヌクレオチド長のホモポリマーウリジンセンサーを使用した、ｓｓＲＮＡ １を標的とする１４のＣａｓ１３ｂオルソログの切断活性。（Ｃ）６ヌクレオチド長のホモポリマーグアニンセンサーを使用した、ｓｓＲＮＡ １を標的とする１４のＣａｓ１３ｂオルソログの切断活性。（Ｄ）６ヌクレオチド長のホモポリマーシチジンセンサーを使用した、ｓｓＲＮＡ １を標的とする１４のＣａｓ１３ｂオルソログの切断活性。 Ｃａｓ１３コラテラル切断後のランダムモチーフライブラリーのサイズ分析を示す。ＬｗａＣａｓ１３ａ−、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ−、ＣｃａＣａｓ１３ｂ−、及びＲＮａｓｅ Ａで処理されたライブラリー試料のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒトレースは、ＲＮａｓｅ活性後のライブラリーサイズの変化を示す。Ｃａｓ１３オルソログは、デングｓｓＲＮＡを標的にしており、コラテラル切断に起因してランダムモチーフライブラリーを切断する。マーカー標準は、第１のレーンに示される。 ＲＮａｓｅによる切断後のさまざまなモチーフの代表を示す。（Ａ）５分及び６０分の時点でのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａの標的対非標的の比のモチーフ分布を示すボックスプロット。ＲＮａｓｅ Ａの比率を、Ｃａｓ１３の３つの非標的条件の平均と比較した。比率はまた、２つの切断反応の繰り返しの平均である。（Ｂ）６０分の時点でのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａの富化されたモチーフの数。富化モチーフは、１（ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ）または０．５（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ）のいずれかの−ｌｏｇ２（標的／非標的）閾値を超えるモチーフとして計算した。１という閾値は少なくとも５０％の枯渇に相当するが、閾値０．５は少なくとも３０％の枯渇に相当する。（Ｃ）ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及びＣｃａＣａｓ１３ｂの富化モチーフから生成された配列ロゴ。ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＣｃａＣａｓ１３ｂは、予想どおり強いＵ優先性を示すが、ＰｓｍＣａｓ１３ｂは、モチーフ全体にわたってＡ塩基の固有の優先性を示し、これは、ホモポリマーコラテラル活性優先性と一致している。（Ｄ）ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及びＣｃａＣａｓ１３ｂの直交モチーフ優先性を示すヒートマップ。ヒートマップで表される値は、表示されている各モチーフの−ｌｏｇ２（標的／非標的）値である。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値では、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。 ランダムモチーフライブラリースクリーニングで決定されたＲＮａｓｅの１塩基及び２塩基の設定を表示す。（Ａ）ランダムモチーフライブラリー切断スクリーニングによって決定された６０分の時点でのＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａの単一塩基の優先性を示すヒートマップ。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇モチーフ全体の各ベースのカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値がＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ条件で１．０を超えるか、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ条件で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値では、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。（Ｂ）ランダムモチーフライブラリー切断スクリーニングによって決定されたＣｃａＣａｓ１３ｂの２塩基優先を示すヒートマップ。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇したモチーフ全体の各２塩基のカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値が、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ条件で１．０を超えるか、またはＰｓｍＣａｓ１３ｂ条件で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値では、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。（Ｃ）ランダムモチーフライブラリー切断スクリーニングにより決定されたＲＮａｓｅ Ａの２塩基優先性を示すヒートマップ。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇モチーフ全体にまたがる各２塩基のカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値がＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ条件で１．０を超えるか、またはＰｓｍＣａｓ１３ｂ条件で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値では、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。 ランダムモチーフライブラリースクリーニングで決定されたＲＮａｓｅの３塩基優先性を示す。ヒートマップは、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａの３塩基の優先性を、ランダムモチーフライブラリーの切断スクリーニングで決定された６０分の時点で示す。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇モチーフ全体での各３塩基のカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値が、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ条件で１．０を超えるか、またはＰｓｍＣａｓ１３ｂ条件で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値において、標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。 ランダムモチーフライブラリースクリーニングで決定されたＲＮａｓｅの４塩基優先性を示す。ヒートマップは、ランダムモチーフライブラリーの切断スクリーニングで決定された６０分の時点での（Ａ）ＣｃａＣａｓ１３ｂ、（Ｂ）ＬｗａＣａｓ１３ａ、（Ｃ）ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及び（Ｄ）ＲＮａｓｅ Ａの４塩基優先性を示す。ヒートマップで表される値は、全ての枯渇モチーフにまたがる各４塩基のカウントである。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値がＬｗａＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、及びＲＮａｓｅ Ａ条件で１．０を超えるか、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ条件で０．５を超える場合、モチーフは枯渇していると見なされる。−ｌｏｇ２（標的／非標的）値において標的及び非標的は、それぞれ、標的条件及び非標的条件でのモチーフの頻度を示す。 インビトロでのポリ−Ｘ基質の切断を伴う、Ｃａｓ１３オルソログの塩基切断の優先性を試験した結果を示す。（Ａ）ｃｒＲＮＡの存在下及び非存在下でインキュベートされたＬｗａＣａｓ１３ａによるポリ−Ｕ、Ｃ、Ｇ、及びＡ標的のインビトロ切断。（Ｂ）ｃｒＲＮＡの存在下及び非存在下でインキュベートされたＣｃａＣａｓ１３ｂによるポリ−Ｕ、Ｃ、Ｇ、及びＡ標的のインビトロ切断。（Ｃ）ｃｒＲＮＡの存在下及び非存在下でインキュベートしたＰｓｍＣａｓ１３ｂによるポリ−Ｕ、Ｃ、Ｇ、及びＡ標的のインビトロ切断。 ＰｓｍＣａｓ１３ｂ切断活性の緩衝液最適化の結果を示す。（Ａ）ｓｓＲＮＡ １を標的とした後のＰｓｍＣａｓ１３ｂコラテラル活性に対するそれらの効果について様々な緩衝液を試験する。（Ｂ）最適化緩衝液を、異なるＰｓｍＣａｓ１３ｂ−ｃｒＲＮＡ複合体濃度で元の緩衝液と比較する。 コラテラル切断のためのＣａｓ１３オルソログのイオン優先性を示す。（Ａ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎに対する蛍光ポリＵセンサーを用いたＰｓｍＣａｓ１３ｂの切断活性。ＰｓｍＣａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。（Ｂ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎに対する蛍光ポリＡセンサーを用いたＰｓｍＣａｓ１３ｂの切断活性。ＰｓｍＣａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。（Ｃ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎに対する蛍光ポリＵセンサーを用いたＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂの切断活性。Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。（Ｄ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎに対する蛍光ポリＡセンサーによるＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂの切断活性。Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。（Ｅ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎについての蛍光ポリＵセンサーによるＣｃａＣａｓ１３ｂの切断活性。ＣｃａＣａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。（Ｆ）二価陽イオンＣａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＺｎに対する蛍光ポリＡセンサーによるＣｃａＣａｓ１３ｂの切断活性。ＣｃａＣａｓ１３ｂを、合成デング熱ｓｓＲＮＡを標的とするｃｒＲＮＡとインキュベートする。 Ｃａｓ１３オルソログの切断活性とアデニン切断優先性の比較を示す。（Ａ）異なる濃度の合成ジカ標的を標的とするそれぞれのｃｒＲＮＡとインキュベートされたＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＬｂａＣａｓ１３ａの切断活性（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定；ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；バーは平均±標準誤差を表す）。（Ｂ）異なる濃度の合成デング熱標的を標的とするそれぞれのｃｒＲＮＡとインキュベートしたＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＬｂａＣａｓ１３ａの切断活性（ｎ＝４技術的複製、両側スチューデントｔ検定；ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；バーは平均±標準誤差を表す）。 ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂを使用したＳＨＥＲＬＯＣＫによるジカ ｓｓＲＮＡ標的４のアトモル検出を示す。（Ａ）ＬｗａＣａｓ１３ａ及びポリＵセンサーによる異なる濃度でのジカ（Ｚｉｋａ）ｓｓＲＮＡのＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。（Ｂ）ＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びポリＡセンサーを用いた異なる濃度でのジカｓｓＲＮＡのＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。 異なる濃度のＣｃａＣａｓ１３ｂでのＳＨＥＲＬＯＣＫによるデングｓｓＲＮＡのアトモル検出を示す。 ｓｓＲＮＡ１をタイリングするｃｒＲＮＡを用いたＣａｓ１３オルソログ再プログラム可能性の試験。（Ａ）ｓｓＲＮＡ１全体にタイリングされたｃｒＲＮＡによるＬｗａＣａｓ１３ａ及びＣｃａＣａｓ１３ｂの切断活性。（Ｂ）ｓｓＲＮＡ１全体にタイリングされたｃｒＲＮＡによるＰｓｍＣａｓ１３ｂの切断活性。 Ｃａｓ１３オルソログの切断に対するｃｒＲＮＡスペーサー長の影響を示す。（Ａ）様々なスペーサー長のｓｓＲＮＡ１標的ｃｒＲＮＡを用いたＰｓｍＣａｓ１３ｂの切断活性。（Ｂ）様々なスペーサー長のｓｓＲＮＡ１標的ｃｒＲＮＡを用いたＣｃａＣａｓ１３ｂの切断活性。 定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫのためのプライマー濃度の最適化を示す。（Ａ）異なる濃度のジカ ＲＮＡ標的及び相補的ｃｒＲＮＡと４８０ｎＭのＲＰＡプライマー濃度でインキュベートしたＬｗａＣａｓ１３ａのＳＨＥＲＬＯＣＫ速度論曲線。（Ｂ）異なる濃度のジカ ＲＮＡ標的及び相補的ｃｒＲＮＡと２４０ｎＭのＲＰＡプライマー濃度でインキュベートされたＬｗａＣａｓ１３ａのＳＨＥＲＬＯＣＫ動態曲線。（Ｃ）異なる濃度のジカ ＲＮＡ標的及び相補的ｃｒＲＮＡと１２０ｎＭのＲＰＡプライマー濃度でインキュベートしたＬｗａＣａｓ１３ａのＳＨＥＲＬＯＣＫ動態曲線。（Ｄ）異なる濃度のジカ ＲＮＡ標的及び相補的ｃｒＲＮＡと２４ｎＭのＲＰＡプライマー濃度でインキュベートされたＬｗａＣａｓ１３ａのＳＨＥＲＬＯＣＫ動態曲線。（Ｅ）４つの異なるＲＰＡプライマー濃度：４８０ｎＭ、２４０ｎＭ、１２０ｎＭ、６０ｎＭ、及び２４ｎＭによる異なる濃度のジカＲＮＡのＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。（Ｆ）バックグラウンドを差し引いたＳＨＥＲＬＯＣＫの蛍光と異なるＲＰＡプライマー濃度でのジカ標的ＲＮＡ濃度と間の平均Ｒ２相関。（Ｇ）１０倍希釈系列（黒色点）及び２倍希釈系列（赤色点）における異なる濃度でのジカＲＮＡ標的の定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。１２０ｎＭのＲＰＡプライマー濃度を使用した。 ジカ及びデング熱標的の多重化検出を示す。（Ａ）ジカ ｓｓＲＮＡ標的を標的とするＬｗａＣａｓ１３ａ及びデングｓｓＲＮＡ標的を標的とするＰｓｍＣａｓ１３ｂを使用した多重化された２色検出。両方の標的とも２０ｎＭ入力である。示されている全てのデータは、反応の１８０分の時点を表している。（Ｂ）ジカ ｓｓＲＮＡ標的を標的とするＬｗａＣａｓ１３ａ及びデングｓｓＲＮＡ標的を標的とするＰｓｍＣａｓ１３ｂを使用した多重化された２色検出。両方の標的とも２００ｐＭ入力である。（Ｃ）ＣｃａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂのコラテラル活性による２０ｐＭのジカ及びデング合成ＲＮＡの試料内多重化検出。 （Ｂ）ジカ及び（Ａ）デングのｓｓＲＮＡの試料内マルチプレックスＲＮＡ検出を示す。ＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＣｃａＣａｓ１３ｂを使用して、ジカ及びデングの合成標的の濃度を下げた、試料内の多重化ＲＰＡ及びコラテラル検出。 変異及びＲＥＰＡＩＲ編集の多重化されていないセラノスティック検出を示す。（Ａ）ＬｗａＣａｓ１３ａを用いた健康及び疾患をシミュレートした試料からのＡＰＣ対立遺伝子の検出。（Ｂ）ＲＥＰＡＩＲ標的化及び非標的化試料からのＡＰＣ対立遺伝子における編集修正のＬｗａＣａｓ１３ａでの検出。 金ナノ粒子凝集によるＲＮａｓｅ活性の比色検出を示す。（Ａ）ＲＮａｓｅ活性の金ナノ粒子ベースの比色分析読み出しの概要。ＲＮａｓｅ活性の非存在下では、ＲＮＡリンカーは、金ナノ粒子を凝集し、赤色の喪失につながる。ＲＮＡリンカーの切断は、ナノ粒子を放出し、赤色の変化を生じる。（Ｂ）種々の単位のＲＮａｓｅＡでの１２０分のＲＮａｓｅ消化後の比色レポーターの画像。（Ｃ）種々の単位濃度のＲＮａｓｅ Ａでの消化によるＡｕＮＰ比色レポーターの５２０ｎｍ吸光度での速度論。（Ｄ）種々の単位濃度のＲＮａｓｅ Ａでの消化１２０分後のＡｕＮＰ比色レポーターの５２０ｎｍ吸光度。（Ｅ）種々の単位濃度のＲＮａｓｅ Ａでの消化を伴う、ＡｕＮＰ比色レポーターのＡ５２０最大半分までの時間。 ダイズゲノムＤＮＡからのＣＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子の定量的検出を示す。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫのバックグラウンドを差し引いた蛍光及びＣＰ４−ＥＰＳＰＳ豆のパーセンテージの異なる検出時点での平均相関Ｒ２。豆のパーセンテージは、切り上げた準備豆と野生型豆の混合物中の切り上げた準備豆の量を表す。ＣＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子は、切り上げた豆にのみ存在する。（Ｂ）３０分のインキュベーションでのＳＨＥＲＬＯＣＫ検出の定量的性質を示す、異なる豆のパーセンテージでのＣＰ４−ＥＰＳＰＳ耐性遺伝子のＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。（Ｃ）異なる豆の割合でのレクチン遺伝子のＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。豆のパーセンテージは、切り上げた準備豆と野生型豆の混合物中の切り上げた準備豆の量を表す。レクチン遺伝子は、両方の種類の豆に存在するので、切り上げた準備豆のパーセンテージとの相関関係は示されない。 アプタマーの色の生成を示す。 アプタマーの設計及び濃度の最適化を示す。 比色検出の吸光度データを示す。 比色変化の安定性を示す。 ジカｓｓＲＮＡの比色検出と蛍光検出の比較を示す。 ニッカーゼ増幅を示す。
例となる実施形態の詳細な説明
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，及びＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｊｏｎｅｓ及びＢａｒｔｌｅｔが公開，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．が公開，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．が公開，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；ならびにＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ及びＪａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出され得る。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」、及び「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈がそうではないと明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
「任意選択の、必要に応じ（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で、必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、その後に記載される事象、状況または置き換えが発生する場合と発生しない場合があること、ならびにその記載にはその事象または状況が発生する場合及び発生しない場合が含まれることを意味する。
終点による数値範囲の列挙は、列挙された終点と同様に、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数を含む。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、パラメーター、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定の値の及び特定の値からの変動を、そのような変動が、開示された本発明において行うために適切である限り、例えば、特定された値の及び特定の値からの±１０％以下、±５％以下、±１％以下、及び＋／−０．１％以下の変動を含むことを意味する。修飾語「約」または「およそ」が指す値自体はまた、具体的であり、かつ好ましくは開示されていることを理解されたい。
本明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態の例」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所における「一実施形態では」、「ある実施形態では」、または「実施形態の例」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、本開示から当業者には明らかなように、１つ以上の実施形態では、任意の適切な方法で組み合わせられてもよい。さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる他の特徴ではなくいくつかを含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用され得る。
「Ｃ２ｃ２」は現在、「Ｃａｓ１３ａ」と呼ばれ、この用語は、特段示さない限り、本明細書において交換可能に使用される。
本明細書に引用される全ての出版物、公開特許文書、及び特許出願は、各々の個々の出版物、公開特許文書、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
概要
微生物がクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）適応免疫系は、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１などのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１の両方がＤＮＡを標的とするが、Ｃ２ｃ２を含む単一のエフェクターＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅが最近発見され（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、特徴付けられた（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、特異的なＲＮＡ検知のためのプラットフォームを提供する。ＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡｓ）を使用して簡単かつ便利に、標的ＲＮＡを切断するように再プログラム可能である。ＤＮＡ標的のみを切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９及びＣｐｆ１とは異なり、Ｃ２ｃ２のようなＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅは、そのＲＮＡ標的を切断した後も活性のままであり、近接した非標的ＲＮＡの「コラテラル」切断を引き起こす（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。このｃｒＲＮＡプログラムされたコラテラルＲＮＡ切断活性は、ＲＮＡガイド付きＲＮａｓｅを使用して、読み出しとして機能し得るインビボのプログラム細胞死またはインビトロの非特異的ＲＮＡ分解をトリガーすることにより、特定のＲＮＡの存在を検出する機会を提供する（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。コラテラル活性のクラス２酵素には、参照によって本明細書に援用される、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１８ Ａｐｒ ２７；３６０（６３８７）：４３９−４４４に記載されるように、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１２ａ酵素が挙げられる。
本明細書に開示される実施形態は、アトモル感度を有するロバストなＣＲＩＳＰＲベースの診断を提供するためにＲＮＡ標的化エフェクターを利用した。本明細書に開示される実施形態は、同等のレベルの感度でブロスのＤＮＡ及びＲＮＡを検出し得、かつ単一の塩基対の違いに基づいて標的を非標的から区別し得る。さらに、本明細書に開示される実施形態は、便利な分布及びポイントオブケア（ＰＯＣ）用途のために、凍結乾燥形式で調製してもよい。そのような実施形態は、例えば、ウイルス検出、細菌株分類、高感度遺伝子型決定、及び疾患関連無細胞ＤＮＡの検出を含む、ヒトの健康における複数のシナリオにおいて有用である。参照を容易にするために、本明細書に開示される実施形態はまた、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）とも呼ばれ得る。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ系、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ−アプタマー、及び試料中で標的核酸分子を増幅するための任意の増幅試薬を含む核酸検出系に関する。１つ以上の検出アプタマーは、１つ以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が、標的ペプチドに対する検出アプタマーの結合の際にのみ露出されるように構成される。ＲＮＡポリメラーゼ部位の露出は、アプタマー配列を鋳型として使用してトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。したがって、そのような実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、トリガーＲＮＡに結合するように構成される。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、複数の個々の個別のボリュームを含む診断デバイスに関する。各個々の個別のボリュームは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及び酵素活性を有する四重鎖を含むＲＮＡアプタマーを含む。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ増幅試薬は、個々の個別のボリュームに事前にロードされてもよいし、または個々の個別のボリュームへの試料の添加と同時にもしくはその後にその個々の個別のボリュームに添加されてもよい。このデバイスは、マイクロ流体ベースのデバイス、ウェアラブルデバイス、またはこの個々の個別のボリュームが規定される可塑性材料基材を含むデバイスであってもよい。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、試料または試料のセットを一連の個々の個別ボリュームに分配することを含む、試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、各個々の個別ボリュームは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つの標的オリゴヌクレオチドに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及び酵素活性を有する四重鎖を含むＲＮＡアプタマーを含む。次いで、試料のセットは、１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下で維持される。１つ以上のガイドＲＮＡの標的核酸への結合は、次に、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する。一旦活性化されると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、四重鎖の酵素活性を不活性化する。閾値未満の酵素活性の検出は、標的分子の存在を示す。
核酸検出系
いくつかの実施形態では、本発明は、エフェクタータンパク質を有する検出ＣＲＩＳＰＲ系と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡと、酵素活性を有する四重鎖を含むＲＮＡアプタマーとを含む核酸検出系を提供する。
検出ＣＲＩＳＰＲ系
一般には、本明細書及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの文書で使用されるＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現または活性の指向に関与する転写物及び他の要素を総称的に指し、これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（「ダイレクトリピート」、及び内因性ＣＲＩＳＰＲ系の環境でのｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の環境では「スペーサー」とも呼ばれる）、または本明細書で使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えばＣａｓ９などのＣａｓをガイドするためのＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の環境ではプロトスペーサーとも呼ばれる）。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。Ｃ２ｃ２はＡｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ”；Ｓｃｉｅｎｃｅ；ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３、ならびにＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｃａｓ１３ｂは、Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．６５，１−１３；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３．（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
１．エフェクタータンパク質
ある特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質複合体の目的の標的遺伝子座への結合を誘導する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であってもよい。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であってもよい。「ＰＡＭ」という用語は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」という用語と交換可能に使用され得る。
好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識し得る。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈである３’ＰＡＭを認識し得、ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＵである。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ ＤＳＭ １９７５７ Ｃ２ｃ２であり得、３’ＰＡＭは、５’Ｈである。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるかまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。言い換えれば、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、かつＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指向される、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、特にＣ２ｃ２をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である。コドン最適化配列の例は、この場合、真核生物、例えば、ヒト（すなわち、ヒトでの発現に最適化されている）、または本明細書で考察される別の真核生物、動物または哺乳動物での発現に最適化された配列である；例えば、ＷＯ ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと。これが好ましいが、他の例が可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化、または特定の臓器のコドン最適化が知られていることが理解されよう。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞での発現のために最適化されたコドンである。真核生物細胞は、限定はされないが、本明細書で考察されるヒトまたは非ヒト真核生物または動物または哺乳動物、例えば、植物、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳類もしくは霊長類を含む、哺乳動物などの特定の生物の細胞であってもまたはそれらに由来する細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセス及び／またはヒトもしくは動物、及びそのようなプロセスから生じる動物にも実質的な医学的利益なしに苦痛を引き起こす可能性が高い動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスは排除されてもよい。一般に、コドン最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンを有する天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を置き換えることにより、目的の宿主細胞での発現を増強するために核酸配列を変更するプロセスを指す。さまざまな種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン用法の相違）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、これは、次に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、所定の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整し得る。コドン使用法の表は、例えば、ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）なども利用可能である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について、最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｃａｓトランスジェニック細胞、特にＣ２ｃ２トランスジェニック細胞を提供することを含み得、ここで１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供されるか、または細胞内で、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節要素と作動可能に接続して導入される。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓトランスジェニック細胞」という用語は、Ｃａｓ遺伝子がゲノムに組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、または起源は、本発明によって特に限定されない。また、Ｃａｓ導入遺伝子が細胞に導入される方法は様々であり得、そして当該分野で公知の任意の方法であり得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離された細胞にＣａｓ導入遺伝子を導入することによって得られる。ある特定の他の実施形態では、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、限定するものではないが、本明細書で言及されるＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物などのＣａｓトランスジェニック真核生物に由来し得る。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座を標的とすることを目的とするＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓに譲渡された米国特許公開第２０１２００１７２９０号及び２０１１０２６５１９８号の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変してもよい。Ｒｏｓａ遺伝子座を標的とすることを指向としたＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許公開第２０１３０２３６９４６号の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するように改変してもよい。さらなる例としては、参照により本明細書に援用されている、Ｃａｓ９ノックインマウスについて説明している、Ｐｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０−４５５（２０１４））が言及される。Ｃａｓ導入遺伝子は、Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−ｐｏｌｙＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットをさらに含んでもよく、それによりＣｒｅ発現をＣｒｅリコンビナーゼにより誘導性にさせる。あるいは、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離された細胞にＣａｓ導入遺伝子を導入することによって得てもよい。導入遺伝子の送達系は、当該技術分野で周知である。例として、Ｃａｓ導入遺伝子は、本明細書のいずれかにも記載されるように、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／または粒子及び／またはナノ粒子送達により、例えば真核細胞に送達され得る。
本明細書で言及されるＣａｓトランスジェニック細胞などの細胞は、組み込まれたＣａｓ遺伝子またはＣａｓを標的遺伝子座に導き得るＲＮＡと複合体化したときにＣａｓの配列特異的作用から生じる変異を有することに加えて、さらなるゲノム変化を含んでもよいことが当業者に理解される。
ある特定の態様では、本発明は、例えば、標的遺伝子座（すなわちガイドＲＮＡ）に細胞内でＣａｓ及び／またはＣａｓを導き得るＲＮＡを、送達または導入するため、ならびに、これらの成分を増殖させるため（例えば原核細胞において）のベクターを含む。本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にするか、または促進するツールである。それは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、その中に別のＤＮＡセグメントを挿入して、挿入されたセグメントの複製を引き起こし得る。一般に、ベクターは、適切な制御要素を伴う場合、複製が可能である。一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の自由端を含むか、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野で公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などにより、追加のＤＮＡセグメントを挿入し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルスにパッケージングするためにベクターに存在する（例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドを含む。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術で有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでもよく、これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、１つ以上の調節要素を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節要素（複数可）に連結されていることを意味することを意図する（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合、宿主細胞中で）。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日にＵＳ ２００４−０１７１１５６ Ａ１として公開された米国特許出願１０／８１５，７３０が言及され、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系を含むトランスジェニック細胞も含み得る。ある特定の例示的な実施形態では、トランスジェニック細胞は、個別の別個の容積として機能し得る。言い換えれば、マスキング構築物を含む試料は、例えば、適切な送達小胞で細胞に送達され得、標的が送達小胞に存在する場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが活性化され、検出可能なシグナルが生成される。
ベクター（複数可）は、調節要素（複数可）、例えばプロモーター（複数可）を含んでもよい。このベクター（複数可）は、Ｃａｓコード配列及び／または単一を含んでもよいが、おそらく、また１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜８、３〜１６、３〜３０、３〜３２、３〜４８、３〜５０のＲＮＡ（複数可）（例えば、ｓｇＲＮＡ）のような少なくとも３または８または１６または３２または４８または５０のガイドＲＮＡ（複数可）（例えば、ｓｇＲＮＡ）コード配列を含んでもよい。単一のベクターには、各ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に対するプロモーターがあり得、有利には、最大約１６までのＲＮＡ（複数可）が存在する場合；そして、単一のベクターが１６を超えるＲＮＡ（複数可）を提供する場合、１つ以上のプロモーター（複数可）が２つ以上のＲＮＡ（複数可）の発現を駆動し得、例えば、３２のＲＮＡ（複数可）がある場合、各プロモーターは、２つのＲＮＡ（複数可）の発現を駆動し得、４８のＲＮＡ（複数可）がある場合、各プロモーターは３つのＲＮＡ（複数可）の発現を駆動し得る。単純な算術及び十分に確立されたクローニングプロトコルならびにこの開示における教示により、当業者は、ＡＡＶなどの適切な例示的なベクターのＲＮＡ（複数可）及びＵ６プロモーターなどの適切なプロモーターに関して本発明を容易に実施し得る。例えば、ＡＡＶのパッケージ制限は、約４．７ｋｂである。単一のＵ６−ｇＲＮＡ（それに加えてクローニング用の制限部位）の長さは３６１ｂｐである。したがって、当業者は、単一のベクターに約１２〜１６、例えば１３のＵ６−ｇＲＮＡカセットを容易に収めることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに使用されるゴールデンゲート戦略（ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）などの任意の適切な方法でアセンブルされ得る。当業者はまた、タンデムガイド戦略を使用して、Ｕ６−ｇＲＮＡの数を約１．５倍、例えば、１２〜１６、例えば、１３から約１８〜２４、例えば、約１９のＵ６−ｇＲＮＡに増大し得る。したがって、当業者は、単一のベクター、例えば、ＡＡＶベクター中の約１８〜２４、例えば、約１９のプロモーター−ＲＮＡ、例えば、Ｕ６−ｇＲＮＡに容易に到達し得る。ベクター中のプロモーター及びＲＮＡの数を増大させるためのさらなる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡのアレイを発現させることである。そして、ベクター中のプロモーター−ＲＮＡの数を増大させるためのさらに別の手段は、コード配列または遺伝子のイントロン内の切断可能な配列によって分離されたプロモーター−ＲＮＡのアレイを発現させることである。そしてこの場合、発現を増大し得、組織特異的な方法で長いＲＮＡの転写を可能にするポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利である（例えば、ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ及びｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照のこと）。有利な実施形態では、ＡＡＶは、最大約５０個の遺伝子を標的とするＵ６タンデムｇＲＮＡをパッケージし得る。したがって、当該技術分野の知識及び本開示の教示から、当業者は、制御下で、または１つ以上のプロモーターに作動可能にもしくは作動可能に連結された、ベクター（複数可）、例えば、単一のベクター（複数のＲＮＡまたはガイドを発現する）を容易に作製及び使用し得る（特に本明細書で考察されるＲＮＡまたはガイドの数に関して、過度の実験なしに）。
ガイドＲＮＡ（複数可）コード配列及び／またはＣａｓコード配列は、機能的または機能的に調節要素に連結されてもよく、したがって調節要素（複数可）は発現を駆動する。プロモーター（複数可）は、構成的プロモーター（複数可）及び／または条件付きプロモーター（複数可）及び／または誘導性プロモーター（複数可）及び／または組織特異的プロモーター（複数可）であってもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群より選択され得る。有利なプロモーターはプロモーターＵ６である。
いくつかの実施形態では、核酸標的化系の１つ以上の要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化系を含む特定の生物に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化系は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含み、これには限定するものではないが、本明細書に記載のＨＥＰＮドメイン、当該技術分野で既知のＨＥＰＮドメイン、及びコンセンサス配列モチーフとの比較によりＨＥＰＮドメインであると認識されるドメインを含む。本明細書では、いくつかのそのようなドメインが提供されている。非限定的な一例では、コンセンサス配列は、本明細書で提供されるＣ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂオルソログの配列から誘導してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、単一のＨＥＰＮドメインを含む。特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを含む。
例示的な一実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、限定するものではないが、本明細書に記載のＨＥＰＮドメインまたは当該技術分野で公知のＨＥＰＮドメイン由来のものであり得る。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、２つ以上のＨＥＰＮドメインの部分を組み合わせることによって作成されたモチーフ配列をさらに含む。述べたように、コンセンサス配列は、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」という表題の米国仮特許出願６２／４３２，２４０、２０１７年３月１５日出願の「Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ」という表題の米国仮特許出願６２／４７１，７１０、及び弁護士整理番号４７６２７−０５−２１３３として表示され、２０１７年４月１２日に提出された「Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」という表題の米国仮特許出願から誘導され得る。
本発明の一実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む少なくとも１つのＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の一実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｙ、またはＨである。ある特定の実施形態では、Ｘ２は、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬである。ある特定の実施形態では、Ｘ３は、Ｌ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。
本発明に従って使用するための追加のエフェクターは、例えば、これらに限定するものではないが、ｃａｓ１遺伝子の開始から２０ｋｂ及びｃａｓ１遺伝子の終わりから２０ｋｂの領域内の、ｃａｓ１遺伝子へのそれらの近接性によって同定され得る。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００アミノ酸を含み、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲアレイの上流または下流２０ｋｂ内の原核生物ゲノムに天然に存在する。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１遺伝子の上流または下流２０ｋｂ内の原核生物ゲノムに天然に存在する。「オルソログ」（本明細書では「オルソログ」とも呼ばれる）及び「ホモログ」（本明細書では「ホモログ」とも呼ばれる）という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによれば、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同性タンパク質は、構造的に関連していなくてもよく、また部分的にのみ構造的に関連している。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連していても、必ずしもそうでなくてもよいし、または部分的にのみ構造的に関連している。
特定の実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡ標的化Ｃａｓ酵素は、Ｃ２ｃ２である。他の例示的な実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡ標的化Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１３ｂである。特定の実施形態では、本明細書に言及されるＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質と少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｒ９−０３１７）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ Ｃ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づく）。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃ２ｃ２と少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬＲ９−０３１７）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ Ｃ２ｃ２のいずれかの野生型配列に基づいて）。
ある特定の他の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系のエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は、２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存し得る。これらは、ＲＮａｓｅドメイン、すなわちヌクレアーゼ（特にエンドヌクレアーゼ）切断ＲＮＡであることが示されている。Ｃ２ｃ２ ＨＥＰＮは、ＤＮＡ、または潜在的にＤＮＡ及び／もしくはＲＮＡを標的にし得る。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが少なくともＲＮＡに結合し得、野生型の形態でＲＮＡを切断し得ることに基づいて、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質がＲＮａｓｅ機能を有することが好ましい。Ｃ２ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ系に関しては、２０１６年６月１７日に提出された米国仮出願６２／３５１，６６２及び２０１６年８月１７日に提出された米国仮出願６２／３７６，３７７が参照される。また、２０１６年６月１７日に提出された米国仮出願６２／３５１，８０３も参照される。ブロード研究所番号１００３５．ＰＡ４及び代理人整理番号４７６２７．０３．２１３３が付与された、２０１６年１２月８日に提出された米国仮出願「Ｎｏｖｅｌ Ｃｒｉｓｐｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」も参照される。Ｅａｓｔ−Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．“Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ−ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０／１０３８／ｎａｔｕｒｅ１９８０２及びＡｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ”ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：１０．１１０１／０５４７４２をさらに参照のこと。
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮａｓｅ機能は既知であり、例えば、特定のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系についてｍＲＮＡ標的化が報告されており（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ．２８，２４３２−２４４３、Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３９，９４５−９５６、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４３，４０６−４１７）及び重要な利点を提供する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ＩＩＩ−Ａ型系では、標的間の転写により、Ｃａｓ１０−Ｃｓｍリボ核タンパク質エフェクタータンパク質複合体内の独立した活性部位を介して、標的ＤＮＡ及びその転写産物が切断される（Ｓａｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１５１，１１６４−１１７４を参照）。したがって、現在のエフェクタータンパク質を介してＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、組成物または方法が提供される。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、限定するものではないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒを含む属の生物体のＣ２ｃ２オルソログであり得る。そのような属の生物の種は、本明細書において別に考察されるものであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系酵素のオルソログを特定するいくつかの方法には、目的のゲノムのｔｒａｃｒ配列を特定することが含まれる場合がある。ｔｒａｃｒ配列の識別は、以下のステップに関連し得る：ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を識別するために、データベースでダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を検索する。センス方向とアンチセンス方向の両方でＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域で相同配列を検索する。転写ターミネーター及び二次構造を探す。ダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列ではないが、ダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒのメイト配列と５０％を超える同一性を有する任意の配列を、潜在的なｔｒａｃｒ配列として特定する。潜在的なｔｒａｃｒ配列を取得し、それに関連付けられている転写ターミネーター配列を分析する。
本明細書に記載の機能のいずれかを、複数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素を含む、他のオルソログからのＣＲＩＳＰＲ酵素に操作し得ることが理解されるであろう。そのようなオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載されている。したがって、キメラ酵素は、限定するものではないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒを含む生物体のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含んでもよい。キメラ酵素は、第１の断片及び第２の断片を含んでもよく、これらの断片は、本明細書で述べた属の生物または本明細書で述べた属の生物体、または本明細書で述べた種の生物体のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのものであり得、有利には、この断片は異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログ由来のものである。
実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２の機能的バリアントまたはそのホモログもしくはオルソログも包含する。本明細書で使用されるタンパク質の「機能的バリアント」は、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持するそのようなタンパク質のバリアントを指す。機能的バリアントとしては、多形などを含む変異体（挿入、欠失、または置換変異体などであってもよい）が含まれ得る。このようなタンパク質と、通常は無関係の別の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの融合産物も機能的バリアントに含まれる。機能的バリアントは自然に発生する場合もあれば、人工的な場合もある。有利な実施形態は、操作された、または天然に存在しないＶＩ型ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質をさらに含んでもよい。
一実施形態では、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログをコードする核酸分子（複数可）は、真核細胞における発現のためにコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書で考察したとおりであり得る。核酸分子（複数可）は、操作されたものであっても、または天然に存在しないものであってもよい。
一実施形態では、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つ以上の変異をさらに含んでもよい（したがって、それをコードする核酸分子（複数可）は変異（複数可）を有し得る）。変異は、人為的に導入された変異であってもよく、限定するものではないが、触媒ドメインにおける１つ以上の変異を含み得る。Ｃａｓ９酵素に関する触媒ドメインの例としては、限定するものではないが、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ、及びＨＮＨドメインが挙げられ得る。
ある実施形態では、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つ以上の変異を含んでもよい。変異は、人為的に導入された変異であってもよく、限定するものではないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異を含んでもよい。Ｃａｓ酵素に関する触媒ドメインの例としては、限定するものではないが、ＨＥＰＮドメインが挙げられ得る。
ある実施形態では、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、機能的ドメインに融合するかまたは作動可能に連結されている一般的な核酸結合タンパク質として使用され得る。例示的な機能的ドメインとしては、限定するものではないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳リプレッサー、ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ、スプライセオソーム、ビーズ、光誘導性／制御可能ドメインまたは化学的誘導／制御可能ドメインが挙げられ得る。
ある特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、以下からなる群より選択される生物に由来し得る；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ。
ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．Ｃ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａのＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ血清型１／２ｂ ｓｔｒであってもよい。ＳＬＣＣ３９５４ Ｃ２ｃ２ｐ及びｃｒＲＮＡ配列は、長さが４４〜４７ヌクレオチドであってもよく、５’２９−ｎｔのダイレクトリピート（ＤＲ）及び１５ｎｔ〜１８ｎｔのスペーサーがある。
ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．のＣ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ ＤＳＭ １９７５７ Ｃ２ｃ２ｐであってもよく、及びｃｒＲＮＡ配列は、４２〜５８ヌクレオチド長であってもよく、５’２４−２８−ｎｔダイレクトリピート（ＤＲ）など少なくとも２４ｎｔの５’ダイレクトリピート、及び１４ｎｔ〜２８ｎｔのスペーサーなど少なくとも１４ｎｔのスペーサー、または１９、２０、２１、２２など以上のｎｔ、例えば、１８〜２８、１９〜２８、２０〜２８、２１〜２８もしくは２２〜２８ｎｔなど少なくとも１８ｎｔのスペーサーを有する。
ある特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｍ６−０６３５であってよい。
ある特定の例示的な実施形態では、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質としては、限定するものではないが、以下の２１オルソログ種（例としては、複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）が挙げられる：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９、［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７（第２ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９−０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６−０６３５、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ−１０１３−ｂ、Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ、［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＨＫＣＩ００４、Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、及びＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．口腔分類群（ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ）８７９ ｓｔｒ．Ｆ０５５７。１２のさらなる非限定的な例は以下である：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１４４、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＴＳＬ５−１、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＯＲ３７、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＹＡＢ３００１、Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｈｕａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｒｉｐａｒｉａ、及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
特定の実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｌ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９またはＬ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質である。
ある特定の実施形態では、本発明によるＣ２ｃ２タンパク質は、以下の表に記載されるようなオルソログの１つであるか、もしくはそれに由来するか、または以下の表に記載されるような２つ以上のオルソログのキメラタンパク質であるか、または以下の表に記載されている１つのオルソログの変異体もしくはバリアント（またはキメラ変異体もしくはバリアント）であり、異種／機能ドメインとの融合を伴う、または伴わない、本明細書のいずれか定義されている、デッド（ｄｅａｄ）Ｃ２ｃ２、スプリットＣ２ｃ２、不安定化Ｃ２ｃ２などを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、以下の表１から選択される。
Figure 2021511795
上記の種の野性型タンパク質配列を下の表２に列挙する。ある特定の実施形態では、Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を示す。
Figure 2021511795
Figure 2021511795
本発明の実施形態では、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｒ９−０３１７）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｍ６−０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ Ｃ２ｃ２のいずれかの野生型配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むエフェクタータンパク質が提供される
本発明の実施形態では、エフェクタータンパク質は、本明細書に記載のコンセンサス配列を含むがこれに限定されないＶＩ型エフェクタータンパク質コンセンサス配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、コンセンサス配列は、Ｃ２ｃ２機能を媒介するＣ２ｃ２オルソログ中の触媒残基及びＨＥＰＮモチーフを含むがこれらに限定されない、保存されたアミノ酸残基及びモチーフを位置決めするのを補助し得る、複数のＣ２ｃ２オルソログから生成され得る。Ｇｅｎｅｉｏｕｓアラインメントを使用して上記の３３のオルソログから生成された、そのようなコンセンサス配列の１つは以下である：
ＭＫＩＳＫＶＸＸＸＶＸＫＫＸＸＸＧＫＬＸＫＸＶＮＥＲＮＲＸＡＫＲＬＳＮＸＬＢＫＹＩＸＸＩＤＫＩＸＫＫＥＸＸＫＫＦＸＡＸＥＥＩＴＬＫＬＮＱＸＸＸＢＸＬＸＫＡＸＸＤＬＲＫＤＮＸＹＳＸＪＫＫＩＬＨＮＥＤＩＮＸＥＥＸＥＬＬＩＮＤＸＬＥＫＬＸＫＩＥＳＸＫＹＳＹＱＫＸＸＸＮＹＸＭＳＶＱＥＨＳＫＫＳＩＸＲＩＸＥＳＡＫＲＮＫＥＡＬＤＫＦＬＫＥＹＡＸＬＤＰＲＭＥＸＬＡＫＬＲＫＬＬＥＬＹＦＹＦＫＮＤＸＩＸＸＥＥＥＸＮＶＸＸＨＫＸＬＫＥＮＨＰＤＦＶＥＸＸＸＮＫＥＮＡＥＬＮＸＹＡＩＥＸＫＫＪＬＫＹＹＦＰＸＫＸＡＫＮＳＮＤＫＩＦＥＫＱＥＬＫＫＸＷＩＨＱＪＥＮＡＶＥＲＩＬＬＸＸＧＫＶＸＹＫＬＱＸＧＹＬＡＥＬＷＫＩＲＩＮＥＩＦＩＫＹＩＸＶＧＫＡＶＡＸＦＡＬＲＮＸＸＫＢＥＮＤＩＬＧＧＫＩＸＫＫＬＮＧＩＴＳＦＸＹＥＫＩＫＡＥＥＩＬＱＲＥＸＡＶＥＶＡＦＡＡＮＸＬＹＡＸＤＬＸＸＩＲＸＳＩＬＱＦＦＧＧＡＳＮＷＤＸＦＬＦＦＨＦＡＴＳＸＩＳＤＫＫＷＮＡＥＬＩＸＸＫＫＪＧＬＶＩＲＥＫＬＹＳＮＮＶＡＭＦＹＳＫＤＤＬＥＫＬＬＮＸＬＸＸＦＸＬＲＡＳＱＶＰＳＦＫＫＶＹＶＲＸＢＦＰＱＮＬＬＫＫＦＮＤＥＫＤＤＥＡＹＳＡＸＹＹＬＬＫＥＩＹＹＮＸＦＬＰＹＦＳＡＮＮＸＦＦＦＸＶＫＮＬＶＬＫＡＮＫＤＫＦＸＸＡＦＸＤＩＲＥＭＮＸＧＳＰＩＥＹＬＸＸＴＱＸＮＸＸＮＥＧＲＫＫＥＥＫＥＸＤＦＩＫＦＬＬＱＩＦＸＫＧＦＤＤＹＬＫＮＮＸＸＦＩＬＫＦＩＰＥＰＴＥＸＩＥＩＸＸＥＬＱＡＷＹＩＶＧＫＦＬＮＡＲＫＸＮＬＬＧＸＦＸＳＹＬＫＬＬＤＤＩＥＬＲＡＬＲＮＥＮＩＫＹＱＳＳＮＸＥＫＥＶＬＥＸＣＬＥＬＩＧＬＬＳＬＤＬＮＤＹＦＢＤＥＸＤＦＡＸＹＪＧＫＸＬＤＦＥＫＫＸＭＫＤＬＡＥＬＸＰＹＤＱＮＤＧＥＮＰＩＶＮＲＮＩＸＬＡＫＫＹＧＴＬＮＬＬＥＫＪＸＤＫＶＳＥＫＥＩＫＥＹＹＥＬＫＫＥＩＥＥＹＸＸＫＧＥＥＬＨＥＥＷＸＱＸＫＮＲＶＥＸＲＤＩＬＥＹＸＥＥＬＸＧＱＩＩＮＹＮＸＬＸＮＫＶＬＬＹＦＱＬＧＬＨＹＬＬＬＤＩＬＧＲＬＶＧＹＴＧＩＷＥＲＤＡＸＬＹＱＩＡＡＭＹＸＮＧＬＰＥＹＩＸＸＫＫＮＤＫＹＫＤＧＱＩＶＧＸＫＩＮＸＦＫＸＤＫＫＸＬＹＮＡＧＬＥＬＦＥＮＸＮＥＨＫＮＩＸＩＲＮＹＩＡＨＦＮＹＬＳＫＡＥＳＳＬＬＸＹＳＥＮＬＲＸＬＦＳＹＤＲＫＬＫＮＡＶＸＫＳＬＩＮＩＬＬＲＨＧＭＶＬＫＦＫＦＧＴＤＫＫＳＶＸＩＲＳＸＫＫＩＸＨＬＫＳＩＡＫＫＬＹＹＰＥＶＸＶＳＫＥＹＣＫＬＶＫＸＬＬＫＹＫ （配列番号３２５）
