KR20200038521A - Dna 말단(들)의 검출 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계 I 내지 III, 및 단계 I 내지 III 각각의 하위-단계 a 내지 h 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)을 검출하는 방법에 관한 것으로서,
I. 물질의 제조: a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화시키는 단계, b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계, c. 상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계를 포함함; II. DNA 말단(들)의 가공: d. 화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계; 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계를 포함함; III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출: 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA; rolling circle amplification) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계, g. DNA 말단(들)을: i. 선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계, ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제(ligase)를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계, iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계에 의해 검출하는 단계, h. 분자 유형 6을 검출하는 단계; 이러한 단계 I의 1개 초과의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있다. 본 발명은 또한, 생물학적 물질에서 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한 롤링 서클 복제의 용도, 및 DNA 말단(들)의 검출을 위한 상기 언급된 방법의 용도에 관한 것이다.
I. 물질의 제조: a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화시키는 단계, b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계, c. 상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계를 포함함; II. DNA 말단(들)의 가공: d. 화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계; 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계를 포함함; III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출: 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA; rolling circle amplification) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계, g. DNA 말단(들)을: i. 선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계, ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제(ligase)를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계, iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계에 의해 검출하는 단계, h. 분자 유형 6을 검출하는 단계; 이러한 단계 I의 1개 초과의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있다. 본 발명은 또한, 생물학적 물질에서 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한 롤링 서클 복제의 용도, 및 DNA 말단(들)의 검출을 위한 상기 언급된 방법의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 분자 진단 및 생물의학적 분야에 속한다. 본 발명은 DNA 손상의 검출 및/또는 정량적 및/또는 정성적 분석 방법에 관한 것이다. 보다 정확하게는, 본 발명은 세포 핵에서 또는 단리된 생물학적 물질에서 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 절단의 유도 결과 형성되는 상이한 유형의 자유 DNA 말단들의 직접적인, 고도로 민감한, 특이적인 그리고 효율적인 인지 및/또는 검출을 가능하게 한다.
생명체가 세대로부터 세대까지 계속 이어지기 위해서는, 유기체의 게놈이 임의의 유의한 변화 없이 전달되어야 한다. 데옥시리보핵산(DNA)을 형성하는 핵염기의 독특한 서열 형태에서 유전적 정보의 저장, 및 이러한 정보를 세대를 통해 전달시키는 능력은 모든 살아 있는 유기체들의 주된 특징이다. 세포는 살아 있는 유기체의 기본적인 구조적 및 기능적 단위이다. 따라서, 염기 서열은 단일 세포의 일생 동안 보존되어야 한다. 더욱이, 부모 세포의 DNA는 충실히 복사되어야 하고, 딸세포에게 넘겨지는 2개의 복사체는 동일해야 한다. 그러나, DNA는 어쩔 수 없이 안정하지 않고, DNA는 생리학적 조건 하에 발생하는 자발적인 화학적 변화에 취약하다([문헌Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993 Apr 22;362(6422):709-15]). DNA 변화, 예컨대 DNA 손상은 다양한 내인성 및 외인성 인자들에 의해 유도될 수 있다. 내인성 인자는 세포 대사 및 호흡의 손상성 부산물(예컨대 반응성 산소종)을 포함한다. 외인성 인자는 다양한 손상성 화학물질(예를 들어, 메틸화제, 산화제 또는 가교제), UV 및 더 높은 에너지의 광자(X-선, 감마선), 및 중이온 및 중입자(예를 들어, 베타 또는 알파 입자)를 포함한다([문헌Friedberg Errol C., Graham C. Walker, Wolfram Siede, Richard D. Wood. DNA Repair and Mutagenesis. American Society for Microbiology Press, 2005]).
DNA는 본질적으로 화학적으로 불안정하고, 다양한 인자들에 의해 끊임없이 손상되기 때문에, 게놈 온전성의 보전은 특수화된 감시 및 복구 기전을 필요로 한다. 이러한 다양한 보호 기전은 지구 상의 유전적 정보를 인코딩하는 주요한 그리고 독특한 분자로서 DNA와 나란히 진화하였다. DNA가 염기 서열에서 높은 비율의 게놈 분해 및 변화를 유도하는 이의 복잡한 환경의 유해한 영향에 취약하다는 사실에도 불구하고, 단일 세포 분열 주기 내에서 축적되는 돌연변이의 수는 낮다(문헌[Araten DJ, Golde DW, Zhang RH, Thaler HT, Gargiulo L, Notaro R, Luzzatto L. A quantitative measurement of the human somatic mutation rate. Cancer Res. 2005 Sep 15;65(18):8111-7. Erratum in: Cancer Res. 2005 Nov 15;65(22):10635]). 돌연변이율은 특수화된 손상 검출 및 복구 기전의 효율적인 작용에 의해 낮게 유지된다. 복구 기전의 올바른 작용을 탈출하는 게놈 분해만 체세포 돌연변이를 유발할 수 있다. 복구되지 않은 DNA 손상의 축적은 게놈 온전성을 위태롭게 하고, 다양한 세포성 기능 부전, 신생물성 형질전환(neoplastic transformation) 또는 사멸을 유발할 수 있다. 게놈에서 비-치사적인 변화는 후속 세대로 전달되며, 축적되고, 결국에는 자손의 심각한 기능 부전을 초래할 수 있다. 신생물성 형질전환은, 형질전환된 세포가 이러한 세포의 클론 및 악성 종양의 성장을 야기할 수 있기 때문에 결국에는 전체 유기체의 수준에서 심각한 결과를 가질 수 있다.
일부 경우, DNA 손상으로 인한 단지 몇몇 세포의 사멸이 전체 유기체에 대해 심각한 결과, 예를 들어, 뇌에서 대체 불가능한 뉴런의 손실을 가질 수 있다. DNA 손상의 축적은 또한, 문헌에서 DNA 복제 스트레스, 세포의 노쇠(senescence) 및 세포 노화(ageing)로서 기재된 다양한 현상들과 직접적으로 연관이 있다(문헌[Techer H, Koundrioukoff S, Nicolas A, Debatisse M. The impact of replication stress on replication dynamics and DNA damage in vertebrate cells. Nat Rev Genet. 2017 Jul 17. doi: 10.1038/nrg.2017.46. [Epub ahead of print] Review; White RR, Vijg J. Do DNA Double-Strand Breaks Drive Aging? Mol Cell. 2016 Sep 1;63(5):729-38. doi: 10.1016/j.molcel.2016.08.004. Review]). 정자 DNA의 온전성은 임신 결과(pregnancy outcome)에 분명한 영향을 갖는 것으로 잘 알려져 있다(문헌[Evenson DP, Darzynkiewicz Z, Melamed MR: Relation of mamalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 1980, 240: 1131-1133; Evenson DP. The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA(®)) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 2016 Jun;169:56-75. doi: 10.1016/j.anireprosci.2016.01.017. Epub 2016 Feb 17; Rex AS, Aagaard J, Fedder J. DNA fragmentation in spermatozoa: a historical review. Andrology. 2017 Jul;5(4):622-630. doi: 10.1111/andr.12381]).
많은 손상 인자들은 DNA 절단을 직접적으로 유도하는 한편, 다른 것들은 DNA 병변을 야기하고, 상기 병변은 결국 DNA 분자의 불연속성, 즉, 단일-가닥 및 이중-가닥 절단을 유발할 수 있다. 단일-가닥 절단 또는 틈은 DNA의 하나의 가닥에서 2개의 인접한 뉴클레오타이드 사이의 포스포디에스테르 결합의 붕괴(disruption)로 인한 것이다. 이중-가닥 DNA 절단은 DNA의 상보적 가닥 둘 모두의 불연속성이고, DNA 가닥 상의 반대되거나 가까이 놓인 위치에서 뉴클레오타이드들을 연결하는 포스포디에스테르 결합이 절단될 때 발생한다. 이중-가닥 DNA 절단(DSB)은 가장 위험한 DNA 병변인 반면, 단일-가닥 절단(SSB)은 덜 유해한 효과를 야기하지만, 이들 SSB의 수는 이중-가닥 병변의 수보다 훨씬 더 많다. 정상 세포에서 이중-가닥 절단은 종종, 1개 초과의 단일-가닥 절단으로 인한 것이며, 이는 상보적 가닥 둘 모두에서 서로 가까이에서 발생한다. 이중-가닥 절단이 유도되는 경우, DNA 말단들은 물리적으로 분리될 수 있다.
DNA 절단의 몇몇 유형은 알려져 있다(문헌[Clark Robert S. B., Minzhi Chen, Patrick M. Kochanek, Simon C. Watkins, Kun Lin Jin, Romesh Draviam, Paula D. Nathaniel, Rodnina Pinto, Donald W. Marion, and Steven H. Graham. Journal of Neurotrauma. July 2004, 18(7): 675-689]):
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단일-가닥 틈(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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단일-가닥 갭(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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이중-가닥 평활-말단 절단(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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이중-가닥 3'-돌출 절단(여기서, 돌출형(overhanging) 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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이중-가닥 5'-돌출 절단(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단이 존재함)
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DNA 가닥의 "손상된" 말단을 갖는 DNA 절단(여기서, 3'-OH DNA 가닥 말단은 존재하지 않음).
DNA 가닥 절단은 많은 정상적인, 내인성 세포 과정, 예컨대 DNA 복제, 전사, 슈퍼코일의 이완, 유전자 재배열, DNA 손상 복구 등 동안에 발생한다. 이러한 가닥 절단은 통상, 특수 효소에 의해 즉각 결찰된다.
복구되지 않은 DSB의 발생은 비보호된 반응성 DNA 말단을 발생시키고, 이러한 DNA 말단은 게놈에서 어디에나 놓인 부분적인 상동성의 DNA 영역과의 재조합을 개시하고/하거나 이에 참여할 수 있다. 이는 게놈에서 다양한 재배열, 예컨대 염색체의 결실, 전좌, 융합 및 절단, 염색체의 고리화, 미니염색체의 출현 등을 생성할 수 있다.
DNA 가닥 절단은 다양한 유형의 장애들과 연관이 있을 수 있거나, 분자 복구 머시너리의 돌연변이 및 기능 부전으로 인한 것일 수 있는 기존의 기저 장애의 발로(manifestation)일 수 있다. DNA 가닥 절단의 축적은 암, 예컨대 결장암, 유방암, 피부암 또는 전립선암, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병을 포함하는 신경퇴행성 장애, 및 질병, 예컨대 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 프리드리히 운동 실조증(Friedrich's ataxia), 척수소뇌 실조증(spinocerebellar ataxia), 2형 진성 당뇨병, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease) 및 근긴장성 디스트로피(myotonic dystrophy), 및 많은 다른 장애들을 포함하는 여러 가지 질병의 발병과 연관이 있을 수 있다.
세포 핵에서 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 절단의 존재, 수 및 장소, 및 특이적인 유형의 병변을 구별하는 능력에 대한 지식은 유기체의 세포 및 조직의 DNA 품질을 평가하고 DNA 손상 유도 및 이의 복구 기전을 연구하고 이해하는 데 필요하다. DNA 절단의 수의 측정 및 하위핵(subnuclear) 국소화의 결정은 다양한 내인성 및 외인성 인자들의 유전자독성(genotoxic) 잠재력을 평가하는 데 필요하다. 더욱이, DNA 단편화 정도(degree)로 반영되는 생물학적 물질의 품질의 분석은 유기체가 살아 있는 환경 조건의 분석에서 마커로서 역할을 할 수 있다. DNA 절단의 결정은 인간 및 다른 유기체의 생식 세포의 품질을 평가하기 위한 매개변수로서 역할을 할 수 있다.
세포성 DNA에서 DNA 절단은 당업계에 알려진 일부 기존의 방법, 예컨대:
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절단이 유도되는 경우 노출되는 DNA 말단의 직접적인 검출 및 인 시추 식별(예를 들어, 폴리머라제 I-매개 틈 번역 검정법, 폴리머라제 I-매개 틈-말단 표지화 검정법의 Klenow 단편, 또는 TUNEL 검정법으로 알려진 종결(terminal) 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)-매개 dUTP 틈-말단 표지화 검정법)
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DNA 병변으로 동원되는 복구 인자(예를 들어 DSB에 대해 53BP1 또는 SSB에 대해 XRCC1)의 검출
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DNA 절단에 특이적인 후생적(epigenetic) 염색질 변형의 검출(현재로서는 γH2A.X만 - 세린139 상에서 히스톤 H2A.X의 인산화)
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생화학적 방법(예를 들어, Comet 검정법, 또는 알칼리성 용출 검정법, 또는 필터 용출 검정법(문헌Kohn Kurt W., Leonard C. Erickson, Regina A. G. Ewig, and Charles A. Friedman. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry, 1976, 15 (21), pp 4629-4637; DNA Damage Detection In Situ, Ex Vivo, and In Vivo (2011). Methods and Protocols. Springer. Editor: Vladimir V Didenko]))에 의한, 추출된 물질 내 DNA 말단의 검출
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인 시추에서 산-유도 DNA 변성에 대한 DNA의 감수성(susceptibility) 정도(degree)에 의해 측정되는 전반적인 dDNA 단편화 정도의 검출(예를 들어 SCSA 시험)
에 의해 검출될 수 있다.
간접적인 접근법(γH2A.X, XRCC1, 53BP1)이 적은 수의 DNA 절단의 검출을 가능하게 하지만, 현재, 살아 있는 세포 또는 고정된 세포에서 개별적인 DNA 절단을 직접적으로 검출하는 방법은 존재하지 않는다.
DNA 말단의 직접적인 표지화 및 검출을 기반으로 하는 방법들은 모두, 낮은 민감도(sensitivity)를 특징으로 하며, 즉, 이들 방법은 온전한 세포 또는 처리된 생물학적 물질에서 개별적인 DNA 절단을 검출할 수 없다. 당업자에게 잘 알려진 TUNEL 검정법은 세포자멸사 동안 많은 수(예컨대 수백 개 이상)의 DNA 절단을 쉽게 검출할 수 있으나, 상기 검정법은 개별적인 DNA 이중-가닥 절단, 또는 심지어 낮은 수(10 등)의 이들 절단으로 이루어진 군을 검출할 수 없다.
가닥 절단을 유도하는 전형적인 매일의 내인성 및 외인성 인자에 노출된 인체에서 대부분의 세포는 적은 수의 이중-가닥 절단(γH2A.X의 면역표지화에 의해 검출되는 바와 같이 임의의 주어진 시간에서 대략 0 내지 10(문헌[Rybak P, Hoang A, Bujnowicz L, et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget.2016;7(31):49574-49587)]), 및 다소 더 많은 수의 단일-가닥 절단을 나타낸다. 항체를 생성하는 세포에서만, DNA 절단은 손상을 이루지 않지만, 유전자 재배열의 자연스런 과정의 구성성분이다. DNA 절단의 수는 프로그래밍된 세포 사멸(세포자멸사) 과정을 겪고 있는 세포에서 매우 크다. 이중-가닥 절단은 통상 많은 시간 동안 지속되는 과정에서 복구되는 한편, 단일-가닥 절단은 신속하게, 종종 수분 이내에 복구된다. 따라서, 인간 체세포에서 임의의 주어진 시간에 존재하는 두 가지 유형 모두의 DNA 절단의 수는 통상, 30을 초과하지 않는다(γH2A.X 및 XRCC1 복구 인자의 축적의 면역표지화에 의해 검출됨(문헌[Berniak K., Rybak P., Bernas T., Zarebski M., Biela E., Zhao H., Darzynkiewicz Z., Dobrucki J.W.: Relationship between DNA damage response, initiated by camptothecin or oxidative stress, and DNA replication, analyzed by quantitative 3D image analysis. Cytometry. A, 2013; 83: 913-24; Rybak P, Hoang A, Bujnowicz L, et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget.2016;7(31):49574-49587; Solarczyk K.J., Kordon M., Berniak K., Dobrucki J.W.: Two stages of XRCC1 recruitment and two classes of XRCC1 foci formed in response to low level DNA damage induced by visible light, or stress triggered by heat shock. DNA Repair (Amst)., 2016; 37: 12-21]). 생리학적 조건 하에 체세포에서 당면하는 전형적인 적은 수의 DNA 절단은 TUNEL, 또는 임의의 다른 확립된 직접적인 검출 접근법에 의해 검출 및 정량화될 수 없다. 기존의 방법들은 모두, 전통적인 면역형광 표지화(TUNEL을 포함함)를 기반으로 하고, 따라서, 이들의 특이성은 제한되고 1차 항체 및 2차 항체의 특이성에 매우 의존하고 있는 한편, 이들 방법의 민감도는 상당한 비-특이적인 배경 신호(특이적인 신호의 강도는 비특이적인 신호의 강도를 충분히 초과하지 않음)의 존재에 의해 제한된다.
동원된 세포성 DNA 손상 반응 인자(예컨대 53BP1 또는 XRCC1)를 검출하는 수단에 의한 DNA 절단의 간접적인 검출은 하기 한계를 가진다: (i) 동원된 단백질 분자는 일반적으로 사용되는 방법, 예컨대 면역형광에 의해 검출되기에 너무 낮을 수 있으며, (ii) 면역형광은 항체의 제한된 특이성으로 인해 종종 완전히 특이적이지 않으며, (iii) 검출의 민감도는 다양한 세포 구성성분들에 대한 2차 항체의 비특이적인 결합으로부터 발생하는 신호 배경의 존재에 의해 제한되며, (iv) 복구 인자의 동원은 DNA 절단의 부재 시 활성화될 수 있거나 복구 역량(capacity)의 포화 조건 하에 부재할 수 있거나, 복구 시스템 자체가 손상되거나 약화될 때, 따라서 위양성 또는 위음성 결과가 발생할 수 있다. DNA 절단을 표시하는 형광 태깅된 복구 단백질(예를 들어 EGFP-53BP1)의 검출은 살아 있는 세포에서 수행될 수 있으나, 이는 통상, 시험관내 배양물에서 융합 단백질의 과발현 조건 하에 심하게 조작된, 형질감염된 세포에서 수행된다. 환자의 신체로부터 새로 유래된 세포에서 손상 부위에서 형광 태깅된 단백질의 축적을 검출하는 수단에 의한 DNA 절단 수의 측정은 가능하지 않다.
히스톤 H2A.X(γH2A.X)의 인산화의 면역검출을 기반으로 한 이중-가닥 절단의 검출은 다른 방법들 중에서 예외인데, 왜냐하면 상기 검출은 자연적인 생물학적 신호 증폭으로 인해 고도로 민감하기 때문이다. 즉, 하나의 DSB는 절단 부근에서 1백만 개 이하의 히스톤 잔기의 인산화를 유도한다. 그러나, 오늘날에, 이러한 증폭을 이용하는 능력은 다양한 세포 표적들에 대한 1차 및 2차 항체의 비특이적인 결합 및 생성된 비특이적인 신호를 포함하는 면역형광 방법의 상기 언급된 결점에 의해 약화된다. 세린139 상에서 히스톤 H2A.X의 인산화가 DSB의 검출을 위한 금본위제(gold 표준)로서 보편적으로 사용되어 왔으나, 최근에는 이러한 방법이 DNA에서 DSB에 관하여 제한된 특이성을 갖는 것으로 알려지게 되었다. 히스톤 H2A.X의 히스톤 인산화가 이중-가닥 절단 이외의 병변에 의해 유도될 수 있다는 것은 몇몇 연구 그룹에 의해 실증되었다(문헌[Cleaver JE1. γH2Ax: biomarker of damage or functional participant in DNA repair "all that glitters is not gold!".Photochem Photobiol. 2011 Nov-Dec;87(6):1230-9; Rybak P, Hoang A, Bujnowicz L, et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget.2016;7(31):49574-49587]). 이들 및 다른 공개된 데이터는, 이 방법이 DSB에 대한 단지 제한된 특이성만 나타낸다는 사실을 증명하는 것이다. 마지막으로, 절단이 가까이 놓인 경우, 이들 절단은, 많은 수의 인산화된 H2A.X 분자를 나타내는 면역형광 신호가 현미경 이미지에서 큰 스팟(수백 나노미터 내지 1 마이크로미터 이하의 직경)으로 보이기 때문에 개별적인 엔터티(entity)로서 검출될 수 없다.
당업계에 알려진 DNA 손상 분석에 사용되는 몇몇 생화학적 방법이 또한 존재한다. 그러나, 이들 알려진 기법은 일부 한계를 가진다. 예를 들어, Comet 검정법은 개별적인 세포에서 많은 수의 DNA 절단들을 검출하는 데 사용된다. 상기 Comet 검정법은 DNA 손상의 일반적인 수준 및 세포 집단 내에서 손상의 분포의 추정에 유용하지만, 상기 검정법은 개별적인 DNA 절단을 검출할 정도의 충분한 민감도를 갖지 않는다. Comet 검정법은 세포 용해를 필요로 하기 때문에, DNA 손상의 유형 및 핵 구조와 비교하여 DNA 절단의 국소화(localization)에 관한 임의의 정보를 전달하지 않는다.
DNA 손상을 평가하는 광범위하게 사용되는 알칼리성 용출 검정법의 몇몇 버전이 존재하지만, 이러한 방법은 이러한 과정에서 DNA 절단을 도입할 수 있는 것으로 알려져 있다(문헌[Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 2000;35(3):206-21]).
당업계의 기존의 지식을 기반으로, 개별적인 DNA 절단의 민감하고 특이적인 검출이 TUNEL 검정법에서 수행되는 바와 같이 DNA 말단에 특이적으로 부착된 분자의 검출을 이용할 것임을 예상하는 것은 합리적이다. 이러한 부착된 분자의 수가 낮을 수 있으므로(단지 1개 또는 몇몇), 이러한 분자의 매우 민감한 검출 방법이 이용되어야 함을 예상하는 것은 논리적이다. 다양한 유형의 질량 분광광도법들, 질량 세포분석법(유세포분석법과 조합된 질량 분광광도법), 에너지 분산형 X-선 마이크로분석(EDXMA, EDXA), 또는 면역형광을 포함하는 형광-기반 방법, 펠스터 공명 에너지 전이(FRET; Forster Resonance Energy Transfer), 2분자 형광 상보 검정법(BiFc; Bimolecular Fluorescence Complementation Assay), 근접 결찰 검정법(PLA), 단일 분자 형광 검출, 분광광도법 및 이미징을 포함하여, 다양한 분자들, 이러한 분자들의 복합체, 또는 이들의 상호작용의 특이적인 검출을 할 수 있는 많은 매우 민감한 기법들은 당업계에 알려져 있다. 이들 접근법(상기 설명된 바와 같이 면역형광을 포함함) 중 어느 것도, 세포 내 염색질에서 또는 단리된 염색질에서 DNA 말단에 부착된 단백질 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 개별적인 분자의 검출에 직접적으로 적용 가능하지 않다.
DNA 절단의 상기 언급된 검출 방법, 및 DSB 또는 SSB의 검출에 잠재적으로 적용 가능한 검출 방법 또한, 특허 및 비-특허 문헌에 널리 기재되어 있다.
예를 들어, WO9708345 공개에 기재된 발명은 기본적인 연구, 의학적 진단 시험 및 법의학적 시험을 위한 DNA 검출 분야에 관한 것이다. 환기된 공개에 기재된 방법은 이전의 단락에서 언급되었던 TUNEL 검정법의 기본을 이룬다. 이러한 발명에 따르면, DNA 가닥은 우선, 할로겐화된 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 예컨대 브롬화된 데옥시우리딘 트리포스페이트(BrdUTP), 및 DNA 가닥의 3'-OH 말단으로의 상기 할로겐화된 데옥시뉴클레오타이드의 첨가를 촉매할 수 있는 효소, 예컨대 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)와 함께 인큐베이션된다. 그 후에, 생성된 변형된 DNA 가닥은 상기 할로겐화된 데옥시뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 예컨대 플루오레세인화된(fluoresceinated) 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션된다. 그 후에, 상기 표지는 유세포분석법, 현미경, 또는 다중매개변수 레이저 스캐닝 현미경에 의해 검출된다. 상기 방법은 세포자멸사, DNA 합성 및/또는 복구를 검출하는 데 있어서 유용성을 갖지만, DNA 말단 표지화를 위한 일반적인 방법으로서는 개별적인 또는 적은 수의 DNA 말단을 검출할 수는 없다. 이전의 단락에 기재된 것에 따르면, 이러한 발명은 세포에서 DNA 절단의 검출에 사용되는 경우, 세포의 세포자멸사 동안 발생하는 수백 개의 이중-가닥 절단의 검출에 전용(dedicated)된다. 과학 문헌에서 실증된 바와 같이, 이의 민감도는 개별적인 DNA 병변의 검출을 가능하게 하기에는 너무 낮다. 이러한 낮은 민감도의 주된 이유는, 이러한 검정법이 문맥에서 이전에 설명된 바와 같이, 비특이적인 신호를 높은 수준으로 초래하는 표준 면역형광 염색 방법을 기반으로 한다는 사실이다.
