CN111201327A - 检测一个或多个dna端部的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测生物材料中的一个或多个DNA端部的方法，所述方法包括以下步骤I‑III和所述步骤I‑III中的每一者的子步骤a‑h中的至少一者：I.制备所述材料，包括a.将所述生物材料固定和/或透化和/或裂解和/或分离和/或分级和/或固定化，b.提高一个或多个DNA端部的可及性，c.封闭所述生物材料中2‑6型分子的一个或多个非特异性结合位点，II.处理一个或多个DNA端部，包括d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰，进行化学或物理处理，随后藉由催化手段或非催化手段使1型分子与所述一个或多个DNA端部结合；封闭所述生物材料中2‑6型分子的一个或多个非特异性结合位点；III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部：将来自步骤II的所述生物材料与至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与所述1型分子结合，g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：i.任选地使合适的4型和/或5型分子与所述2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，h.检测所述6型分子；其中当执行步骤I的多于一个子步骤a‑c时，它们可以以任何次序发生。本发明还涉及滚环复制用于标识单个DNA端部的存在和位置的用途，以及上述方法用于检测生物材料中的一个或多个DNA端部的用途。
Description
技术领域
本发明落入分子诊断和生物医学领域。本发明涉及检测和/或定量分析和/或定性分析DNA损伤的方法。更精确地，本发明使得能够直接、高度灵敏、特异和有效地识别和/或检测不同类型的游离DNA端部，所述不同类型的游离DNA端部是由于在细胞核或分离的生物材料中诱导单链或双链DNA断裂而形成的。
背景技术
为了让生命继续代代相传，生物体的基因组必须在没有任何重大改变的情况下传承下去。所有活的(living)生物体的主要特征是以形成脱氧核糖核酸(DNA)的核碱基的独特序列的形式储存遗传信息，以及通过多个世代传递所述遗传信息的能力。细胞是活的生物体的基本结构和功能单位。因此，必须在单个细胞的寿命期间保留碱基的序列。此外，应如实拷贝亲本细胞的DNA，并且传递给子细胞的两个拷贝应相同。然而，DNA并非绝对稳定的，并且容易受到生理条件下发生的自发化学变化的影响(Lindahl T.Instability anddecay of the primary structure of DNA.Nature.1993年4月22日；362(6422):709-15)。DNA变化(诸如DNA损伤)可由各种内源和外源因子引起。内源因子包括细胞代谢和呼吸的有害副产物(诸如活性氧物质)。外源因子包括各种有害化学物质(例如，甲基化剂、氧化剂，或交联剂)、紫外线光子和较高能的光子(X射线、γ射线)，以及重离子和粒子(例如，β粒子或α粒子)(Friedberg Errol C.、Graham C.Walker、Wolfram Siede、Richard D.Wood.DNARepair and Mutagenesis.American Society for Microbiology Press,2005)。
由于DNA本质上是在化学上不稳定的，并且会不断受到各种因素的损伤，因此保持基因组完整性需要专门的监视和修复机制。此类各种保护机制已经与作为编码地球上遗传信息的主要和独特分子的DNA一起进化。尽管事实上DNA受其复杂环境的有害影响而引起了高基因组降解率和碱基序列变化，但是在单个细胞分裂周期内积累的突变数目较少(Araten DJ、Golde DW、Zhang RH、Thaler HT、Gargiulo L、Notaro R、Luzzatto L.Aquantitative measurement of the human somatic mutation rate.Cancer Res.2005年9月15日；65(18):8111-7.勘误见：Cancer Res.2005年11月15日；65(22):10635)。突变率通过专门的损伤检测和修复机制的有效作用而保持较低。只有逃避了修复机制的正确作用的基因组降解才可能导致体细胞突变。未修复的DNA损伤的积累会损害基因组完整性，并且可导致各种细胞功能失常、致瘤性(neoplastic)转化，或死亡。基因组的非致死性变化可能会传给后代，积累，并最终导致子代的严重功能失常。致瘤性转化可最终对整个生物体的水平具有严重的影响，因为转化的细胞可能会引起此类细胞的克隆和恶性肿瘤的生长。
在一些情况下，DNA损伤所导致的少数细胞死亡可具有对整个生物体的严重后果，例如脑中不可替代的神经元的损失。DNA损伤的积累还与文献中描述的各种现象(如DNA复制压力、细胞衰老，以及细胞老化)直接相关(Técher H、Koundrioukoff S、Nicolas A、Debatisse M.The impact of replication stress on replication dynamics and DNAdamage in vertebrate cells.Nat Rev Genet.2017年7月17日，doi:10.1038/nrg.2017.46.[在印刷前电子出版]Review；White RR,Vijg J.Do DNA Double-StrandBreaks Drive Aging？Mol Cell.2016年9月1日；63(5):729-38.doi:10.1016/j.molcel.2016.08.004.Review)。众所周知，精子DNA的完整性对妊娠结局具有深远的影响(Evenson DP、Darzynkiewicz Z、Melamed MR:Relation of mamalian sperm chromatinheterogeneity to fertility.Science.1980,240:1131-1133；Evenson DP.The SpermChromatin Structure Assay
and other sperm DNA fragmentation testsfor evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility.AnimReprod Sci.2016年6月；169:56-75.doi:10.1016/j.anireprosci.2016.01.017.电子出版2016年2月17日；Rex AS、Aagaard J、Fedder J.DNA fragmentation in spermatozoa:ahistorical review.Andrology.2017年7月；5(4):622-630.doi:10.1111/andr.12381)。
许多破坏性因子直接引起DNA断裂，而其他破坏性因子则导致DNA损害(lesions)，所述DNA损害可最终导致DNA分子的不连续性，即单链和双链断裂。单链断裂或切口是由一条DNA链中两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键的破坏所引起的。双链DNA断裂是DNA的两条互补链的不连续性，并且当连接在DNA链上的相对或接近定位的位置处的核苷酸的磷酸二酯键断裂时发生。双链DNA断裂(DSB)是最危险的DNA损害，而单链DNA断裂(SSB)带来较小的有害效应，然而，单链DNA断裂的数目要比双链损害的数目高得多。正常细胞中的双链断裂通常是由两条互补链中彼此靠近的多于一个单链断裂引起的。当双链断裂被诱发时，DNA端部可能会变得在物理上分开。
已知有几种类型的DNA断裂(Clark Robert S.B.、Minzhi Chen、PatrickM.Kochanek、Simon C.Watkins、Kun Lin Jin、Romesh Draviam、Paula D.Nathaniel、Rodnina Pinto、Donald W.Marion和Steven H.Graham.Journal of Neurotrauma.2004年7月，18(7)：675-689)：
·单链切口(其中存在3'-OH DNA链端部)
·单链空位(其中存在3'-OH DNA链端部)
·单个磷酸二酯键的单链断裂(其中存在3'-OH DNA链端部)
·双链平端断裂(其中存在3'-OH DNA链端部)
·双链3'突出断裂(其中存在悬突(overhanging)3'-OH DNA链端部)
·双链5'突出断裂(其中存在3'-OH DNA链端部)
·具有DNA链的“受损”端部的DNA断裂(其中不存在3'-OH DNA链端部)
DNA链断裂在许多正常的内源细胞过程(诸如DNA复制、转录、超螺旋松弛、基因重排、DNA损伤修复等)中发生。此类链断裂通常立即通过专门的酶被连接。
未修复的DSB的发生产生了无保护的反应性DNA端部，所述无保护的反应性DNA端部可引发或/和参与与位于基因组中其他地方的部分同源的DNA区域的重组。这可能会在基因组中产生各种重排，诸如缺失、易位、染色体融合和断裂、染色体环化、微型染色体的出现等。
DNA链断裂可能与各种类型的病症有关，或者可能是可由于分子修复机制的突变和功能失常而导致的现有潜在病症的表现。DNA链断裂的积累可能与多种疾病的发展有关，所述多种疾病包括癌症，诸如结肠癌、乳腺癌、皮肤癌或前列腺癌；神经退行性病症，包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森氏病；以及诸如脆性X染色体综合征、弗里德利希共济失调(Friedrich's ataxia)、脊髓小脑共济失调、2型糖尿病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)和肌强直性营养不良等疾病；以及许多其他病症。
需要有关细胞核中单链和双链DNA断裂的存在、数目和定位的知识，以及区分特定类型损害的能力，以便评定生物体的细胞和组织的DNA的质量，并研究和理解DNA损伤诱导及其修复的机制。为了评定各种内源性和外源性因子的潜在遗传毒性，需要对DNA断裂的亚核定位进行数目测量和确定。此外，对DNA片段化程度所反映的生物材料质量的分析可以作为分析生物体生存的环境条件的标识。DNA断裂的确定可以用作参数来评定人类和其他生物的生殖细胞的质量。
可以通过本领域已知的一些现有方法来检测细胞DNA中的DNA断裂，所述本领域已知的一些现有方法为诸如：
-直接检测和原位鉴定当断裂被诱导时暴露的DNA端部(例如，聚合酶I介导的切口翻译测定、对克列诺片段(Klenow fragment)进行聚合酶I介导的切口端部标记测定，或末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP切口端部标记测定(称为TUNEL测定))
-检测募集至DNA损害的修复因子(例如，对于DSB为53BP1或对于SSB为XRCC1)
-检测特异于DNA断裂的表观遗传染色质修饰(目前仅有对丝氨酸139上的组蛋白H2A.X的γH2A.X磷酸化)