別の非限定的な例では、コンセンサス配列の生成及び保存された残基の同定を支援するための配列アラインメントツールは、ＭＵＳＣＬＥアラインメントツール（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。例えば、ＭＵＳＣＬＥを使用すると、Ｃ２ｃ２オルソログ間で保存されている次のアミノ酸位置を、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃ２ｃ２において特定し得る：Ｋ２；Ｋ５；Ｖ６；Ｅ３０１；Ｌ３３１；Ｉ３３５；Ｎ３４１；Ｇ３５１；Ｋ３５２；Ｅ３７５；Ｌ３９２；Ｌ３９６；Ｄ４０３；Ｆ４４６；Ｉ４６６；Ｉ４７０；Ｒ４７４（ＨＥＰＮ）；Ｈ４７５；Ｈ４７９（ＨＥＰＮ）、Ｅ５０８；Ｐ５５６；Ｌ５６１；Ｉ５９５；Ｙ５９６；Ｆ６００；Ｙ６６９；Ｉ６７３；Ｆ６８１；Ｌ６８５；Ｙ７６１；Ｌ６７６；Ｌ７７９；Ｙ７８２；Ｌ８３６；Ｄ８４７；Ｙ８６３；Ｌ８６９；Ｉ８７２；Ｋ８７９；Ｉ９３３；Ｌ９５４；Ｉ９５８；Ｒ９６１；Ｙ９６５；Ｅ９７０；Ｒ９７１；Ｄ９７２；Ｒ１０４６（ＨＥＰＮ）、Ｈ１０５１（ＨＥＰＮ）、Ｙ１０７５；Ｄ１０７６；Ｋ１０７８；Ｋ１０８０；Ｉ１０８３；Ｉ１０９０。
高度に保存された残基を示すＨＥＰＮドメインの例示的な配列アラインメントを、図５０に示す。
ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂ及びグループ２９またはグループ３０タンパク質などのＶＩ型−Ｂエフェクタータンパク質である。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、Ｃ末端ＨＥＰＮドメイン、Ｎ末端ＨＥＰＮドメイン、またはその両方を含む。本発明の文脈において使用され得るＶＩ型−Ｂエフェクタータンパク質の例に関して、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題され、２０１６年１０月２１日に提出された米国特許出願第１５／３３１，７９２号、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題され、２０１６年１０月２１日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３０２、及びＳｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｓ１３ｂ ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ｂ ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６５，１−１３（２０１７）；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３，及び２０１７年３月１５日出願の「Ｎｏｖｅｌ Ｃａｓ１３ｂ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ」と題された、譲渡される米国仮出願番号が参照される。具体的な実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ酵素は、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍに由来する。ある特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、表３に列挙されている任意の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。
Figure 2021511795
ある特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１３ｂオルソログの野性型配列は、下の表４または５に見出される。
Figure 2021511795
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ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質は、２０１７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／５２５，１６５号、及び２０１７年８月１６日に出願されたＰＣＴ出願番号ＵＳ２０１７／０４７１９３に開示されているＣａｓ１３ｃエフェクタータンパク質である。Ｃａｓ１３ｃの例示的な野生型オルソログ配列を以下の表６に示す。
Figure 2021511795
特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、以下のいずれかから選択され得る。
Figure 2021511795
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Ｃａｓ１２タンパク質
ある特定の例示的な実施形態では、アッセイは、複数のＣａｓ１２オルソログまたは１つ以上のＣａｓ１３オルソログと組み合わせた１つ以上のオルソログを含んでもよい。ある特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１２オルソログは、Ｃｐｆ１オルソログである。ある特定の他の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１２オルソログは、Ｃ２ｃ１オルソログである。
Ｃｐｆ１オルソログ
本発明は、サブタイプＶ−Ａとして示されるＣｐｆ１遺伝子座に由来するＣｐｆ１エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は、「Ｃｐｆ１ｐ」、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質とも呼ばれる（そしてそのようなエフェクタータンパク質またはＣｐｆ１タンパク質またはＣｐｆ１遺伝子座に由来するタンパク質は、「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とも呼ばれる）。現在、サブタイプＶ−Ａ遺伝子座には、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｐｆ１と呼ばれる別個の遺伝子、及びＣＲＩＳＰＲアレイが含まれている。Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１、サブタイプＰＲＥＦＲＡＮ）は、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとともに、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチのクラスターの対応物を含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。ただし、Ｃｐｆ１には、全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインがなく、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
ＲＮＡ誘導型Ｃｐｆ１のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。１つの実施形態では、Ｃｐｆ１系は、ＲＮＡのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。別の実施形態では、Ｃｐｆ１系は、ｓｓＤＮＡのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。したがって、操作されたＣｐｆ１系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作のプラットフォームを提供する。Ｃｐｆ１は、哺乳類の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発された。Ｃｐｆ１は、配列固有の標的ＤＮＡ結合によって活性化されると、ＲＮＡ及びｓｓＤＮＡのロバストなコラテラル切断が可能である。
「オルソログ」（本明細書では「オルソログ」とも呼ばれる）及び「ホモログ」（本明細書では「ホモログ」とも呼ばれる）という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによって、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連する。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する、異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。ホモログ及びオルソログは、相同性モデリング（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖｏｌ １７２（１９８８），５１３を参照）または「ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ」（Ｄｅｙ Ｆ，Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ，Ｈｏｎｉｇ Ｂ．Ｔｏｗａｒｄ ａ「ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ」：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５．）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野での適用に関しては、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）も参照のこと。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ関連している。
Ｃｐｆ１遺伝子は、いくつかの多様な細菌のゲノムに見られ、通常はｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子とＣＲＩＳＰＲカセット（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１−ＦＮＦＸ１＿１４２８）と同じ遺伝子座にある。したがって、この推定上の新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトは、ＩＩ型−Ｂのレイアウトに似ているようである。さらに、Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１タンパク質には、トランスポゾンＯＲＦ−Ｂと相同であり、かつ活性なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９には存在しない）を含む、容易に識別可能なＣ末端領域が含まれている。ただし、Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ状況のないいくつかのゲノムにも存在し、ＯＲＦ−Ｂとの比較的高い類似性によって、それがトランスポゾン構成要素であり得ることが示唆される。これが本物のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であり、Ｃｐｆ１がＣａｓ９の機能的アナログである場合、それは新規なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプ、すなわちＶ型であることが示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７−７５を参照のこと）。しかし、本明細書に記載のとおり、Ｃｐｆ１は、それを同一のドメイン構造は有さず、したがってサブタイプＶ−ＢにあるとされているＣ２ｃ１ｐと区別するように、サブタイプＶ−Ａにあるものとされている。
具体的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む属由来の生物体由来のＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。
さらなる具体的な実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉから選択される生物体由来である。
エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片、及び第２のエフェクター（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質オルソログ由来の第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含み、この第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）オルソログのうち少なくとも１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む生物体由来のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）；例えば、第１及び第２の断片の各々が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓを含む生物体のＣｐｆ１から選択される、第１の断片及び第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここでこの第１及び第２の断片が、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質；例えば、第１の断片及び第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここでこの第１及び第２の断片が、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ；Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ；Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅのＣｐｆ１から選択され、この第１及び第２の断片が、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質を含んでもよい。
さらに好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅから選択される細菌種由来である。ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０から選択される細菌種由来である。ある特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、限定するものではないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎａｖｉｃｉｄａを含むＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １の亜種由来である。
いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ｐは、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍの属由来の生物体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅの細菌種由来の生物体由来のＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＯＬＡ１６０４９．１に相当する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、またはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＯＬＡ１６０４９．１と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０、例えば、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％という配列相動性または配列同一性を有する。当業者は、これが配列同一性が短縮型の長さにわたって決定される短縮型のＣｐｆ１タンパク質を含むことを理解する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクターは、ＴＴＴＮまたはＣＴＴＮのＰＡＭ配列を認識する。
具体的な実施形態では、本明細書で言及されるＣｐｆ１の相同体またはオルソログは、Ｃｐｆ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣｐｆ１のホモログまたはオルソログは、野性型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。Ｃｐｆ１が１つ以上の変異を有する（変異した）場合、本明細書で言及される上記Ｃｐｆ１のホモログまたはオルソログは、変異したＣｐｆ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
一実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉを含むがこれらに限定されない属の生物体のオルソログであり得る。具体的な実施形態では、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７を含むがこれに限定されない種の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、本明細書で言及されるＣｐｆのホモログまたはオルソログは、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列の１つ以上と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣｐｆのホモログまたはオルソログは、異性型ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、またはＬｂＣｐｆ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
具体的な実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、またはＬｂＣｐｆ１と、少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０、例えば少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣｐｆ１タンパク質は、野生型のＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１と少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より具体的には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。具体的な実施形態では、本発明のＣｐｆ１タンパク質は、ＦｎＣｐｆ１と６０％未満の配列同一性を有する。当業者は、これがＣｐｆ１タンパク質の切断型を含み、それにより配列同一性が切断型の長さにわたって決定されることを理解するであろう。
以下のうちの特定のものでは、Ｃｐｆ１アミノ酸の後に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（斜体字）、グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、及び３ｘＨＡタグが続く。１−Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）（配列番号２８１）；３−Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）（配列番号２８２）；４−Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ（ＢｐＣｐｆ１）（配列番号２８３）；５−Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）（配列番号２８４）；６−Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）（配列番号２８５）；７−Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）（配列番号２８６）；８−Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）（配列番号２８７）；９−Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）（配列番号２８８）；１０−Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ（ＣＭｔＣｐｆ１）（配列番号２８９）；１１−Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ（ＥｅＣｐｆ１）（配列番号２９０）；１２−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１）（配列番号２９１）；１３−Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ（ＬｉＣｐｆ１）（配列番号２９２）；１４−Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）（配列番号２９３）；１５−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ（ＰｃＣｐｆ１）（配列番号２９４）；１６−Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ（ＰｄＣｐｆ１）（配列番号２９５）；１７−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ（ＰｍＣｐｆ１）（配列番号２９６）；１８−Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）（配列番号２９７）；１９−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）（配列番号２９８）；２０−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）（配列番号２９９）；及び２１−Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）（配列番号３００）が続く。
さらなるＣｐｆ１オルソログとしては、ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２２５１２３．１、ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２３７２６０．１、ＮＣＢＩ ＷＰ＿０５５２７２２０６．１、及びＧｅｎＢａｎｋ ＯＬＡ１６０４９．１が挙げられる。
Ｃ２ｃ１オルソログ
本発明は、サブタイプＶ−Ｂとして示されるＣ２ｃ１遺伝子座に由来するＣ２ｃ１エフェクタータンパク質の使用を包含する。本明細書では、そのようなエフェクタータンパク質は「Ｃ２ｃ１ｐ」とも呼ばれ、例えばＣ２ｃ１タンパク質である（そしてそのようなエフェクタータンパク質またはＣ２ｃ１タンパク質またはＣ２ｃ１遺伝子座に由来するタンパク質は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とも呼ばれる）。現在、サブタイプＶ−Ｂ遺伝子座には、ｃａｓ１−Ｃａｓ４融合、ｃａｓ２、Ｃ２ｃ１と呼ばれる別個の遺伝子、及びＣＲＩＳＰＲアレイが含まれている。Ｃ２ｃ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃ２ｃ１）は、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとともに、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチなクラスターの対応物を含む大きなタンパク質（約１１００〜１３００アミノ酸）である。ただし、Ｃ２ｃ１には全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインがなく、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃ２ｃ１配列で隣接している。したがって、具体的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
Ｃ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂとしても知られる）タンパク質は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。その切断は、ｔｒａｃｒ ＲＮＡに依存して、ガイド配列及びダイレクトリピートを含むガイドＲＮＡを動員し、このガイド配列は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖を形成する。現在の研究に基づくと、Ｃ２ｃ１ヌクレアーゼ活性は、ＰＡＭ配列の認識も必要とし、それに依存する。Ｃ２ｃ１ ＰＡＭ配列は、Ｔリッチな配列である。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’ＴＴＮ３’または５’ＡＴＴＮ３’であり、Ｎは任意のヌクレオチドである。具体的な実施形態では、ＰＡＭ配列は５’ＴＴＣ３’である。具体的な実施形態では、ＰＡＭは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの配列にある。
Ｃ２ｃ１は、５’オーバーハングまたは標的配列のＰＡＭ遠位側の「スティッキーエンド」で、標的遺伝子座に互い違いのカットを作成する。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは７ｎｔである。Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｋｅ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１７Ｆｅｂ２；６５（３）：３７７−３７９を参照のこと。
本発明は、Ｃ２ｃ１（Ｖ型−Ｂ；Ｃａｓ１２ｂ）エフェクタータンパク質及びオルソログを提供する。「オルソログ」（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）（本明細書では「オルソログ」（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）とも呼ばれる）及び「ホモログ」（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（本明細書では「ホモログ」（ｈｏｍｏｌｏｇ）とも呼ばれる）という用語は、当該技術分野で周知である。さらなるガイダンスによって、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、それがホモログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連する。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」とは、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは類似の機能を実行する異なる種のタンパク質である。オーソロガスタンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。ホモログ及びオルソログは、ホモロジーモデリングによって特定され得る（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｖｏｌ １７２（１９８８），５１３を参照のこと）または「ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ」（Ｄｅｙ Ｆ、Ｃｌｉｆｆ Ｚｈａｎｇ Ｑ、Ｐｅｔｒｅｙ Ｄ、Ｈｏｎｉｇ Ｂ．Ｔｏｗａｒｄ ａ“ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５．を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野での適用に関しては、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ（２０１５）も参照のこと。相同タンパク質は、構造的に関連している可能性があるが、必ずしもそうである必要はないか、または部分的にのみ構造的に関連している。
Ｃ２ｃ１遺伝子は、典型的にはｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲカセットを有する同じ遺伝子座において、いくつかの多様な細菌ゲノムに見られる。したがって、この推定上の新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトは、ＩＩ型−Ｂのレイアウトに似ているようである。さらに、Ｃａｓ９と同様に、Ｃ２ｃ１タンパク質には、活性なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９にはない）が含まれている。
具体的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅを含む属に由来する生物体に由来するＣ２ｃ１エフェクタータンパク質である。
さらなる具体的な実施形態では、Ｃ２ｃ１エフェクタータンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ４９０２５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １７９７５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７９８０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ株Ｃ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ（例えば、ＤＳＭ １０７１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ（例えば、株ＭＬＦ−１）、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ ＷＯＲ＿２ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７５７２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ（例えば、株Ｂ４１６６）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １８７３４）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｒｂａｒｉｕｓ（例えば、ＤＳＭ １３６０９）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ８０９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ（例えば、ＯＲＳ ２０６０）から選択される種に由来する。
エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃ２ｃ１）オルソログ由来の第１の断片及び第２のエフェクター（例えば、Ｃ２ｃ１）タンパク質オルソログ由来の第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含み得、ここでこの第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃ２ｃ１）オルソログの少なくとも１つは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａｉ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、ａｎｄ Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅを含む生物体由来のエフェクタータンパク質（例えば、Ｃ２ｃ１）、例えば、第１の断片及び第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、この第１及び第２の断片の各々は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａｉ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅを含む生物体のＣ２ｃ１から選択され、ここでこの第１及び第２の断片は、同じ細菌由来ではない、エフェクタータンパク質、例えば、第１の断片及び第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質であって、この第１及び第２の断片の各々は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ４９０２５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １７９７５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７９８０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ株Ｃ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ（例えば、ＤＳＭ １０７１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ（例えば、株ＭＬＦ−１）、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ ＷＯＲ＿２ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７５７２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ（例えば、株Ｂ４１６６）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １８７３４）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｒｂａｒｉｕｓ（例えば、ＤＳＭ １３６０９）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ８０９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ（例えば、ＯＲＳ ２０６０）のＣ２ｃ１から選択され、ここでこの第１及び第２の断片は、同じ細菌由来ではないエフェクタータンパク質を含んでもよい。
より好ましい実施形態では、Ｃ２ｃ１ｐは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ４９０２５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １７９７５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７９８０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ株Ｃ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ（例えば、ＤＳＭ １０７１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ（例えば、株ＭＬＦ−１）、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ ＷＯＲ＿２ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７５７２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ（例えば、株Ｂ４１６６）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １８７３４）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｒｂａｒｉｕｓ（例えば、ＤＳＭ １３６０９）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ８０９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ（例えば、ＯＲＳ ２０６０）．ある特定の実施形態では、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ４９０２５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １７９７５）から選択される細菌種に由来する。
具体的な実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、例えば、野生型Ｃ２ｃ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。Ｃ２ｃ１が１つ以上の変異を有する（変異した）場合、本明細書で言及される上記Ｃ２ｃ１の相同体またはオルソログは、変異したＣ２ｃ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
一実施形態では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、限定するものではないが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａｉ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅを含む属の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、Ｖ型Ｃａｓタンパク質は、限定するものではないが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（例えば、ＡＴＣＣ ４９０２５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １７９７５）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７９８０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ株Ｃ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｎｄｏｗｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ（例えば、ＤＳＭ １０７１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ（例えば、株ＭＬＦ−１）、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＯＸＹＡ１２、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｈｉｃａ ＷＯＲ＿２ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＡＶ５、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＴ−ＮＡＧＡＢ−Ｄ１、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＲＢＧ＿１３＿４６＿１０、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＢ１＿２７＿１３、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＢＡ２４２９、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｉｄｕｓ（例えば、ＤＳＭ １７５７２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ（例えば、株Ｂ４１６６）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＣＦ１１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＳＰ２．１、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｒｈａｂｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｉｖｏｒａｎｓ（例えば、ＤＳＭ １８７３４）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｒｂａｒｉｕｓ（例えば、ＤＳＭ １３６０９）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（例えば、ＡＴＣＣ ８０９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ（例えば、ＢＡＢ−２５００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ（例えば、ＯＲＳ ２０６０）を含む種の生物体のオルソログであってもよい。具体的な実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、本明細書に開示される１つ以上のＣ２ｃ１配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ１のホモログまたはオルソログは、野生型ＡａｃＣ２ｃ１またはＢｔｈＣ２ｃ１と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
具体的な実施形態では、本発明のＣ２ｃ１タンパク質は、ＡａｃＣ２ｃ１またはＢｔｈＣ２ｃ１と、少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０、例えば少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％などの配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態では、本明細書で言及されるＣ２ｃ１タンパク質は、野生型ＡａｃＣ２ｃ１と、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、より具体的には少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えばでは少なくとも９５％などの配列同一性を有する。具体的な実施形態では、本発明のＣ２ｃ１タンパク質は、ＡａｃＣ２ｃ１と６０％未満の配列同一性を有する。当業者は、これがＣ２ｃ１タンパク質の切断形態を含み、それにより配列同一性が切断形態の長さにわたって決定されることを理解するであろう。
本発明による、ある特定の方法では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が、標的配列を含む標的遺伝子座の一方または両方のＤＮＡ鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異されることが好ましい。特定の実施形態では、Ｃ２ｃ１タンパク質の１つ以上の触媒ドメインを変異させて、標的配列の１つのＤＮＡ鎖のみを切断する変異Ｃａｓタンパク質を生成する。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質が実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠くように、対応する野生型酵素に関して変異され得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、変異酵素の切断活性が、酵素の非変異型の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下である場合、全てのＤＮＡ及び／またはＲＮＡ切断活性を実質的に欠いていると見なされ得る；一例は、変異形態の核酸切断活性が、非変異形態と比較してゼロまたは無視できる場合であり得る。
本明細書で提供される方法の、ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質は、１つのＤＮＡ鎖のみを切断する変異したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、すなわち、ニッカーゼである。より具体的には、本発明の文脈において、ニッカーゼは、非標的配列、すなわち、標的配列の反対のＤＮＡ鎖上にあり、ＰＡＭ配列の３’にある配列内の切断を確実にする。さらなるガイダンスによって、そして限定するものではないが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓからのＣ２ｃ１のＮｕｃドメインのアルギニンからアラニンへの置換（Ｒ９１１Ａ）は、両方の鎖をニッカーゼに切断するヌクレアーゼからＣ２ｃ１をニッカーゼに変換する（一本鎖を切断する）。酵素がＡａｃＣ２ｃ１ではない場合、対応する位置の残基に変異を生じさせ得ることは、当業者には理解されよう。
ある特定の実施形態では、Ｃ２ｃ１タンパク質は、ＲｕｖＣドメインに変異を含む触媒的に不活性なＣ２ｃ１である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｃ２ｃ１におけるアミノ酸位置Ｄ５７０、Ｅ８４８、またはＤ９７７に対応する変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣ２ｃ１タンパク質は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ Ｃ２ｃ１におけるＤ５７０Ａ、Ｅ８４８Ａ、またはＤ９７７Ａに対応する変異を含む。
ＲＮＡ誘導Ｃ２ｃ１のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。１つの実施形態では、Ｃ２ｃ１系は、ＲＮＡのコラテラル非特異的切断を提供及び利用するように操作される。別の実施形態では、Ｃ２ｃ１系は、ｓｓＤＮＡのコラテラル非特異的切断を提供し、利用するように操作される。したがって、操作されたＣ２ｃ１系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作、ならびに細胞死の誘導のためのプラットフォームを提供する。Ｃ２ｃ１は、哺乳動物の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発された。Ｃ２ｃ１は、配列固有の標的ＤＮＡ結合によって活性化されると、ＲＮＡ及びｓｓＤＮＡのロバストなコラテラル切断が可能である。
ある特定の実施形態では、Ｃ２ｃ１は、インビトロ系または細胞において、一時的または安定的に提供または発現され、細胞核酸を非特異的に切断するように標的化または誘発される。一実施形態では、Ｃ２ｃ１は、ｓｓＤＮＡ、例えばウイルスのｓｓＤＮＡをノックダウンするように操作される。別の実施形態では、Ｃ２ｃ１は、ＲＮＡをノックダウンするように操作される。系は、ノックダウンが細胞またはインビトロの系に存在する標的ＤＮＡに依存するように、またはこの系もしくは細胞への標的核酸の添加によって誘発されるように考案され得る。
一実施形態では、Ｃ２ｃ１系は、例えば異常なＤＮＡの切断が不完全または効果的でない可能性がある場合に、異常なＤＮＡ配列の存在によって識別可能な細胞のサブセットにおいてＲＮＡを非特異的に切断するように操作される。非限定的な一例では、がん細胞に存在し、細胞形質転換を駆動するＤＮＡ転座が標的とされる。染色体ＤＮＡ及び修復を受ける細胞の小集団は、生き残る可能性があるが、非特異的なコラテラルリボヌクレアーゼ活性は、有利に、存在し得る生存細胞の細胞死をもたらす。
コラテラル活性は、多くの臨床診断に有用なＳＨＥＲＬＯＣＫと呼ばれる高感度でかつ特異的な核酸検出プラットフォームについて近年活用された（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５６，４３８−４４２（２０１７））。
本発明によれば、操作されたＣ２ｃ１系は、ＤＮＡまたはＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性のために最適化され、哺乳動物細胞で発現され、細胞内のレポーター分子または転写物を効果的にノックダウンするように標的化され得る。
２．ガイドＲＮＡ
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」、「ｃｒＲＮＡ」「ガイドＲＮＡ」または「シングルガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズして、ガイド配列及びＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含むＲＮＡ標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を差し向けるように、標的核酸配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。いくつかの例示的な実施形態では、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くための（核酸標的化ガイドＲＮＡ内の）ガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、核酸標的化複合体の成分をコードするベクターを用いてトランスフェクションなどによって、続いて、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアアッセイなどによる、標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）の評価によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験されるガイド配列及びその試験ガイドとは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の構成要素を、を提供すること、ならびに試験と対照のガイドの配列の反応の間の標的配列での結合または切断率の比較により試験管内で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするために、ガイド配列、したがって核酸標的ガイドを選択してもよい。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドは、核酸標的化ガイド内の二次構造の程度を低減するように選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約７５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、またはそれ未満の％である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの１つの例は、ｍＦｏｌｄであり、ｍＦｏｌｄは、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄであり、これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａで開発されたものである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４、及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照のこと）。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流（すなわち５’）に位置してもよい。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流（すなわち、３’）に位置してもよい。
ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５〜３５ｎｔである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、スペーサー長は、１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６、または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４、または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、あるいは３５ｎｔ、またはそれ以上である。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ系とは、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されているものであり、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の場合はＣａｓ９遺伝子、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「スペーサー」とも呼ばれる）、またはその用語が本明細書で使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を総称的に指す。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況ではプロトスペーサーとも呼ばれる）によって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の状況において、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列への相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と呼ばれる。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、オルガネラ、小胞、リポソームまたは粒子の中またはそれに由来する核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、特に非核用途の場合、ＮＬＳは好ましくない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上の核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上のＮＬＳ及び１つ以上のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを検索することにより、インシリコでダイレクトリピートを同定し得る：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂのウィンドウで見られる；２．２０〜５０ｂｐの範囲；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔。いくつかの実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば１と２、２と３、または１と３を使用し得る。いくつかの実施形態では、３つ全ての基準を使用してもよい。
本発明の実施形態では、ガイド配列という用語及びガイドＲＮＡという用語、すなわちＣａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドし得るＲＮＡは、ＷＯ ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献のように交換可能に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示すために、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列される場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列のアラインメントに適した任意のアルゴリズムを使用して決定され得る。その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示すガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、続いて、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによる、標的配列内の優先的切断の評価などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験と対照ガイド配列反応の間の標的配列での結合または切断速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、または１００％またはそれ以上であってもよく；ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５より多い、またはそれより多いのヌクレオチド長であってもよく；あるいは、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２より少ない、またはそれ未満のヌクレオチド長であってもよく；有利には、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長である。しかし、本発明のある態様は、オフ標的相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイドを低減することである。実際、この実施例では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が８０％を超えて約９５％までの相補性、例えば８３％〜８４％または８８〜８９％または９４〜９５％の相補性を有する、標的配列とオフ標的配列との間を区別し得る変異（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２または３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフ標的を区別する）を含むことが示されている。したがって、本発明の状況では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％、または１００％より大きい。オフ標的は、配列とガイドとの間の１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満の相補性であり、オフ標的が配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
ガイド改変
あるある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然には存在しない核酸、及び／または天然には存在しないヌクレオチド、及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学的改変を含む。天然には存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド、及び天然には存在しないヌクレオチドの混合物が挙げられ得る。天然には存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び／または塩基部分で改変され得る。本発明のある１つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の１つでは、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、１つ以上の天然には存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合、ボラノリン酸連結、リボース環の２’と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋型核酸（ＢＮＡ）を有するヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、または２’−フルオロアナログが挙げられる。改変塩基のさらなる例としては、限定するものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学改変の例としては、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を１つ以上の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドは、オン標的特異性とオフ標的特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性の向上、及び活性の増大を含み得る（２０１５年６月２９日にオンラインで公開されたＨｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０、Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０−Ｅ７１１１、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１−９０４、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０−１１８７５、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４−１４７１、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５−９８９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１−０１７−００６６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの５’末端及び／または３’末端は、さまざまな機能性部分によって改変され、こうした機能性部分としては、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４−８３を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ１に結合する領域に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある１つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、限定されないが、５’及び／または３’末端、ステムループ領域及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の５’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルを化学的に改変すると、ガイドの機能が消失し得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、または少なくとも７５個のヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端または５’末端のいずれかに位置する３〜５ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変（２’−Ｆ改変など）が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端に２’−Ｆ改変が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する３〜５ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５−９８９を参照のこと）。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート（ＰＳ）で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する５を超えるヌクレオチドが、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、またはＳ−拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０−Ｅ７１１１を参照のこと）。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分としては、限定するものではないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、化学部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子など）に付加するために使用され得る。化学的に改変されたそのようなガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ系は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡまたは類似のポリヌクレオチドを利用し得、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの混合物であるか、及び／またはこのポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドアナログを含む。この配列は、バルジ、ヘアピンまたはステムループ構造などの天然のｃｒＲＮＡの構造を含むがこれらに限定されない任意の構造を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する。
ある特定の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡが使用される。ガイドＲＮＡの化学改変の例としては、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の、１つ以上の末端ヌクレオチドでの組み込みが挙げられる。このような化学的に改変されたガイドＲＮＡは、非改変ガイドＲＮＡと比較して、安定性向上及び活性向上があり得るが、オン標的対オフ標的の特異性は予測し得ない。（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，２０１５年６月２９日オンライン公開、を参照のこと）。化学的に改変されたガイドＲＮＡとしてはさらに、限定するものではないが、ホスホロチオエート結合及びリボース環の２’と４’炭素間のメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを有するＲＮＡが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５以上、またはそれより多いヌクレオチド長またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２より少ない、またはそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示すガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素（試験すべきガイド配列を含む）は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクションなどによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、次に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによる、標的配列内の優先的切断の評価が続く。同様に、標的ＲＮＡの切断は、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素（試験すべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照配列を含む）を提供すること、ならびに試験と対照のガイド配列反応との間の標的配列での切断の結合または速度を比較することにより、試験管で評価してもよい。他のアッセイが可能であり、当業者が思いつくであろう。
いくつかの実施形態では、ガイドに対する改変は、化学改変、挿入、欠失、または分割である。いくつかの実施形態では、化学改変としては、限定するものではないが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログ、２’−デオキシアナログ、２−チオウリジンアナログ、Ｎ６−メチルアデノシンアナログ、２’−フルオロアナログ、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ−拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、または２’−Ｏ−メチル−３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を組み込むことが挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドは、ホスホロチオエート改変のうちの１つ以上を含む。あるある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２５個が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、シード領域における１つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、３’末端における１つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、５’ハンドルにおけるヌクレオチドはいずれも、化学的に改変されない。いくつかの実施形態では、シード領域における化学改変は、軽微な改変（２’−フルオロアナログの組み込みなど）である。具体的な実施形態では、シード領域のヌクレオチドの１ヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。いくつかの実施形態では、３’末端における５または１０個のヌクレオチドが化学的に改変される。Ｃｐｆ１ ＣｒＲＮＡの３’末端をそのように化学的に改変することで、遺伝子切断効率が改善する（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６参照のこと）。具体的な実施形態では、３’末端における５ヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。具体的な実施形態では、３’末端における１０のヌクレオチドが、２’−フルオロアナログで置き換えられる。具体的な実施形態では、３’末端における５ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル（Ｍ）アナログで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。いくつかの実施形態では、欠失、挿入、分割、または化学改変を有するように、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。ある特定の実施形態では、ループは、ヌクレオチドを３つ、４つ、または５つ含む。ある特定の実施形態では、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵという配列を含む。