DNA 손상 검출을 위한 변형된 근접 결찰 검정법(PLA)의 용도의 특허 및 특허 출원에 일부 개시내용이 존재한다. 간략하게는, PLA 기법은, 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 표지된 항체, 또는 복합체를 형성하는 2개의 분석물들의 상이한 에피토프들에 또는 동일한 분석물에 가까이 근접하여(10 내지 40 nm 이격됨) 결합하는 다른 분자를 이용한다. 이러한 검정법은 일반적으로, 단백질-단백질 복합체의 국소화된 검출, 시각화 및 정량화, 및 단백질의 민감한 검출에 사용되도록 대체로 권고된다. 2가지의 잘 알려진 방법들을 조합하는 이러한 기법은 소위 "근접 프로브화(proximity probing)"의 원리에 의존하고, 상기 근접 프로브화에서 분석물은 2개의 프로브들의 결합에 의해 검출되며, 상기 프로브들은 분석물에 결합함으로써 근접하게 놓이게 될 때(따라서, "근접" 프로브) 신호가 발생되도록 한다(예를 들어, 미국 특허 공개 US8013134 B2, US7306904 B2, 미국 특허 출원 공개 US2008/0293051, 또는 WO16106298A1 참조). 이러한 접근법은 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 이용하며(예를 들어, 유럽 특허 공개 EP1997909, 미국 특허 공개 US7,88,849 또는 US7,790,338 참조), 상기 반응은 2개의 프로브들로부터 유래된 신호를 곱한다(multiply). 근접 프로브화와 RCA의 상기 조합 또한, 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 국제 출원 WO 2012/160083 A1은 멀티플렉스드(multiplexed) 근접 결찰 검정법에 의해, 적어도 3개의 표적 기질 중 임의의 2개 또는 표적 기질의 적어도 3개의 특징부(feature) 중 임의의 2개 사이의 또는 이들과의 상호작용, 또는 표적 기질과 특징부의 상호작용의 조합을 검출하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은: a) 적어도 3개의 표적 기질 또는 특징부 각각에 대해, 상기 기질 상의 특징부 또는 결합 부위에 대한 친화도를 갖는 결합 모이어티, 및 상기 결합 모이어티에 커플링된 근접 프로브 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 근접 프로브를 제공하는 단계로서, 각각의 상기 근접 프로브 올리고뉴클레오타이드는 독특한 태그 서열을 운반하는 단계; b) 각각의 근접 프로브를, 결합 모이어티를 통해 각각의 상기 기질 상의 이의 각각의 결합 부위 또는 특징부에 결합시킬 수 있는 조건 하에, 근접 프로브를 시료와 혼합하는 단계; c) 상기 단계 b)와 동시에 또는 그 후에, 임의의 2개의 근접 프로브들이 기질 상에서 서로에게 충분히 가까이 결합하는 고리화된 DNA 분자를 형성하는 단계로서, 각각의 상기 고리화된 DNA 분자는 2개의 근접 프로브 올리고-뉴클레오타이드들로부터 독특한 태그 서열에 상보적인 서열을 포함하는 단계; d) 상기 고리화된 DNA 분자를 증폭시키는 단계; 및 e) 증폭된 DNA를 특징화하는 단계를 포함한다. PLA 기법에 관한 보다 다른 해결방안에 대해서는, 특허 출원 US2011223585A, US2014194311A, US2004248103A, 또는 US2003008313A를 또한 참조한다.
그러나, 임의의 유형의 DNA 절단의 결과로서 발생하는 DNA 말단의 직접적인 검출을 위해 상기 해결방안, 즉, PLA 기법을 사용하는 어떠한 구현예도 없다. 더욱이, DNA 손상 검출에서 PLA 기법의 단순한 적용은, 단지 하나의 유형의 DNA 절단 부위에서 배제적으로 발생하는 특이적인 단백질을 표적화하는 프로브를 필요로 할 것이며, 상기 언급된 바와 같이, 동일한 단백질이 다수의 기능들을 가질 수 있기 때문에, DNA 절단 이외의 부위에서 단백질의 존재 확률은 상당히 가능성이 있다.
공개["A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues", Aging Cell (2017) 16, pp 422-427] 및 문헌[Alessandro Galbiati, Christian Beausejour and Fabrizio d'Adda di Fagagna]는, 'DNA 손상 인 시추 결찰, 뒤이은 근접 결찰 검정법'(DI-PLA)이라고 하는 방법이 세포에서 DSB의 검출 및 이미징에 관한 것임을 개시하고 있다. DI-PLA는 비오틴화된 이중-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드로의 결찰에 의한, 인 시추에서 고정된 세포에서 자유 DNA 말단의 포착을 기반으로 하고, 이는 다음으로 항비오틴 항체에 의해 인지된다. 검출은 상기 언급된 항체와, DSB 부위에서 DNA 손상 반응의 과정에 관여하는 파트너 단백질(γH2AX 또는 53BP1)을 인지하는 항체의 조합에 대해 PLA 기법을 사용함으로써 증강된다. 상기 DI-PLA 방법의 확증은, 배양된 세포 및 조직에서 다양한 유전자독성 상해(insult)들에 의해 유도되는 DSB를 검출하는 상기 방법의 능력을 실증함으로써 수행되었다. 그러나, 이러한 방법은 히스톤 H2AX 인산화에 의해 표시된 또는 복구 인자 53BP1이 동원된 이중-가닥 DNA 절단에 대해서만 사용될 수 있으며, 따라서, 이의 용도는 제한된다. 첫째로, 이러한 방법은 히스톤 변형 또는 DNA 손상 복구에 관여하는 단백질의 동시적인 검출을 필요로 하기 때문에 DNA 절단의 직접적인 검출 기회를 제공하는 기법이 아니다. 둘?로, 이러한 방법은, 세포성 단백질 복구 머시너리에 의해 인지되지 않았던, 또는 기능 부전성 복구 머시너리를 받는 DNA 절단의 검출에 사용될 수 없다.
문헌[Hanif Rassoolzadeh, Christos Coucoravas & Marianne Farnebo, "The proximity ligation assay reveals that at DNA double-strand breaks WRAP53β associates with γH2AX and controls interactions between RNF8 and MDC1", Nucleus, 6:5, 417-424, 201]의 공개에서, PLA 검정법은, DNA 이중-가닥 절단에서 WRAP53b가 γH2A.X에 가까이 근접하여 축적된다는 것을 보여주는 데 사용되었다. 보다 중요하게는, 이 문헌은, 종래의 면역형광을 사용하여 검출하기 어려운 DNA 절단에서 복구 인자의 동원 및 복합체 형성의 분석을 위한 보다 민감한 방법으로서 PLA를 강조하고 있다. 그렇긴 하지만, 이중-가닥 절단만 이 변형된 PLA 방법에 의해 검출될 수 있다. 더욱이, 이들은 단지, 2개의 특정한 복구 인자들(RNF8 및 MRC1)이 DNA 손상 부위에 존재한다면 검출될 수 있다. 더욱이, 이러한 변형은 세포에서 자연적으로 발생하는 단백질들 사이의 상호작용을 기반으로 하고, 이러한 상호작용은 DNA 손상 부위와 상이한 부위들에서 이들 단백질 및 이들의 복합체의 존재 확률로 인해 위양성 결과를 유발할 수 있다. 따라서, 이 공개에 제시된 방법은 충분히 특이적이지 않고, 이의 적용은 단지 하나의 특정 유형의 DNA 이중-가닥 절단에 제한되되, 단, 이들은 복구 머시너리에 의해 인지되었다.
WO12080515A1에 기재된 발명은 이온화 방사선에 노출된 대상체의 세포에서 DNA 손상 수준을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 대상체로부터 수득되는 세포를 포함하는 시료를, DNA 복구 포커스에 존재하는 동일한 또는 상이한 단백질(들) 상의 에피토프에 결합하는 적어도 2개의 항체, 앱타머(aptamer), 또는 안티칼린(anticalin)과 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료를 적어도 제1 및 제2 근접 프로브와 접촉시키는 단계로서, 각각의 프로브는 상기 항체, 앱타머, 또는 안티칼린에 대한 친화도를 갖는 결합 모이어티, 및 이에 커플링된 반응성 작용기로서 작용하는 핵산을 포함하는 단계; (c) 상기 근접 프로브의 결합 모이어티가 상기 항체, 앱타머, 또는 안티칼린에 결합하도록 하고, 근접 프로브들이 서로에 대해 가까이 근접하여 있다면 상기 근접 프로브의 핵산들이 서로 상호작용하도록 하는 단계; 및 (d) 상기 핵산들 사이의 상호작용 정도를 검출하여, DNA 손상 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 그렇긴 하지만, 이 방법은 방사선-유도 DNA 이중-가닥 절단을 검출함으로써 방사선 노출을 모니터링하도록 설계되었다. 다른 어떠한 유형의 절단도 검출될 수 없다. 그러나, 무엇보다도, 이는 DNA 절단의 간접적인 검출 방법의 또 다른 예이다. 상기 기재된 것과 유사하게, 이는 DNA 절단으로 인한 DNA 말단의 직접적인 검출보다는 DNA 손상 복구 과정에 관여하는 단백질(들)의 검출을 기반으로 한다.
기존 방법의 연구는, 고정된 또는 살아 있는 세포 또는 조직에서, 뿐만 아니라 추출된 DNA, 단리된 염색질 또는 임의의 유형의 생물학적 물질에서 임의의 유형의 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA 절단을 식별하고 검출하는 고도로 민감하며, 특이적이고 직접적인 방법에 대한 필요성을 실증한다.
이용 가능한 접근법의 측면에서, 동일한 시기에 편리하고 단순할 DNA 손상 인 시추 또는 시험관내 분석에 이용 가능한 보다 민감하며, 특이적이며, 선택적이고 유니버셜한 방법에 대한 요건이 존재한다. DNA 손상의 민감하고 선택적인 검출은 약물 설계, 환자의 상태 및 마찬가지로 질병의 진행의 진단 및/또는 모니터링에 매우 중요하다. 더욱이, 이는 또한, 발암, 퇴행성 및 자가면역 질병, 또는 노화 - 주요한 동시대의 건강 문제와 관련된 과정에 대한 보다 양호한 이해를 제공할 수 있다.
본 발명은 당업계에 알려진 방법들의 단점을 극복하고, DNA 절단의 연구에, 따라서 DNA 손상의 검출과 관련된 진단에 사용되는 방법의 영역에서 유의한 진전을 이룬다.
본 발명은 하기 단계 I 내지 III, 및 단계 I 내지 III 각각의 하위-단계 a 내지 h 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)을 검출하는 방법에 관한 것으로서,
I. 물질의 제조
a.
생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화(immobilization)시키는 단계,
b.
DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c.
상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d.
화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f.
단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA; rolling circle amplification) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g.
DNA 말단(들)을 하기 단계에 의해 검출하는 단계:
i.
선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii.
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제(ligase)를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii.
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h.
분자 유형 6을 검출하는 단계
상기 단계 I의 1개 이상의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있다.
본 발명에 따르면, DNA 말단(들)은 바람직하게는 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 포함하는 임의의 DNA 절단(들)의 결과이다. 바람직하게는, DNA 절단(들)은 단일-가닥 틈(nick), 단일-가닥 갭, 단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단, 이중-가닥 평활-말단(blunt-end) 절단, 이중-가닥 3'-돌출 절단(protruding break), 이중-가닥 5'-돌출 절단, 3'-OH 또는 5'-포스페이트 DNA 말단이 존재하지 않는 것들을 포함하는 유형의 DNA 가닥 절단을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 DNA 말단(들)의 검출은 인 시추에서 수행된다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 살아 있다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 고정된 것이다.
보다 바람직하게는 상기 생물학적 물질은 동물, 식물, 원생동물, 박테리아 세포, 바이러스, 조직 및 이들의 단편 및/또는 구성성분을 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 동물은 인간이다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 막에 의해 둘러싸인 세포 또는 조직 또는 이들의 단편이다. 이러한 구현예에서, 바람직한 하위-단계 c는 단계 I에서 수행된다.
바람직하게는 단계 I 하위-단계 a) 전에, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 추가의 단계가 수행된다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 용액 내에 또는 다공성 표면 또는 고형 지지체 상에 존재한다. 보다 바람직하게는 고형 지지체 또는 다공성 표면 유형은 유리, 플라스틱, 워터젤, 에어로젤, 금속 및 세라믹을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 1은 할로겐화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자, 예컨대 BrdU, IdU, CldU, 또는 DNA 전구체 유사체, 예컨대 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘), F-ara-EdU, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드 분자, ADP-리보스 분자, 또는 단백질 분자, 형광 분자, 또는 화학발광 분자, 또는 방사성동위원소, 또는 효소 기질, 또는 비오틴 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오사이드 분자를 포함하는 군으로부터 선택되고, 분자 유형 1은 또한, DNA 또는 RNA 말단(들)에 결합하고 분자 유형 2, 또는 유형 3, 또는 효소에 대한 임의의 다른 기질에 결합하기 위한 표적으로서 역할을 할 수 있는 임의의 다른 분자, 또는 임의의 이들의 유사체, 또는 올리고머, 또는 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 2 및 분자 유형 3은 독립적으로, 항체 또는 이의 단편, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 분자 또는 이의 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 및 이들의 임의의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 다른 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 2)와의 상호작용(선택된 영역의 혼성화), 이들의 결찰, 및 후속적인 RCA 반응을 가능하게 하는 서열의 핵산(올리고뉴클레오타이드 유형 1)에 공유 연결된 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 항체 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘 유사체, 비오틴 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항체 단편, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 6은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 3)이다.
바람직하게는 분자 유형 7은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있고, 분자 서명을 운반하거나 발생시킬 수 있는 다른 분자에 대한 결합 표적으로서 역할을 할 수 있는 분자이다.
바람직하게는 상기 단계 III에서 하위-단계 g의 증폭은 분자 유형 6에 결합하는 분자 유형 7의 첨가에 의해 향상된다.
바람직하게는 상기 분자 유형 7은 형광 화학발광 분자, 방사성동위원소, 효소 기질, 비오틴, 나노입자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
바람직하게는 촉매적 수단은 비-효소적 또는 효소적 수단을 포함한다. 보다 바람직하게는 효소적 수단은 DNA 폴리머라제 I, TdT, Klenow 단편, Phu 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, RNA 폴리머라제를 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 비-효소적 수단은 촉매적 특성을 갖는 화학적 인자를 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 비-촉매적 수단은 물리적 또는 생화학적 인자를 포함한다.
바람직하게는 하위-단계 h의 검출은 현미경, 높은 세포 수의 자동화된 분석 방법, 형광 현미경(광역(wide field), 공초점, 다초점, 초-해상(super-resolution), 사출(catapulting)을 이용하는 현미경, 레이저 스캐닝, 고속 대량, 고함량)을 포함하는 분광광도법, 형광측정법, 흡수 검출을 위한 투과광 광학 현미경, 유세포분석법, 세포 소팅(FACS), 질량 분광광도법을 포함하는 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행된다.
바람직하게는 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는다. 이러한 구현예에 따르면, 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 바람직하게 접촉시키는 단계는 상기 단계 III 하위-단계 g (i)에서 수행된다.
바람직하게는 DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 DNA 손상을 유도하지 않는다.
바람직하게는 단일 DNA 말단(들)을 검출하는 단계가 수득된다.
바람직하게는 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하는 단계가 획득된다.
바람직하게는, 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함한다:
I. 물질의 제조
a.
생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
b.
DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d.
화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f.
단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1의 상이한 유형의 결합 부위들에 결합하는 1차 항체인 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g.
DNA 말단(들)을:
ii.
2차 항체인 적합한 분자 유형 4 및 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
iii.
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iv.
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계
에 의해 검출하는 단계,
h.
분자 유형 6을 검출하는 단계.
바람직하게는 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함한다:
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
b.
DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d.
화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f.
단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1의 상이한 유형의 결합 부위들에 결합하는 1차 항체인 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g.
DNA 말단(들)을:
i.
2차 항체인 적합한 분자 유형 4 및 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii.
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii.
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계
에 의해 검출하는 단계,
h.
분자 유형 6을 검출하는 단계.
바람직하게는 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함한다:
I. 물질의 제조
a.
생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
b.
DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 4 및 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d.
화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 4 및 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f.
단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자: 1차 항체인 분자 유형 2 및 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된 스트렙타비딘인 분자 유형 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g. DNA 말단(들)을 하기 단계에 의해 검출하는 단계:
i.
선택적으로 2차 항체인 적합한 분자 유형 4를 분자 유형 2와 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii.
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 2 및 3에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 올리고뉴클레오타이드 유형 1이 분자 2와 공액되지 않는다면 분자 유형 3 및 4에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii.
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h. 분자 유형 6을 검출하는 단계.
본 발명은 또한, 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한, 롤링 서클 복제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적절하게 제조된 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출을 위한, 하기 단계의 용도에 관한 것이다:
-
적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
-
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
-
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계.
바람직하게는 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계가 수행된다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 하기 단계에 의해 제조된다:
- 선택적으로, 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
- DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
- 선택적으로 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계.
본 발명은 또한, 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출을 위한, 하기 단계 I 내지 III, 및 단계 I 내지 III 각각의 하위-단계 a 내지 h 중 적어도 하나를 포함하는 방법의 용도에 관한 것이다:
I. 물질의 제조
a.
생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화시키는 단계,
b.
DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c.
상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d.
화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e.
생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f.
단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g.
DNA 말단(들)을 하기 단계에 의해 검출하는 단계:
i.
선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii.
올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii.
효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h.
분자 유형 6을 검출하는 단계,
상기 단계 I의 1개 초과의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있다.
바람직하게는 DNA 말단(들)은 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 포함하는 임의의 DNA 절단(들)의 결과이다. 보다 바람직하게는, DNA 절단(들)은 단일-가닥 틈, 단일-가닥 갭, 단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단, 이중-가닥 평활-말단 절단, 이중-가닥 3'-돌출 절단, 이중-가닥 5'-돌출 절단, 3'-OH 또는 5'-포스페이트 DNA 말단이 존재하지 않는 것들을 포함하는 유형의 DNA 가닥 절단을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 DNA 말단(들)의 검출은 인 시추에서 수행된다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 살아 있다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 고정된 것이다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 동물, 식물, 원생동물, 박테리아 세포, 바이러스, 조직 및 이들의 단편 및/또는 구성성분을 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 동물은 인간이다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 막에 의해 둘러싸인 세포 또는 조직 또는 이들의 단편이다. 이러한 구현예에서, 바람직한 하위-단계 c는 단계 I에서 수행된다.
바람직하게는 단계 I 하위-단계 a) 전에, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 추가의 단계가 수행된다.
바람직하게는 상기 생물학적 물질은 용액 내에 또는 다공성 표면 또는 고형 지지체 상에 존재한다. 보다 바람직하게는 고형 지지체 또는 다공성 표면 유형은 유리, 플라스틱, 워터젤, 에어로젤, 금속 및 세라믹을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 1은 할로겐화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자, 예컨대 BrdU, IdU, CldU, 또는 DNA 전구체 유사체, 예컨대 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘), F-ara-EdU, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드 분자, ADP-리보스 분자, 또는 형광 분자, 또는 화학발광 분자, 또는 방사성동위원소, 또는 효소 기질, 또는 비오틴 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 단백질 분자, 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오사이드 분자를 포함하는 군으로부터 선택되고, 분자 유형 1은 또한, DNA 또는 RNA 말단(들)에 결합하고 분자 유형 2, 또는 유형 3, 또는 효소에 대한 임의의 다른 기질에 결합하기 위한 표적으로서 역할을 할 수 있는 임의의 다른 분자, 또는 임의의 이들의 유사체, 또는 올리고머, 또는 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 2 및 분자 유형 3은 독립적으로, 항체 또는 이의 단편, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 분자 또는 이의 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 및 이들의 임의의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 다른 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 2)와의 상호작용(선택된 영역의 혼성화), 이들의 연결, 및 후속적인 RCA 반응을 가능하게 하는 서열의 핵산(올리고뉴클레오타이드 유형 1)에 공유 연결된 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 항체 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘 유사체, 비오틴 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항체 단편, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 분자 유형 6은 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 3)이다.
바람직하게는 분자 유형 7은 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있고, 분자 서명을 운반하거나 발생시킬 수 있는 다른 분자에 대한 결합 표적으로서 역할을 할 수 있는 분자이다.
바람직하게는 상기 단계 III에서 하위-단계 g의 증폭은 분자 유형 6에 결합하는 분자 유형 7의 첨가에 의해 향상된다.
바람직하게는 상기 분자 유형 7은 형광 화학발광 분자, 방사성동위원소, 효소 기질, 비오틴, 나노입자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된다.
바람직하게는 촉매적 수단은 비-효소적 또는 효소적 수단을 포함한다. 보다 바람직하게는 효소적 수단은 DNA 폴리머라제 I, TdT, Klenow 단편, Phu 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, RNA 폴리머라제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는 비-효소적 수단은 촉매적 특성을 갖는 화학적 인자를 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 비-촉매적 수단은 물리적 또는 생화학적 인자를 포함한다.
바람직하게는 하위-단계 h의 검출은 현미경, 높은 세포 수의 자동화된 분석 방법, 형광 현미경(광역, 공초점, 다초점, 초-해상, 사출을 이용하는 현미경, 레이저 스캐닝, 고속 대량, 고함량)을 포함하는 분광광도법, 형광측정법, 흡수 검출을 위한 투과광 광학 현미경, 유세포분석법, 세포 소팅(FACS), 질량 분광광도법을 포함하는 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행된다.
바람직하게는 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는다. 이러한 구현예에 따르면, 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 바람직하게 접촉시키는 단계는 상기 단계 III 하위-단계 g (i)에서 수행된다.
바람직하게는 DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 DNA 손상을 유도하지 않는다.
바람직하게는 단일 DNA 말단(들)을 검출하는 단계가 수득된다.
바람직하게는 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하는 단계가 획득된다.
대표적인 구현예
본 발명에 따른 방법이 본 상세한 설명에 의해 뒷받침되는 청구항에 의해 기재되어 있으모로, 청구항을 기반으로 한 여러 가지 구현예들이 강조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법의 모든 하위-단계들은 순서 a 내지 h에서, 하나의 단계에 뒤이어 또 다른 단계가 사용된다(a, 뒤이어 b, b 뒤이어 c 등).
다른 구현예에서, 하위-단계 a 내지 c로부터 오로지 하나의 하위-단계, 뒤이어 하위-단계 d, e, f, g 및 h는 개시된 순서이다. 그렇긴 하지만, 또 다른 바람직한 구현예에서, 하위-단계 a 내지 c로부터 적어도 2개가 상기 방법에 사용된다.
본 발명에 따르면, 상기 방법의 소정의 구현예는 상술한 하위-단계 a 내지 c에 관한 변이를 고려하여 하위-단계 d 또는 d 및 e를 포함한다.
동일한 방식으로, 여러 가지 구현예들은 하위-단계 f 내지 h 와 관련하여 명시될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 모든 하위-단계 f, g 및 h가 본 방법에 사용된다. 모든 2차 하위-단계 i 내지 iii은 소정의 구현예에서, 하위-단계 g에 대해 사용될 수 있으나; 다른 구현예에서, 2차 하위-단계 i은 생략될 수 있다.
추가의 하위-단계에서 생물학적 물질을 가공하기 위한 단계 I에서 물질의 제조는 예를 들어, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키고/시키거나 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하기 전에, 고정, 투과, 용해, 단리, 분획화, 부동화 군으로부터 선택되는 하나 이상의 과정에 따라 수행될 수 있다.
상이한 구현예에서, 당업자는 상기로부터 적합한 방법을, 예를 들어 사용되는 생물학적 물질의 유형을 기반으로 예측하고 이용할 것이다.
예를 들어, 일 구현예에서, 생물학적 물질이 세포 또는 조직이라면, 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계가 수행된다.
단계 I 하위-단계 b에서 DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 살아 있는 세포 또는 조직에서 상기 생물학적 물질을 Tris, 또는 저삼투성 스트레스를 야기하는 임의의 다른 작용제와 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
단계 I 하위-단계 b에서 DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 생물학적 물질을 EDTA, 또는 세포 핵의 염색질 풀림(loosening) 및/또는 팽창을 야기하는 임의의 다른 작용제와 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
분자 유형 1 내지 7 및 뉴클레오타이드 1 내지 3의 변이는 본 발명에 따른 DNA 말단(들)의 검출 방법에 사용될 수 있다. 당업자는, 하위-단계 a 내지 h 및 2차 하위-단계 i 내지 iii의 어떤 조합 및 순서가 어떤 적용에 사용되어야 하는지 알 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 분자 유형 2 및 3은 항상, 친화도의 양태에서 상이하고/하거나 분자 유형 1에서 상이한 결합 부위들을 인지하고 결합하는 2개의 상이한 유형의 분자들이다.
하나의 구체적인 구현예에서, 단계 I에서 하위-단계 c는 생략되었고, DNA 말단(들)의 가공은 BrdU를 분자 유형 I로서 사용함으로써 수행되었고, 촉매적 수단은 효소 TdT이다. 이러한 경우, 분자 유형 2 및 3은 항체, 구체적으로, 각각 마우스 모노클로날 항-BrdU 항체 및 토끼 폴리클로날 항-BrdU 항체이다.
또 다른 구체적인 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공은 비오틴-공액 뉴클레오타이드(들)를 분자(들) 유형 1로서 사용함으로써 수행되었고, 촉매적 수단은 효소 DNA 폴리머라제 I이다. 이러한 경우, 분자 유형 2 및 3은 항체, 구체적으로, 각각 마우스 모노클로날 항-비오틴 항체 및 토끼 폴리클로날 항-비오틴 항체이다.
또 다른 구체적인 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공은 비오틴-공액 뉴클레오타이드(들)를 분자(들) 유형 1로서 사용함으로써 수행되었고, 촉매적 수단은 효소 DNA 폴리머라제 I이지만, 이러한 경우, 분자 유형 2는 항체, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항-비오틴 항체이고, 분자 유형 3은 스트렙타비딘 분자이며, 둘 모두는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된다. 2차 하위-단계 i은 생략되어야 한다.
또 다른 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공은 비오틴-공액 뉴클레오타이드를 또한 분자 유형 1로서 사용함으로써 수행되었으나, 촉매적 수단은 효소 Klenow 단편이다.
또 다른 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공은, 첫째로 (뉴클레오타이드의 존재 없이) DNA 폴리머라제 I의 엑소뉴클레아제 활성을 사용하여 시료에서 DNA 말단의 유형을 트리밍(trim)하고 변형시키며, 둘째로 비변형된 뉴클레오타이드와 조합된 비오틴-공액 뉴클레오타이드를 분자(들) 유형 1로서 그리고 효소 Klenow 단편을 촉매적 수단으로서 사용함으로써 수행되었다.
또 다른 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공은, ADP-리보스 단량체를 분자 유형 1로서 사용함으로써 수행되었고, 촉매적 수단은 효소 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제이고, 단계 II에서, DNA 말단(들)의 가공은 폴리(ADP-리보스) 글리코하이드롤라제를 사용한 내인성 폴리(ADP)-리보스 중합체의 분해 및 예를 들어, 프로테이나제 K를 사용한 단백질의 소화(digestion)와 함께 예상된다.