-通过生化方法(例如，彗星测定(Comet assay)、或碱性洗脱测定、或滤器洗脱测定)检测提取材料中的DNA端部(Kohn Kurt W.、Leonard C.Erickson、Regina A.G.Ewig和Charles A.Friedman.Fractionation of DNA from mammalian cells by alkalineelution.Biochemistry,1976,15(21)，第4629-4637页；DNA Damage Detection In Situ,Ex Vivo,and In Vivo(2011).Methods and Protocols.Springer.编著者：Vladimir VDidenko)
-检测通过DNA对酸诱导的DNA原位变性的易感程度测量的总体DNA片段化程度(例如SCSA测试)。
尽管间接方法(γH2A.X、XRCC1、53BP1)允许检测少量DNA断裂，但目前尚没有直接检测活细胞或固定细胞中的单独DNA断裂的方法。
基于直接标记和检测DNA端部的方法均表征为低灵敏度，即它们无法检测完整细胞或经处理的生物材料中的单独DNA断裂。本领域技术人员众所周知的TUNEL测定能够在细胞凋亡期间容易地检测大量(可能数百个和更多)DNA断裂，然而，它不能检测单独的DNA双链断裂，或甚至由少量(约10个)这些断裂组成的组。
人体中暴露于诱导链断裂的典型每日内源和外源因子的大多数细胞表现出低数目的双链断裂(在任何给定时间约0-10个，如通过γH2A.X的免疫标记检测到的(Rybak P、Hoang A、Bujnowicz L等人，Low level phosphorylation of histone H2AX on serine139(γH2AX)is not associated with DNA double-strand breaks.Oncotarget.2016；7(31):49574-49587))，以及稍微略多数目的单链断裂。仅在产生抗体的细胞中，DNA断裂不构成损伤，而是自然的基因重排过程的组成部分。在经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)过程的细胞中，DNA断裂的数目非常多。双链断裂在通常持续数小时的过程中被修复，而单链断裂被快速地，通常在数分钟之内修复。因此，人类体细胞中在任何给定时间存在的两种类型的DNA断裂的数目通常不超过30(通过γH2A.X和XRCC1修复因子的积累的免疫标记检测到的)(Bemiak K.、Rybak P.、Bemas T.、
M.、Biela E.、Zhao H.、DarzynkiewiczZ.、Dobrucki J.W.:Relationship between DNA damage response,initiated bycamptothecin or oxidative stress,and DNA replication,analyzed by quantitative3D image analysis.Cytometry.A,2013；83:913-24；Rybak P、Hoang A、Bujnowicz L等人，Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139(γH2AX)is notassociated with DNA double-strand breaks.Oncolargel.2016；7(31):49574-49587；Solarczyk K.J.、Kordon M.、Berniak K.、Dobrucki J.W.:Two stages of XRCC1recruitment and two classes of XRCC1 foci formed in response to low level DNAdamage induced by visible light,or stress triggered by heat shock.DNA Repair(Amst).,2016；37:12-21)。在生理条件下在体细胞中遇到的典型较低数目的DNA断裂无法通过TUNEL或任何其他已建立的直接检测方法进行检测和量化。现有方法均基于传统的免疫荧光标记(包括TUNEL)，因此它们的特异性是有限的，并且严重依赖于一抗和二抗的特异性，同时这些方法的灵敏性受到相当多的非特异性背景信号的存在的限制(特异性信号的强度不足以超过非特异性信号的强度)。
通过检测募集的细胞DNA损伤响应因子(如53BP1或XRCC1)来间接检测DNA断裂具有以下限制：(i)募集的蛋白质分子的数目可能太少而无法通过常用方法(如免疫荧光)检测；(ii)免疫荧光通常由于抗体的特异性有限而不是完全特异的；(iii)检测灵敏度受到信号背景存在的限制，所述信号背景是由于二抗与各种细胞组分的非特异性结合而引起的；(iv)修复因子的募集可在没有DNA断裂的情况下被激活，或者可在修复能力饱和的条件下或者当修复系统本身受到损伤或损害时被抑制或不存在，因此可能会出现假阳性或假阴性结果。可以在活细胞中执行对标识DNA断裂的荧光标记修复蛋白(例如EGFP-53BP1)的检测，然而，这通常在融合蛋白在体外培养物中过表达的条件下在经严格操纵的转染细胞中进行。不可能通过检测从患者身体新近得到的细胞中的损伤部位处的荧光标记蛋白的积累来测量DNA断裂的数目。
基于组蛋白H2A.X(γH2A.X)磷酸化免疫检测的双链断裂检测是其他方法中的一个例外，因为其由于自然的生物信号放大而高度灵敏。即，一个DSB诱导断裂附近的多达一百万个组蛋白残基的磷酸化。迄今为止，由于免疫荧光方法的上述缺点，包括一抗和二抗与各种细胞靶标的非特异性结合，以及所得的非特异性信号，利用所述放大的能力受损。尽管丝氨酸139上组蛋白H2A.X的磷酸化已被普遍用作检测DSB的金标准，但是最近已知该方法对DNA中DSB的特异性有限。几个研究组已证明，不同于双链断裂的损害也可诱导组蛋白H2A.X的组蛋白磷酸化(Cleaver JE1.γH2Ax:biomarker of damage or functionalparticipant in DNA repair"all that glitters is not gold！".PhotochemPhotobiol.2011年11月至12月；87(6):1230-9；Rybak P,Hoang A,Bujnowicz L等人，Lowlevel phosphorylation of histone H2AX on serine 139(γH2AX)is not associatedwith DNA double-strand breaks.Oncotarget.2016；7(31):49574-49587)。这些和其他公开的数据证明了该方法仅表现出对DSB的有限特异性。最后，当断裂紧邻定位时，它们不能作为单独实体被检测到，因为代表大量磷酸化的H2A.X分子的免疫荧光信号在显微镜图像中显示为大斑点(直径为几百纳米至一微米)。
已知现有技术中还存在几种用于分析DNA损伤的生化方法。然而，这些已知技术具有一些限制。例如，彗星试验用于检测单独细胞中的大量DNA断裂。它可用于估计DNA损伤的一般水平以及细胞群中的损伤分布，然而，它对检测单独的DNA断裂没有足够的灵敏性。它不提供任何有关DNA损伤类型以及DNA断裂相对于核结构的定位的信息，因为它需要细胞裂解。
有多种版本的广泛使用的评定DNA损伤的碱洗脱测定，然而，已知该方法可在过程中引入DNA断裂(Tice RR、Agurell E、Anderson D、Burlinson B、Hartmann A、KobayashiH、Miyamae Y、Rojas E、Ryu JC、Sasaki YF.Single cell gel/comet assay:guidelinesfor in vitro and in vivo genetic toxicology testing.Environ Mol Mutagen.2000；35(3):206-21)。
基于目前的现有技术知识，合理地预期单独DNA断裂的灵敏和特异性检测将采用对特异性附着至DNA端部的分子的检测，如在TUNEL测定中所进行的。由于此类附着分子的数目可能较少(仅一个或几个)，因此合乎逻辑地预期必须采用非常灵敏的检测此类分子的方法。能够特异性检测各种分子或分子复合物或其相互作用的许多非常灵敏的技术是本领域已知的，包括各种类型的质谱，大量细胞计数法(质谱与流式细胞术的组合)，能量色散X射线微分析(EDXMA、EDXA)，或基于荧光的方法(包括免疫荧光)，福斯特共振能量转移(
Resonance Energy Transfer,FRET)，双分子荧光互补测定(BimolecularFluorescence Complementation Assay,BiFc)，邻位连接测定(proximity ligationassay,PLA)，单分子荧光检测，光谱学和成像。这些方法(包括如上所述的免疫荧光)都不能直接用于检测单独分子，包括附着至细胞或分离的染色质中的DNA端部的蛋白质或核苷酸类似物。
在专利和非专利文献中也广泛地描述了上述检测DNA断裂的方法以及可能适用于检测DSB或SSB的方法。
例如，WO9708345公开中描述的发明属于用于基础研究、医学诊断测试和法医测试的DNA检测的领域。该引用公开中描述的方法构成了先前段落中已提到的TUNEL测定的基础。根据本发明，首先将DNA链与卤化的脱氧核苷酸三磷酸(诸如溴化的脱氧尿苷三磷酸(BrdUTP))和能够催化卤化的脱氧核苷酸至DNA链的3'-OH端部的加成的酶(诸如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))一起孵育。然后将所得的经修饰的DNA链与标记的抗体(诸如荧光素化的单克隆抗体)一起孵育，该标记的抗体与卤化的脱氧核苷酸特异性结合。然后通过流式细胞术、显微术或多参数激光扫描显微术来检测标记。该方法可用于检测细胞凋亡、DNA合成和/或修复，并且作为DNA端部标记的通用方法，然而不能检测单独或少量的DNA端部。根据前几段中所述的内容，本发明当用于检测细胞中的DNA断裂时，专用于检测在细胞凋亡期间发生的数百个双链断裂。如科学文献中所证明的，其灵敏度太低而无法检测单独DNA损害。该低灵敏度的主要原因是事实上该测定基于免疫荧光染色的标准方法，从而导致高水平的非特异性信号，如本文先前所解释的。
在专利和专利申请中有一些关于改良的邻位连接测定(PLA)用于DNA损伤检测的用途的公开内容。简而言之，PLA技术利用一对寡核苷酸标记的抗体，或与形成复合物的两种分析物的不同表位或同一分析物紧邻(隔开10-40nm)结合的其他分子。一般来讲，主要建议将该测定用于蛋白质-蛋白质复合物的局部检测、可视化和量化，或灵敏的蛋白质检测。结合了两种众所周知的方法的该技术依赖于所谓的“邻近探测”原理，其中通过两个探针的结合来检测分析物，所述两个探针当通过与分析物结合而变得邻近(因此是“邻近”探针)时，允许产生信号(参见例如美国专利公开No.US8013134B2、US7306904B2，美国专利申请公开No US2008/0293051，或WO16106298A1)。该方法采用滚环扩增(RCA)反应(参见例如，欧洲专利公开No.EP1997909、美国专利公开No.US7,88,849或US7,790,338)，该RCA使源自两个探针的信号增强。邻近探测和RCA的所述组合在本领域中也是已知的。例如，国际申请WO2012/160083A1公开了一种通过多重邻位连接测定来检测以下物质之间或与以下物质的相互作用：至少三种靶底物中的任何两种，或靶底物的至少三种特征中的任何两种，或靶底物的相互作用和特征的组合的方法，所述方法包括：a)对于至少三种靶底物或特征中的每一种，提供包含对所述底物上的特征或结合位点具有亲和力的结合部分的邻近探针，以及与所述结合部分偶联的邻近探针寡核苷酸；其中所述邻近探针寡核苷酸中的每一个带有独特的标签序列；b)在允许每个邻近探针与所述底物中的每一种上的其相应结合位点或特征通过结合部分结合的条件下，将邻近探针与样品混合，c)与步骤b)同时或在步骤b)之后，形成环化的DNA分子，在所述环化的DNA分子中任意两个邻近探针在底物上彼此足够接近地结合，其中所述环化DNA分子中的每一个包含与来自所述两个邻近探针寡核苷酸的独特标签序列互补的序列；d)扩增所述环化的DNA；以及e)表征经扩增的DNA。对于与PLA技术有关的更多变体解决方案，还参见专利申请No.US2011223585A、US2014194311A、US2004248103A，或US2003008313A。