ガイド配列、したがって核酸標的ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列または標的分子を標的とするように選択され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」または「標的分子」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列または分子を指し、ここで標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるかまたはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。言い換えると、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、かつＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指向される、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ））からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、標的分子は標的ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、この系は、標的ＤＮＡと結合し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１８ヌクレオチドであり、２８ヌクレオチド未満である。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２８ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９〜２５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２０ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２３ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は２５ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、切断効率の調節は、ミスマッチの導入、例えばスペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含む、スペーサー配列と標的配列の間の１つまたは２つのミスマッチなどの、例えば、１つ以上のミスマッチの導入によって利用され得る。例えば二重のミスマッチがより中心的（すなわち、３’または５’ではない）であるほど、より多くの切断効率が影響を受ける。したがって、スペーサーに沿ったミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の１００％未満の切断が望ましい場合（例えば、細胞集団において）、スペーサーと標的配列との間の１つ以上、好ましくは２つなどのミスマッチがスペーサー配列に導入され得る。ミスマッチ位置のスペーサーに沿ってより中央にあるほど、切断率は低くなる。
ある特定の例示的な実施形態では、切断効率を利用して、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、変形、または（点）変異など、単一ヌクレオチドが異なる２つ以上の標的を区別し得る単一ガイドを設計してもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＮＰ（または他の単一ヌクレオチドの変形）に対する感度が低下している可能性があり、ある特定レベルの効率でＳＮＰ標的を切断し続ける。したがって、２つの標的または標的のセットについて、標的の１つ、すなわち、オン標的のＳＮＰに相補的であるヌクレオチド配列を用いてガイドＲＮＡを設計してもよい。ガイドＲＮＡはさらに、合成ミスマッチを有するように設計されている。本明細書で使用される場合、「合成ミスマッチ」とは、天然に存在するＳＮＰの上流または下流に導入される非天然に生じるミスマッチ、例えば、上流または下流で最大５ヌクレオチド、例えば４、３、２、または１ヌクレオチド上流または下流、好ましくは上流または下流で最大３ヌクレオチド、より好ましくは上流または下流で最大２ヌクレオチド、最も好ましくは上流または下流で１ヌクレオチド（すなわち、ＳＮＰに隣接）を指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクターがオン標的ＳＮＰに結合すると、合成ミスマッチで単一のミスマッチのみが形成され、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは引き続き活性化され、検出可能なシグナルが生成される。ガイドＲＮＡがオフ標的のＳＮＰにハイブリダイズすると、ＳＮＰからのミスマッチ及び合成ミスマッチの２つのミスマッチが形成され、検出可能なシグナルは生成されない。したがって、本明細書に開示される系は、集団内のＳＮＰを区別するように設計され得る。例えば、この系を使用して、単一のＳＮＰが異なる病原性株を区別するか、または限定するものではないが、がん関連ＳＮＰなどの疾患関連ＳＮＰなどの特定の疾患特異的ＳＮＰを検出してもよい。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡを、ＳＮＰがスペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０（５’末端から開始）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から始まる）に位置するように設計される。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡを、ＳＮＰがスペーサー配列の２、３、４、５、６、または７位（５’末端から始まる）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡを、ＳＮＰがスペーサー配列の３、４、５、または６位（５’末端から始まる）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡを、ＳＮＰがスペーサー配列の３位（５’末端から始まる）に位置するように設計する。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチ（例えば、合成ミスマッチ、すなわちＳＮＰ以外の追加の変異）がスペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０（開始５’の端）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または９位（５’末端から始まる）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の４、５、６、または７位（５’末端から始まる）に位置するように設計する。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサーの３位、４位、５位、６位、または７位に位置するように設計する（５’末端から始まる）。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチが（５’末端から始まる）スペーサー配列の５位に位置するように設計する。
ある特定の実施形態では、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド上流に位置するようにガイドＲＮＡを設計する（すなわち、１つの介在ヌクレオチド）。
ある特定の実施形態では、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド下流に位置するようにガイドＲＮＡを設計する（すなわち、１つの介在ヌクレオチド）。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の５位に位置し（５’末端から始まる）、ＳＮＰがスペーサー配列の３位に位置する（５’末端から始まる）ように設計する。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるように標的ＲＮＡまたはＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型を検出するように設計されてもよいし、またはそれは、ＲＮＡ転写物のスプライスバリアントを検出するように設計されてもよい。
本明細書に記載の実施形態は、本明細書に考察されるベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察される真核細胞中で（インビトロ、すなわち単離された真核細胞中で）１つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。変異（複数可）は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した細胞（複数可）の各標的配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列における１〜７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列における１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられる。変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列で２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、削除、または置換が挙げられ得る。変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した上記細胞（複数可）の各標的配列における４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドの導入、欠失または置換が挙げられ得る。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む）の形成は、標的配列における、または（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対以内の）その近位での切断をもたらすが、特にＲＮＡ標的の場合には、例えば二次構造に依存し得る。
本明細書で使用される場合、「マスキング構築物」とは、本明細書に記載される活性化ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質によって切断されるか、または他の方法で不活性化され得る分子を指す。「マスキング構築物」という用語は、代わりに「検出構築物」と呼ばれる場合もある。ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＲＮＡベースのマスキング構築物である。ＲＮＡベースのマスキング構築物は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって切断可能なＲＮＡ要素を含む。ＲＮＡ要素の切断は、薬剤を放出するか、または検出可能なシグナルの生成を可能にする立体構造変化を生成する。検出可能なシグナルの生成を防止またはマスキングするためにＲＮＡ要素をどのように使用できるかを示す例示的な構築物を以下に記載しており、本発明の実施形態はその変種を含む。切断の前、またはマスキング構築物が「活性な」状態の場合、マスキング構築物は、正の検出可能なシグナルの生成または検出をブロックする。ある特定の例示的な実施形態では、最小のバックグラウンドシグナルが、活性なＲＮＡマスキング構築物の存在下で生成され得ることが理解されよう。正の検出可能なシグナルは、光学的、蛍光的、化学発光的、電気化学的、または当該分野で公知の他の検出方法を使用して検出され得る任意のシグナルであり得る。「正の検出可能なシグナル」という用語は、マスキング構築物の存在下で検出可能な他の検出可能なシグナルと区別するために使用される。例えば、特定の実施形態では、マスキング剤が存在するときに第１のシグナル（すなわち、負の検出可能なシグナル）が検出され得、次いで標的分子の検出及び活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるマスキング剤の切断または非活性化の際に第２のシグナル（例えば、正の検出可能なシグナル）に変換される。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、遺伝子産物の生成を抑制し得る。遺伝子産物は、試料に加えられるレポーター構築物によってコードされてもよい。マスキング構築物は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉経路に関与する干渉ＲＮＡであってもよい。マスキング構築物はまた、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含んでもよい。存在している間、マスキング構築物は、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、標識プローブ、アプタマー、または抗体によって、ただしマスキング構築物の存在について、そうでなければ検出可能である、蛍光タンパク質または他のＲＮＡ転写物またはタンパク質であってもよい。エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物は切断されるか、さもなければサイレンシングされて、遺伝子産物の発現及び検出が正の検出可能なシグナルとして可能になる。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な正のシグナルを生成するために必要な１つ以上の試薬を隔離して、マスキング構築物からの１つ以上の試薬の放出が検出可能な正のシグナルの生成をもたらし得る。１つ以上の試薬は、比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、または他の任意の検出可能なシグナルを生成するために組み合わされてもよく、そのような目的に適していることが知られている任意の試薬を含んでもよい。特定の例示的な実施形態では、１つ以上の試薬は、１つ以上の試薬に結合するＲＮＡアプタマーによって隔離される。標的分子の検出時にエフェクタータンパク質が活性化され、ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーが分解されると、１つ以上の試薬が放出される。
ある特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡは、疾患状態の診断となる１つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。
いくつかの実施形態では、疾患はがんであってもよい。がんとしては、限定するものではないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤血球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキン病）、ウォルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、または多発性骨髄腫などの液体腫瘍を含み得る。
がんは、限定するものではないが、肉腫及び癌腫などの固形腫瘍を含み得る。固形腫瘍の例としては、限定するものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、上皮癌、気管支癌、肝癌、結腸直腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌）、肛門癌、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、膵島細胞癌、神経内分泌腫瘍）、乳癌（例えば、乳管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液癌）、卵巣癌（例えば、卵巣上皮癌または表面上皮間質性腫瘍、例としては、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍及びムチン性嚢胞腺癌、性索間質性腫瘍）、前立腺癌、肝臓癌及び胆管癌（例えば、肝細胞癌、胆管癌、血管腫）、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫）、子宮頸癌、子宮癌（例えば、子宮内膜腺癌、子宮乳頭漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫及び平滑筋肉腫、混合ミュラー腫瘍）、精巣癌、胚細胞腫瘍、肺癌（例えば、肺腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫）、膀胱癌、印環細胞癌、頭頸部癌（例えば、扁平上皮癌）、食道癌腫（例えば、食道腺癌）、脳の腫瘍（例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、黒色腫、胃癌（例えば、胃腺癌、消化管間質腫瘍）、またはカルチノイドが挙げられる。リンパ増殖性障害も増殖性疾患と見なされる。
いくつかの実施形態において、疾患は自己免疫疾患であってもよく、これには必ずしも限定するものではないが、関節リウマチ、ループス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、ギランバレー症候群、グレーブス病、またはその他の自己免疫疾患が挙げられる。
いくつかの実施形態では、疾患は感染症であってもよい。感染症としては、必ずしも限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物による感染症が挙げられる。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、対象から得られる生物学的試料などの、試料中の１つ以上の微生物因子の存在を検出することに関する。特定の例示的な実施形態では、微生物は、細菌、真菌、酵母、原生動物、寄生生物、またはウイルスであってよい。したがって、本明細書に開示される方法は、微生物種の迅速な同定、微生物タンパク質（抗原）、抗体、抗体遺伝子の存在のモニタリング、特定の表現型（例えば、細菌耐性）の検出、疾患の進行及び／または発生のモニタリング、ならびに抗生物質スクリーニングを必要とする他の方法とともに（または組み合わせての）他の方法の使用に適合され得る。本明細書に開示された実施形態の迅速かつ高感度の診断能力、単一ヌクレオチドの違いまでの微生物種のタイプの検出、及びＰＯＣデバイスとして展開される能力のため、本明細書に開示された実施形態は、適切な抗生物質または抗ウイルス薬の選択など、治療計画のガイドとして使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、微生物汚染の存在について環境試料（空気、水、表面、食品など）をスクリーニングするために使用され得る。
開示されるのは、細菌、ウイルス、真菌、酵母、または寄生生物種などの微生物種を同定する方法である。本明細書に開示される特定の実施形態は、単一の試料内または複数の試料にわたって微生物種を特定及び区別し、多くの異なる微生物の認識を可能にする方法及び系を説明する。本方法は、試料中の標的核酸配列の存在を検出することにより、病原体の検出及び１つ以上の生物体の２つ以上の種、例えば細菌、ウイルス、酵母、原生動物、及び真菌またはそれらの組み合わせの識別を、生物学的または環境的試料中において、可能にする。試料から得られた正のシグナルは、微生物の存在を示す。複数の微生物は、２つ以上のエフェクタータンパク質の使用を採用することにより、本発明の方法及び系を使用して同時に同定し得、各エフェクタータンパク質は、特定の微生物標的配列を標的とする。このようにして、多数の微生物を一度に検出し得る特定の対象に対してマルチレベル分析を実行し得る。いくつかの実施形態では、複数の微生物の同時検出は、１つ以上の微生物種を特定し得るプローブのセットを使用して実行され得る。
試料の多重分析は、試料の大規模な検出を可能にし、分析の時間とコストを削減する。ただし、マルチプレックス分析は、生物学的試料の利用可用性によって制限される場合が多い。しかしながら、本発明によれば、複数のエフェクタータンパク質を単一の試料に加え得、各マスキング構築物を別個のクエンチャー色素と組み合わせ得るように、マルチプレックス分析の代替を行い得る。この場合、単一の試料でマルチプレックス検出を行うために、各クエンチャー色素から正のシグナルを個別に取得し得る。
本明細書に開示されるのは、試料中の１つ以上の生物体の２つ以上の種の間を識別するための方法である。この方法はまた、試料中の１つ以上の生物体の１つ以上の種を検出するのに適している。
いくつかの実施形態では、試料中の微生物を検出するための方法が提供され、この方法は、試料または試料のセットを１つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含むことと；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の微生物特異的標的への結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすることと；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここでＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにＲＮＡベースのマスキング構築物が改変されることと；検出可能な正のシグナルを検出することであって、ここで検出可能な正のシグナルの検出が試料中の１つ以上の標的分子の存在を示すこととを含む。１つ以上の標的分子は、２つ以上の微生物種／菌株を互いに識別するために使用され得る、標的ヌクレオチドタイド配列を含む、ｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ（コードまたは非コード）、ｔｒＲＮＡ、またはｒＲＮＡであり得る。ガイドＲＮＡは、標的配列を検出するように設計され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションを改善するために特定のステップを利用し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを増強するための方法は、参照により本明細書に組み入れられる「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」と題されたＷＯ２０１５／０８５１９４に開示されている。微生物特異的標的は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはタンパク質であり得る。ＤＮＡ法場合、本明細書に記載されるようなＲＮＡポリメラーゼプロモーターを導入するＤＮＡプライマーの使用をさらに含み得る。標的がタンパク質である場合、この方法は、本明細書に記載されるタンパク質検出に特異的なアプタマー及びステップを利用するであろう。
ｉ）ウイルス
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、試料中のウイルスを検出することに関する。本明細書に開示される実施形態は、（例えば、対象または植物の）ウイルス感染を検出するため、または一塩基多型が異なるウイルス株を含むウイルス株を決定するために使用され得る。ウイルスは、ＤＮＡウイルスであっても、ＲＮＡウイルスであっても、またはレトロウイルスであってもよい。本発明で有用なウイルスの非限定的な例としては、限定するものではないが、エボラ、麻疹、ＳＡＲＳ、チクングニア、肝炎、マールブルグ、黄熱病、ＭＥＲＳ、デング熱、ラッサ、インフルエンザ、ラブドウイルスまたはＨＩＶが挙げられる。肝炎ウイルスとしては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎を含み得る。インフルエンザウイルスは、例えば、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザを含み得る。ＨＩＶは、ＨＩＶ １またはＨＩＶ ２を含み得る。特定の例示的な実施形態では、ウイルス配列は、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョ（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ）ウイルス、タイフォレストエボラ（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｅｂｏｌａ）ウイルス、レストンエボラ（Ｒｅｓｔｏｎ ｅｂｏｌａ）ウイルス、アチモタ（Ａｃｈｉｍｏｔａ）、Ａｅｄｅｓフラビウイルス、アグアカタ（Ａｇｕａｃａｔｅ）ウイルス、アカバネ（Ａｋａｂａｎｅ）ウイルス、アレチノフィドレプタレナウイルス（Ａｌｅｔｈｉｎｏｐｈｉｄ ｒｅｐｔａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、アルパフアヨマアンマレナウイルス（Ａｌｌｐａｈｕａｙｏ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、アマパリマンマレナウイウルス（Ａｍａｐａｒｉ ｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、アンデス（Ａｎｄｅｓ）ウイルス、アポイ（Ａｐｏｉ）ウイルス、アラバン（Ａｒａｖａｎ）ウイルス、アロア（Ａｒｏａ）ウイルス、Ａｒｕｍｗｏｔウイルス、タイヘイヨウサケパラミクソウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、鳥ボルナウイルス（Ａｖｉａｎ ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、トリメタニューモウイルス（Ａｖｉａｎ ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、トリパラミクソウイルス、ペンギンまたはフォークランド諸島ウイルス（ｐｅｎｇｕｉｎ ｏｒ Ｆａｌｋｌａｎｄ Ｉｓｌａｎｄｓｖｉｒｕｓ）、ＢＫポリオーマウイルス、バガザ（Ｂａｇａｚａ）ウイルス、バンナ（Ｂａｎｎａ）ウイルス、コウモリヘルペスウイルス、コウモリサポウイルス（Ｂａｔ ｓａｐｏｖｉｒｕｓ）、ベアカノンマンマレナウイルス（Ｂｅａｒ Ｃａｎｏｎ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、Ｂｅｉｌｏｎｇウイルス、ベータコロナウイルス（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎｏａｖｉｒｕｓ）、ベータパピローマウイルス（Ｂｅｔａｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）１−６、バーンヤ（Ｂｈａｎｊａ）ウイルス、Ｂｏｋｅｌｏｈ ｂａｔ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ、ボルナ病ウイルス、バーボン（Ｂｏｕｒｂｏｎ）ウイルス、ウシヘパシウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）、ウシパラインフルエンザ（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス３、ウシ呼吸器合胞体（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、Ｂｒａｚｏｒａｎウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス、カリフォルニア脳炎（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、カンディル（Ｃａｎｄｉｒｕ）ウイルス、犬ジステンパー（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）ウイルス、イヌニューモウイルス、シダー（Ｃｅｄａｒ）ウイルス、細胞融合剤（Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）ウイルス、クジラモルビリウイルス（Ｃｅｔａｃｅａｎ ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルス、Ｃｈａｏｙａｎｇウイルス、チャパレマンマレナウイルス（Ｃｈａｐａｒｅ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、チングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、コロブスモンキーパピローマウイルス（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｍｏｎｋｅｙ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、コロラドダニ熱（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｔｉｃｋ ｆｅｖｅｒ）ウイルス、牛痘（Ｃｏｗｐｏｘ）ウイルス、クリミヤ・コンゴ（Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ）出血熱ウイルス、Ｃｕｌｅｘフラビウイルス、クピキシマンマレナウイルス（Ｃｕｐｉｘｉ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、デング（Ｄｅｎｇｕｅ）ウイルス、ドブラバ−ベルグラード（Ｄｏｂｒａｖａ−Ｂｅｌｇｒａｄｅ）ウイルス、ドンガン（Ｄｏｎｇｇａｎｇ）ウイルス、ジュグベ（Ｄｕｇｂｅ）ウイルス、ドゥベンヘイジ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）ウイルス、東部ウマ脳炎（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、エテンベコウモリ（Ｅｎｔｅｂｂｅ ｂａｔ）ウイルス、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）Ａ−Ｄ、ヨーロッパコウモリリッサウイルス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）１−２、Ｅｙａｃｈウイルス、ネコモルビリウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、フェルドランス（Ｆｅｒ−ｄｅ−Ｌａｎｃｅ）パラミクソウイルス、フィッツロイリバー（Ｆｉｔｚｒｏｙ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス、フレクサルマンマレナウイルス（Ｆｌｅｘａｌ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ＧＢウイルスＣ、Ｇａｉｒｏウイルス、ゲミサーキュラーウイルス（Ｇｅｍｙｃｉｒｃｕｌａｒｖｉｒｕｓ）、ガチョウ（Ｇｏｏｓｅ）パラミクソウイルスＳＦ０２、グレートアイランド（Ｇｒｅａｔ Ｉｓｌａｎｄ）ウイルス、グアナリトマンマレナウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ハンタン（Ｈａｎｔａａｎ）ウイルス、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）Ｚ１０、ハートランド（Ｈｅａｒｔｌａｎｄ）ウイルス、ヘンドラ（ウイルス）、肝炎Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｅ、デルタ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ）ウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒト内因性レトロウイルスＫ、ヒト腸内コロナウイルス、ヒト生殖器関連環状ＤＮＡウイルス（Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｉｔａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ）−１、ヒトヘルペスウイルス１−８、ヒト免疫不全ウイルス１／２、ヒトマストアデノウイルス（Ｈｕａｎ ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）Ａ−Ｇ、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１−４、ヒトパラエコーウイルス、ヒトピコルナウイルス、ヒトスマコウイルス（Ｈｕｍａｎ ｓｍａｃｏｖｉｒｕｓ）、イコマリッサウイルス（Ｉｋｏｍａ ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、イルヘウス（Ｉｌｈｅｕｓ）ウイルス、インフルエンザＡ−Ｃ、イッピイマンマレナウイルス（Ｉｐｐｙ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、イルクート（Ｉｒｋｕｔ）ウイルス、Ｊ−ウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンマンマレナウイルス（Ｊｕｎｉｎ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ＫＩポリオーマウイルス、カディピロ（Ｋａｄｉｐｉｒｏ）ウイルス、カミチリバー（Ｋａｍｉｔｉ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、ケドゥグ（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ）ウイルス、ホジェンド（Ｋｈｕｊａｎｄ）ウイルス、ココベラ（Ｋｏｋｏｂｅｒａ）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ラゴスコウモリ（Ｌａｇｏｓ ｂａｔ）ウイルス、ランガット（Ｌａｎｇａｔ）ウイルス、ラッサマンマレナウイルス（Ｌａｓｓａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ラチノマンマレナウイルス（Ｌａｔｉｎｏ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、レオパーズヒル（Ｌｅｏｐａｒｄｓ Ｈｉｌｌ）ウイルス、リアオニン（Ｌｉａｏ ｎｉｎｇ）ウイルス、ユンガン（Ｌｊｕｎｇａｎ）ウイルス、Ｌｌｏｖｉｕウイルス、Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌウイルス、Ｌｕｊｏ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ、ルナマンマレナウイルス（Ｌｕｎａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、Ｌｕｎｋウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎マンマレナウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ Ｏｚｅｒｎｏｅ、ＭＳＳＩ２＼．２２５ウイルス、マチュポマンマレナウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ママストロウイルス（Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）１、マンサニリャ（Ｍａｎｚａｎｉｌｌａ）ウイルス、マプエラ（Ｍａｐｕｅｒａ）ウイルス、マーブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、麻疹ウイルス、メナングル（Ｍｅｎａｎｇｌｅ）ウイルス、Ｍｅｒｃａｄｅｏウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、モバラマンマレナウイウルｓ（Ｍｏｂａｌａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、モドック（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス、モヤン（Ｍｏｉｊａｎｇ）ウイルス、モコロ（Ｍｏｋｏｌｏ）ウイルス、サル痘（Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ）ウイルス、マンタナホオヒゲコウモリ白血球炎（Ｍｏｎｔａｎａ ｍｙｏｔｉｓ ｌｅｕｋｏｅｎｃｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、モペイアラッサウイルス再集合体（Ｍｏｐｅｉａ ｌａｓｓａ ｖｉｒｕｓ ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）２９、Ｍｏｐｅｉａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ、モロゴロ（Ｍｏｒｏｇｏｒｏ）ウイルス、モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）ウイルス、ムンプスウイルス、マウス肺炎（Ｍｕｒｉｎｅ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ウイルス、マレー渓谷脳炎（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、ナリバ（Ｎａｒｉｖａ）ウイルス、ニューカッスル病（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、ニパ（Ｎｉｐａｈ）ウイルス、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、ノルウェーラットヘパシウイルス（Ｎｏｒｗａｙ ｒａｔ ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）、ウンタヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス、オニョンニョンウイルス、オリベロスマンマレナウイルス（Ｏｌｉｖｅｒｏｓ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱（Ｏｍｓｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ）ウイルス、オロポーチ（Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス５、パラナマンマレナウイルス（Ｐａｒａｎａ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、パラマッタリバー（Ｐａｒｒａｍａｔｔａ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、小反芻動物病（Ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）ウイルス、ピカンデマンレナウイルス（Ｐｉｃｈａｎｄｅ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス科ウイルス、ピリタールマンマレナウイルス（Ｐｉｒｉｔａｌ ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、ピシヘペウイルス（Ｐｉｓｃｉｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）Ａ、ブタパラインフルエンザウイルス１、ブタルブラウイルス、ポワッサンウイルス、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス１−２、霊長類エリスロパルボウイルス１、プンタトロウイルス、プウマラウイルス、クアンビンウイルス、狂犬病ウイルス、ラズダンウイルス、爬虫類ボルナウイルス１、ライノウイルスＡ−Ｂ、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、リオブラボーウイルス、げっ歯類トルクテノ（Ｒｏｄｅｎｔ Ｔｏｒｑｕｅ Ｔｅｎｏ）ウイルス、げっ歯類ヘパシウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ−Ｉ、ロイヤルファームウイルス、風疹ウイルス、サビアマンマレナウイルス、セイラムウイルス、サンドフライ熱ナポリウイルス、サンドフライ熱シチリアウイルス、札幌ウイルス、サスペリウイルス、シールアネロウイルス、セムリキ森林ウイルス、センダイウイルス、ソウルウイルス、セピックウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症熱性血小板減少症症候群ウイルス、シャモンダウイルス、シモニコウモリウイルス、シュニウイルス、シンブウイルス、シミアントルクテノウイルス、シミアンウイルス４０−４１、シンノンブレウイルス、シンドビスウイルス、スモールアネロウイルス、ソスガウイルス、スペインヤギ脳炎ウイルス、スポンドウェニウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、サンシャインウイルス、ＴＴＶ様ミニウイルス、タカリベマンマレナウイルス、タイラウイルス、
タマナコウモリウイルス、タミアミマンマレナウイルス、テンブスウイルス、トゴトウウイルス、トッタパラヤンウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ティオマンウイルス、トガウイルス科ウイルス、トルクテノカニス（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｃａｎｉｓ）ウイルス、トルクテノドゥルークーリ（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｄｏｕｒｏｕｃｏｕｌｉ）ウイルス、トルクテノネコ（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｆｅｌｉｓ）ウイルス、トルクテノミジ（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｍｉｄｉ）ウイルス、トルクテノサス（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｓｕｓ）ウイルス、トルクテノタマリン（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｔａｍａｒｉｎ）ウイルス、トルクテノ（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ）ウイルス、トルクテノアザラシ（Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ ｚａｌｏｐｈｕｓ）ウイルス、トウホク（Ｔｕｈｏｋｏ）ウイルス、トゥーラ（Ｔｕｌａ）ウイルス、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）パラミクソウイルス、ウストゥ（Ｕｓｕｔｕ）ウイルス、ウークニエミ（Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ）ウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウェッセルブロンウイルス、西コーカサスコウモリウイルス、西ナイルウイルス、西部馬脳炎ウイルス、ホワイトウォーターアロヨマンマレナウイルス、黄熱病ウイルス、横瀬ウイルス、ユグボグダノバックウイルス、ザイールエボラウイルス、ジカウイルス、またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉウイルスＺウイルスの配列であってもよい。検出され得るＲＮＡウイルスの例としては、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、またはデルタウイルスのうちの１つ以上（またはそれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスである。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、ＲＴウイルスカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、柑橘類トリステザウイルス（ＣＴＶ）、オオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、トマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＢＳＶ）、イネツングロ球状ウイルス（ＲＴＳＶ）、イネ黄斑ウイルス（ＲＹＭＶ）、イネホジャブランカウイルス（ＲＨＢＶ）、トウモロコシラヤドフィノウイルス（ＭＲＦＶ）、トウモロコシ委縮モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）、サトウキビモザイクウイルス（ＳＣＭＶ）、サツマイモ斑紋モザイクウイルス（ＳＰＦＭＶ）、サツマイモサンクンベインクロステロウイルス（ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｓｕｎｋｅｎ ｖｅｉｎ ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）（ＳＰＳＶＶ）、ブドウファンリーフウイルス（ＧＦＬＶ）、ブドウＡウイルス（ＧＶＡ）、ブドウＢウイルス（ＧＶＢ）、ブドウフレックウイルス（ＧＦｋＶ）、ブドウ葉巻随伴ウイルス１、−２、及び−３、（ＧＬＲａＶ−１、−２、及び−３）、アラビスモザイクウイルス（ＡｒＭＶ）、またはルペストリスステムピット随伴（Ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ ｓｔｅｍ ｐｉｔｔｉｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＲＳＰａＶ）を含む群から選択される植物ウイルスであり得る。好ましい実施形態では、標的ＲＮＡ分子は、上記病原体の一部であるか、または上記病原体のＤＮＡ分子から転写される。例えば、標的配列は、ＲＮＡウイルスのゲノムに含まれ得る。上記病原体が上記植物に感染するかまたは感染した場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が上記植物の上記病原体の上記標的ＲＮＡ分子を加水分解することがさらに好ましい。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ系（またはその完了に必要な部分）が治療に適用されたとき、すなわち感染が起こった後、または予防的に、すなわち感染が起こる前に適用されたときの両方で、植物病原体から標的ＲＮＡ分子を切断し得ることが好ましい。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスはレトロウイルスであってよい。本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得るレトロウイルスの例としては、属アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、またはメタウイルス科、シュードウイルス科、及びレトロウイルス科（ＨＩＶを含む）、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルスを含む）、及びカリモウイルス科（カリフラワーモザイクウイルスを含む）のウイルスの１つ以上または任意の組み合わせが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、ウイルスはＤＮＡウイルスである。本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得るＤＮＡウイルスの例としてハ、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、Ｃｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、イリドウイルス科、Ｍａｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘及び天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスなど由来のウイルスの１つ以上（または任意の組み合わせ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌感染を有することが疑われる対象における種特異的細菌感染を診断する方法は、対象から細菌リボソームリボ核酸を含む試料を入手すること；試料を１つ以上の記載されたプローブと接触させること、ならびに試料に存在する細菌のリボソームリボ核酸配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出すること記載され、ここでハイブリダイゼーションの検出により、対象が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａまたはそれらの組み合わせに感染していることが示される。
特定の実施形態では、ウイルス感染は、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、またはそれらの組み合わせによって引き起こされ得る。
ｉｉ）細菌
以下は、本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得る微生物の種類の例示的なリストを提供する。ある特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌である。開示された方法に従って検出され得る細菌の例としては、限定するものではないが、とりわけ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ ｂｉｏｖａｒ ｓｏｂｒｉａ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｏｂｒｉａ）、及びＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ及びＢａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐ．（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｎｔｅｎｓｉｓ及びＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．，Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｕｍ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓｕｃｈ ａｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ及びｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｅｅｎｓｉａ及びＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．，Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇｉｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐ．，Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐ．，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ｓｐ．（例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．（例えば、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａ及びＮｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ．Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ及びＰｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｐ．（例えば、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ及びＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．（例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ（ｆｏｒｍｅｒｌｙ：Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ及びＳｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、スペクチノマイシン耐性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、エリスロマイシン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプトチン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファンピシン耐性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、テトラサイクリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、クロラムフェニコール耐性血清型４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、スペクチノマイシン耐性血清型６Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オプトチン耐性血清型１４ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、リファンピシン耐性血清型１８Ｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ Ｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｍｉｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ Ｄ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｇｒｏｕｐ Ｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ Ｇｒｏｕｐ Ｇ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｔｅｎｕｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｅｎｄｅｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．，Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ及びＶｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｉｉ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ならびにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａのうちの任意の１つ以上（またはその任意の組み合わせ）が挙げられる。
ｉｉｉ）真菌類
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は真菌または真菌種である。開示された方法に従って検出され得る真菌の例としては、限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉ、ｓｐ．Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．（例えば、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ（例えば、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、Ｍｕｃｒｏｙｍｃｏｓｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、真菌性眼感染白癬（ｆｕｎｇａｌ ｅｙｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍのうちの任意の１つ以上（またはその任意の組み合わせ）が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、真菌は酵母である。開示された方法に従って検出し得る酵母の例としては、限定するものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上（またはその任意の組み合わせ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、この真菌類は、カビ（ｍｏｌｄ）である。カビの例としては限定するものではないが、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ種、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ｉｖ）原生動物
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は原生動物である。開示された方法及びデバイスに従って検出され得る原生動物の例としては、限定するものではないが、Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｂｏｓｅａ、Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｉｄａ、Ａｍｏｅｂｏｚｏａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ，及びＡｐｉｃｏｍｐｌｅｘａのうちの任意の１つ以上（またはその任意の組み合わせ）が挙げられる。Ｅｕｇｌｅｎｏｚａの例としては、限定するものではないが、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ，及びＬ．ｄｏｎｏｖａｎｉが挙げられる。Ｈｅｔｅｒｏｌｏｂｏｓｅａの例としては、限定するものではないが、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉが挙げられる。Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｉｄｓの例としては、限定するものではないが、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ、Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）が挙げられる。Ａｍｏｅｂｏｚｏａの例としては、限定するものではないが、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓの例としては、限定するものではないが、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｈｏｍｉｎｉｓが挙げられる。Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａの例としては、限定するものではないが、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ，及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
ｖ）寄生生物
ある特定の例示的な実施形態では、微生物は寄生生物である。開示された方法に従って検出され得る寄生生物の例としては、限定するものではないが、オンコセルカ種及びプラスモディウム種のうちの１つ以上（またはそれらの任意の組み合わせ）が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、寄生生物の例としては、必ずしも限定するものではないが、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ、Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、ｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
３．ＲＮＡアプタマー
特定の実施形態では、ガイドはエスコートされたガイドである。「エスコートされた」とは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または複合体またはガイドが、細胞内に選択された時間または場所に送達され、その結果、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または複合体またはガイドの活性が空間的または時間的に制御されることを意味する。例えば、３ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または複合体またはガイドの活性及び仕向け先は、細胞表面タンパク質またはその他の局所的な細胞成分などの、アプタマーリガンドに対する結合親和性を有するエスコートＲＮＡアプタマー配列によって制御され得る。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、特定の時間に細胞に適用される外部エネルギー源などの一時的エフェクターなどの、細胞上または細胞内のアプタマーエフェクターに応答性であり得る。
エスコートされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または複合体は、ガイド分子構造、構成、安定性、遺伝子発現、またはそれらの任意の組み合わせを改善するように設計された機能的構造を有するガイド分子を有する。そのような構造は、アプタマーを含んでもよい。
アプタマーは、例えば、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化と呼ばれる技術を使用して他のリガンドに緊密に結合するように設計または選択され得る生体分子である（ＳＥＬＥＸ；Ｔｕｅｒｋ Ｃ，Ｇｏｌｄ Ｌ：「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４９：５０５−５１０）。核酸アプタマーは、例えば、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから選択されてもよく、幅広い生物医学的に関連する標的に対して高い結合親和性及び特異性を有し、アプタマーの幅広い治療的有用性を示唆している（Ｋｅｅｆｅ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｄ．，Ｓｕｐｒｉｙａ Ｐａｉ、及びＡｎｄｒｅｗ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ．「Ａｐｔａｍｅｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９．７（２０１０）：５３７−５５０）。これらの特性はまた、ドラッグデリバリービヒクルとしてのアプタマーの幅広い使用を示唆している（Ｌｅｖｙ−Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ，Ｅｔｇａｒ，ｅｔ ａｌ．「Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６．８（２００８）：４４２−４４９；及び、Ｈｉｃｋｅ ＢＪ、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＡＷ．「Ｅｓｃｏｒｔ ａｐｔａｍｅｒｓ：ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｅｒｖｉｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０００，１０６：９２３−９２８．）。フルオロフォアと結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するＲＮＡアプタマーなどの、特性を変化することによってキューに応答する、分子スイッチとして機能するアプタマーも構築され得る（Ｐａｉｇｅ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓ．，Ｋａｒｅｎ Ｙ．Ｗｕ、及びＳａｍｉｅ Ｒ．Ｊａｆｆｒｅｙ．「ＲＮＡ ｍｉｍｉｃｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３．６０４２（２０１１）：６４２−６４６）。アプタマーは、例えば、細胞表面タンパク質を標的する、標的化ｓｉＲＮＡ治療用デリバリーシステムの構成要素として使用され得ることも示唆されている（Ｚｈｏｕ、Ｊｉｅｈｕａ、及びＪｏｈｎ Ｊ．Ｒｏｓｓｉ「Ａｐｔａｍｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．」Ｓｉｌｅｎｃｅ １．１（２０１０）：４）。
したがって、特定の実施形態では、ガイド分子は、例えば、細胞膜を横切る、細胞内区画への、または核への送達を含む、ガイド分子送達を改善するように設計された１つ以上のアプタマー（複数可）によって修飾される。そのような構造は、ガイド分子を選択可能なエフェクターに送達可能、誘導可能または応答可能にさせるために、１つ以上のアプタマー（複数可）に加えて、またはそのような１つ以上のアプタマー（複数可）なしで、部分（複数可）を含んでもよい。したがって、本発明は、ｐＨ、低酸素、Ｏ２濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、露光、機械的破壊（例えば超音波）、磁場、電場、または電磁放射を含むがこれらに限定されない正常または病理学的生理学的状態に応答するガイド分子を包含する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ−アプタマーは、オクラトキシンＡ（ＯＴＡ）を認識する。ＯＴＡは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍを含むいくつかの真菌種によって生成されるマイコトキシンである。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個々の個別のボリューム（以下でさらに定義される）で固体基材上に固定化され得、単一の試薬を隔離する。例えば、この試薬は、染料を含むビーズであってもよい。固定化試薬によって隔離されると、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物から解放されると、例えば凝集または溶液濃度の単純な増大によって検出可能なシグナルを生成し得る。ある特定の例示的な実施形態では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得る、ＲＮＡベースのアプタマーである。他の実施形態では、この固定されたマスキング剤は、標的分子の検出の際に、活性化されたエフェクタータンパク質によって切断され得るｓｓＤＮＡベースのアプタマーである。
ある特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、溶液中の固定化試薬に結合し、それにより、溶液中で遊離している別個の標識された結合パートナーに結合する試薬の能力を遮断する。したがって、試料に洗浄工程を適用すると、標識された結合パートナーは、標的分子の非存在下で試料から洗い流され得る。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化される場合、マスキング構築物は、マスキング構築物が試薬に結合する能力を妨害するのに十分な程度まで切断され、それにより標識結合パートナーが固定化試薬に結合することが可能になる。したがって、標識された結合パートナーは、洗浄工程後も残り、試料中の標的分子の存在を示す。特定の態様において、固定化された試薬に結合するマスキング構築物は、ＲＮＡアプタマーである。この固定化試薬はタンパク質であってもよく、標識された結合パートナーは標識された抗体であってもよい。あるいは、固定化試薬はストレプトアビジンであってもよく、標識された結合パートナーは、標識されたビオチンであってもよい。上記の実施形態で使用される結合パートナー上の標識は、当技術分野で公知の任意の検出可能な標識であってよい。さらに、他の公知の結合パートナーを、本明細書に記載されている全体的な設計に従って使用してもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物はリボザイムを含んでもよい。リボザイムは触媒作用を有するＲＮＡ分子である。リボザイムとは、天然及び人工の両方であり、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によって標的化され得るＲＮＡを含むかまたはそれからなる。リボザイムは、負の検出可能なシグナルを生成するか、または正の制御シグナルの生成を防止する反応を触媒するように選択されても、または操作されてもよい。活性化されたエフェクタータンパク質によるリボザイムの失活時に、負の制御シグナルを生成するか、または正の検出可能なシグナルの生成を防止する反応が除去され、それによって正の検出可能なシグナルを生成することが可能になる。例示的な一実施形態では、リボザイムは、比色反応を触媒して、溶液を第１の色として表示し得る。リボザイムが不活性化されると、その溶液は第２の色に変わる。第２の色は検出可能な正のシグナルである。リボザイムを使用して比色反応を触媒する方法の例は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．「Ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｇｌｕｍＳ」，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４；１６：３３７−４２に記載されており、そのような系が、本明細書に開示されている実施形態の文脈において機能するようにどのように改変され得るかの例を示す。あるいは、リボザイムは、存在する場合、例えば、ＲＮＡ転写物の切断産物を生成し得る。したがって、正の検出可能なシグナルの検出は、リボザイムの非存在下でのみ生成される非切断ＲＮＡ転写物の検出を含み得る。