또 다른 구현예에서, 하위-단계 a 내지 d 후, 생물학적 물질의 단리가 수행된다. 또 다른 구현예에서, 분자 유형 2 및 3은, 상이한 수준의 친화도를 특징으로 하고 분자 유형 1에 존재하는 상이한 항원들에 결합하는 상이한 숙주들로부터의 1차 항체이다. 이러한 구현예에서, 적합한 분자 유형 4 및 5는, 1차 항체를 특이적으로 표적화하는 2차 항체이고, 상기 1차 항체는 분자 유형 1에 존재하는 항원에 결합된 분자 유형 2 및 3이다. 이러한 구현예에 대해 보다 구체적으로, 분자 유형 2 및 3은 각각 마우스 1차 항체 및 토끼 1차 항체이고, 분자 유형 4 및 5는 항-마우스 2차 항체 및 항-토끼 2차 항체이다.
또 다른 구현예에서, 분자 유형 2는 분자 유형 1에 존재하는 항원 또는 항원들에 결합하는 1차 항체이고, 이때, 분자 유형 1은 비오틴화된 뉴클레오타이드를 포함하고, 분자 유형 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된 스트렙타비딘 분자이다. 그 후에, 단계 III 하위-단계 g에서, 2차 하위-단계 i은 분자 유형 2를 소정의 숙주로부터의 1차 항체를 표적화하는 적합한 2차 항체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이는 분자 유형 4가 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액됨을 의미한다.
또 다른 구현예에서, 분자 유형 2는 분자 유형 1에 존재하는 항원 또는 항원들에 결합하는 1차 항체이고, 이때, 분자 유형 1은 비오틴화된 뉴클레오타이드를 포함하고 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되고, 분자 유형 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된 스트렙타비딘 분자이다. 이러한 구현예에서, 단계 g에서 2차 하위-단계 i은 생략된다.
또 다른 구현예에서, 분자 유형 2 및 3은 상이한 유형의 친화도를 특징으로 하고 분자 유형 1에 존재하는 상이한 에피토프들에 결합하는 상이한 숙주들로부터의 1차 항체이고, 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된다. 이러한 구현예에서, 하위-단계 g에서 2차 하위-단계 i은 생략된다.
또 다른 구현예에서, 분자 유형 2는 분자 유형 1에 존재하는 항원 또는 항원들에 결합하는 1차 항체이고, 이때, 분자 유형 1은 비오틴화된 뉴클레오타이드를 포함하고, 분자 유형 3은 스트렙타비딘 분자이다. 이러한 구현예에서, 하위-단계 g의 2차 단계 i에서, 분자 유형 2는 소정의 숙주로부터의 1차 항체를 표적화하는 적합한 2차 항체와 접촉되고, 이는 분자 유형 4가 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액됨을 의미하는 반면, 분자 유형 3은 스트렙타비딘에 독특한 항원을 인지하고 이에 결합하고 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된 분자 유형 5를 이루는 적합한 1차 항체와 접촉된다.
다른 구현예에서, 분자 유형 1이 임의의 비오틴화된 분자를 포함한다면, 단계 c는 생략될 수 없다.
또 다른 구체적인 구현예에서, 분자 유형 1은 자유 DNA 말단(들) 부위에서 결합되고 가교되는 DNA 말단(들) 가공에 관여하는 효소적 수단(예를 들어 DNA 폴리머라제 I, Klenow 단편, TdT 또는 PARP1)인 단백질이다. 분자 2 및 3은 상이한 수준의 친화도를 특징으로 하고 분자 유형 1에 존재하는 상이한 항원들을 인지하고 이에 결합하는, 다시 말해, 효소의 동일한 분자 상에 존재하는 상이한 에피토프들을 표적화하는 상이한 숙주들로부터의 1차 항체이다. 이러한 구체적인 구현예에서, DNA 말단(들)의 가공 후에, 가교 반응 및 뒤이은 투과 반응이 이어진다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 배양물 또는 조직 내 세포로부터 단리된 세포 핵에 적용될 수 있고, 이때, 상기 핵은 상업적으로 입수 가능한 시약 키트들 중 하나, 또는 임의의 다른 단리 방법, 예컨대 수크로스 방법을 사용하여 추출될 수 있다. 단리 후, 핵은 부동화되어야 하며, 예를 들어, 핵은 1x HBSS(137 mM Na+, 1 mM Mg2+) 중 폴리-D-라이신 표면에 부착될 수 있다. 하위-단계 b는 이러한 구현예에서 생략되어야 하지만, 염색질에서 DNA 말단의 접근성의 증가에 사용될 수 있는 Tris 완충제는 물질의 단리에 사용되는 구성성분들 중 하나이다.
또 다른 구현예에서, 핵은 하위-단계 d 후에 그러나 하위-단계 e 전에 세포로부터 단리되고 부착될 수 있다. 하위-단계 b는 이러한 구현예에서 생략되어야 하고, 세포는 단리 전에 가교를 받지 않아야 한다.
또 다른 구현예에서, 본 방법이 배양물 또는 조직 내 세포를 포함하는 생물학적 물질로부터 단리된 DNA 또는 추출된 염색질에 적용되어, 하위-단계 a가 생물학적 물질의 용해 및/또는 단리, 및/또는 분획화, 및/또는 부동화를 포함한다는 것을 의미한다면, 상기 물질은 예를 들어, 유리 상에서 부동화되거나, 상기 물질은 비오틴으로 피복되며, 비오틴화된 뉴클레오타이드가 DNA 말단의 부동화 및 추가의 변형 단계 전에 틈 번역 검정법을 사용하여 혼입된다면 스트렙타비딘으로 차단된 유리 상에서 부동화될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단을 변형시키는 경우, 효소와 변형된 및 비변형된 뉴클레오타이드의 혼합물, 예를 들어, 비변형된 뉴클레오타이드, 비오틴화된 뉴클레오타이드 및 BrdU의 혼합물과 함께 폴리머라제 I과 함께 TdT가 사용될 수 있다. 이들 구현예는 비오틴화된 뉴클레오타이드의 추가의 검출 확률을 배제하며; DNA 말단의 변형이 물질의 부동화 전에 용액 내에서 수행된다면, DNA는 이소프로판올을 사용하여 침전되고 70% 에탄올로 세척되고; 하위-단계 b는 생략된다.
다른 구현예에서, DNA 또는 염색질은 하위-단계 d 후에 그러나 하위-단계 e 전에 현탁액 또는 조직 내 부착성 세포 또는 세포들로부터 단리되고, 부동화된다(세포는 단리 전에 임의의 가교 반응을 받지 않아야 함).
또 다른 구현예에서, DNA 또는 염색질은 하위-단계 a 내지 g 후에 현탁액 또는 조직 내 부착성 세포 또는 세포들로부터 단리되고, 부동화된다.
상기 언급된 구현예는 또한, 생물학적 물질에서 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한 롤링 서클 복제의 용도, 및 DNA 말단(들)의 검출 방법의 용도를 반영한다.
정의
본 발명의 방법, 기법, 및 상기 방법에 사용되는 작용제, 예를 들어, 화합물, 조성물, 용액, 완충제를 기재하는 경우, 하기 용어는 다르게 나타내지 않는 한 하기 의미를 가진다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같이, 단수형("a," "an," 등 "the")은 사용의 맥락이 명확하게 다르게 나타내지 않는 한 상응하는 복수형을 포함한다. 용어 "포함하는(comprising)", "수반하는(including)" 및 "갖는(having)"은 포함적이고자 하고, 열거된 요소 이외의 추가의 요소가 존재할 수 있음을 의미한다. 본원에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 처리 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 수식되는 것으로 이해되며, 이는 본 발명의 목적을 위해 동등하고, 다르게 나타내지 않는 한 상호교환적으로 사용될 수 있다. 적어도, 청구항의 범위에 대한 등가물의 독트린(doctrine)의 적용을 제한하려는 시도가 아니게, 각각의 숫자는 보고된 유효 숫자의 측면에서 간주되고 일상적인 반올림 기법을 적용함으로써 간주되어야 한다.
본 발명이 DNA 말단(들)의 검출 방법에 관한 것이기 때문에, 본원에서 "DNA 말단"은, 뉴클레오타이드가 단지 하나의 다른 뉴클레오타이드와 연결되거나 데옥시리보스가 단지 하나의 포스페이트기와 연결되거나 포스페이트기가 2개 대신에 하나의 데옥시리보스 분자에 연결되는 DNA 분자 내의 부위로서 정의된다. 일반적으로, 이러한 말단은 (생물)화학적(예를 들어, 엔도뉴클레아제, 토포이소머라제) 또는 물리적(예를 들어, 이온화 방사선) 인자에 의해 발생될 수 있다. DNA 말단(토포이소머라제에 의해 생성되는 트랜지언트(transient) 또는 텔로미어에서가 아님)은 DNA의 기능을 방해하여, 세포 기능에 유해 효과를 야기한다.
용어 "DNA 손상"은 DNA의 염기 조성물, 염기 구조, 1차 구조 또는 2차 구조에서의 임의의 변화로서 이해되고, 염기 손실, 염기 산화, 포스포디에스테르 결합의 절단을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니고, 이는 손상제의 작용 전에 살아 있는 유기체의 정상적인 건강한 세포에서 확인되는 원래의 DNA 분자와 상이한 DNA 분자를 만든다. 전형적인 손상제는 예를 들어, 이온화 방사선, UV, 산화제, 메틸화제, 및 당업계에 잘 알려진 다른 것들이다.
"DNA 절단"은 본 상세한 설명에서 DNA 중합체의 불연속성을 초래하는, 공유 결합의 임의의 절단, 예를 들어, 포스포디에스테르 결합의 절단 또는 데옥시리보스 고리의 절단으로서 정의된다. DNA 절단은 전형적으로 DNA 손상을 유발하고, 본 발명의 목적을 위해 DNA 말단의 형성을 유발하는 것으로 이해된다. DNA 분자에서 관찰되는 DNA 절단의 대표적인 유형은 단일-가닥 틈, 단일-가닥 갭, 단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단, 이중-가닥 평활-말단 절단, 이중-가닥 3'-돌출 절단, 이중-가닥 5'-돌출 절단 등, 및 3'-OH 또는 5'-포스페이트 DNA 말단이 존재하지 않는 것들을 포함하는 유형의 DNA 가닥 절단을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"DNA 가닥(들)", "DNA 분자", "DNA 중합체", DNA는 본원에서 등가물로서 사용되고 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 따른 방법이 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출에 관한 것이기 때문에, 본 발명의 목적을 위해 "생물학적 물질"은 예를 들어, 인간을 포함하는 동물, 식물, 원생동물, 또는 박테리아 세포, 바이러스, 조직 및 이들의 단편 및 상기 물질의 구성성분을 포함하는 군으로부터 선택되는 살아 있거나 고정된 물질을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 물질 중 모두 또는 일부는 시험관내 조건 하에 절제되거나 성장되며, 추출, 분획화, 크로마토그래피 또는 다른 단리 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 "생물학적 물질의 제조"는 생물학적 물질의 고정, 투과, 용해, 단리, 분획화 방법, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 방법, 비특이적인 결합 부위를 차단하는 방법을 포함하는 군으로부터 선택되는 처리 방법을 포함한다.
용어 "생물학적" 물질의 "고정"은 생물학적 물질의 구조 및/또는 화학적 구성성분의 보존을 야기하고자 하는 생물학적 물질의 변화를 초래하는 화학적 및/또는 물리적 절차를 의미한다. 예는 포름알데하이드 또는 글루타르알데하이드에 의한 단백질 및 DNA의 가교, 에틸 알코올, 아세톤 또는 다른 화학물질(따라서 고정제라고 함)에의 노출에 의한 생물학적 물질의 보존을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "생물학적 물질의 투과"는 세포 또는 조직에 들어가기 위해 제한된 역량을 갖는 분자의 접근을 가능하게 하기 위해 생물학적 막(혈장 및 세포내) 및/또는 세포벽의 온전성을 약화시키는 화학적 및/또는 물리적 절차를 의미한다.
용어 "용해(lysis)"는 추가의 분석을 위해 가용성 구성성분을 추출하기 위해 생물학적 물질의 온전성의 파괴를 의미한다. 용해는 비제한적으로 균질화, 삼투압 충격, 또는 세제 및 다른 화학물질을 함유하는 용해 완충제를 포함하는 화학적 또는 물리적 수단에 의해 수행될 수 있다.
단리 단계는 본 발명에 따라, 적절하게 제조된 생물학적 물질을 달성하기 위해 필요할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 용어 "단리"는 물질로부터 특이적인 구성성분의 분리를 유발하는, 생물학적 물질 상에서 수행되는 임의의 과정을 의미한다. 특이적인 구성성분은 조직으로부터의 세포, 세포로부터의 세포소기관, 세포소기관의 단편, 핵으로부터의 염색질을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
용어 "생물학적 물질의 분획화"는 이러한 생물학적 물질로부터 하나 이상의 요망되는 구성성분을 분리하는 것을 의미한다. 분획화는 조(crude)(비가공된) 생물학적 물질, 뿐만 아니라 용해 과정에서 획득되는 물질에서와 같이 가공된 생물학적 물질에 적용될 수 있다.
"DNA 말단의 접근성을 증가시키는 것"은 분자(예를 들어 단백질)의 DNA 말단으로의 접근을 가능하기 위해 입체 장해(steric hindrance)를 제거하고 충분한 공간을 제공하는 과정이고, 그렇지 않으면 이들 말단과 접촉하는 데 있어서 제한된 역량을 갖게 된다.
생물학적 물질에서 비특이적인 결합 부위와 비교하여 용어 "차단하는"은, 검정법에 사용되는 중대한 분자, 예를 들어, 항체가, 선택된 분자가 검정법에 유용한 친화도를 나타내는 분자 표적 이외의 분자 표적에 결합하는 것의 방지를 유발하는 절차를 의미한다. 차단의 전형적인 예는 생물학적 물질에서 관심 분자의 항체 검출(면역검출)에 사용되는 절차이다. 항체는 잘-정의된 항원에 대한 것일 뿐만 아니라, 약한 화학적 상호작용을 통해 다양한 세포 구성성분들에 결합할 수 있다. 이러한 비특이적인 결합은 이러한 결합 부위를 차지하는 차단제(예컨대 알부민)의 사전 첨가(prior addition)에 의해 최소화된다.
본 발명의 목적에서 본 해결방안을 보다 잘 이해하기 위해, 용어 "분자 유형 1 내지 7"이 포함되었다.
"분자 유형 1"은 DNA 말단에 결합할 수 있고 비제한적으로 (a) 할로겐화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자, 예컨대 BrdU, IdU, CldU, 또는 DNA 전구체 유사체, 예컨대 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘), F-ara-EdU, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드 분자, (b) 형광 분자, 또는 화학발광 분자, 또는 방사성동위원소, 또는 효소 기질, 또는 비오틴 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오사이드 분자, (c) DNA 또는 RNA 말단(들)에 결합하고 분자 유형 2, 또는 유형 3, 또는 효소에 대한 임의의 다른 기질에 결합하기 위한 표적으로서 역할을 할 수 있는 ADP-리보스 분자, 또는 단백질, 또는 임의의 다른 분자, 또는 임의의 이들의 유사체, 또는 올리고머, 또는 중합체, 또는 이들의 조합을 이루는 임의의 분자로서 정의된다.
"분자 유형 2" 및 "분자 유형 3"은 분자 유형 1과 상호작용하고/하거나 이에 결합하는 역량을 갖는 비제한적으로, 항체 또는 이의 단편, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 분자 또는 이의 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 및 이들의 임의의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 분자로서 정의된다.
"분자 유형 4" 및 "분자 유형 5"는 비제한적으로, 다른 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 2)와의 상호작용(선택된 영역의 혼성화), 이들의 결찰, 및 후속적인 RCA 반응을 가능하게 하는 서열의 핵산(올리고뉴클레오타이드 유형 1)에 공유 연결된 항체를 포함하는 분자로서 정의된다. 분자 유형 4 및 유형 5는 분자 유형 2 및 유형 3과 상호작용하고/하거나 이들에 결합하는 역량을 가진다.
용어 "결찰"은 촉매화된 반응에 의해 2개 분자들 사이에서 공유 화학 결합을 형성하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 결찰은, RCA 반응에서 주형으로서 역할을 할 고리형 올리고뉴클레오타이드를 발생시키기 위해 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 말단들의 접합, 뒤이은 이들 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드 유형 1, 즉, 분자 유형 4 및 5의 구성성분을 이루는 올리고뉴클레오타이드(항체에 연결된 올리고뉴클레오타이드)의 혼성화 과정을 지칭한다.
본 발명의 상세한 설명에서 사용된 바와 같이, "혼성화"(핵산 혼성화, 올리고뉴클레오타이드-올리고뉴클레오타이드 혼성화)는 핵산의 2개의 상보적 신전물(stretch)(2개의 올리고뉴클레오타이드) 사이에서 수소 결합을 형성하는 과정(어닐링)을 지칭한다.
"분자 유형 6"은 비제한적으로, 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합(혼성화)할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 3)를 포함하는 분자로서 정의된다. 분자 유형 6은 분자 서명, 예를 들어, 형광 발광을 운반하며, 상기 분자 서명은 적절한 장비, 예를 들어, 형광 현미경, 유세포 분석기, 레이저 스캐닝 세포분석기 또는 분광형광계에 의해 검출된다.
RCA 반응 후 증폭 단계(단계 3, 하위-단계 g, iii)에서 사용되는 용어 "분자 유형 6(올리고뉴클레오타이드 유형 3)"에서 "올리고뉴클레오타이드"는 RCA 반응의 생성물에 혼성화하고자 하고, 보편적인 지식(예를 들어, FISH - 형광 인 시추 혼성화에서와 같이)을 기반으로 당업자에 의해 선택될 수 있다.
"분자 유형 7"은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있고, 분자 서명, 예를 들어, 질량 분광광도법에 의해 검출 가능한 표지와 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드, 또는 후속적으로 결찰되고 검출 가능한 생성물을 유발하는 RCA 반응에 대한 기질로서 역할을 하는 올리고뉴클레오타이드를 운반하거나 발생시킬 수 있는 다른 분자에 대한 결합 표적으로서 역할을 할 수 있는 분자로서 정의된다.
예를 들어, 분자 유형 1 내지 7의 정의에 사용되는 용어 "결합"은, 공유 결합 또는 결합들의 형성을 유도함으로써, 또는 약한 화학적 상호작용 또는 결합(수소, 이온, 소수성, 반데르발스를 포함함)을 유도함으로써, 다양한 분자들을 영구적으로 또는 일시적으로 접촉시키는 것을 의미하고, 이때, 상기 분자들을 접촉, 연결 또는 부착시키는 것은 효소적 또는 비-효소적 수단에 의해 달성된다. 본 발명에 따른 결합 과정의 일례는 분자 유형 1을 DNA 말단과, 또는 분자 유형 2 및 3을 분자 유형 1과 접촉시켜 이들 분자 사이에서 새로운 연결을 형성하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "촉매적 수단"은, 자발적으로 발생하지 않는 시스템에서 화학적 변화를 야기하는 방법 또는 작용제를 의미하지만, 이들은 특이적인 효소(단백질 촉매), RNA 또는 다른 인자들, 예를 들어, 표면(예를 들어 백금 표면) 또는 저분자량 화학물질의 작용을 이용함으로써 가능해진다.
"RCA 반응" 또는 "롤링 서클 증폭 반응"은 당업자에게 알려진 반응으로서, 롤링 서클 복제(RCR)를 이용한다. RCR은 DNA 또는 RNA의 고리형 분자의 다수의 복사물들을 합성할 수 있는 핵산의 신속한 복제이다. 상기 반응은 일부 박테리오파지 및 바이러스에 의해 사용되는 자연적인 생물학적 시스템으로부터 유래된다. 본 발명에 사용되는 'RCA 반응'은 DNA 말단에 대한 정보를 수송하는 검출 가능한 신호의 발생을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법의 검출 단계를 이해하기 위해, 본원에 사용되는 용어 "신호"는 RCA 반응 정의뿐만 아니라 본 명세서에 제공되는 다른 정의에서 분자 또는 분자들의 검출 가능한 서명, 예를 들어, 특징적인 형광 발광, 또는 전자기파의 에너지의 다른 특징적인 흡수 또는 방출, 또는 자기 공명 특성 또는 다른 분광광도적, 화학적 또는 물리적 특징을 의미한다.
"신호의 증폭"은 관심 분자 또는 이의 분자 환경을, 이러한 관심 분자의 존재 및/또는 특성에 대한 정보를 수송하는 더 강하고 보다 쉽게 검출 가능한 신호를 초래하는 방식으로 변형시키는 절차 또는 절차들을 의미한다. 본 발명에 따르면, 증폭은 많은 수의 분자들을 발생시키는 RCA 반응에 의해 가능해지며, 상기 분자들은 후속적으로, 전형적인 수단에 의해 검출될 수 있는 "증강된" 신호, 예를 들어, 형광 신호를 초래하는 다수의 표지된 분자들에 의해 인지된다.
"검출"은 당업자에게 명백한 바와 같이, 목적 또는 특성이 숨겨져 있거나 쉽게 알아채 지지 않는 환경에서 이러한 목적 또는 특성의 존재에 대한 정보를 획득하는 역량이다. 본 발명에 따르면, 정보는 시료로부터 유래되는 형광 또는 다른 신호에서 인코딩되고 전용 장비에 의해 기록될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 검출 기법은 다양한 유형의 현미경들, 높은 세포 수의 자동화된 분석 방법, 형광 현미경(광역, 공초점, 다초점, 초-해상, 사출을 이용하는 현미경, 레이저 스캐닝, 고속 대량, 고함량)을 포함하는 분광광도법, 형광측정법, 흡수 검출(조직학)을 위한 투과광 광학 현미경, 유세포분석법, 세포 소팅(FACS), 질량 분광광도법을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 관하여, 본 방법의 특징부를 이해하는 것은 매우 중요하며, 검출 민감도는 적은 수의 또는 많은 수의 관심 객체, 또는 적은 수의 또는 많은 수의 관심 특성을 검출하는 능력으로서 추가로 정의되며; 높은 민감도는 적은 수의 또는 많은 수의 관심 객체 또는 특성을 검출하는 능력을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 검출 능력과 비교하여 높은 민감도는, 심지어 단일(하나의) DNA 말단이 적절한 기법에 의해 검출 가능함을 의미한다. 명백한 것은, 임의의 다른 더 많은 수의 단일 말단들(많은 말단들)은 본 발명에 따른 방법에 의해 검출 가능하다. 상기 사실들은, 하기 상세한 설명에 제시된 실시예에 예시되어 있다.
본 발명에 따른 청구항에서, 다른 용어가 또한 도입되어 본 발명의 보호 범위를 기재하였다.
용어 "변형된 뉴클레오타이드"는, 살아 있는 유기체의 DNA 또는 RNA에서는 통상적으로 존재하지 않는 작용기 또는 작용기들의 소유 또는 다른 화학적 변형에 의해 DNA 또는 RNA의 구축 블록(block)인 뉴클레오타이드와 상이한 뉴클레오타이드를 의미한다. 비-제한적인 예는 브로모데옥시우리딘, 에티닐데옥시우리딘 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드 유형 1"은 비제한적으로, 분자 유형 4 및 분자 유형 5를 형성하기 위해 항체에 연결되고 올리고뉴클레오타이드 유형 2와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드로서 정의된다.
용어 "올리고뉴클레오타이드 유형 2"는 (i) 분자 유형 4 및 분자 유형 5의 구성성분인 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 혼성화하며, (ii) 결찰을 겪고, 따라서, (iii) 후속적인 RCA 반응을 위한 기질을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드 유형 3"은 당업계에 알려진 방법에 의해 검출 가능하며, RCA 반응에 의해 형성된 생성된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 형광단 또는 형광단들, 또는 다른 표지로 표지화된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
증폭 단계(단계 3, 하위-단계 g, iii)에서 지칭되는 "뉴클레오타이드 용액"은 살아 있는 유기체의 DNA의 전형적인 구성성분인 4개의 뉴클레오타이드들의 용액이다.
본 발명의 방법을 보다 잘 이해하기 위해, 청구항에서 하기 시스템이 사용되었다. 본 발명에 따른 방법은 3개의 주요 단계 I 내지 III을 포함하고, 각각의 단계는 추가의 하위-단계 a 내지 g를 포함한다. 나아가, 하위-단계 g는 3개의 2차 하위-단계 i 내지 iii을 포함한다. 상기 단계들은 제시된 순서대로 수행되어야 하며, 즉, 단계 II는 단계 I을 뒤따라야 하고, 단계 III은 단계 II를 뒤따라야 하고, 각각의 이들 주요 단계들은 적어도 하나의 하위-단계를 포함해야 한다. 다르게 나타내지 않는 한, 다른 하위-단계는 청구항에서 나타낸 바와 같이 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있고, 이들의 많은 조합들이 사용될 수 있다. 용어 "선택적으로"는, 하위-단계(예를 들어, 2차 하위-단계)가 본 방법에 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있음을 의미한다. 주요 단계 I 내지 III의 명칭은 정의된 의미를 갖지 않고, 단계 순서를 구조화하여 본 방법을 이해할 수 있고 명확하게 하기 위해 도입되었다.
본 발명에 따른 상기 기재된 분자 유형 1 내지 7, 올리고뉴클레오타이드 1 내지 3 또는 다른 유형의 분자, 또는 이들의 용액은 상업적인 공급원으로부터 입수되고/되거나 임의의 편리한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 보편적인 지식을 기반으로 하고 본 명세서의 정의에 따른 상기 언급된 분자의 선택은 다르게 언급되지 않는 한, 당업자에게 자연적이고 명백한 것으로 여겨져야 한다.
본 발명에 따른 방법이 분자 진단 분야에 알려진 비변형된 방법, 예컨대 표준 TUNEL, 또는 종래에 단백질의 검출에 사용되도록 권고된 PLA 방법의 사용을 포함하지 않지만, 이의 접근법의 단지 부분, 요소 또는 양태를 사용하기 때문에, 일반적으로 정의된 분자 1 내지 7, 올리고뉴클레오타이드 1 내지 3, 또는 다른 유형의 분자 또는 이들의 용액, 뿐만 아니라 배지, 예컨대 완충제 중 일부는 상업적으로 입수 가능한 키트로부터 본 발명의 실현에 개별적으로 또는 그룹(들)으로 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명에 지정된 특이적인 화합물의 카탈로그를 분자 1 내지 7로서 제공하고 이의 사양을 실시예에 제공하는 것은, 공급업체가 이들의 특징을 제공하지 않기 때문에 가능하지 않은 것이 명백하다.