然而，没有使用所述解决方案(即PLA技术)来直接检测由于任何类型的DNA断裂而存在的DNA端部的实施方式。此外，将PLA技术简单地应用于DNA损伤检测将需要靶向在仅一种类型的DNA断裂的位点处唯一存在的特定蛋白质的探针，并且如上所述，由于同一蛋白质可具有多种功能，因此可能在不同于DNA断裂的位点处存在蛋白质是极有可能的。
出版物“A novel single-cell method provides direct evidence ofpersistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues”,AgingCell(2017)16，第422-427页和Alessandro Galbiati、Christian Beauséjour和Fabriziod’Adda di Fagagna公开了一种名为“DNA损伤原位连接，之后进行邻位连接测定(DNAdamage in situ ligation followed by proximity ligation assay)”(DI-PLA)的方法，所述方法涉及细胞中DSB的检测和成像。DI-PLA基于通过与生物素化的双链DNA寡核苷酸连接来原位捕获固定细胞中的游离DNA端部，然后通过抗生物素抗体识别所述生物素化的双链DNA寡核苷酸。检测通过以下方式而得到了增强：使用PLA技术将上述抗体与识别DSB位点处的DNA损伤响应过程中所涉及的伴侣蛋白(γH2AX或53BP1)的抗体进行组合。所述DI-PLA方法的验证是通过以下方式执行的：证明所述DI-PLA方法检测由培养的细胞和组织中的各种遗传毒性损伤诱导的DSB的能力。然而，该方法仅可用于以组蛋白H2AX磷酸化为标识的双链DNA断裂，或募集了修复因子53BP1的双链DNA断裂，因此该方法的用途受到限制。首先，这不是提供直接检测DNA断裂的机会的技术，因为它需要同时检测DNA损伤修复中所涉及的组蛋白修饰或蛋白质。其次，它不能用于检测未被细胞蛋白质修复机制识别出或经受了功能失常修复机制的DNA断裂。
在Hanif Rassoolzadeh、Christos Coucoravas和Marianne Farnebo的出版物“The proximity ligation assay reveals that at DNA double-strand breaks WRAP53βassociates withγH2AX and controls interactions between RNF8 and MDC1”Nucleus,6:5,417-424,2015中，PLA测定被用于显示在DNA双链断裂处WRAP53b紧邻γH2A.X积累。更重要的是，该文件强调PLA是一种分析难以使用常规免疫荧光法检测的DNA断裂处的修复因子募集和复合物形成的更灵敏方法。但是，通过该改进的PLA方法只能检测到双链断裂。此外，只有在DNA损伤位点处存在两个特定的修复因子(RNF8和MRC1)时，才能检测到它们。此外，该修饰基于细胞中天然存在的蛋白质之间的相互作用，所述相互作用由于这些蛋白质及其复合物存在于不同于DNA损伤位点的不同位点处的可能性而可能导致假阳性结果。因此，该出版物中提出的方法不够特异，并且其应用限于仅一种特定类型的DNA双链断裂，前提条件是所述特定类型的DNA双链断裂被修复机制所识别。
WO12080515A1中描述的发明提供了一种确定暴露于电离辐射的受试者的细胞中的DNA损伤水平的方法，所述方法包括(a)使包含从所述受试者获得的细胞的样品与至少两种抗体、适体(aptamer)或抗运载蛋白(anticalin)接触，所述抗体、适体或抗运载蛋白与存在于DNA修复焦点(foci)中的相同或不同蛋白质上的表位结合；(b)使所述样品与至少第一和第二邻近探针接触，所述第一和第二邻近探针均包含对所述抗体、适体或抗运载蛋白具有亲和力的结合部分，以及与所述结合部分偶联的充当反应功能性的核酸；(c)允许所述邻近探针的结合部分与所述抗体、适体或抗运载蛋白结合，以及如果所述邻近探针彼此紧邻，则允许所述邻近探针的核酸彼此相互作用；以及(d)检测所述核酸之间的相互作用程度，从而确定DNA损伤水平。尽管如此，该方法被设计为通过检测辐射诱导的DNA双链断裂来监测辐射暴露。无法检测到其他类型的断裂。然而，最重要的是，这是检测DNA断裂的间接方法的另一示例。与上述内容类似，其基于对DNA损伤修复过程中所涉及的一种或多种蛋白质的检测，而不是直接检测由DNA断裂产生的DNA端部。
对现有方法的研究表明，需要高度灵敏、特异且直接的方法来鉴定和检测固定的或活的细胞或组织中，以及提取的DNA、或分离的染色质、或任何类型的生物材料中的任何类型的双链或单链DNA断裂。
根据可用的方法，需要适用于应同时方便和简单的DNA损伤原位或体外分析的更灵敏、特异、选择性和通用的方法。灵敏和选择性的DNA损伤检测在药物设计中、在诊断和/或监测患者状态以及疾病进展中非常重要。此外，它还可以提供对有关致癌作用、退行性和自体免疫性疾病、或老化(当代主要健康问题)的过程的更好洞察。
本发明克服了本领域已知方法的缺点，并且构成了用于DNA断裂研究并因此用于与DNA损伤检测有关的诊断的方法的领域中的重大进步。
发明内容
本发明涉及一种检测生物材料中的一个或多个DNA端部的方法，所述方法包括以下步骤I-III和所述步骤I-III中的每一者的子步骤a-h中的至少一者：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定(fixation)和/或透化(permeabilization)和/或裂解和/或分离和/或分级(fractionation)和/或固定化(immobilization)，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性(accessibility)，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰，进行化学或物理处理，随后藉由催化手段或非催化手段使1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的所述生物材料与至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与所述1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使合适的4型和/或5型分子与所述2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子，
其中当执行步骤I的多于一个子步骤a-c时，它们可以以任何次序发生。
根据本发明，一个或多个DNA端部是一个或多个结果，优选任何一个或多个DNA断裂(包括单链断裂或双链断裂)的结果。优选地，DNA断裂选自包括以下的组：单链切口、单链空位、单个磷酸二酯键的单链断裂、双链平端断裂、双链3'-突出断裂、双链5'-突出断裂，包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA链断裂在内的DNA链断裂类型。
优选地，一个或多个DNA端部的检测是原位执行的。
优选地，生物材料是活的。
优选地，生物材料是固定的。
更优选地，生物材料选自包括以下的组：动物、植物、原生动物、细菌细胞、病毒、组织，以及它们的片段和/或组分。更优选地，动物是人类。
优选地，生物材料是由膜包围的细胞或组织或它们的片段。在该实施方式中，优选地，子步骤c在步骤I中执行。
优选地，在步骤I的子步骤a)之前，执行提高一个或多个DNA端部的可及性的附加步骤。
优选地，生物材料存在于溶液中或存在于多孔表面或固体支持物上。更优选地，固体支持物或多孔表面的类型选自包括以下的组：玻璃、塑料、水凝胶、气凝胶金属和陶瓷。
优选地，1型分子选自包括以下的组：卤代核苷酸或核苷分子，诸如BrdU，IdU，CldU，或DNA前体类似物，诸如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，F-ara-EdU，5-乙炔基-2'-脱氧胞苷，或生物素化的核苷酸分子，ADP-核糖分子，或用标记物标记的蛋白质分子、核苷酸或核苷分子，所述标记物选自包括以下的组：荧光分子，或化学发光分子，或放射性同位素，或酶底物，或生物素分子，1型分子还选自包括以下的组：能够与一个或多个DNA或RNA端部结合并用作结合2型或3型分子的靶标的任何其他分子，或任何其他酶底物，或它们的类似物，或寡聚物，或聚合物中的任何，或其组合。
优选地，2型分子和3型分子独立地选自包括以下的组：抗体或其片段、链霉亲和素、亲和素、生物素分子或其类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗原、反应性分子(如叠氮化物)、寡聚物、聚合物，以及上述物质的任何类似物，或它们的组合。
优选地，4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：与具有这样的序列的核酸(1型寡核苷酸)共价连接的抗体，所述序列允许与其他寡核苷酸(2型寡核苷酸)相互作用(所选区域的杂交)，它们的连接，以及随后的RCA反应。
优选地，4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：抗体链霉亲和素、亲和素、生物素、链霉亲和素类似物、生物素类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗体片段、抗原、反应性分子(如叠氮化物)、寡聚物、聚合物，上述物质的类似物，或它们的组合。
优选地，6型分子是标记的寡核苷酸(3型寡核苷酸)，所述标记的寡核苷酸能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物。
优选地，7型分子是这样的分子，所述分子能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物，并且能够用作携带分子特征码(signature)或能够生成分子特征码的其他分子的结合靶标。
优选地，通过加入与6型分子结合的7型分子来改善步骤III中子步骤g)的扩增。
优选地，将7型分子用选自包括以下的组的标记物标记：荧光化学发光分子、放射性同位素、酶底物、生物素、纳米粒子。