ある特定の例示的な実施形態では、１つ以上の試薬は、酵素などのタンパク質であり、比色、化学発光、または蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルの生成を促進し得、阻害または隔離されて、その結果、そのタンパク質は、１つ以上のＲＮＡアプタマーのタンパク質への結合によって検出可能なシグナルを生成し得ない。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、ＲＮＡアプタマーは、検出可能なシグナルを生成するタンパク質の能力をもはや阻害しない程度まで切断または分解される。特定の例示的な実施形態では、アプタマーは、トロンビン阻害剤アプタマーである。特定の例示的な実施形態では、トロンビン阻害剤アプタマーは、ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣ（配列番号４１４）の配列を有する。このアプタマーが切断されるとき、トロンビンが活性になり、ペプチドの比色または蛍光基質を切断する。特定の例示的な実施形態では、この比色基質は、トロンビンのペプチド基質に共有結合したパラ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）である。トロンビンによって切断されると、ｐＮＡが放出されて黄色になり、目で簡単に見えるようになる。特定の例示的な実施形態では、蛍光基質は、蛍光検出器を使用して検出され得る青色フルオロフォアである７−アミノ−４−メチルクマリンである。阻害アプタマーはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、または子牛のアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）、及び上記の一般的な原理の範囲内で使用可能である。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅ活性は、酵素阻害アプタマーの切断を介して比色分析的に検出される。ＤＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅ活性を比色シグナルに変換する１つの潜在的なモードは、ＲＮＡアプタマーまたはｓｓＤＮＡの切断を、比色出力を生成できる酵素の再活性化と組み合わせることである。ＲＮＡまたはＤＮＡ切断がない場合、インタクトなアプタマーは酵素標的に結合し、その活性を阻害する。この読み出しシステムの利点は、酵素が追加の増幅ステップを提供することである：コラテラル活性（例えば、Ｃｐｆ１またはＣａｓ１３ａコラテラル活性）によってアプタマーから解放されると、比色酵素は、比色産物を生成し続け、シグナルの増加をもたらす。
有利には、ある特定の実施形態では、比色読み取り値で酵素を阻害する既存のアプタマーが使用される。トロンビン、プロテインＣ、好中球エラスターゼ、スブチリシンなど、比色読み取りがあるいくつかのアプタマー／酵素の対が存在する。これらのプロテアーゼは、ｐＮＡに基づく比色基質を有し、市販されている。特定の実施形態では、一般的な比色酵素を標的とする新規アプタマーが使用される。β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、または子牛の腸のアルカリホスファターゼなどの一般的かつ強力な酵素は、ＳＥＬＥＸなどの選択戦略によって設計された人工アプタマーの標的となり得る。このような戦略は、ナノモルの結合効率を有するアプタマーの迅速な選択を可能にし、比色読み取りのための追加の酵素／アプタマーの対の開発に使用し得る。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｓｅ活性は、ＲＮＡテザー阻害剤の切断を介して比色分析的に検出される。多くの一般的な比色酵素には、競合する可逆的な阻害剤がある：例えば、β−ガラクトシダーゼは、ガラクトースによって阻害され得る。これらの阻害剤の多くは弱いが、それらの効果は、局所濃度の増大によって増大され得る。ＲＮＡｓｅ活性に阻害剤の局所濃度をリンクさせることにより、比色酵素と阻害剤の対をＲＮＡｓｅセンサーに組み込んでもよい。小分子阻害剤に基づく比色ＲＮＡｓｅセンサーには、３つの構成要素が含まれる：比色酵素、阻害剤、及び阻害剤と酵素の両方に共有結合し、阻害剤を酵素につなぐ架橋性ＲＮＡ。切断されていない構成では、この酵素は、小分子の局所濃度の増大によって阻害される；ＲＮＡが切断されるとき（例えば、Ｃａｓ１３コラテラル切断などにより）、阻害剤が放出され、比色酵素が活性化される。比色シフトを検出する能力によって、可視波長での使用を容易にする検出へのアプローチが得られる。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｓｅ活性は、実施例８に記載のように、Ｇ−四重鎖の形成及び／または活性化を介して比色分析的に検出される。ＤＮＡのＧ四重鎖は、ヘム（鉄（ＩＩＩ）−プロトポルフィリンＩＸ）と複合体を形成し、ペルオキシダーゼ活性を有するＤＮＡｚｙｍｅを形成し得る。ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＡＢＴＳ：（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩））が供給された場合、過酸化水素の存在下でＧ−四重鎖−ヘム複合体は、基質の酸化を生じ、基質は次に溶液中で緑色になる。Ｇ−四重鎖形成ＤＮＡ配列の例は、ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡ（配列番号４１５）である。ＲＮＡ配列をこのＤＮＡアプタマーにハイブリダイズさせることにより、Ｇ−四重鎖構造の形成が制限される。ＲＮＡｓｅコラテラルの活性化（例えば、Ｃ２ｃ２複合体コラテラル活性化）の際、ＲＮＡステープルが切断され、Ｇ四重鎖が形成され、ヘムが結合する。色の形成は酵素的であるため、この戦略は特に魅力的であり、すなわち、ＲＮＡｓｅ活性化を超える追加の増幅が存在する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡｓｅ活性は、実施例８に記載のように、Ｇ−四重鎖の形成及び／または活性化を介して比色分析的に検出される。ＤＮＡのＧ四重鎖は、ヘムと複合体を形成し（鉄（ＩＩＩ）−プロトポルフィリンＩＸ）、ペルオキシダーゼ活性を有するＤＮＡｚｙｍｅを形成し得る。ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＡＢＴＳ：（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ジアンモニウム塩））が供給された場合、過酸化水素の存在下でＧ−四重鎖−ヘム複合体は、基質の酸化を生じ、基質は次に溶液中で緑色になる。Ｇ−四重鎖形成ＤＮＡ配列の例は：ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡ（配列番号４１５）である。ｓｓＤＮＡ配列をこのＤＮＡアプタマーにハイブリダイズさせることにより、Ｇ−四重鎖構造の形成が制限される。ＤＮＡｓｅコラテラルの活性化（例えば、Ｃｐｆ１複合体コラテラル活性化）の際、ＤＮＡステープルが切断され、Ｇ四重鎖が形成され、ヘムが結合する。色の形成は酵素的であるため、この戦略は特に魅力的であり、すなわち、ＤＮＡｓｅ活性化を超える追加の増幅が存在する。
いくつかの実施形態では、核酸検出系は、酵素活性を有する四重鎖を含むＲＮＡ−アプタマーまたはＤＮＡアプタマーを含む。特定の実施形態では、酵素活性はペルオキシダーゼ活性である。実施形態では、この方法、系、およびアッセイは、１つ以上の標的分子の指標としてフルオロフォアおよびクエンチャーを利用し得る。別の実施形態では、この方法、系およびアッセイは、１つ以上の標的分子の指標として比色シフトを利用し得る。標的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個々の個別の容積（以下でさらに定義される）で固体基材上に固定化され得、単一の試薬を隔離する。例えば、試薬は、染料を含むビーズであり得る。固定化試薬によって隔離されると、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物から解放されると、例えば凝集または溶液濃度の単純な増大によって検出可能なシグナルを生成し得る。特定の例示的な実施形態では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得る、ＲＮＡベースのアプタマーまたはｓｓＤＮＡベースのアプタマーである。
例示的な一実施形態では、マスキング構築物は、検出剤が凝集しているか溶液中に分散しているかに応じて色が変化する検出剤を含む。例えば、コロイド金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子に移動するにつれて、目に見える紫色から赤色にシフトする。したがって、特定の例示的な実施形態では、そのような検出剤は、１つ以上の架橋分子によって全体として保持され得る。例えば、図４３を参照のこと。架橋分子の少なくとも一部は、ＲＮＡを含む。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際、架橋分子のＲＮＡ部分が切断され、検出剤が分散して、対応する色の変化がもたらされる。例えば、図４６を参照のこと。ある特定の例示的な実施形態では、架橋分子はＲＮＡ分子である。他の実施形態では、架橋分子は、コラテラルｓｓＤＮＡ活性を示すＣａｓタンパク質とともに利用できるｓｓＤＮＡ分子である。ある特定の例示的な実施形態では、検出剤は、コロイド金属である。コロイド金属材料は、液体、ヒドロゾル、または金属ゾルに分散された水不溶性金属粒子または金属化合物を含んでもよい。コロイド金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ及びＩＩＩＢ族の金属、ならびに遷移金属、特にＶＩＩＩ族の金属から選択され得る。好ましい金属としては、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル及びカルシウムが挙げられる。他の適切な金属としては、さまざまな酸化状態の全てで次のものが含まれる：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、プラチナ、及びガドリニウム。金属は、好ましくは、適切な金属化合物、例えば、Ａｌ３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋及びＣａ２＋イオンから誘導されるイオン形態で提供される。
ＲＮＡ架橋が活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクターによって切断されると、前述の色のシフトが観察される。特定の例示的な実施形態では、粒子はコロイド金属である。特定の他の例示的な実施形態では、コロイド金属はコロイド金である。特定の例示的な実施形態では、コロイドナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。金コロイドナノ粒子の固有の表面特性に起因して、溶液に完全に分散すると、５２０ｎｍで最大の吸光度が観察され、肉眼では赤色に見える。ＡｕＮＰが凝集すると、最大吸収の赤シフトが示され、色が暗くなり、最終的に溶液から濃い紫色の凝集体として沈殿する。特定の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から延びるＤＮＡリンカーを含むように改変される。個々の粒子は、ＤＮＡリンカーの少なくとも一部に各端でハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）架橋によって一緒にリンクされる。したがって、ナノ粒子は、リンクされた粒子及び凝集体のウェブを形成し、暗い沈殿物としてみられる。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターが活性化されると、ｓｓＲＮＡ架橋が切断され、ＡＵ ＮＰＳがリンクされたメッシュから解放され、可視の赤色が生成される。ＤＮＡリンカーと架橋配列の例を以下に示す。ＤＮＡリンカーの末端にあるチオールリンカーは、ＡｕＮＰＳへの表面コンジュゲーションに使用され得る。他の形態のコンジュゲーションが使用されてもよい。ある特定の例示的な実施形態では、ＡｕＮＰの２つの集団が、各ＤＮＡリンカーについて１つ、生成され得る。これにより、ｓｓＲＮＡ架橋が適切な向きで適切に結合しやすくなる。ある特定の例示的な実施形態では、第１のＤＮＡリンカーは３’末端によってコンジュゲートされ、第２のＤＮＡリンカーは５’末端によってコンジュゲートされる。ｓｓＤＮＡコラテラル活性を示すＣＲＩＳＰＲ−エフェクタータンパク質のための同様の系をまた、本明細書に示される開示に従って設計してもよい。
Figure 2021511795
ある他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な標識及びその検出可能な標識のマスキング剤が付着しているＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでもよい。そのような検出可能な標識／マスキング剤の対の例は、フルオロフォアとフルオロフォアのクエンチャーである。フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光分子との間の非蛍光複合体の形成の結果として、フルオロフォアの消光が起こり得る。この機構は、基底状態の複合体形成、静的消光、または接触消光として公知である。したがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、フルオロフォア及びクエンチャーが、接触クエンチングが起こるのに十分に近接するように設計され得る。フルオロフォア及びそれらの同族クエンチャーは、当技術分野で公知であり、当業者によってこの目的のために選択され得る。特定のフルオロフォア／クエンチャーの対は、本発明の文脈において重要ではなく、フルオロフォア／クエンチャーの対の選択のみがフルオロフォアのマスキングを確実にする。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断され、それにより、接触消光効果を維持するために必要なフルオロフォアとクエンチャーとの間の近接を切断する。したがって、フルオロフォアの検出を使用して、試料中の標的分子の存在を決定してもよい。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、金ナノ粒子などの１つ以上の金属ナノ粒子が付着している１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドによって架橋された複数の金属ナノ粒子を含む。一実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する３つのＲＮＡオリゴヌクレオチドによって架橋された３つの金ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、金属ナノ粒子によって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、１つ以上の量子ドットが付着している１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、量子ドットによって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
例示的な一実施形態では、マスキング構築物は量子ドットを含み得る。量子ドットは、表面に付着した複数のリンカー分子を有し得る。リンカー分子の少なくとも一部は、ＲＮＡを含む。リンカー分子は、量子ドットの消光が起こるのに十分近接してクエンチャーが維持されるように、リンカーの一端で量子ドットに、リンカーの長さに沿ってまたは末端で１つ以上のクエンチャーに取り付けられる。リンカーは分岐していてもよい。上記のように、量子ドット／クエンチャーの対は重要ではなく、量子ドット／クエンチャーの対の選択のみがフルオロフォアのマスキングを保証する。量子ドット及びそれらの同族クエンチャーは、当技術分野で公知であり、当業者によってこの目的のために選択され得る。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、リンカー分子のＲＮＡ部分が切断され、それにより、量子ドットと、消光効果を維持するのに必要な１つ以上のクエンチャーとの間の近接が排除される。特定の例示的な実施形態では、量子ドットは、ストレプトアビジンコンジュゲートされている。ＲＮＡは、ビオチンリンカーを介して結合され、配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号：４１６）または／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号：４１７）の配列でクエンチング分子を動員し、／５Ｂｉｏｓｇは、ビオチンタグであり、かつ／３ｌＡｂＲＱＳｐ／はＩｏｗａブラッククエンチャーである。切断すると、本明細書に開示される活性化エフェクターによって、量子ドットは可視的に蛍光を発する。
同様の方法で、蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して、検出可能な正のシグナルを生成してもよい。ＦＲＥＴは、エネルギー的に励起されたフルオロフォア（すなわち、「ドナーフルオロフォア」）からの光子が別の分子（すなわち、「アクセプター」）の電子のエネルギー状態を、励起一重項状態のより高い振動レベルに上げる非放射プロセスである。ドナーフルオロフォアは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光を発することなく基底状態に戻る。アクセプターは、別のフルオロフォアであっても、または非蛍光分子であってもよい。アクセプターがフルオロフォアである場合、転送されたエネルギーは、そのフルオロフォアに特徴的な蛍光として放出される。アクセプターが非蛍光分子である場合、吸収されたエネルギーは熱としての損失である。したがって、本明細書に開示される実施形態の文脈では、フルオロフォア／クエンチャーの対は、オリゴヌクレオチド分子に付着したドナーフルオロフォア／アクセプターの対で置き換えられる。インタクトな場合、マスキング構築物は、アクセプターから放出される蛍光または熱によって検出される第１のシグナル（検出可能な負のシグナル）を生成する。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化の際に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断され、ＦＲＥＴが破壊されて、その結果、ドナーフルオロフォアの蛍光が検出されるようになる（正の検出可能なシグナル）。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、長いＲＮＡの短いヌクレオチドへの切断に応答して、それらの吸光度を変化させる挿入色素の使用を含む。そのような色素はいくつか存在する。例えば、ピロニンＹは、ＲＮＡと複合体を形成し、５７２ｎｍに吸収を有する複合体を形成する。ＲＮＡの切断により、吸光度が失われ、色が変化する。メチレンブルーは、ＲＮＡ切断時に６８８ｎｍでの吸光度が変化する同様の方法で使用され得る。したがって、特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によるＲＮＡの切断時に吸光度を変化させるＲＮＡ及び挿入色素複合体を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＨＣＲ反応のための開始因子を含んでもよい。例えば、Ｄｉｒｋｓ及びＰｉｅｒｃｅ．ＰＮＡＳ １０１，１５２７５−１５７２８（２００４）を参照のこと。ＨＣＲ反応は、２つのヘアピン種のポテンシャルエネルギーを利用する。ヘアピンの１つ上の対応する領域に相補的な部分を有する一本鎖開始因子が以前の安定した混合物に放出されると、１つの種のヘアピンが開く。このプロセスは、次に、他の種のヘアピンを開く一本鎖領域を露出させる。このプロセスは、次に、元の開始因子と同一の一本鎖領域を露出させる。結果として生じる連鎖反応は、ヘアピンの供給がなくなるまで成長するニックの入った二重らせんの形成につながる可能性がある。得られた生成物の検出は、ゲル上で、または比色分析で行ってもよい。比色検出法の例としては、例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＡＣＳ Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１７，９（１）：１６７−１７５，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ−ｆｒｅｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｔ ａｐｔａｍｅｒｓ」Ａｎａｌｙｓｔ ２０１５，１５０，７６５７−７６６２、及びＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｎｏｎ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｈａｉｒｐｉｎ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，７０（４）：６８６−６９４（２０１６）に開示される方法が挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＨＣＲ開始因子配列、及びこの開始因子がＨＣＲ反応を開始するのを防ぐ、ループまたはヘアピンなどの切断可能な構造要素を含み得る。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による構造要素の切断時に、次に開始因子が放出されてＨＣＲ反応を引き起こし、その検出は試料中の１つ以上の標的の存在を示す。ある特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＲＮＡループを有するヘアピンを含む。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がＲＮＡループを切断するとき、この開始因子が解放されてＨＣＲ反応が誘発され得る。
標的の増幅
ある特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する前に、標的ＲＮＡ及び／またはＤＮＡを増幅してもよい。任意の適切なＲＮＡまたはＤＮＡ増幅技術が使用され得る。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅は等温増幅である。特定の例示的な実施形態では、等温増幅は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、またはニック酵素の増幅反応（ＮＥＡＲ）であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、限定するものではないが、ＰＣＲ、複数置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または分岐増幅法（ＲＡＭ）を含む非等温増幅法を使用してもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を作成するための配列特異的リバースプライマーによる標的ＲＮＡの逆転写で開始される、ＮＡＳＢＡである。次に、ＲＮａｓｅ Ｈを使用してＲＮＡ鋳型を分解し、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むフォワードプライマーが結合して相補性鎖の伸長を開始し、二本鎖ＤＮＡ産物を生成しすることを可能にする。次に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを介したＤＮＡ鋳型の転写により、標的ＲＮＡ配列のコピーが作成される。重要なことに、新しい標的ＲＮＡはそれぞれガイドＲＮＡによって検出され得るので、アッセイの感度がさらに向上する。次いで、ガイドＲＮＡによる標的ＲＮＡの結合は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性化につながり、この方法は上記で概説したように進行する。ＮＡＳＢＡ反応には、適度な等温条件下、例えば約４１℃で進行し得るという追加の利点があり、現場での、臨床検査室から離れた、早期かつ直接の検出用に配備された系及びデバイスに適するようになる。
ある特定の他の例示的な実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を使用して、標的核酸を増幅し得る。ＲＰＡ反応は、配列特異的プライマーを二重鎖ＤＮＡの相同配列と対合し得るリコンビナーゼを使用する。標的ＤＮＡが存在する場合、ＤＮＡ増幅が開始され、熱サイクルまたは化学融解などの他の試料操作は必要ない。ＲＰＡ増幅系全体は、乾燥した製剤として安定しており、冷蔵せずに安全に輸送され得る。ＲＰＡ反応はまた、３７〜４２℃の最適反応温度での等温温度で実行されてもよい。配列特異的プライマーは、検出されるべき標的核酸配列を含む配列を増幅するように設計される。ある特定の例示的な実施形態では、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、プライマーの１つに加える。これは、標的配列及びＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む増幅された二本鎖ＤＮＡ産物をもたらす。ＲＰＡ反応の後、またはその間に、二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを生成するＲＮＡポリメラーゼを追加する。次に、増幅された標的ＲＮＡをＣＲＩＳＰＲエフェクター系によって検出し得る。このようにして、標的ＤＮＡは、本明細書に開示される実施形態を使用して検出され得る。ＲＰＡ反応は、標的ＲＮＡの増幅にも使用され得る。標的ＲＮＡは、最初に逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換され、次に第２の鎖のＤＮＡ合成が行われ、この時点でＲＰＡ反応は上記で概説したとおり進行する。
本発明の一実施形態では、ニッキング酵素は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質である。したがって、ｄｓＤＮＡへのニックの導入は、プログラム可能であり、配列特異的であり得る。図１１２は、ｄｓＤＮＡ標的の反対の鎖を標的とするように設計された２つのガイドから始まる、本発明の実施形態を描写する。本発明によれば、ニッカーゼは、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ９、またはＤＮＡ二重鎖の一本鎖を切断するか、または切断するように設計された任意のオルソログまたはＣＲＩＳＰＲタンパク質であり得る。次いで、ニックの入った鎖は、ポリメラーゼによって伸長され得る。一実施形態では、ニックの位置は、ポリメラーゼによる鎖の伸長が、ニック部位間の標的二本鎖ＤＮＡの中央部分に向かうように選択される。特定の実施形態では、プライマーは、伸長鎖にハイブリダイズし得る反応に含まれ、その後、プライマーのさらなるポリメラーゼ伸長により、以下のような２つのｄｓＤＮＡ片が再生される：第１鎖Ｃｐｆ１ガイド部位または第１及び第２鎖Ｃｐｆ１ガイド部位の両方を含む第１のｄｓＤＮＡ、ならびに第２鎖Ｃｐｆ１ガイド部位または第１及び第２の鎖Ｃｐｒｆガイド部位の両方を含む第２のｄｓＤＮＡ。これらの断片は、ニッキング部位の間の標的の領域を指数関数的に増幅する周期的な反応で、ニッキングされ、拡張され続ける。
この増幅は、等温であり、温度について選択され得る。一実施形態では、増幅は３７度で急速に進行する。他の実施形態では、等温増幅の温度は、異なる温度で操作可能なポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｕ、Ｂｓｔ、Ｐｈｉ２９、クレノウフラグメントなど）を選択することによって選択されてもよい。
したがって、ニッキング等温増幅技術は、（例えば、ニッキング酵素増幅反応またはＮＥＡＲにおいて）固定された配列優先性を有するニッキング酵素を使用するが、これは、元のｄｓＤＮＡ標的を変性して、ニッキング基質を標的の末端に追加する、プライマーのアニーリング及び伸長を可能にすることと、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼの使用であって、このニッキング部位は、変性ステップが不要であることを意味する、ガイドＲＮＡを介してプログラム可能であり得る使用と、反応全体を真に等温にし得ることとを必要とする。これはまた、ニッキング基質を追加するこれらのプライマーが反応の後半で使用されるプライマーとは異なるので、反応を簡略化し、すなわち、ＮＥＡＲには２つのプライマーセット（すなわち４プライマー）が必要であるが、Ｃｐｆ１のニッキング増幅には１つのプライマーセット（すなわち２プライマー）しか必要としない。これにより、Ｃｐｆ１増幅のニッキングは、変性を行ってから等温温度に冷却するための複雑な機器を使わなくても、操作がはるかに簡単で簡単になる。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される系は、増幅試薬を含んでもよい。核酸の増幅に有用な異なる成分または試薬が、本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載される増幅試薬は、Ｔｒｉｓ緩衝液などの緩衝液をさらに含んでもよい。Ｔｒｉｓ緩衝液は、例えば、限定するものではないが、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１Ｍなどの濃度を含む、所望の適用または使用に適切な任意の濃度で使用され得る。当業者は、本発明で使用するためのＴｒｉｓなどの緩衝液の適切な濃度を決定し得るであろう。
核酸断片の増幅を改善するために、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの塩を、ＰＣＲなどの増幅反応に含んでもよい。塩濃度は特定の反応及び用途に依存するが、いくつかの実施形態では、特定のサイズの核酸断片は、特定の塩濃度で最適な結果を生み出す場合がある。より大きな生成物は、望ましい結果を生み出すために、塩濃度の変更、通常はより低い塩を必要とする場合もあり、より小さな生成物の増幅は、より高い塩濃度でより良い結果を生じ得る。当業者は、塩濃度の変化とともに塩の存在及び／または濃度が、生物学的または化学反応のストリンジェンシーを変化し得させ、したがって、適切な条件を提供する任意の塩が、本発明の反応のために、及び本明細書に記載のとおり使用され得ることを理解するであろう。
生物学的反応または化学反応の他の構成要素は、その中の物質の分析のために細胞を破壊するかまたは溶解するために、細胞溶解成分を含んでもよい。細胞溶解成分は、限定するものではないが、界面活性剤、上記の塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］、またはその他を含んでもよい。本発明に適切であり得る界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、臭化エチルトリメチルアンモニウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）が挙げられ得る。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依存し得、場合によっては反応に特異的であり得る。増幅反応は、限定するものではないが、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭなどの濃度を含む、本発明に適切な任意の濃度で使用されるｄＮＴＰ及び核酸プライマーを含んでもよい。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼなどを含む、当該技術分野で公知であり、本発明に有用な任意の特定のポリメラーゼであっても、または一般的なポリメラーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される増幅試薬は、ホットスタート増幅での使用に適切であり得る。ホットスタート増幅は、いくつかの実施形態では、アダプター分子もしくはオリゴの二量体化を低減または排除するか、そうでなければ不要な増幅産物もしくはアーチファクトを防ぎ、所望の産物の最適な増幅を得るために有益であり得る。増幅に使用するために本明細書に記載されている多くの成分は、ホットスタート増幅にも使用してもよい。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用に適切な試薬または成分は、必要に応じて、１つ以上の組成物成分の代わりに使用され得る。例えば、特定の温度または他の反応条件で所望の活性を示すポリメラーゼまたは他の試薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用のために設計または最適化された試薬を使用してもよく、例えば、ポリメラーゼは、転位後または特定の温度に達した後に活性化され得る。そのようなポリメラーゼは、抗体ベースであっても、またはアパタマーベースであってもよい。本明細書に記載されるポリメラーゼは、当該技術分野で公知である。そのような試薬の例としては、限定するものではないが、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートｄＮＴＰ、及び光ケージ化ｄＮＴＰが挙げられる。そのような試薬は、当該技術分野で公知であり、入手可能である。当業者は、個々の試薬に適切な最適温度を決定し得るであろう。
核酸の増幅は、特定の熱サイクル機械または装置を使用され得、単一の反応またはバルクで実行され得るので、任意の所望の反応数を同時に実行し得る。いくつかの実施形態では、増幅は、マイクロ流体デバイスまたはロボットデバイスを使用して実行してもよいし、または所望の増幅を達成するために温度の手動変更を使用して実行してもよい。いくつかの実施形態では、最適化を実行して、特定の用途または材料に最適な反応条件を得てもよい。当業者は、十分な増幅を得るために反応条件を理解し、最適化し得るであろう。
ある特定の実施形態では、本発明の方法または系によるＤＮＡの検出は、検出の前に（増幅された）ＤＮＡのＲＮＡへの転写を必要とする。
本発明の検出方法は、様々な組み合わせでの核酸増幅及び検出手順を含み得ることが明らかであろう。検出されるべき核酸は、任意の適切な方法によって増幅されて、検出され得る中間産物を提供し得る、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない、天然の核酸であっても、または合成の核酸であってもよい。中間産物の検出は、直接またはコラテラル活性によって検出可能なシグナル部分を生成する、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の結合及び活性化を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によってもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、検出可能な正のシグナルをさらに増幅するさらなる修飾を導入してもよい。例えば、活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のコラテラル活性化は、二次標的もしくは追加のガイド配列、またはその両方を生成するために使用してもよい。例示的な一実施形態では、反応溶液は、高濃度でスパイクされる二次標的を含むであろう。二次標的は、一次標的（すなわち、アッセイが検出するように設計されている標的）とは異なる場合があり、特定の例では、全ての反応容量にわたって共通であり得る。二次標的の二次ガイド配列は、例えば、ＲＮＡループのあるヘアピンなどの二次構造的特徴により、保護されてもよく、第２の標的にもＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質にも結合できない。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による保護基の切断（すなわち、溶液中の１次標的（複数可）との複合体の形成による活性化後）、及び溶液中の遊離のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との複合体の形成、及び２次標的のスパイクからの活性化。特定の他の例示的な実施形態では、同様の概念が、二次標的配列への第２のガイド配列と共に使用される。二次標的配列は、二次標的上の構造的特徴または保護基を保護し得る。二次標的から保護基を切断すると、追加のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／二次ガイド配列／二次標的複合体の形成が可能になる。さらに別の例示的な実施形態では、一次標的（複数可）によるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性化を使用して、保護または環状化プライマーを切断し、次いでこれを放出して、本明細書に開示されるような等温増幅反応を、二次ガイド配列、二次標的配列、またはその両方をコードする鋳型で実施する。この増幅された鋳型のその後の転写により、より多くの二次ガイド配列及び／または二次標的配列が生成され、その後、追加のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質のコラテラル活性化が続く。
ＲＮＡ誘導型Ｃｐｆ１のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。一実施形態では、Ｃｐｆ１系を操作して、ＲＮＡのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。別の実施形態では、Ｃｐｆ１系を操作して、ｓｓＤＮＡのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。したがって、設計されたＣｐｆ１系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作のプラットフォームを提供する。Ｃｐｆ１は、哺乳類の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発される。Ｃｐｆ１は、配列特異的な標的ＤＮＡ結合によって活性化されると、ＲＮＡ及びｓｓＤＮＡのロバストなコラテラル切断が可能である。
ＲＮＡ誘導Ｃ２ｃ１のプログラム可能性、特異性、及びコラテラル活性によってまた、それは核酸の非特異的切断のための理想的な切り替え可能なヌクレアーゼになる。一実施形態では、Ｃ２ｃ１系を操作して、ＲＮＡのコラテラル非特異的切断を提供し、利用する。別の実施形態において、Ｃ２ｃ１系を操作して、ｓｓＤＮＡのコラテラル非特異的切断を提供及び利用する。したがって、設計されたＣ２ｃ１系は、核酸検出及びトランスクリプトーム操作、ならびに細胞死の誘導のためのプラットフォームを提供する。Ｃ２ｃ１は、哺乳動物の転写産物のノックダウン及び結合ツールとして使用するために開発されている。Ｃ２ｃ１は、配列特異的な標的ＤＮＡ結合によって活性化されると、ＲＮＡ及びｓｓＤＮＡのロバストなコラテラル切断が可能である。
標的ＲＮＡ／ＤＮＡ濃縮（富化）
ある特定の例示的な実施形態では、標的ＲＮＡまたはＤＮＡは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの検出または増幅の前に最初に濃縮されてもよい。特定の例示的な実施形態では、この濃縮は、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系による標的核酸の結合によって達成され得る。
現在の標的特異的濃縮プロトコルは、プローブとのハイブリダイゼーションの前に一本鎖核酸を必要とする。様々な利点のうちでも、本実施形態は、このステップをスキップして、二本鎖ＤＮＡ（部分的または完全に二本鎖のいずれか）への直接標的化を可能にし得る。さらに、本明細書に開示される実施形態は、等温濃縮を可能にする、より速い速度論及びより容易なワークフローを提供する酵素駆動の標的化方法である。特定の例示的な実施形態では、濃縮は、２０〜３７℃という低い温度で行われ得る。特定の例示的な実施形態では、異なる標的核酸へのガイドＲＮＡのセットが、単一のアッセイにおいて使用され、複数の標的及び／または単一の標的の複数のバリアントの検出を可能にする。
ある特定の例示的な実施形態では、デッド（ｄｅａｄ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、溶液中の標的核酸に結合し、次いで上記溶液から単離されてもよい。例えば、標的核酸に結合したデッドＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、デッドＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーなどの他の分子を使用して溶液から単離され得る。
他の例示的な実施形態では、デッドＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、固体基質に結合し得る。固定された基質とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの付着に適切であるか、または適切になるように改変され得る任意の材料を指す場合がある。可能性のある基材としては、限定するものではないが、ガラスと改変された機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）など）、多糖類、ナイロン、またはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料、例としては、シリコン及び変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、及びその他のさまざまなポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、規則正しいパターンでの分子の固定化に適したパターン化表面を含む。特定の実施形態では、パターン化表面は、固体支持体の露出した層の中または上の異なる領域の配置を指す。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面にウェルまたは窪みのアレイを含む。固体支持体の組成及び形状は、その用途によって異なり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ及び／またはアレイなどの平面構造である。したがって、基材の表面は、平面層の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用する「フローセル」という用語は、１つ以上の流体試薬を流すことができる固体表面を備えるチャンバを指す。本開示の方法で容易に使用できる例示的なフローセル及び関連する流体システム及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０９１８４９７、米国特許第７，０５７，０２６号；ＷＯ ９１／０６６７８；ＷＯ ０７／１２３７４４；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されている。いくつかの実施形態では、固体支持体またはその表面は、チューブまたは容器の内面または外面などの非平面である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ミクロスフェアまたはビーズを含む。「ミクロスフェア」、「ビーズ」、「粒子」は、プラスチック、セラミック、ガラス、及びポリスチレンを含むがこれらに限定されない様々な材料でできた小さな個別の粒子を意味する固体基材の文脈内で意味するものとする。特定の実施形態では、ミクロスフェアとは、磁性ミクロスフェアまたはビーズである。あるいはまたはさらに、ビーズは多孔性であってもよい。ビーズのサイズは、ナノメートルの範囲、例えば、１００ｎｍから数ミリメートル、例えば１ｍｍである。
次に、標的核酸を含むか、または含む疑いのある試料を基質に曝露して、結合したデッドＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質への標的核酸の結合を可能にし得る。次に、非標的分子を洗い流してもよい。特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、本明細書に開示される方法を使用してさらに検出するために、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／ガイドＲＮＡ複合体から放出されてもよい。特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、本明細書に記載されるように最初に増幅されてもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、化学的にタグ付けされ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは化学的にビオチン化されてもよい。別の例示的な実施形態では、融合は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに融合をコードする追加の配列を追加することによって作成され得る。そのような融合の１つの例は、ＡｖｉＴａｇ（商標）であり、これは、固有の１５アミノ酸ペプチドタグ上の単一のビオチンの高度に標的化された酵素コンジュゲーションを採用している。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フラグ、Ｈｉｓタグ、ＴＡＰタグ、及びＦｃタグなどであるがこれらに限定されない捕捉タグで標識され得る。結合タグは、融合、化学タグ、捕捉タグのいずれであっても、標的核酸に結合した後、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系をプルダウンするか、またはＣＲＩＳＰＲエフェクター系を固体基材に固定するために使用され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡ全体は、ビオチン化ウラシルなどの１つ以上のビオチン化ヌクレオチドを組み込んだインビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して標識してもよい。いくつかの実施形態では、ビオチンは、ガイドＲＮＡの３’末端への１つ以上のビオチン基の付加など、ガイドＲＮＡに化学的または酵素的に付加され得る。結合タグは、例えば、ガイドＲＮＡ／標的核酸をストレプトアビジンコーティング固体基質に曝露することにより、結合が起こった後にガイドＲＮＡ／標的核酸複合体をプルダウンするために使用されてもよい。
特定の実施形態では、固体基材は、フローセルであってもよい。特定の実施形態では、フローセルは、試験試料中の分析物の存在または量を検出するためのデバイスであり得る。フローセルデバイスは、試験試料に含まれ得る分析物に対して電気的または光学的に検出可能な応答を生成する固定化試薬手段を有し得る。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、操作された、または天然に存在しないＣＲＩＳＰＲエフェクターを、濃縮目的で使用してもよい。一実施形態では、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の変異を含み得る。１つ以上の変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒的に活性なドメインにあってよい。エフェクタータンパク質は、上記１つ以上の変異を欠くエフェクタータンパク質と比較して、ヌクレアーゼ活性が低下または消失している可能性がある。エフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座でのＲＮＡ鎖の切断を指示しない場合がある。好ましい実施形態では、１つ以上の変異は、２つの変異を含み得る。好ましい実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、例えば、操作されたまたは天然には存在しないエフェクタータンパク質またはＣ２ｃ２で改変される。特定の実施形態では、変異アミノ酸残基の１つ以上の改変は、変異Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ及びＨ１２８３Ａのような、Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８及びＨ１２８３（Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸と呼ばれる）に対応するＣ２ｃ２中のもののうちの１つ以上、またはＬｓｈ Ｃ２ｃ２オルソログの対応するアミノ酸残基である。
特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基の１つ以上の改変は、Ｃ２ｃ２コンセンサス番号付けに応じて、Ｋ２、Ｋ３９、Ｖ４０、Ｅ４７９、Ｌ５１４、Ｖ５１８、Ｎ５２４、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｅ５８０、Ｌ５９７、Ｖ６０２、Ｄ６３０、Ｆ６７６、Ｌ７０９、Ｉ７１３、Ｒ７１７（ＨＥＰＮ）、Ｎ７１８、Ｈ７２２（ＨＥＰＮ）、Ｅ７７３、Ｐ８２３、Ｖ８２８、Ｉ８７９、Ｙ８８０、Ｆ８８４、Ｙ９９７、Ｌ１００１、Ｆ１００９、Ｌ１０１３、Ｙ１０９３、Ｌ１０９９、Ｌ１１１１、Ｙ１１１４、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｙ１２４４、Ｌ１２５０、Ｌ１２５３、Ｋ１２６１、Ｉ１３３４、Ｌ１３５５、Ｌ１３５９、Ｒ１３６２、Ｙ１３６６、Ｅ１３７１、Ｒ１３７２、Ｄ１３７３、Ｒ１５０９（ＨＥＰＮ）、Ｈ１５１４（ＨＥＰＮ）、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｋ１５４６、Ｋ１５４８、Ｖ１５５１、Ｉ１５５８に対応するＣ２ｃ２のもののうち１つ以上である。ある特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基の１つ以上の改変は、Ｒ７１７及びＲ１５０９に対応するＣ２ｃ２のそれらの１つ以上である。ある特定の実施形態では、変異したアミノ酸残基のうち１つ以上は、Ｋ２、Ｋ３９、Ｋ５３５、Ｋ１２６１、Ｒ１３６２、Ｒ１３７２、Ｋ１５４６及びＫ１５４８に対応するＣ２ｃ２内のものの１つ以上である。ある特定の実施形態では、上記変異は、変化したまたは改変された活性を有するタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、上記変異は、低下した特異性などの低下した活性を有するタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、上記変異は、触媒活性を有さない（すなわち、「デッド」Ｃ２ｃ２）タンパク質をもたらす。一実施形態では、上記アミノ酸残基は、Ｌｓｈ Ｃ２ｃ２アミノ酸残基、または異なる種に由来するＣ２ｃ２タンパク質の対応するアミノ酸残基に対応する。これらの手順を容易にし得るデバイス。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｂエフェクターと１つ以上の機能的ドメインの融合タンパク質のサイズを小さくするために、Ｃａｓ１３ｂエフェクターのＣ末端を、そのＲＮＡ結合機能を維持したたまで切断し得る。例えば、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、または少なくとも１００アミノ酸、または少なくとも１５０アミノ酸、または少なくとも２００アミノ酸、または少なくとも２５０アミノ酸、または少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも３５０アミノ酸、または最大１２０アミノ酸、または最大１４０アミノ酸、または最大１６０アミノ酸、または最大１８０アミノ酸、または最大２００アミノ酸、または最大２５０アミノ酸、または最大３００アミノ酸、または最大３５０アミノ酸、または最大４００アミノ酸は、Ｃａｓ１３ｂエフェクターのＣ末端で切断されてもよい。Ｃａｓ１３ｂ切断の特定の例としては、Ｃ末端Δ９８４−１０９０、Ｃ末端Δ１０２６−１０９０、及びＣ末端Δ１０５３−１０９０、Ｃ末端Δ９３４−１０９０、Ｃ末端Δ８８４−１０９０、Ｃ末端Δ８３４−１０９０、Ｃ−末端Δ７８４−１０９０、及びＣ末端Δ７３４−１０９０が含まれ、ここで、アミノ酸位置は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５−１２５ Ｃａｓ１３ｂタンパク質のアミノ酸位置に対応する。
したがって、いくつかの例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含み得る。特定の実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性なＣ２ｃ２であってもよい。
上記の濃縮システムはまた、ある特定の核酸の試料を枯渇させるためにも使用され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、非標的ＲＮＡを結合して試料から非標的ＲＮＡを除去するように設計され得る。例示的な一実施形態では、ガイドＲＮＡは、特定の核酸変異を保持する核酸を結合するように設計されてもよい。例えば、所与の試料では、より多くのコピー数の非変異型核酸が予想される場合がある。したがって、本明細書に開示される実施形態を使用して、試料から非変異核酸を除去し、検出ＣＲＩＳＰＲエフェクター系が所与の試料中の標的変異配列を検出できる効率を高めてもよい。
診断デバイス
本明細書で説明される系は、診断デバイス上で具現化し得る。多くの基材及び構成が使用され得る。デバイスは、デバイス内の複数の個別のボリュームを定義し得る場合がある。本明細書で使用される場合、「個々の個別のボリューム」とは、標的分子の移動を防止及び／または阻害する特性によって定義され得る、容器、レセプタクル、または他の定義されたボリュームもしくは空間などの個別の空間、例えば、壁、例えば、ウェルの壁、チューブ、または液滴の表面などの物理的特性によって定義されるボリュームまたは空間を指し、これは不透過性もしくは半透過性であってもよく、または化学的、拡散速度制限、電磁もしくは光照明、あるいは定義された空間内に試料を含み得るそれらの任意の組み合わせなどの他の手段によって定義されてもよい。個々の個別のボリュームは、核酸バーコードなどの分子タグによって識別され得る。「拡散速度が制限される」とは（例えば、拡散によって定義されたボリューム）は、拡散によって標的分子の１つの流れから他の流れへの移行が制限される、２つの平行な層流の場合と同様に、拡散の制約が空間または体積を効果的に定義するので、特定の分子または反応にのみアクセスできる空間を意味する。「化学的」な定義されたボリュームまたは空間とは、サイズなどの化学的または分子的特性のおかげで特定の標的分子のみが存在し得る空間を意味し、例えば、ゲルビーズは、ビーズの内部に入る可能性のある種の選択を可能にし得る、ビーズの表面電荷、マトリックスサイズまたは他の物理的性質などによって、他ではなく特定の種がビーズに入ることを排除し得る。「電磁的に」定義されたボリュームまたは空間とは、標的分子の電磁特性または電荷もしくは磁気特性などのそれらの支持体を使用して、磁場内にまたは磁石に直接、磁性粒子を捕捉するなど、空間内の特定の領域を定義し得る空間を意味する。「光学的に」規定されたボリュームとは、規定された空間またはボリューム内の標的分子のみが標識され得るように、可視、紫外、赤外線、または他の波長の光でそれを照射することによって規定され得る、空間の任意の領域を意味する。非壁または半透過性の個別のボリュームを使用する利点の１つは、緩衝液、化学活性剤、またはその他の試薬などの一部の試薬が個別のボリュームを通過し得る一方で、標的分子などの他の材料は別個のボリュームまたは空間に維持され得るということである。通常、個別のボリュームには、標的分子を、標識を可能にする条件下で、インデックス可能な核酸識別子を用いて標識するのに適した流体媒体（例えば、水溶液、オイル、緩衝液、及び／または細胞増殖を支持可能な媒体）が含まれる。開示された方法において有用な例示的な個別のボリュームまたは空間としては、とりわけ、液滴（例えば、マイクロ流体液滴及び／またはエマルジョン液滴）、ヒドロゲルビーズまたは他のポリマー構造（例えば、ポリエチレングリコールジアクリレートビーズまたはアガロースビーズ）、組織スライド（例えば、特定の領域、ボリューム、または空間が化学的、光学的、または物理的手段によって定義された、固定ホルマリンパラフィン包埋組織スライド）、配列されたアレイまたはランダムパターンで試薬を配置することによって領域が定義された顕微鏡スライド、チューブ（遠心チューブ、マイクロ遠心チューブ、試験管、キュベット、コニカルチューブなど）、ボトル（ガラスボトル、プラスチックボトル、セラミックボトル、エーレンマイヤーフラスコ、シンチレーションバイアルなど）、ウェル（プレートのウェルなど）、プレート、ピペット、またはピペットチップが挙げられる。特定の実施形態では、区画は、油中水型エマルジョン中の水性液滴である。特定の実施形態では、正確なまたは均一な容量を必要とする、本明細書に記載の用途、方法、または系のいずれかが、音響液体ディスペンサーの使用を採用し得る。
ある特定の例示的な実施形態では、個々の個別のボリュームは、固体基板上に定義される。ある特定の実施形態では、個々の別個のボリュームは、マイクロウェルである。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、多数のスポットを定義し得る可塑性材料基材を備える。診断及びバイオセンシングでの使用に適した可塑性基材材料は、当技術分野で公知である。可塑性基材材料は、セルロース系繊維などの植物由来の繊維から作製されてもよく、または可塑性ポリエステルフィルム及び他のポリマータイプなどの可塑性ポリマーから作製されてもよい。規定された各スポット内で、本明細書に記載されている系の試薬が個々のスポットに適用される。各スポットには、異なるガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡのセットを除いて、同じ試薬が含まれてもよいし、または、複数の標的を一度にスクリーニングするための異なる検出アプタマーが適用可能である。したがって、本明細書の系及びデバイスは、同じ標的、または限られた数の標的の存在について、複数の供給源（例えば、異なる個人からの複数の臨床試料）、または試料中の複数の異なる標的の存在について単一の試料（または同じ供給源由来の複数の試料）のアリコートから、試料をスクリーニングし得る。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載される系の要素は、紙または布の基材上に凍結乾燥される。特定の例示的なデバイスで使用され得る例示的な可塑性材料ベースの基材は、Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６，１６５（５）：１２５５−６６及びＰａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１４，１５９（４）：９５０−５４に開示される。血液を含む生体液に使用するのに適した可塑性材料ベースの基材は、Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓらに対する「Ｐａｐｅｒ ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ」という名称の国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／０７１３０１、Ｓｉｅｇｅｌらへの「Ｐａｐｅｒ−ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ」と題された米国特許出願公開第２０１１／０１１１５１７号、及びＳｈａｆｉｅｅら「Ｐａｐｅｒ ａｎｄ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｉｏｔａｒｇｅｔｓ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８７１９（２０１５）に開示されている。さらなる可塑性可塑性ベースの材料としては、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」Ｃｅｌｌ ３４（１１）：９０９−２１（２０１６）に開示される着用可能な診断デバイスにおける使用に適切な材料が挙げられる。さらなる可塑性ベースの材料は、ニトロセルロース、ポリカーボネート、メチルエチルセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、またはガラスを含んでもよい（例えば、ＵＳ２０１２０２３８００８を参照）。ある特定の実施形態では、個別のボリュームは、限定されないが、ワックス、フォトレジスト、または固体インクなどの疎水性表面によって分離される。
特定の実施形態では、可塑性材料基材は、紙基材または可塑性ポリマーベースの基材である。
いくつかの実施形態では、センサーまたはインジケーターとして機能する線量計またはバッジを提供して、それによって着用者がある特定の微生物または他の薬剤への曝露について通知されるようにしてもよい。例えば、本明細書に記載される系は、特定の病原体を検出するために使用され得る。同様に、上に開示されたアプタマーベースの実施形態は、ポリペプチドならびに特定のアプタマーが結合し得る化学物質などの他の物質の両方を検出するために使用され得る。そのようなデバイスは、潜在的に危険な物質への曝露に関する情報を可能な限り迅速に提供するために、例えば、生物兵器または化学兵器の検出のために、兵士または他の軍人、ならびに臨床医、研究者、病院スタッフなどの監視に役立つ可能性がある。他の実施形態では、そのような監視バッジは、免疫不全患者、火傷患者、化学療法を受けている患者、子供、または高齢者における危険な微生物または病原体への曝露を防止するために使用され得る。
本明細書に記載の系及びデバイスを使用して分析され得る試料源としては、対象の生物学的試料または環境試料が挙げられる。環境試料には、表面または流体が含まれる場合がある。生物学的試料としては、限定するものではないが、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脊髄液、脳脊髄液、皮膚または粘膜のスワブ、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。例示的な実施形態では、環境試料は、食品または他の敏感な組成物及び材料の調製に使用される表面などの固体表面から採取される。
他の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系の要素は、表面または試料流体を拭き取るために使用されるスワブまたは布などの使い捨て基材上に配置されてもよい。例えば、この系は、果物または野菜などの食品の表面を拭くことによって、食品上の病原体の存在を試験するために使用してもよい。同様に、使い捨て基材は、安全性スクリーニングで使用するためなど、特定の微生物または物質を検出するために他の表面を拭き取るために使用してもよい。使い捨ての基材は、法医学でも用途があり、ＣＲＩＳＰＲ系は、検出するため、例えば、容疑者、もしくはある特定の組織もしくは細胞マーカーを特定して試料中に存在する生物学的物質の種類を特定するために使用され得るＤＮＡ ＳＮＰの特定に設計されている。同様に、使い捨て基材は、口からの唾液試料などの患者からの試料、または皮膚のスワブの収集に使用され得る。他の実施形態では、肉製品上または肉製品内の汚染物質の存在の有無を検出するために、肉製品の試料またはスワブを採取してもよい。
ほぼリアルタイムの微生物診断が、食品、臨床、産業、及びその他の環境設定に必要である（例えば、Ｌｕ ＴＫ、Ｂｏｗｅｒｓ Ｊ、及びＫｏｅｒｉｓ ＭＳ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｊｕｎ；３１（６）：３２５−７を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明は、病原体（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、またはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）に特異的なガイドＲＮＡを用いる食品媒介病原体の迅速な検出に使用される。
いくつかの実施形態では、個々の個別のボリュームはそれぞれ、本明細書に記載されるような核酸増幅試薬を含み得る。したがって、標的分子は標的ＤＮＡであり得、個々の個別のボリュームは、標的ＤＮＡと結合し、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、デバイスは流動ストリップであるか、流動ストリップを含む。例えば、側方流動ストリップでは、ＲＮＡｓｅ（Ｃ２ｃ２など）を色で検出可能である。ＲＮＡレポーターは、５’端に１番目の分子（例えばＦＩＴＣなど）が接続され、３’端に第２の分子（例えばビオチンなど）が接続されるように（またはその逆）改変される。側方流動ストリップは、第１のラインでハイブリダイズした抗第１分子（例えば、抗ＦＩＴＣ）抗体及び第２の下流ラインで抗二次分子（例えば、抗ビオチン）抗体を備えた２つの捕捉ラインを有するように設計されている。反応がストリップを流れると、切断されていないレポーターは第１の捕捉ラインで抗第１分子抗体に結合し、切断されたレポーターは第２の分子を遊離させ、第２の捕捉ラインでの第２の分子の結合を可能にする。例えば、金ナノ粒子などのナノ粒子にコンジュゲートされた第２の分子サンドイッチ抗体は、１番目または第２のラインで任意の第２の分子に結合し、強力な読み出し／シグナル（例えば、色）をもたらす。より多くのレポーターが切断されるほど、より多くのシグナルが第２の捕捉ラインに蓄積され、より少ないシグナルが第１のラインに現れる。ある特定の態様では、本発明は、核酸またはポリペプチドを検出するための、本明細書に記載されている流動ストリップの使用に関する。ある特定の態様では、本発明は、本明細書で定義される流動ストリップ、例えば、（側方）流動試験または（側方）フローイムノクロマトアッセイを用いて核酸またはポリペプチドを検出するための方法に関する。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、異なる液滴（すなわち、個々の個別のボリューム）を生成及び／または融合するマイクロ流体デバイスである。例えば、スクリーニングされる試料を含む第１のセットの液滴が形成されてもよく、本明細書に記載される系の要素を含む第２のセットの液滴が形成されてもよい。次に、第１及び第２の液滴セットが融合され、次に、本明細書に記載される診断方法を、融合された液滴セットに対して実行する。本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、シリコーンベースのチップであってもよく、限定するものではないが、ホットエンボス、エラストマーの成形、射出成形、ＬＩＧＡ、ソフトリソグラフィー、シリコン製造及び関連する薄膜処理技術を含む、様々な技術を使用して製造され得る。マイクロ流体デバイスを製造するための適切な材料には、限定するものではないが、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、及びポリ（メチルアクリレート）（ＰＭＭＡ）が挙げられる。一実施形態では、ＰＤＭＳにおけるソフトリソグラフィーを使用して、マイクロ流体デバイスを調製してもよい。例えば、モールド（鋳型）は、基材内のフローチャネル、バルブ、及びフィルターの位置を規定するフォトリソグラフィーを使用して作製され得る。基材材料を型に流し込み、硬化させてスタンプを作成する。次に、スタンプは、ガラスなどであるがこれに限定されない固体支持体に密封される。いくつかのタンパク質を吸収し、ある特定の生物学的プロセスを阻害し得る、ＰＤＭＳなどのいくつかのポリマーは疎水性であるせいで、不動態化剤が必要な場合がある（Ｓｃｈｏｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４：３７５−３７９）。適切な不動態化剤は当技術分野で公知でありこれには、限定するものではないが、シラン、パリレン、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マトシド（ＤＤＭ）、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ−２０、他の類似の界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、コラーゲン、ならびに他の同様のタンパク質及びペプチドが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、この系及び／またはデバイスは、単一の実験で数百万の細胞の高感度かつ定量的測定の全てにおいて、またはそれを可能にするために、フローサイトメトリーの読み出しへの変換に適合させてもよく、ＰｒｉｍｅＦｌｏｗアッセイなどの既存の流動ベースの方法の際に改善し得る。ある特定の例示的な実施形態では、細胞は、非重合ゲルモノマーを含む液滴にキャストされてもよく、次いで、フローサイトメトリーによる分析に適した単一細胞の液滴にキャストされてもよい。蛍光検出可能標識を含む検出構築物は、非重合ゲルモノマーを含む液滴にキャストされてもよい。ゲルモノマーの重合の際に液滴内にビーズを形成する。ゲルの重合はフリーラジカルの形成によるので、蛍光レポーターはゲルに共有結合する。検出構築物は、アミンなどのリンカーを含むようにさらに改変されてもよい。ゲル形成後にクエンチャーを加えてもよく、リンカーを介してレポーター構築物に結合する。したがって、クエンチャーはゲルに結合しておらず、レポーターがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって切断されるときに自由になり拡散して離れる。液滴内のシグナルの増幅は、検出構築物をハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ開始因子）増幅に結合することによって達成され得る。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドヘアピンは、ＲＮａｓｅ感受性ドメインを有するヘアピンループを含み得るゲルに組み込まれ得る。ＲＮａｓｅ感受性ドメインを有するヘアピンループ内の鎖置換足場を保護することにより、ＨＣＲ開始因子は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるヘアピンループの切断後に選択的に脱保護され得る。足場媒介性の鎖置換によるＨＣＲ開始因子の脱保護に続いて、蛍光ＨＣＲモノマーをゲルに洗い流して、開始因子が脱保護されているシグナル増幅を可能にし得る。
本発明の文脈で使用され得るマイクロ流体デバイスの例は、Ｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ．「Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」Ｌａｐ Ｃｈｉｐ．１５（１０）：２２９７−２３０７（２０１６）に記載されている。