예를 들어, 분자 유형 6은 RCA 생성물과의 혼성화를 가능하게 하는 서열을 가져야 하고, 부착된 형광 분자를 가져야 한다. 일반적으로, 이러한 서열 및 형광 분자 유형은 이들의 제조업체에 의해 개시되어 있지 않다. 상기에 대한 또 다른 예는, 추가의 RCA 반응에 적합한 또 다른 뉴클레오타이드(기질)일 수 있거나 특이적인 형광을 방출하는 형광 표지된 분자일 수 있거나, 또 다른 분자와 함께 FRET를 나타낼 수 있는 등이다.
상업적으로 입수 가능한 키트, 시약 및 이들의 공급업체의 예는 APO-BRDU 키트(AU:1001, Phoenix Flow Systems), HCS DNA 손상 키트(H10292, ThermoFisher,), 비색 TUNEL 세포자멸사 검정법(#8088, ScienCell), OxiSelect™ Comet 검정법 키트(STA-350, Cell Biolabs, Inc.), NEBuffer2(NEBiolabs, B7002S), N6-(6-아미노)헥실-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 - 비오틴(비오틴-7-dATP)(Jena Bioscience, NU-835-BIO-S), 비오틴-16-프로파길아미노-dCTP(Jena Bioscience, NU-809-BIO16), 비오틴-16-5-아미노알릴-dUTP(Jena Bioscience, NU-803-BIO16), dGTP(Jena Bioscience, NU-1003), DNA 폴리머라제 I(이. 콜라이(E. Coli))(NEBiolabs, MO209), Duolink® 인 시추 PLA 프로브 항-마우스 MINUS(Sigma, DUO92004), Duolink® 인 시추 PLA 프로브 항-토끼 PLUS(Sigma, DUO92002), Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014), Duolink® 인 시추 검출 시약 레드(Sigma, DUO92008), Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)이다.
당업계의 측면에서 본 발명의 주요 이점의 예는 하기에 기재된다.
본 발명에 따른 방법은 당업계의 임의의 알려진 방법을 사용하여 달성되지 않았던 DNA 말단(들)의 직접적인 검출 및 후속적인 시각화를 가능하게 한다. 본 발명은 단일 DNA 절단의 존재 및 위치를 표시할 수 있게 한다. 이들 특징부는, 본 발명이 당업계에 존재하는 필수적인 기술적 문제점을 해결하는 것을 생각할 수 있게 하며, 즉, 핵에서 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 절단의 존재, 수 및 장소를 결정할 수 있게 하고, 절단(들)의 유형을 구별하는 능력을 제공한다. 이는, 대상체의 DNA의 품질을 평가하고, DNA 손상 유도, 감지 및 복구 기전의 추가 연구에 필요하다.
더욱이, 결정 자체가 본 발명의 방법에 의해 달성될 수 있을 뿐만 아니라, DNA 말단의 수의 정량적 검정법이 수득될 수 있다. 상기 언급된 특징부는 생물학적 물질의 품질, 또는 환경 유해의 존재를 평가하는 데 사용될 수 있다.
상기 언급되고 청구항에 노출될 뿐만 아니라 실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 고도로 민감하며; 당업계에 알려진 다른 방법들보다 더 민감하다. 본 발명은 심지어 단일 DNA 절단을 직접적으로 검출할 수 있게 한다.
나아가, 본 발명은 고도로 특이적이고, 특이적인 유형의 DNA 병변을 검출할 수 있게 하는 방법에 관한 것이다. 이에 의해 수득되는 지식은, 이러한 지식이 DNA 절단의 형성의 병인(etiology)에 관한 정보와 유전적 장애에서 이의 역할의 적절한 조합과 함께 사용된다면, 예를 들어, 진단 목적에 사용될 수 있다.
본 방법은 또한, 본 발명의 범위에 관하여 유니버셜하다. 상기 방법은 사용되는 DNA 절단 유형, DNA 말단의 유형, 생물학적 물질, 분자, 시약의 종류 및 기법을 고려하여, 사용되는 여러 가지 구현예들의 능력에 관여한다.
도 1. HeLa 세포에서 DNA 말단을 검출하는 절차의 일례에서 사건들의 순서의 도해이다. 이는 방법의 예시적인 변이, 즉, 분자 2 및 3이 1차 항체이고 분자 유형 4 및 5가 2차 항체일 때 생물학적 물질에서 DNA 말단의 검출을 유발하는 구현예의 주요 부분이고, 이는 11개의 하기 다이어그램에 기재될 수 있다: 1. DNA 절단은 살아 있는 세포에서 형성된다. 이러한 계획은 임의의 유형의 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 절단을 나타낸다. 2. 세포의 고정에 뒤이어, 효소는 DNA 절단을 인지한다. 3. 상기 효소는 분자 유형 1(뉴클레오타이드 유사체)을 DNA 말단에 연결하기 시작한다. 많은 분자 유형 1들이 다이어그램에 도시된 2개의 DNA 말단들에 첨가된다. 4. 효소의 작용은 2개의 인지된 DNA 말단들 각각에 부착된 분자 유형 1의 사슬의 형성을 초래한다. 5. 2가지 유형의 분자, 유형 2 및 3은 DNA 말단에 부착된 분자 유형 1을 인지하고 부착한다. 부착하는 분자 2 및 3의 수 및 역가(titer)는 많은 분자 유형 2 및 3을 분자 유형 1의 사슬 상에서 서로에 대해 가까이 위치시키기에충분히 높다(명확히 하기 위해, 2개의 DNA 절단 중 하나에 부착하는 다양한 분자들만 도시됨). 6. 분자 유형 1의 사슬에 이미 부착된 분자 유형 2 및 3은 분자 유형 4 및 5에 의해 인지된다. 이들 분자 유형 4 및 5는 DNA 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 1, 2개 부류)와 공액되고, 분자 2 및 3에 결합한다. 7. 올리고뉴클레오타이드(유형 2, 2개의 상이한 올리고뉴클레오타이드들의 용액)는 올리고뉴클레오타이드 유형 1(분자 유형 4 및 5의 구성성분들임)과 혼성화한다. 8. 효소 리가제는 혼성화된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 말단들을 결찰하여, RCA 반응에 필요하게 될 고리형 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 9. RCA 반응에 준비가 된, 결찰의 생성물, 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 혼성화된 고리형 올리고뉴클레오타이드. 10. RCA 반응의 생성물 - 항체 4 또는 5 중 하나에 부착된 길이가 긴(long) 올리고뉴클레오타이드. 11. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드 유형 3은 RCA 반응의 생성물과 혼성화하여, DNA 절단의 존재 및 위치를 표시한다. 이러한 계획은 생물학적 물질의 제조 단계를 포함하지 않는데, 왜냐하면 이것이, 예시가 포커스를 둔 분자 유형 1 내지 6 사이의 상호작용의 설명에 필요하지 않기 때문이다.
도 2. 표준 TUNEL 검정법과 절차 1에 따른 방법의 민감도 사이의 비교 - 형광 공초점 이미지이다. 자유 DNA 말단이 표준 TUNEL 검정법(APO-BRDU) 또는 절차 1에 따라 검출되었던 DNase I 처리된 HeLa 세포 및 비처리된 세포의 대표적인 형광 공초점 이미지가 도시된다. 절차 1에 따라 제조된 시료에서, 자유 DNA 말단은 밝고 분명한 형광 포커스(우측 컬럼)로서 보여질 수 있다. 두 검정법 모두의 경우, 고농도의 DNase I을 이용한 세포의 처리(4U, 첫번째 열)는 비처리된 세포(0 U, 세번째 열)와 비교할 때 핵에서 신호의 유의한 증가를 초래하였다. 그러나, 절차 1에 따라 제조된 시료의 경우에만, 저농도의 DNase I로 처리된 세포(두번째 열, 우측 이미지)와 비처리된 세포(세번째 열, 우측 이미지) 사이에 차이가 존재하였으며 - 검출된 자유 DNA 말단의 수는 DNase 처리된 세포에서 더 높다. 표준 TUNEL 검정법의 경우, 비처리된 세포(세번째 열, 좌측 이미지)와 비교할 때 저농도의 DNase I로 처리된 시료(두번째 열, 좌측 이미지)에서 어떠한 유의한 형광 신호도 관찰되지 않는다. 척도 막대 - 20 μm.
도 3. TUNEL 검정법과 절차 1에 따른 방법의 민감도 사이의 비교 - 상자 도면이다. 상자 도면은 DNA 절단의 현미경 이미지의 분석 결과를 나타낸다. 표준 TUNEL 검정법(APO-BRDU)의 경우, 신호는 핵 내에서 픽셀(형광 강도)의 평균 회색 값이었다(TUNEL은 개별적인 DNA 절단의 이미지를 산출하지 않으며, 상기 TUNEL은 단지 핵 전체를 통해 선명하지 못한(grainy) 신호를 초래함을 주목함). 절차 1에 따른 방법의 경우, 각각의 핵에서 포커스의 수가 결정되었다. 각각의 상자의 하단은 25번째 백분위이며, 상단은 75번째 백분위이고, 중간의 선은 50번째 백분위이며, 위스커(whisker)는 10번째 및 90번째 백분위이다. 수평 실선(상자보다 넓음)은 평균 값을 나타낸다. 독립적인 2-시료 t-검정은, 저농도의 DNase I로 처리된 시료(0.2 U)와 비처리된 시료(0 U) 사이의 평균 값의 차이가 절차 1에 따라 세포를 가공한 후에만 통계학적으로 유의함을 보여주었다(우측 그래프; p-값=2.8 x 10-7). 이는, 절차 1에 따른 방법이 표준 TUNEL 검정법보다 유의하게 더 민감함을 나타낸다.
도 4. 표준 틈 번역 검정법 및 절차 2에 따른 방법에 의한 DNA 말단의 검출에 대한, 내인성 비오틴의 차단 효과의 평가이다. 자유 DNA 말단이 표준 틈 번역 검정법(첫번째 열) 또는 절차 2(두번째 열)에 따라 검출되었던 비처리된 HeLa 세포의 대표적인 형광 공초점 이미지이다. 시료는 사전-차단 단계(절차 2에서 단계 3 - 내인성 비오틴의 차단)와 함께 또는 없이 제조되었다. 표준 틈 번역 검정법에 따라 제조된 시료의 경우, 내인성 비오틴의 차단은 세포 핵에서 형광 신호의 유의한 저하를 초래하며 - 신호의 차이는 기록된 공초점 이미지(첫번째 열) 상에서 명백하게 볼 수 있다. 절차 2에 따라 제조된 시료의 경우, 사전-차단은 수득된 이미지(두번째 열) 상에서 주요한 영향을 갖지 않는다. 척도 막대 - 20 μm.
도 5. 복구 단백질 XRCC1의 축적 영역과 비교하여 DNA 절단 부위에서 BrdU 분자의 혼입의 검출이다. BrdU 분자의 혼입은 TdT 효소에 의해 인지되는 특이적인 유형의 DNA 3'-OH 말단을 표시하고, 이러한 말단은 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭이 발생할 때 존재한다. 상기 갭은 BER 경로에 의해 복구된다. XRCC1 단백질은 이러한 복구 과정에 관여하는 주된 복구 인자들 중 하나이다. BrdU가 인접한 XRCC1 포커스와 함께 검출되는 부위는 대체로 추정컨대 유일하게, 단일-가닥 갭이 발생하는 부위이다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하고, BrdU 포커스의 형광 최대치(정사각형)을 확인하고 배정하는 데 사용되었다. 상기 최대치는 BrdU 포커스의 매스(mass)의 중심을 나타내고, 따라서, DNA 손상의 국소화를 표시한다. 복구 단백질 포커스를 나타내고 프로파일에서 상기 언급된 최대치를 국소화하는 이미지의 형광 프로파일(현미경 이미지 패널 하에, 하단에서)의 분석은, DNA 절단이 XRCC1 복구 포커스에 인접하거나 상기 포커스의 주변 영역에서 일관되게 검출됨을 보여준다. 현미경 이미지에서 검출되는 XRCC1과 BrdU 포커스 사이에 분명한 공간적 연관성이 존재한다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사(projection)이다. 형광 강도의 프로파일은 화살표들 사이의 영역에서 측정되었다.
도 6. BrdU 혼입에 의해 표지되는 DNA 절단의 국소화이며, 이들은 DNA 복제 영역(EdU로 표지됨) 및 XRCC1 복구 포커스와 비교하여 대체로 추정컨대 단일-가닥 갭이다(실시예 4에 기재되고 설명된 바와 같음). 프로파일(BrdU 포커스 - 정사각형, DNA 복제 영역 - 마름모)에서 복구 단백질 포커스를 나타내고 형광 최대치를 국소화하는 이미지의 형광 프로파일(하단에서)의 분석은, 3가지 유형의 하위핵 객체 사이에서 공간적 연관성을 확증한다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하며, 형광 최대치를 확인하고 배정하고, 형광 강도 프로파일을 생성하는 데 사용되었다. DNA 복제의 모든 영역이, 절차 1에 따른 검출 방법의 최소화된 교차-반응성을 입증하는 BrdU 검출 영역과 연관이 있는 것은 아니다(상기 방법은 EdU의 임의의 비특이적인 검출 없이 BrdU의 검출만 유발함). 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다. 형광 강도의 프로파일은 화살표들 사이의 영역에서 측정되었다. 척도 막대: 5 μm 또는 1 μm(이미지에서 확대된 부분).
도 7. 대조군, 세포자멸사 및 손상된 HeLa 세포의 예이다. a). BrdU가 혼입되고 절차 1에 따른 방법을 사용하여 검출되었던 세포 핵의 이미지의 예이다. 이 예는 세포 배양물에서 세포자멸사 세포의 검출 방법의 적용성을 입증한다. 세포자멸사 세포의 핵은 정상적인 대조군 세포의 핵보다 유의하게 더 많은 DNA 절단을 함유한다. b). 상이한 손상제들(UV, 토포테칸(Tpt) 및 H2O2)로 처리된 세포의 이미지의 예이다. 상자 도면은, 상이한 작용제들의 처리가 비처리된 대조군 세포와 비교하여, 검출 가능한 BrdU 분자 혼입 영역의 평균 수의 증가를 유발함을 보여준다. BrdU의 혼입 영역은 DNA의 자유 말단의 국소화 영역을 나타낸다(하기 물질로 처리된 세포의 평균 수: H2O2: 31.57 ± 8.61, UV: 10.73 ± 4.89, Tpt: 16.39 ± 4.92). 그 결과는 스튜던츠 t-검정(p-값)을 사용하여 시험되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. c). 패널은 핵-내 및 염색질 구조(DAPI)와 비교하여 H2O2로 처리된 세포 핵에서 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭의 국소화를 예시하는 이미지의 일례를 제시한다. 형광 강도의 프로파일은 상기 이미지에서 선으로 표시된 영역으로부터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득되었다. DAPI의 형광 강도 및 DNA 절단을 나타내는 형광 최대치(BrdU 포커스)에 대한 면밀한 관찰은 손상된 영역에서 염색질의 국소적인 밀도에 대한 정보를 줄 수 있다. 제시된 이미지에서, BrdU 포커스는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 검출된 형광 최대치를 이용하여 시각화되었다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다. 척도 막대: 5 μm.
도 8. BrdU 혼입 없이 절차 1에 따라 처리된 HeLa 세포에서 검출된 형광 신호의 수준의 대조군 측정이다. 검출된 포커스의 수 및 관찰된 핵의 수는 평균적으로, 1개의 단일 세포 핵 당 검출되는 포커스가 단지 0.13 ± 0.04개(핵의 총 수 N = 63) 존재함을 보여준다. 상기 포커스는 형광 신호의 수준이 0 a.u.보다 더 높은 영역으로서 정의되었고, 이들의 국소화는 형광 최대치를 국소화하는 ImageJ 소프트웨어의 빌트-인(built-in) 특징부를 사용하여 결정되었다. 이들 중 대부분은 세포 핵의 외부에서 국소화되었고, 이는 DAPI로 염색된 세포 핵의 형광 이미지와 형광 최대치의 중첩을 기반으로 결정되었다. 제시된 현미경 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
도 9. 광역학적 효과(에티듐 브로마이드(500 nM) 및 488 nm 레이저 광선)에 의해 세포 핵의 작은 선택된 영역에 가해진 DNA 절단(들)의 직접적인 검출이다.
Hela 세포는 에티듐 브로마이드(500 nM)와 함께 인큐베이션되었고, 백색 원(circle)(첫번째 열)에 의해 표시된 장소에서 488 nm 레이저 광선(9 mJ - 손상을 유도하는 것으로 알려진 선량(문헌[Zarebski, M., Wiernasz, E. and Dobrucki, J. W. (2009), Recruitment of heterochromatin protein 1 to DNA repair sites. Cytometry, 75A: 619-625. doi:10.1002/cyto.a.20734)])을 사용하여 투광되었다. DNA 절단은 표준 TUNEL(좌측 컬럼) 및 절차 1(우측 컬럼)에 따라 검출되었다. DNA 절단(들)(포커스)은 형광 이미지(두번째 열) 및 형광 강도 프로파일(세번째 열, 형광 강도 프로파일은 화살표들 사이에서 측정되었음) 상에서 제시된 바와 같이, 절차 1에 따른 검출 후에만 보인다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하고 형광 최대치를 확인 및 배정하고 형광 강도 프로파일을 생성하는 데 사용되었다.
도 10. U2-OS 세포에서 뉴클레아제 SpCas9에 의해 유도된 수십 개의 분할(염색체 3의 하위텔로머성(subtelomeric) 영역에서 유도된 분할)의 검출에 사용된, 표준 TUNEL 방법과 절차 1에 따른 방법 사이의 비교이다. 형광 강도의 이미지 및 프로파일은, 뉴클레아제 SpCas9의 축적과 연관된 영역에서 측정되고 BrdU의 표준 면역형광 검출(표준 TUNEL 검정법)에서 사용된 2차 항체와 공액된 Alexa Fluor® 594에 의해 방출된 형광 강도의 평균 값이 대략 0 a.u.였음을 보여준다(50개의 핵이 분석되었고, 값은 비-특이적으로 결합된 항체 분자를 나타내는 배경 신호의 수준을 기반으로 정규화되었음). 기록된 현미경 이미지의 대표적인 예에 대해 측정된 형광 프로파일의 예는, 표준 TUNEL 검정법이 적용되었을 때 표준 형광 광역 현미경을 사용하여 기록된 현미경 이미지에서 어떠한 BrdU 포커스도 검출될 수 없었음을 분명하게 예시한다. 각각, 절차 1에 따른 방법이 적용된 경우, 어떠한 비-특이적인 배경 신호도 검출되지 않았고, BrdU의 혼입 영역은 현미경 이미지에서 시각화된 분명한 포커스에 의해 나타났다. 이들 포커스는 SpCas9의 축적 영역과 함께 공동국소화되었고, 이들은 형광 강도의 프로파일에서 추가로 예시되었다. 형광 강도 프로파일은 화살표들 사이의 영역에 대해 생성되었다. 이미지 크기: 30 x 30 μm.
도 11. 인간 U2-OS 세포에서 뉴클레아제 SpCas9에 의해 유도된 단일 분할의 검출에서 절차 1에 따른 방법의 적용이다. SpCas9가 임의의 분할 활성을 수행하지 않는 경우, 뉴클레아제 축적 영역에서 어떠한 BrdU 포커스도 검출될 수 없다. 다시 말해서, SpCas9의 축적 부위에서 단일 절단의 유도는 혼입된 BrdU 분자의 검출을 초래한다. 분명한 BrdU 포커스는 SpCas9 포커스와 공간적으로 연관이 있으며, 이는 형광 강도의 프로파일에 의해 추가로 예시된다. 프로파일은 화살표들 사이에서 측정되었다. 그 결과는, 절차 1에 따른 방법이 DNA 절단의 인지에서 매우 높은 민감도에 도달할 수 있으며 - 심지어 단지 하나의 단일 이중-가닥 DNA 절단이 검출될 수 있음을 입증한다. 제시된 현미경 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
도 12. 인간 U2-OS 세포에서 닉카제(nickase) SpCas9n(H840A)에 의해 유도된 단일 분할의 검출에서 절차 2에 따른 방법의 적용이다. SpCas9n이 임의의 분할 활성을 수행하지 않는 경우, 닉카제 축적 영역에서 어떠한 비오틴화된 뉴클레오타이드 포커스도 검출될 수 없다. 2개의 하위핵 객체들 사이에서 어떠한 공간적 연관성도 없다. 다시 말해서, SpCas9n의 축적 부위에서 단일 틈 또는 수십 개 이하의 틈들의 유도는 혼입된 변형된 뉴클레오타이드의 검출을 초래한다. 비오틴화된 뉴클레오타이드의 포커스는 국소회되었고, 이미지에서 형광 최대치로 나타났다. 단지 하나의 단일-가닥 DNA 절단이 유도되는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입 부위는 SpCas9n 포커스와 함께 공동국소화된다. 틈의 수가 1개보다 많다면(수십 개 이하), 뉴클레오타이드 혼입 영역 및 SpCas9n 포커스 또한, 공동국소화된다. 형광 강도의 제시된 프로파일은 이러한 연관성을 분명하게 도시한다(최대치는 BrdU 및 SpCas9n 포커스 중첩을 나타냄). 그 결과는, 절차 2에 따라 수행된 방법의 높은 민감도를 입증한다. 상기 방법은 세포 핵에서 인 시추에서 단일의 단일-가닥 DNA 절단의 검출에 적용될 수 있다. 형광 강도의 프로파일은 관심 SpCas9n 포커스를 가로질러 진행되는 수평선을 따라 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득되었다.
도 13. 단리된 생물학적 물질에서 BrdU의 혼입 수준의 측정이다. 상기 물질은 비처리된 대조군 HeLa 세포, 및 H2O2(4 mM, 30분)를 받은 HeLa 세포로부터 단리되었다. 자유 DNA 말단의 수는 손상제, 예컨대 H2O2의 처리 결과 증가하며, 이는 시료에서 혼입된 BrdU 분자 수의 증가 및 총 형광 강도 신호의 증가를 초래한다(BrdU는 절차 1에 따른 방법을 사용하고, 뒤이어 염색질 및 DNA를 포함하는 세포성 구성성분의 추출을 사용하여 검출되었음). 그래프(상자 도면) 상에 제시된 최종적인 결과는 1 ng의 DNA 당 형광 강도이다. 각각의 상자의 하단은 25번째 백분위이고, 상단은 75번째 백분위이며, 위스커는 10번째 및 90번째 백분위이고, 중앙의 선은 평균 값이다. 대조군 시료에서 1개의 DNA 단위(1 ng) 당 측정된 형광 강도는 2.9 ± 0.2 x 10-4 a.u.인 반면, H2O2로 처리된 시료에서 1 ng의 DNA 당 측정된 형광 강도는 더 높았다(3.2 ± 0.3 x 10-4 a.u.)(표 및 도면 참조). 독립적인 2-시료 t-검정은, 비처리된 시료와 H2O2 처리된 시료 사이에서 1 ng의 DNA 당 형광 강도 사이의 차이가 통계학적으로 유의함을 보여주었다(p-값 < 0.001). DNA의 농도는 멀티모드 플레이트 판독기 Infinite 200 Pro(Tecan)를 사용하여 측정되었다.
도 14. DNA 말단의 접근성이 고정 전에 증가되었던 고정된 U2-OS 세포에서 DNA 말단의 검출을 위한 절차 2의 사용이다. 우측 이미지는 변형된 DNA 말단(절차 2에 따름)을 나타내는 형광 포커스를 제시한다. 이들 말단은 세포 핵(핵은 좌측 상의 투과된 광 이미지에서 국소화됨) 내부에서 특이적으로 검출되고, 이들의 수는 개별적인 세포들 사이에서 상이하다. 단일-가닥 DNA 절단을 나타내는 형광 포커스의 국소화에 관하여, 수득된 이미지는 신뢰할 만하고, 이는 염색질과 DNA 말단의 접근성을 증가시키는 데 있어서 살아 있는 세포(고정 전)와 Tris(이 경우, 1 mM, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션)의 인큐베이션 단계의 적용성을 입증한다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
도 2. 표준 TUNEL 검정법과 절차 1에 따른 방법의 민감도 사이의 비교 - 형광 공초점 이미지이다. 자유 DNA 말단이 표준 TUNEL 검정법(APO-BRDU) 또는 절차 1에 따라 검출되었던 DNase I 처리된 HeLa 세포 및 비처리된 세포의 대표적인 형광 공초점 이미지가 도시된다. 절차 1에 따라 제조된 시료에서, 자유 DNA 말단은 밝고 분명한 형광 포커스(우측 컬럼)로서 보여질 수 있다. 두 검정법 모두의 경우, 고농도의 DNase I을 이용한 세포의 처리(4U, 첫번째 열)는 비처리된 세포(0 U, 세번째 열)와 비교할 때 핵에서 신호의 유의한 증가를 초래하였다. 그러나, 절차 1에 따라 제조된 시료의 경우에만, 저농도의 DNase I로 처리된 세포(두번째 열, 우측 이미지)와 비처리된 세포(세번째 열, 우측 이미지) 사이에 차이가 존재하였으며 - 검출된 자유 DNA 말단의 수는 DNase 처리된 세포에서 더 높다. 표준 TUNEL 검정법의 경우, 비처리된 세포(세번째 열, 좌측 이미지)와 비교할 때 저농도의 DNase I로 처리된 시료(두번째 열, 좌측 이미지)에서 어떠한 유의한 형광 신호도 관찰되지 않는다. 척도 막대 - 20 μm.
도 3. TUNEL 검정법과 절차 1에 따른 방법의 민감도 사이의 비교 - 상자 도면이다. 상자 도면은 DNA 절단의 현미경 이미지의 분석 결과를 나타낸다. 표준 TUNEL 검정법(APO-BRDU)의 경우, 신호는 핵 내에서 픽셀(형광 강도)의 평균 회색 값이었다(TUNEL은 개별적인 DNA 절단의 이미지를 산출하지 않으며, 상기 TUNEL은 단지 핵 전체를 통해 선명하지 못한(grainy) 신호를 초래함을 주목함). 절차 1에 따른 방법의 경우, 각각의 핵에서 포커스의 수가 결정되었다. 각각의 상자의 하단은 25번째 백분위이며, 상단은 75번째 백분위이고, 중간의 선은 50번째 백분위이며, 위스커(whisker)는 10번째 및 90번째 백분위이다. 수평 실선(상자보다 넓음)은 평균 값을 나타낸다. 독립적인 2-시료 t-검정은, 저농도의 DNase I로 처리된 시료(0.2 U)와 비처리된 시료(0 U) 사이의 평균 값의 차이가 절차 1에 따라 세포를 가공한 후에만 통계학적으로 유의함을 보여주었다(우측 그래프; p-값=2.8 x 10-7). 이는, 절차 1에 따른 방법이 표준 TUNEL 검정법보다 유의하게 더 민감함을 나타낸다.