优选地，催化手段包括非酶促手段或酶促手段。更优选地，酶促手段选自包括以下的组：DNA聚合酶I、TdT、克列诺片段、Phu聚合酶、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、RNA聚合酶。更优选地，非酶促手段选自包括以下的组：具有催化特性的化学因子。更优选地，非酶促手段包括物理因子或生化因子。
优选地，子步骤h)的检测通过选自包括以下的组的技术执行：显微术、自动分析高细胞数目的方法、光谱学(包括荧光显微镜法(宽视野、共焦、多焦点、超分辨率、带弹射的显微镜法、激光扫描、高通量、高含量))、荧光测定法、用于吸收检测的透射光光学显微术、流式细胞术、细胞分选(FACS)、质谱法。
优选地，2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。根据该实施方式，优选地，在步骤III的子步骤g(i)中执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
优选地，提高一个或多个DNA端部的可及性不引起DNA损伤。
优选地，获得对单个DNA端部的检测。
优选地，获取对单个DNA端部的存在和位置的标识。
优选地，对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为核苷酸或其类似物的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与为一抗的至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子的不同类型的结合位点结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
ii.使为二抗的合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和5型分子与1型寡核苷酸缀合，
iii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与4型和5型分子连接的1型寡核苷酸杂交，随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iv.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
优选地，对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为未修饰的核苷酸或生物素化的核苷酸的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与为一抗的至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子的不同类型的结合位点结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.使为二抗的合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和5型分子与1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与4型和5型分子连接的1型寡核苷酸杂交，随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
优选地，对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2型至4型和6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为未修饰的核苷酸或生物素化的核苷酸的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2型至4型和6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与以下与1型寡核苷酸缀合的至少两种分子一起孵育：为一抗的2型分子和为链霉亲和素的3型分子，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使为二抗的合适4型分子与2型分子接触，其中所述4型分子与1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与2型和3型分子连接的1型寡核苷酸杂交，或如果1型寡核苷酸未与2型分子缀合的话则与3型和4型分子杂交，并随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
本发明还涉及滚环复制用于标识单个DNA端部的存在和位置的用途。
本发明还涉及以下步骤用于检测适当制备的生物材料中的一个或多个DNA端部的用途：
-使合适的4型和/或5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与1型寡核苷酸缀合，
-加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
-通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交。
优选地，2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。在该实施方式中，优选地执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
优选地，通过以下步骤制备生物材料：
-任选地，将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
-提高一个或多个DNA端部的可及性，
-任选地，封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点。
本发明还涉及一种方法用于检测生物材料中的一个或多个DNA端部的用途，所述方法包括以下步骤I-III和所述步骤I-III的每一者的子步骤a-h中的至少一者：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或裂解和/或分离和/或分级和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰，进行化学或物理处理，随后藉由催化手段或非催化手段使1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的所述生物材料与至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与所述1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使合适的4型和/或5型分子与所述2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子，
其中当执行来自步骤I的多于一个子步骤a-c时，它们可以以任何次序发生。
优选地，一个或多个DNA端部是任何一个或多个DNA断裂(包括单链断裂或双链断裂)的结果。更优选地，DNA断裂选自包括以下的组：单链切口、单链空位、单个磷酸二酯键的单链断裂、双链平端断裂、双链3'-突出断裂、双链5'-突出断裂，包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA链断裂在内的DNA链断裂类型。
优选地，一个或多个DNA端部的检测是原位执行的。
优选地，生物材料是活的。
优选地，生物材料是固定的。
优选地，生物材料选自包括以下的组：动物、植物、原生动物、细菌细胞、病毒、组织，以及它们的片段和/或组分。更优选地，动物是人类。
优选地，生物材料是由膜包围的细胞或组织或它们的片段。在该实施方式中，优选地，子步骤c在步骤I中执行。
优选地，在步骤I的子步骤a)之前，执行提高一个或多个DNA端部的可及性的附加步骤。
优选地，生物材料存在于溶液中或存在于多孔表面或固体支持物上。更优选地，固体支持物或多孔表面的类型选自包括以下的组：玻璃、塑料、水凝胶、气凝胶金属和陶瓷。
优选地，1型分子选自包括以下的组：卤代核苷酸或核苷分子，诸如BrdU，IdU，CldU，或DNA前体类似物，诸如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，F-ara-EdU，5-乙炔基-2'-脱氧胞苷，或生物素化的核苷酸分子，ADP-核糖分子，或用标记物标记的蛋白质分子、核苷酸或核苷分子，所述标记物选自包括以下的组：荧光分子，或化学发光分子，或放射性同位素，或酶底物，或生物素分子，1型分子还选自包括以下的组：能够与一个或多个DNA或RNA端部结合并用作结合2型或3型分子的靶标的任何其他分子，或任何其他酶底物，或它们的类似物，或寡聚物，或聚合物中的任何，或其组合。
优选地，2型分子和3型分子独立地选自包括以下的组：抗体或其片段、链霉亲和素、亲和素、生物素分子或其类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗原、反应性分子(如叠氮化物)、寡聚物、聚合物，以及上述物质的任何类似物，或它们的组合。
优选地，4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：与具有这样的序列的核酸(1型寡核苷酸)共价连接的抗体，所述序列允许与其他寡核苷酸(2型寡核苷酸)相互作用(所选区域的杂交)，它们的连接，以及随后的RCA反应。
优选地，4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：抗体链霉亲和素、亲和素、生物素、链霉亲和素类似物、生物素类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗体片段、抗原、反应性分子(如叠氮化物)、寡聚物、聚合物，上述物质的类似物，或它们的组合。
优选地，6型分子是标记的寡核苷酸(3型寡核苷酸)，所述标记的寡核苷酸能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物。
优选地，7型分子是这样的分子，所述分子能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物，并且能够用作携带分子特征码或能够生成分子特征码的其他分子的结合靶标。
优选地，通过加入与6型分子结合的7型分子来改善步骤III中子步骤g)的扩增。
优选地，将7型分子用选自包括以下的组的标记物标记：荧光化学发光分子、放射性同位素、酶底物、生物素、纳米粒子。
优选地，催化手段包括非酶促手段或酶促手段。更优选地，酶促手段选自包括以下的组：DNA聚合酶I、TdT、克列诺片段、Phu聚合酶、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、RNA聚合酶。
更优选地，非酶促手段选自包括以下的组：具有催化特性的化学因子。更优选地，非酶促手段包括物理因子或生化因子。
优选地，子步骤h)的检测通过选自包括以下的组的技术执行：显微术、自动分析高细胞数目的方法、光谱学(包括荧光显微镜法(宽视野、共焦、多焦点、超分辨率、带弹射的显微镜法、激光扫描、高通量、高含量))、荧光测定法、用于吸收检测的透射光光学显微术、流式细胞术、细胞分选(FACS)、质谱法。