本明細書に記載の系では、クリニック設定外の対象の生物学的液などの生物学的試料を評価し、医療従事者によってアクセス可能な中央サーバーにアッセイの結果を遠隔的に報告する着用可能な医療デバイスにさらに組み込んでもよい。このデバイスは、Ｐｅｅｔｅｒｓらに対する、「Ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ Ｂｌｏｏｄ Ｄｒａｗ」と題された米国特許出願公開第２０１５／０３４２５０９号、Ａｎｄｒｅｗ Ｃｏｎａｒｄに対する「Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｈｏｒｅｓｉｓ」と題された米国特許出願公開第２０１５／００６５８２１号に開示されたデバイスなど、血液を自己サンプリングする能力を備え得る。
ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、マイクロプレートウェルなどの個々のウェルを含み得る。マイクロプレートウェルのサイズは、標準の６、２４、９６、３８４、１５３６、３４５６、または９６００サイズのウェルというサイズであり得る。ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系の要素は、凍結乾燥され、分配及び使用の前にウェルの表面に適用されてもよい。
本明細書に開示されるデバイスは、入口及び出口ポート、または開口部をさらに備えてもよく、次にこれらは、デバイスへの及びデバイスからの流体の導入及び抽出のために、バルブ、チューブ、チャネル、チャンバ、及びシリンジ及び／またはポンプに接続され得る。このデバイスは、マイクロ流体デバイス内の流体の方向性のある動きを可能にする流体フローアクチュエータに接続されてもよい。アクチュエータの例としては、限定するものではないが、シリンジポンプ、機械的に作動する再循環ポンプ、電気浸透ポンプ、バルブ、ベローズ、ダイヤフラム、または流体の移動を強制するための気泡が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、デバイスは、デバイスを通して流体を移動させるために一緒に機能するプログラム可能なバルブを有するコントローラーに接続される。ある特定の例示的な実施形態では、このデバイスは、以下でさらに詳細に論じられるコントローラーに接続される。このデバイスは、デバイスの入口ポートに挿入するために金属ピンで終端するチューブによって、フローアクチュエータ、コントローラー、及び試料ローディングデバイスに接続され得る。
本明細書に示されるように、系の要素は凍結乾燥された場合に安定であり、したがって、支持デバイスを必要としない実施形態も企図され、すなわち、この系は、本明細書に開示される反応を支持し、そして任意の表面または流体に適用されて、その表面または溶液からの正の検出可能なシグナルの検出を可能にし得る。凍結乾燥に加えて、この系はペレット化された形で安定して保管及び利用されてもよい。適切なペレット化形態を形成するのに有用なポリマーは、当技術分野で公知である。
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、デバイス内の各個別のボリュームに結合される。各別個のボリュームは、異なる標的分子に特異的な異なるガイドＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、試料は、それぞれが標的分子に特異的なガイドＲＮＡを含む、２つ以上の別個のボリュームを含む固体基材に曝露される。理論に縛られることなく、各ガイドＲＮＡは、試料からその標的分子を捕捉し、その試料を個別のアッセイに分割する必要はない。したがって、貴重な試料が保存され得る。エフェクタータンパク質は、親和性タグを含む融合タンパク質であってもよい。親和性タグは当技術分野で周知である（例えば、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、フラグタグ、Ｈｉｓタグ、ビオチン）。エフェクタータンパク質は、ビオチン分子に連結されてもよく、個別のボリュームはストレプトアビジンを含んでもよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、エフェクタータンパク質に特異的な抗体によって結合される。ＣＲＩＳＰＲ酵素を結合する方法は以前に説明されている（例えば、ＵＳ２０１４０３５６８６７Ａ１を参照のこと）。
本明細書に開示されるデバイスはまた、他の方法によって試料を分析するための、当該分野で公知のポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスの要素を備えてもよい。例えば、Ｓｔ Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｐｒｉｃｅ「Ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ」（Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２０１４ Ａｕｇ；３５（３）：１５５−１６７）を参照のこと。
本発明は、ワイヤレスラボオンチップ（ＬＯＣ）診断センサーシステム（例えば、米国特許番号９，４７０，６９９「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒａｄｉｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」を参照）と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、本発明は、ワイヤレスデバイス（例えば、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、タブレット）によって制御されるＬＯＣで実行され、結果は上記デバイスに報告される。
無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグシステムは、ＲＦＩＤリーダー（インテロゲータとも呼ばれる）による受信のためにデータを送信するＲＦＩＤタグを含む。典型的なＲＦＩＤシステムでは、個々の物体（例えば、店舗の商品）には、トランスポンダを含む比較的小さなタグが装備されている。トランスポンダには、固有の電子製品コードが割り当てられたメモリチップがある。ＲＦＩＤリーダーは、通信プロトコルを使用して、タグ内のトランスポンダをアクティブにするシグナルを発信する。したがって、ＲＦＩＤリーダーは、タグに対してデータを読み書きし得る。さらに、ＲＦＩＤタグリーダーは、ＲＦＩＤタグシステムアプリケーションに従ってデータを処理する。現在、パッシブ型とアクティブ型のＲＦＩＤタグがある。パッシブ型のＲＦＩＤタグは、内部電源を備えていないが、ＲＦＩＤリーダーから受信した無線周波数シグナルによって給電される。あるいは、アクティブ型のＲＦＩＤタグは、アクティブ型のＲＦＩＤタグがより大きな伝送範囲とメモリ容量を所有できるようにする内部電源を備えている。パッシブタグ対アクティブタグの使用は、特定のアプリケーション次第である。
ラボオンザチップ技術は、科学文献に十分に記載されており、複数のマイクロ流体チャネル、入力または化学ウェルからなる。ＲＦＩＤ電子チップからの導電性リードは、各試験ウェルに直接リンクできるので、ウェル内の反応は、無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグ技術を使用して測定され得る。アンテナは、電子チップの別の層に印刷してもよいし、デバイスの背面に直接取り付けてもよい。さらに、リード線、アンテナ、電子チップをＬＯＣチップに埋め込んでもよく、それによって電極または電子機器の短絡を防いでもよい。ＬＯＣは、複雑な試料の分離と分析を可能にするため、この技術により、複雑、または高価なリーダーとは独立してＬＯＣ試験を行ってもよい。むしろ、携帯電話またはＰＤＡなどの単純なワイヤレスデバイスを使用してもよい。一実施形態では、ワイヤレスデバイスは、より複雑なＬＯＣ分析のために、マイクロ流体チャネルの分離及び制御も制御する。一実施形態では、ＬＥＤ及び他の電子測定または感知デバイスを、ＬＯＣ−ＲＦＩＤチップに備える。理論に縛られるものではないが、この技術は使い捨てであり、分離と混合を必要とする複雑な試験を実験室の外で行うことを可能にする。
好ましい実施形態では、ＬＯＣは、マイクロ流体デバイスであってもよい。ＬＯＣは、パッシブチップであり得、このチップは、ワイヤレスデバイスを通じて電力が供給され、制御される。特定の実施形態では、ＬＯＣは、試薬を保持するためのマイクロ流体チャネル及び試料を導入するためのチャネルを含む。特定の実施形態では、ワイヤレスデバイスからのシグナルは、ＬＯＣに電力を送達し、試料及びアッセイ試薬の混合を活性化する。具体的には、本発明の場合、この系は、マスキング剤、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、及び標的分子に特異的なガイドＲＮＡを含み得る。ＬＯＣの活性化の際に、マイクロ流体デバイスは試料とアッセイ試薬を混合し得る。混合の際、センサーがシグナルを検出し、その結果をワイヤレスデバイスに送信する。特定の実施形態では、アンマスキング剤は、導電性ＲＮＡ分子である。導電性ＲＮＡ分子は、導電性材料に付着され得る。導電性分子は、導電性ナノ粒子、導電性タンパク質、タンパク質もしくはラテックスに付着した金属粒子、または導電性である他のビーズであってもよい。特定の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用するならば、導電性分子を、一致するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に直接付着してもよい。導電性分子の放出は、センサー全体で検出され得る。アッセイは、一段階プロセスであってもよい。
表面積の導電率は正確に測定され得るので、使い捨てワイヤレスＲＦＩＤ電気アッセイで定量的な結果が可能である。さらに、試験領域を非常に小さくし得、特定の領域でより多くの試験を実行できるため、コストを節約につながる。ある特定の実施形態では、それぞれが異なるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びセンサーに固定化されたガイドＲＮＡと関連付けられた別個のセンサーが、複数の標的分子を検出するために使用される。理論に拘束されることはないが、さまざまなセンサーの活性化は、ワイヤレスデバイスによって区別される場合がある。
本明細書に記載される導電性方法に加えて、使い捨てＲＦＩＤアッセイのための基本的な低コスト通信及び電力プラットフォームとしてＲＦＩＤまたはブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ）に依存する他の方法が使用され得る。例えば、光学的手段を使用して、所与の標的分子の存在及びレベルを評価し得る。ある特定の実施形態では、光学センサーは、蛍光マスキング剤のアンマスキングを検出する。
ある特定の実施形態では、本発明のデバイスは、アッセイの診断読み取りのための手持ち式携帯型デバイスを含み得る（例えば、Ｖａｓｈｉｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｓｍａｒｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２０１４，４（３），１０４−１２８；ｍＲｅａｄｅｒ ｆｒｏｍ Ｍｏｂｉｌｅ Ａｓｓａｙ；及びＨｏｌｏｍｉｃ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔ Ｒｅａｄｅｒを参照のこと）。
本明細書で述べるように、ある特定の実施形態は、実施形態がＰＯＣ状況で、及び／またはシグナルを読み出すためのより複雑な検出機器へのアクセスが制限され得るリソース不足環境で利用される場合に、ある特定の付随する利点を有する比色変化による検出を可能にする。しかし、本明細書に開示される携帯可能な実施形態は、可視範囲外のシグナルの検出を可能にする手持ち式分光光度計と結合されてもよい。本発明と組み合わせて使用され得る手持ち式分光光度計デバイスの例は、Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．「Ｕｌｔｒａ−ｐｏｒｔａｂｌｅ， ｗｉｒｅｌｅｓｓ ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ，ｎｏｎ−ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｅｓｓ．」Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６，６：３２５０４，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３２５０４に記載されている。最後に、量子ドットベースのマスキング構築物を利用するある特定の実施形態では、手持ち式ＵＶ光または他の適切なデバイスの使用が、量子ドットによって提供されるほぼ完全な量子収量のおかげで、シグナルを検出するために首尾よく使用され得る。
試料中で標的核酸を検出するための方法
本明細書ではまた、試料内の標的核酸を検出する方法も提供され、この方法は、試料または試料のセットを１つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含むこと；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、このＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、四重鎖を含むＲＮＡアプタマーが修飾され、その結果四重鎖の酵素活性が不活性化されること；ならびに酵素活性を検出することであって、ここで閾値を下回る検出は、試料中の１つ以上の標的分子の存在を示すこと、を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、標的分子は、本明細書の他の場所に記載されているような標的ＤＮＡであってよい。ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、本明細書の他の場所に記載されるように、ＲＮＡポリメラーゼ部位を含むプライマーと標的ＤＮＡを結合することをさらに含み得る。
ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、本明細書の他の場所に記載されるように、試料ＲＮＡまたはトリガーＲＮＡを増幅することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの増幅は、本明細書に記載されるようなＮＡＳＢＡによる増幅を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの増幅は、本明細書に記載されるようなＲＰＡによる増幅を含む。
いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料であっても、または環境試料であってもよい。環境試料としては、必ずしもこれらに限定されないが、食品試料（新鮮な果物または野菜、肉）、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属の表面、木材の表面、プラスチックの表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、大気もしくは他のガス試料への暴露、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含むがこれらに限定されない任意の材料で作製された家庭用／商業用／産業用の表面を拭き取り、汚染物質を検査してもよい。土壌試料は、環境目的及び／またはヒト、動物、もしくは植物の病気の試験の両方のために、病原菌もしくは寄生生物、または他の微生物の存在について試験してもよい。淡水試料、廃水試料、または生理食塩水試料などの水試料を、清浄度及び安全性、ならびに／または飲料適性について評価し、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、または他の微生物汚染の存在を検出し得る。さらなる実施形態では、生体試料は、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿膜腫、膿、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブを含むがこれらに限定されない供給源から得てもよい。いくつかの特定の実施形態において、環境試料または生物学的試料は、粗製試料であってもよく、そして／または１つ以上の標的分子は、方法の適用前に試料から精製も増幅もされなくてもよい。微生物の同定は、多数の用途に有用及び／または必要であり得、したがって、当業者によって適切であると見なされる任意の供給源からの任意のタイプの試料が、本発明に従って使用され得る。
生物学的試料は、限定されないが、とりわけ、細菌、酵母、原生動物、及びアメーバなどの単細胞生物、多細胞生物を含む任意の生きた生物体から得られるか、排泄されるか、または分泌される任意の固体または流体試料（例えば、植物または動物、例としては、診断もしくは検討されるべき状態もしくは疾患、例えば、健常もしくは見かけ上健常なヒト対象、または病原性細菌またはウイルスのような病原性微生物での感染に罹患したヒト患者由来の試料）である。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍またはその他の感染または炎症部位から得られた液体）から得られる生物学的液体、または関節（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節）から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであり得る。
試料はまた、任意の臓器または組織（腫瘍生検などの生検または剖検標本を含む）から得られた試料であってもよいし、あるいは細胞（初代細胞または培養細胞のいずれか）または任意の細胞、組織もしくは臓器によって調整された培地を含んでもよい。例示的な試料としては、限定されないが、細胞、細胞溶解物、血液スメア、細胞遠心調製物、細胞診スメア、体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、気管支肺胞洗浄液、精液など）、組織生検（例えば、腫瘍生検）、細針吸引、及び／または組織切片（例えば、クリオスタット組織切片及び／またはパラフィン包埋組織切片）が挙げられる。他の例では、試料は循環腫瘍細胞を含む（これは細胞表面マーカーによって識別可能である）。特定の例では、試料は直接使用（例えば、新鮮または凍結）するか、または使用前に、例えば固定（例えば、ホルマリンを使用）及び／またはワックスに埋め込む（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料）ことにより操作してもよい。対象から組織を得る任意の方法を利用してもよく、使用する方法の選択は、組織の種類、対象の年齢、または開業医が利用できる手順などの様々な要因に依存することは理解されよう。そのような試料を取得するための標準的な技術は、当技術分野で利用可能である。例えば、Ｓｃｈｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７−３３（１９９２）；Ｂｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３３：５１５−１８（１９８６）；Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３１８：５８９−９３（１９８８）；及びＯｇｎｉｂｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２９：９２９−３２（１９８４）を参照のこと。
特定の実施形態では、生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、血清腫、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体の分泌物、漏出物、浸出物（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症部位の任意の他の部位から得られた液体）、または関節（例えば、正常な関節または疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎に冒された関節）から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブであってもよい。
特定の実施形態では、環境試料は、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られてもよい。
いくつかの実施形態では、１つ以上の同定された標的配列は、本明細書に記載されるような標的配列に特異的であり、かつ、その標的配列に結合するガイドＲＮＡを使用して検出され得る。本発明の系及び方法は、異なる微生物種間に存在する一塩基多型の間でも識別し得、したがって、本発明による複数のガイドＲＮＡの使用は、種の間を識別するために使用され得る標的配列の数をさらに拡大または改善し得る。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、種、属、科、目、綱、門、界、もしくは表現型、またはそれらの組み合わせで微生物を識別し得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、本明細書の他の場所に記載されるように、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、疾患状態の診断である１つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。本明細書の他の箇所に記載されているように、病状は、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患であり得る。
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、無細胞核酸に結合するように設計されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料を本明細書に記載の核酸検出系と接触させること、及び接触した試料を、本明細書に記載されるように、側方流動イムノクロマトグラフィック分析に適用することを含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。
タンパク質の検出
本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーの組み込みを介して、核酸の検出に加えて、ポリペプチド（または他の分子）の検出に適合され得る。ポリペプチド検出アプタマーは、上記のマスキング構築物アプタマーとは異なる。まず、アプタマーは１つ以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。例示的な一実施形態では、標的分子は標的ポリペプチドである。別の例示的な実施形態では、標的分子は、標的治療用分子などの標的化合物である。ＳＥＬＥＸなどの所与の標的に特異性を有するアプタマーを設計及び選択する方法は、当技術分野で公知である。所定の標的に対する特異性に加えて、アプタマーはさらに、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むように設計されている。ある特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７プロモーターである。アプタマー結合を標的に結合する前は、ＲＮＡポリメラーゼ部位は、ＲＮＡポリメラーゼにアクセスできないか、そうでなければ認識不能である。しかしながら、アプタマーは、標的の結合時にアプタマーの構造が高次構造変化を受けて、その結果、次にＲＮＡポリメラーゼプロモーターが露出されるように構成される。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流のアプタマー配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成のための鋳型として機能する。したがって、アプタマーの鋳型部分は、所与のアプタマー及びその標的を同定するバーコードまたは他の同定配列をさらに組み込んでもよい。上記のガイドＲＮＡは、これらの特定のトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識するように設計してもよい。トリガーオリゴヌクレオチドへのガイドＲＮＡの結合は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化し、これが進行して前述のようにマスキング構築物を非活性化し、正の検出可能なシグナルを生成する。
したがって、ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、試料または試料のセットを一連の個々の個別ボリュームに分配する追加のステップであって、この各個々の個別ボリュームは、ペプチド検出アプタマー、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物を含むステップと、１つ以上の標的分子への検出アプタマーの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートし、対応する標的へのアプタマーの結合がＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位の露出をもたらし、その結果トリガーＲＮＡの合成がＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位への結合により開始されるステップとを含む。
別の例示的な実施形態では、アプタマーの結合は、アプタマーが標的ポリペプチドに結合すると、プライマー結合部位を露出し得る。例えば、アプタマーは、ＲＰＡプライマー結合部位を露出し得る。これによって、次に、プライマーの添加または包含は、上記で概説したＲＰＡ反応などの増幅反応に供給される。
ある特定の例示的な実施形態では、アプタマーは、目的の標的に結合すると二次構造を変化し得、一本鎖ＤＮＡの新しい領域を露出し得る高次構造スイッチングアプタマーであり得る。特定の例示的な実施形態において、一本鎖ＤＮＡのこれらの新しい領域は、ライゲーションのための基質として使用され得、アプタマーを伸長し、そして本明細書に開示される実施形態を使用して特異的に検出され得る、より長いｓｓＤＮＡ分子を作製する。アプタマーの設計は、グルコースなどの低エピトープ標的を検出するための三元複合体とさらに組み合わせられ得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５：ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０１６３４）。高次構造シフトのアプタマー及び対応するガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の例を以下に示す。
Figure 2021511795
例示的な方法及びアッセイ
アッセイプラットフォームの低コスト及び適応性は、（ｉ）一般的なＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質定量、（ｉｉ）迅速な多重化ＲＮＡ／ＤＮＡ及びタンパク質の発現検出、ならびに（ｉｉｉ）標的核酸、ペプチド及びタンパク質（臨床試料及び環境試料の両方における）の高感度検出を含む多くの用途に役立つ。さらに、本明細書に開示される系は、細胞などの生物学的設定内での転写物の検出に適合され得る。本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲエフェクターの非常に特異的な性質を考えると、生細胞における転写産物または疾患関連変異の対立遺伝子特異的発現を追跡することが可能であり得る。
ある特定の例示的な実施形態では、単一の標的に特異的な単一のガイド配列が別々のボリュームに配置される。次に、各ボリュームは、異なる試料または同じ試料のアリコートを受け取り得る。ある特定の例示的な実施形態では、別々の標的に対するそれぞれの複数のガイド配列は、複数の標的が異なるウェルでスクリーニングされ得るように単一のウェルに配置され得る。単一の容積内の複数のガイドＲＮＡを検出するために、ある特定の例示的な実施形態では、異なる特異性を有する複数のエフェクタータンパク質が使用され得る。例えば、１つのオルソログは、Ａを優先的に切断するが、他のオルソログはＣ、Ｇ、Ｕ／Ｔを優先的に切断する。したがって、単一のヌクレオチドの全てであるか、または十分な部分を備えるマスキング構築物を生成してもよく、それぞれが異なる波長で検出され得る異なるフルオロフォアを有する。このようにして、最大４つの異なる標的を、単一の個別のボリュームでスクリーニングし得る。ある特定の例示的な実施形態では、２つのＣａｓ１３ａオルソログ、２つのＣａｓ１３ｂオルソログ、または２つのＣａｓ１３オルソログなど、同じクラスのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質からの異なるオルソログを使用してもよい。様々なＣａｓ１３タンパク質のヌクレオチド優先性を、図６７に示す。ある特定の他の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂのオルソログ、またはＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｃのオルソログ、またはＣａｓ１３ｂのオルソログ及びＣａｓ１３ｃのオルソログなど、ヌクレオチド編集の優先性が異なる異なるオルソログを使用してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、ポリＵ優先のＣａｓ１３タンパク質及びポリＡ優先のＣａｓ１３ｂタンパク質を使用する。ある特定の例示的な実施形態では、ポリＵ優先のＣａｓ１３ｂタンパク質は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ Ｃａｓ１３ｂであり、ポリＡ優先のＣａｓ１３ｂタンパク質は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＡ２１０６ Ｃａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ）である。ある特定の例示的な実施形態では、ポリＵ優先のＣａｓ１３タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｃａｓ１３ａ（ＬｗａＣａｓ１３ａ）タンパク質であり、ポリＡ優先のＣａｓ１３タンパク質は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ＭＡ２１０６ Ｃａｓ１３ｂタンパク質である。特定の例示的な実施形態では、ポリＵ優先性を有するＣａｓ１３タンパク質は、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ Ｃａｓ１３タンパク質（ＣｃａＣａｓ１３ｂ）である。
一塩基編集の優先性に加えて、Ｃａｓ１３オルソログの他のモチーフ切断優先性に基づいて、追加の検出構築物を設計し得る。例えば、Ｃａｓ１３オルソログは、ジヌクレオチド配列、トリヌクレオチド配列、または４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のヌクレオチドモチーフを含むより複雑なモチーフを優先的に切断し得る。したがって、本明細書に開示される実施形態を使用するマルチプレックスアッセイの上限は、識別可能な検出可能な標識の数によって主に制限される。そのようなモチーフを同定するための例示的な方法は、以下の実施例にさらに開示されている。
本明細書に示されるように、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系は、標的分子のアトモル濃度までの検出が可能である。例えば、図１３、１４、１９、２２及び下記の実施例を参照のこと。上記系の感度に起因して、迅速かつ高感度の検出を必要とする多くの用途は、本明細書に開示された実施形態から利益を得る可能性があり、本発明の範囲内であることが企図される。アッセイ及び適用の例については、以下で詳しく説明する。
ｒＲＮＡ配列に基づく検出
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法を使用して、試料中の複数の微生物種を区別し得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、１６Ｓ、２３Ｓ、及び５Ｓサブユニットを含むリボソームＲＮＡ配列に基づき得る。関連するｒＲＮＡ配列を同定する方法は、米国特許出願公開第２０１７／００２９８７２号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡのセットが、各々の種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計され得る。ガイドＲＮＡはまた、属、科、目、綱、門、もしくは界、またはそれらの組み合わせで微生物を区別するＲＮＡ遺伝子を標的とするように設計されてもよい。増幅が使用されるある特定の例示的な実施形態では、一連の増幅プライマーが、リボソームＲＮＡ配列の隣接する定常領域及び可変内部領域によって各種を区別するように設計されたガイドＲＮＡに設計され得る。ある特定の例示的な実施形態では、プライマー及びガイドＲＮＡは、１６Ｓサブユニット内で可変領域がそれぞれ保存されるように設計されてもよい。ＲｅｃＡ遺伝子ファミリー、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットなどの種間または種のサブセット間で一意に変化する他の遺伝子またはゲノム領域も同様に使用してもよい。他の適切な系統学的マーカー、及びそれを同定する方法は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ａｒＸｉｖ：１３０７．８６９０［ｑ−ｂｉｏ．ＧＮ］で考察されている。
ある特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、複数の系統学的及び／または表現型レベルにわたって微生物を同時にスクリーニングするように設計される。例えば、この方法または診断は、異なるガイドＲＮＡを伴う複数のＣＲＩＳＰＲ系の使用を含んでもよい。ガイドＲＮＡの第１のセットは、例えば、マイコバクテリア、グラム陽性菌、及びグラム陰性菌を区別し得る。これらの一般的なクラスは、さらに細分化され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、グラム陰性菌内で腸溶性と非腸溶性を区別する方法または診断で設計及び使用され得る。ガイドＲＮＡの第２のセットは、微生物を属または種レベルで区別するように設計され得る。したがって、これらのクラスの１つに該当する所定の試料で識別された細菌の種の各属で、グラム陽性、グラム陰性（さらに腸溶性と非腸溶性に分類）の全てのマイコバクテリアを識別するマトリックスを作成し得る。上記は、例示のみを目的としている。他の微生物の種類を分類するための他の手段も企図され、上記の一般的な構造に従う。
薬剤耐性のスクリーニング
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法は、目的の微生物遺伝子、例えば、抗生物質及び／または抗ウイルス耐性遺伝子をスクリーニングするために使用され得る。ガイドＲＮＡは、公知の目的遺伝子を区別するように設計してもよい。次に、臨床試料を含む試料を、そのような遺伝子の検出のために、本明細書に開示される実施形態を使用してスクリーニングしてもよい。ＰＯＣで薬剤耐性をスクリーニングする能力は、適切な治療計画を選択する上で非常に有益である。ある特定の例示的な実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、ＫＰＣ、ＮＤＭ１、ＣＴＸ−Ｍ１５、ＯＸＡ−４８を含むカルバペネマーゼである。他の抗生物質耐性遺伝子は公知であり、例えば包括的抗生物質耐性データベース（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．「ＣＡＲＤ ２０１７：ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ−ｃｅｎｔｒｉｃ ｃｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５，Ｄ５６６−５７３）に見出され得る。
リバビリンは、多くのＲＮＡウイルスを攻撃する効果的な抗ウイルス剤である。いくつかの臨床的に重要なウイルスがリバビリン耐性を進化させており、これには口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０３５９４−１３；ポリオウイルス（Ｐｆｅｉｆｅｒ ａｎｄ Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ．ＰＮＡＳ，１００（１２）：７２８９−７２９４，２００３）；及びＣ型肝炎ウイルス（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ａｎｄ Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（４）：２３４６−２３５５，２００５）が挙げられる。いくつかの他の持続性ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎及びＨＩＶは、既存の抗ウイルス薬に対する耐性を進化させてきた：Ｂ型肝炎ウイルス（ラミブジン、テノフォビル、エンテカビル）ｄｏｉ：１０／１００２／ｈｅｐ２２９００；Ｃ型肝炎ウイルス（テラプレビル、ＢＩＬＮ２０６１、ＩＴＭＮ−１９１、ＳＣｈ６、ボセプレビル、ＡＧ−０２１５４１、ＡＣＨ−８０６）ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２２５４９；及びＨＩＶ（多くの薬物耐性変異）ｈｉｖｂ．ｓｔａｎｄｆｏｒｄ．ｅｄｕ。本明細書に開示される実施形態は、とりわけそのようなバリアントを検出するために使用されてもよい。
薬物耐性の他に、ＬＣＭＶにおける持続感染対急性感染（ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１９３０４１０８）、及びエボラ感染性の増大（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６，１６７（４）：１０８８−１０９８）など、本明細書に開示される実施形態で検出され得る臨床的に関連する多数の変異がある。
本明細書のいずれかに記載されるように、密接に関連する微生物種（例えば、所与の標的配列において単一のヌクレオチドの違いのみを有する）は、ｇＲＮＡにおける合成ミスマッチの導入によって区別され得る。
セットカバーアプローチ
特定の実施形態では、例えば、規定された微生物のセット内の全ての微生物種を特定し得るガイドＲＮＡのセットが設計される。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡを生成するための方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０４０３１６号に開示されている方法と比較され得る。ＷＯ２０１７０４０３１６に記載されているように、セットカバーソリューションは、標的配列全体または標的配列のセット、例えば、ゲノム配列のセットをカバーするために必要な最小数の標的配列プローブまたはガイドＲＮＡを特定し得る。セットカバーアプローチは、通常２０〜５０塩基対の範囲で、プライマー及び／またはマイクロアレイプローブを特定するために以前使用されていた。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｃｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／〜ｒｏｂｉｎｓ／ｐａｐｅｒｓ／ｐｒｉｍｅｒｓ＿ｄａｍ１１＿ｆｉｎａｌ．ｐｄｆ．，Ｊａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ ３４（２２）：６６０５−１１，Ｊａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（１）：ｅ３ ｄｏｉ１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ１１０６，Ｄｕｉｔａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９，３７（８）：２４８３−２４９２，Ｐｈｉｌｌｉｐｐｙ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９，１０：２９３ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−１０−２９３を参照のこと。ただし、このようなアプローチでは、一般的に各プライマー／プローブをｋ−ｍｅｒとして扱うこと、完全一致を検索するか、またはサフィックス（ｓｕｆｆｉｘ）アレイを使用して不正確な一致を可能にすることを含む。さらに、この方法は一般に、各入力配列が１つのプライマーまたはプローブによってのみ結合される必要があり、配列に沿ったこの結合の位置は無関係であるように、プライマーまたはプローブを選択することにより、ハイブリダイゼーションを検出するバイナリアプローチをとる。代替方法では、標的ゲノムを事前定義されたウィンドウに分割し、バイナリアプローチ下で各ウィンドウを個別の入力配列として効果的に処理し得る。すなわち、所定のプローブまたはガイドＲＮＡが、各ウィンドウ内に結合し、いくつかのプローブまたはガイドＲＮＡの状態によって、全てのウィンドウが結合される必要があるか否かを決定する。効果的には、これらのアプローチは、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を、入力配列全体または入力配列の事前定義されたウィンドウのいずれかとして扱い、その要素内でプローブまたはガイドＲＮＡが結合することを開始する場合、その各要素は「カバーされている」と見なされる。これらのアプローチは、異なるプローブまたはガイドＲＮＡの設計が、所定の標的配列をカバーし得る流動性を制限する。
対照的に、本明細書に開示される実施形態は、ハイブリッド選択配列決定に適した、例えば７０ｂｐ〜２００ｂｐの範囲のより長いプローブまたはガイドＲＮＡ長を検出することに関する。さらに、本明細書におけるＷＯ２０１７／０４０３１６開示される方法は、大きい及び／または可変の標的配列セットにおける全ての種及び／または株配列の検出配列決定を同定及び促進し得る、プローブまたはガイドＲＮＡセットを定義し得る汎標的配列アプローチを採用するために適用され得る。例えば、本明細書に開示される方法は、単一のアッセイにおいて所与のウイルスの全てのバリアント、または複数の異なるウイルスを特定するために使用され得る。さらに、本明細書で開示される方法は、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を、標的配列のヌクレオチドであるとして扱い、プローブまたはガイドＲＮＡがその要素を含む標的ゲノムのいくつかのセグメントに結合する限り、各要素は「カバーされた」と見なす。これらのタイプのセットカバー方法は、以前の方法のバイナリアプローチの代わりに使用してもよく、本明細書に開示される方法は、あるプローブまたはガイドＲＮＡが、標的配列にハイブリダイズし得る様式の、より良好なモデルである。所定のガイドＲＮＡ配列が所定のウィンドウに結合するかしないかを尋ねるだけでなく、そのようなアプローチを使用して、ハイブリダイゼーションパターン（すなわち、所定のプローブまたはガイドＲＮＡが標的配列または標的配列に結合する場所）を検出し得、次いで、これらのハイブリダイゼーションパターンから、試料からの濃縮及び任意のかつ全ての標的配列の配列決定の両方を可能にするのに十分な程度に標的配列のセットをカバーするために必要なプローブまたはガイドＲＮＡの最小数を決定する。これらのハイブリダイゼーションパターンは、損失関数を最小限に抑える、ある特定のパラメーターを定義することで決定され得、これにより、例えば、各種の多様性を反映するため、パラメーターが種ごとに変わることを可能にする方法で、同様に、以前にプローブまたはガイドＲＮＡの設計状況で適用されていたようなセットカバーソリューションの簡単な適用を用いては達成できない計算効率の高い方法で、最小限のプローブまたはガイドＲＮＡセットを特定し得る。
複数の転写物存在量を検出する能力は、特定の表現型を示す独特の微生物特徴の生成を可能にし得る。さまざまな機械学習技術を使用して、遺伝子特徴を導出し得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系のガイドＲＮＡは、特定の表現型を検出するために、遺伝子特徴によって定義されたバイオマーカーの相対レベルを特定及び／または定量化するために使用してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、遺伝子特徴は、抗生物質に対する感受性、抗生物質に対する耐性、またはそれらの組み合わせを示す。
本発明の一態様では、方法は、１つ以上の病原体を検出することを含む。このようにして、個々の微生物による対象の感染間の識別を行ってもよい。いくつかの実施形態では、そのような識別は、特定の疾患、例えば、疾患の異なるバリアントの臨床医による検出または診断を可能にし得る。好ましくは、病原体配列は、病原体のゲノムまたはその断片である。この方法は、病原体の進化を決定することをさらに含んでもよい。病原体の進化を決定することは、病原体変異の特定、例えば、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド置換をさらに含んでもよい。後者の中には、非同義、同義、及び非コード置換がある。アウトブレイク中の変異は、非同義である場合がさらに多い。この方法は、上記のように分析された２つの病原体配列間の置換率を決定することをさらに含んでもよい。変異が有害であるか適応であるか否かは、機能分析が必要であるが、非同義変異の割合によって、この流行の継続的な進行が病原体適応の機会を与え、迅速な封じ込めの必要性を強調し得ることが示唆される。したがって、この方法は、ウイルス適応のリスクを評価することをさらに含み得、非同義変異の数が決定される（Ｇｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１３６９，２０１４）。
微生物アウトブレイクのモニタリング
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系またはその使用方法を使用して、病原体アウトブレイクの進展を決定し得る。この方法は、１人以上の対象由来の複数の試料から１つ以上の標的配列を検出することを含んでもよく、この標的配列は、アウトブレイクを引き起こしている微生物由来の配列である。そのような方法は、病原体伝染のパターン、または病原体によって引き起こされる疾患のアウトブレイクに関与する機序を決定することをさらに含んでもよい。
病原体伝染のパターンは、病原体の天然のリザーバーからの継続的な新しい伝染、またはその天然のリザーバーからの単一の伝染に続く対象から対象への伝染（例えば、ヒトからヒトへの伝染）または両方の混合物をさらに含み得る。一実施形態では、病原体伝染は、細菌またはウイルス伝染であってもよく、そのような場合、標的配列は、好ましくは、微生物ゲノムまたはその断片である。一実施形態では、病原体伝染のパターンは、病原体伝染の初期パターン、すなわち病原体アウトブレイクの始まりである。アウトブレイクの開始時に病原体伝染のパターンを決定することにより、アウトブレイクを可能な限り早期に停止する可能性が高まり、それにより、地域的及び国際的な感染の可能性が減少する。
病原体伝染のパターンを決定することは、本明細書に記載の方法に従って病原体配列を検出することをさらに含み得る。病原体伝染のパターンを決定することは、対象間の病原体配列の共有宿主内変動を検出すること、及びその共有宿主内変動が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含み得る。観察された宿主内及び宿主間の変動のパターンは、伝染及び疫学に関する重要な洞察を提供する（Ｇｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
時間的パターンを示す対象間で共有される宿主内変動の検出は、複数の感染源からの対象感染（重複感染）、試料汚染再発性変異（変異を強化するために選択のバランスの有無）、または感染チェーンの初期の変異によって生じたわずかに異なるウイルスの同時伝達（Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６１（７）：１５１６−１５２６，２０１５）により説明し得るため、対象間の（特にヒト間の）伝染リンクの指標である。対象間の共有宿主内変動の検出は、一般的な一塩基多型（ＳＮＰ）の位置にある宿主内バリアントの検出をさらに含んでもよい。共通（ＳＮＰ）位置にある宿主内バリアントの陽性検出は、宿主内バリアントの主な説明として、重複感染及び汚染を示している。重複感染及び汚染は、宿主間バリアントとして現れるＳＮＰ頻度に基づいて分離され得る（Ｐａｒｋ、ｅｔ ａｌ．，２０１５）。それ以外の場合は、重複感染及び汚染を除外してもよい。この後者の場合、対象間の共有宿主内変動の検出は、同義及び非同義バリアントの頻度を評価すること、ならびに同義及び非同義バリアントの頻度を互いに比較することをさらに含み得る。非同義変異は、タンパク質のアミノ酸を変更する変異であり、自然淘汰の対象となる微生物の生物学的変化をもたらす可能性が高い。同義置換は、アミノ酸配列を変更しない。同義及び非同義のバリアントの等しい頻度によって、宿主内のバリアントが中立的に進化していることが示されている。同義と非同義のバリアントの頻度が異なる場合、宿主内のバリアントは、選択のバランスをとることによって維持される可能性がある。同義及び非同義のバリアントの頻度が低い場合、これは再発性突然変異の指標である。同義及び非同義のバリアントの頻度が高い場合、これは同時伝染を示している（Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
エボラウイルスと同様に、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）は、致死率の高い出血熱を引き起こし得る。Ａｎｄｅｒｓｅｎらは、臨床及びげっ歯類のリザーバー試料からほぼ２００のＬＡＳＶ配列のゲノムカタログを生成した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ １６２，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐ７３８−７５０，１３ Ａｕｇｕｓｔ ２０１５）。Ａｎｄｅｒｓｅｎらは、２０１３〜２０１５年のＥＶＤの流行は人から人への伝染によるものであるが、ＬＡＳＶ感染は主にリザーバーから人への感染が原因であることが示されている。Ａｎｄｅｒｓｅｎらは、西アフリカにおけるＬＡＳＶの広がりを解明し、この移行には、ＬＡＳＶゲノムの量、致死率、コドン適応、及び翻訳効率の変化が伴うことを示す。この方法は、第１の病原体配列を第２の病原体配列と系統発生的に比較すること、及び第１の病原体配列と第２の病原体配列との間に系統発生的関連があるか否かを判定することをさらに含み得る。第２の病原体配列は、以前の参照配列であり得る。系統学的関連がある場合、この方法は、第１の病原体配列の系統を第２の病原体配列に根付かせることをさらに含み得る。したがって、第１の病原体配列の系統を構築することが可能である（Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
この方法は、変異が有害であるか適応的であるかを決定することをさらに備み得る。有害な変異は、伝染障害のあるウイルス及び行き止まりの感染症の指標であるため、通常は個々の対象にのみ存在する。１つの個別の対象に固有の変異は、系統樹の外部分岐で発生する変異であるが、内部分岐の変異とは、複数の試料に（すなわち、複数の対象に）存在する変異である。非同義置換の割合が高いことは、系統樹の外部分岐の特徴である（Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
系統樹の内部分岐において、選択は、有害な変異体をろ過するより多くの機会を有してきた。定義により、内部分岐は、複数の子孫系統を生成しているため、変異を含める可能性は低くなり、適応コストを伴う。したがって、非同義置換の割合が低いことは、内部分岐を示している（Ｐａｒｋ、ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
適合性への影響が少ない可能性が高い同義変異は、内部及び外部の分岐でより匹敵する頻度で発生した（Ｐａｒｋ， ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ウイルスゲノムなどの配列決定された標的配列を分析することにより、２０１４年のエボラのアウトブレイク中などの流行エピソードの重症度の原因となる機序を発見することが可能である。例えば、Ｇｉｒｅらは、２０１４年のアウトブレイクのゲノムと、以前のアウトブレイク由来の２０のゲノム全てとの系統学的比較を行い、これによって、２０１４年の西アフリカウイルスが過去１０年以内に中央アフリカから広まった可能性が高いことを示唆している。他のエボラウイルスゲノムからの分岐を使用して系統発生を探索することには問題があった（６、１３）。ただし、最古のアウトブレイクでツリーを探索すると、試料の日付と根から先端までの距離との間に強い相関関係があり、１年あたり１部位あたりの置換率は８×１０−４である（１３）。これによって、最近の３つのアウトブレイクの系統全てが、ほぼ同時に２００４年頃に共通の祖先から分岐したことが示唆されており、これによって、各アウトブレイクがその天然のリザーバー中の同じ遺伝子的に多様なウイルス集団由来の独立した人畜共通伝染病事象に相当するという仮説が支持される。彼らはまた、２０１４年のＥＢＯＶのアウトブレイクは、自然のリザーバーからの単一の伝染が原因で発生し得、その後、アウトブレイク中に人から人への伝染が発生する可能性があることも見出した。彼らの結果によってまた、シエラレオネ（Ｓｉｅｒｒａ Ｌｅｏｎ）での流行エピソードは、ほぼ同時期にギニア由来の２つの遺伝的に異なるウイルスの導入に起因し得ることも示唆された（Ｇｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
特にヒトからヒトへの伝染のおかげで、ラッサウイルスがその起源点からどのように広がったかを決定することも可能であった；そして、この広がりの歴史を４００年前にさかのぼることさえ可能であった（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６２（４）：７３８−５０，２０１５）。
２０１３〜２０１５年のＥＢＯＶのアウトブレイク中に必要な作業及びアウトブレイクの場所で医療スタッフが遭遇する困難に関して、より一般的には、本発明の方法は、より少ない選択されたプローブを使用して配列決定を実行することを可能にし、その結果、配列決定を加速し得、試料の採取から結果の取得までに必要な時間を短縮する。さらに、キット及び系を現場で使用し得るように設計し得、その結果試料を国の別の地域または世界に送付または発送する必要なしに、患者の診断を容易に行い得る。
上記の任意の方法において、標的配列またはその断片の配列決定には、上記の任意の配列決定プロセスを使用してもよい。さらに、標的配列またはその断片の配列決定は、ほぼリアルタイムの配列決定であり得る。標的配列またはその断片の配列決定は、以前に記載された方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ｍａｔｒａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、及びＧｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）に従って行ってもよい。標的配列またはその画分の配列決定は、複数の標的配列の並行配列決定をさらに含んでもよい。標的配列またはその画分の配列決定は、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）配列決定を含んでもよい。
選択されたプローブのうち１つ以上にハイブリダイズする標的配列またはその断片の分析は、同定分析であり得、この標的配列またはその画分への選択されたプローブのハイブリダイゼーションは、試料内の標的配列の存在を示す。
現在、一次診断は、患者が有する症状に基づいている。ただし、さまざまな疾患が同一の症状を共有し得るので、その結果診断は、統計に大きく依存している。例えば、マラリアは、インフルエンザのような症状、すなわち頭痛、発熱、震え、関節痛、嘔吐、溶血性貧血、黄疸、尿中のヘモグロビン、網膜の損傷、及びけいれんを引き起こす。これらの症状はまた、敗血症、胃腸炎、ウイルス性疾患にもよく見られる。後者の中で、エボラ出血熱には次の症状がある：発熱、喉の痛み、筋肉痛、頭痛、嘔吐、下痢、発疹、肝臓及び腎臓の機能低下、内外の出血。
患者が例えば熱帯アフリカの医療施設で診られた場合、統計的にマラリアはアフリカのその地域内で最も可能性の高い疾患であるため、基本的な診断はマラリアと結論付けるであろう。その結果、患者は実際にはその疾患にかかっていない可能性があるにもかかわらず、マラリアの処置を受け、患者は正しく処置されないことになる。この正しい処置の欠如は、特に患者が発症した疾患が急速に進展する場合、生命を脅かす可能性がある。医療スタッフが患者に施された処置が効果的ではなく、正確な診断を受けて患者に適切な処置を施すことに気づくには、遅すぎる場合がある。
本発明の方法は、この状況に対する解決策を提供する。実際、ガイドＲＮＡの数を劇的に減らし得るので、これにより単一チップ上で、各グループが１疾患に特異的であるグループに分割された選択されたプローブを提供することが可能になり、その結果複数の疾患、例えば、ウイルス感染が同時に診断され得る。本発明のおかげで、単一のチップで３つ以上の疾患、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０超える疾患を同時に、好ましくは所定の地理的領域の集団内で最も一般的に発生する疾患を診断し得る。選択されたプローブの各グループは、診断された疾患の１つに固有であるため、より正確な診断を実行でき、患者に間違った処置を施すリスクを軽減し得る。
他の場合では、ウイルス感染などの疾患は、症状なしで発生する場合もあるか、または症状を引き起こしたが、患者が医療スタッフに診られる前に消えていった。そのような場合、患者は医療援助を求めないか、または診察の日に症状がないせいで複雑になる。
本発明はまた、疾患を診断し、病原体を同定し、そして粗製の非精製試料中のｍＲＮＡなどの核酸の検出に基づいて処置を最適化する他の方法と組み合わせて使用されてもよい。
本発明の方法はまた、この状況に対処するための強力なツールを提供する。実際、選択されたガイドＲＮＡの複数のグループ（各グループは特定の領域の母集団内で発生する最も一般的な疾患の１つに固有）が単一の診断に含まれるため、医療スタッフはチップを持った患者から取られた生物学的試料に接触するだけで済む。チップを読み取れば、患者が発症した疾患が明らかになる。
いくつかの場合において、患者は、特定の症状の診断のために医療スタッフに診られる。本発明の方法は、どの疾患がこれらの症状を引き起こすかを特定するだけでなく、同時に、患者が気づかなかった別の疾患に罹患しているか否かを決定することを可能にする。
アウトブレイクの機序を検索する場合、この情報は最も重要になる可能性がある。実際、同一のウイルスに感染した患者のグループは、対象間の感染経路を示唆する一時的なパターンも示す。
微生物の遺伝的摂動のスクリーニング
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ系は、微生物の遺伝的摂動をスクリーニングするために使用され得る。そのような方法は、例えば、微生物経路及び機能ネットワークをマッピングするために有用であり得る。微生物細胞は、遺伝子改変され、異なる実験条件下でスクリーニングされる。上記のように、本明細書に開示される実施形態は、単一の試料中の複数の標的分子、または多重様式で単一の個々の個別のボリューム中の単一の標的をスクリーニングし得る。遺伝的に改変された微生物は、特定の微生物細胞または微生物細胞の集団によって運ばれる特定の遺伝子改変を同定する核酸バーコード配列を含むように改変されてもよい。バーコードは、識別子として使用されるヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）の短い配列である。核酸バーコードは、４〜１００ヌクレオチドの長さを有してもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。バーコードで細胞を同定する方法は、当該技術分野で公知である。したがって、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクター系のガイドＲＮＡは、バーコードを検出するために使用され得る。正の検出可能なシグナルの検出は、試料における特定の遺伝子改変の存在を示す。本明細書に開示される方法は、試験された実験条件下での遺伝子改変の効果を示す相補的な遺伝子型または表現型の読み出しを検出するための他の方法と組み合わせてもよい。スクリーニングされる遺伝的改変には、限定するものではないが、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、逆位、転座、転位、または１つ以上のヌクレオチド挿入、欠失、置換、変異、または追加（タンパク質の安定性または検出の変更などの機能的な結果を有するエピトープをコードする核酸の）が含まれ得る。同様に、本明細書に記載の方法は、遺伝子調節要素及び遺伝子発現モジュールの特定の配置の機能性をスクリーニングするために、合成生物学適用で使用されてもよい。
ある特定の例示的な実施形態では、この方法は、低次形態（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）をスクリーニングするために使用されてもよい。参照によって本明細書に組み込まれる、２０１６年１１月４日に出願された「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｒｅｌａｔｅｄ Ｋｉｔｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ」と題されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０７３０に開示される低次形態（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）の生成ならびに主要な細菌機能遺伝子の同定及び新しい抗生物質治療法の同定におけるそれらの使用。
異なる実験条件は、微生物細胞を異なる化学薬品、化学薬品の組み合わせ、異なる濃度の化学薬品または化学薬品の組み合わせ、化学薬品または化学薬品の組み合わせに対する異なる曝露時間、異なる物理的パラメーター、あるいはその両方を含んでもよい。ある特定の例示的な実施形態では、化学剤は抗生物質または抗ウイルス剤である。スクリーニングされる異なる物理的パラメーターとしては、異なる温度、大気圧、異なる大気圧及び非大気圧ガス濃度、異なるｐＨレベル、異なる培地組成、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。
環境試料のスクリーニング
本明細書に開示される方法はまた、標的核酸またはポリペプチドの存在を検出することにより、汚染物質について環境試料をスクリーニングするために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、微生物を検出する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝露すること；１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の微生物特異的標的ＲＮＡまたは１つ以上のトリガーＲＮＡへの結合を介してＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化し、その結果検出可能な正のシグナルを生成することを含む。正のシグナルが検出され得、これは試料中の１つ以上の微生物の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書に記載されるように基材上にあってもよく、この基材は試料に曝され得る。他の実施形態では、同じＣＲＩＳＰＲ系、及び／または異なるＣＲＩＳＰＲ系を、基材上の複数の別個の場所に適用してもよい。さらなる実施形態では、異なるＣＲＩＳＰＲ系は、各場所で異なる微生物を検出し得る。上記でさらに詳細に説明したように、基材は、例えば、ペーパー基材、布基材、または可塑性ポリマーベースの基材を含むがこれらに限定されない可塑性材料基材であり得る。
本発明によれば、基材は、サンプリングされる流体にその基材を一時的に浸漬することにより、試験される流体をその基材に適用することにより、または試験される表面を基材と接触させることにより、受動的に試料に曝され得る。試料を基質に導入する任意の手段を適宜使用してもよい。
本明細書に記載されるように、本発明で使用するための試料は、食品試料（新鮮な果物または野菜、肉）、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、大気もしくは他のガス試料への曝露、またはそれらの組み合わせなどの生物学的または環境的な試料であり得る。例えば、限定するものではないが、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含む任意の材料で作られた家庭用／商業用／産業用の表面を拭き取り、汚染物質を検査してもよい。土壌試料は、環境目的及び／またはヒト、動物、もしくは植物の病気の試験の両方のために、病原菌もしくは寄生生物、または他の微生物の存在について試験してもよい。淡水試料、廃水試料、または塩水試料などの水試料は、清浄度及び安全性、ならびに／または携帯性について評価され、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、または他の微生物汚染の存在を検出し得る。さらなる実施形態では、生体試料は、限定するものではないが、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、便、尿、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿膜腫、血清腫、膿、または皮膚のスワブまたは粘膜表面を含む表面に由来し得る。いくつかのある特定の実施形態では、環境試料または生物学的試料は、粗製試料であってもよく、そして／または１つ以上の標的分子は、方法の適用前に試料から精製または増幅されなくてもよい。微生物の同定は、任意の数の用途に有用及び／または必要であり得、したがって、当業者によって適切であると見なされる任意の供給源からの任意のタイプの試料が、本発明に従って使用され得る。
いくつかの実施形態では、レストランまたは他の食品提供業者における、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌による食品汚染；食品の表面をチェックすること；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＥ．ｃｏｌｉなどの病原菌について水を試験すること；また、製造業者及び規制当局が食肉の純度を判断するために食品の品質をチェックすること；レジオネラなどの病原菌による空気汚染を特定すること；ビールがＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどの病原体によって汚染されているか、腐敗しているか否かをチェックすること；製造中の細菌または真菌による低温殺菌または非低温殺菌チーズの汚染である。
本発明による微生物は、病原性微生物、または食物もしくは消費製品の腐敗をもたらす微生物であり得る。病原性微生物は病原性であるか、さもなければヒト、動物、もしくは植物にとって望ましくない場合がある。ヒトまたは動物の目的では、微生物は疾患を引き起こすか、疾患につながる場合がある。本発明の動物または獣医への適用は、微生物に感染した動物を特定し得る。例えば、本発明の方法及び系は、ケンネルコフ（Ｋｅｎｎｅｌ ｃｏｕｇｈ）、狂犬病ウイルス、及び糸状虫を含むがこれらに限定されない病原体を有するコンパニオンアニマルを同定し得る。他の実施形態では、本発明の方法及び系は、育種目的の血統試験に使用されてもよい。植物微生物は、植物への害もしくは病気、収量の減少、または色、味、粘稠度、臭気などの形質の変化を生じ得る場合がある。食品または消費可能な汚染の目的で、微生物は、食品または消費可能な製品の味、臭い、色、粘稠度、またはその他の商業的特性に悪影響を及ぼし得る。ある特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌種である。細菌は、低温菌、大腸菌群、乳酸菌、または胞子形成細菌であってもよい。ある特定の例示的な実施形態では、細菌は、疾患もしくは病気を引き起こすか、そうでなければ望ましくない産物もしくは形質をもたらす任意の細菌種であり得る。本発明による細菌は、ヒト、動物、または植物に対して病原性であり得る。
試料タイプ
本明細書に開示される方法での使用に適切な試料は、植物、動物、細菌などのような生物またはその一部から得られる任意の従来の生物学的試料を含む。特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒト対象などの動物対象から得られる。生物学的試料とは、任意の生きている生物、例としては、限定するものではないが、単細胞生物、例えば、細菌、酵母、原生動物、及びとりわけアメーバ、多細胞生物（植物または植物など）から取得、排泄、または分泌される任意の固体または液体の試料であり、例としては、健常もしくは見かけ上健常なヒト対象、または病原性細菌もしくはウイルスなどの病原性部生物による感染などを診断もしくは検討される状態もしくは疾患に罹患している、ヒト患者由来の試料が挙げられる。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、房水、もしくは硝子体液、または任意の体液、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍またはその他の感染もしくは炎症部位から得られた液体）、または関節から得られた液体（例えば、正常な関節または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、もしくは敗血症性関節炎などの疾患に冒された関節）、または皮膚のスワブまたは粘膜表面から得られる生物学的液であり得る。