도 4. 표준 틈 번역 검정법 및 절차 2에 따른 방법에 의한 DNA 말단의 검출에 대한, 내인성 비오틴의 차단 효과의 평가이다. 자유 DNA 말단이 표준 틈 번역 검정법(첫번째 열) 또는 절차 2(두번째 열)에 따라 검출되었던 비처리된 HeLa 세포의 대표적인 형광 공초점 이미지이다. 시료는 사전-차단 단계(절차 2에서 단계 3 - 내인성 비오틴의 차단)와 함께 또는 없이 제조되었다. 표준 틈 번역 검정법에 따라 제조된 시료의 경우, 내인성 비오틴의 차단은 세포 핵에서 형광 신호의 유의한 저하를 초래하며 - 신호의 차이는 기록된 공초점 이미지(첫번째 열) 상에서 명백하게 볼 수 있다. 절차 2에 따라 제조된 시료의 경우, 사전-차단은 수득된 이미지(두번째 열) 상에서 주요한 영향을 갖지 않는다. 척도 막대 - 20 μm.
도 5. 복구 단백질 XRCC1의 축적 영역과 비교하여 DNA 절단 부위에서 BrdU 분자의 혼입의 검출이다. BrdU 분자의 혼입은 TdT 효소에 의해 인지되는 특이적인 유형의 DNA 3'-OH 말단을 표시하고, 이러한 말단은 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭이 발생할 때 존재한다. 상기 갭은 BER 경로에 의해 복구된다. XRCC1 단백질은 이러한 복구 과정에 관여하는 주된 복구 인자들 중 하나이다. BrdU가 인접한 XRCC1 포커스와 함께 검출되는 부위는 대체로 추정컨대 유일하게, 단일-가닥 갭이 발생하는 부위이다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하고, BrdU 포커스의 형광 최대치(정사각형)을 확인하고 배정하는 데 사용되었다. 상기 최대치는 BrdU 포커스의 매스(mass)의 중심을 나타내고, 따라서, DNA 손상의 국소화를 표시한다. 복구 단백질 포커스를 나타내고 프로파일에서 상기 언급된 최대치를 국소화하는 이미지의 형광 프로파일(현미경 이미지 패널 하에, 하단에서)의 분석은, DNA 절단이 XRCC1 복구 포커스에 인접하거나 상기 포커스의 주변 영역에서 일관되게 검출됨을 보여준다. 현미경 이미지에서 검출되는 XRCC1과 BrdU 포커스 사이에 분명한 공간적 연관성이 존재한다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사(projection)이다. 형광 강도의 프로파일은 화살표들 사이의 영역에서 측정되었다.
도 6. BrdU 혼입에 의해 표지되는 DNA 절단의 국소화이며, 이들은 DNA 복제 영역(EdU로 표지됨) 및 XRCC1 복구 포커스와 비교하여 대체로 추정컨대 단일-가닥 갭이다(실시예 4에 기재되고 설명된 바와 같음). 프로파일(BrdU 포커스 - 정사각형, DNA 복제 영역 - 마름모)에서 복구 단백질 포커스를 나타내고 형광 최대치를 국소화하는 이미지의 형광 프로파일(하단에서)의 분석은, 3가지 유형의 하위핵 객체 사이에서 공간적 연관성을 확증한다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하며, 형광 최대치를 확인하고 배정하고, 형광 강도 프로파일을 생성하는 데 사용되었다. DNA 복제의 모든 영역이, 절차 1에 따른 검출 방법의 최소화된 교차-반응성을 입증하는 BrdU 검출 영역과 연관이 있는 것은 아니다(상기 방법은 EdU의 임의의 비특이적인 검출 없이 BrdU의 검출만 유발함). 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다. 형광 강도의 프로파일은 화살표들 사이의 영역에서 측정되었다. 척도 막대: 5 μm 또는 1 μm(이미지에서 확대된 부분).
도 7. 대조군, 세포자멸사 및 손상된 HeLa 세포의 예이다. a). BrdU가 혼입되고 절차 1에 따른 방법을 사용하여 검출되었던 세포 핵의 이미지의 예이다. 이 예는 세포 배양물에서 세포자멸사 세포의 검출 방법의 적용성을 입증한다. 세포자멸사 세포의 핵은 정상적인 대조군 세포의 핵보다 유의하게 더 많은 DNA 절단을 함유한다. b). 상이한 손상제들(UV, 토포테칸(Tpt) 및 H2O2)로 처리된 세포의 이미지의 예이다. 상자 도면은, 상이한 작용제들의 처리가 비처리된 대조군 세포와 비교하여, 검출 가능한 BrdU 분자 혼입 영역의 평균 수의 증가를 유발함을 보여준다. BrdU의 혼입 영역은 DNA의 자유 말단의 국소화 영역을 나타낸다(하기 물질로 처리된 세포의 평균 수: H2O2: 31.57 ± 8.61, UV: 10.73 ± 4.89, Tpt: 16.39 ± 4.92). 그 결과는 스튜던츠 t-검정(p-값)을 사용하여 시험되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. c). 패널은 핵-내 및 염색질 구조(DAPI)와 비교하여 H2O2로 처리된 세포 핵에서 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭의 국소화를 예시하는 이미지의 일례를 제시한다. 형광 강도의 프로파일은 상기 이미지에서 선으로 표시된 영역으로부터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득되었다. DAPI의 형광 강도 및 DNA 절단을 나타내는 형광 최대치(BrdU 포커스)에 대한 면밀한 관찰은 손상된 영역에서 염색질의 국소적인 밀도에 대한 정보를 줄 수 있다. 제시된 이미지에서, BrdU 포커스는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 검출된 형광 최대치를 이용하여 시각화되었다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다. 척도 막대: 5 μm.
도 8. BrdU 혼입 없이 절차 1에 따라 처리된 HeLa 세포에서 검출된 형광 신호의 수준의 대조군 측정이다. 검출된 포커스의 수 및 관찰된 핵의 수는 평균적으로, 1개의 단일 세포 핵 당 검출되는 포커스가 단지 0.13 ± 0.04개(핵의 총 수 N = 63) 존재함을 보여준다. 상기 포커스는 형광 신호의 수준이 0 a.u.보다 더 높은 영역으로서 정의되었고, 이들의 국소화는 형광 최대치를 국소화하는 ImageJ 소프트웨어의 빌트-인(built-in) 특징부를 사용하여 결정되었다. 이들 중 대부분은 세포 핵의 외부에서 국소화되었고, 이는 DAPI로 염색된 세포 핵의 형광 이미지와 형광 최대치의 중첩을 기반으로 결정되었다. 제시된 현미경 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
도 9. 광역학적 효과(에티듐 브로마이드(500 nM) 및 488 nm 레이저 광선)에 의해 세포 핵의 작은 선택된 영역에 가해진 DNA 절단(들)의 직접적인 검출이다.
Hela 세포는 에티듐 브로마이드(500 nM)와 함께 인큐베이션되었고, 백색 원(circle)(첫번째 열)에 의해 표시된 장소에서 488 nm 레이저 광선(9 mJ - 손상을 유도하는 것으로 알려진 선량(문헌[Zarebski, M., Wiernasz, E. and Dobrucki, J. W. (2009), Recruitment of heterochromatin protein 1 to DNA repair sites. Cytometry, 75A: 619-625. doi:10.1002/cyto.a.20734)])을 사용하여 투광되었다. DNA 절단은 표준 TUNEL(좌측 컬럼) 및 절차 1(우측 컬럼)에 따라 검출되었다. DNA 절단(들)(포커스)은 형광 이미지(두번째 열) 및 형광 강도 프로파일(세번째 열, 형광 강도 프로파일은 화살표들 사이에서 측정되었음) 상에서 제시된 바와 같이, 절차 1에 따른 검출 후에만 보인다. ImageJ 소프트웨어는 이미지를 분석하고 형광 최대치를 확인 및 배정하고 형광 강도 프로파일을 생성하는 데 사용되었다.
도 10. U2-OS 세포에서 뉴클레아제 SpCas9에 의해 유도된 수십 개의 분할(염색체 3의 하위텔로머성(subtelomeric) 영역에서 유도된 분할)의 검출에 사용된, 표준 TUNEL 방법과 절차 1에 따른 방법 사이의 비교이다. 형광 강도의 이미지 및 프로파일은, 뉴클레아제 SpCas9의 축적과 연관된 영역에서 측정되고 BrdU의 표준 면역형광 검출(표준 TUNEL 검정법)에서 사용된 2차 항체와 공액된 Alexa Fluor® 594에 의해 방출된 형광 강도의 평균 값이 대략 0 a.u.였음을 보여준다(50개의 핵이 분석되었고, 값은 비-특이적으로 결합된 항체 분자를 나타내는 배경 신호의 수준을 기반으로 정규화되었음). 기록된 현미경 이미지의 대표적인 예에 대해 측정된 형광 프로파일의 예는, 표준 TUNEL 검정법이 적용되었을 때 표준 형광 광역 현미경을 사용하여 기록된 현미경 이미지에서 어떠한 BrdU 포커스도 검출될 수 없었음을 분명하게 예시한다. 각각, 절차 1에 따른 방법이 적용된 경우, 어떠한 비-특이적인 배경 신호도 검출되지 않았고, BrdU의 혼입 영역은 현미경 이미지에서 시각화된 분명한 포커스에 의해 나타났다. 이들 포커스는 SpCas9의 축적 영역과 함께 공동국소화되었고, 이들은 형광 강도의 프로파일에서 추가로 예시되었다. 형광 강도 프로파일은 화살표들 사이의 영역에 대해 생성되었다. 이미지 크기: 30 x 30 μm.
도 11. 인간 U2-OS 세포에서 뉴클레아제 SpCas9에 의해 유도된 단일 분할의 검출에서 절차 1에 따른 방법의 적용이다. SpCas9가 임의의 분할 활성을 수행하지 않는 경우, 뉴클레아제 축적 영역에서 어떠한 BrdU 포커스도 검출될 수 없다. 다시 말해서, SpCas9의 축적 부위에서 단일 절단의 유도는 혼입된 BrdU 분자의 검출을 초래한다. 분명한 BrdU 포커스는 SpCas9 포커스와 공간적으로 연관이 있으며, 이는 형광 강도의 프로파일에 의해 추가로 예시된다. 프로파일은 화살표들 사이에서 측정되었다. 그 결과는, 절차 1에 따른 방법이 DNA 절단의 인지에서 매우 높은 민감도에 도달할 수 있으며 - 심지어 단지 하나의 단일 이중-가닥 DNA 절단이 검출될 수 있음을 입증한다. 제시된 현미경 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
도 12. 인간 U2-OS 세포에서 닉카제(nickase) SpCas9n(H840A)에 의해 유도된 단일 분할의 검출에서 절차 2에 따른 방법의 적용이다. SpCas9n이 임의의 분할 활성을 수행하지 않는 경우, 닉카제 축적 영역에서 어떠한 비오틴화된 뉴클레오타이드 포커스도 검출될 수 없다. 2개의 하위핵 객체들 사이에서 어떠한 공간적 연관성도 없다. 다시 말해서, SpCas9n의 축적 부위에서 단일 틈 또는 수십 개 이하의 틈들의 유도는 혼입된 변형된 뉴클레오타이드의 검출을 초래한다. 비오틴화된 뉴클레오타이드의 포커스는 국소회되었고, 이미지에서 형광 최대치로 나타났다. 단지 하나의 단일-가닥 DNA 절단이 유도되는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입 부위는 SpCas9n 포커스와 함께 공동국소화된다. 틈의 수가 1개보다 많다면(수십 개 이하), 뉴클레오타이드 혼입 영역 및 SpCas9n 포커스 또한, 공동국소화된다. 형광 강도의 제시된 프로파일은 이러한 연관성을 분명하게 도시한다(최대치는 BrdU 및 SpCas9n 포커스 중첩을 나타냄). 그 결과는, 절차 2에 따라 수행된 방법의 높은 민감도를 입증한다. 상기 방법은 세포 핵에서 인 시추에서 단일의 단일-가닥 DNA 절단의 검출에 적용될 수 있다. 형광 강도의 프로파일은 관심 SpCas9n 포커스를 가로질러 진행되는 수평선을 따라 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득되었다.
도 13. 단리된 생물학적 물질에서 BrdU의 혼입 수준의 측정이다. 상기 물질은 비처리된 대조군 HeLa 세포, 및 H2O2(4 mM, 30분)를 받은 HeLa 세포로부터 단리되었다. 자유 DNA 말단의 수는 손상제, 예컨대 H2O2의 처리 결과 증가하며, 이는 시료에서 혼입된 BrdU 분자 수의 증가 및 총 형광 강도 신호의 증가를 초래한다(BrdU는 절차 1에 따른 방법을 사용하고, 뒤이어 염색질 및 DNA를 포함하는 세포성 구성성분의 추출을 사용하여 검출되었음). 그래프(상자 도면) 상에 제시된 최종적인 결과는 1 ng의 DNA 당 형광 강도이다. 각각의 상자의 하단은 25번째 백분위이고, 상단은 75번째 백분위이며, 위스커는 10번째 및 90번째 백분위이고, 중앙의 선은 평균 값이다. 대조군 시료에서 1개의 DNA 단위(1 ng) 당 측정된 형광 강도는 2.9 ± 0.2 x 10-4 a.u.인 반면, H2O2로 처리된 시료에서 1 ng의 DNA 당 측정된 형광 강도는 더 높았다(3.2 ± 0.3 x 10-4 a.u.)(표 및 도면 참조). 독립적인 2-시료 t-검정은, 비처리된 시료와 H2O2 처리된 시료 사이에서 1 ng의 DNA 당 형광 강도 사이의 차이가 통계학적으로 유의함을 보여주었다(p-값 < 0.001). DNA의 농도는 멀티모드 플레이트 판독기 Infinite 200 Pro(Tecan)를 사용하여 측정되었다.
도 14. DNA 말단의 접근성이 고정 전에 증가되었던 고정된 U2-OS 세포에서 DNA 말단의 검출을 위한 절차 2의 사용이다. 우측 이미지는 변형된 DNA 말단(절차 2에 따름)을 나타내는 형광 포커스를 제시한다. 이들 말단은 세포 핵(핵은 좌측 상의 투과된 광 이미지에서 국소화됨) 내부에서 특이적으로 검출되고, 이들의 수는 개별적인 세포들 사이에서 상이하다. 단일-가닥 DNA 절단을 나타내는 형광 포커스의 국소화에 관하여, 수득된 이미지는 신뢰할 만하고, 이는 염색질과 DNA 말단의 접근성을 증가시키는 데 있어서 살아 있는 세포(고정 전)와 Tris(이 경우, 1 mM, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션)의 인큐베이션 단계의 적용성을 입증한다. 상기 이미지는 3D 스택 이미지의 최대 강도 투사이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예의 도움을 받아 보다 상세히 설명되며, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
실시예는 상세한 설명에 제시된 주요 구현예에 관한 일반적인 프로토콜을 기반으로 기재된다.
비교를 위해, 하기 실시예는 대부분의 경우, DNA 절단의 표준 검출 방법, 즉, TUNEL 검정법을 사용한다. TUNEL 검정법(종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 틈 말단 표지화)은 고정된 세포에서 DNA 말단을 검출하는 기법으로서, 특허 출원 WO 1997008345 A1 및 커뮤니케이션[Darzynkiewicz Z, Galkowski D, Zhao H. Analysis of apoptosis by cytometry using TUNEL assay. Methods. 2008 Mar;44(3):250-4. doi: 10.1016/j.ymeth.2007.11.008]에 개시된 바와 같이 폴리머라제 Tdt, 뉴클레오타이드 유사체 및 항-유사체 항체, 및 형광 검출을 이용한다.
일반적인 절차
절차 1
효소 TdT(종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제)를 사용하여 수행된 인 시추 DNA 손상 검출 - 단일-가닥 갭, 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단의 검출의 일반적인 절차.
시료 제조: 세포를 사용되는 세포 유형에 대한 표준 조건 하에 유리 바닥을 가진 커버슬립 상에서 또는 페트리 디쉬 상에서 배양하였다. 세포 배양물의 밀도는 절차의 시작 시 대략 50% 내지 60%의 포화도(confluency)에 도달해야 한다.
절차:
1.
사전-제조(선택적):
살아 있는 세포를 0.5 내지 10 mM Tris(실온(RT)에서 5분 내지 1시간)의 인큐베이션하고, 세포 형태 이상(morphological abnormality)에 대해 모니터링해야 한다.
2.
고정 및 투과:
a.
1% 내지 4% 포름알데하이드 용액과 4℃에서 10분 내지 15분 동안 인큐베이션(선택적).
b.
이온성 계면활성제 (예를 들어, Triton X-100(0.25% 내지 3%))와 RT에서 10분 내지 1시간 동안 인큐베이션(선택적).
c.
수중 70% 에탄올에서 -20℃에서 최소 1시간 그러나 바람직하게는 12시간 내지 18시간 동안 인큐베이션하며, 시료는 수개월 동안 안정해야 한다(선택적이지만 가장 바람직함).
3.
사전-차단(선택적):
a.
세척(PBS 1 x 5분)
b.
스트렙타비딘 용액 - 액적 상에서 RT에서 30분 동안 수행되는 인큐베이션
c.
세척(PBS 3 x 5분)
d.
비오틴 용액 - 액적 상에서 RT에서 30분 동안 수행되는 인큐베이션
e.
세척(PBS 3 x 5분)
4.
DNA 말단의 접근성을 증가시킨다:
수중 0.5 내지 10 mM EDTA에서 RT에서 10분 내지 한시간 동안 인큐베이션.
5.
혼입 절차:
종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용한, 비변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어, BrdU)의 혼입:
a.
인큐베이션을 습한 챔버에서 액적 상에서 수행한다
b.
시료를 세척 완충제에서 헹군다
6.
차단:
PBS 중 1% 내지 5% BSA 용액과 함께 인큐베이션(4℃, RT에서 1시간 내지 밤새).
7.
1차 항체와 함께 인큐베이션 - 습한 챔버에서 액적 상에서 수행된다:
a.
1차 항체 유형 1(예를 들어, BrdU에 대한 마우스 모노클로날), 바람직한 희석 1% 내지 5% BSA 중 1:100, 1시간, RT
b.
세척(PBS 3 x 5분)
c.
1차 항체 유형 2(예를 들어, BrdU에 대한 토끼 폴리클로날), 바람직한 희석 1% 내지 5% BSA 중 1:100, 1시간, RT
d.
세척(PBS 3 x 5분)
8.
PLA 절차:
a.
하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물 중 1% BSA(37℃, 60분, 습한 챔버에서 액적 상에서의 반응)에서 희석된 PLA 프로브와 함께 인큐베이션:
·
8 μl의 PLA 프로브 MINUS 스탁(stock)(예를 들어, 항-마우스)
·
8 μl의 PLA 프로브 PLUS 스탁(예를 들어, 항-토끼)
·
24 μl의 1% BSA
b.
시료를 세척 완충제 A로 세척(2 x 5분)
c.
결찰 - 하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물에서 인큐베이션(37℃, 30분, 습한 챔버에서 액적 상에서의 반응):
·
8 μl의 5x 결찰 스탁(Sigma, Duolink, DUO82009),
·
31 μl의 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수,
·
1 μl의 리가제(1 U/μl)(Sigma, Duolink, DUO82027 또는 DUO82029)
d.
시료를 세척 완충제 A로 세척(2 x 2분)
e.
증폭 - 하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물에서 인큐베이션(37℃, 100분, 습한 챔버에서 액적 상에서 수행되는 반응):
·
8 μl의 5x 증폭 스탁(Sigma, Duolink, DUO82060 또는 DUO82011),
·
31.5 μl의 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수,
·
0.5 μl의 폴리머라제(10 U/μl)(Sigma, Duolink, DUO82028 또는 DUO82030)
9.
형광 현미경을 사용한 PBS 중 시료의 이미징.
절차 2
효소 DNA 폴리머라제 I을 사용하여 수행된 DNA 손상 검출의 일반적인 절차 - 단일-가닥 틈, 단일-가닥 갭 및 이중-가닥 3' 오목 말단(recessed end)의 검출.
시료 제조: 세포를 사용되는 세포 유형에 대한 표준 조건 하에 유리 바닥을 가진 커버슬립 상에서 또는 페트리 디쉬 상에서 배양하였다. 세포 배양물의 밀도는 절차의 시작 시 대략 50% 내지 60%의 포화도에 도달해야 한다.
절차:
1.
사전-제조(선택적):
a.
살아 있는 세포를 0.5 내지 10 mM Tris(실온(RT)에서 5분 내지 1시간)의 인큐베이션하고, 세포 형태 이상에 대해 모니터링해야 한다.
2.
고정 및 투과:
a.
1% 내지 4% 포름알데하이드 용액과 4℃에서 10분 내지 15분 동안 인큐베이션(선택적).
b.
이온성 계면활성제 (예를 들어, Triton X-100(0.25% 내지 3%))와 RT에서 10분 내지 1시간 동안 인큐베이션(선택적).
c.
수중 70% 에탄올에서 -20℃에서 최소 1시간 그러나 바람직하게는 12시간 내지 18시간 동안 인큐베이션하며, 시료는 수개월 동안 안정해야 한다(선택적이지만 가장 바람직함).
3.
사전-차단(선택적):
a.
세척(PBS 1 x 5분)
b.
스트렙타비딘 용액 - 액적 상에서 RT에서 30분 동안 수행되는 인큐베이션
c.
세척(PBS 3 x 5분)
d.
비오틴 용액 - 액적 상에서 RT에서 30분 동안 수행되는 인큐베이션
e.
세척(PBS 3 x 5분)
4.
DNA 말단의 접근성을 증가시킴:
수중 0.5 내지 10 mM EDTA에서 RT에서 10분 내지 1시간 동안 인큐베이션.
5.
DNA 폴리머라제 I을 사용한, 비변형된 뉴클레오타이드 및 변형된(예를 들어, 비오틴-공액) 뉴클레오타이드의 혼입:
a.
시료를 증류수로 헹군다
b.
하기로 이루어진 반응 혼합물에서 인큐베이션(습한 챔버에서 액적 상에서 RT에서 5분 내지 60분):
·
반응 완충제
·
dNTP(변형된 뉴클레오타이드 : 비변형된 뉴클레오타이드의 비는 3:1 내지 1:3으로 다양함)
·
DNA 폴리머라제 I
·
초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수
c.
반응 종료:
·
50 mM TrisHCl (pH 7.48)과 함께 인큐베이션, 2 x 10분, RT
·
0.5 mM TrisHCl과 함께 인큐베이션, 1 x 1분, RT
6.
차단:
PBS 중 1% 내지 5% BSA 용액(4℃, RT에서 1시간 내지 밤새).
7.
1차 항체와 함께 인큐베이션 - 습한 챔버에서 액적 상에서 수행된다:
a.
1차 항체 유형 1(예를 들어, 비오틴에 대한 마우스 모노클로날), 바람직한 희석 1% 내지 5% BSA 중 1:100, 1시간, RT
b.
세척(PBS 3 x 5분)
c.
1차 항체 유형 2(예를 들어, 비오틴에 대한 토끼 폴리클로날), 바람직한 희석 1% 내지 5% BSA 중 1:100, 1시간, RT
d.
세척(PBS 3 x 5분)
8.
PLA 절차:
a.
하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물에서 1% BSA에 희석된 PLA 프로브와 함께 인큐베이션(37℃, 60분, 습한 챔버에서 액적 상에서의 반응):
·
8 μl의 PLA 프로브 MINUS 스탁(예를 들어, 항-마우스)
·
8 μl의 PLA 프로브 PLUS 스탁(예를 들어, 항-토끼)
·
24 μl의 1% BSA
b.
시료를 세척 완충제 A로 세척 (2 x 5분)
c.
결찰 - 하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물에서 인큐베이션(37℃, 30분, 습한 챔버에서 액적 상에서의 반응):
·
8 μl의 5x 결찰 스탁(Sigma, Duolink, DUO82009),
·
31 μl의 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수,
·
1 μl의 리가제(1 U/μl)(Sigma, Duolink, DUO82027 또는 DUO82029)
d.
시료를 세척 완충제 A로 세척(2 x 2분)
e.
증폭 - 하나의 커버슬립 당 40 μl의 반응 혼합물에서 인큐베이션(37℃, 100분, 습한 챔버에서 액적 상에서 수행되는 반응):
·
8 μl의 5x 증폭 스탁(Sigma, Duolink, DUO82060 또는 DUO82011),
·
31.5 μl의 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수,
·
0.5 μl의 폴리머라제(10 U/μl)(Sigma, Duolink, DUO82028 또는 DUO82030)
9.
PBS 중 시료를 형광 현미경을 사용한 이미징.
실시예 1
절차 1에 따른 방법을 사용한, 비처리된 고정된 HeLa 세포 및 DNase I 처리된 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출
이 실험에서, HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 0.2 x 106개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 3일 동안 배양하였다. 후속적으로, 세포를 수중 70% 에탄올에서 -20℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 0.5 mM EDTA에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. DNA 말단의 가공 전에, 일부 시료를 DNase I로 처리하여, DNA 절단을 유도하였다. 반응을 하기로 이루어진 반응 혼합물에서 실온에서 30분 동안 액적에서 수행하였다: 0.2 또는 4단위의 DNase I(Thermo Fisher Scientific, AM2222), 1x DNase I 완충제(Thermo Fisher Scientific, AM8170G) 및 물. 후속적으로, BrdU를 APO-BRDU 키트(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 사용하여 TdT 효소를 사용하여 DNA의 자유 말단에 연결하였다. 그 후에, 세포를 PBS 중 1% BSA에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절차 1의 단계 7에 따라 1차 항체 유형 1 및 2과 함께 인큐베이션을 각각 마우스 모노클로날 항-BrdU(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039) 및 토끼 폴리클로날 항-BrdU(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)를 사용하여 수행하였다. 마지막 세척 후, 세포를 단계 8(PLA 절차)에 따라 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002), 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014), Duolink 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 처리하였다. PLA 프로브를 1% BSA에서 희석시켰다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 500 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하고, 분석하였다.