优选地，2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。在该实施方式中，优选地，在步骤III的子步骤g(i)中执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
优选地，提高一个或多个DNA端部的可及性不引起DNA损伤。
优选地，获得对单个DNA端部的检测。
优选地，获取对单个DNA端部的存在和位置的标识。
代表性实施方式
由于根据本发明的方法通过得到本说明书支持的权利要求书描述，因此可以强调基于权利要求书的各种实施方式。
在本发明的一个实施方式中，所述方法的所有子步骤以从a至h的次序使用，一个步骤之后是另一步骤(a之后是b，b之后是c，依此类推)。
在其他实施方式中，使用来自子步骤a-c中的仅一个，之后是以公开的次序的子步骤d、e、f、g和h。然而，在另一个优选实施方式中，在该方法中使用了来自子步骤a-c中的至少两个。
根据本发明，该方法的某些实施方式包括子步骤d或d和e，并考虑了与前述子步骤a-c有关的变化。
以相同的方式，可以关于子步骤f-h来指定各种实施方式。
在优选实施方式中，在该方法中使用所有子步骤f、g和h。在某些实施方式中，所有二级子步骤i-iii都可以用于子步骤g；然而，在其他实施方式中，可以省略二级子步骤i。
例如，可以在提高一个或多个DNA端部的可及性和/或封闭2型至6型分子的一个或多个非特异性结合位点之前，根据选自固定、透化、裂解、分离、分级、固定化的一种或多种方法执行在步骤I中制备材料以用于在进一步子步骤中处理所述生物材料。
在不同的实施方式中，本领域技术人员将例如基于所使用的生物材料的类型来预测和采用来自上述的合适方法。
例如，在一个实施方式中，如果生物材料是细胞或组织，则执行生物材料的固定和/或透化和/或分离和/或固定化。
通过将所述生物材料与Tris或引起低渗应激的任何其他试剂一起孵育，可以在活细胞或组织中进行步骤I的子步骤b中提高一个或多个DNA端部的可及性。
可以通过将生物材料与EDTA或引起染色质松弛和/或细胞核扩展的任何其他试剂一起孵育，来进行步骤I的子步骤b中提高一个或多个DNA端部的可及性。
1型至7型分子和1型至3型核苷酸的变体可用于根据本发明的检测一个或多个DNA端部的方法中。本领域技术人员将知道子步骤a-h和二级子步骤i-iii的哪种组合和次序应该用于哪种应用。
出于本发明的目的，2型和3型分子始终是两种不同类型的分子，它们在亲和力方面不同且/或识别并结合于1型分子中的不同结合位点。
在一个特定实施方式中，省略了步骤I中的子步骤c，并且使用BrdU作为1型分子执行一个或多个DNA端部的处理，并且催化手段是酶TdT。在该情况下，2型和3型分子是抗体，特别地分别是小鼠单克隆抗BrdU抗体和兔多克隆抗BrdU抗体。
在另一个特定实施方式中，使用一个或多个生物素缀合的核苷酸作为一个或多个1型分子来执行一个或多个DNA端部的处理，并且催化手段是DNA聚合酶I。在该情况下，2型和3型分子是抗体，特别地分别是小鼠单克隆抗生物素抗体和兔多克隆抗生物素抗体。
在另一个特定实施方式中，使用一个或多个生物素缀合的核苷酸作为一个或多个1型分子来执行一个或多个DNA端部的处理，并且催化手段是DNA聚合酶I，但是在该情况下2型分子是抗体，例如小鼠单克隆抗生物素抗体，并且3型分子是链霉亲和素分子，2型分子和3型分子两者均与1型寡核苷酸缀合。二级子步骤i应该被省略。
在又一个实施方式中，还使用生物素缀合的核苷酸作为1型分子来执行一个或多个DNA端部的处理，但是催化手段是酶克列诺片段。
在又一个实施方式中，通过以下方式来执行一个或多个DNA端部的处理：首先使用DNA聚合酶I的核酸外切酶活性(在不存在核苷酸的情况下)修剪(trim)和修饰样品中的各种类型的DNA端部，其次使用生物素缀合的核苷酸与未修饰的核苷酸的组合作为一个或多个1型分子并使用酶克列诺片段作为催化手段。
在又一个实施方式中，使用ADP-核糖单体作为1型分子来执行一个或多个DNA端部的处理，并且催化手段是聚(ADP-核糖)聚合酶，并且在步骤II中，一个或多个DNA端部的处理预期为使用聚(ADP-核糖)糖水解酶降解内源性聚(ADP)-核糖聚合物并使用例如蛋白酶K消化蛋白质。
在又一个实施方式中，在子步骤a-d之后，执行生物材料的分离。在另一个实施方式中，2型和3型分子是来自不同宿主的一抗，它们表征为具有不同水平的亲和力并结合1型分子中存在的不同抗原。在该实施方式中，合适的4型和5型分子是特异性靶向一抗的二抗，所述一抗是2型和3型分子，所述2型和3型分子与存在于1型分子中的抗原结合。更具体地说，对于该实施方式，2型和3型分子是小鼠一抗和兔一抗，并且4型和5型分子分别是抗小鼠二抗和抗兔二抗。
在又一个实施方式中，2型分子是与存在于1型分子中的一种或多种抗原结合的一抗，其中1型分子包括生物素化的核苷酸，并且3型分子是与1型寡核苷酸缀合的链霉亲和素分子。然后在步骤III子步骤g中，二级子步骤i包括使2型分子与靶向来自特定宿主的一抗的合适二抗接触，这意味着4型分子与1型寡核苷酸缀合。
在另一个实施方式中，2型分子是与存在于1型分子中的一种或多种抗原结合的一抗，其中1型分子包括生物素化的核苷酸，并且与1型寡核苷酸缀合，并且3型分子是与1型寡核苷酸缀合的链霉亲和素分子。在该实施方式中，省略了步骤g中的二级子步骤i。
在另一个实施方式中，2型和3型分子是来自不同宿主的一抗，它们表征为具有不同的亲和力水平并且与存在于1型分子中的不同表位结合，并且与1型寡核苷酸缀合。在该实施方式中，省略了子步骤g中的二级子步骤i。
在另一个实施方式中，2型分子是与存在于1型分子中的一种或多种抗原结合的一抗，其中1型分子包括生物素化的核苷酸，并且3型分子是链霉亲和素分子。在该实施方式中，在子步骤g中的二级子步骤i中，使2型分子与靶向来自特定宿主的一抗的合适的二抗接触，这意味着4型分子与1型寡核苷酸缀合，而使3型分子与合适的一抗接触，所述合适的一抗识别并结合链霉亲和素特有的抗原并构成与1型寡核苷酸缀合的5型分子。
在其他实施方式中，如果1型分子包括任何生物素化的分子，则步骤c不能被省略。
在另一个特定实施方式中，1型分子是作为参与一个或多个DNA端部处理的酶促手段的蛋白质(例如DNA聚合酶I、克列诺片段、TdT或PARP1)，所述蛋白质在一个或多个游离DNA端部的位点处结合并交联。2型和3型分子是来自不同宿主的一抗，它们表征为具有不同的亲和力水平，并且识别并结合存在于1型分子中的不同抗原，换句话说，靶向于相同酶分子上的不同表位。在该特定实施方式中，对一个或多个DNA端部的处理之后是交联反应，之后是透化反应。
在另一个实施方式中，该方法可以应用于从组织或培养物中的细胞分离的细胞核，其中可以使用市售试剂盒中的一种或任何其他分离方法(诸如蔗糖法)来提取细胞核。分离后，必须将细胞核固定化，例如，细胞核可粘附至1x HBSS(137mM Na+，1mM Mg2+)中的聚-D-赖氨酸表面。在该实施方式中必须省略子步骤b，但是可用于提高染色质中DNA端部的可及性的Tris缓冲液是用于分离所述材料的组分中的一种。
在另一个实施方式中，可在子步骤d之后但在子步骤e之前将细胞核从细胞中分离并粘附。在该实施方式中，必须省略子步骤b，并且在分离之前，细胞不应进行交联。
在另一个实施方式中，如果将该方法应用于来自包括组织或培养物中的细胞在内的生物材料的分离的DNA或提取的染色质，这意味着子步骤a包括生物材料的裂解和/或分离、和/或分级和/或固定化，则将所述材料例如在玻璃上固定化，或者如果在固定化和修饰DNA端部的另外的步骤之前使用切口平移法(nick translation assay)掺入了生物素化的核苷酸，则可将所述材料在覆盖有生物素的玻璃上固定化，用链霉亲和素进行封闭。或者，当修饰DNA端部时，可以使用酶与经修饰和未修饰的核苷酸的混合物，例如，TdT和聚合酶I以及未修饰的核苷酸、生物素化的核苷酸和BrdU的混合物。这些实施方式排除了进一步检测生物素化的核苷酸的可能性；如果DNA端部的修饰是在溶液中执行的，则在固定化所述材料之前，使用异丙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗涤；子步骤b被省略。
在其他实施方式中，从粘附性细胞或悬浮性细胞、或组织中分离DNA或染色质，并在子步骤d之后但在子步骤e之前固定化(细胞在分离之前不应进行任何交联反应)。
在又一个实施方式中，从粘附性细胞、悬浮性细胞、或组织中分离DNA或染色质，并在子步骤a-g之后固定化。
上述实施方式还反映了滚环复制用于标识单个DNA端部的存在和位置的用途，以及使用所述方法用于检测生物材料中的一个或多个DNA端部的用途。
定义
当描述本发明的方法、技术和用于所述方法中的试剂(例如化合物、组合物、溶液、缓冲液)时，除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。另外，如本文所用，除非使用的上下文另外明确指出，否则不使用数量词限定包括单数形式和复数形式。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包括性的，并且意味着除所列要素外可能还存在附加要素。在本文中使用的表示成分的量、性质(诸如处理条件)等的所有数字均应理解为在所有情况下均被术语“约”或“大致”修饰，除非另有说明，否则这些术语出于本发明的目的是等同的并且可以互换使用。至少并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求书范围，每个数值应根据报告的有效数字并通过应用普通的舍入技术来解释。
由于本发明涉及检测一个或多个DNA端部的方法，因此在本文中“DNA端部”被定义为DNA分子中的位点，在所述位点处核苷酸与仅一个其他核苷酸连接，或者在所述位点处脱氧核糖与仅一个磷酸基团连接，或者在所述位点处磷酸基团与一个而不是两个脱氧核糖分子连接。通常，此类端部可以通过(生物)化学(例如核酸内切酶、拓扑异构酶)或物理(例如电离辐射)因子产生。DNA端部(除了在通过拓扑异构酶产生的瞬变(transients)或端粒中)会干扰DNA的功能，从而对细胞功能造成不利影响。
术语“DNA损伤”应理解为DNA的碱基组成、碱基结构或一级或二级结构的任何变化，并且包括但不限于碱基损失、碱基氧化、磷酸二酯键断裂，这使得DNA分子与在损伤剂作用之前在活生物体的正常健康细胞中发现的原始DNA分子不同。典型的损伤剂是例如电离辐射、紫外线、氧化剂、甲基化剂以及本领域中众所周知的其他损伤剂。
在本说明书中，“DNA断裂”被定义为共价键的任何断裂，例如，磷酸二酯键断裂或脱氧核糖环断裂，从而导致DNA聚合物的不连续性。DNA断裂通常导致DNA损伤，并且出于本发明的目的应理解为导致DNA端部的形成。在DNA分子中观察到的代表性DNA断裂类型包括但不限于单链切口、单链空位、单个磷酸二酯键的单链断裂、双链平端断裂、双链3'-突出断裂、双链5'-突出断裂等，以及其他类型的DNA断裂，包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA断裂。
“DNA链”、“DNA分子”、“DNA聚合物”、DNA在本文中用作等同物并可互换使用。
由于根据本发明的方法涉及检测生物材料中的一个或多个DNA端部，因此出于本发明的目的，“生物材料”包括但不限于选自包括以下的组的活的或固定的材料：例如，动物(包括人)、植物、原生动物、或细菌细胞、病毒，它们的组织和片段，以及所述材料的组分。所有或一些所述材料可以被切离或在体外条件下生长，通过提取、分级、色谱法或其他分离方法获得。