試料はまた、任意の臓器または組織（腫瘍生検などの生検または剖検標本を含む）から得られた試料であってもよいし、または細胞（初代細胞または培養細胞のいずれか）または任意の細胞、組織もしくは臓器により馴化された培地を含んでもよい。例示的な試料としては、限定するものではないが、細胞、細胞溶解物、血液スメア、細胞遠心調製物、細胞学スメア、体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、喀痰、尿、気管支肺胞洗浄液、精液など）、組織生検（例えば、腫瘍生検）、細針吸引、及び／または組織切片（例えば、クリオスタット組織切片及び／またはパラフィン包埋組織切片）が挙げられる。他の例では、試料は、循環腫瘍細胞を含む（これは細胞表面マーカーによって特定され得る）。特定の実施例では、試料は直接使用（例えば、新鮮または凍結）されてもよいし、使用前に、例えば固定（例えば、ホルマリンを使用）及び／またはワックスに埋め込むこと（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料）により操作してもよい。対象から組織を得る任意の方法を利用してもよいこと、使用する方法の選択は、組織の種類、対象の年齢、または施術者が利用し得る手順などの様々な要因に依存することが理解されよう。そのような試料を取得するための標準的な技術は、当該技術分野で利用可能である。例えば、Ｓｃｈｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７−３３（１９９２）；Ｂｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３３：５１５−１８（１９８６）；Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３１８：５８９−９３（１９８８）、及びＯｇｎｉｂｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２９：９２９−３２（１９８４）を参照のこと。
他の実施形態では、試料は、水、土壌などの環境試料であってもよいし、または工業用もしくは医療用表面などの表面であってもよい。いくつかの実施形態では、米国特許公開第２０１３／０１９０１９６号に開示されているような方法を、高度な感度及び特異性を有する粗細胞試料に直接由来する核酸特徴、具体的にはＲＮＡレベルの検出に適用してもよい。目的の各病原体に特異的な配列は、目的の病原体由来のコード配列を、ＢＬＡＳＴソフトウェアにより他の生物体における全てのコード配列と比較することにより、同定してもよく、または選択してもよい。
本開示のいくつかの実施形態は、臨床血液試料を首尾よく分画するための、当該技術分野で公知の手順及びアプローチの使用を含む。例えば、Ｈａｎ Ｗｅｉ Ｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ ２０１１，２，３１９−３４３に記載されている手順、Ａｌｉ Ａｓｇａｒ Ｓ．Ｂｈａｇａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅａｎ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＤＦＦ）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ，１５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２−６，２０１１，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ、及び、国際特許公開番号ＷＯ２０１１１０９７６２（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。血液試料は通常、試験目的で試料サイズを増大するために培養物中で拡大される。本発明のいくつかの実施形態では、血液または他の生物学的試料は、培養における拡大の必要なしに、本明細書中に記載されるような方法において使用され得る。
さらに、本開示のいくつかの実施形態は、Ｈａｎ Ｗｅｉ Ｈｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｉｒａｌ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ，Ｃａｓｅ Ｎｏ．１５９９５ＪＲ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（その開示がその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように、スパイラルマイクロチャネルを使用する全血からの病原体を首尾よく分離する当該分野で公知の手順及びアプローチの使用を含む。
本明細書に開示される実施形態の感度の増大により、ある特定の例示的な実施形態では、アッセイ及び方法は、粗試料、または検出される標的分子が試料からさらに分画または精製されない試料に対して実行され得る。
マラリアの検出及びモニタリング
マラリアは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物によって引き起こされる蚊媒介性の疾患状態である。この寄生生物は感染した雌性Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に刺されて人々に広がる。５つのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、すなわちＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉがヒトのマラリアの原因となる。その中でも、世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘが最大の脅威の原因である。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、アフリカ大陸で最も蔓延しているマラリア原虫であり、世界中で最も多くのマラリア関連死の原因となっている。Ｐ．ｖｉｖａｘは、サハラ以南のアフリカ以外のほとんどの国で主要なマラリア原虫である。
２０１５年には、９１の国及び地域がマラリア伝染を継続していた。最新のＷＨＯの推定によれば、２０１５年には２億１，２００万のマラリアの症例があり、４２９０００人が死亡している。マラリアの感染率が高い地域では、５歳未満の子供が特に感染し、病気にかかり、死にやすく、マラリアによる全死亡の３分の２超（７０％）がこの年齢層で発生している。２０１０年〜２０１５年の間に、５歳未満のマラリアによる死亡率は世界的に２９％低下した。しかし、マラリアは依然として５歳未満の子供の主要な死亡原因であり、２分ごとに１人の子供の命を奪っている。
ＷＨＯにより記載されているように、マラリアは急性熱性疾患である。免疫のない人では、感染性の蚊に刺されてから７日以上経過すると症状が現れる。第１の症状である発熱、頭痛、悪寒、及び嘔吐は軽度であり得、マラリアとして認識するのは難しい場合もあるが、２４時間以内に処置しない場合、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアは深刻な疾患に進行し、死に至る場合が多い。
重度のマラリアの子供は、以下の症状の１つ以上を高頻度に発症する：重度の貧血、代謝性アシドーシスに関連する呼吸窮迫、または脳マラリア。成人では、複数臓器の関与も頻繁に見られる。マラリアの流行地域では、人々は部分的な免疫を生じる場合があり、無症候性の感染を引き起こす可能性がある。
迅速かつ効率的な診断試験の開発は、公衆衛生にとって非常に重要である。実際に、マラリアの早期診断及び処置は、疾患を減らし、死を防ぐだけでなく、マラリア伝染の減少にも貢献している。ＷＨＯの勧告によれば、マラリアが疑われる全ての症例は、寄生生物ベースの診断試験（特に迅速診断テストを使用）を使用して、処置を施す前に確認する必要がある（２０１５年４月に発行された「マラリアの治療に関するＷＨＯガイドライン（ＷＨＯ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ）」第３版を参照のこと）。
抗マラリア療法に対する耐性は、治療戦略を激減させる重大な健康問題を表す。実際、ＷＨＯのウェブサイトで報告されているように、クロロキン及びスルファドキシン／ピリメタミン（ＳＰ）などの以前の世代の医薬に対するＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの耐性は、１９５０年代と１９６０年代に蔓延し、マラリア対策の労力を無効にさせ、子供の生存率を後退させた。したがって、ＷＨＯは、抗マラリア薬耐性の定期的なモニタリングを推奨している。実際、正確な診断は、不適切な治療を回避し、抗マラリア薬に対する耐性の拡大を限定し得る。
この文脈において、２０１５年５月に世界保健総会（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）によって採択された２０１６年〜２０３０年のマラリアのためのＷＨＯグローバル技術戦略（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｍａｌａｒｉａ）は、全てのマラリア流行国に技術的枠組みを提供する。これは、マラリアの抑制と撲滅に向けて取り組む地域及び国別プログラムを指導及び支援することを目的としている。この戦略は、以下を含む野心的だが達成可能なグローバルな目標を設定する。
●２０３０年までにマラリア症例の発生率を少なくとも９０％削減する。
●マラリアによる死亡率を２０３０年までに少なくとも９０％削減する。
●２０３０年までに少なくとも３５か国でマラリアを撲滅する。
●マラリアのない全ての国でのマラリアの再発を防止する。
この戦略は、２年間にわたる広範な協議プロセスの結果であり、７０の加盟国から４００人を超える技術専門家が参加した。これは、３つの主要な軸に基づいている。
●マラリアの予防、診断、及び処置への普遍的なアクセスを確保すること、
●マラリアのない状態の解消及び達成に向けた取り組みを加速すること、ならびに
●マラリアのサーベイランスを中心的な介入に変換すること。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍに対する処置には、キニーネなどのアリール−アミノアルコール、またはクロロキン、アモジアキン、メフロキン、ピペラキン、ルメファントリン、プリマキンなどのキニーネ誘導体；アトバコンなどの親油性ヒドロキシナフトキノンアナログ；サルファ剤、スルファドキシン、ダプソン、及びピリメタミンなどの葉酸拮抗剤；プログアニル；アトバコン／プログアニルの組み合わせ；アテミシン薬；及びそれらの組み合わせが挙げられる。
蚊媒介性病原体の存在を診断する標的配列には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、特にヒトが罹患するＰｌａｓｍｏｄｉａ種、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉの存在について診断的である配列を含み、そのゲノム由来の配列を含む。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、特にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉなどのヒトに罹患するＰｌａｓｍｏｄｉａ種に対する治療に対する薬剤耐性をモニタリングするための診断的である標的配列。
さらなる標的配列には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の必須の生物学的プロセスに関与するタンパク質、及び特に輸送体タンパク質、例えば、薬物／代謝産物輸送体ファミリー由来のタンパク質、ＡＢＣ輸送体ＣサブファミリーまたはＮａ＋／Ｈ＋交換体、膜グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの、基質転移に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質；ジヒドロプロテイン酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性またはジヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼなどの葉酸経路に関与するタンパク質；ならびに、ミトコンドリア内膜、特にチトクロームｂ複合体を横切るプロトンの移動に関与するタンパク質をコードする標的分子／核酸分子を含む配列が挙げられる。追加の標的には、ヘムポリメラーゼをコードする遺伝子（複数可）も含まれ得る。
さらなる標的配列には、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍクロロキン耐性輸送体遺伝子（ｐｆｃｒｔ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ多剤耐性輸送体１（ｐｆｍｄｒ１）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ多剤耐性関連タンパク質遺伝子（Ｐｆｍｒｐ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｎａ＋／Ｈ＋交換遺伝子（ｐｆｎｈｅ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍエクスポートタンパク質１、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃａ２＋輸送ＡＴＰａｓｅ ６（ｐｆａｔｐ６）をコードする遺伝子；Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍジヒドロプロテイン酸合成酵素（ｐｆｄｈｐｓ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性（ｐｆｄｈｐｒ）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼ（ｐｆｄｈｆｒ）遺伝子、チトクロームｂ遺伝子、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ及びＫｅｌｃｈ１３（Ｋ１３）遺伝子、ならびに他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種におけるそれらの機能的異種遺伝子から選択され得る必須の生物学的プロセスに関与するタンパク質をコードする標的分子／核酸分子が挙げられる。
現在の治療の標的であり、特定の耐性表現型に関連するタンパク質において、いくつかの変異、特に単一点変異が同定されている。したがって、本発明は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍなどの蚊媒介性寄生生物の様々な耐性表現型の検出を可能にする。
本発明は、標的核酸／分子における１つ以上の変異（複数可）、特に１つ以上の単一ヌクレオチド多型を検出することを可能にする。したがって、以下の変異のいずれか１つ、またはそれらのうちそれらの組み合わせを、薬剤耐性マーカーとして使用してもよく、本発明に従って検出し得る。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｋ１３の単一点変異には、以下の位置２５２、４４１、４４６、４４９、４５８、４９３、５３９、５４３、５５３、５６１、５６８、５７４、５７８、５８０、６７５、４７６、４６９、４８１、５２２、５３７、５３８、５７９、５８４及び７１９ならびに特に変異Ｅ２５２Ｑ、Ｐ４４１Ｌ、Ｆ４４６Ｉ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ４５８Ｙ、Ｙ４９３Ｈ、Ｒ５３９Ｔ、Ｉ５４３Ｔ、Ｐ５５３Ｌ、Ｒ５６１Ｈ、Ｖ５６８Ｇ、Ｐ５７４Ｌ、Ａ５７８Ｓ、Ｃ５８０Ｙ、Ａ６７５Ｖ、Ｍ４７６Ｉ；Ｃ４６９Ｙ；Ａ４８１Ｖ；Ｓ５２２Ｃ；Ｎ５３７Ｉ；Ｎ５３７Ｄ；Ｇ５３８Ｖ；Ｍ５７９Ｉ；Ｄ５８４Ｖ；及びＨ７１９Ｎの以下の単一点変異が含まれる。これらの変異は一般に、アルテミシンの薬剤耐性表現型と関連している（Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ａｎｄ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（アルテミシニン及びアルテミシニンに基づく併用療法耐性），Ａｐｒｉｌ ２０１６ ＷＨＯ／ＨＴＭ／ＧＭＰ／２０１６．５）。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（ＰｆＤＨＦＲ−ＴＳ、ＰＦＤ０８３０ｗ）において、重要な多型としては、ピリメタミンに対する耐性を調節する１０８、５１、５９及び１６４位、特に１０８Ｄ、１６４Ｌ、５１Ｉ及び５９Ｒにおける変異が挙げられる。他の多型としては、また、スルファドキシンへの耐性に関連する４３７Ｇ、５８１Ｇ、５４０Ｅ、４３６Ａ及び６１３Ｓが挙げられる。追加で観察された変異としては、Ｓｅｒ１０８Ａｓｎ、Ａｓｎ５１Ｉｌｅ、Ｃｙｓ５９Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ｃｙｓ５０Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ａｓｎ１８８Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１８９Ａｒｇ及びＶａｌ２１３Ａｌａ、Ｓｅｒ１０８Ｔｈｒ及びＡｌａ１６Ｖａｌが挙げられる。変異Ｓｅｒ１０８Ａｓｎ、Ａｓｎ５１Ｉｌｅ、Ｃｙｓ５９Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ｃｙｓ５０Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕは、ピリメタミンベースの治療及び／またはクロログアニン−ダプソン併用療法の耐性に特に関連している。シクログアニル耐性は、Ｓｅｒ１０８Ｔｈｒ及びＡｌａ１６Ｖａｌの二重変異と関連しているようである。ｄｈｆｒの増幅は、治療耐性、特にピリメタミン耐性にも高い関連性がある。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのジヒドロプロテイン酸合成酵素（ＤＨＰＳ）（ＰｆＤＨＰＳ、ＰＦ０８＿００９５）では、重要な多型には、位置４３６、４３７、５８１及び６１３のＳｅｒ４３６Ａｌａ／Ｐｈｅ、Ａｌａ４３７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ５４０Ｇｌｕ、Ａｌａ５８１Ｇｌｙ及びＡｌａ６１３Ｔｈｒ／Ｓｅｒの変異が挙げられる。５８１位及び／または６１３位の多型もまた、スルファドキシン−ピリメタミン塩基療法に対する耐性と関連付けられている。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのクロロキン耐性輸送体（ＰｆＣＲＴ）では、７６位の多型、特に変異Ｌｙｓ７６Ｔｈｒは、クロロキンに対する耐性と関連している。さらなる多型には、Ｃｙｓ７２Ｓｅｒ、Ｍｅｔ７４Ｉｌｅ、Ａｓｎ７５Ｇｌｕ、Ａｌａ２２０Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２７１Ｇｌｕ、Ａｓｎ３２６Ｓｅｒ、Ｉｌｅ３５６Ｔｈｒ及びＡｒｇ３７１Ｉｌｅが含まれ、これらはクロロキン耐性と関連している可能性がある。ＰｆＣＲＴはまた、残基Ｓ３３、Ｓ４１１、及びＴ４１６でもリン酸化されており、これがタンパク質の輸送活性または特異性を調節している可能性がある。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの多剤耐性輸送体１（ＰｆＭＤＲ１）（ＰＦＥ１１５０ｗ）では、８６、１８４、１０３４、１０４２位の多型、特にＡｓｎ８６Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１８４−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１０３４Ｃｙｓ、Ａｓｎ１０４２Ａｓｐ及びＡｓｐ１２４６Ｔｙｒが同定されており、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、ハロファントリン、及びクロロキンに対する感受性に影響を与えることが報告されている。さらに、ＰｆＭＤＲ１の増幅は、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、及びハロファントリンに対する感受性の低下と関連しており、ＰｆＭＤＲ１の脱増幅は、クロロキン耐性の増大につながる。ｐｆｍｄｒ１の増幅も検出される場合がある。ＰｆＭＤＲ１のリン酸化状態も関連性が高いものである。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ多剤耐性関連タンパク質（ＰｆＭＲＰ）（遺伝子参照ＰＦＡ０５９０ｗ）では、１９１位及び／または４３７位の多型、例えばＹ１９１Ｈ及びＡ４３７Ｓが同定され、クロロキン耐性表現型と関連している。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＮＡ＋／Ｈ＋エンチャンジャー（ＰｆＮＨＥ）（参照ＰＦ１３＿００１９）において、マイクロサテライトｍｓ４６７０におけるＤＮＮＮＤの反復の増大は、キニーネ耐性のマーカーであり得る。
シトクロムｂｅ遺伝子（ｃｙｔｂ、ｍａｌ＿ｍｉｔｏ＿３）によってコードされるシトクロムｂタンパク質のユビキノール結合部位を変化させる変異は、アトバコン耐性と関連している。２６、２６８、２７６、１３３及び２８０位置の変異、特にＴｙｒ２６Ａｓｎ、Ｔｙｒ２６８Ｓｅｒ、Ｍ１３３１及びＧ２８０Ｄは、アトバコン耐性と関連している場合がある。
例えば、Ｐ Ｖｉｖａｘでは、Ｐｆ ＭＤＲ１の同族体であるＰｖＭＤＲ１の変異は、クロロキン耐性、特に変異Ｙ９７６Ｆなどの９７６位の多型と関連づけられている。
上記の変異は、タンパク質配列に関して定義される。しかしながら、当業者は、核酸標的配列として同定されるべき、ＳＮＰＳを含む対応する変異を決定し得る。
他の同定された薬物耐性マーカーは、例えば、“Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｔｏ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ（１９９６−２００４）”；ＷＨＯ；Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ａｎｄ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ａｐｒｉｌ ２０１６ ＷＨＯ／ＨＴＭ／ＧＭＰ／２０１６．５）、“Ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍａｌａｒｉａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１１ Ｊｕｎ ６；５８５（１１）：１５５１−６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１１．０４．０４２．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５３０５１０（その内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該分野で公知である。
本発明に従って検出し得るポリペプチドに関しては、本明細書で言及した全ての遺伝子の遺伝子産物を標的として使用し得る。対応して、そのようなポリペプチドは、種の同定、分類及び／または薬剤耐性の検出に使用し得ることが企図される。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される系、デバイス、及び方法は、対象から得られる生体試料などの試料中の１つ以上の蚊媒介寄生生物の存在を検出することに関する。ある特定の例示的な実施形態では、寄生生物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉという種から選択してもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、寄生生物種の迅速な特定、寄生生物及び寄生生物形態の存在（例えば、感染及び寄生生物の生活周期のさまざまな段階、例えば、外赤血球周期、赤血球周期、胞子形成周期；メロゾイト、スポロゾイト、シゾント、配偶子母細胞を含む寄生生物の形態に対応する）のモニタリング；ある特定の表現型（病原体の薬剤耐性など）の検出、疾患の進行及び／またはアウトブレークのモニタリング、及び治療（薬剤）スクリーニングを必要とする他の方法とともに（または組み合わせて）、他の方法での使用に適合させてもよい。さらに、マラリアの場合、感染性咬傷後、長期間が、すなわち、患者が症状を示さない長い潜伏期間が経過する可能性がある。同様に、予防的処置は症状の出現を遅らせ得、再発前に無症候性の長い期間が観察される場合もある。このような遅れは、誤診または診断の遅れを引き起こしやすく、治療の効果を損なう場合がある。
本明細書に開示される実施形態の迅速かつ高感度の診断能力、単一ヌクレオチドの相違までの寄生生物タイプの検出、及びＰＯＣデバイスとして配備される能力のおかげで、本明細書に開示される実施形態は、処置の適切な経過の選択など、治療用ガイドとして使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、寄生生物の存在及び分類について環境試料（蚊の集団など）をスクリーニングするために使用されてもよい。実施形態はまた、蚊媒介性寄生生物及び他の蚊媒介性病原体を同時に検出するように改変されてもよい。場合によっては、マラリア及び他の蚊媒介性病原体が最初に同様の症状を示し得る。したがって、感染のタイプを迅速に区別する能力は、重要な処置の決定を導き得る。マラリアと関連して検出され得る他の蚊媒介性病原体としては、デング熱、西ナイルウイルス、チクングニア、黄熱病、フィラリア症、日本脳炎、セントルイス脳炎、西部ウマ脳炎、東部ウマ脳炎、ベネズエラウマ脳炎、ラクロス脳炎及びジカが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法は、試料中の複数の蚊媒介性寄生生物種を区別するために使用され得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、１８Ｓ、１６Ｓ、２３Ｓ、及び５Ｓサブユニットを含むリボソームＲＮＡ配列に基づき得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、ＣＹＴＢのようなミトコンドリア遺伝子などの、ゲノム中に複数のコピーで存在する遺伝子の配列に基づき得る。ある特定の例示的な実施形態では、同定は、ＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ２Ｂ、エノラーゼ、またはＬＤＨなどの高度に発現及び／または高度に保存されている遺伝子の配列に基づき得る。関連するｒＲＮＡ配列を同定する方法は、米国特許出願公開第２０１７／００２９８７２号に開示されている。ある特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡのセットは、各種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計され得る。ガイドＲＮＡはまた、属、科、目、綱、門、界のレベル、またはそれらの組み合わせで微生物を区別するＲＮＡ遺伝子を標的とするように設計されてもよい。増幅が使用されるある特定の例示的な実施形態では、一連の増幅プライマーは、リボソームＲＮＡ配列の隣接する定常領域及び可変内部領域によって各種を区別するように設計されたガイドＲＮＡに設計され得る。ある特定の例示的な実施形態では、プライマー及びガイドＲＮＡは、１６Ｓサブユニット内の、それぞれ保存領域及び可変領域に対して設計されてもよい。種間または種のサブセット、例えば、ＲｅｃＡ遺伝子ファミリー、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットなどの間で一意に変化する他の遺伝子またはゲノム領域も使用してもよい。他の適切な系統学的マーカー、及びそれを同定する方法は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ａｒＸｉｖ：１３０７．８６９０［ｑ−ｂｉｏ．ＧＮ］で考察されている。
ある特定の例示的な実施形態では、種の同定は、ＣＹＴＢのようなミトコンドリア遺伝子などの、ゲノム内の複数のコピーに存在する遺伝子に基づいて実行してもよい。ある特定の例示的な実施形態では、種同定は、ＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ２Ｂ、エノラーゼ、またはＬＤＨなどの高度に発現されるか及び／または高度に保存された遺伝子に基づいて行い得る。
ある特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、複数の系統学的及び／または表現型レベルにわたって蚊媒介性寄生生物を同時にスクリーニングするように設計される。例えば、方法または診断は、異なるガイドＲＮＡを伴う複数のＣＲＩＳＰＲ系の使用をさらに含んでもよい。ガイドＲＮＡの第１のセットは、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘを識別し得る。これらの一般的なクラスは、さらに細分化され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、一般に、または特定の薬物または薬物の組み合わせに関して、薬物耐性株を区別する方法または診断において設計及び使用され得る。ガイドＲＮＡの第２のセットは、微生物を種レベルで区別するように設計してもよい。したがって、薬物耐性に従ってさらに分割された、全ての蚊媒介性寄生生物種または亜種を特定するマトリックスが生成され得る。上記は、例示のみを目的としている。他の種類の蚊媒介寄生生物を分類するための他の手段も考えられ、上記の一般的な構造に従う。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるデバイス、系、及び方法を使用して、目的の蚊媒介性寄生生物遺伝子、例えば、薬物耐性遺伝子をスクリーニングしてもよい。ガイドＲＮＡは、目的の公知の遺伝子を区別するように設計してもよい。次いで、試料（臨床試料を含む）を、１つ以上のそのような遺伝子の検出のために、本明細書に開示されている実施形態を使用してスクリーニングしてもよい。ＰＯＣで薬剤耐性をスクリーニングする能力は、適切な治療計画を選択する上で非常に有益である。ある特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、輸送体タンパク質などのタンパク質、例えば、薬物／代謝産物輸送体ファミリー由来のタンパク質、ＡＢＣ輸送体ＣサブファミリーまたはＮａ＋／Ｈ＋交換体などの、基質転移に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質；ジヒドロプロテイン酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性またはジヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼなどの葉酸経路に関与するタンパク質；ならびに、ミトコンドリア内膜、特にチトクロームｂ複合体を横切るプロトンの移動に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。追加の標的としては、ヘムポリメラーゼをコードする遺伝子（複数可）も挙げられ得る。ある特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのクロロキン耐性輸送体遺伝子（ｐｆｃｒｔ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ多剤耐性輸送体１（ｐｆｍｄｒ１）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ多剤耐性関連タンパク質遺伝子（Ｐｆｍｒｐ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｎａ＋／Ｈ＋交換遺伝子（ｐｆｎｈｅ）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃａ２＋輸送ＡＴＰａｓｅ ６（ｐｆａｔｐ６）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍジヒドロプロテイン酸合成酵素（ｐｆｄｈｐｓ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性（ｐｆｄｈｐｒ）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ−チミジル酸シンターゼ（ｐｆｄｈｆｒ）遺伝子、チトクロームｂ遺伝子、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ及びＫｅｌｃｈ１３（Ｋ１３）遺伝子、ならびに他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種におけるそれらの機能的異種遺伝子から選択される。他の同定された薬物耐性マーカーは、例えば、“Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｔｏ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ（１９９６−２００４）”；ＷＨＯ；Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ａｎｄ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ−ｂａｓｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ａｐｒｉｌ ２０１６ ＷＨＯ／ＨＴＭ／ＧＭＰ／２０１６．５）；“Ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍａｌａｒｉａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１１ Ｊｕｎ ６；５８５（１１）：１５５１−６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１１．０４．０４２．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２３．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２１５３０５１０（その内容が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当該分野で公知である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系、検出系またはそれらの使用方法は、蚊媒介性寄生生物アウトブレイクの進展を決定するために使用され得る。この方法は、１人以上の対象由来の複数の試料から１つ以上の標的配列を検出することを含み得、ここでこの標的配列は、蚊媒介性寄生生物の蔓延またはアウトブレイクを引き起こすことに由来する配列である。そのような方法は、蚊媒介性寄生生物伝染のパターン、または蚊媒介性寄生生物によって引き起こされる疾患のアウトブレイクに関与する機序を決定することをさらに含み得る。この試料は、１人以上のヒトに由来してもよいし、及び／または１匹以上の蚊に由来してもよい。
病原体の伝染のパターンは、蚊媒介寄生生物の天然のリザーバーからの継続的な新しい伝染、もしくは天然のリザーバーからの単一の伝染に続く他の伝染（例えば、蚊を横切る）、またはその両方の混合を含んでもよい。一実施形態では、標的配列は、好ましくは、蚊媒介寄生生物ゲノムまたはその断片内の配列である。一実施形態では、蚊媒介性寄生生物伝染のパターンは、蚊媒介性寄生生物伝染の初期パターン、すなわち、蚊媒介性寄生生物のアウトブレイクの始まりでのパターンである。アウトブレイクの開始時に蚊が媒介する寄生生物の伝染のパターンを特定することにより、アウトブレイクを可能な限り早期に停止する可能性が高まり、それによって地域的及び国際的な感染の可能性が減少する。
蚊媒介寄生生物伝染のパターンを決定することは、本明細書に記載の方法に従って蚊媒介寄生生物配列を検出することを含んでもよい。病原体伝染のパターンを決定することは、対象間の蚊媒介寄生生物配列の共有宿主内変動を検出すること、及び共有宿主内変動が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含んでもよい。観察された宿主内及び宿主間変動のパターンによって、伝染及び疫学に関する重要な洞察が得られる（Ｇｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
本明細書に開示される他の試料タイプに加えて、試料は、１つ以上の蚊に由来する場合があり、例えば、試料は、蚊唾液をさらに含む場合がある。
バイオマーカー検出
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、バイオマーカー検出に使用されてもよい。例えば、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、ＳＮＰ検出及び／または遺伝子型決定のために使用され得る。本明細書に開示される系、デバイス、及び方法はまた、異常な遺伝子発現によって特徴付けられる任意の疾患状態または障害の検出のために使用され得る。異常な遺伝子発現としては、発現した遺伝子、発現の場所、発現レベルの異常が含まれる。他の疾患の中でも、心臓血管、免疫障害、及びがんに関連する複数の転写物またはタンパク質マーカーが検出され得る。ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される実施形態は、肝線維症及び拘束性／閉塞性肺疾患などの溶解を含む疾患の無細胞ＤＮＡ検出に使用されてもよい。ある特定の例示的な実施形態では、この実施形態は、無細胞ＤＮＡの出生前検査のためのより迅速かつより持ち運びがしやすい検出のために利用され得る。本明細書に開示されている実施形態は、とりわけ、心血管の健康、脂質／代謝の特徴、民族特定、父子照合、ヒトＩＤ（例えば、ＳＮＰ特徴の犯罪データベースへの容疑者の照合）に関連する異なるＳＮＰのパネルをスクリーニングするために使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、がん腫瘍に関連する、及びがん腫瘍から放出される変異の無細胞ＤＮＡ検出のためにも使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、例えば、所与の肉製品における異なる動物源の迅速な検出を提供することによって、肉の品質の検出のために使用され得る。本明細書に開示される実施形態は、ＧＭＯの検出またはＤＮＡに関連する遺伝子編集にも使用され得る。本明細書の他のいずれかで説明されているように、密接に関連する遺伝子型／対立遺伝子またはバイオマーカー（例えば、所定の標的配列に単一のヌクレオチドの違いだけがある）を、ｇＲＮＡに合成ミスマッチを導入することで区別し得る。
一態様では、本発明は、試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、この方法は以下を含む：
ａ）試料または試料のセットを１つ以上の個々の個別容積に分配することであって、個別の容積は、本明細書に記載される本発明によるＣＲＩＳＰＲ系を含む、分配すること；
ｂ）１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすること；
ｃ）１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、このＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにＲＮＡベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること；及び
ｄ）検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の１つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
バイオマーカーの試料タイプ
本明細書に記載のアッセイの感度は、標的核酸が希釈されているか、または試料材料が限定されている試料タイプを含む、多種多様な生物学的試料タイプにおける標的核酸の検出によく適している。バイオマーカーのスクリーニングは、唾液、尿、血液、糞便、喀痰、及び脳脊髄液を含むがこれらに限定されないいくつかの種類の試料に対して行い得る。本明細書に開示される実施形態はまた、遺伝子の上方調節及び／または下方調節を検出するためにも使用され得る。例えば、過剰発現された遺伝子のみがアッセイの検出限界閾値を超えて残るように、試料を連続的に希釈してもよい。
ある特定の実施形態では、本発明は、生体液（例えば、尿、血漿または血清、喀痰、脳脊髄液）の試料を入手し、ＤＮＡを抽出するステップを提供する。検出される変異ヌクレオチド配列は、より大きな分子の一部であってもよいし、または最初は別個の分子として存在してもよい。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡは、がん患者の血漿／血清から単離される。比較のために、ＤＮＡ試料が腫瘍組織から分離され、第２の試料は、同じ患者の非腫瘍組織（対照）、例えばリンパ球から分離され得る。非腫瘍性組織は、腫瘍性組織と同じタイプであってもよいし、または異なる臓器源に由来してもよい。ある特定の実施形態では、血液試料が収集され、血漿が遠心分離によって血球から直ちに分離される。血清はろ過され、ＤＮＡ抽出まで凍結保存される。
ある特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、血液、血清、唾液、脳脊髄液、喀痰、または尿などの粗製または未処理の試料から直接検出される。ある特定の例示的な実施形態では、この標的核酸は無細胞ＤＮＡである。
循環腫瘍細胞
一実施形態では、循環細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））は、本発明を用いてアッセイされ得る。本明細書に記載されている方法のいずれかで使用するための循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離を行ってもよい。本発明において使用され得る循環細胞の特異的かつ高感度な検出及び捕捉を達成する例示的な技術が記載されている（Ｍｏｓｔｅｒｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２００９；３５：４６３−４７４、及びＴａｌａｓａｚ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒａｒｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｗｅｅｐｅｒ ｄｅｖｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：３９７０−３９７５）。１０５〜１０６個の末梢血単核細胞のバックグラウンドで１つだけのＣＴＣが見つかる場合がある（Ｒｏｓｓ Ａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．１９９３，８２：２６０５−２６１０）。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）プラットフォームは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体でコーティングされた免疫磁気ビーズを使用して、ＥＰＣＡＭを発現する上皮細胞を濃縮した後、免疫染色を行ってサイトケラチン染色があることと白血球マーカーＣＤ４５が無いことを確認し、捕捉された細胞が上皮性腫瘍細胞であることを確認する（Ｍｏｍｂｕｒｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｒ ３４，０００ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８７；４７：２８８３−２８９１、及びＡｌｌａｒｄ ＷＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ａｌｌ ｍａｊｏｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；１０：６８９７−６９０４）。捕獲された細胞の数は、進行性疾患を有する乳癌、結腸直腸癌、及び前立腺癌の患者に予後的意義があることが前向きに証明されている（Ｃｏｈｅｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８；２６：３２１３−３２２１；Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４；３５１：７８１−７９１、Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００５；２３：１４２０−１４３０、及びｄｅ Ｂｏｎｏ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；１４：６３０２−６３０９）。
本発明はまた、ＣＴＣ−チップ技術を用いたＣＴＣの単離を提供する。ＣＴＣ−Ｃｈｉｐは、マイクロ流体ベースのＣＴＣ捕捉デバイスであり、ＣＴＣが結合する抗ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされた数千のマイクロポストを含むチャンバを介して血液が流れる（Ｎａｇｒａｔｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ．２００７；４５０：１２３５−１２３９）。ＣＴＣ−Ｃｈｉｐは、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）系と比較して、ＣＴＣの数及び純度を有意に向上させ（Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＥＧＦＲ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｕｎｇ−ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００８；３５９：３６６−３７７）、両方のプラットフォームとも下流の分子分析に使用され得る。
無細胞クロマチン
ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が、本発明に従って単離及び分析される。ヌクレオソームは、健康な個体（Ｓｔｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９０６：１６１−１６８（２０００））、ならびに疾患状態に苦しむ個体の血清において検出され得る。さらに、ヌクレオソームの血清濃度は、がん及び自己免疫疾患などの良性及び悪性疾患に罹患している患者ではかなり高い（Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９５，１ １４−１２０，Ｔｒｅｊｏ−Ｂｅｃｅｒｒｉｌ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０４，６６３−６６８、Ｋｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ １９９９ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ６，３６１−３６４；Ｋｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｔ ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １９，１４３−１４８、Ａｍｏｕｒａ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕｍ ４０，２２１７−２２２５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２８，８１−９４）。理論に拘束されるものではないが、腫瘍を有する患者における高濃度のヌクレオソームは、増殖中の腫瘍で自然発生するアポトーシスに由来する。血中を循環するヌクレオソームには、に改変されたヒストンが含まれている。例えば、米国特許公開第２００５／００６９９３１号（２００５年３月３１日）は、患者の血液または血清試料からヌクレオソームを単離して、診断／スクリーニングの目的で、付随するＤＮＡの精製と分析を容易にするために、そのようなヒストン特異的抗体を使用する、疾患の診断指標としての特定のヒストンＮ末端改変に対する抗体の使用に関する。したがって、本発明は、例えば腫瘍変異を検出及びモニタリングするためにクロマチン結合ＤＮＡを使用し得る。改変されたヒストンに関連するＤＮＡの同定は、疾患及び先天性欠損症の診断マーカーとして役立つ。
したがって、別の実施形態では、単離されたクロマチン断片は、循環クロマチン、好ましくは循環モノ及びオリゴヌクレオソームに由来する。単離されたクロマチン断片は、生物学的試料に由来し得る。生物学的試料は、それを必要とする対象または患者に由来し得る。生物学的試料は、血清、血漿、リンパ液、血液、血液画分、尿、滑液、髄液、唾液、循環腫瘍細胞または粘液であり得る。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）
ある特定の実施形態では、本発明を使用して、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出し得る。血漿または血清中の無細胞ＤＮＡは、非侵襲的な診断ツールとして使用され得る。例えば、無細胞胎児ＤＮＡは、互換性のあるＲｈＤ因子の試験、Ｘ連鎖遺伝性疾患の性別判定、単一遺伝子障害の試験、子癇前症の特定のために研究及び最適化されている。例えば、母体血漿中のｃｆＤＮＡの胎児細胞分画の配列決定は、胎児染色体異数性に関連するコピー数の変化を検出するための信頼し得るアプローチである。別の例として、がん患者から分離されたｃｆＤＮＡは、治療の決定に関連する主要な遺伝子の変異を検出するために使用されている。
ある特定の例示的な実施形態では、本開示は、患者試料から直接ｃｆＤＮＡを検出することを提供する。ある他の例示的な実施形態では、本開示は、標的ｃｆＤＮＡを検出する前に、上記で開示された濃縮実施形態を使用して、ｃｆＤＮＡを濃縮することを提供する。
エキソソーム
一実施形態では、エキソソームを本発明でアッセイし得る。エキソソームは、ＲＮＡを含むことが示されている小さな細胞外小胞である。超遠心分離、ろ過、化学沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、及びマイクロ流体工学によるエキソソームの単離は、当該技術分野で公知である。一実施形態では、エキソソームは、エキソソームバイオマーカーを使用して精製される。生体試料からのエキソソームの単離及び精製は、任意の公知の方法によって行われ得る（例えば、ＷＯ２０１６１７２５９８Ａ１を参照のこと）。
ＳＮＰ検出と遺伝子型決定
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、生物学的試料中の一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出するために使用され得る。ＳＮＰは、産科検査（例えば、性別の決定、胎児の欠陥）に関連している場合がある。それらは犯罪捜査に関連している場合がある。一実施形態では、犯罪捜査の容疑者が本発明によって特定され得る。理論に縛られないが、核酸ベースの法医学的証拠は、試験される試料が限定的であり得るので、容疑者または犠牲者の遺伝物質を検出するために利用可能な最も感度の高いアッセイを必要とする場合がある。
他の実施形態では、疾患に関連するＳＮＰが、本発明に包含される。疾患に関連するＳＮＰは、当該技術分野で周知であり、当業者は本発明の方法を適用して適切なガイドＲＮＡを設計し得る（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ？ｔｅｒｍ＝ｈｕｍａｎ％５Ｂｏｒｇｎ％５Ｄを参照のこと）。
一態様では、本発明は、以下を含む、ＳＮＰ遺伝子型決定などの遺伝子型決定方法に関する：
ａ）試料または試料のセットを１つ以上の個体の個別ボリュームに分配することであって、この個々の個別ボリュームは、本明細書に記載される本発明によるＣＲＩＳＰＲ系を含む、分配すること；
ｂ）１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でこの試料または試料のセットをインキュベートすること；
ｃ）１つ以上のガイドＲＮＡの１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、検出可能な正のシグナルが生成されるようにＲＮＡベースのマスキング構築物が改変される、活性化すること；及び
ｄ）検出可能な正のシグナルを検出することであって、この検出可能な正のシグナルの検出は、試料中の特定の遺伝子型に特徴的な１つ以上の標的分子の存在を示す、検出すること。
ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、（例えば、シグナル強度の比較により）１つ以上の標準シグナル、好ましくは、例えば図６０の例示的な実施形態に示されるような合成標準シグナルと比較される。ある特定の実施形態では、標準は、特定の遺伝子型であるか、またはそれに対応する。ある特定の実施形態では、この標準は、特定のＳＮＰまたは他の（単一の）ヌクレオチド変形を含む。ある特定の実施形態では、標準は（ＰＣＲ増幅）遺伝子型標準である。ある特定の実施形態では、標準はＤＮＡであるかまたはＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、標準は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、標準は、ＤＮＡから転写されるＲＮＡであるか、またはそのＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、標準は、ＲＮＡから逆転写されるＤＮＡであるか、またはそのＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、１つ以上の標準と比較され、そのそれぞれは、ＳＮＰまたは他の（単一の）ヌクレオチド変異などの公知の遺伝子型に対応する。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルは、１つ以上の標準シグナルと比較され、比較は、一元配置または二元配置分散分析などによるパラメトリックまたはノンパラメトリック統計分析などによる統計分析を含む。ある特定の実施形態では、検出可能なシグナルを、１つ以上の標準シグナルと比較し、検出可能なシグナルが（統計的に）標準から大きく逸脱しない場合、遺伝子型は上記標準に対応する遺伝子型として決定される。
他の実施形態では、本発明によって、緊急薬理ゲノミクスのための迅速な遺伝子型決定が可能になる。一実施形態では、救急治療室に運ばれた患者の遺伝子型を決定するために、シングルポイントオブケアアッセイを使用してもよい。患者は血栓を有する疑いがある場合があり、救急医は投与する抗凝血剤の投与量を決定する必要がある。例示的な実施形態では、本発明は、ＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｃ１９などのマーカーの遺伝子型分類に基づいて、心筋梗塞または脳卒中治療中に抗凝血剤を投与するためのガイダンスを提供し得る。一実施形態では、抗凝血剤は、抗凝固剤ワルファリンである（Ｈｏｌｆｏｒｄ，ＮＨ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８６）．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｗａｒｆａｒｉｎ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ”．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１１（６）：４８３−５０４）。血液凝固に関連する遺伝子は当該分野で公知である（例えば、ＵＳ２００６０１６６２３９Ａ１、Ｌｉｔｉｎ ＳＣ， Ｇａｓｔｉｎｅａｕ ＤＡ（１９９５）“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０（３）：２６６−７２、及びＲｕｓｄｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｗａｒｆａｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＶＫＯＲＣ１，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ａｎｄ ＣＹＰ４Ｆ２ ｉｎ ａｎ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；６９（３）：３９５−４０５）。具体的には、ＶＫＯＲＣ１ １６３９（または３６７３）一塩基多型では、共通（「野生型」）Ｇ対立遺伝子が、Ａ対立遺伝子に置き換わる。Ａ対立遺伝子（または「Ａハプロタイプ」）を有する人々は、Ｇ対立遺伝子（または「非Ａハプロタイプ」）を有する人々よりも生成するＶＫＯＲＣ１が少ない。これらのバリアントの有病率も人種によって異なり、白人の３７％、アフリカ人の１４％がＡ対立遺伝子を保有している。最終結果は、凝固因子の数が減少するため、凝固能力が低下する。
ある特定の例示的な実施形態では、患者におけるＳＮＰを検出するための遺伝物質の利用可能性は、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料の増幅なしにＳＮＰを検出することを可能にする。遺伝子型決定の場合、試験された生体試料は簡単に入手し得る。ある特定の例示的な実施形態では、本発明のインキュベーション時間は短縮され得る。このアッセイは、酵素反応が起こるのに必要な期間で実施され得る。当業者は、５分で生化学反応を行い得る（例えば、５分のライゲーション）。本発明は、血液からＤＮＡを得るために、自動化されたＤＮＡ抽出デバイスを使用し得る。次に、エフェクタータンパク質の標的分子を生成する反応にＤＮＡを追加し得る。標的分子を生成するとすぐに、マスキング剤を切断し、シグナルを検出し得る。例示的な実施形態では、本発明は、薬物（例えば、抗凝血剤）を投与する前に遺伝子型を決定するためのＰＯＣ迅速診断を可能にする。増幅ステップを使用する場合、全ての反応は１つのステップのプロセスで同じ反応で発生する。好ましい実施形態では、ＰＯＣアッセイは、１時間未満、好ましくは１０分、２０分、３０分、４０分、または５０分で行い得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される系、デバイス、及び方法は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の存在または発現レベルを検出するために使用され得る。ある特定のｌｎｃＲＮＡの発現は、疾患状態及び／または薬剤耐性と関連している。特に、ある特定のｌｎｃＲＮＡ（例えば、ＴＣＯＮＳ＿０００１１２５２、ＮＲ＿０３４０７８、ＴＣＯＮＳ＿０００１０５０６、ＴＣＯＮＳ＿０００２６３４４、ＴＣＯＮＳ＿０００１５９４０、ＴＣＯＮＳ＿０００２８２９８、ＴＣＯＮＳ＿０００２６３８０、ＴＣＯＮＳ＿０００９８６１、ＴＣＯＮＳ＿０００２６５２１、ＴＣＯＮＳ＿０００１６１２７、ＮＲ＿１２５９３９、ＮＲ＿０３３８３４、ＴＣＯＮＳ＿０００２１０２６、ＴＣＯＮＳ＿００００６５７９、ＮＲ＿１０９８９０、及びＮＲ＿０２６８７３）は、黒色腫（例えば、結節性黒色腫、悪性黒子、黒子性悪性黒色腫、側黒斑性黒色腫、表層拡大、黒色腫、粘膜黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏黒色腫、及び軟部組織黒色腫）を処置するための１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、及びＬＧＸ８１８）に対する耐性など、がん処置に対する耐性に関連する。本明細書に記載されている様々な実施形態を使用したｌｎｃＲＮＡの検出は、疾患の診断及び／または処置オプションの選択を容易にし得る。
一実施形態では、本発明は、特に治療の迅速な投与が処置の転帰にとって重要である状況において、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的治療（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥ、ジンクフィンガータンパク質、ＲＮＡｉ）を導き得る。
ＬＯＨ検出
がん細胞は、正常細胞と比較した場合、遺伝物質（ＤＮＡ）の喪失を受ける。全てではないにしてもほとんど全てのがんが受ける遺伝物質のこの欠失は、「ヘテロ接合性の喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）」（ＬＯＨ）と呼ばれる。ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）は、遺伝子全体及び周囲の染色体領域の喪失をもたらす、全体的な染色体イベントである。ヘテロ接合性の喪失は、がんでよく見られる現象であり、喪失した領域に機能的な腫瘍抑制遺伝子がないことを示している可能性がある。しかし、染色体対のもう一方の染色体には１つの機能的遺伝子が残っているため、消失してもサイレントであり得る。腫瘍抑制遺伝子の残りのコピーは、点突然変異によって不活性化され得、腫瘍抑制遺伝子の喪失につながる。がん細胞からの遺伝物質の喪失は、染色体上の特定の遺伝子座での細胞生存率または細胞増殖に不可欠な遺伝子の２つ以上の対立遺伝子の１つを選択的に喪失させ得る。
「ＬＯＨマーカー」は、正常細胞と比較した場合にがんまたは他の疾患に関連する、マイクロサテライト遺伝子座、欠失、変更、または増幅由来のＤＮＡである。ＬＯＨマーカーは、多くの場合、腫瘍抑制遺伝子または別の、通常は腫瘍関連の遺伝子の喪失に関連している。
「マイクロサテライト」という用語は、ヒトゲノムに広く分布しているＤＮＡの短いリピート配列を指す。マイクロサテライトは、長さが２〜５ヌクレオチドの範囲にあるタンデムに繰り返される（すなわち、隣接する）ＤＮＡモチーフの経路であり、通常５〜５０回繰り返される。例えば、配列ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ（配列番号４１８）はジヌクレオチドマイクロサテライトであり、ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ（配列番号４１９）は、トリヌクレオチドマイクロサテライト（Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、及びＴはチミン）である。そのようなマイクロサテライトの繰り返しの長さにおける体細胞の変化は、腫瘍の特徴的な特徴を表すことが示されている。ガイドＲＮＡは、そのようなマイクロサテライトを検出するように設計されてもよい。さらに、本発明は、検出可能なシグナルの定量に基づいて、リピート長の変化、ならびに増幅及び欠失を検出するために使用され得る。ある特定のマイクロサテライトは、遺伝子の調節性隣接領域もしくはイントロン領域、または遺伝子のコドンに直接配置されている。そのような場合のマイクロサテライト変異は、特に脆弱Ｘ症候群及びハンチントン病などのトリプレット拡大疾患において、表現型の変化及び疾患につながり得る。
特定の染色体領域でのヘテロ接合性（ＬＯＨ）の頻繁な喪失は、多くの種類の悪性腫瘍で報告されている。特定の染色体領域での対立遺伝子の喪失は、さまざまな悪性腫瘍で観察される最も一般的な遺伝的変化であり、したがって、マイクロサテライト分析は、肺癌の痰及び膀胱癌の尿などの体液からの検体中のがん細胞のＤＮＡを検出するために適用されている。（Ｒｏｕｌｅａｕ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３，５１５−５２１（１９９３）、及びＬａｔｉｆ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，１３１７−１３２０（１９９３））。さらに、がん及び他のいくつかの疾患を有する個体の血漿中に、著しく増大した濃度の可溶性ＤＮＡが存在することが確立されており、無細胞血清または血漿がマイクロサテライト異常を有するがんＤＮＡの検出に使用され得ることが示されている。（Ｋａｍｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，４３６−４４０（１９９４）、及びＳｔｅｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５（４），３５６−３６２（１９９７））。２つのグループが、小細胞肺癌または頭頸部癌の限られた数の患者の血漿または血清におけるマイクロサテライトの変化を報告している。（Ｈａｈｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，３５０−３５３（１９９６）、及びＭｉｏｚｚｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，２２８５−２２８８（１９９６））。腫瘍及び黒色腫患者の血清におけるヘテロ接合性の喪失の検出も以前に示されている（例えば、米国特許番号ＵＳ６４６５１７７Ｂ１を参照のこと）。
したがって、がんに罹患しているか、またはがんのリスクがある対象においてＬＯＨマーカーを検出することは有利である。本発明は、腫瘍細胞におけるＬＯＨを検出するために使用され得る。一実施形態では、循環腫瘍細胞を生物学的試料として使用し得る。好ましい実施形態では、血清または血漿から得られた無細胞ＤＮＡを使用して、ＬＯＨを非侵襲的に検出及び／またはモニタリングする。他の実施形態では、生物学的試料は、本明細書に記載されている任意の試料（例えば、膀胱癌の尿試料）であってもよい。理論に拘束されるものではないが、本発明を使用して、任意の従来の方法と比較して感度が改善されたＬＯＨマーカーを検出し得、それにより変異の早期検出を提供する。一実施形態では、ＬＯＨは生物学的液中で検出され、ＬＯＨの存在はがんの発生に関連している。本明細書に記載される方法及び系は、がんに関連する特定の対立遺伝子のＬＯＨを検出するための非侵襲的、迅速かつ正確な方法を提供することにより、ＰＣＲまたは組織生検などの従来の技術を大きく上回る進歩を表す。したがって、本発明は、ハイリスク集団をスクリーニングし、化学予防、化学療法、免疫療法または他の治療を受けているハイリスク患者をモニタリングするために使用され得る方法及び系を提供する。
本発明の方法は、血液などの体液からのＤＮＡ抽出のみを必要とするので、単一の患者に対していつでも、かつ繰り返して実施し得る。手術前または手術後；化学療法、放射線療法、遺伝子療法、または免疫療法などの処置前、処置中、及び処置後；または、疾患の進行、安定性、または再発の処置後の追跡検査中に血液を採取し、ＬＯＨをモニターしてもよい。理論に拘束されるものではないが、本発明の方法はまた、ＬＯＨマーカーが個々の患者の腫瘍に特異的であるため、その患者に特異的なＬＯＨマーカーを用いて無症状の疾患の存在または再発を検出するために使用してもよい。この方法はまた、腫瘍特異的なＬＯＨマーカーを使用して、複数の転移が存在するかを検出もし得る。
後成的な改変の検出
本発明では、がんまたはがんの進行を示すヒストンバリアント、ＤＮＡ改変、及びヒストン改変を使用してもよい。例えば、米国特許公開２０１４０２０６０１４は、がんの試料が、健康な対象と比較して、ヌクレオソームＨ２ＡＺ、マクロＨ２Ａ１．１、５−メチルシトシン、Ｐ−Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）レベルを上昇させたことを記載している。個体におけるがん細胞の存在は、がん細胞のアポトーシスの増大の結果として、血中に、より高いレベルの無細胞ヌクレオソームを生成し得る。一実施形態では、Ｈ２Ｂ Ｓｅｒ １４（Ｐ）などのアポトーシスに関連するマークに対する抗体を使用して、アポトーシス性腫瘍細胞から放出された単一のヌクレオソームを同定し得る。したがって、腫瘍細胞から生じるＤＮＡは、本発明に従って、高い感度及び正確性で有利に分析され得る。
出産前スクリーニング
ある特定の実施形態では、本発明の方法及び系は、出生前スクリーニングで使用され得る。ある特定の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、出生前スクリーニングの方法において使用される。ある特定の実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するＤＮＡを、本発明を用いて検出され得る。好ましい実施形態では、単一のヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連するＤＮＡの検出は、出生前スクリーニングのために使用される。ある特定の実施形態では、無細胞クロマチン断片が出生前スクリーニングの方法で使用される。
出生前診断または出生前スクリーニングは、胎児または胚が生まれる前に、それらの疾患または状態を検査することを指す。目的は、神経管欠損症、ダウン症候群、染色体異常、遺伝性障害、及び他の状態、例えば、二分脊椎、口蓋裂、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー及び脆弱性Ｘ症候群などの先天性欠損症を検出することである。スクリーニングはまた、出生前の性別の識別にも使用し得る。一般的な検査手順としては、羊水穿刺、頸部半透明（ｎｕｃｈａｌ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｃｙ）超音波を含む超音波検査、血清マーカー検査、または遺伝子スクリーニングが挙げられる。場合によっては、胎児が流産するか否かを判断するために試験を実施するが、医師及び患者はまた、リスクの高い妊娠を早期に診断して、赤ちゃんが適切なケアを受け得る専門治療（ｔｅｒｔｉａｎ）の病院で出産をスケジュールし得るようにすることも役立つと考えている。
母親の血液中に存在する胎児細胞があること、及びこれらの細胞が出生前のＤＮＡに基づく診断のための胎児染色体の潜在的な供給源であることが認識されている。さらに、胎児ＤＮＡは、母体血中の総ＤＮＡの約２〜１０％の範囲である。現在利用可能な出生前遺伝子検査は、通常、侵襲的な手順を伴う。例えば、妊娠約１０〜１２週間の妊婦に対して行われる絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）、及び約１４〜１６週間後に行われる羊水穿刺には、全て、胎児の染色体異常を検査するための試料を得るための侵襲的手順が含まれる。これらのサンプリング手順によって得られた胎児細胞は、通常、細胞遺伝学的または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を使用して染色体異常について試験される。無細胞胎児ＤＮＡは、妊娠第６週という早い時期に妊婦の血漿及び血清に存在することが示されており、濃度は妊娠中に上昇し、分娩前にピークに達する。これらの細胞は妊娠の非常に早い段階で出現するため、正確で非侵襲的な妊娠初期試験の基礎を形成する可能性がある。理論に拘束されるものではないが、本発明は、少量の胎児ＤＮＡを検出する際に前例のない感度を提供する。理論に縛られることなく、通常、大量の母体ＤＮＡが目的の胎児ＤＮＡとともに同時に回収されるため、胎児ＤＮＡの定量化と変異検出の感度が低下する。本発明は、アッセイの予想外に高い感度によってそのような問題を克服する。
ヒストンのＨ３クラスは、以下の４つの異なるタンパク質型からなる：主要型、Ｈ３．１及びＨ３．２；交換型、Ｈ３．３；ならびに精巣特有のバリアント、Ｈ３ｔ。Ｈ３．１及びＨ３．２は密接に関連しており、Ｓｅｒ９６のみで異なり、Ｈ３．１は少なくとも５つのアミノ酸位置がＨ３．３と異なる。さらに、Ｈ３．１は、肝臓、腎臓、及び心臓などの成人組織での存在と比較して、胎児肝臓で非常に濃縮されている。成体のヒト組織では、Ｈ３．３バリアントは、Ｈ３．１バリアントよりも豊富であるが、胎児の肝臓ではその逆である。本発明は、これらの差異を使用して、胎児細胞及び母親細胞ならびに／または胎児核酸の両方を含む母親の生物学的試料中の胎児ヌクレオソーム及び胎児核酸を検出し得る。