결과:
절차 1을 수행한 비처리된 HeLa 세포 대부분은 세포 핵 내에서 자유 DNA 말단을 나타내는 형광 포커스를 나타내지 않았다. 그러나, 3개 이하의 포커스가 세포의 하위세트의 핵에서 검출되었다(도 2.; 세번째 열, 우측 이미지). DNase I로 처리된 세포에서, 비처리된 세포에서보다 더 많은 포커스가 검출되었다. 더 낮고 더 높은 DNase I 농도의 경우, 검출된 포커스의 최대 수는 각각 12 및 156이었다. 비처리된 세포 및 DNase I 처리된(저농도 및 고농도) 세포에서 검출된 포커스의 평균 수는 0.4 ± 0.1(N=49), 2.4 ± 0.3(N=78) 및 62.2 ± 4.6 (N=36)(도 3)이었다. 비처리된 세포 및 DNase I 처리된(저농도) 세포에서 포커스의 평균 수 사이의 차이는 통계학적으로 유의하며, 이때, p-값 = 2.3 x 10-7(독립적인 2개의 시료 t-검정)이다.
비교예 1
표준 TUNEL 검정법을 사용한, 비처리된 고정된 HeLa 세포 및 DNase I 처리된 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출
HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 0.2 x 106개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 3일 동안 배양한 다음, APO-BRDU(TUNEL 검정법) 키트 설명서에 따라 가공하였다. 에탄올에서 고정 후, 일부 시료를 DNase I로 처리하여, DNA 절단을 유도하였다. 반응을 0.2 또는 4단위의 DNase I(Thermo Fisher Scientific, AM2222), 1x DNase I 완충제(Thermo Fisher Scientific, AM8170G) 및 물로 이루어진 반응 혼합물에서 실온에서 30분 동안 액적에서 수행하였다. BrdU의 면역형광 염색에 사용된 항체는: 마우스 모노클로날 항-BrdU(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039) 및 염소 항-마우스 IgG(H+L) 고도로 교차-흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-11029)이었다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 510 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하였다.
비교예 1을 실시예 1의 결과와 비교하였다.
결과:
현미경 이미지를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 시료에 대해 적어도 30개의 핵을 분석하였다. 표준 TUNEL 검정법(APO-BRDU)의 경우, 신호는 핵 내의 픽셀의 평균 회색 값이었다(형광 강도). 절차 1에 따른 방법의 경우, 각각의 핵에서 포커스의 수를 결정하였다. 두 검정법 모두에 대해(표준 TUNEL 및 절차 1에 따른 방법), 고농도의 DNase I(4 U)로 처리된 세포에서, 신호의 유의한 증가가 비처리된 세포와 비교하여 관찰되었다(표준 TUNEL, 형광 강도: DNase 처리된 세포에서 111.8 ± 14.6 a.u.(N=34) vs 비처리된 세포에서 5.7 ± 0.1 a.u.(N=40), 절차 1: DNase 처리된 세포에서 62.2 ± 4.6 포커스(N=36) vs 비처리된 세포에서 0.4 ± 0.1 포커스(N=49))(도3). 그러나, 독립적인 2개의-시료 t-검정은, 저농도의 DNase I(0.2 U)로 처리된 시료와 비처리된 시료 사이에서 신호의 차이가 절차 1에 따라 세포를 가공한 후에만 통계학적으로 유의하였음을 보여주었다(표준 TUNEL, DNase 처리된 세포에서 형광 강도 6.0 ± 0.2 a.u.(N=34) vs 비처리된 세포에서 5.7 ± 0.1 a.u.(N=40), p-값 = 0.2; 절차 1: DNase 처리된 세포에서 2.4 ± 0.3 포커스(N=78) vs 비처리된 세포에서 0.4 ± 0.1 포커스(N=49), p-값 = 2.3 x 10-7). 대표적인 이미지 및 정량적 분석은 도 2 및 도 3에 제시된다.
결론:
절차 1에 따른 방법은 표준 TUNEL 검정법보다 유의하게 더 민감하다.
실시예 2
절차 2에 따른 방법을 사용한, 비처리된 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출
이 실험에서, HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 0.2 x 106개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 3일 동안 배양한 다음, 수중 70% 에탄올에서 -20℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 시료를 절차 2의 단계 3에 따라 처리하였다(내인성 비오틴의 차단)(Molecular Probes, 내인성 비오틴 차단 키트, E-21390). DNA 말단의 접근성을 증가시키는 단계(단계 4)를 수중 0.5 mM EDTA로 RT에서 30분 동안 수행하였다. 비변형된 및 변형된 비오틴-공액 뉴클레오타이드를 혼입하기 위해, 세포를 초순수 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)에 침지시키고, 그 후에 1개 커버슬립 당 1x NEBuffer2(NEBiolabs, B7002S), 30 μM의 각각의 dNTP(Jena Bioscience, dATP: NU-1001, dCTP: NU-1002, dGTP: NU-1003, 비오틴-16-5-아미노알릴-dUTP: NU-803-BIO16), 3 단위의 DNA 폴리머라제 I(이. 콜라이)(NEBiolabs, MO209) 및 초순수 증류수로 이루어진 반응 혼합물과 함께 인큐베이션(습한 챔버에서 37℃에서 1시간 인큐베이션)하였다. 반응을 종료하기 위해, 다음으로 세포를 절차 2의 단계 5(c)에 기재된 바와 같이 인큐베이션하고, 뒤이어 PBS 중 1% BSA 용액으로 차단 단계를 수행하였다(4℃에서 밤새). 1차 항체 유형 1 및 2와 함께 인큐베이션(절차 2의 단계 7)을 각각 마우스 모노클로날 항-비오틴(Abcam, ab201341)(1% BSA에서 1:100) 및 토끼 폴리클로날 항-BrdU(Abcam, ab53494)(1% BSA에서 1:100)를 사용하여 수행하였다. 마지막 세척 후, 세포를 단계 8(PLA 절차)에 따라 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002), 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014), Duolink 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)을 사용하여 처리하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 510 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하였다.
결과
밝은 형광 포커스로서 나타나는 자유 DNA 말단은 절차 2(단계 3 - 내인성 비오틴 차단을 갖는)에 따라 가공된 비처리된 HeLa 세포에서 쉽게 검출되었다(도 4, 두번째 열, 우측 이미지). 1개 핵 당 검출된 포커스의 평균 수는 116 ± 6(N=23)이었다.
실시예 3
절차 2에 따른 방법을 사용한, 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출 - 내인성 비오틴 차단의 효과의 평가.
HeLa 21-4 세포를 실시예 2에서와 같이 그러나 절차 2로부터 단계 3(사전-차단) 없이 처리하였다.
결과:
밝은 형광 포커스로서 나타나는 자유 DNA 말단은 절차 2(단계 3 - 내인성 비오틴 차단 없음)에 따라 가공된 비처리된 HeLa 세포에서 쉽게 검출되었다(도 4, 두번째 열, 좌측 이미지). 1개 핵 당 검출된 포커스의 평균 수는 128 ± 6(N=24)이었다.
결론(실시예 2 및 3):
약간 더 많은 자유 DNA 말단들이 내인성 비오틴 차단(단계 3)이 존재하는 시료보다 상기 단계 없이 절차 2에 따라 가공된 시료에서 검출되었다(128 ± 6 vs 116 ± 6). 그러나, 독립적인 2개의-시료 t-검정은 p-값 = 0.15를 산출하였으며, 이는, 이들 2개의 시료 사이의 차이가 통계학적으로 유의하지 않음을 나타낸다. 따라서, 당업자는, 내인성 비오틴의 차단이 여전히 권고되는 한편, 절차 2에 따라 시료를 가공함으로써 수득되는 결과에 중대하지 않다고 결론내릴 수 있다.
표준 기법과 본 발명의 방법 사이의 차이를 결정하기 위해, 하기 비교예를 수행하였다.
비교예 2
DNA 폴리머라제 I 및 표준 틈 번역 검정법을 사용한, 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출
HeLa 세포를 실시예 2 또는 3에서와 같이 처리하였으나, 절차 2의 단계 7c 내지 8을 생략하였다. 대신에, 단계 7b에 뒤이어, 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용되는 2차 항체는: 염소 항-마우스 IgG(H+L) 고도로 교차-흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A-11029)이었다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 510 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하였다.
결과:
프로토콜 둘 모두(표준 및 본 발명의 방법)는 비처리된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단을 검출할 수 있게 하였다(도 4). 내인성 비오틴의 차단 효과는 표준 틈 번역 검정법에 따라 처리된 시료에서 쉽게 볼 수 있었으며 - 사전-차단은 내인성 비오틴 차단 단계가 없는 시료와 비교할 때 형광 신호의 유의한 저하를 초래하였다(형광 신호: 단계 3을 갖는 시료에서 11 a.u. vs 단계 3이 없는 시료에서 92 a.u.)(도 4, 첫번째 열). 단계 3이 있거나 없이 절차 2에 따라 제조된 시료에서, 포커스의 평균 수 사이의 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(116 ± 6 vs 128 ± 6 포커스, 독립적인 2개의-시료 t-검정: p-값 = 0.15)(도 4, 두번째 열).
결론:
DNA 폴리머라제 I을 이용하는 두 검정법 모두가 비처리된 세포에서 자유 DNA 말단을 검출할 수 있긴 하지만, 절차 2에 따른 검정법은 DNA 절단의 정량화 가능성 측면에서 유리하다. 이는, 이러한 절차에 따라 제조된 시료에서, 자유 DNA 말단이 제로-근접(near-zero) 배경 상에서 쉽게 검출 가능한 밝은 형광 포커스로서 나타난다는 사실로부터 기원한다. 또한, 이들 방법을 사용하여 수득된 결과에 대한 내인성 비오틴 차단 효과의 비교는, 절차 2에 따른 방법이 표준 검정법보다 더 특이적이며, 즉, 위양성을 덜 유발한다는 것을 보여준다. 이러한 결론은, 내인성 비오틴의 차단이 절차 2에 따른 방법에 의해 검출되는 포커스의 평균 수에서 저하를 유발하지 않는다는 사실에 의해 강하게 뒷받침된다.
실시예 4
복구 단백질 X-선 복구 교차 상보적 단백질 1(X-ray Repair Cross Complementing Protein 1,
XRCC1
)의 축적된 분자에 의해 형성된 복구
포커스의
국소화와
비교하여, 내인성의 자발적인 DNA 절단의
국소화를
결정하기 위한, 절차 1에 따른 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출.
본 발명의 절차 1에 따른 방법이 특이적인 유형의 절단, 즉, 단일-가닥 갭을 검출할 수 있는지 확증하기 위해, 자발적 DNA 절단을 절차 1에 기재된 방법을 사용하여 세포 핵 내부에서 검출하였다. 이들은 복구 단백질 X-선 교차 상보적 단백질 1(XRCC1)의 축적된 분자에 의해 형성된 복구 포커스의 국소화와 비교하여 국소화되었다. 이러한 단백질은 단일-가닥 DNA 손상 복구 경로(단일-가닥 절단 복구(Single-strand break repair), SSBR로 약칭됨, 또는 염기 절제 복구 (base excision repair), BER로 약칭됨)에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이 실험에서, HeLa 21-4 세포주(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 사용하였다. 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 3.5 x 104개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양한 다음, 플라스미드 pmRFP-C1-XRCC1(형질감염 작용제: FuGene(Promega, E2311), OptiMEM(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 31985070)에서 제조된 형질감염 혼합물, 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양된 세포)로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 36시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 세포를 4% PFA(Electron Microscopy Sciences, 15710-S)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 0.25% Triton X-100(Sigma, T8787)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 투과시켰다. BrdU를, APO-BRDU 키트(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 사용하여 TdT 효소를 사용하여 DNA의 자유 말단에 연결하였다. 그 후에, 세포를 PBS 중 5% BSA 용액과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절차 1의 단계 7에 따라 1차 항체 유형 1 및 2과 함께 인큐베이션을 각각 BrdU에 대한 마우스 모노클로날 항체(희석: 5% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039) 및 BrdU에 대한 토끼 폴리클로날 항체(희석: 5% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)를 사용하여 수행하였다. 마지막 세척 단계 후, 세포를 단계 8(PLA 절차)에 따라 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002)를 사용하여 처리하였으며; PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰다. 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. 형광 신호를 Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014)을 사용하여 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific), 10977-035)에서 제조하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(DNA의 자유 말단에 결합된 BrdU의 검출을 위해: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm; XRCC1의 검출을 위해: 여기: 561 nm, 방출: 600 내지 700 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다. 3D 스택 이미지를 SVI 3D Huygens Deconvolution & 분석 소프트웨어(Scientific Volume Imaging B.V., 네덜란드 힐베르쉼 소재)를 사용하여 디콘볼루션하였다(deconvolve).
결과:
BrdU 분자의 혼입은 TdT 효소에 의해 인지되는 DNA 3'-OH 말단의 특이적인 유형을 표시하며, 이는 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭이 발생할 때 존재한다. 상기 갭은 BER 경로 동안 발생한다. 따라서, BrdU가 인접한 XRCC1 포커스와 함께 검출되는 영역은, 대체로 추정컨대 단지 단일-가닥 갭이 발생하는 부위이다. ImageJ 소프트웨어(문헌[Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J.: Image processing with imageJ. (Biophotonics Int., 2004; 11: 36-41])를 사용하여, 이미지를 분석하고 BrdU 포커스의 형광 최대치를 확인 및 배정하였다. 프로파일에서 복구 단백질 포커스를 나타내고 상기 언급된 최대치를 국소화하는 이미지의 형광 프로파일의 분석은, DNA 절단이 XRCC1 복구 포커스에 인접하거나 그 주변 영역에서 일관되게 검출됨을 보여준다(도 5).
결론:
상기 결과는, DNA 절단이 발생하여 복구 인자의 축적에 의해서 확증되는 경우에만 신호가 수득됨을 보여주는 절차 1에 따른 방법의 특이성을 확증한다. 문헌(문헌[Caldecott K.W.: XRCC1 and DNA strand break repair. DNA Repair (Amst)., 2003; 2: 955-969; Hanssen-Bauer A., Solvang-Garten K., Akbari M., Otterlei M.: X-ray Repair Cross Complementing protein 1 in base excision repair. Int. J. Mol. Sci., 2012; 13: 17210-17229, Abbotts R., Wilson D.M. 3rd: Coordination of DNA single strand break repair. Free Radic. Biol. Med., 2017; 107: 228-244])에 따르면 XRCC1은, 단일-가닥 갭이 발생하는 경우 염기 절제 복구에 관여하는 단백질의 활성을 필요로 하는것들을 포함하여 단일-가닥 DNA 절단의 발생에 반응하여 DNA 손상 부위에서 특이적으로 축적된다. BrdU 분자가 혼입되는 부위에서 이러한 복구 단백질의 축적의 동시적인 검출은, BrdU로부터 검출된 신호가 인공물이 아니고, 절차 1에 따른 방법이 자유 DNA 말단의 인지를 초래한다는 확증을 제공한다. 더욱이, 이러한 실험의 결과는, 절차 1에 따른 방법이 세포 핵에서 인 시추에서 DNA 절단 국소화의 분석에 적용 가능함을 보여준다.
실시예 5
복구 단백질 X-선 복구 교차 상보적 단백질 1(XRCC1)의 축적된 분자에 의해 형성된 복구 포커스의 국소화와 비교하여, 그리고 DNA 복제 영역의 국소화와 비교하여, 내인성의 자발적인 DNA 절단의 국소화를 결정하기 위한, 절차 1에 따른 고정된 HeLa 세포에서 자유 DNA 말단의 검출.
본 발명의 절차 1에 따른 방법이, 최소화된 비특이적인 검출 신호와 함께 DNA 복제 영역 내에서 발생하는 특이적인 유형의 절단의 검출에 사용될 수 있는지 확증하기 위해, 내인성의 자발적인 DNA 절단을, 복구 단백질 X-선 교차 상보적 단백질 1(XRCC1)의 축적된 분자에 의해 형성된 복구 포커스의 국소화와 비교하여 그리고 DNA 복제 영역의 국소화와 비교하여 국소화하였다.
실험을 동일한 HeLa 세포주를 사용하여 실시예 4에서와 같이 수행하였다. 복제 분기점을 표지하기 위해, 살아 있는 세포를 전구체 EdU(Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, C10337)와 함께 37℃에서 30분 동안 제조업체의 설명서에 따라 인큐베이션한 후, 4% PFA로 고정시켰다. PLA 프로브의 검출 후, EdU의 혼입 영역을, "클릭(click)" 반응(Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, C10337)을, 키트에 제공된 Alexa Fluor 488 아자이드 시약을 Atto 390 아자이드(Sigma, 68321)로 대체한 점을 제외하고는 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 검출하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(DNA를 복제하는 영역에 혼입된 EdU의 검출의 경우: 여기: 405 nm, 방출: 420 내지 480 nm; DNA의 자유 말단에 결합된 BrdU의 검출의 경우: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm; XRCC1의 검출의 경우: 여기: 561 nm, 방출: 600 내지 700 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다. 3D 스택 이미지를 SVI 3D Huygens Deconvolution & 분석 소프트웨어(Scientific Volume Imaging B.V., 네덜란드 힐베르쉼 소재)를 사용하여 디콘볼루션하였다.
결과:
BrdU 분자의 혼입에 의해 변형된 DNA 절단은 대체로 추정컨대 단일-가닥 갭(실시예 4에서 기재되고 설명된 바와 같음)이며, 복제 부위 내에 그리고 XRCC1 복구 포커스에 인접하여 또는 그 주변 영역에서 동일한 때에 위치한다(도 6). 공동국소화의 분석, BrdU 포커스 및 DNA 복제 영역(EdU의 혼입 영역)의 형광 프로파일 및 형광 최대치의 국소화의 분석은 3가지 유형의 하위핵 객체들 사이에서 공간적 연관성을 확증한다. 더욱이, DNA 복제의 모든 영역이 BrdU 검출 영역과 연관이 있는 것은 아님이 강조되어야 한다.
결론:
그 결과는, 절차 1에 따른 방법이 복제 스트레스와 관련된 연구 분야에 적용 가능함을 보여준다. 이 주제는 세포 노쇠 및 노화 과정의 맥락에서 관련이 있다. 더욱이, EdU 혼입 영역의 국소화와 BrdU 혼입 영역의 국소화 사이에 어떠한 분명한 연관성도 없다는 사실은 절차 1에 따른 방법에서 검출의 어떠한 교차-반응성도 없음을 나타내고, 상기 교차-반응성은 이 실험에 사용되는 또 다른 뉴클레오사이드 유사체, 즉, EdU의 비-특이적인 인지를 유발할 것이다. 이는 변형된 DNA 말단의 인지의 특이성을 입증한다.
실시예 6
절차 1에 따른 방법을 사용한, 상이한 손상제들(UV-유도 DNA 손상, H
2
O
2
-유도 DNA 손상, 캄포테신 유도체 - 토포테칸(Tpt)을 이용하여 유도된 DNA 절단)을 받은 고정된 HeLa 세포에서 DNA 말단 검출.
실험의 목적은, 비처리된 HeLa 세포에서 그리고 DNA가 상이한 손상제들(UV-유도 DNA 손상, H2O2-유도 DNA 손상, 캄포테신 유도체 - 토포테칸(Tpt)을 이용하여 유도된 DNA 절단)을 받은 세포에서 절차 1에 따른 방법을 사용하여, 자유 DNA 말단으로의 BrdU의 혼입 후 수득되는 형광 신호를 이미지화하고 비교하는 것이었다.
HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 0.12 x 106개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다.
후속적으로, HeLa 세포를 상이한 손상제들(UV-유도 DNA 손상, H2O2-유도 DNA 손상, 캄포테신 유도체 - 토포테칸(Tpt)을 이용하여 유도된 DNA 절단)을 하기 방식으로 받게 하였다.
UV:
10% FBS가 보충된 DMEM을 Mg2+ 및 Ca2+ 이온이 보충된 예열된 PBS(37℃)로 대체하고, 시료를, 표준 세포 배양 인큐베이터(CO2 조절 없음)에 놓이며 254 nm에서 방출하는 Philips TUV PL-S 5 W/2P 램프 하에 두었다. 램프는 상기 램프로부터 20 cm에서 측정되는 10 W/m2s를 전달하였다. 세포를 UV-C에 1분 동안 노출시켰다. 그 후에, 상기 시료를 얼음 상에 두고, 4% PFA로 즉시 고정시켰다.
H
2
O
2
:
H2O2(최종 농도는 4 mM이었음)를 성장 배지(10% FBS가 보충된 DMEM)에 직접적으로 첨가하였다. 세포를, CO2 수준이 조절되는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시료를 4% PFA에서 즉시 고정시켰다.
Tpt:
Tpt(Sigma-Aldrich, T2705)를 20 μM의 최종 농도에서 성장 배지에 직접적으로 첨가하였다. 세포를, CO2 수준이 조절되는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 시료를 4% PFA에서 즉시 고정시켰다.
실험의 추가의 파트를 실시예 4에서와 같이 동일한 HeLa 세포주를 사용하여, 상기 세포를 임의의 플라스미드로 형질감염시키지 않는다는 사실을 제외하고는, 수행하였다. 이미징 전에, 세포 내 DNA를 DAPI로 염색하였다(4'6'-디아미디노-2-페닐인돌, PBS 중 1 μM, 30분, RT)(Sigma-Aldrich, D9542). 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(DAPI의 검출의 경우: 여기: 405 nm, 방출: 420 내지 480 nm; DNA의 자유 말단에 결합된 BrdU의 검출의 경우: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
결과:
도 7에 제시된 HeLa 세포의 핵의 기록된 이미지의 예는, 대조군, 정상적인, 비처리된 세포에서보다 DNA 손상이 외인성 작용제를 사용하여 유도된 세포에서 검출된 유의하게 더 많은 신호가 존재함을 보여준다. 검출된 내인성 BrdU 포커스의 평균 수는 0.4 ± 0.1(실시예 1에 따라)이다. 상이한 작용제들을 이용한 처리는 BrdU 분자의, 다시 말해 DNA의 자유 말단의 검출 가능한 혼입 영역의 평균 수의 증가(하기로 처리된 세포에서 평균 수: H2O2: 31.57 ± 8.61, UV: 10.73 ± 4.89, Tpt: 16.39 ± 4.92)(도 7)를 유발한다. 추가로, 정상적인, 비처리된 세포 배양물에서 세포자멸사 세포의 예의 이미지는, 이러한 세포에서 BrdU의 더 많은 검출 가능한 혼입 영역이 존재함을 보여준다. 이들의 수(100 초과)는 세포자멸사 동안 발생하는 dDNA 단편화 정도를 반영한다. 심각한 DNA 손상의 징후를 보여주는 야생형의 비처리된 HeLa 세포(세포자멸사 세포)는 통상, 전체 세포 집단 중 5% 미만을 이룬다. 상이한 작용제들로 처리된 세포 집단에서, 이들의 퍼센트는 H2O2로 처리된 세포에서는 대략 30%까지, UV 광으로 처리된 세포에서는 대략 20%까지, 그리고 Tpt로 처리된 세포에서는 대략 18%까지 증가하였다.
결론:
절차 1에 따른 방법은 세포에서 인 시추에서 외인적으로 유도된 DNA 손상의 검출에 적용 가능하다. 이는, 이미지 분석 기법의 추가의 적용에 의해 제시되는 DNA 절단의 국소화를 가능하게 한다. 형광 최대치의 국소화 및 형광 프로파일의 분석은, 핵내 구조 및 염색질 구조(DAPI를 사용하여 염색됨)와 비교하여 고정된 세포 핵에서 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭의 국소화에 관한 정보를 제공할 수 있다(도 7c에 제시된 이러한 분석의 일례). 더욱이, 도 7a에 제시된 이미지는, 절차 1에 따른 방법이 세포자멸사의 검출에도 사용될 수 있음을 입증한다. 제시된 세포는 세포자멸사 세포의 형태적 특징부 특징의 징후를 보여준다(투과광 이미지를 참조). 그 외에도, 제시된 이미지는, 이러한 방법의 적용 결과롯 수득되는 형광 신호가 DNA 절단 유도의 결과로서 발생하는 DNA 말단을 특이적으로 나타내는 신호임을 입증한다. 비처리된 세포에서 검출 가능한 포커스의 수와 손상된 세포에서 검출되는 포커스의 수 사이의 비교는, 수득된 신호가 표지화 기법의 기술적 결점의 인공적인 효과가 아님을 입증한다. 더욱이, 그 결과는, 절차 1에 따른 방법은 수득된 현미경 이미지의 철저한 정량적 분석으로 이어질 수 있고 분석된 생물학적 물질의 조건 및 품질에 대한 많은 정보를 줄 수 있음을 입증한다. 더욱이, 이러한 분석은, 생물학적 물질이 받는 환경 조건에 대한 정보를 전달할 수 있다. 데이터는 비교 분석에 사용될 수 있다.
실시예 7
절차 1의 전체 단계 5(TdT 효소와 함께 BrdU의 혼입)가 생략된 절차 1에 따라 처리된 비처리된 고정된 HeLa 세포에서 신호의 검출.
실험을 실시예 6에서와 같이 동일한 HeLa 세포주를 사용하여, 세포는 임의의 손상 인자를 받게 하지 않고 절차 1의 전체 단계 5가 생략된 점을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 처리 후, 대조군 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
결과:
매우 소수의 포커스가 전체 커버슬립 상에서 검출되었다. 포커스는 형광 신호의 수준이 0 a.u. 초과인 영역으로서 정의되었고, 이들의 국소화는 형광 최대치를 국소화하는 ImageJ 소프트웨어의 빌트-인 특징부를 사용하여 결정되었다. 대부분의 포커스는 세포 핵의 외부에서 국소화되었고, 이는 DAPI로 염색된 세포 핵의 형광 이미지와 형광 최대치의 중첩을 기반으로 결정되었다(도 8). 검출된 포커스의 수 및 관찰된 핵의 수의 분석은, 평균적으로, 1개의 단일 세포 핵 당 검출되는 포커스는 단지 0.13 ± 0.04(핵의 총 수 N = 63)로 존재함을 보여준다. DNA의 자유 말단이 BrdU의 혼입에 의해 변형된 비처리된 HeLa 세포의 경우, 1개의 단일 핵 당 검출되는 포커스의 평균 수는 실시예 1에 기재된 바와 같이 0.4 ± 0.1(N=49)이었다.