根据本发明的“制备生物材料”包括选自包括以下的组的处理方法：将所述生物材料固定、透化、裂解、分离、分级，提高一个或多个DNA端部的可及性，封闭非特异性结合位点。
术语“将生物材料固定”是指导致所述生物材料变化的化学和/或物理程序，旨在导致所述生物材料的结构和/或化学组分得到保存。示例包括但不限于通过甲醛或戊二醛使蛋白质和DNA交联，通过暴露于乙醇、丙酮或其他化学物质来保存生物材料(因此称为固定剂)。
术语“将生物材料透化”是指导致生物膜(质膜和细胞内膜)和/或细胞壁的完整性被破坏，以允许进入细胞或组织的能力有限的分子的进入的化学和/或物理程序。
术语“裂解”是指破坏生物材料的完整性，以便提取可溶性组分来进行进一步分析。裂解可以通过化学或物理手段执行，所述化学或物理手段包括但不限于均质化、渗透休克，或含有去污剂和其他化学物质的裂解缓冲液。
根据本发明，可能需要分离步骤以获得适当制备的生物材料。出于本发明的目的，术语“分离”是指对生物材料执行的导致从所述材料中分离出特定组分的任何过程。特定组分包括但不限于来自组织的细胞、来自细胞的细胞器、细胞器的片段，来自细胞核的染色质。
术语“将生物材料分级”是指从该生物材料中分离一种或多种期望的组分。分级可应用于粗制的(未处理的)生物材料，以及经处理的生物材料，例如如在裂解过程中获取的材料中。
“提高DNA端部的可及性”是消除空间位阻并提供足够空间以实现分子(例如蛋白质)与DNA端部的接近的过程，所述分子在其他情况下具有有限的与这些端部接触的能力。
关于生物材料中的非特异性结合位点，术语“封闭”是指导致防止测定中所用的关键分子(例如抗体)与分子靶标(可用于测定中的选定的分子表现出针对其的亲和力的分子靶标除外)结合的程序。封闭的典型示例是用于生物材料中感兴趣的分子的抗体检测(免疫检测)中的程序。该抗体针对明确限定的抗原，但也可以经由弱化学相互作用与各种细胞组分结合。通过事先加入占据此类结合位点的封闭剂(诸如白蛋白)，可以使该非特异性结合最小化。
出于本发明的目的，为了更好地理解本发明的解决方案，引入术语“1型至7型分子”。
“1型分子”被定义为能够与DNA端部结合并构成但不限于以下物质的任何分子：(a)卤代核苷酸或核苷分子(诸如BrdU、IdU、CldU)、或DNA前体类似物(诸如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)、F-ara-EdU、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷)，或生物素化的核苷酸分子；(b)用选自包括以下的组的标记物标记的核苷酸或核苷分子：荧光分子、或化学发光分子、或放射性同位素、或酶底物、或生物素分子；(c)ADP-核糖分子，或蛋白质，或能够与一个或多个DNA或RNA端部结合并用作用于结合2型或3型分子的靶标的任何其他分子，或任何其他酶底物，或它们的类似物，或寡聚物，或聚合物中的任何，或其组合。
“2型分子”和“3型分子”被定义为包括但不限于以下的具有与1型分子相互作用和/或结合的能力的分子：抗体或其片段、链霉亲和素、亲和素、生物素分子或其类似物、或配体、蛋白质、肽、核酸、抗原、反应性分子(如叠氮化物)、寡聚物、聚合物，以及上述物质的任何类似物，或它们的组合。
“4型分子”和“5型分子”被定义为包括但不限于以下的分子：与具有这样的序列的核酸(1型寡核苷酸)共价连接的抗体，所述序列允许与其他寡核苷酸(2型寡核苷酸)相互作用(所选区域的杂交)，它们的连接，以及随后的RCA反应。4型和5型分子具有与2型和3型分子相互作用和/或结合的能力。
术语“连接”是指通过催化反应在两个分子之间形成共价化学键。根据本发明，连接是指在2型寡核苷酸与1型寡核苷酸(即构成4型和5型分子的组分的寡核苷酸(与抗体连接的寡核苷酸))的杂交过程之后，接合2型寡核苷酸的端部，以便生成环状寡核苷酸，所述环状寡核苷酸将充当RCA反应中的模板。
如本发明的描述中所使用的“杂交”(核酸杂交、寡核苷酸-寡核苷酸杂交)是指在两个互补的核酸段(两个寡核苷酸)之间形成氢键(退火)的过程。
“6型分子”被定义为包括但不限于以下的分子：能够识别并结合(杂交)使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物的寡核苷酸(3型寡核苷酸)。6型分子带有分子特征码，例如荧光发射，所述分子特征码可通过适当的仪器(例如荧光显微镜、流式细胞仪、激光扫描细胞仪或荧光分光光度计)进行检测。
在RCA反应后的扩增步骤(步骤3，子步骤g，iii)中使用的术语“6型分子中的“寡核苷酸”(3型寡核苷酸)”旨在与RCA反应产物杂交，并且可以由本领域技术人员基于公知常识(例如如在FISH荧光原位杂交中)进行选择。
“7型分子”被定义为这样的分子，所述分子能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物，并且能够用作带有分子特征码或能够生成分子特征码的其他分子的结合靶标，例如连接有可通过质谱法检测的标记物的互补寡核苷酸，或随后被连接并用作产生可检测的产物的RCA反应的底物的寡核苷酸。
例如，在1型至7型分子的定义中使用的术语“结合”是指通过诱导一个或多个共价键的形成，或通过诱导弱的化学相互作用或键(包括氢键、离子键、疏水键、范德华力)使各种分子永久或瞬时接触，其中通过酶促或非酶促手段来实现所述分子的接触、连接或附接。根据本发明的结合方法的一个示例是使1型分子与DNA端部接触，或使2型和3型分子与1型分子接触，以便在这些分子之间形成新的连接。
出于本发明的目的，术语“催化手段”是指这样的方法或试剂，所述方法或试剂导致系统中不会自发发生，但可通过利用特定酶(蛋白质催化剂)、RNA或其他因子(例如表面(例如铂表面)或低分子量化学物质)的作用而可行的化学变化。
“RCA反应”或“滚环扩增反应”是本领域技术人员已知的采用滚环复制(RCR)的反应。RCR是核酸的快速复制，能够合成环状DNA或RNA分子的多个拷贝。它源自一些噬菌体和病毒所使用的天然生物系统。在本发明中使用的“RCA反应”使得能够生成传达有关DNA端部的信息的可检测信号。
为了理解根据本发明的方法的检测步骤，本文所用的术语“信号”是指RCA反应定义以及本说明书中提供的其他定义中的一个或多个分子的可检测特征码，例如特征性荧光发射、或其他特征性吸收、或电磁波能量发射、或磁共振性质，或其他光谱、化学或物理特征。
“信号放大”是这样的一种或多种程序，所述一种或多种程序导致以某种方式改变感兴趣的分子或其分子环境，所述改变导致传达有关该感兴趣的分子的存在和/或性质的信息的更强、更易检测的信号。根据本发明，RCA反应使放大可行，所述RCA反应生成大量分子，所述大量分子随后被多个标记的分子识别，从而产生“增强的”信号，例如荧光信号，所述信号可以是通过常规手段可检测的。
对于本领域技术人员而言明显的是，“检测”是获取关于在对象或性质被隐藏或不容易注意到的环境中该对象或性质的存在的信息的能力。根据本发明，信息可以被编码在来自样品并由专用仪器记录的荧光或其他信号中。可以在本发明中使用的检测技术包括但不限于各种类型的显微术、自动分析高细胞数目的方法、光谱学(包括荧光显微镜法(宽视野、共焦、多焦点、超分辨率、带弹射的显微镜法、激光扫描、高通量、高含量))、荧光测定法、用于吸收检测的透射光光学显微术(组织学)、流式细胞术、细胞分选(FACS)、质谱法。
关于本发明，极其重要的是理解该方法的特征，检测灵敏度被进一步定义为检测低或高数量的感兴趣的对象，或低或高水平的感兴趣的性质的能力；高灵敏度是指检测少量或低水平的感兴趣的对象或性质的能力。出于本发明的目的，关于检测手段能力的高灵敏度意味着即使是单个(一个)DNA端部也是能够通过适当的技术检测的。明显的是，通过根据本发明的方法能够检测任何其他较高数量的单末端(多末端)。在以下描述中示出的示例中说明了以上事实。
在根据本发明的权利要求书中，还引入了其他术语来描述本发明的保护范围。
术语“经修饰的核苷酸”是指这样的核苷酸，所述核苷酸与作为DNA或RNA的结构单元的核苷酸的不同之处在于：其具有官能团或在活生物体的DNA或RNA中通常不存在的基团或其他化学修饰。非限制性示例包括溴脱氧尿苷、乙炔基脱氧尿苷或生物素化的核苷酸。
术语“1型寡核苷酸”被定义为但不限于与抗体连接以形成4型分子和5型分子并且能够与2型寡核苷酸杂交的寡核苷酸。
术语“2型寡核苷酸”是指这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸可以(i)与作为4型分子和5型分子的组分的1型寡核苷酸杂交，(ii)经历连接，并且因此(iii)形成用于随后的RCA反应的底物。
术语“3型寡核苷酸”是指这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸标记有一个或多个荧光团，或能够通过本领域中已知的方法检测的其他标记物，能够与通过RCA反应形成的所得寡核苷酸杂交。
扩增步骤(步骤3，子步骤g，iii)中提到的“核苷酸溶液”是作为活生物体的DNA的典型组分的四种核苷酸的溶液。
为了更好地理解本发明的方法，使用了权利要求1中的以下系统。根据本发明的方法包括三个主要步骤I-III，并且每个步骤包括另外的子步骤a-g。此外，子步骤g包括三个二级子步骤i-iii。必须按照所示次序执行步骤，即步骤II必须在步骤I之后并且步骤III必须在步骤II之后，并且这些主要步骤中的每一个都必须包含至少一个子步骤。除非另有说明，否则如权利要求书中所述，可以使用也可以不使用其他子步骤，并且可以使用这些步骤的许多组合。术语“任选地”是指子步骤(例如，二级子步骤)可以在该方法中使用，也可以不在该方法中使用。主要步骤I-III的名称没有限定的含义，其被引入是为了结构化步骤顺序，从而使方法易于理解和清楚。
根据本发明的上述1型至7型分子、1型至3型寡核苷酸或其他类型的分子或其溶液可以从商业来源获得和/或使用任何方便的方法制备。除非另有说明，否则基于公知常识并根据本说明书中的定义，上述分子的选择对于本领域技术人员而言应被认为是自然且明显的。
由于根据本发明的方法不包括使用分子诊断领域中已知的未更改的方法(如通常建议用于检测蛋白质的PLA方法或标准TUNEL)，而是仅使用其方法的部分、要素或方面，因此一些一般限定的1型至7型分子、1型至3型寡核苷酸、或其它类型的分子或其溶液，以及介质(如缓冲液)可从市售试剂盒中单独或成组地获得以实现本发明。因此，显然不可能提供本发明中指定为1型至7型分子的特定化合物的目录并在示例中提供其规格，因为供应商未提供它们的特性。
例如，6型分子必须具有允许与RCA产物杂交的序列，并且必须具有附接的荧光分子。通常，此类序列和荧光分子类型未被其制造商公开。上面的另一个示例是7型分子，所述7型分子可以是适合进一步RCA反应的另一种核苷酸(底物)，或者可以是发出特定荧光的经荧光标记的分子，或者可以表现出与另一种分子的FRET等。