１つの実施形態では、胎児ヌクレオソームは、血液から得られ得る。他の実施形態では、胎児ヌクレオソームは、子宮頸管粘液試料から得られる。ある特定の実施形態では、子宮頸管粘液試料は、妊娠の第２期の初期または妊娠の第１期の後半に妊婦から拭き取りまたは洗浄することによって得られる。粘液に閉じ込められたＤＮＡを放出するために、試料をインキュベーターに入れてもよい。インキュベーターは３７℃に設定され得る。試料は約１５〜３０分間振とうしてもよい。粘液は、ＤＮＡを放出する目的でムチナーゼでさらに溶解されてもよい。また、試料は、当該技術分野で周知の化学処理などの条件に供して、アポトーシスを誘発して胎児ヌクレオソームを放出させてもよい。したがって、子宮頸管粘液試料を、アポトーシスを誘発する薬剤で処理して、それにより胎児ヌクレオソームが放出される。循環胎児ＤＮＡの濃縮については、米国特許公開番号２００７０２４３５４９及び２０１００２４００５４を参照のこと。本発明は、ヌクレオソームまたはＤＮＡのごく一部のみが胎児由来であり得る出生前スクリーニングに方法及び系を適用する場合に特に有利である。
本発明による出生前スクリーニングは、トリソミー１３、トリソミー１６、トリソミー１８、クラインフェルター症候群（４７、ＸＸＹ）、（４７、ＸＹＹ）及び（４７、ＸＸＸ）、ターナー症候群、ダウン症候群（トリソミー２１）、嚢胞性線維症、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、ポルフィリン症、脆弱Ｘ症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディジョージ症候群、及びウルフ・ヒルシュホルン症候群を含むがこれらに限定されない疾患に対するものであり得る。
本発明のいくつかのさらなる態様は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトのトピックのサブセクション遺伝性障害（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（ｗｅｂｓｉｔｅ ａｔ ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）にさらに記載されている広範囲の遺伝病に関連する欠陥の診断、予後及び／または処置に関する。
がん及びがん薬物耐性検出
ある特定の実施形態では、本発明は、がんに関連する遺伝子及び変異を検出するために使用され得る。ある特定の実施形態では、耐性に関連する変異が検出される。耐性腫瘍細胞の増幅または腫瘍細胞のクローン集団における耐性変異の出現が、処置中に発生し得る（例えば、Ｂｕｒｇｅｒ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＢＴＫ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｍａｙ ２０；７：１１５８９；Ｌａｎｄａｕ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｒｉｖｉｎｇ ＣＬＬ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｐｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；５２６（７５７４）：５２５−３０、Ｌａｎｄａｕ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１４ Ｊａｎ；２８（１）：３４−４３、及びＬａｎｄａｕ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｆｅｂ １４；１５２（４）：７１４−２６を参照のこと）。従って、このような変異の検出には高感度のアッセイが必要であり、モニタリングには繰り返しの生検が必要である。生検の繰り返しは不便で、侵襲的で、かつ費用がかかる。耐性変異は、当該技術分野で公知である従来の方法を使用して、血液試料または他の非侵襲的に収集された生体試料（例えば、血液、唾液、尿）で検出するのが難しい場合がある。耐性変異とは、化学療法、標的療法、または免疫療法に対する耐性に関連する変異を指し得る。
ある特定の実施形態では、変異は、がんの進行を検出するために使用され得る個々のがんにおいて生じる。一実施形態では、腫瘍に対するＴ細胞の細胞溶解活性に関連する変異が特徴付けられており、本発明によって検出され得る（例えば、Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｊａｎｕａｒｙ １５；１６０（１−２）：４８−６１）。これらの変異の検出に基づいて、個別化された治療法を患者のために開発し得る（例えば、ＷＯ２０１６１００９７５Ａ１を参照のこと）。ある特定の実施形態では、細胞溶解活性に関連するがん特異的変異は、ＣＡＳＰ８、Ｂ２Ｍ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＣ１Ａ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＴＥＴ２、ＡＬＰＫ２、ＣＯＬ５Ａ１、ＴＰ５３、ＤＮＥＲ、ＮＣＯＲ１、ＭＯＲＣ４、ＣＩＣ、ＩＲＦ６、ＭＹＯＣＤ、ＡＮＫＬＥ１、ＣＮＫＳＲ１、ＮＦ１、ＳＯＳ１、ＡＲＩＤ２、ＣＵＬ４Ｂ、ＤＤＸ３Ｘ、ＦＵＢＰ１、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、ＢまたはＣ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＭＥＴ、ＡＳＸＬ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＡＬＯＸ１２Ｂ及びＡＬＯＸ１５Ｂからなる群より選択される遺伝子中の変異、または染色体全体の事象を除き、次の染色体バンドのいずれかに影響を与えるコピー数の増大：６ｑ１６．１−ｑ２１、６ｑ２２．３１−ｑ２４．１、６ｑ２５．１−ｑ２６、７ｐ１１．２−ｑ１１．１、８ｐ２３．１、８ｐ１１．２３−ｐ１１．２１（ＩＤＯ１、ＩＤＯ２を含む）、９ｐ２４．２−ｐ２３（ＰＤＬ１、ＰＤＬ２を含む）、１０ｐ１５．３、１０ｐ１５．１−ｐ１３、１１ｐ１４．１、１２ｐ１３．３２−ｐ１３．２、１７ｐ１３．１（ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＡＬＯＸ１５Ｂを含む）、及び２２ｑ１１．１−ｑ１１．２１からなる群より選択される遺伝子中の変異であり得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、治療の過程の間及び治療が完了した後に、がん変異（例えば、耐性変異）を検出するために使用される。本発明の感度は、処置中に生じるクローン変異の非侵襲的検出を可能にし得、疾患の再発を検出するために使用され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、差示的に発現されるｍｉＲＮＡのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び／またはｍｉＲＮＡ特徴の検出は、がんの進行を検出またはモニタリングするか、及び／またはがん治療への薬物耐性を検出するために使用され得る。例として、Ｎａｄａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０１５）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１２４６４）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を検出するために使用され得るｍＲＮＡ特徴について説明している。
ある特定の例示的な実施形態では、細胞のクローン性亜集団における耐性変異の存在を、処置レジメンを決定する際に使用し得る。他の実施形態では、患者を治療するための個別化された治療は、一般的な腫瘍変異に基づいて投与され得る。ある特定の実施形態では、処置に応答して一般的な変異が生じ、薬物耐性をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明は、そのような薬物耐性変異を有する細胞の変異または増幅を獲得する細胞について患者をモニタリングする際に使用され得る。
様々な化学療法剤、特にチロシンキナーゼ阻害剤などの標的療法による治療は、治療薬の活性に抵抗する標的分子に新しい変異をもたらす場合が多い。この耐性を克服するための複数の戦略が評価されており、これには、これらの変異の影響を受けない第２世代療法の開発、及び耐性変異の下流で作用する薬剤を含む多剤による処置が含まれる。例示的な実施形態では、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を標的とし、ＣＬＬ及び特定のリンパ腫に使用される分子であるイブルチニブに対する一般的な変異は、位置４８１でのシステインからセリンへの変化（ＢＴＫ／Ｃ４８１Ｓ）である。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼドメインを標的とするエルロチニブは、肺癌の処置に一般的に使用され、耐性腫瘍が治療後に必ず発症する。耐性クローンに見られる一般的な変異は、７９０位のスレオニンからメチオニンへの変異である。
がん患者の集団間で共有される非サイレント変異及び本発明で検出され得る一般的な耐性変異は、当該技術分野で公知である（例えば、ＷＯ／２０１６／１８７５０８を参照のこと）。ある特定の実施形態では、薬物耐性変異は、イブルチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、トラスツズマブ、ベムラフェニブ、ＲＡＦ／ＭＥＫ、チェックポイント遮断療法、または抗エストロゲン療法による処置によって誘発され得る。ある特定の実施形態では、がん特異的変異は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＮＲＡＳ、ＲＡＣ１、及びＥＳＲ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子に存在する。
免疫チェックポイントは、免疫反応を減速または停止し、免疫細胞の制御されない活性による過度の組織損傷を防ぐ抑制経路である。ある特定の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、プログラム死−１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ−４）である。追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲなどのＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーである。さらなる追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＩＭ−３などのＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。
最近、腫瘍及びそれらの微小環境における遺伝子発現は、単一細胞レベルで特徴付けられている（例えば、Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ−ｓｅｑ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，１８９−１９６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ０５０１（２０１６））、Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ＲＮＡ−ｓｅｑ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｎｏｖ １０；５３９（７６２８）：３０９−３１３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０１２３．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｎｏｖ ２、及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｒｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ ＷＯ ２０１７００４１５３ Ａ１）。ある特定の実施形態では、遺伝子特徴が、本発明を使用して検出され得る。一実施形態では、補体遺伝子が、腫瘍微小環境でモニタリングまたは検出される。一実施形態では、ＭＩＴＦ及びＡＸＬプログラムがモニタリングまたは検出される。一実施形態では、腫瘍特異的幹細胞または前駆細胞の特徴が検出される。このような兆候は、免疫応答の状態及び腫瘍の状態を示す。ある特定の実施形態では、増殖、処置に対する耐性、及び免疫細胞の存在量に関する腫瘍の状態が検出され得る。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、特に疾患の再発または一般的な耐性変異の発生をモニタリングするために、腫瘍ＤＮＡなどの循環ＤＮＡのための低コストで迅速な多重がん検出パネルを提供する。
免疫療法の適用
本明細書に開示される実施形態はまた、さらなる免疫療法の状況において有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、対象における免疫応答を診断、予後診断及び／または病期分類する方法は、１つ以上のバイオマーカーの第１レベルの発現、活性及び／または機能を検出すること、及び検出レベルを対照レベルと比較することを含み、ここで検出されたレベルと対照レベルの差は、対象における免疫応答の存在を示す。
ある特定の実施形態では、本発明を使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の機能不全または活性化を決定し得る。ＴＩＬは、公知の方法を使用して腫瘍から分離し得る。ＴＩＬを分析して、養子細胞移植療法に使用すべきかを判断し得る。さらに、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を、機能障害または活性化の兆候について分析し得、その後対象に投与してもよい。機能不全及び活性化Ｔ細胞の例示的な特徴が説明されている（例えば、Ｓｉｎｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｇｅｎｅ Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ ｆｒｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｓｅｐ ８；１６６（６）：１５００−１５１１．ｅ９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０８．０５２を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、Ｃ２ｃ２が、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）などの免疫細胞のその状態を評価するために使用される。特に、Ｔ細胞の活性化及び／または機能不全は、例えば、１つ以上のＴ細胞状態に関連する遺伝子または遺伝子特徴に基づいて決定され得る。このようにして、ｃ２ｃ２を使用して、Ｔ細胞の１つ以上の亜集団の存在を決定してもよい。
いくつかの実施形態では、Ｃ２ｃ２は、診断アッセイにおいて使用され得るか、または患者が免疫療法または別のタイプの療法を施すのに適しているかを決定する方法として使用され得る。例えば、遺伝子またはバイオマーカーの特徴の検出は、ｃ２ｃ２を介して実行され、患者が所定の処置に反応しているか、または患者が反応していない場合は、Ｔ細胞機能障害に起因し得るかを判断する。このような検出は、患者が受けるのに最も適した治療の種類に関して有益である。例えば、患者が免疫療法を受けるべきかである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される系及びアッセイは、治療（例えば、養子細胞移入（ＡＣＴ）治療）に対する患者の応答が細胞機能障害に起因するものであるかを臨床医が識別することを可能にし、及び、もしそうであれば、バイオマーカー特徴全体の上方制御及び下方制御のレベルにより、問題に対処し得る。例えば、ＡＣＴを受けている患者が無反応である場合、ＡＣＴの一部として投与された細胞を、本明細書に開示されるアッセイによってアッセイして、細胞活性化及び／または機能不全の状態に関連することが公知のバイオマーカー特徴の発現の相対レベルを決定してもよい。特定の阻害性受容体または分子が、ＡＣＴ細胞で上方制御される場合、患者はその受容体または分子の阻害剤で処置され得る。特定の刺激性受容体または分子がＡＣＴ細胞で下方制御される場合、患者はその受容体または分子のアゴニストで治療され得る。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の系、方法、及びデバイスを使用して、特定の細胞型、細胞表現型、または細胞状態を識別する遺伝子特徴をスクリーニングしてもよい。同様に、圧縮センシングなどの方法を使用することにより、本明細書に開示される実施形態を使用して、トランスクリプトームを検出し得る。遺伝子発現データは高度に構造化されているため、一部の遺伝子の発現レベルで、他の遺伝子の発現レベルが予測される。遺伝子発現データが高度に構造化されているという知識により、この系の自由度の数が少ないという仮定が可能になり、相対的な遺伝子量の計算の基礎が希薄であるという仮定が可能になる。出願人はどの遺伝子が相互作用する可能性があるかについての特定の知識がなくても、アンダーサンプリングしながら非線形相互作用項を回復することが可能であるという生物学的に動機付けられたいくつかの仮定を立てることが可能である。特に、出願人らは、遺伝的相互作用が低ランク、希薄、またはこれらの組み合わせであると想定するならば、真の自由度数は完全な組み合わせ展開に比べて小さく、これにより出願人らは比較的少数の摂動を有する全非線形ランドスケープを推論することが可能である。これらの仮定を回避し、行列の完成及び圧縮センシングの分析理論を使用して、アンダーサンプリングされた組み合わせ摂動実験を設計してもよい。さらに、カーネル学習フレームワークを使用して、個々の相互作用係数を直接学習せずに組み合わせ摂動の予測関数を構築することにより、アンダーサンプリングを採用し得る。圧縮センシングは、包括的な遺伝子発現プロファイルを取得するために検出される標的転写物の最小数を特定する方法を提供する。圧縮センシングの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１０月２７日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９２３０「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ａｂｕｎｄａｎｃｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」に開示されている。圧縮センシングのような方法を使用して最小転写産物標的セットを識別したら、対応するガイドＲＮＡのセットを設計して、上記転写産物を検出してもよい。したがって、ある特定の例示的な実施形態では、細胞の遺伝子発現プロファイルを取得する方法は、本明細書で開示された実施形態を使用して、細胞または細胞集団の遺伝子発現プロファイルを提供する最小転写産物セットを検出することを含む。
遺伝子編集及び／またはオフ標的効果の検出
本明細書に開示される実施形態は、他の遺伝子編集ツールと組み合わせて使用して、所望の遺伝子編集が成功したことを確認するか、及び／または任意のオフ標的効果の存在を検出してもよい。編集されたセルは、１つ以上の標的遺伝子座への１つ以上のガイドを使用してスクリーニングされ得る。本明細書に開示される実施形態はＣＲＩＳＰＲ系を利用するので、治療用途も想定される。例えば、本明細書に開示される遺伝子型決定の実施形態は、適切な標的遺伝子座を選択するか、または標的編集が必要な細胞もしくは細胞集団を同定するために使用され得る。次に、同じまたは別個の系を使用して、編集効率を決定してもよい。以下の実施例に記載されるように、本明細書に開示される実施形態は、１週間程度で、合理化されたセラノスティックパイプラインを設計するために使用され得る。
核酸タグ付きアイテムの検出
あるいは、本明細書に記載される実施形態は、核酸識別子を検出するために使用され得る。核酸識別子は、特定の物品を識別するために使用され得る非コーディング核酸である。ＤＮＡ透かしなどの核酸識別子の例は、Ｈｅｉｄｅｒ及びＢａｒｎｅｋｏｗ．“ＤＮＡ ｗａｔｅｒｍａｒｋｓ：Ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ”ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：４０（２００８）に記載されている。核酸識別子はまた、核酸バーコードであってもよい。核酸ベースのバーコードは、標的分子及び／または標的核酸などの関連分子の識別子として使用されるヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）の短い配列である。核酸バーコードは、少なくとも、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有し得、一本鎖形態であっても、または二本鎖形態であってもよい。１つ以上の核酸バーコードを、標的分子及び／または標的核酸に付着しても、または「タグ付け」してもよい。この付着は、直接的（例えば、標的分子へのバーコードの共有結合または非共有結合）または間接的（例えば、追加の分子、例えば、抗体（または他のタンパク質）などの特異的結合剤を介して）であっても、またはバーコード受信アダプター（または他の核酸分子）であってもよい。標的分子及び／または標的核酸は、核酸バーコードコンカテマーなどの複数の核酸バーコードで組み合わせて標識され得る。通常、核酸バーコードを使用して、標的分子及び／または標的核酸を、特定のコンパートメント（例えば、別個の容積）からのものであるか、特定の物理的特性（例えば、親和性、長さ、配列など）を有するか、または特定の処理条件を受けたものとして特定する。標的分子及び／または標的核酸を、複数の核酸バーコードと関連付けて、これら全ての機能（及びそれ以上）に関する情報を得てもよい。核酸バーコードの生成方法は、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４／０４７５６１に開示されている。
酵素
本出願は、Ｃ２ｃ２のオルソログをさらに提供し、これは、それらをＲＮＡ切断及び検出の異なる適用にそれらを特に適したものにさせるロバストな活性を示す。これらの適用には、本明細書に記載されている適用が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、試験された他のものよりも強い活性を有することが実証されているオルソログは、生物体Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉから同定されたＣ２ｃ２オルソログ（ＬｗＣ２ｃ２）である。したがって、本出願は目的の標的遺伝子座を改変するための方法を提供し、この方法は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、より具体的には本明細書に記載の活性が増大したＣ２ｃ２エフェクタータンパク質及び１つ以上の核酸成分を含む非天然に存在するかまたは操作された組成物を、上記遺伝子座に送達することを含む。ここで少なくとも１つ以上の核酸成分が操作されており、１つ以上の核酸成分が複合体を目的の標的に導き、エフェクタータンパク質が１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、この複合体が目的の標的遺伝子座に結合する。特定の実施形態では、目的の標的遺伝子座は、ＲＮＡを含む。本出願はさらに、ＲＮＡ配列特異的干渉、ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節、ＲＮＡもしくはＲＮＡ産物のスクリーニング、またはｌｉｎｃＲＮＡまたは非コードＲＮＡ、または核ＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、変異原性、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、または育種における活性が増大したＣｃ２エフェクタータンパク質の使用を提供する。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、それらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
実施例１−一般的なプロトコル
ＤＮＡ及びＲＮＡについてのＣ２ｃ２診断試験を行う２つの方法が提供される。このプロトコルは、検出アプタマーの送達後、タンパク質検出バリアントでも使用してもよい。１つ目は、増幅及びＣ２ｃ２検出が別々に行われる２段階反応である。２つ目は、全てが１つの反応で組み合わされ、これは２段階反応と呼ばれる。高濃度の試料では増幅が不要な場合があるので、増幅が組み込まれていない別のＣ２ｃ２プロトコルを用意することを強く勧めるものである。
Figure 2021511795
反応緩衝液は：４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３である。
この反応を３７℃で２０分〜３時間行う。励起：４８５ｎＭ／２０ｎＭ、発光：５２８ｎＭ／２０ｎＭで読み取る。単一分子の感度のシグナルは、２０分で開始し検出される場合があるが、当然ながら反応時間が長いほど感度は高くなる。
２ステップの反応：
ＲＰＡ増幅混合物
Figure 2021511795
この反応を一緒に混合し、次いで凍結乾燥酵素混合物の２〜３本の管で再懸濁する。５μＬの２８０ｍＭ ＭｇＡｃをこの混合物に追加して反応を開始する。反応を１０〜２０分間行う。各反応物は２０μＬなので、これは最大５つの反応に十分である。
Figure 2021511795
反応緩衝液は：４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３である。
これを２０分〜３時間行う。単一分子の感度を確認するには、最小検出時間は約２０分である。長時間反応させても感度が上がるだけである。
Figure 2021511795
参照されるＮＥＢキットは、ＨｉｇｈＳｃｒｉｂｅ Ｔ７高収率キットである。緩衝液を再懸濁するには、１．５倍の濃度を使用し：凍結乾燥した基質の３つの管で５９μＬの緩衝液に再懸濁し、上記の混合物で使用する。各反応は２０μＬなので、５回の反応に十分である。この反応による単一分子の感受性は、３０〜４０分という早い段階で観察されている。
実施例２−Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ Ｗａｄｅｉ由来のＣ２Ｃ２は、ＤＮＡ及びＲＮＡの高感度で特異的な検出を媒介する
迅速、安価、及び高感度の核酸検出は、ポイントオブケア病原体検出、遺伝子型決定、及び疾患モニタリングを補助し得る。ＲＮＡガイド付き、ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクターＣａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２として知られていた）は、標的認識時に無差別なＲＮＡｓｅ活性の「コラテラル効果」を示す。出願人は、Ｃａｓ１３ａのコラテラル効果と等温増幅とを組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲベースの診断（ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘ）を確立し、ＤＮＡまたはＲＮＡの迅速な検出と、アトモル感度及び単一塩基ミスマッチ特異性を得る。出願人は、このＣａｓ１３ａベースの分子検出プラットフォームを使用して、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ（特定の高感度酵素レポーターアンロッキング））と呼んで、ジカウイルス及びデング熱ウイルスの特定の株を検出し、病原菌を識別し、ヒトＤＮＡを遺伝子型決定し、無細胞腫瘍ＤＮＡ変異を特定する。さらに、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応試薬は、コールドチェーンの独立性及び長期保存のために凍結乾燥してもよく、フィールド適用用のペーパーに簡単に再構成し得る。
ポータブルプラットフォーム上で高感度及び単一塩基特異性によって核酸を迅速に検出する能力は、疾患の診断及びモニタリング、疫学、及び一般的な実験室の作業に役立ち得る。核酸を検出する方法は存在するが（１〜６）、感度、特異度、単純さ、コスト、及び速度の間でトレードオフがある。微生物のクラスター化された定期的に間隔を空けたショートパリンドロームリピート（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）適応免疫系には、ＣＲＩＳＰＲベースの診断（ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘ）に活用し得るプログラム可能なエンドヌクレアーゼが含まれている。一部のＣａｓ酵素はＤＮＡを標的にするが（７、８）、Ｃａｓ１３ａ（以前はＣ２ｃ２として知られていた）（８）などのシングルエフェクターＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（９−１１）で再プログラムして、特定のＲＮＡセンシング用プラットフォームを提供し得る。ＲＮＡ標的が認識されると、活性化されたＣａｓ１３ａは近くの非標的ＲＮＡの「コラテラル」的切断に関与する（１０）。このｃｒＲＮＡプログラムのコラテラル切断活性により、Ｃａｓ１３ａは、プログラムされた細胞死（１０）を誘発することにより、インビボで特定のＲＮＡの存在を検出するか（１０）、または標識されたＲＮＡの非特異的分解により、インビトロで検出し得る（１０、１２）。ここでは出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特定の高感度酵素レポーターのアンロック：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ）、核酸増幅に基づくアトモル感度を備えたインビトロ核酸検出プラットフォーム、及び標的のリアルタイム検出を可能にする３つのＣａｓ１３ａを介した市販のレポーターＲＮＡのコラテラル切断（１２）について説明する（図１７）。
方法
発現のためのＣ２ｃ２遺伝子座及びタンパク質のクローニング
細菌のインビボ効率アッセイのために、Ｌａｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉのＦ０２７９及びＬａｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉからのＣ２ｃ２タンパク質を、哺乳動物発現用のコドン最適化遺伝子（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｊｉａｎｇｓｕ、Ｃｈｉｎａ）として注文し、ベータ−ラクタマーゼ標的化または非標的化スペーサーのいずれかに隣接する対応するダイレクトリピートとともにｐＡＣＹＣ１８４バックボーンにクローニングした。スペーサーの発現は、Ｊ２３１１９プロモーターによって駆動された。
タンパク質精製のために、哺乳動物のコドン最適化Ｃ２ｃ２タンパク質を、タンパク質精製のために細菌発現ベクターにクローニングした（６ｘ Ｈｉｓ／Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ ＳＵＭＯ，Ｉｌｙａ Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎから贈呈されたｐＥＴベースの発現ベクター）。
細菌インビボ Ｃ２ｃ２効率アッセイ
ＬｗＣ２ｃ２及びＬｓｈＣ２ｃ２ インビボ効率プラスミド及び以前に記載されたベータ−ラクタマーゼプラスミド（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ２０１６）を、それぞれ９０ｎｇ及び２５ｎｇで、ＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓコンピテント細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に同時形質転換した。形質転換後、細胞の希釈物をアンピシリン及びクロラムフィコールＬＢ−寒天プレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーは翌日カウントした。
核酸標的及びｃｒＲＮＡ調製
核酸標的を、ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉホットスタート（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲ増幅し、ゲル抽出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、精製したｄｓＤＮＡをＴ７ポリメラーゼと３０℃で一晩インキュベートし、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でＲＮＡを精製した。
ｃｒＲＮＡの調製のために、構築物は、付加されたＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。ｃｒＲＮＡ ＤＮＡを、短いＴ７プライマー（最終濃度１０μＭ）にアニーリングし、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、Ｔ７ポリメラーゼと３７℃で一晩インキュベートした。ＲＮＡＸＰクリーンビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ビーズの反応容積に対する比率を２倍にして、イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ）をさらに１．８倍に追加して、ｃｒＲＮＡを精製した。
ＮＡＳＢＡ等温増幅
ＮＡＳＢＡ反応の詳細は、［Ｐａｒｄｅｅ ２０１６］に記載されている。総反応容量が２０μＬの場合、６．７μＬの反応緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＥＣＢ−２４）、３．３μＬのヌクレオチド混合物（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥＣＮ−２４）、０．５μＬのヌクレアーゼ非含有水、０．４μＬの１２．５μＭ ＮＡＳＢＡプライマー、０．１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、０３３３５４０２００１）及び４μＬのＲＮＡアンプリコン（または陰性対照の場合は水）を４℃で組み合わせし、６５℃で２分間、次に４１℃で１０分間インキュベートした。５μＬの酵素混合物（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＥＣ−１−２４）を各反応に添加し、反応混合物を４１℃で２時間インキュベートした。使用したＮＡＳＢＡプライマーは、５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号１６）、及び５’−ＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１７）であり、下線部はＴ７プロモーター配列を示している。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
アンプリコンのサイズ（１００〜１４０ｎｔの間）、プライマーの融解温度（５４℃〜６７℃の間）及びプライマーサイズ（３０〜３５ｎｔ）を除いて、デフォルトパラメーターを使用してＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ ｂｌａｓｔ（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｉｃｓ １３，１３４（２０１２））を使用してＲＰＡのプライマーを設計した。次いで、プライマーをＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。
実行されたＲＰＡ及びＲＴ−ＲＰＡ反応は、ＴｗｉｓｔＡｍｐ（登録商標）ＢａｓｉｃまたはＴｗｉｓｔＡｍｐ（登録商標）Ｂａｓｉｃ ＲＴ（ＴｗｉｓｔＤｘ）でそれぞれ指示されたとおりであったが、例外として、２８０ｍＭのＭｇＡｃを入力鋳型の前に追加した。特に記載のない限り、反応は１μＬの入力量で３７℃で２時間実行した。
ＬｗＣ２ｃ２タンパク質精製
Ｃ２ｃ２細菌発現ベクターを、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ Ｓｉｎｇｌｅｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に形質転換した。１６ｍＬのスターター培養物をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４増殖培地（１２ ｇ／Ｌトリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、９．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ、２．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、Ｓｉｇｍａ）で増殖させ、（ＴＢ）を４ＬのＴＢに接種し、これをＯＤ６００が０．６になるまで３７℃、３００ＲＰＭでインキュベートした。この時点で、タンパク質発現は、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）の補充により最終濃度５００μＭまで誘導し、細胞はタンパク質発現のために１８℃で１６時間冷却した。次に、細胞を５２００ｇ、１５分、４℃で遠心分離した。細胞ペレットを回収し、後で精製するために−８０℃で保存した。
タンパク質精製の後続のステップは全て４℃で実行する。細胞ペレットを破砕し、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｕｌｔｒａ ＥＤＴＡ非含有錠剤）、リゾチーム、及びベンゾナーゼを添加した溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ８．０）に再懸濁した後、超音波処理（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０、Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を、以下の条件すなわち振幅１００、１秒オン、２秒オフ、合計超音波処理時間１０分によって行った。溶解物を４℃、１０，０００ｇで１時間の遠心分離により清澄化し、その上清をＳｔｅｒｉｃｕｐ ０．２２ミクロンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。ろ過した上清を、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ）に供しし、回転させながら１時間インキュベートした後、タンパク質結合ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ樹脂を溶解緩衝液で３回洗浄した。その樹脂を、ＳＵＭＯ消化緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ １ｍＭ ＤＴＴ、０．１５％Ｉｇｅｐａｌ（ＮＰ−４０）、ｐＨ８．０）に、２５０単位のＳＵＭＯプロテアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに再懸濁し、４℃で一晩回転させながらインキュベートした。消化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣｏｍｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色により確認し、タンパク質溶出液を、樹脂をスピンダウンすることにより分離した。タンパク質を、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ ＰＵＲＥ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介して５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードし、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール、ｐＨ８．０）中で１３０ｍＭ〜２ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配で溶出した。。得られた画分を、ＬｗＣ２ｃ２の存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、タンパク質を含む画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを介してＳ２００緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０）で１ｍＬに濃縮した。濃縮されたタンパク質を、ＦＰＬＣを介してゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。ゲルろ過で得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＬｗＣ２ｃ２を含む画分をプールし、Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ（６００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）に緩衝液交換し、−８０Ｃで凍結保存した。
ＬｗＣ２ｃ２コラテラル検出
検出アッセイは、特に明記しない限り、ヌクレアーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３）中で、４５ｎＭの精製ＬｗＣ２ｃ２、２２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ、１２５ｎＭの基質レポーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＲＮＡｓｅ Ａｌｅｒｔ ｖ２）、２μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤、１００ｎｇのバックグラウンド全ＲＮＡ、及びさまざまな量の入力核酸標的を用いて行いた。入力がＲＰＡ反応由来のＴ７プロモーターを含む増幅されたＤＮＡである場合、上記のＣ２ｃ２反応は、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ及び０．６μＬＴ７ポリメラーゼ混合物（ＮＥＢ）を含むように変更された。反応を、５分ごとに測定される蛍光反応速度で、蛍光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、３７℃で１〜３時間（特に明記しない限り）進行させた。
上記の反応条件をＲＰＡ増幅混合物と統合することにより、ＲＰＡ−ＤＮＡ増幅、ＤＮＡのＲＮＡへのＴ７ポリメラーゼ変換、及びＣ２ｃ２検出を組み合わせるワンポット反応を行った。簡単に言えば、５０μＬのワンポットアッセイでは、０．４８μＭフォワードプライマー、０．４８μＭリバースプライマー、１×ＲＰＡ再水和緩衝液、さまざまな量のＤＮＡ入力、４５ｎＭのＬｗＣ２ｃ２組換えタンパク質、２２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ、２５０ｎｇのバックグラウンド全ＲＮＡ、２００ｎＭ基質レポーター（ＲＮａｓｅアラートｖ２）、４μＬ ＲＮａｓｅインヒビター、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、１μＬＴ７ポリメラーゼ混合物、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び１４ｍＭ ＭｇＡｃから構成した。
ＴａｑＭａｎプローブによる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
ＳＨＥＲＬＯＣＫ定量化を他の確立された方法と比較するために、ｓｓＤＮＡ１の希釈系列でのｑＰＣＲを実施した。ＴａｑＭａｎプローブとプライマーセット（以下の配列）を、ｓｓＤＮＡ１に対して設計し、ＩＤＴで合成した。アッセイを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して行い、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０で測定した。
Figure 2021511795
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩによるリアルタイムＲＰＡ
ＳＨＥＲＬＯＣＫ定量を他の確立された方法と比較するために、出願人は、ｓｓＤＮＡ１の希釈系列でＲＰＡを実行した。リアルタイムでＤＮＡの蓄積を定量化するために、出願人は、上記の典型的なＲＰＡ反応混合物に、１ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を追加し、核酸の量と相関する蛍光シグナルを得る。反応は、蛍光反応速度を５分ごとに測定しながら、蛍光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で３７℃で１時間進行させた。
レンチウイルスの調製及び処理
レンチウイルスの調製及び処理は、以前から公知の方法に基づいた。簡単に言えば、ジカ（Ｚｉｋａ）またはデング（Ｄｅｎｇｕｅ）のＲＮＡ断片、７．５μｇのｐｓＰＡＸ２、及び２．５μｇのｐＭＤ２．Ｇを含む１０μｇのｐＳＢ７００誘導体を、ＨｅＢＳ−ＣａＣｌ２方法を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒ７００７）にトランスフェクトした。培地交換２８時間後、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭで、０．４５μｍシリンジフィルターを使用して上清をろ過した。ＶｉｒａｌＢｉｎｄレンチウイルス精製キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＶＰＫ−１０４）及びＬｅｎｔｉ−Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３１２３１）を使用して、上清からレンチウイルスを精製及び調製した。ウイルス濃度は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＶＰＫ−１１２）を使用して定量した。ウイルス試料を７％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ４５２２）にスパイクし、９５℃で２分間加熱し、ＲＰＡへの入力として使用した。
ジカのヒト血清試料の分離及びｃＤＮＡ精製
ジカ陽性の疑いのあるヒト血清または尿試料を、ＡＶＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で不活性化し、ＲＮＡの単離を、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で達成した。ランダムプライマー、ｄＮＴＰ類、及び試料ＲＮＡを混合することによって、単離したＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、７０℃で７分間熱変性させた。次に変性ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写し、２２〜２５℃で１０分間、５０℃で４５分間、５５℃で１５分間、８０℃で１０分間インキュベートした。次に、ｃＤＮＡを、ＲＮＡｓｅ Ｈ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に３７℃で２０分間インキュベートし、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを破壊した。
ヒト唾液からのゲノムＤＮＡ抽出
採取の３０分前に飲食物を摂取することが制限された志願者から２ｍＬの唾液を採取した。次に、キットのプロトコルで推奨されているように、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して試料を処理した。煮沸した唾液試料の場合、４００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ）を、１００μＬのボランティアの唾液に加え、１８００ｇで５分間遠心分離した。その上清をデカントし、ペレットを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した後、９５℃で５分間インキュベートした。１μＬの試料をＲＰＡ反応への直接入力として使用した。
凍結乾燥とペーパーでの付着
ガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ，１８２７−０２１）を、９０分間オートクレーブし（Ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ Ｓｔｉｌｌｓ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒｓ，ＭＫＩＩ）、５％ヌクレアーゼ非含有ＢＳＡ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１２６６０９−１０ＧＭ）で一晩ブロックした。ヌクレアーゼ非含有の水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＭ９９３２）でペーパーを１回すすいだ後、４％ＲＮＡｓｅｃｕｒｅＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＭ７００６）と６０℃で２０分間インキュベートし、ヌクレアーゼ非含有の水でさらに３回すすいだ。処理したペーパーを、使用前にホットプレート（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，ＩＫＡ Ｃ−Ｍａｇ ＨＳ７）上で８０℃で２０分間乾燥した。先に示した１．８μＬのＣ２ｃ２反応混合物を、黒い透明な底の３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４）に置いたディスク（２ｍｍ）に置いた。凍結乾燥試験では、反応混合物ディスクを含むプレートを、液体窒素で瞬間凍結し、Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ（２）に記載されているように一晩凍結乾燥した。ＲＰＡ試料を、ヌクレアーゼ非含有の水で１：１０に希釈し、１．８μＬの混合液をペーパーディスクにロードし、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｎｅｏ）を使用して３７℃でインキュベートした。
細菌ゲノムＤＮＡ抽出
ＣＲＥ検出を含む実験のために、細菌培養物を、溶原性ブロス（ＬＢ）で対数中期まで増殖させ、次いでペレット化し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ及びＴｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して、必要に応じて、グラム陰性またはグラム陽性菌のいずれかの製造業者のプロトコルを使用して、ｇＤＮＡ抽出及び精製に供した。ｇＤＮＡは、ＱｕｂｉｔフルオロメーターでのＱｕａｎｔ−Ｉｔ ｄｓＤＮＡアッセイによって定量化し、その品質は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計で２００−３００ｎＭの吸光度スペクトルを介して評価した。
Ｅ．ｃｏｌｉとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａとの間を区別する実験のために、細菌培養物を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスで初期定常期まで増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの両方の１．０ｍＬを、ポータブルＰｕｒｅＬｙｓｅ細菌ｇＤＮＡ抽出キット（Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して処理した。１Ｘ結合緩衝液を細菌培養液に添加した後、電池式の溶解カートリッジを３分間通過させた。洗浄溶液として０．５×の結合緩衝水溶液を使用した後、１５０μＬの水で溶出した。
デジタルドロップレットＰＣＲ定量
図１Ｃで使用されるｓｓＤＮＡ１及びｓｓＲＮＡ１の標準希釈の濃度を確認するために、出願人は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行った。ＤＮＡ定量化のために、ｓｓＤＮＡ１配列を標的とするように設計されたＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ／プライマーアッセイでｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）を使用して液滴を作成した。ＲＮＡ定量のために、ｓｓＲＮＡ１配列を標的とするように設計されたＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ／プライマーアッセイを備えた、プローブ用のワンステップＲＴ−ｄｄＰＣＲキットを使用して、液滴を作成した。いずれの場合も、ＱＸ２００液滴発生器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成し、ＰＣＲプレートに移した。キットのプロトコルに記載されているように、液滴ベースの増幅をサーモサイクラーで実行し、続いてＱＸ２００ドロップレットリーダーでの測定を介して核酸濃度を決定した。
ヒトの遺伝子型決定のための合成標準
ヒト試料の遺伝子型を正確に呼び出すための標準を作成するために、出願人は、ＳＮＰ標的の周りにプライマーを設計して、２つのホモ接合遺伝子型のそれぞれを表すヒトゲノムＤＮＡから約２００ｂｐの領域を増幅した。次に、ホモ接合型標準を、１：１の比率で混することによって、ヘテロ接合型標準を作成した。次に、これらの標準を、同等のゲノム濃度（約０．５６ｆｇ／μＬ）に希釈し、実際のヒトの試料とともにＳＨＥＲＬＯＣＫの入力として使用した。
腫瘍変異無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出
実際の患者のｃｆＤＮＡ試料をシミュレートする模擬ｃｆＤＮＡ標準を、市販業者（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｇｒｏｕｐ）から購入した。これらの標準は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ及びＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ変異体の両方について、４つの対立遺伝子画分（１００％ＷＴ及び０．１％、１％、及び５％変異体）として提供された。これらの標準の３μＬを、ＳＨＥＲＬＯＣＫへの入力として提供した。
蛍光データの分析
バックグラウンドを差し引いた蛍光データを計算するために、試料の第１の蛍光を差し引いて、異なる条件間の比較を可能にした。バックグラウンド条件（入力なしまたはｃｒＲＮＡ条件なし）の蛍光を試料から差し引いて、バックグラウンドを差し引いた蛍光を生成した。
ＳＮＰまたは系統の識別のためのガイド比を、各ガイドをガイド値の合計で除すことによって算出して、試料間の全体的な変動を調整した。以下のように、試料間の全体的な変動を調整するために、ＳＮＰまたは系統の識別のためのｃｒＲＮＡ比を計算した：
Figure 2021511795
ここで、Ａｉ及びＢｉは、所定の個体の対立遺伝子Ａまたは対立遺伝子Ｂをそれぞれ検知する、ｃｒＲＮＡの技術的な複製ｉのＳＨＥＲＬＯＣＫ強度値を指す。通常、アッセイには、ｃｒＲＮＡごとに４つの技術的な複製があるため、ｍ及びｎは４に等しく、分母は所定のＳＮＰ遺伝子座及び個体の８つのｃｒＲＮＡ ＳＨＥＲＬＯＣＫ強度値全ての合計に相当する。２つのｃｒＲＮＡがあるため、個体の各ｃｒＲＮＡの平均ｃｒＲＮＡ比率は、常に合計２になる。したがって、ホモ接合性の理想的な事例では、陽性対立遺伝子ｃｒＲＮＡの平均ｃｒＲＮＡ比は２になり、陰性対立遺伝子ｃｒＲＮＡの平均ｃｒＲＮＡ比はゼロになる。ヘテロ接合性の理想的な場合には、２つのｃｒＲＮＡのそれぞれの平均ｃｒＲＮＡ比は１になる。
ＬｗＣａｓ１３ａの切断要件の特徴付け。
プロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）は、Ｃａｓ１３ａによるロバストなリボヌクレアーゼ活性に必要とされる標的部位の近くに存在する特定のモチーフである。ＰＦＳは、標的部位の３’末端に位置しており、以前はＨ（Ｇではなく）として本発明者らのグループによってＬｓｈＣａｓ１３ａに対して特徴付けされていた（１）。このモチーフはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、クラス２系を標的とするＤＮＡの配列制限に似ているが、内因性の系でのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の自己標的化の防止には関与しないため、機能的に異なる。Ｃａｓ１３ａの将来の構造研究により、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ標的複合体形成及び切断活性に対するＰＦＳの重要性が明らかになる可能性が高い。
出願人は、Ｅ．ｃｏｌｉ（図２Ｄ〜Ｅ）から組換えＬｗＣａｓ１３ａタンパク質を精製し、各可能性のあるプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）ヌクレオチド（Ａ、Ｕ、ＣまたはＧ）で１７３ｎｔ ｓｓＲＮＡを切断するその能力をアッセイした。（図２Ｆ）。ＬｓｈＣａｓ１３ａと同様に、ＬｗＣａｓ１３ａは、Ａ、Ｕ、またはＣのＰＦＳで標的を強力に切断可能であり、Ｇ ＰＦＳのｓｓＲＮＡでの活性はより低くなる。Ｇ ＰＦＳではｓｓＲＮＡ１に対してより弱い活性が見られるが、Ｇ ＰＦＳモチーフでは２つの標的部位のロバストな検出が依然として見られる（表３；ｒｓ６０１３３８ ｃｒＲＮＡ及びジカの標的化ｃｒＲＮＡ ２）。Ｈ ＰＦＳは、あらゆる状況で必要とされるわけではない可能性が高く、多くの場合、Ｇ ＰＦＳで強力な切断またはコラテラル活性が達成され得る。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）及びその他の等温増幅戦略についての考察。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、３つの必須酵素、すなわちリコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ類）、及び鎖置換ポリメラーゼからなる等温増幅技術である。ＲＰＡは、酵素が全て３７℃前後の一定温度で動作するため、温度調節を必要としないことにより、他の増幅戦略、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に存在する多くの技術的困難を克服する。ＲＰＡは、二本鎖鋳型の全体的な溶解及びプライマーアニーリングの温度サイクルを、インビボのＤＮＡ複製及び修復からヒントを得た酵素的アプローチに置き換える。リコンビナーゼ−プライマー複合体は、二本鎖ＤＮＡをスキャンし、相補的な部位での鎖交換を促進する。鎖の交換はＳＳＢによって安定化され、プライマーが結合したままになる。リコンビナーゼの自発的な分解は、そのＡＤＰ結合状態で発生し、鎖置換型ポリメラーゼがプライマーに侵入して伸長することを可能にし、ポイントオブケア及びフィールド設定で利用できない複雑な機器なしで増幅を可能にする。３７〜４２℃の温度範囲でこのプロセスを周期的に繰り返すと、指数関数的にＤＮＡが増幅される。公開された元の製剤では、鎖置換ポリメラーゼとしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ Ｉ（Ｂｓｕ）を、リコンビナーゼとしてＴ４ ｕｖｓＸを、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としてＴ４ ｇｐ３２を使用している（２）が、この研究で使用されたＴｗｉｓｔＤｘによって販売されている現在の製剤に何の成分があるかは不明確である。
さらに、ＲＰＡには多くの制限がある：
１）Ｃａｓ１３ａの検出は定量的であるが（図１５）、リコンビナーゼが利用可能な全てのＡＴＰを使用すると、リアルタイムＲＰＡは急速に飽和するため、リアルタイムのＲＰＡ定量は困難な場合がある。リアルタイムＰＣＲは増幅をサイクルする能力のため定量的であるが、ＲＰＡには増幅率を厳密に制御する機序がない。利用可能なマグネシウムまたはプライマー濃度の低下、反応温度の低下、または非効率的なプライマーの設計など、ある特定の調整を行って増幅速度を低下させてもよい。図３１、３２、及び５２などの定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫのいくつかの事例が観察されるが、常にそうであるとは限らず、鋳型によって異なる場合がある。
２）ＲＰＡ効率はプライマー設計に影響され得る。製造業者は通常、平均ＧＣ含有量（４０−６０％）で効率的なリコンビナーゼ結合を確保するために長いプライマーを設計すること、及び高感度のプライマー対を見つけるために最大１００のプライマー対をスクリーニングすることを推奨している。ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して、単一分子の感度でのアトモルの試験を達成するには、設計するプライマー対は２つだけでよいことが出願人には判明した。このロバストネスは、アンプリコン増幅の非効率性を相殺する、構成的に活性なＣａｓ１３ａコラテラル活性によるシグナルの追加の増幅に起因する可能性がある。この品質は、図３４の本発明者らの細菌病原体の同定にとって特に重要である。ＲＰＡに関与する融解ステップがないため、細菌ゲノムの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子部位などの高度に構造化された領域の増幅で問題が発生した。したがって、プライマーの二次構造が問題になり、増幅効率、したがって感度が制限される。本明細書に開示されている実施形態は、これらのＲＰＡ特有の問題にもかかわらず、Ｃａｓ１３ａからの追加のシグナル増幅という理由で成功すると考えられた。
３）効率的なＲＰＡを実現するには、増幅配列の長さが短い（１００〜２００ｂｐ）必要がある。ほとんどの適用では、これは重大な問題ではなく、おそらくさらに有利である（例えば、平均断片サイズが１６０ｂｐのｃｆＤＮＡ検出）。例えば、細菌の検出にユニバーサルプライマーが必要で、識別用のＳＮＰが広い領域に分散している場合など、大きいアンプリコンの長さが重要な場合がある。
ＳＨＥＲＬＯＣＫのモジュール性によって、任意の増幅技術、非等温アプローチでさえ、Ｔ７転写及びＣａｓ１３ａ検出の前に使用することが可能になる。このモジュール性は、単一の反応におけるＴ７及びＣａｓ１３ａステップの互換性によって可能になり、Ｔ７プロモーターを有する任意の増幅ＤＮＡ入力で検出を実行することを可能にする。ＲＰＡを使用する前に、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（３、４）を検出アッセイで試みた（図１０）。しかし、ＮＡＳＢＡは、Ｃａｓ１３ａの感度を大幅に改善しなかった（図１１及び５３）。検出前に使用し得るその他の増幅技術には、ＰＣＲ、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（５）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（６）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（７）、及びニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）（８）が挙げられる。等温技術を交換する能力により、ＳＨＥＲＬＯＣＫが任意の１つの増幅技術の特定の制限を克服することが可能になる。
操作されたミスマッチの設計。
出願人は、標的：ｃｒＲＮＡ二本鎖に２つ以上のミスマッチがある場合、ＬｓｈＣａｓ１３ａ標的切断が減少したが、単一のミスマッチにより比較的影響を受けないことを示し、これは出願人がＬｗＣａｓ１３ａコラテラル切断について確認した観察である（図３６Ａ）。ｃｒＲＮＡスペーサー配列に追加の変異を導入することにより、追加のミスマッチ（合計２つのミスマッチ）を有する標的に対するコラテラルの切断を不安定化し、一方で単一のミスマッチのみが存在するため、オン標的のコラテラル切断を保持すると仮定した。特異性の増大を操作する可能性を試験するために、ｓｓＲＮＡ１を標的とする複数のｃｒＲＮＡを設計し、ｃｒＲＮＡの長さ全体にミスマッチを含め（図３６Ａ）、オン標的コラテラル切断を最適化し、単一のミスマッチによって異なる標的のコラテラル切断を最小限に抑えた。これらのミスマッチはｓｓＲＮＡ１のコラテラル切断を減少させなかったが、追加のミスマッチ（ｓｓＲＮＡ２）を含む標的のシグナルが有意に減少したことが観察された。ｓｓＲＮＡ１と２との間を最もよく区別する設計されたｃｒＲＮＡには、ｓｓＲＮＡ２ミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれ、事実上ハイブリダイズしたＲＮＡに「バブル」または歪みが生じた。合成ミスマッチと標的に存在する追加のミスマッチ（すなわち、二重ミスマッチ）の調整によって引き起こされる感度の低下は、連続的または近傍のダブルミスマッチに対するＬｓｈＣａｓ１３ａ及びＬｗＣａｓ１３ａの感度と一致し、単一ヌクレオチドの識別を可能にするｃｒＲＮＡの合理的な設計の基礎を示す（図３６Ｂ）。
ＺＩＫＶ株とＤＥＮＶ株とのミスマッチ検出では、本発明者らの全長のｃｒＲＮＡに２つのミスマッチが含まれていた（図３７Ａ、Ｂ）。菌株間の配列の相違が大きいため、２つのゲノム間で１ヌクレオチドの相違しかない２８ｎｔの連続ストレッチを見つけ得なかった。しかし、出願人はより短いｃｒＲＮＡが依然として機能することを予測し、スペーサー配列に合成ミスマッチを含み、標的配列に１つのみミスマッチを含む２つのＺＩＫＶ株の標的に対して、より短い２３ｎｔ ｃｒＲＮＡを設計した。これらのｃｒＲＮＡは、依然としてアフリカとアメリカのＺＩＫＶ株を区別し得た（図３６Ｃ）。２３ｎｔ及び２０ｎｔのｃｒＲＮＡのその後の試験によって、スペーサー長の減少が活性を減少させるが、単一のミスマッチを区別する能力を維持または強化することが示されている（図５７Ａ〜Ｇ）。単一ヌクレオチド変異の識別を容易にするために合成ミスマッチを導入し得る方法をよりよく理解するために、スペーサーの第１の７つの位置にわたって合成ミスマッチを３つの異なるスペーサー長（２８、２３、及び２０ｎｔ）で並べた（図５７Ａ）。３番目の位置に変異がある標的では、ＬｗＣａｓ１３ａは、スペーサーの位置５に合成ミスマッチがある場合に最大の特異性を示すが、より低いレベルのオン標的活性ではあるが、短いスペーサー長では特異性が向上する（図５７Ｂ〜Ｇ）。出願人は、また、標的の変異を３〜６の位置にシフトし、変異周辺のスペーサーの合成ミスマッチを並べた（図５８）。
合成標準を使用したＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定。
ＳＮＰ遺伝子座のＰＣＲ増幅から作成された合成標準の評価により、遺伝子型の正確な同定が可能になる（図６０Ａ、Ｂ）。個体の試料のＳＨＥＲＬＯＣＫ結果と合成標準間の全ての比較を計算することにより（分散分析）、最も類似したＳＨＥＲＬＯＣＫ検出強度を有する合成標準を見つけることによって、各個体の遺伝子型を特定し得る（図６０Ｃ、Ｄ）。このＳＨＥＲＬＯＣＫ遺伝子型決定アプローチは、任意のＳＮＰ遺伝子座に一般化され得る（図６０Ｅ）。
ＳＨＥＲＬＯＣＫは、手頃な価格で適応性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘプラットフォームである。
ＳＨＥＲＬＯＣＫの費用分析のために、無視し得る費用であると決定された試薬は省略し、ｃｒＲＮＡの合成のためのＤＮＡ鋳型、ＲＰＡで使用されるプライマー、一般的な緩衝液（ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、グリセロール、ＮａＣｌ、ＤＴＴ）、ガラスマイクロファイバー濾紙、及びＲＮＡｓｅｃｕｒｅ試薬を含めた。ＤＮＡ鋳型の場合、ＩＤＴからのウルトラマー合成は、４０のインビトロ転写反応（各約１０，０００反応に十分）の材料を約７０ドルで提供し、ｃｒＲＮＡ合成に追加されるコストはごくわずかである。ＲＰＡプライマーの場合、３０ｎｔのＤＮＡプライマーの２５ｎモルのＩＤＴ合成を、約１０ドルで購入し得、５０００ ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応に十分な材料が提供される。ガラスマイクロファイバーペーパーは０．５０ドル／シートで入手可能で、数百のＳＨＥＲＬＯＣＫ反応に十分である。４％のＲＮＡｓｅｃｕｒｅ試薬のコストは７．２０ドル／ｍＬで、５００の試験に十分である。
さらに、ペーパーベースのアッセイを除く全ての実験について、０．０３６ドル／反応という費用で、３８４ウェルプレートを使用した（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５４４）。無視し得るコストのため、これは全体的なコスト分析には含まれていない。さらに、ＳＨＥＲＬＯＣＫ−ＰＯＣは、ペーパーの上で簡単に実行し得るため、プラスチック容器を使用する必要はない。本明細書で使用したＳＨＥＲＬＯＣＫの読み取り方法は、フィルターセットまたはモノクロメーターのいずれかを備えたプレートリーダーであった。設備投資として、リーダーの費用は計算に含まれておらず、これは、機器で実行される反応が増えるとコストが急激に減少し無視し得るほどであるためである。ＰＯＣ適用では、ハンドヘルド分光光度計（９）またはポータブル電子リーダー（４）など、より安価でポータブルな代替品を使用してもよく、これにより、計測の費用が２００ドル未満に削減される。これらの携帯性の高いソリューションは、かさばる機器と比較して、速度及び読み取りの容易さを低下させるが、より幅広い用途を可能にする。
結果
本明細書に記載されるアッセイ及び系は、一般に、増幅及び検出の２段階プロセスをさらに含んでもよい。第１のステップでは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの核酸試料が、例えば等温増幅によって増幅される。第２のステップの間、増幅されたＤＮＡをＲＮＡに転写し、その後ＣＲＩＳＰＲエフェクター、例えば、Ｃ２ｃ２及びプログラムされたｃｒＲＮＡとインキュベートされて、標的核酸配列の存在を検出する。検出を可能にするために、消光されたフルオロフォアで標識されたレポーターＲＮＡを反応に追加する。レポーターＲＮＡのコラテラル切断により、フルオロフォアが消光しなくなり、核酸標的のリアルタイム検出が可能になる（図１７Ａ）。
ロバストなシグナル検出を達成するために、Ｃ２ｃ２のオルソログを生物体Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（ＬｗＣ２ｃ２）から同定し、評価した。ＬｗＣ２ｃ２タンパク質の活性は、合成ＣＲＩＳＰＲアレイと共にＥ．ｃｏｌｉで発現させ、それをプログラミングしてベータ−ラクタマーゼｍＲＮＡ内の標的部位を切断し、アンピシリン選択下で細菌を死滅させることによって評価した（図２Ｂ）。ＬｗＣ２ｃ２遺伝子座では、ＬｓｈＣ２ｃ２遺伝子座よりも生存しているＥ．ｃｏｌｉコロニーの数が少なく、これによってＬｗＣ２ｃ２オルソログの切断活性が高いことが実証された（図２Ｃ）。次いで、ヒトコドン最適化ＬｗＣ２ｃ２タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（図２Ｄ〜Ｅ）から精製し、１７３ｎｔのｓｓＲＮＡを切断するその能力を、異なるプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）ヌクレオチドでアッセイした（図２Ｆ）。ＬｗＣ２ｃ２は、可能な４つのＰＦＳ標的のそれぞれを切断し得、Ｇ ＰＦＳを使用したｓｓＲＮＡでの活性はわずかに低かった。