결론 및 해석:
절차 1에 따른 방법에서 비-특이적인 항체 인지는 매우 적게 존재한다. 절차 1에 따른 방법의 매우 높은 특이성은, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체가 서로에 대해 가까이 근접하게 결합된 경우에만 신호가 수득될 수 있다는 사실로 인한 것이다. 다시 말해: 이들 항체가 동일한 BrdU 분자에 결합된다면 또는 이들 항체가 DNA 자유 3'-OH 말단에 부착된 사슬을 형성하는 BrdU 분자에 선택적으로 결합된다면 그러하다. 2가지 상이한 유형의 1차 항체들의 사용은 특이성을 증가시킨다. BrdU가 존재하지 않아도, 매우 적은 신호가 검출 가능하며, 이는 적용된 검출 방법의 매우 적은 교차-반응성이 존재한다는 개념을 뒷받침한다.
실시예 8
절차 1에 따른 방법을 사용한, 광역학적 효과에 의해 유도된 고정된 HeLa 세포에서 DNA 절단의 검출.
이 실험에서, 살아 있는 세포(HeLa 21-4 세포, 옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 에티듐 브로마이드(500 μM)로 10분 동안 처리하고, 그 후에, 절차 1의 투광 단계 2를 수행한 후 2분째에 핵 내부(선량: 9 mJ)의 선택된 장소에 레이저 빔(488 nm)을 쏘아서, DNA 절단을 유도하였다. 실험의 목적은 광역학적 효과에 의해 세포 핵의 특정 영역에서 입은 DNA 절단(들)을 직접적으로 검출하는 것이었다.
HeLa 21-4 세포를 우선, 18-mm 커버슬립 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후, DNA 손상을 이전에 기재된 바와 같이 선택된 세포에서 유도하였으며, 뒤이어 수중 70% 에탄올에서 -20℃에서 15시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, DNA 말단의 접근성을 증가시키는 단계(단계 4)를 수중 10 mM EDTA를 이용하여 RT에서 1시간 동안 수행하였다. 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 의한 변형된 (BrdUTP) 뉴클레오타이드(Phoenix Flow Systems)의 혼입을 키트 제조업체(APO-BRDU 키트, Phoenix Flow Systems)의 설명서에 따라 수행하였다. 그 후에, 세포를 PBS 중 1% BSA 용액과 함께 인큐베이션하였다(4℃에서 밤새). 절차 2의 단계 7에 따라 1차 항체 유형 1 및 2와의 인큐베이션을, 각각 마우스 모노클로날 항-BrdU(Abcam, ab8039) 및 토끼 폴리클로날 항-BrdU(Abcam, ab152095)(1% BSA에서 1:100)를 사용하여 수행하였다. 마지막 세척 후, 세포를 단계 8(PLA 절차)에 따라 Duolink 인 시추 PLA 프로브 항-토끼 MINUS(Sigma, DUO92006), Duolink 인 시추 PLA 프로브 항-마우스 PLUS(Sigma, DUO92001), 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014), Duolink 인 시추 세척 완충제, DUO82049를 사용하여 처리하였다. 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 510 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하였다.
결과:
현미경 이미지를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(문헌[Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J.: Image processing with imageJ. Biophotonics Int., 2004; 11: 36-41]). 형광 포커스는 손상된 핵 중 90%에서 정확히 투광된 장소에서 또는 이의 직접적인 근접부에서 명료하게 볼 수 있다(실시예: 도10, 우측 컬럼).
결론:
광과 DNA 인터칼레이터(intercalator)(감광제)의 상호작용에 의해 유도되는 적은 수의 DNA 절단은 절차 1에 따른 방법에 의해 검출 가능하다.
비교예 3
표준 TUNEL 검정법을 사용한, 광역학적 효과에 의해 유도된 고정된 HeLa 세포에서 DNA 절단의 검출.
HeLa 21-4 세포를 실시예 6에서와 같이 접종하고, 배양하고, 처리하였다. 추가의 처리를 위해, 표준 TUNEL 검정법(APO BrdU Phoenix Flow Systems)을 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 488 nm, 방출: 510 내지 600 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
비교예 3을 실시예 9의 결과와 비교하였다.
결과:
현미경 이미지를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다 (Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J.: Image processing with imageJ. Biophotonics Int., 2004; 11: 36-41). 표준 TUNEL 검정법의 경우, 투광된 장소에서, 어떠한 포커스도 보이지 않았다. 절차 1에 따른 방법의 경우, 포커스는 정확하게 투광된 장소에서 또는 이의 직접적인 근접부에서 명료하게 보일 수 있었다(도 9).
결론:
절차 1에 따른 방법은 표준 TUNEL 검정법보다 더 민감하고, 광과 감광제 사이의 상호작용에 의해 유도되는 적은 수의 DNA 이중-가닥 절단의 검출을 가능하게 한다. 유사한 수의 손상은 표준 TUNEL 검정법에 의해서는 검출되지 않는다.
실시예 9
고정된 U2-OS 세포에서 뉴클레아제 SpCas9의 분할 활성의 결과로서 생성되는 DNA 말단의 검출을 위한 절차 1 및 표준 TUNEL 검정법의 용도
뉴클레아제 SpCas9의 분할 활성의 결과로서 발생하는 DNA 말단의 검출을 위한 절차 1의 적용성을 결정하기 위해, CRISPR/Cas9 기법을 사용하였다. 뉴클레아제는 반복 서열의 존재를 특징으로 하는 염색체 3 상에 놓인 하위텔로머성 영역에 대해 표적화되었다. SpCas9를 사용하여, 몇몇 개 초과의(수십개 이하의) 분할을 유도하였다.
이 실시예에서, 검출 전에, U2-OS 세포(HTB-96™, ATCC)를 14 mm 마이크로웰을 갖는 유리 바닥 35 mm 페트리 디쉬(No. 1.0 피복유리, 두께: 0.13 내지 0.16 mm)(MatTek Corporation, P35G-1.0-14-C)(1개 페트리 디쉬 당 3.5 x 104개 세포) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포 핵 내부의 특이적인 부위에서 Cas9 포커스를 이미지화하기에 적합한 조건을 수득하기 위해(CRISPR/Cas9 기법), 세포를, 형광 표지된(3X mCherry) 뉴클레아제 SpCas9를 인코딩하는 플라스미드 및 sgRNA의 적합한 조합(형질감염 작용제: FuGene(Promega, E2311), OptiMEM으로 제조된 형질감염 혼합물(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 31985070), 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양된 세포)으로 형질감염시키고, 세포를 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양하였다. 형질감염 후, 세포를 48시간 동안 배양하였다. 절차 1에 따라 시험되고 도 10에 제시된 세포의 경우, Tris를 이용한 사전-제조가 존재하지 않았다(단계 1). 다음, 단계 2는 1% PFA(Electron Microscopy Sciences, 15710-S)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션, 및 0.25% Triton X-100(Sigma, T8787)을 이용하여 실온에서 1시간 동안의 투과를 포함하였다. 투과 후, BrdU를, APO-BRDU 키트(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 사용하여 TdT 효소로 DNA의 자유 말단에 연결하였다. 효소와의 인큐베이션을 습한 챔버에서 액적 상에서 수행하였다. 효소적 반응(공급업체의 설명서에 따라 수행됨) 후, 시료를 헹굼 완충제(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)로 신속하게 2회 헹구었다. 이후, 시료를 PBS 중 5% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속적으로 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[마우스 모노클로날 항-BrdU(희석: 5% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039), 토끼 폴리클로날 항-BrdU(희석: 5% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였으며: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰고; PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰다. PLA 검출: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. Duolink® 인 시추 검출 시약 레드(Sigma, DUO92008)를 사용하여 형광 신호를 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific), 10977-035)에서 제조하였다.
TUNEL 검정법의 경우, 세포를 상기 언급된 바와 같이 접종하고, 형질감염시켰다. 형질감염 후, 도 10에 제시된 세포를 또한, 48시간 동안 배양하고, 후속적으로 1% PFA(Electron Microscopy Sciences, 15710-S)로 실온에서 15분 동안 고정하고, 0.25% Triton X-100(Sigma, T8787)으로 실온에서 1시간 동안 투과하였다. DNA의 자유 말단으로의 BrdU 연결을 또한, 동일한 방식으로 수행하였다. 이후, 세포를 습한 챔버에서 액적(50 μl) 상에서 1차 항체[마우스 모노클로날 항-BrdU(희석: 5% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039)]와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체와의 인큐베이션 후, 시료를 PBS(완충제를 4회 대체하였으며, 시료를 PBS에서 1시간 동안 유지시켰음)에서 세척하고, 2차 항체와의 인큐베이션[염소 항-마우스 IgG1 2차 항체, Alexa Fluor® 594 공액체(희석: 5% BSA에서 1:400)(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, A21125)]을 습한 챔버에서 액적(50 μl) 상에서 실온에서 1시간 동안 수행하였다. 다음, 시료를 PBS(3 x 5분)에서 세척하고, PBS에서 밤새 놔두었다.
처리 후, 모든 시료에 대해, 위상-대조 및 형광 현미경 이미징을 수은 아크 램프, 10-위치 필터 휠(wheel)(Sutter Instrument), CFP/YFP/HcRed 필터 세트, GFP/DsRed 필터 세트(Semrock), CCD 카메라(Photometrics), 및 MetaMorph 획득 소프트웨어(Molecular Devices)가 장착된 Leica DM-IRB 도립 현미경으로 수행하였다. 레드 표지(Alexa Fluor® 594 및 Duolink® 인 시추 검출 시약 레드(Sigma, DUO92008)에 사용된 표지)를 556/20 nm(파장/대역)에서 여기시키고, 이의 방출을 630/91-nm 채널에서 수합하였다. GFP를 470/28 nm에서 여기시키고, 이의 방출을 512/23-nm 채널 이미징에서 수합하고, 데이터를 MetaMorph 획득 소프트웨어(Molecular Devices) 및 ImageJ 소프트웨어(문헌[Abramoff M.D., Magalhaes P.J., Ram S.J.: Image processing with ImageJ . (Biophotonics Int., 2004; 11: 36-41])로 획득하고 분석하였다. 역치를 배경 핵질 형광에 대한 핵 포커스 신호의 비를 기반으로 설정하였다.
결과:
도 10에 제시된 형광 강도의 이미지 및 프로파일은, 수십 개의 분할이 인간 게놈에서 하나의 부위에서 유도되는 CRISPR/Cas9 기법을 사용하여 발생된 자유 DNA 말단의 검출에 표준 TUNEL 검정법이 사용되었을 때 어떠한 신호도 검출되지 않았음을 보여준다. 뉴클레아제 SpCas9의 축적과 연관되고 BrdU의 표준 면역형광 검출에 사용되는 2차 항체와 공액된 Alexa Fluor® 594에 의해 방출되는 영역에서 측정된 형광 강도의 평균 값은 대략 0이었다(50개의 핵을 분석하고, 그 값을 배경 신호의 수준을 기반으로 정규화하여, 비-특이적으로 결합된 항체 분자를 나타내었음). 기록된 현미경 이미지의 대표적인 예에 대해 측정된 형광 프로파일의 예는, 어떠한 BrdU 포커스도 검출될 수 없었음을 분명하게 예시한다. 대조적으로, 절차 1에 따른 방법을 적용하였을 때, 어떠한 비-특이적인 배경 신호도 검출되지 않았고, BrdU 혼입 영역은 현미경 이미지에서 시각화된 분명한 포커스로 나타났다(도 10). 이들 포커스는 SpCas9의 축적 영역과 함께 공동국소화되었다. 이들 관찰은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득된 대표적인 형광 강도 프로파일에 의해 추가로 확증되었다(도 10).
결론:
그 결과는, 인간 게놈에서 특이적인 부위에서 서로 가까이 근접하게 놓인 수십 개의 이중-가닥 DNA 절단을 인지하기에는 심지어 충분히 민감하지 않는 표준 TUNEL 검정법과는 달리, 절차 1에 따른 방법은 인간 세포에서 SpCas9에 의해 유도되는 DNA 분할을 검출할 수 있음을 확증한다. 이미지 분석 결과는 절차 1에 따른 방법의 특이성 및 민감도에 대한 또 다른 증거를 제공하고, 현재까지 DNA 절단의 검출에 사용되었던 기존의 방법을 능가하는 상기 방법의 이점을 강조한다.
실시예 10
고정된 U2-OS 세포에서 뉴클레아제
SpCas9의
절단 활성의 결과로서 생성되는 DNA 말단의 고도로 민감한 검출을 위한 절차 1의 용도
뉴클레아제 SpCas9의 절단 활성으로 인한 DNA 말단의 검출을 위한 절차 1의 적용 가능성을 결정하기 위해, CRISPR/Cas9 기법을 사용하였다. 뉴클레아제는 반복 서열의 존재를 특징으로 하는 염색체 3 상에 놓인 하위텔로머성 영역에 대해 표적화되었다. 이를 위해, U2-OS 세포(HTB-96™, ATCC)를 2가지 상이한 방식으로 제조하여, 하기를 수득하였다:
·
뉴클레아제 분자가 표적화된 영역에 결합된 사실에도 불구하고, SpCas9가 임의의 절단을 유도하지 않은 세포
·
SpCas9이 반복 서열의 영역에 가까이 근접하게 국소화된 게놈 서열에 놓인 부위에서 단지 하나의 단일-이중 가닥 절단부(절단)을 유도한 세포.
이 실시예에서, 검출 전에, U2-OS 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 3.5 x 104개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 상기 언급된 "세포 유형"을 발생시키고, 세포 핵(CRISPR/Cas9 기법) 내부에서 특이적인 부위에서 SpCas9 포커스를 이미지화하기에 적합한 조건을 생성하기 위해, 세포를, 형광 표지된(3X mCherry) SpCas9을 인코딩하는 플라스미드 및 sgRNA의 적합한 조합(형질감염 작용제: FuGene(Promega, E2311), OptiMEM으로 제조된 형질감염 혼합물(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 31985070), 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양된 세포)으로 형질감염시키고, 세포를 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양하였다.
세포를, 형광 표지된(3X mCherry) 뉴클레아제 SpCas9를 인코딩하는 플라스미드 및 sgRNA의 적합한 조합(형질감염 작용제: FuGene(Promega, E2311), OptiMEM으로 제조된 형질감염 혼합물(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 31985070), 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양된 세포)으로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 48시간 동안 배양하고, 후속적으로 절차 1에 따라 처리하였다. 도 11에 제시된 세포의 경우, Tris를 이용한 사전-제조가 존재하지 않았다(단계 1). 단계 2는 70% Et(OH)(밤새; -20℃)를 이용한 고정만 포함하였다. 수중 10 mM EDTA 용액에서 실온에서 30분 동안 시료의 인큐베이션 후, 상기 시료를 세척 완충제(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)로 단지 신속하게 2회 헹구었다. BrdU를, APO-BRDU 키트(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 사용하여 TdT 효소를 이용하여 DNA의 자유 말단에 연결하였다. 효소와의 인큐베이션을 습한 챔버에서 액적 상에서 수행하였다. 효소적 반응(공급업체의 설명서에 따라 수행됨) 후, 시료를 헹굼 완충제(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)로 신속하게 2회 헹구었다. 이후, 시료를 PBS 중 1% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속적으로 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[BrdU에 대한 마우스 모노클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039), BrdU에 대한 토끼 폴리클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였다: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 1% BSA에서 희석시켰다. PLA 검출: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. 형광 신호를 Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014)을 사용하여 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)에서 제조하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(DNA의 자유 말단에 결합된 BrdU의 검출의 경우: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm; SpCas9의 검출의 경우: 여기: 594 nm, 방출: 605 내지 700 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
결과:
도 11에 제시된 이미지는, 심지어 단지 하나의 DNA 이중-가닥 절단이 SpCas9 절단 활성의 결과로서 발생한다면, 이러한 절단이 절차 1에 따른 방법에 의해 특이적으로 인지될 수 있음을 보여준다. 이는 축적된 SpCas9 분자 및 혼입된 BrdU 분자에 대한 연관된 형광 신호 특징의 발생에 의해 반영된다. SpCas9이 임의의 절단 활성을 수행하지 않는 경우, BrdU의 어떠한 혼입도 뉴클레아제의 축적 영역에서 검출될 수 없다(도 11). 도 11의 이미지는, 단지 하나의 단일 이중-가닥 DNA 절단이 유도되는 경우, BrdU 검출 영역의 국소화가 SpCas9 포커스와 함께 공동국소화되는 영역에 존재함을 보여준다(도 11). 일부 경우, BrdU 포커스는 SpCas9 포커스에 인접한 영역에서 검출될 수 있다(데이터는 제시되지 않음). 대체로 추정컨대, 이는, 염색질 풀림을 야기하는 EDTA의 처리가, DNA가 절단될 때 발생하고 유리되는 2개의 상보적인(3' 및 5') DNA 말단들의 전위를 유발한다는 사실에 의해 야기된다. 병변 부위에서 생성되는 2개의 비-안정화된 DNA 단편들은 분리되고, 서로 이격된다.
결론:
상기 결과는, 절차 1에 따른 방법이 인간 세포에서 SpCas9에 의해 유도되는 DNA 절단을 검출할 수 있음을 확증한다. 더욱이, 이는 단일 병변을 검출할 수 있을 정도로 높은 민감도를 갖고 있기 때문에 절단 수에 상관없이, SpCas9-유도 DSB의 검출에서 고도로 특이적인 마커로서 사용될 수 있다. 어떠한 절단도 유도되지 않는 경우에 어떠한 검출 가능한 신호도 없다는 사실은 상기 방법의 높은 특이성을 확증한다. 그 결과는 또한, 이러한 기법의 매우 높은 민감도를 확증하고: 상기 기법은 하나의 이중-가닥 DNA 절단을 검출하는 확률을 제공한다.
실시예 11
고정된 U2-OS 세포에서 닉카제 SpCas9n(H840A)의 틈형성(nicking) 활성의 결과로서 생성되는 DNA 말단의 검출을 위한 절차 2의 용도
닉카제 SpCas9n(H840A)의 틈형성 활성으로 인한 DNA 말단의 검출을 위한 절차 2의 적용성을 결정하기 위해, CRISPR/Cas9 기법을 사용하였다. 닉카제는 반복 서열의 존재를 특징으로 하는 염색체 3 상에 놓인 하위텔로머성 영역에 대해 표적화되었다. 이를 위해, U2-OS 세포(HTB-96™, ATCC)를 3가지 상이한 방식으로 제조하여, 하기를 수득하였다:
·
SpCas9n이 수 개 초과의(수십 개 이하의) 단일-가닥 틈을 유도한 세포(틈은 동일한 DNA 가닥에서 유도되었음),
·
SpCas9n 분자가 표적화된 영역에 결합된 사실에도 불구하고, SpCas9n이 임의의 절단을 유도하지 않은 세포,
·
SpCas9n이 반복 서열의 영역에 가까이 근접하게 국소화된 게놈 서열에 놓인 부위에서 단지 하나의 단일-가닥 틈을 유도한 세포.
이 실험에서, 검출 전에, U2-OS 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 3.5 x 104개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 상기 언급된 "세포 유형"을 발생시키고, 세포 핵(CRISPR/Cas9 기법) 내부에서 특이적인 부위에서 SpCas9n 포커스를 이미지화하기에 적합한 조건을 생성하기 위해, 세포를, 형광 표지된(3X GFP) SpCas9n(H840A)을 인코딩하는 플라스미드 및 sgRNA의 적합한 조합(형질감염 작용제: FuGene(Promega, E2311), OptiMEM으로 제조된 형질감염 혼합물(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 31985070), 10% FBS가 보충된 OptiMEM에서 배양된 세포)으로 형질감염시켰다. 그 후에, 세포를 형질감염 후 48시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 세포를 절차 2에 따라 처리하였다. 도 12의 이미지에서 제시된 세포의 경우, Tris를 이용한 처리가 존재하지 않았다. 다음 단게는 70% Et(OH)(밤새 인큐베이션; -20℃)를 이용한 고정을 포함하였다. 이후, 시료를 내인성 비오틴-차단 키트(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, E21390)를 절차 2에 제공된 설명에 따라 사용하여 사전-차단하였다. 시료를 수중 10 mM EDTA 용액에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상기 시료를 증류수로 신속하게 헹구고, 틈 번역 검정법 반응 혼합물[1x NEBuffer2(NEBiolabs, B7002S), 30 uM의 각각의 dNTP(Jena Bioscience, N6-(6-아미노)헥실-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 - 비오틴(비오틴-7-dATP): NU-835-BIO-S, 비오틴-16-프로파길아미노-dCTP: NU-809-BIO16, 비오틴-16-5-아미노알릴-dUTP: NU-803-BIO16, dGTP: NU-1003) 1개 커버슬립 당 3 단위의 DNA 폴리머라제 I(이. 콜라이)(NEBiolabs, MO209), 초순수 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)]과 함께 습한 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 시료를 PBS 중 1% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, 상기 시료를 PBS 중 1% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속적으로 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[마우스 모노클로날 항-비오틴[Hyb-8](희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab201341), 토끼 폴리클로날 항-비오틴(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab53494)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였다: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰다. PLA 검출: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. 형광 신호를 Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014)을 사용하여 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)에서 제조하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(SpCas9n의 검출의 경우: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm; DNA의 자유 말단에 결합된 비오틴화된 또는 비변형된 뉴클레오타이드의 검출의 경우: 여기: 594 nm, 방출: 605 내지 700 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
결과:
도 12에 제시된 이미지는, 하나 이상의 단일-가닥 DNA 절단이 SpCas9n(H840A) 틈형성 활성의 결과로서 발생한다면, 이들 절단이 DNA 폴리머라제 I 및 절차 2에 따른 방법에 의해 특이적으로 인지됨을 보여준다. 이는 축적된 형광 표지된 SpCas9n 분자 및 혼입된 비오틴화된 뉴클레오타이드에 대한 연관된 형광 신호 특징의 발생에 의해 반영된다. SpCas9n이 임의의 절단 활성을 수행하지 않는 경우, 변형된 뉴클레오타이드의 어떠한 혼입도 닉카제의 축적 영역과 함께 공동국소화되는 또는 부분적으로 국소화되는 영역에서 검출될 수 없다(도 12). 도 12의 이미지는, 단지 하나의 단일-가닥 DNA 절단이 유도되는 경우, 뉴클레오타이드 혼입의 국소화가 SpCas9n 포커스와 함께 공동국소화됨을 보여준다(도 12). 틈의 수가 하나 초과(수십 개 이하)인 경우, 뉴클레오타이드 혼입 및 SpCas9n 포커스 영역 또한, 공동국소화된다(도 12).
결론:
그 결과는, 절차 2에 따른 방법이 인간 세포에서 SpCas9n에 의해 유도되는 DNA 틈을 검출할 수 있음을 확증한다. 더욱이, 이는 절단 수에 상관없이, SpCas9n-유도 단일-가닥 절단(SSB)의 검출에서 고도로 특이적인 마커로서 사용될 수 있다. 어떠한 SSB도 유도되지 않는 경우에 어떠한 검출 가능한 신호도 없다는 사실은 상기 방법의 높은 특이성을 확증한다. 그 결과는 또한, TUNEL 기법을 초월하는 매우 높은 민감도를 확증하고: 상기 기법은 단지 하나 이하의 단일-가닥 DNA 절단을 검출하는 가능성을 제공한다.
실시예 12
염색질의 후속적인 단리를 이용한, 현탁액 중 세포에서 DNA 절단의 검출을 위한 절차 1의 용도
이 실시예에서, HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 6-웰 플레이트 상에 접종하고, 배양물이 100% 포화도(세포 수: 1개 웰 당 1.2 x 106개)에 도달할 때까지 10% FBS가 보충된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다. 다음, 세포를 DNA 손상제 H2O2로 처리하였으며, 상기 손상제를 성장 배지에 직접적으로 첨가하였다(최종 농도: 4 mM). 상기 세포를, CO2 수준이 조절되는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 대조군, 비처리된 세포 및 손상된 세포(H2O2)를 0.5 ml 트립신을 사용하여 수합하고, 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 이후, 0.5 ml의 10% FBS가 보충된 DMEM을 첨가함으로써 트립신을 불활성화시켰다. 후속적으로, 세포를 테이블 탑 원심분리기(에펜도르프 원심분리기, 5417C, 로터(rotor): F45-30-11)(1700 rpm, 5분, 실온)에서 회전 침강(spin down)시켰다. 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, 다시 회전 침강시켰다(이 세척 단계를 2회 반복하였음). 상층액 PBS를 폐기했을 때, 세포를 PBS의 잔여 액적에 재현탁시켰다. 후속적으로, 얼음-냉각 70% Et(OH)를 적가하고, 세포를 Et(OH)에서 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 세포를 절차 1에 따라 처리하였으며, 여기서, 단계 1, 3, 4, 9를 생략하였고, 모든 세척 단계 및 모든 인큐베이션 후에 원심분리가 이어졌다. BrdU를, APO-BRDU 키트(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 TdT 효소를 사용하여 DNA의 자유 말단에 연결하였다. 다음, 세포를 PBS 중 1% BSA 용액에서 30분 동안 차단시키고, 후속적으로 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[BrdU에 대한 마우스 모노클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039), BrdU에 대한 토끼 폴리클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였으며: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰고: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014)을 사용하여 형광 신호를 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific), 10977-035)에서 제조하였다. 표지화 후, 세포 펠렛을 50 μl 10 mM Tris(pH 8.8)에 재현탁시키고, 테이블 탑 원심분리기(1분, 14000 rpm, 실온)에서 회전 침강시켰다. 상기 세포를 10 μl의 TE 완충제(1 mM EDTA·Na2를 함유하는 10 mM Tris-HCl)에 재현탁시키고, 15분 동안 가열하였다(99℃). 시료를 얼음 상에서 냉각시키고, 상기 테이블 탑 원심분리기(1분, 전속력: 14000 rpm, 실온)에서 회전 침강시켰다. 전체 상층액을 수합하고, 증류수에서 40 μl의 총 부피까지 희석시키고, 추가의 측정에 사용하였다.