市售试剂盒、试剂及其供应商的示例有APO-BRDU试剂盒(AU:1001,Phoenix FlowSystems)、HCS DNA损伤试剂盒(H10292,ThermoFisher)、比色TUNEL细胞凋亡测定(#8088,ScienCell)、OxiSelectTM彗星试验试剂盒(STA-350,Cell Biolabs,Inc.)、NEBuffer2(NEBiolabs,B7002S)、N6-(6-氨基)己基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸-生物素(生物素-7-dATP)(Jena Bioscience,NU-835-BIO-S)、生物素-16-炔丙基氨基-dCTP(JenaBioscience,NU-809-BIO16)、生物素-16-5-氨基烯丙基-dUTP(Jena Bioscience,NU-803-BIO16)、dGTP(Jena Bioscience,NU-1003)、DNA聚合酶I(大肠杆菌(E.Coli))(NEBiolabs,MO209)、
原位PLA探针抗小鼠MINUS(Sigma,DUO92004)、
原位PLA探针抗兔PLUS(Sigma,DUO92002)、
原位检测试剂绿(Sigma,DUO92014)、
原位检测试剂红(Sigma,DUO92008)、
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)。
本发明的优点
根据现有技术，下面描述本发明的主要优点的示例。
根据本发明的方法使得能够对一个或多个DNA端部进行直接检测和随后的可视化，这是使用本领域已知的任何方法都无法实现的。本发明使得能够标识单个DNA断裂的存在和位置。这些特征允许认为本发明解决了本领域中存在的基本技术问题，即，其允许确定细胞核中单链和双链DNA断裂的存在、数目和位置，并提供了区分一种或多种断裂的类型的能力。这是评定受试者的DNA质量，并进一步研究DNA损伤诱导、感测和修复的机制所必需的。
此外，不仅测定本身可以通过本发明的方法来实现，而且可以获得DNA端部数目的定量检测。上述特征可用于评估生物材料的质量或环境危害的存在。
如上所述并且在权利要求书中以及实施例中已表明的，根据本发明的方法是高度灵敏的；它比本领域中已知的其他方法更灵敏。本发明允许直接检测甚至单个DNA断裂。
本发明还涉及一种高度特异并且允许检测特定类型的DNA损害的方法。如果将由此获得的知识与有关DNA断裂形成的病因及其在遗传疾病中的作用的信息的适当组合一起使用，则所述知识可用于例如诊断目的。
就发明范围而言，该方法也是通用的。考虑到DNA断裂的类型、DNA端部的类型、生物材料的种类、所使用的分子、试剂和技术，该方法涉及所使用的各种实施方式的能力。
附图说明
图1.检测HeLa细胞中的DNA端部的程序的一个示例中的一系列事件的示意图。所述程序是方法的示例性变体的主要部分，即当2型和3型分子是一抗并且4型和5型分子是二抗，从而导致检测生物材料中的DNA端部的实施方式，并且所述程序可在以下11个图解中进行描述：1.在活细胞中形成DNA断裂。该方案代表任何类型的单链或双链DNA断裂。2.在固定细胞后，酶识别DNA断裂。3.酶开始将1型分子(核苷酸类似物)与DNA端部连接。将多个1型分子添加到图中所示的两个DNA端部。4.酶的作用导致形成附接至两个所识别的DNA端部中的每一者的1型分子的链。5.两种类型的分子(2型和3型)识别并附接至与DNA端部附接的1型分子。附接的2型和3型分子的数目和滴度高到足以使许多2型和3型分子在1型分子的链上彼此靠近地定位(为清楚起见，仅示出了与两个DNA断裂中的一个附接的各种分子)。6.已经附接至1型分子的链的2型和3型分子被4型和5型分子识别。这些4型和5型分子与DNA寡核苷酸(1型寡核苷酸，两种类别)缀合，并与2型和3型分子结合。7.寡核苷酸(2型，两种不同寡核苷酸的溶液)与1型寡核苷酸(其是4型和5型分子的组分)杂交。8.连接酶连接杂交的2型寡核苷酸的端部，从而制备将在RCA反应中需要的环状寡核苷酸。9.连接产物，与1型寡核苷酸杂交的环状寡核苷酸，准备好用于RCA反应。10.RCA反应的产物-附接至4型或5型抗体中的一者的长寡核苷酸。11.荧光标记的3型寡核苷酸与RCA反应产物杂交，从而标识DNA断裂的存在和位置。该方案不包括制备生物材料的步骤，因为该步骤对于解释图示所聚焦的1型至6型分子之间的相互作用不是必需的。
图2.标准TUNEL测定与根据程序1的方法之间的灵敏度比较—荧光共焦图像。示出了未处理和经DNA酶I处理的HeLa细胞的代表性荧光共焦图像，其中根据标准TUNEL测定(APO-BRDU)或程序1来检测游离DNA端部。在根据程序1制备的样品中，能够观察到作为明亮且独特的荧光焦点的游离DNA端部(右列)。对于这两种测定，与未处理的细胞(0U，第三行)相比，使用高浓度的DNA酶I处理细胞(4U，第一行)导致细胞核中的信号显著增强。然而，仅对于根据程序1制备的样品，在使用低浓度的DNA酶I处理的细胞(第二行，右图)与未处理的细胞(第三行，右图)之间存在差异—检测到的游离DNA端部的数目高于经DNA酶处理的细胞中的游离DNA端部的数目。对于标准TUNEL测定，当与未处理的细胞(第三行，左图)相比时，在用低浓度DNA酶I处理过的样品中未观察到明显的荧光信号(第二行，左图)。比例尺-20μm。
图3.TUNEL测定与根据程序1的方法之间的灵敏度比较—箱线图(box plot)。表示DNA断裂的显微镜图像分析结果的箱线图。对于标准TUNEL测定(APO-BRDU)，信号是核内像素的平均灰度值(荧光强度)(应注意TUNEL不会产生单独DNa断裂的图像，其只会导致遍及整个核的粒状信号)。对于根据程序1的方法，确定每个核中的焦点的数目。每个箱的底部是第25个百分位，顶部是第75个百分位，中间的线是第50个百分位，晶须(whiskers)是第10个百分位和第90个百分位。水平实线(比箱更宽)表示平均值。独立的两样品t检验已表明，仅在根据程序1处理细胞后，用低浓度的DNA酶I(0.2U)处理的样品与未处理的样品(0U)之间的平均值差异才是统计学上显著的(右侧图表；p值＝2.8×10-7)。这表明，根据程序1的方法的灵敏度显著高于标准TUNEL测定的灵敏度。
图4.通过标准切口平移法(standard nick translation assay)和根据程序2的方法来评估封闭内源性生物素对DNA端部检测的影响。根据标准切口平移法(第一行)或程序2(第二行)检测到游离DNA端部的未处理的HeLa细胞的代表性荧光共焦图像。在有或没有预封闭步骤的情况下制备样品(程序2中的步骤3—封闭内源性生物素)。对于根据标准切口平移法制备的样品，封闭内源性生物素会导致细胞核中荧光信号的显著降低—信号的差异在记录的共焦图像上清晰可见(第一行)。对于根据程序2制备的样品，预封闭对获得的图像没有重大影响(第二行)。比例尺-20μm。
图5.检测在与修复蛋白XRCC1的积累区域有关的DNA断裂位点处BrdU分子的掺入。BrdU分子的掺入标识了被TdT酶识别的特定类型的DNA 3'-OH端部，当双链平端断裂或双链3'-突出断裂或单链空位出现时会存在所述特定类型的DNA 3'-OH端部。空位通过BER途径修复。XRCC1蛋白是该修复过程中涉及的主要修复因子之一。其中检测到BrdU以及相邻的XRCC1焦点的位点很可能仅是出现单链空位的位点。使用ImageJ软件来分析图像和查找并分配BrdU焦点的荧光极大点(maxima)(正方形)。极大点代表BrdU焦点的质心，因此标识DNA损伤的定位。对代表修复蛋白焦点并在荧光分布图中定位上述极大点的图像的荧光分布图(在底部，显微镜图像的小图下方)的分析表明，在邻近XRCC1修复焦点处或在XRCC1修复焦点的周围区域中始终检测到DNA断裂。在显微镜图像中检测到的XRCC1焦点和BrdU焦点之间存在明显的空间关联。所述图像是3D堆栈图像的最大强度投影。在箭头之间的区域中测量荧光强度的分布图。
图6.通过BrdU掺入标记的DNA断裂的定位，所述DNA断裂很可能是与DNA复制区域(用EdU标记的)和XRCC1修复焦点有关的单链空位(如在实施例4中所描述和解释的)。对代表修复蛋白焦点并在荧光分布图中定位荧光极大点(BrdU焦点-正方形，DNA复制区域-菱形)的图像的荧光分布图(在底部)的分析确定了三种类型的亚核对象之间的空间关联。使用ImageJ软件分析图像，并找到和分配荧光极大点，并生成荧光强度分布图。并非每个DNA复制区域都与BrdU检测区域相关联，这证明了根据程序1的检测方法的最小化的交叉反应性(该方法仅导致对BrdU的检测，而没有对EdU的任何非特异性检测)。所述图像是3D堆栈图像的最大强度投影。在箭头之间的区域中测量荧光强度的分布图。比例尺：5μm或1μm(在图像的放大部分中)。
图7.对照、凋亡和受损HeLa细胞的示例。A).掺入BrdU并使用根据程序1的方法检测的细胞核的图像的示例。该示例证明了该方法用于检测细胞培养物中的凋亡细胞的适用性。与正常对照细胞的细胞核相比，凋亡细胞的细胞核包含显著更多的DNA断裂。B).用不同的损伤剂(紫外线、托泊替康(Tpt)和H2O2)处理的细胞的图像的示例。箱线图显示与未处理的对照细胞相比，用不同试剂进行处理导致可检测的BrdU分子掺入区域的平均数目增加。BrdU掺入区域代表游离DNA端部的定位区域(用H2O2处理的细胞中的平均数：31.57±8.61，用紫外线处理的细胞中的平均数：10.73±4.89，用Tpt处理的细胞中的平均数：16.39±4.92)。使用学生t检验(p值)来检验结果。误差棒代表平均值的标准误差。C).小图呈现了图像的一个示例，说明了在用H2O2处理的细胞核中双链平端断裂或双链3'-突出断裂或单链空位相对于核内和染色质结构的定位(DAPI)。使用ImageJ软件从图像中用线条标识的区域获得的荧光强度分布图。仔细研究DAPI的荧光强度和代表DNA断裂(BrdU焦点)的荧光极大点，能够提供有关受损区域中染色质局部密度的信息。在呈现的图像中，BrdU焦点通过使用ImageJ软件检测到的荧光极大点而被可视化。所述图像是3D堆栈图像的最大强度投影。比例尺：5μm。
图8.在没有BrdU掺入的情况下，在根据程序1处理的HeLa细胞中检测到的荧光信号水平的对照测量。检测到的焦点的数目和观察到的细胞核的数目表明，平均每个单细胞核仅检测到0.13±0.04(细胞核总数N＝63)个焦点。焦点被定义为荧光信号水平高于0a.u.的区域，并使用ImageJ软件的定位荧光极大点的嵌入特征来确定所述焦点的位置。它们中的大多数定位在细胞核之外，这是基于荧光极大点与用DAPI染色的细胞核的荧光图像的重叠所确定的。呈现的显微镜图像是3D堆栈图像的最大强度投影。
图9.对通过光动力学效应(溴化乙锭(500nM)和488nm激光线)在细胞核的小选定区域处造成的DNA断裂的直接检测。
将Hela细胞与溴化乙锭(500nM)一起孵育并在由白色圆圈标识的位置处使用488nm激光线(9mJ-已知诱导损伤的剂量(Zarebski,M.、Wiemasz,E.和Dobrucki,J.W.(2009),Recruitment of heterochromatin protein 1to DNA repair sites.Cytometry,75A:619-625.doi:10.1002/cyto.a.20734))进行照射(第一行)。通过标准TUNEL(左列)和根据程序1(右列)来检测DNA断裂。DNA断裂(焦点)仅在根据程序1检测后可见，如在荧光图像(第二行)和荧光强度分布图(第三行，荧光强度分布图是在箭头之间测量的)上所示。使用ImageJ软件分析图像，并找到和分配荧光极大点，并生成荧光强度分布图。
图10.在通过核酸酶SpCas9在U2-OS细胞中诱导的几十种切割(在3号染色体的子端粒区域诱导的切割)的检测中使用的标准TUNEL方法与根据程序1的方法之间的比较。图像和荧光强度分布图显示，在与核酸酶SpCas9积累相关的区域中测量并由与BrdU的标准免疫荧光检测(标准TUNEL测定)中使用的二抗缀合的Alexa 