ＬｗＣ２ｃ２ ＲＮａｓｅコラテラル活性のリアルタイム測定は、市販のＲＮＡ蛍光プレートリーダーを使用して測定した（図１７Ａ）。ＬｗＣ２ｃ２活性のベースライン感度を決定するために、ＬｗＣ２ｃ２を、ｓｓＲＮＡ標的１（ｓｓＲＮＡ１）及びｓｓＲＮＡ標的内の部位に相補的なｃｒＲＮＡと共に、ＲＮＡセンサープローブと共にインキュベートした（図１８）。これにより、約５０ｆＭの感度が得られ（図２７Ａ）、これは、他の最近の核酸検出技術（Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）よりは感度が高いが、フェムトモルより低い検出性能を必要とする多くの診断適用には十分な感度ではない。（Ｂａｒｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｅｍｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｒｉｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
感度を上げるために、ＬｗＣ２ｃ２とのインキュベーションの前に等温増幅ステップを追加した。ＬｗＣ２ｃ２媒介の検出と、以前に使用された等温増幅アプローチ、例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１；Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を組み合わせると、感度がある程度向上した（図１１）。代替の等温増幅アプローチである、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）を試験し、これは、２時間以内にＤＮＡを指数関数的に増幅するために使用され得る。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをＲＰＡプライマーに追加することにより、増幅されたＤＮＡをＲＮＡに変換し、その後ＬｗＣ２ｃ２で検出し得る（図１７）。したがって、ある特定の例示的な実施形態では、アッセイは、ＲＰＡによる増幅、ＤＮＡのＲＮＡへのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変換、及び消光したレポーターからの蛍光のＣ２ｃ２アンロックによるＲＮＡのその後の検出の組み合わせを含む。
ｓｓＲＮＡ１の合成されたＤＮＡバージョンについての例示的な方法を使用して、１反応あたり１〜１０分子の範囲のアトモル感度を達成することが可能であった（図２７Ｂ、左）。検出の精度を検証するために、入力ＤＮＡの濃度をデジタルドロップレットＰＣＲで確認し、検出可能な最低の標的濃度（２ａＭ）が１マイクロリットルあたり１分子の濃度であることを確認した。逆転写ステップを追加することで、ＲＰＡはＲＮＡをｄｓＤＮＡフォームに増幅することも可能で、出願人は、ｓｓＲＮＡ１でアトモル感度を達成することが可能になる（２７Ｂ、右）。同様に、ＲＮＡ標的の濃度は、デジタルドロップレットＰＣＲによって確認された。ＰＯＣ診断テストとして機能する例示的な方法の実行可能性を評価するために、全ての構成要素（ＲＰＡ、Ｔ７ポリメラーゼ増幅、及びＬｗＣ２ｃ２検出）が単一の反応で機能する能力を試験し、アッセイのワンポットバージョンでのアトモル感度を確認した（図２２）。
このアッセイでは、液体中またはペーパー上での高感度なウイルス検出が可能である。
次に、アッセイが、高感度を必要とし、携帯型診断から利益を得ることが可能な感染症の適用において有効であるかが決定された。モデル系での検出を試験するために、ジカウイルスゲノムのＲＮＡ断片と関連するフラビウイルスデング熱（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を保持するレンチウイルスを作製し、ウイルス粒子の数を定量化した（図３１Ａ）。偽ウイルスのレベルは２ａＭまで検出された。同時に、ジカとデング熱ＲＮＡ断片を含むこれらのプロキシウイルスを明確に区別することも可能であった（図３１Ｂ）。アッセイが凍結乾燥に適合して流通のコールドチェーンへの依存を取り除くかを決定するために、反応成分を凍結乾燥した。試料を使用して凍結乾燥した成分を再水和した後、２０ｆＭのｓｓＲＮＡ１を検出した（図３３Ａ）。リソース不足及びＰＯＣ設定は、使いやすさのためにペーパーの試験から恩恵を受けるので、ガラス繊維ペーパーでのＣ２ｃ２検出の活性も評価され、ペーパー点在のＣ２ｃ２反応が標的検出が可能であることがわかった（図３３Ｂ）。組み合わせて、凍結乾燥及びペーパースポッティングすると、Ｃ２ｃ２検出反応はｓｓＲＮＡ１を高感度で検出した（図３３Ｃ）。溶液中のＬｗＣ２ｃ２と凍結乾燥ＬｗＣ２ｃ２との間の合成ジカウイルスＲＮＡ断片の検出でも同様のレベルの感度が観察され、凍結乾燥ＳＨＥＲＬＯＣＫのロバストネス及び迅速なＰＯＣジカウイルス診断の可能性が実証された（図３３Ｄ〜Ｅ）。この目的のために、アッセイのＰＯＣバリアントの能力を試験して、ジカＲＮＡをデングＲＮＡから区別する能力を決定した（図３１Ｃ）。ペーパースポッティング及び凍結乾燥により、読み取り値の絶対シグナルがわずかに減少したが、このアッセイはそれでも、デング制御配列によるモックウイルスの検出と比較して、２０ａＭ程度の低い濃度でニセのジカウイルスを有意に検出した（図３１Ｄ）。
ヒトでのジカウイルスＲＮＡレベルは、患者の唾液では３×１０６コピー／ｍＬ（４．９ｆＭ）、及び患者の血清では７．２×１０５コピー／ｍＬ（１．２ｆＭ）程度に低いことが報告されている（Ｂａｒｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｇｏｕｒｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。得られた患者の試料から、１．２５×１０３コピー／ｍＬ（２．１ａＭ）という低い濃度が観察された。アッセイが低力価の臨床分離株のジカウイルス検出が可能かを評価するために、ウイルスＲＮＡを患者から抽出し、逆転写し、得られたｃＤＮＡをアッセイの入力として使用した（図３２Ａ）。ジカヒト血清試料の有意な検出は、１．２５コピー／μＬ（２．１ａＭ）まで低い濃度で観察された（図３２Ｂ）。さらに、患者試料からのシグナルは、ジカウイルスＲＮＡコピー数を予測するものであり、ウイルス負荷の予測に使用できた（図３１Ｆ）。核酸精製が利用できない疾患の状況に対する幅広い適用性を試験するために、ヒト血清にスパイクされたｓｓＲＮＡ１の検出を試験し、アッセイが２％未満の血清レベルで活性化されることが確認された（図３３Ｇ）。
細菌の病原体の区別及び遺伝子の区別
このアッセイが細菌病原体を区別するために使用し得るかを決定するために、保存された隣接領域がユニバーサルＲＰＡプライマーを細菌種全体で使用することを可能にし、可変内部領域が種の分化を可能にするので、１６Ｓ Ｖ３領域を第１の標的として選択した。病原性株及び単離されたＥ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｇＤＮＡのために５つの可能な標的化ｃｒＲＮＡのパネルを設計した（図３４Ａ）。このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｇＤＮＡを区別し得、他の種のｃｒＲＮＡのバックグラウンドシグナルが低いことを示した（図３４Ａ、Ｂ）。
アッセイはまた、抗生物質耐性遺伝子などの目的の細菌遺伝子を迅速に検出及び区別するように適合してもよい。カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）は、重要な新たな公衆衛生上の課題である（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。カルバペネム耐性遺伝子を検出するアッセイの能力を評価し、この試験で異なるカルバペネム耐性遺伝子を区別し得るかを評価した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）またはニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ１（ＮＤＭ−１）耐性遺伝子のいずれかを保有する臨床分離株から得られ、遺伝子間を区別するためにｃｒＲＮＡを設計した。全てのＣＲＥは、これらの耐性遺伝子を欠く細菌に対して有意なシグナルを示し（図３５Ａ）、耐性のＫＰＣ株とＮＤＭ−１株との間を有意に区別し得た（図３５Ｂ）。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅの単一塩基ミスマッチ特異性
ＬｓｈＣ２ｃ２などのある特定のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅオルソログは、単一塩基のミスマッチを容易に区別できないことが示されている。（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本明細書に実証されているように、ＬｗＣ２ｃ２もこの特徴を共有している（図３７Ａ）。ＬｗＣ２ｃ２切断の特異性を高めるために、ｃｒＲＮＡ：標的二重鎖に合成ミスマッチを導入するための系を開発し、ミスマッチに対する全体的な感度を高め、単一塩基のミスマッチ感度を可能にした。標的１の複数のｃｒＲＮＡを設計し、ｃｒＲＮＡの長さ全体にわたってミスマッチを含め（図３７Ａ）、オン標的切断を最適化し、単一のミスマッチが異なる標的の切断が最小限に抑えるようにした。これらのミスマッチは、ｓｓＲＮＡ標的１の切断効率を低下させず、追加のミスマッチを含む標的（ｓｓＲＮＡ標的２）のシグナルを有意に減少させた。標的１と２を最もよく区別する設計されたｃｒＲＮＡには、標的２のミスマッチに近い合成ミスマッチが含まれており、実質的に「バブル」が生じていた。標的に存在する合成ミスマッチ及び追加のミスマッチ（すなわち、ダブルミスマッチ）の調整によって引き起こされる感度の損失は、連続または近くのダブルミスマッチに対するＬｓｈＣ２ｃ２の感度と一致し（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、単一ヌクレオチドの区別を可能にするｃｒＲＮＡの合理的な設計のためのフォーマットを示す（図３７Ｂ）。
Ｃ２ｃ２が一塩基ミスマッチを認識するように操作され得ることを実証したので、この操作された特異性を使用して、密接に関連するウイルス病原体を区別し得るかを決定した。複数のｃｒＲＮＡを、アフリカまたはアメリカのジカウイルス株（図３７Ａ）及びデングウイルスの１または３株（図３７Ｃ）のいずれかを検出するように設計した。これらのｃｒＲＮＡは、スペーサー配列に合成ミスマッチを含んでおり、この合成ミスマッチが原因でオン標的の株に二重化されたときに単一のバブルを形成した。しかし、合成ミスマッチスペーサーがオフ標的株に二重化される場合、合成ミスマッチとＳＮＰミスマッチが原因で２つの気泡が形成される。合成ミスマッチｃｒＲＮＡは、オフ標的の株よりも有意に高いシグナルでそれらの対応する株を検出し、ロバストな株の区別を可能にした（図３７Ｂ、３７Ｄ）。菌株間の大幅な配列類似性に起因して、真の単一ヌクレオチド株の区別を実証するために、２つのゲノム間に単一ヌクレオチドの相違のみがある２８ｎｔの連続ストレッチを見つけることは不可能であった。しかし、ＬｓｈＣ２ｃ２（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）と同様に、より短いｃｒＲＮＡでも機能することが予測され、それに応じて、スペーサー配列に合成ミスマッチを、及び標的配列にミスマッチを１つだけ含む、２つのジカ株の標的に対して、より短い２３ｎｔ ｃｒＲＮＡを設計した。これらのｃｒＲＮＡは依然として、高感度でアフリカとアメリカのジカ株を区別し得た（図３６Ｃ）。
唾液から精製されたＤＮＡを使用した迅速な遺伝子型決定
ヒト唾液からの迅速な遺伝子型決定は、緊急の薬理ゲノム状況において、または在宅診断のために有用であり得る。本明細書に開示される実施形態の遺伝子型決定の可能性を実証するために、５つの遺伝子座を選択して、２３ａｎｄＭｅ遺伝子型決定データをゴールドスタンダードとして使用してＣ２ｃ２検出を基準に応じて評価した（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（図３８Ａ）。５つの遺伝子座は、スタチンまたはアセトアミノフェンなどの薬物に対する感受性、ノロウイルス感受性、及び心疾患のリスクを含む、広範な機能的関連にまたがっている（表１５）。
Figure 2021511795
４人のヒト対象から唾液を収集し、簡単な市販のキットを使用して１時間未満でゲノムＤＮＡを精製した。４人の対象は、５つの遺伝子座にわたって遺伝子型の多様なセットを持っており、遺伝子型決定のアッセイを基準により評価する十分に広い試料スペースが得られた。５つのＳＮＰ遺伝子座のそれぞれについて、ＲＰＡと適切なプライマーを使用して対象のゲノムＤＮＡを増幅した後、ＬｗＣ２ｃ２及びｃｒＲＮＡ対（２つの可能な対立遺伝子の１つを特異的に検出するように設計された）で検出した（図３８Ｂ）。アッセイは、高い有意性で対立遺伝子を区別し、ホモ接合型とヘテロ接合型の両方の遺伝子型を推定するのに十分に特異的であった。検出前に唾液でＤＮＡ抽出プロトコルが実行されたので、このアッセイを試験して、９５℃に加熱された唾液を５分間加熱して、それ以上抽出することなくＰＯＣ遺伝子型決定をさらに実施し得るかを判断した。このアッセイは、唾液を５分間のみ加熱し、その後増幅及びＣ２ｃ２検出が行われた２人の患者の遺伝子型を正しく決定し得た（図４０Ｂ）。
低対立遺伝子画分におけるｃｆＤＮＡのがん性変異の検出
アッセイは標的の単一ヌクレオチドの違いに対して高度に特異的であるため、アッセイが無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のがん変異を検出するのに十分な感度であるかを判断するための試験を考案した。ｃｆＤＮＡ断片は、野生型ｃｆＤＮＡ画分のわずかな割合（０．１％〜５％）である（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｏｌｍｅｄｉｌｌａｓ Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ｃｆＤＮＡ分野での重要な課題は、これらの変異を検出することである。なぜなら、これらの変異は、血液中のバックグラウンドで高レベルの非変異ＤＮＡが検出されるため、通常、発見が難しいためである（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＰＯＣでのｃｆＤＮＡがん試験は、がんの存在の定期的なスクリーニング、特に寛解についてリスクがある患者のスクリーニングにも役立つ。
野生型バックグラウンドで変異体ＤＮＡを検出するアッセイの能力は、ｃｒＲＮＡ標的部位に単一変異を有するｓｓＤＮＡ１のバックグラウンドでｄｓＤＮＡ標的１を希釈することにより決定された（図４１Ａ〜Ｂ）。ＬｗＣ２ｃ２は、ｄｓＤＮＡ１をバックグラウンドｄｓＤＮＡの０．１％の低レベルまで、及びｄｓＤＮＡ１のアトモル濃度内で検知できた。この結果により、バックグラウンド変異体ｄｓＤＮＡ１のＬｗＣ２ｃ２切断が、０．１％の対立遺伝子画分でオン標的のｄｓＤＮＡを確実に検出し得るのに十分低いことが示されている。０．１％未満のレベルでは、バックグラウンド活性が問題である可能性が高く、正しい標的をさらに大幅に検出することを妨げる。
アッセイは、臨床的に適切な範囲の対立遺伝子画分を有する合成標的を検知し得たので、このアッセイがｃｆＤＮＡにおけるがん変異を検出し得るかを評価した。ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅという２つの異なるがん変異に対するＲＰＡプライマーを設計し、実際のヒトｃｆＤＮＡ試料に似た、５％、１％、及び０．１％という対立遺伝子画分を用いて市販のｃｆＤＮＡ標準を用いて試験した。変異体対立遺伝子を野生型対立遺伝子から区別し得る一対のｃｒＲＮＡを使用して（図３８Ｃ）、両方の突然変異遺伝子座について０．１％対立遺伝子画分の検出を達成した（図３９Ａ〜Ｂ）。
考察
Ｃ２ｃ２の天然特性を、等温増幅及び消光蛍光プローブと組み合わせることにより、本明細書に開示されるアッセイ及び系は、ＲＮＡ及びＤＮＡを検出するための多目的でロバストな方法として実証され、感染性疾患適用及び迅速な遺伝子型決定を含む様々な迅速診断に適している。本明細書に開示されているアッセイ及び系の主な利点は、新しいＰＯＣ試験を１試験あたりわずか０．６ドルで数日で再設計及び合成し得るということである。
多くのヒト疾患の適用は、単一のミスマッチを検出する能力を必要とするため、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に合成ミスマッチを導入することにより、ｃｒＲＮＡを標的配列の単一のミスマッチに高度に特異的に操作するための合理的なアプローチを開発した。ＣＲＩＳＰＲエフェクターで特異性を達成するための他のアプローチは、何十ものガイド設計のスクリーニングベースの方法に依存している（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。設計されたミスマッチｃｒＲＮＡを使用して、単一のミスマッチ、ヒト唾液ｇＤＮＡからのＳＮＰの迅速な遺伝子型決定、及びｃｆＤＮＡ試料でのがん変異の検出が異なる、現場でのジカ及びデング熱ウイルス株の識別が実証された。
アッセイプラットフォームの低コスト及び適応性により、（ｉ）Ｔａｑｍａｎなどの特定のｑＰＣＲアッセイの代わりの一般的なＲＮＡ／ＤＮＡ定量化経験、（ｉｉ）マイクロアレイに似た迅速な多重化ＲＮＡ発現検出、及び（ｉｉｉ）食品中の他の発生源からの核酸汚染の検出など、他の高感度検出適用を含む、さらなる適用に向く。さらに、Ｃ２ｃ２は、細胞などの生物学的設定内での転写産物の検出に潜在的に使用してもよく、Ｃ２ｃ２検出の非常に特異的な性質を考えれば、転写産物の対立遺伝子特異的発現または生細胞における疾患関連変異を追跡することが可能であり得る。アプタマーの幅広い利用可能性により、アプタマーによるタンパク質の検出を、ＲＰＡの潜在的な増幅部位の解明とそれに続くＣ２ｃ２検出と組み合わせることにより、タンパク質を検知することも可能であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出：アトモル感度と単一ヌクレオチド特異性
ロバストなシグナル検出を実現するために、出願人は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（ＬｗＣａｓ１３ａ）由来のＣａｓ１３ａのオルソログを特定した。これは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）（１０）と比較してより大きなＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅ活性を示す（図２、上記の「ＬｗＣａｓ１３ａの切断要件の特徴付け」も参照のこと）。ｓｓＲＮＡ標的１（ｓｓＲＮＡ１）、ｃｒＲＮＡ、及びレポーター（消光された蛍光ＲＮＡ）とインキュベートされたＬｗＣａｓ１３ａは（図１８）（１３）、検出感度が約５０ｆＭ（図５１、１５）であり、多くの診断適用に感度十分ではない（１２、１４〜１６）。したがって、出願人は、Ｃａｓ１３ａベースの検出を、さまざまな等温増幅ステップと組み合わせることを検討した（図１０、１１、５３、１６）（１７、１８）。検討された方法のうち、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（１８）が最大の感度をもたらし、Ｔ７転写と組み合わせて、増幅されたＤＮＡをＲＮＡに変換し、ＬｗＣａｓ１３ａによるその後の検出に使用し得る（上記の「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）及びその他の等温増幅戦略についての考察」も参照のこと）。出願人は、ＲＰＡによる増幅、増幅されたＤＮＡからＲＮＡへのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写、ならびにＣａｓ１３ａコラテラルＲＮＡ切断媒介性のレポーターシグナルの放出による標的ＲＮＡの検出のこの組み合わせをＳＨＥＲＬＯＣＫと呼ぶ。
ＲＮＡ（逆転写と組み合わせた場合）またはＤＮＡ標的の検出のためのＳＨＥＲＬＯＣＫの感度を、出願人は最初に決定した。デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって確認されたように、ＲＮＡとＤＮＡの両方で単一分子の感度を達成した（図２７、５１、５４Ａ、Ｂ）。単一の反応で全てのＳＨＥＲＬＯＣＫ構成要素を組み合わせると、アトモル感度が維持され、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断としてこのプラットフォームの実行可能性が実証された（図５４Ｃ）。ＲＰＡだけでは低レベルの標的を検出するのに十分な感度がなかったのに対し、ＳＨＥＲＬＯＣＫには、２つの確立された高感度な核酸検出アプローチであるｄｄＰＣＲ及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と同様の感度レベルがあり、（図５５Ａ〜Ｄ）。さらに、複製全体の変動係数で測定すると、ＳＨＥＲＬＯＣＫでは、ｄｄＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＰＡよりも変動が少ないことが示される（図５５Ｅ〜Ｆ）。
次に、出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫが、高感度を必要とする感染症用途に有効であるかを調べた。出願人は、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）または関連フラビウイルスデング熱（ＤＥＮＶ）のいずれかのゲノム断片を保有するレンチウイルスを作製した（１９）（図３１Ａ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、２ａＭまで低いウイルス粒子を検出し、ＺＩＫＶとＤＥＮＶとの間を区別できた（図３１Ｂ）。現場でのＳＨＥＲＬＯＣＫの可能性のある使用を調査するために、出願人は、Ｃａｓ１３ａｃｒＲＮＡ複合体を凍結乾燥し、その後再水和（２０）すると、２０ｆＭの非増幅ｓｓＲＮＡ１を検出し得ること（図３３Ａ）、及びガラス繊維ペーパーでも標的検出が可能であることを最初に実証した（図。３３Ｂ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫの他の構成要素も凍結乾燥に適している：ＲＰＡは、大気温で凍結乾燥試薬として提供され、出願人は、Ｔ７ポリメラーゼが凍結乾燥に耐えることを以前に実証した（２）。Ｃａｓ１３ａ検出反応の凍結乾燥及びペーパースポッティングを組み合わせると、水性反応と同等レベルの感度でｓｓＲＮＡ１を検出し得る（図３３Ｃ〜Ｅ）。ペーパーのスポッティング及び凍結乾燥により、読み取りの絶対シグナルがわずかに減少したが、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（図３１Ｃ）は、２０ａＭ程度の低濃度の偽ＺＩＫＶウイルスを容易に検出できた（図３１Ｄ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、力価が２×１０３コピー／ｍＬ（３．２ａＭ）程度に低い臨床分離株（血清、尿、または唾液）でも、ＺＩＫＶを検出し得る（２１）。患者の血清または尿試料から抽出され、ｃＤＮＡに逆転写されたＺＩＫＶ ＲＮＡ（図３２Ｅ及び図５２Ａ）は、１．２５×１０３コピー／ｍＬ（２．１ａＭ）までの濃度で検出でき、ｑＰＣＲによって確認された（図３２Ｆ及び５２Ｂ）。さらに、患者試料からのシグナルは、ＺＩＫＶ ＲＮＡコピー数を予測するものであり、ウイルスロードの予測に使用され得る（図３３Ｆ）。核酸精製なしの試料検出をシミュレートするために、ヒト血清にスパイクされたｓｓＲＮＡ１の検出を測定し、Ｃａｓ１３ａが２％もの血清を含む反応でＲＮＡを検出し得ることを見出した（図３３Ｇ）。本明細書に開示される実施形態のもう１つの重要な疫学的適用は、細菌性病原体の特定及び特定の細菌性遺伝子の検出である。出願人は、保存された隣接領域がユニバーサルＲＰＡプライマーを、細菌種全体で使用可能にさせる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ３領域を標的とし、この可変内部領域は、種の分化を可能にする。異なる病原性菌株ならびにＥ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから分離されたｇＤＮＡの５つの可能な標的化ｃｒＲＮＡのパネル（図３４Ａ）では、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、菌株を正しく遺伝子型決定し、低い交差反応性を示した（図３４Ｂ）。さらに、出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して、以下の２つの異なる耐性遺伝子を有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床分離株を区別し得た：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペナマーゼ（ＫＰＣ）及びニューデリーメタロ−ベータ−ラクタマーゼ１（ＮＤＭ−１）（２２）（図５６）。
ＳＨＥＲＬＯＣＫの特異性を高めるために、出願人は、ＬｗＣａｓ１３ａが単一塩基のミスマッチによって異なる標的を区別し得る、ｃｒＲＮＡ：標的二重鎖に合成ミスマッチを導入した（図３６Ａ、Ｂ；上記「操作されたミスマッチの設計」も参照のこと）。出願人は、スペーサー配列に合成ミスマッチのある複数のｃｒＲＮＡを設計して、アフリカまたはアメリカのＺＩＫＶ株（図３７Ａ）及びＤＥＮＶの株１または３（図３７Ｃ）を検出した。合成ミスマッチｃｒＲＮＡは、オフ標的株よりも有意に高いシグナル（両側スチューデントｔ検定；ｐ＜０．０１）で対応する株を検出し、単一のミスマッチに基づいてロバストな株識別を可能にした（図３７Ｂ、Ｄ、３６Ｃ）。さらなる特徴付けにより、変異がスペーサーの３位にあり、合成ミスマッチが５位にある場合、Ｃａｓ１３ａ検出がオン標的感度を維持しながら最大の特異性を達成することが明らかになった（図５７及び５８）。単一塩基の相違を検出する能力により、ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して迅速な遺伝子型決定を行う機会が開かれる。健康関連の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（表１）の範囲にまたがる５つの遺伝子座を選択し、これらのＳＮＰのゴールドスタンダードとして２３ａｎｄＭｅ遺伝子型決定データを使用してＳＨＥＲＬＯＣＫ検出を基準に従って評価した（２３）（図３８Ａ）。目的の遺伝子座全体で多様な遺伝子型を有する４例のヒト対象から唾液を収集し、市販のカラム精製または５分間の直接加熱により、ゲノムＤＮＡを抽出した（２０）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ホモ接合型とヘテロ接合型の両方の遺伝子型を推定するのに高い有意性及び十分な特異性で対立遺伝子を識別した（図３８Ｂ、４０、５９、６０；上記の「合成標準を使用したＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定」も参照のこと）。最後に、ＳＨＥＲＬＯＣＫが無細胞（ｃｆ）ＤＮＡ画分で低頻度のがん変異を検出し得るか否かを調べたが、これは、患者の血液中の野生型ＤＮＡのレベルが高いせいで困難である（２４〜２６）。出願人は、最初に、ＳＨＥＲＬＯＣＫが、ゲノムＤＮＡのバックグラウンドで希釈されたアトモル濃度のｓｓＤＮＡ１を検出し得ることを見出した（図６１）。次に、ＳＨＥＲＬＯＣＫが一塩基多型（ＳＮＰ）を含む対立遺伝子（図４１Ａ、Ｂ）を、臨床的に関連する範囲であるバックグラウンドＤＮＡの０．１％という低いレベルでも検出し得ることも判明した。次に、ＳＨＥＲＬＯＣＫが０．１％という低い対立遺伝子画分を含むニセのｃｆＤＮＡ試料で、２つの異なるがん変異（ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ）を検出し得ることを示した（図３８、３９）（２０）。
ＳＨＥＲＬＯＣＫプラットフォームは、（ｉ）ＴａｑＭａｎなどの特定のｑＰＣＲアッセイの代わりの一般的なＲＮＡ／ＤＮＡ定量、（ｉｉ）迅速な多重ＲＮＡ発現検出、及び（ｉｉｉ）他の高感度検出用途、例えば、核酸混入の検出を含むさらなる用途に役立つ。さらに、Ｃａｓ１３ａは、潜在的に生物学的設定内の転写物を検出し、転写物の対立遺伝子特異的発現または生細胞における疾患関連変異を追跡し得る。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、感染症の適用及び敏感な遺伝子型決定などの迅速な診断に適している、ＲＮＡ及びＤＮＡを検出するための多用途でロバストな方法であることを示した。試験されたほとんどあらゆるｃｒＲＮＡが高い感度及び特異性になったので、ＳＨＥＲＬＯＣＫペーパー試験は、１試験あたりわずか０．６１ドルで、信頼性をもって、数日で再設計及び合成され得る（上記の「ＳＨＥＲＬＯＣＫは、手頃な価格で適応性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘプラットフォームである」も参照のこと）。これらの品質によって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘの力が際立ち、生物学的分子の迅速でロバストで高感度な検出のための新しい道が開かれる。
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実施例３−直交の塩基優先性によるＣａｓ１３ｂオルソログの特徴付け
出願人は、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的化酵素の最近定義されたＶＩ型 ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ｂファミリーの１４個のオルソログを生化学的に特徴付けて、ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出技術を改善するための新しい候補を見つけた（図８３Ａ及び８５）。出願人は、Ｅ．ｃｏｌｉで１４のＣａｓ１３ｂオルソログを異種発現し、タンパク質をインビトロ ＲＮａｓｅ活性アッセイのために精製し得た（図８６）。異なるＣａｓ１３オルソログは、最適な切断活性のためのさまざまな塩基優先性を有している可能性があるため、出願人は、直交切断優先性を評価するために５つのＡｓ、Ｇｓ、Ｃｓ、またはＵｓからなる蛍光ＲＮａｓｅホモポリマーセンサーを生成した。出願人は、各オルソログを、合成１７３ｎｔ ｓｓＲＮＡ １を標的とする同種のｃｒＲＮＡとインキュベートし、ホモポリマー蛍光センサーを使用してコラテラル切断活性を測定した（図８３Ｂ及び図８７）。
実施例４−ライブラリーを使用したモチーフ検出スクリーニング
様々なＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂオルソログの切断優先の多様性をさらに調査するために、出願人は、コラテラル活性に応答してエンドヌクレアーゼ活性に好ましいモチーフを特徴付けるためのライブラリーベースのアプローチを開発した。出願人は、一定のＤＮＡハンドルに隣接した縮重６マーＲＮＡレポーターを使用し、これにより、非切断配列の増幅及び読み出しが可能になった（図８３Ｃ）。このライブラリーをコラテラル活性化Ｃａｓ１３酵素と一緒にインキュベートすると、検出可能な切断が生じ、標的ＲＮＡの追加に依存していた（図８８）。枯渇したモチーフの配列決定により、消化時間の経過に伴うライブラリーのスキューの増大が明らかになり（図８９Ａ）、塩基優先性が示され、閾値比を超える配列を選択すると、酵素の切断に対応する数の豊富な配列が生成された（図８９Ｂ））。濃縮されたモチーフの配列ロゴは、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＣｃａＣａｓ１３ｂで観察されたＵ優先性、ならびにＰｓｍＣａｓ１３ｂのＡ優先性を再現した（図８９Ｃ）。出願人はまた、独立した読み出しを可能にするために、１つのオルソログのみで切断を示す（ただし他ではない）複数の配列を決定した（図８９Ｄ）。
酵素優先性の特定のサブモチーフを理解するために、出願人は、単一塩基優先性の枯渇モチーフを分析し（図９０Ａ）、これは、試験されたホモポリマーモチーフ及び２塩基モチーフと一致した（図８３Ｃ及び図９０Ｂ）。これらの２つの塩基モチーフは、特にＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂの場合、ＴＡ、ＧＡ、及びＡＴの２塩基配列を優先する、より複雑な優先性が明らかになる。より高次のモチーフによってまた、さらなる優先性が明らかになった（図９１及び９２）。
出願人は、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及びＣｃａＣａｓ１３ｂのコラテラル優先性を、標的のインビトロ消化で確認した（図９３）。ＰｓｍＣａｓ１３ｂの弱い消化を改善するために、出願人は、緩衝液組成と酵素濃度を最適化した（図９４Ａ、Ｂ）。ＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｂオルソログで試験された他のジカチオンは大きな影響を有さなかった（図９５Ａ−Ｆ）。出願人はまた、ＰｓｍＣａｓ１３ｂを２つのＲＮＡ標的について以前に特徴付けられたＡ優先性Ｃａｓ１３ファミリーメンバーと比較し、同等または改善された感度を発見した（図９６Ａ、Ｂ）。これらの結果から、出願人は、独立したレポーターとの別々の反応で、ＬｗａＣａｓ１３ａとＰｓｍＣａｓ１３ｂの反応速度論を比較し、２つのチャネル間のクロストークのレベルが低いことを発見した（図８３Ｄ）。
実施例５−ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及びＣｃａＣａｓ１３ｂによる単一分子の検出
ＳＨＥＲＬＯＣＫ技術の重要な特徴は、それがＬｗａＣａｓ１３ａコラテラルＲＮアーゼ活性による単一分子検出（２ａＭまたは１分子／μＬ）を可能にすることである。Ｃａｓ１３ｂ酵素の感度を特徴付けるために、出願人は、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＣｃａＣａｓ１３ｂ（ウリジンを優先する別の高活性Ｃａｓ１３ｂ酵素）を使用してＳＨＥＲＬＯＣＫを実行した（図８３Ｅ）。出願人は、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、及びＣｃａＣａｓ１３ｂが、２つの異なるＲＮＡ標的、ｓＲＮＡ １及び合成ジカ ｓｓＲＮＡの２ａＭ検出を達成できることを発見した（図８３Ｅ、９７、及び９８）。これら３つの酵素による標的化のロバストネスを調査するために、出願人はｓｓＲＮＡ １に等間隔で配置された１１の異なるｃｒＲＮＡを設計し、ＬｗａＣａｓ１３ａが最も一貫してシグナル検出を達成し、一方でＣｃａＣａｓ１３ｂとＰｓｍｃａｓ１３ｂが両方ともｃｒＲＮＡからｃｒＲＮＡへの検出においてはるかに多様性を示したことを見出した（図９９）。検出に最適なｃｒＲＮＡを特定するために、出願人は、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ及びＣｃａＣａｓ１３ｂのスペーサー長を３４−１２ｎｔから変更し、ＣｓＣａｓ１３ｂが２８ｎｔのスペーサー長を超える同等の感度を有していたのに対し、ＰｓｍＣａｓ１３ｂは３０のスペーサー長でピーク感度を有したことを見出した（図１００）。出願人はまた、検出限界が２ａＭを超えてプッシュされ、ＳＨＥＲＬＯＣＫへのより大きな試料量の入力を可能にするか否かを試験した。増幅前のＲＰＡステップをスケールアップすることにより、出願人は、ＬｗａＣａｓ１３ａとＰｓｍＣａｓ１３ｂの両方が２００、２０、及び２ｚＭの入力試料に対して有意な検出シグナルを提供し、２５０μＬ及び５４０μＬのボリューム入力を可能にすることを発見した。
実施例６−ＲＰＡを使用した定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫ
ＳＨＥＲＬＯＣＫは、指数関数的増幅に依存しているので、核酸の正確な定量は困難な場合がある。出願人は、ＲＰＡステップの効率を下げると、入力量とＳＨＥＲＬＯＣＫ反応のシグナルとの間の相関が改善され得ると仮定した。出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出の動態は、ある範囲の試料濃度にわたってプライマー濃度に非常に敏感であることを観察した（図１０１Ａ〜Ｄ）。出願人はプライマー濃度を希釈し、シグナルと定量の両方の精度を向上させた（図８３Ｇ及び１０１Ｅ）。この観察は、プライマーダイマー形成の減少による可能性があり、飽和を防ぎながらより効果的な増幅が可能になる。１２０ｎＭのプライマー濃度は、シグナルと入力の間に最大の相関を示した（図１０１Ｆ）。この精度は、アトモル範囲までの広範囲の濃度にわたって持続可能であった（図８３Ｈ及び１０１Ｇ）。
実施例７−直交性Ｃａｓ１３オルソログを使用した２色の多重化
核酸診断の有利な特徴は、複数の試料入力を同時に検出する能力であり、これにより、多重化された検出パネル、または試料制御が可能になる。Ｃａｓ１３酵素の直交性塩基優先性によって、ＳＨＥＲＬＯＣＫを多重化する機会となる。出願人は、異なる塩基同一性とフルオロフォアカラーの蛍光ホモポリマーセンサーを介して、同じ反応で異なるＣａｓ１３酵素のコラテラル活性をアッセイし得、複数の標的を同時に測定可能である（図８４Ａ）。この概念を実証するために、出願人はジカウイルスｓｓＲＮＡに対するＬｗａＣａｓ１３ａ ｃｒＲＮＡとデングウイルスｓｓＲＮＡに対するＰｓｍＣａｓ１３ｂ ｃｒＲＮＡを設計した。出願人は、同じ反応におけるＣａｓ１３−ｃｒＲＮＡ複合体の両方のセットを用いたこのアッセイによって、ジカもしくはデングのＲＮＡ、または両方が反応に存在するか否かを識別し得ることを発見した（図８４Ｂ）。出願人はまた、ＣｃａＣａｓ１３ｂとＰｓｍＣａｓ１３ｂの間の直交の優先性のおかげで、これらの２つの酵素がジカ及びデングの標的の多重化検出にも利用され得ることを見出した（図１０２）。出願人は、この概念を、多重化されたＲＰＡプライマーとＣａｓ１３−ｃｒＲＮＡ複合体の両方を含む、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応全体に拡張することに成功した。出願人は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対するＬｗａＣａｓ１３ａ ｃｒＲＮＡ及びＳ．ａｕｒｅｕｓに対するＰｓｍＣａｓ１３ｂ ｃｒＲＮＡを設計し、両方のＤＮＡ標的をアトモル範囲まで検出し得た（図８４Ｃ）。同様に、ＰｓｍＣａｓ１３ｂとＬｗａＣａｓ１３ａの両方を使用すると、出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して、ジカ及びデングのＲＮＡのアトモルの多重化検出を達成し得た（図１０３）。
出願人は、ＬｗａＣａｓ１３ａが単一ヌクレオチドバリアント検出を可能にすること、及びこれをヒト唾液からの迅速な遺伝子型判定に適用し得ることを示したが、検出には各々の対立遺伝子検知ｃｒＲＮＡについて１つという、２つの別々の反応が必要であった。単一反応のＳＨＥＲＬＯＣＫ遺伝子型決定を可能にするために、出願人は、Ｇ−対立遺伝子に対するＬｗａＣａｓ１３ａ ｃｒＲＮＡ及びｒｓ６０１３３８ ＳＮＰのＡ−対立遺伝子に対するＰｓｍＣａｓ１３ｂ ｃｒＲＮＡ（ノロウイルス耐性と関連する、アルファ（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ ＦＵＴ２遺伝子のバリアントである）を設計した。この単一試料の多重化アプローチを使用して、出願人は唾液を使用して４つの異なるヒト対象を正常に遺伝子型決定し、それらがホモ接合型かヘテロ接合型かを正確に識別することが可能であった。
酵素のＣａｓ１３ファミリーの多様性の例をさらに示すために、出願人は、付随する診断及び治療自体の両方として機能するＣａｓ１３を含む治療アプローチをシミュレートした。出願人は最近、プログラム可能なＡからＩへの置換のためのＲＮＡ編集（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＲＥＰＡＩＲ）と呼ばれるシステムを使用する、遺伝子疾患の変異の修正に使用され得る転写産物のプログラム可能なＲＮＡ編集用のＰｓｐＣａｓ１３ｂを開発した。診断は治療法と組み合わせて治療の決定を導くか、または治療の転帰をモニターする場合に非常に役立つので、出願人は、ＲＥＰＡＩＲ治療の指針として遺伝子型判定に、及びまた治療の編集効率を追跡するために編集されたＲＮＡの読み取りとしてもＳＨＥＲＬＯＣＫを用い得ると考えた（図８４Ｅ）。出願人は、大腸及び直腸のがんを含む遺伝性疾患である家族性腺腫性ポリポーシス１におけるＡＰＣ変異（ＡＰＣ：ｃ．１２６２Ｇ＞Ａ）を修正するために、このセラノスティック概念を実証することを選択した。出願人は、ＡＰＣ遺伝子の健康及び変異体のｃＤＮＡを設計し、これらをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。出願人は、これらの細胞からＤＮＡを採取し、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｓｍＣａｓ１３ｂによる単一試料の多重化ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して、正しい試料の遺伝子型決定に成功した（図８４Ｆ）。同時に、出願人は、ＲＥＰＡＩＲ系用のガイドＲＮＡを設計及びクローニングし、ガイドＲＮＡ及びｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ−ＡＤＡＲ２ｄｄ（Ｅ４８８Ｑ）ＲＥＰＡＩＲ系で病気の遺伝子型を有する細胞をトランスフェクトした。４８時間後、出願人はＲＮＡを収穫し、ここで出願人はＳＨＥＲＬＯＣＫへの入力用に分割して編集結果を検出し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析用に編集率を確認した。配列決定により、出願人はＲＥＰＡＩＲ系（図８４Ｇ）で４３％の編集を達成し、ＳＨＥＲＬＯＣＫでこれを、健常を感知するｃｒＲＮＡ（非標的化ガイドコントロール条件よりも高いシグナルを示した）、及び疾患を感知するｃｒＲＮＡ（シグナルの減少を示した）として検出し得た（図８４Ｈ及び１０４）。全体的に、このアッセイの試薬の設計及び合成には３日かかり、遺伝子型決定には１日かかり、ＲＥＰＡＩＲによる修正及び編集速度の検知には３日かかり、セラノスティックスパイプラインの合計は７日間だけであった。
出願人は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉからのＶＩ型 ＲＮＡガイドＲＮＡ標的化ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａオルソログを使用して、核酸の非常に高感度で特異的な検出を実証した。出願人はさらに、Ｃａｓ１３ｂファミリーの酵素が生化学的に活性であり、ＳＨＥＲＬＯＣＫによる核酸の多重化検出を可能にさせる固有の特性を有することを示した。Ｃａｓ１３ｂ酵素の直交性塩基優先を特徴付けることにより、出願人は、ＬｗａＣａｓ１３ａが認識しないＰｓｍＣａｓ１３ｂによって認識される蛍光ＲＮＡセンサーの特定の配列を発見した。出願人は、これらの塩基優先性を活用して、２つの異なる標的の試料内多重化検出を可能にし、この機能がウイルス株の識別及び個人の遺伝子型決定に役立つことを示すことができた。さらに、前増幅ステップの操作により、ＳＨＥＲＬＯＣＫを定量的にし得、入力核酸濃度または定量の概算が可能になる。出願人はさらに、直交性ＰｓｍＣａｓ１３ｂが単一分子の検出が可能であること、及び容積を拡大することにより、出願人が最大０．５ｍＬかつ最低２ｚＭの濃度まで試料の検出を実行し得ることを示した。
ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた多重化検出は、複数の反応を空間的に実行することによって可能であるが、直交性塩基優先性を介した試料内多重化により、多くの標的を大規模にかつより安価に検出することが可能になる。出願人はここで２入力多重化を示したが、切断モチーフスクリーニングは追加の直交性切断センサーの設計を可能にする（図９０）。ＬｗａＣａｓ１３ａとＣｃａＣａｓ１３ｂは、どちらも同じウリジンホモポリマーを切断し、したがって、ホモポリマーセンサーで測定すると直交性ではない（図８３Ｂ）が、モチーフスクリーニングによって非常に固有の切断優先性が示された（図９０）。追加のＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃオルソログをスクリーニングすることにより、多くのオルソログは、理論的には、スペクトル的に固有の蛍光センサーの数によってのみ制限される高度に多重化されたＳＨＥＲＬＯＣＫを可能にし得る、固有の６マーのモチーフの優先性を明らかにする可能性が高い。高度に多重化されたＳＨＥＲＬＯＣＫは、多くの技術的適用、特に、複雑な入力検知及び論理計算を含むものを可能にする。
視覚的な、より感度が高く、多重化された読み出しのためのＣａｓ１３ベースの検出のこれらの追加の改良により、特に携帯可能で機器を使わない分析が必要な状況では、核酸検出の適用の増大が可能になる。迅速多重化遺伝子型決定では、薬理ゲノミクスの決定、現場での複数の作物特性の試験、または共存する病原体の存在の評価に関して情報提供可能である。迅速な等温読み取りにより、循環ＤＮＡなどの希少種であっても、電源またはポータブルリーダーが利用できない設定でのこの検出のアクセス性が増大する。改良されたＣＲＩＳＰＲベースの核酸試験により、農業、病原体検出、及び慢性疾患における核酸の存在を理解しやすくなる。
実施例８−ＳＨＥＲＬＯＣＫ比色検出
ＤＮＡ四重鎖は、生体分子分析物検出に使用され得る（図１０７）。１つの例では、ＯＴＡアプタマー（青）がＯＴＡを認識し、構造変化を引き起こして、四重鎖（赤）を露出して、ヘミンに結合するようにする。ヘミン四重鎖複合体にはペルオキシダーゼ活性があり、ＴＭＢ基質を着色された形（通常は溶液中では青色）に酸化し得る。出願人は、Ｃａｓ１３が本明細書に記載されているコラテラル活性の一部として分解し得る、これらの四重鎖のＲＮＡ形態を作成した。分解は、ＲＮＡアプタマーの損失を引き起こし、これによって核酸標的の存在下で色シグナルの損失を引き起こす。以下に２つの設計例を示す。
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グアニンは、四重鎖構造を生成する主要な塩基対を形成し、これが次にヘミン分子に結合する。出願人らは、グアニンのセットがウリジン（太字で示されている）で隔てられており、グアニンがほとんど分解されていないことをジヌクレオチドデータが示すとおり、Ｃａｓ１３が四重鎖を分解可能にした。
出願人らは、２つの異なる濃度で２つのアプタマー設計を試験した（図１０８）。低い１００ｎＭ濃度では発色には不十分であった。４００ｎＭの状態は色を形成した。この分析で一致した吸光度データも定量化した（図１０９）。具体的には、デザイン１はｂ９で最高の結果を出し、デザイン２はＬｗａで最高の結果を出した。
出願人は、比色変化の安定性をさらに試験した（図１１０）。Ｃａｓ１３の比色変化は１時間後も安定している。ＬｗａＣａｓ１３ａの比色シグナルは１時間以上安定しているが、Ｃａｓ１３ｂ９の色差はそれほど安定していない。出願人は、１時間後、基質の酸化に起因して色が現れ、色の違いが観察され得るので、１００ｎＭのアプタマー条件でもＣａｓ１３ｂ９で機能することを観察した。
出願人は、比色検出を蛍光検出と比較した（図１１１）。２ａＭの濃度は、両方の系で検出できたが、バックグラウンドでの蛍光の増大は、バックグラウンドでの比色検出の減少よりも少なかった。これによって、比色分析がより感度の高い結果を提供し得ることが示される。
比色アッセイは、本明細書に記載されるような診断アッセイとしての使用に適用可能である。一実施形態では、四重鎖は、試験試料及びＣａｓ１３ ＳＨＥＲＬＯＣＫ系とインキュベートされる。インキュベーション期間後、Ｃａｓ１３による標的配列の同定を可能にし、コラテラル活性によるアプタマーの分解のために、基質を追加してもよい。次いで、吸光度を測定してもよい。他の実施形態では、基質は、四重鎖及びＣａｓ１３ ＳＨＥＲＬＯＣＫ系を用いたアッセイに含まれる。
本発明の記載された方法、薬学的組成物、及びキットの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明を具体的な実施形態に関連して説明してきたが、更なる改変が可能であること、請求される本発明はそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解される。実際、当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、かつ本発明が関係する技術内の公知の慣習に含まれ、本書において前に記載されている重要な特徴に適用され得、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適合を範囲に含むことを意図している。

Claims (68)

  1. 核酸検出系であって：
    エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含む検出ＣＲＩＳＰＲ系と；
    酵素活性を有する四重鎖を含む核酸アプタマーと、を含む前記核酸検出系。
  2. 前記酵素活性がペルオキシダーゼ活性である、請求項１に記載の系。
  3. 核酸増幅試薬をさらに含む、請求項１または２に記載の系。
  4. 前記標的分子が標的ＤＮＡであり、前記系が、標的ＤＮＡと結合し、かつＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含む、請求項１に記載の系。
  5. 前記ＣＲＩＳＰＲ系のエフェクタータンパク質がＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の系。
  6. 前記ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質が、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む、請求項５に記載の系。
  7. 前記１つ以上のＨＥＰＮドメインがＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む、請求項６に記載の系。
  8. 前記ＲｘｘｘＨモチーフがＲ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列を含む、請求項７に記載の系。
  9. Ｘ１がＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、またはＹであり、かつＸ２が独立してＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬであり、かつＸ３が独立してＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである、請求項８に記載の系。
  10. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質がＣ２ｃ２である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の系。
  11. 前記ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質がＣ２ｃ２である、請求項６に記載の系。
  12. 前記Ｃ２ｃ２がＣａｓ１遺伝子の２０ｋｂ内である、請求項１１に記載の系。
  13. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａからなる群より選択される属の生物体由来である、請求項１２に記載の系。
  14. 請求項１３に記載の系であって、前記Ｃ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂエフェクタータンパク質が：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９；［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７（第２のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）；Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９−０３１７；Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６−０６３５；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ−１０１３−ｂ；Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ；［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＨＫＣＩ００４；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ８７９ ｓｔｒ．Ｆ０５５７；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１４４；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ；Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ；Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＴＳＬ５−１；Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＯＲ３７；Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＹＡＢ３００１；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ２３９８；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ−Ｐ３００７；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｈｕａｅ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｒｉｐａｒｉａ；及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍからなる群より選択される生物体由来である、前記系。
  15. 前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質が、Ｌ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９またはＬ．ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質である、請求項１４に記載の系。
  16. 前記ＲＮＡ−アプタマーがオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）を認識する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の系。
  17. 対応する標的分子に結合するように設計された前記１つ以上のガイドＲＮＡが（合成）ミスマッチを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の系。
  18. 前記ミスマッチが、前記標的分子におけるＳＮＰまたは他の単一ヌクレオチド変異の上流または下流にある、請求項１７に記載の系。
  19. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントにおける単一ヌクレオチド多型を検出するように設計されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の系。
  20. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、疾患状態の診断用である１つ以上の標的分子に結合するように設計されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の系。
  21. 前記疾患状態ががんである、請求項２０に記載の系。
  22. 前記疾患状態が自己免疫疾患である、請求項２１に記載の系。
  23. 前記疾患状態が、感染症である、請求項２０に記載の系。
  24. 前記感染症が、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生生物によって引き起こされる、請求項２３に記載の系。
  25. 前記感染症がウイルス感染症である、請求項２４に記載の系。
  26. 前記ウイルス感染がＤＮＡウイルスによって引き起こされる、請求項２５に記載の系。
  27. 前記ＤＮＡウイルスが、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、Ｃｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、フーゼウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、イリドウイルス科、Ｍａｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス類、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘及び天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科、テクチウイルス科、トゥリウイルス科、ディノドナウイルス、サルテルプロウイルス、リジドウイルスである、請求項２６に記載の系。
  28. 前記ウイルス感染が、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラスセンスＲＮＡウイルス、マイナスセンスＲＮＡウイルス、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせによって生じる、請求項２５に記載の系。
  29. 前記ウイルス感染症が、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニウイルス科、オルソミクソウイルス科、もしくはデルタウイルスによって引き起こされる、請求項２８に記載の系。
  30. 前記ウイルス感染症が、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスによって引き起こされる、請求項２９に記載の系。
  31. 前記感染症が細菌感染症である、請求項２４に記載の系。
  32. 上記細菌感染を引き起こす細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ａｎａｐｌａｓｍａ種、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ種、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ種、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｏｘｉｅｌｌａ種、Ｃｏｒｙｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｈｌｉｃｈｉａ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ種、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ種、Ｇｅｍｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種、Ｋｉｎｇｅｌｌａ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ種、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌ種、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌａａ種、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓ種、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ種、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ種、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ種、Ｖｉｂｒｉｏ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種、またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の系。
  33. 上記感染症が真菌によって引き起こされる、請求項２４に記載の系。
  34. 上記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉ、ｓｐ．Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．（例えば、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ（例えば、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、Ｍｕｃｒｏｙｍｃｏｓｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、真菌眼感染白癬、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｍｙｃｅｓ種、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ種またはそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の系。
  35. 上記感染症が原生動物によって引き起こされる、請求項２４に記載の系。
  36. 上記原生動物がＥｕｇｌｅｎｏｚｏａ、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｂｏｓｅａ、Ｄｉｐｌｏｍｏｎａｄｉｄａ、Ａｍｏｅｂｏｚｏａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ、Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ、またはそれらの組み合わせである、請求項３５に記載の系。
  37. 上記感染症が寄生生物によって引き起こされる、請求項２４に記載の系。
  38. 上記寄生生物が、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ、Ｇ．ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）、ｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｃ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、またはそれらの組み合わせである、請求項３７に記載の系。
  39. 標的ＲＮＡ分子を増幅するための前記試薬が、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ＰＣＲ、複数置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または分岐増幅法（ＲＡＭ）を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の系。
  40. 濃縮ＣＲＩＳＰＲ系をさらに含み、前記濃縮ＣＲＩＳＰＲ系が、検出ＣＲＩＳＰＲ系による検出の前に対応する標的分子に結合するように設計されている、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の系。
  41. 前記濃縮ＣＲＩＳＰＲ系が、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む、請求項４０に記載の系。
  42. 前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が、触媒的に不活性なＣ２ｃ２である、請求項４１に記載の系。
  43. 前記濃縮ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がタグをさらに含み、前記タグを使用して、濃縮ＣＲＩＳＰＲエフェクター系をプルダウンするか、または前記濃縮ＣＲＩＳＰＲ系を固体基板に結合する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の系。
  44. 前記固体基質がフローセルである、請求項４３に記載の系。
  45. 各個々の個別のボリュームが、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含む、１つ以上の個々の個別のボリュームを含む診断デバイス。
  46. 各個々の個別のボリュームが、核酸増幅試薬をさらに含む、請求項４５に記載のデバイス。
  47. 前記標的分子が標的ＤＮＡであり、かつ前記個々の個別のボリュームが、標的ＤＮＡに結合し、かつＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含む、請求項４５に記載のデバイス。
  48. 前記個々の個別のボリュームが液滴である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載のデバイス。
  49. 前記個々の個別ボリュームが固体基板上に定義されている、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載のデバイス。
  50. 前記個々の個別のボリュームがマイクロウェルである、請求項４９に記載のデバイス。
  51. 前記個々の個別のボリュームが、基板上に定義されたスポットである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の診断デバイス。
  52. 前記基板が可塑性材料基板である、請求項５１に記載のデバイス。
  53. 前記可塑性材料の基板が紙の基板または可塑性ポリマーベースの基板である、請求項５２に記載のデバイス。
  54. 試料中の標的核酸を検出する方法であって：
    試料または試料のセットを１つ以上の個々の個別ボリュームに分配することであって、前記個々の個別ボリュームは請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含むことと；
    １つ以上の標的分子への前記１つ以上のガイドＲＮＡの結合を可能にするのに十分な条件下で試料または試料のセットをインキュベートすることと；
    前記１つ以上のガイドＲＮＡの前記１つ以上の標的分子への結合を介してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化することであって、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、四重鎖を含むＲＮＡアプタマーが改変され、その結果前記四重鎖の前記酵素活性が不活性化されることと；
    前記酵素活性を検出することであって、ここで、閾値未満の検出は、前記試料中の１つ以上の標的分子の存在を示すことと、を含む、前記方法。
  55. 前記標的分子が標的ＤＮＡであり、前記方法が、前記標的ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼ部位を含むプライマーと結合させることをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 試料試料ＲＮＡまたは前記トリガーＲＮＡを増幅することをさらに含む、請求項５４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ＲＮＡを増幅することが、ＮＡＳＢＡによる増幅を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＲＮＡを増幅することがＲＰＡによる増幅を含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記試料が生物学的試料または環境試料である、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 生物学的試料が、血液、血漿、血清、尿、便、喀痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体の分泌物、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍または感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られた液体）、または関節（例えば、正常な関節または疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎に罹患した関節）から得られた液体、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記環境試料が、食品試料、紙表面、布地、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌試料、淡水試料、廃水試料、塩水試料、またはそれらの組み合わせから得られる、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントにおける一塩基多型を検出するように設計されている、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、疾患状態について診断的である１つ以上の標的分子に結合するように設計されている、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、無細胞核酸に結合するように設計されている、請求項５４〜６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記病状が、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境に起因する疾患である、請求項６３記載の方法。
  66. 試料中の標的核酸を検出する方法であって：
    試料を請求項１〜４４のいずれか１項に記載の核酸検出系と接触させること；及び
    前記接触した試料を側方流動イムノクロマトグラフアッセイに適用することを、含む、前記方法。
  67. 前記四重鎖の前記酵素活性が、前記試料中で色シグナルを生じる、請求項５４に記載の方法。
  68. 前記四重鎖の前記酵素活性の前記不活性化が、前記標的分子の存在の指標である、色シグナルの喪失を生じる、請求項６７に記載の方法。
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