비처리된 대조군 세포 및 H2O2 손상 세포로부터 수득된 세포 추출물의 형광 강도 수준을 형광 분광광도계(Xe 램프가 공급된 Hitachi F-7000)를 사용하여 측정하였다. 형광 강도를 30초 동안 측정하였다(여기 480 nm, 방출 520 nm).
결과:
BrdU의 혼입은 TdT 효소에 의해 인지되는 특이적인 유형의 DNA 3'-OH 말단을 표시하며, 이들은 이중-가닥 평활-말단 절단 또는 이중-가닥 3'-돌출 절단 또는 단일-가닥 갭이 발생할 때 존재한다. 자유 DNA 말단의 수는 손상제, 예컨대 H2O2를 처리한 결과로서 증가하며, 이는 절차 1에 따라 처리된 시료에서 혼입된 BrdU 분자의 수의 증가 및 총 형광 강도 신호의 증가를 초래한다(도 13). 대조군 시료에서 1개 DNA 단위(1 ng) 당 측정된 형광 강도는 2.9 x 10-4 a.u.인 반면, H2O2로 처리된 시료에서 1 ng의 DNA 당 측정된 형광 강도는 더 높았다 - 3.19 x 10-4 a.u.(표 1).
결론:
절차 1에 따른 방법은 현탁액 중 세포에서 DNA 손상의 정량적 검출 및 비교 분석, 뒤이은 염색질의 추출에 적용 가능하다.
| 비처리 | H2O2 처리 | |
| DNA 농도 [ng/μl] |
5.0 | 3.6 |
| 부피 [μl] | 40 | 40 |
| 형광 신호 [a.u.] | 0.058 ± 0.005 | 0.046 ± 0.005 |
| 1 ng의 DNA 당 형광 신호 [a.u./ng] | 2.9 ± 0.2 x 10 -4 | 3.2 ± 0.3 x 10 -4 |
실시예 13
단리된 염색질에서 DNA 절단의 검출을 위한 절차 1과 2의 조합의 용도.
이 실시예에서, HeLa 21-4 세포(옥스포드 대학교의 P.R. Cook으로부터 입수)를 6-웰 플레이트 상에 접종하고, 배양물이 100% 포화도(세포 수: 1개 웰 당 1.2 x 106개)에 도달할 때까지 10% FBS가 보충된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다. 다음, 세포를 DNA 손상제 H2O2로 처리하였으며, 상기 손상제를 성장 배지에 직접적으로 첨가하였다(최종 농도: 4 mM). 상기 세포를, CO2 수준이 조절되는 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 대조군, 비처리된 세포 및 손상된 세포(H2O2)를 0.5 ml 트립신을 사용하여 수합하고, 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 이후, 0.5 ml의 10% FBS가 보충된 DMEM을 첨가함으로써 트립신을 불활성화시켰다. 후속적으로, 세포를 테이블 탑 원심분리기(에펜도르프 원심분리기, 5417C, 로터: F45-30-11)(1700 rpm, 5분, 실온)에서 회전 침강시켰다. 세포 펠렛을 10 mM Tris(pH 8.8)에 재현탁시키고, 상기 현탁액(50 μl) 중 세포의 작은 분취물을 새 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮기고, 테이블 탑 원심분리기에서 회전 침강시켰다(1분, 14000 rpm, 실온). 상층액 PBS를 폐기하고, 동일한 부피(50 μl)의 10 mM Tris(pH 8.8)에서의 세척 단계를 반복하였다(테이블 탑 원심분리기에서의 원심분리(1분, 14000 rpm, 실온)). 상기 세포를 10 μl의 TE 완충제(1 mM EDTA·Na2를 함유하는 10 mM Tris-HCl)에 재현탁시키고, 15분 동안 가열하였다(99℃). 시료를 얼음 상에서 냉각시키고, 상기 테이블 탑 원심분리기(1분, 전속력: 14000 rpm, 실온)에서 회전 침강시켰다. 전체 상층액(세포로부터 추출된 염색질을 함유함)을 수합하였다. 8 μl의 이소프로판올을 첨가하고, 뒤이어 테이블 탑 원심분리기에서 원심분리(1분, 전속력: 14000 rpm, 실온)함으로써 상층액 중 DNA를 침전시켰다. DNA를 5 μl의 70% Et(OH)에 재현탁시키고, 테이블 탑 원심분리기(1분, 전속력: 14000 rpm, 실온)에서 회전 침강시켰다. 상층액을 폐기하였다. 시료를 절차 1에 따라 처리하였으며, 여기서, 단계 1은 생물학적 물질의 단리를 유발하여 DNA 말단의 접근성의 증가를 유발하는 상기 언급된 단계의 일부였다. 단계 2, 3 및 4는 생략되었다. 단계 5에서, 단리된 DNA를 하기를 함유하는 변형된 반응 혼합물에 재현탁시킴으로써 DNA 말단을 변형시켰다: DNA 폴리머라제 I(이. 콜라이)(NEBiolabs, MO209), 1x NEBuffer2(NEBiolabs, B7002S), 반응 완충제(Phoenix Flow Systems, AU: 1001)를 갖는 TdT(Phoenix Flow Systems, AU: 1001), dNTP의 혼합물(Jena Bioscience, N6-(6-아미노)헥실-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 - 비오틴(비오틴-7-dATP): NU-835-BIO-S, 비오틴-16-프로파길아미노-dCTP: NU-809-BIO16, dGTP: NU-1003) 및 BrdU(Phoenix Flow Systems, AU: 1001), 초순수 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035). 현탁액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 절차 2의 단계 5c에 기재된 바와 같이 Tris-HCl을 사용하여 폴리머라제 반응을 종료시켰다. 상기 현탁액을, 스트렙타비딘으로 사전-인큐베이션되고, 비오틴-피복된 피복 유리(Bio-02, Microsurfaces, Inc.) 상으로 옮기고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 단리된, 변형된 DNA(혼입된 BrdU 및 비오틴화된 뉴클레오타이드를 가짐)를 유리 커버슬립 상에 부동화시켰다. 다음, 부동화된 DNA를 PBS 중 1% BSA 용액에서 30분 동안 차단시키고, 후속적으로, 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[BrdU에 대한 마우스 모노클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab8039), BrdU에 대한 토끼 폴리클로날 항체(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab152095)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였으며: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰고: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. Duolink® 인 시추 검출 시약 그린(Sigma, DUO92014)을 사용하여 형광 신호를 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific), 10977-035)에서 제조하였다. 처리 후, 비처리된 대조군 세포 및 H2O2 손상 세포로부터 수득된 세포 추출물의 형광 강도 수준을 Leica TCS SP5 공초점 현미경을 사용하여, 피복 유리 상에서 부동화된, 상기 부동화된 변형된 DNA의 형광 이미지를 이미지화함으로써 측정하였다(DNA의 자유 말단에 결합된 BrdU의 검출의 경우: 여기: 488 nm, 방출: 498 내지 540 nm).
결과:
자유 DNA 말단의 수는 손상제, 예컨대 H2O2의 처리 결과 증가한다. 이는 절차 1과 2의 조합에 따라 처리된 시료에서, 혼입된 BrdU 분자의 수의 증가 및 전체 통합된 형광 강도 신호의 증가를 초래한다. 각각의 시료에 대해, 평균 회색 값(형광 강도)을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 대조군 시료에서 측정된 형광 강도는 6.0 ± 0.1 a.u.인 반면, H2O2로 처리된 시료에서 측정된 형광 강도는 8.9 ± 0.1 a.u이었다. 언페어드(unpaired) 2-시료 t-검정은, 대조군 시료와 H2O2 처리 시료 사이에서 평균의 차이가 통계학적으로 유의함을 보여주었다(p-값 < 0.001).
결론:
절차 1과 2의 조합에 따른 방법은 단리된 염색질에서 DNA 손상의 정량적 검출 및 비교 분석에 적용 가능하다.
실시예 14
DNA 말단의 접근성이 고정 전에 증가된, 고정된 U2-OS 세포에서 DNA 말단의 검출을 위한 절차 2의 용도.
이 실험에서, 검출 전에, U2-OS 세포를 18-mm 커버슬립(세포 수: 1개 커버슬립 당 3.5 x 104개) 상에 접종하고, 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 72시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 세포를 절차 2에 따라 처리하였다. 고정 전에, 세포를 1 mM Tris와 함께 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 동안, 세포의 형태를 모니터링하였다. 다음 단계는 70% Et(OH)(밤새 인큐베이션; -20℃)를 이용한 고정을 포함하였다. 이후, 시료를 내인성 비오틴-차단 키트(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, E21390)를 절차 2에 제공된 설명에 따라 사용하여 사전-차단하였다. 시료를 수중 10 mM EDTA 용액에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상기 시료를 증류수로 신속하게 헹구고, 틈 번역 검정법 반응 혼합물[1x NEBuffer2(NEBiolabs, B7002S), 30 uM의 각각의 dNTP(Jena Bioscience, N6-(6-아미노)헥실-2'-데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 - 비오틴(비오틴-7-dATP): NU-835-BIO-S, 비오틴-16-프로파길아미노-dCTP: NU-809-BIO16, 비오틴-16-5-아미노알릴-dUTP: NU-803-BIO16, dGTP: NU-1003) 1개 커버슬립 당 3 단위의 DNA 폴리머라제 I(이. 콜라이)(NEBiolabs, MO209), 초순수 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)]과 함께 습한 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 시료를 PBS 중 1% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음, 상기 시료를 PBS 중 1% BSA 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 후속적으로 1차 항체와의 인큐베이션을 수행하였다[마우스 모노클로날 항-비오틴 [Hyb-8](희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab201341), 토끼 폴리클로날 항-비오틴(희석: 1% BSA에서 1:100)(Abcam, ab53494)]. 추가의 처리를 위해, 하기 시약을 사용하였다: PLA 프로브: Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-마우스 MINUS, 친화도 정제된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Sigma, DUO82004, 키트: DUO92004) 및 Duolink® 인 시추 PLA® 프로브 항-토끼 PLUS, 친화도 정제된 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(Sigma, DUO82002, 키트: DUO92002); PLA 프로브를 5% BSA에서 희석시켰다. PLA 검출: 시료를 Duolink® 인 시추 세척 완충제(Sigma, DUO82049)를 사용하여 세척하였다. 형광 신호를 Duolink® 인 시추 검출 시약 레드(Sigma, DUO92008)를 사용하여 발생시켰다. 효소적 반응을 초순수, RNAse/DNAse-무함유, 증류수(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 10977-035)에서 제조하였다. 처리 후, 시료를 Leica TCS SP5 공초점 현미경(여기: 594 nm, 방출: 605 내지 700 nm)을 사용하여 이미지화하고 분석하였다.
결과:
수득된 이미지(도 14)에서, 상이한 수의 형광 포커스들이 검출될 수 있었다. 상기 포커스는 세포 핵 내부에서 특이적으로 국소화되었다.
결론:
살아 있는 세포에서 염색질의 접근성을 증가시키는 방식은, 살아 있는 세포를 Tris 용액과 함께 인큐베이션함으로써 수득될 수 있다. 이러한 절차에서 이 단계는 유의한 염색질 풀림에 의해 세포에서 DNA 손상 검출의 효율을 유의하게 향상시킬 수 있었다. 그 결과는, 이 단계를 절차 2에 추가하는 것이 신뢰할 만한 데이터를 초래하고, 이는 고정 전에 Tris를 이용한 살아 있는 세포의 처리가 시료에서 DNA 말단의 접근성을 증가시키는 대안적인 방식일 수 있음을 입증한다.
상기 기재된 실시예는 본 방법을 개시한다. 또 다른 양태에서, 본 발명이 또한, 생물학적 물질에서 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한 롤링 서클 복제의 용도, 뿐만 아니라 DNA 말단(들)의 검출 방법의 용도를 제공하므로, 당업자에게 있어, 상기 언급된 실시예는 본 발명의 용도-관련 양태에 대해 동일하게 나타내고, 이들 실시예는 설명의 간략성을 위해 다시 기재되지는 않을 것임이 분명해야 한다.
당업자는 또한, 본 발명이 많은 변형, 변경, 변화, 치환을 받을 수 있고, 실시예에서 제시된 특징(feature)이 특정 필요성에 적합하게 조합될 수 있으며, 이들 모두가 첨부된 청구항에서 정의된 바와 같은 보호 범위에 의해 포괄될 것임을 알 것이다.
Claims (68)
- 하기 단계 I 내지 III, 및 단계 I 내지 III 각각의 하위-단계 a 내지 h 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)을 검출하는 방법으로서,
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화(immobilization)시키는 단계,
b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c. 상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d. 화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f. 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA; rolling circle amplification) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g. DNA 말단(들)을 하기에 의해 검출하는 단계:
i. 선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제(ligase)를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h. 분자 유형 6을 검출하는 단계,
상기 단계 I의 1개 이상의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 DNA 말단(들)은 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 포함하는 임의의 DNA 절단(들)의 결과인, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 DNA 절단(들)은 단일-가닥 틈(nick), 단일-가닥 갭, 단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단, 이중-가닥 평활-말단(blunt-end) 절단, 이중-가닥 3'-돌출 절단(protruding break), 이중-가닥 5'-돌출 절단, 3'-OH 또는 5'-포스페이트 DNA 말단이 존재하지 않는 것들을 포함하는 유형의 DNA 가닥 절단을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 말단(들)의 검출은 인 시추(in situ)에서 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 살아 있는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 고정된 것인, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 동물, 식물, 원생동물, 박테리아 세포, 바이러스, 조직 및 이들의 단편 및/또는 구성성분을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 막에 의해 둘러싸인 세포 또는 조직 또는 이들의 단편인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 하위-단계 c는 상기 단계 I에서 수행되는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계 I 하위-단계 a 전에, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 추가의 단계가 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 용액 내에 또는 다공성 표면 또는 고형 지지체 상에 존재하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 고형 지지체 또는 다공성 표면 유형은 유리, 플라스틱, 워터젤, 에어로젤, 금속 및 세라믹을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 유형 1은 할로겐화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자, 예컨대 BrdU, IdU, CldU, 또는 DNA 전구체 유사체, 예컨대 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘), F-ara-EdU, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드 분자, ADP-리보스 분자, 또는 형광 분자, 또는 화학발광 분자, 또는 방사성동위원소, 또는 효소 기질, 또는 비오틴 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 단백질 분자, 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오사이드 분자를 포함하는 군으로부터 선택되고, 분자 유형 1은 또한, DNA 또는 RNA 말단(들)에 결합하고 분자 유형 2, 또는 유형 3, 또는 효소에 대한 임의의 다른 기질에 결합하기 위한 표적으로서 역할을 할 수 있는 임의의 다른 분자, 또는 임의의 이들의 유사체, 또는 올리고머, 또는 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 유형 2 및 분자 유형 3은 독립적으로, 항체 또는 이의 단편, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 분자 또는 이의 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 및 이들의 임의의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 다른 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 2)와의 상호작용(선택된 영역의 혼성화), 이들의 결찰, 및 후속적인 RCA 반응을 가능하게 하는 서열의 핵산(올리고뉴클레오타이드 유형 1)에 공유 연결된 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 항체 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘 유사체, 비오틴 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항체 단편, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 유형 6은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 3)인, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 유형 7은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있고, 분자 서명을 운반하거나 발생시킬 수 있는 다른 분자에 대한 결합 표적으로서 역할을 할 수 있는 분자인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 III에서 하위-단계 g의 증폭은 분자 유형 6에 결합하는 분자 유형 7의 첨가에 의해 향상되는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 분자 유형 7은 형광 화학발광 분자, 방사성동위원소, 효소 기질, 비오틴, 나노입자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 촉매적 수단은 비-효소적 또는 효소적 수단을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 효소적 수단은 DNA 폴리머라제 I, TdT, Klenow 단편, Phu 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, RNA 폴리머라제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 비-효소적 수단은 촉매적 특성을 갖는 화학적 인자를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 비-촉매적 수단은 물리적 또는 생화학적 인자를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하위-단계 h의 검출은 현미경, 높은 세포 수의 자동화된 분석 방법, 형광 현미경(광역(wide field), 공초점, 다초점, 초-해상(super-resolution), 사출(catapulting)을 이용하는 현미경, 레이저 스캐닝, 고속 대량, 고함량)을 포함하는 분광광도법, 형광측정법, 흡수 검출을 위한 투과광 광학 현미경, 유세포분석법, 세포 소팅(FACS), 질량 분광광도법을 포함하는 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는, 방법.
- 제26항에 있어서, 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계는 상기 단계 III 하위-단계 g (i)에서 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 DNA 손상을 유도하지 않는, 방법.
- 제1항에 있어서, 단일 DNA 말단(들)을 검출하는 단계가 수득되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하는 단계가 획득되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함하는, 방법:
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d. 화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f. 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1의 상이한 유형의 결합 부위들에 결합하는 1차 항체인 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g. DNA 말단(들)을 하기에 의해 검출하는 단계:
i. 2차 항체인 적합한 분자 유형 4 및 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h. 분자 유형 6을 검출하는 단계. - 제1항에 있어서, 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함하는, 방법:
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d. 화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f. 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1의 상이한 유형의 결합 부위들에 결합하는 1차 항체인 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g. DNA 말단(들)을 하기 단계에 의해 검출하는 단계:
i. 2차 항체인 적합한 분자 유형 4 및 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계,
h. 분자 유형 6을 검출하는 단계. - 제1항에 있어서, 세포 또는 조직인 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출은 하기 단계를 포함하는, 방법:
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
a. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
b. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 4 및 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
c. 화학적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드인 분자 유형 1을 촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
d. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 4 및 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
e. 단계 II 유래의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자: 1차 항체인 분자 유형 2 및 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액된 스트렙타비딘인 분자 유형 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
f. DNA 말단(들)을:
i. 선택적으로 2차 항체인 적합한 분자 유형 4를 분자 유형 2와 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 2 및 3에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 올리고뉴클레오타이드 유형 1이 분자 2와 공액되지 않는다면 분자 유형 3 및 4에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계
에 의해 검출하는 단계,
h. 분자 유형 6을 검출하는 단계. - 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치를 표시하기 위한, 롤링 서클 복제의 용도.
- 적절하게 제조된 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출을 위한, 하기 단계의 용도:
- 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
- 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
- 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계. - 제35항에 있어서, 상기 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는, 용도.
- 제36항에 있어서, 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계가 수행되는, 용도.
- 제35항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 하기 단계에 의해 제조되는, 용도:
- 선택적으로, 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 단리 및/또는 부동화시키는 단계,
- DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
- 선택적으로 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계. - 생물학적 물질에서 DNA 말단(들)의 검출을 위한, 하기 단계 I 내지 III, 및 단계 I 내지 III 각각의 하위-단계 a 내지 h 중 적어도 하나를 포함하는 방법의 용도로서,
I. 물질의 제조
a. 생물학적 물질을 고정 및/또는 투과 및/또는 용해 및/또는 단리 및/또는 분획화 및/또는 부동화시키는 단계,
b. DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계,
c. 상기 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
II. DNA 말단(들)의 가공
d. 화학적 또는 물리적 가공에 의한 DNA 말단(들)의 변형, 뒤이어 분자 유형 1을 촉매적 또는 비촉매적 수단에 의해 DNA 말단(들)에 결합시키는 단계,
e. 생물학적 물질에서 분자 유형 2 내지 6에 대한 비특이적인 결합 부위(들)를 차단하는 단계,
III. 변형된 DNA 말단(들)의 인지 및 검출
f. 단계 II로부터의 생물학적 물질을, 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 유발하는 단계를 가능하게 하는 방식으로 분자 유형 1에 결합하는 적어도 2개의 분자 유형 2 및 3과 함께 인큐베이션하는 단계,
g. DNA 말단(들)을:
i. 선택적으로 적합한 분자 유형 4 및/또는 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계로서, 상기 분자 유형 4 및/또는 5는 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되는 단계,
ii. 올리고뉴클레오타이드 유형 2 및 효소 리가제를 첨가하여, 상기 첨가된 올리고뉴클레오타이드 유형 2를 분자 유형 4 및/또는 5에 이미 연결된 올리고뉴클레오타이드 유형 1에, 또는 분자 유형 2 및 3이 올리고뉴클레오타이드 유형 1에 연결된다면 상기 분자 유형 2 및 3에 혼성화시키고, 후속적으로 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 DNA 결찰을 수행하는 단계,
iii. 효소 폴리머라제 및 뉴클레오타이드 용액을 첨가하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 가능하게 함으로써 증폭을 수행하고, 분자 유형 6을 첨가하여 상기 분자 유형 6과 RCA 반응의 수득된 생성물의 후속적인 혼성화를 가능하게 하는 단계
에 의해 검출하는 단계,
g. 분자 유형 6을 검출하는 단계,
상기 단계 I의 1개 이상의 하위-단계 a 내지 c가 수행될 때, 이들 하위-단계는 임의의 순서로 발생할 수 있는, 용도. - 제39항에 있어서, 상기 DNA 말단(들)은 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 포함하는 임의의 DNA 절단(들)의 결과인, 용도.
- 제40항에 있어서, 상기 DNA 절단(들)은 단일-가닥 틈, 단일-가닥 갭, 단일 포스포디에스테르 결합의 단일-가닥 절단, 이중-가닥 평활-말단 절단, 이중-가닥 3'-돌출 절단, 이중-가닥 5'-돌출 절단, 3'-OH 또는 5'-포스페이트 DNA 말단이 존재하지 않는 것들을 포함하는 유형의 DNA 가닥 절단을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 DNA 말단(들)의 검출은 인 시추에서 수행되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 살아 있는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 고정된 것인, 용도.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 동물, 식물, 원생동물, 박테리아 세포, 바이러스, 조직 및 이들의 단편 및/또는 구성성분을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 막에 의해 둘러싸인 세포 또는 조직 또는 이들의 단편인, 용도.
- 제46항에 있어서, 상기 하위-단계 c는 상기 단계 I에서 수행되는, 용도.
- 제43항에 있어서, 상기 단계 I 하위-단계 a 전에, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 추가의 단계가 수행되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 용액 내에 또는 다공성 표면 또는 고형 지지체 상에 존재하는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 고형 지지체 또는 다공성 표면 유형은 유리, 플라스틱, 워터젤, 에어로젤, 금속 및 세라믹을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 유형 1은 할로겐화된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자, 예컨대 BrdU, IdU, CldU, 또는 DNA 전구체 유사체, 예컨대 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘), F-ara-EdU, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 또는 비오틴화된 뉴클레오타이드 분자, ADP-리보스 분자, 또는 형광 분자, 또는 화학발광 분자, 또는 방사성동위원소, 또는 효소 기질, 또는 비오틴 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 단백질 분자, 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오사이드 분자를 포함하는 군으로부터 선택되고, 분자 유형 1은 또한, DNA 또는 RNA 말단(들)에 결합하고 분자 유형 2, 또는 유형 3, 또는 효소에 대한 임의의 다른 기질에 결합하기 위한 표적으로서 역할을 할 수 있는 임의의 다른 분자, 또는 임의의 이들의 유사체, 또는 올리고머, 또는 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 유형 2 및 분자 유형 3은 독립적으로, 항체 또는 이의 단편, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 분자 또는 이의 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 및 이들의 임의의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 다른 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 2)와의 상호작용(선택된 영역의 혼성화), 이들의 결찰, 및 후속적인 RCA 반응을 가능하게 하는 서열의 핵산(올리고뉴클레오타이드 유형 1)에 공유 연결된 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항 또는 제53항에 있어서, 분자 4 및 분자 5는 독립적으로, 항체 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 스트렙타비딘 유사체, 비오틴 유사체, 리간드, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항체 단편, 항원, 반응성 분자, 예컨대 아자이드, 올리고머, 중합체, 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 유형 6은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있는 표지된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 유형 3)인, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 유형 7은 결찰된 올리고뉴클레오타이드 유형 2의 선택된 서열을 주형으로서 사용하여 형성된 RCA 반응의 생성물을 인지하고 상기 생성물에 결합할 수 있고, 분자 서명을 운반하거나 발생시킬 수 있는 다른 분자에 대한 결합 표적으로서 역할을 할 수 있는 분자인, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 단계 III에서 하위-단계 g의 증폭은 분자 유형 6에 결합하는 분자 유형 7의 첨가에 의해 향상되는, 용도.
- 제57항에 있어서, 상기 분자 유형 7은 형광 화학발광 분자, 방사성동위원소, 효소 기질, 비오틴, 나노입자를 포함하는 군으로부터 선택되는 표지로 표지되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 촉매적 수단은 비-효소적 또는 효소적 수단을 포함하는, 용도.
- 제59항에 있어서, 상기 효소적 수단은 DNA 폴리머라제 I, TdT, Klenow 단편, Phu 폴리머라제, Taq 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, RNA 폴리머라제를 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제59항에 있어서, 상기 비-효소적 수단은 촉매적 특성을 갖는 화학적 인자를 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 비-촉매적 수단은 물리적 또는 생화학적 인자를 포함하는, 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 하위-단계 h의 검출은 현미경, 높은 세포 수의 자동화된 분석 방법, 형광 현미경(광역, 공초점, 다초점, 초-해상, 사출을 이용하는 현미경, 레이저 스캐닝, 고속 대량, 고함량)을 포함하는 분광광도법, 형광측정법, 흡수 검출을 위한 투과광 광학 현미경, 유세포분석법, 세포 소팅(FACS), 질량 분광광도법을 포함하는 군으로부터 선택되는 기술에 의해 수행되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 분자 유형 2 및 3은 올리고뉴클레오타이드 유형 1과 공액되지 않는, 용도.
- 제64항에 있어서, 적합한 분자 유형 4 및 유형 5를 분자 유형 2 및 3과 접촉시키는 단계는 상기 단계 III 하위-단계 g (i)에서 수행되는, 용도.
- 제39항에 있어서, DNA 말단(들)의 접근성을 증가시키는 단계는 DNA 손상을 유도하지 않는, 용도.
- 제39항에 있어서, 단일 DNA 말단(들) 검출이 수득되는, 용도.
- 제39항에 있어서, 단일 DNA 말단(들)의 존재 및 위치 표시가 획득되는, 용도.
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