594发射的荧光强度的平均值是约0a.u.(分析了50个细胞核，并将该值基于背景信号的水平归一化，从而表示非特异性结合的抗体分子)。针对所记录的显微镜图像的代表性示例所测量的荧光分布图的示例鲜明地说明，当应用标准TUNEL测定时，在使用标准荧光广视野显微镜记录的显微镜图像中无法检测到BrdU焦点。分别地，当应用根据程序1的方法时，未检测到非特异性背景信号，并且BrdU掺入区域由在显微镜图像中可视化的不同焦点表示。这些焦点与SpCas9积累区域共定位，这在荧光强度分布图中另外示出。生成了箭头之间的区域的荧光强度分布图。图像大小：30μm×30μm。
图11.根据程序1的方法在检测人U2-OS细胞中由核酸酶SpCas9诱导的单切割中的应用。当SpCas9不执行任何切割活性时，在核酸酶积累区域中无法检测到BrdU焦点。继而，在SpCas9积累位点处诱导单缺刻(cut)导致检测到掺入的BrdU分子。独特的BrdU焦点在空间上与SpCas9焦点相关联，这由荧光强度分布图另外示出。在箭头之间测量分布图。结果证明，根据程序1的方法在识别DNA断裂时能够达到极高的灵敏度—即使仅一个单一双链DNA断裂也能够被检测到。呈现的显微镜图像是3D堆栈图像的最大强度投影。
图12.根据程序2的方法在检测人U2-OS细胞中由切口酶SpCas9n(H840A)诱导的单切割中的应用。当SpCas9n不执行任何切割活性时，在切口酶积累区域中无法检测到生物素化核苷酸焦点。这两个亚核对象之间没有空间关联。继而，在SpCas9n积累位点处诱导单个切口或多达几十个切口导致检测到掺入的经修饰的核苷酸。生物素化的核苷酸的焦点已被定位并由图像中的荧光极大点表示。当诱导仅一个单链DNA断裂时，核苷酸掺入位点与SpCas9n焦点共定位。如果切口的数目大于一个(高达几十个)，则核苷酸掺入区域和SpCas9n焦点也会共定位。呈现的荧光强度分布图鲜明地示出了这种关联(极大点代表BrdU和SpCas9n焦点的重叠)。结果证明了根据程序2执行的方法的高灵敏度。该方法能够应用于原位检测细胞核中的单一单链DNA断裂。呈现的显微镜图像是3D堆栈图像的最大强度投影。使用ImageJ软件沿着跨感兴趣的SpCas9n焦点行进的水平线获得荧光强度分布图。
图13.测量分离的生物材料中的BrdU掺入水平。所述材料是从未处理的对照HeLa细胞和经受过H2O2(4mM，30分钟)的HeLa细胞中分离出的。作为使用诸如H2O2等损伤剂处理的结果，游离DNA端部的数目增加，这导致掺入的BrdU分子的数目增加，并且样品中的总荧光强度信号增加(使用根据程序1的方法检测BrdU，之后提取包括染色质和DNA在内的细胞组分)。图表(箱线图)上呈现的最终结果是每1ng DNA的荧光强度。每个箱的底部是第25个百分位，顶部是第75个百分位，晶须是第10个百分位和第90个百分位，并且中间的线是平均值。对照样品中测得的每DNA单位(1ng)的荧光强度是2.9±0.2×10-4a.u.，而经H2O2处理的样品中测得的每1ng DNA的荧光强度更高(3.2±0.3×10-4a.u.)(参见表格和曲线图)。独立的两样品t检验已显示，未处理的样品和经H2O2处理的样品之间的每1ng DNA的荧光强度差异是统计学上显著的(p值<0.001)。使用多模式酶标仪Infinite 200Pro(Tecan)测量DNA的浓度。
图14.使用程序2来检测固定的U2-OS细胞中的DNA端部，其中在所述固定的U2-OS细胞中在固定之前提高了DNA端部的可及性。右图呈现了代表经修饰的DNA端部的荧光焦点(根据程序2)。它们在细胞核内部被特定地检测到(细胞核定位在左侧上的透射光图像中)，并且它们的数目在各个细胞之间有所不同。关于代表单链DNA断裂的荧光焦点的定位，所获得的图像是可靠的，这证明了将活细胞(在固定之前)与Tris(在这种情况下为1mM，在37℃下孵育20分钟)一起孵育的步骤用于提高染色质和DNA端部的可及性的适用性。所述图像是3D堆栈图像的最大强度投影。
实施例
借助于以下实施例更详细地解释了本发明，所述实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。
基于关于说明书中提出的主要实施方式的一般方案来描述实施例。
出于比较目的，在大多数情况下，以下实施例使用检测DNA断裂的标准方法，即TUNEL测定。TUNEL测定(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口端部标记)是一种检测固定细胞中DNA端部的技术，其采用聚合酶Tdt、核苷酸类似物和抗类似物抗体，以及荧光检测，如在专利申请WO 1997008345Al，以及通讯(communication)Darzynkiewicz Z、Galkowski D、ZhaoH.Analysis of apoptosis by cytometry using TETNEL assay.Methods.2008年3月；44(3):250-4.doi:10.1016/j.ymeth.2007.11.008中所公开的。
一般程序
程序1
使用酶TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)执行原位DNA损伤检测的一般程序—检测单链空位、双链平端断裂或双链3'-突出断裂。
样品制备：在针对所用细胞类型的标准条件下，在盖玻片上或在具有玻璃底的陪替氏培养皿(Petri dish)上培养细胞。在程序开始时，细胞培养物的密度应达到约50％-60％的融汇度。
程序：
1.预制备(任选的)：
用0.5-10mM Tris孵育活细胞(在室温(RT)下5min-1h)，应监测细胞的形态异常。
2.固定和透化：
a.用1％-4％甲醛溶液在4℃下孵育10-15min。(任选的)
b.用离子去污剂(例如Triton X-100(0.25-3％))在室温下孵育10min-1h。(任选的)
c.在70％的乙醇的水溶液中在-20℃下孵育至少1小时，但优选孵育12-18h，样品应稳定达数月(任选的，但是最优选的)
3.预封闭(任选的)：
a.洗涤(PBS 1×5min)
b.链霉亲和素溶液-在室温下在小滴上执行孵育30min，
c.洗涤(PBS 3×5min)
d.生物素溶液-在室温下在小滴上执行孵育30min
e.洗涤(PBS 3×5min)
4.提高DNA端部的可及性：
用0.5-10mM的EDTA水溶液在室温下孵育10min-1h。
5.掺入程序：
使用末端脱氧核苷酸转移酶掺入未修饰的和经修饰的核苷酸(例如BrdU)：
a.在潮湿室中的小滴上执行孵育
b.在洗涤缓冲液中冲洗样品
6.封闭：
用1-5％BSA的PBS溶液孵育(在4℃、室温下，从1h至过夜)。
7.与一抗一起孵育—在潮湿室中的小滴上执行：
a.1型一抗(例如，针对BrdU的小鼠单克隆抗体)，优选在1-5％BSA中以1:100稀释，1h，室温
b.洗涤(PBS 3×5min)
c.2型一抗(例如，针对BrdU的兔多克隆抗体)，优选在1-5％BSA中以1:100稀释，1h，室温
d.洗涤(PBS 3×5min)
8.PL A程序：
a.每张盖玻片在40μl反应混合物中与在1％BSA中稀释的PLA探针一起孵育(37℃，60min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的PLA探针MINUS储备液(例如抗小鼠)
·8μl的PLA探针PLUS储备液(例如抗兔)
·24μl的1％BSA
b.用洗涤缓冲液A洗涤样品(2×5min)
c.连接-每张盖玻片在40μl反应混合物中孵育(37℃，30min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的5x连接储备液(Sigma,Duolink,DUO82009)，
·31μl的无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水，
·1μl的连接酶(1U/μl)(Sigma,Duolink，DUO82027或DUO82029)
d.用洗涤缓冲液A洗涤样品(2×2min)
e.扩增-每张盖玻片在40μl反应混合物中孵育(37℃，100min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的5x扩增储备液(Sigma,Duolink，DUO82060或DUO82011)，
·31.5μl的无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水，
·0.5μl的聚合酶(10U/μl)(Sigma,Duolink，DUO82028或DUO82030)
9.使用荧光显微镜对PBS中的样品成像。
程序2
使用DNA聚合酶I执行DNA损伤检测的一般程序—检测单链切口、单链空位和双链3'凹陷端部。
样品制备：在针对所用细胞类型的标准条件下，在盖玻片上或在具有玻璃底的陪替氏培养皿上培养细胞。在程序开始时，细胞培养物的密度应达到约50％-60％的融汇度。
程序：
1.预制备(任选的)：
a.用0.5-10mM Tris孵育活细胞(在室温(RT)下5min-1h)，应监测细胞的形态异常。
2.固定和透化：
a.用1％-4％甲醛溶液在4℃下孵育10-15min。(任选的)
b.用离子去污剂(例如Triton X-100(0.25-3％))在室温下孵育10min-1h。(任选的)
c.在70％的乙醇的水溶液中在-20℃下孵育至少1小时，但优选孵育12-18h，样品应稳定达数月(任选的，但是最优选的)
3.预封闭(任选的)：
a.洗涤(PBS 1×5min)
b.链霉亲和素溶液-在室温下在小滴上执行孵育30min，
c.洗涤(PBS 3×5min)
d.生物素溶液-在室温下在小滴上执行孵育30min
e.洗涤(PBS 3×5min)
4.提高DNA端部的可及性：
用0.5-10mM的EDTA水溶液在室温下孵育10min-1h。
5.使用DNA聚合酶I掺入未修饰的和经修饰的(例如，生物素缀合的)核苷酸：
a.用蒸馏水冲洗样品
b.在由以下物质组成的反应混合物中进行孵育(在室温下在潮湿室中的小滴上进行5-60min)：
·反应缓冲液
·dNTP(经修饰的核苷酸与未修饰的核苷酸之比从3:1到1:3变化)
·DNA聚合酶I
·无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水
c.反应终止：
·在室温下与50mM TrisHCl(pH 7.48)一起孵育2×10min
·在室温下与0.5mM TrisHCl一起孵育1×1min
6.封闭：
1-5％BSA的PBS溶液(在4℃、室温下，从1小时至过夜)。
7.与一抗一起孵育—在潮湿室中的小滴上执行：
a.1型一抗(例如，针对生物素的小鼠单克隆抗体)，优选在1-5％BSA中以1:100稀释，1h，室温
b.洗涤(PBS 3×5min)
c.2型一抗(例如，针对生物素的兔多克隆抗体)，优选在1-5％BSA中以1:100稀释，1h，室温
d.洗涤(PBS 3×5min)
8.PL A程序：
a.每张盖玻片在40μl反应混合物中与在1％BSA中稀释的PLA探针一起孵育(37℃，60min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的PLA探针MINUS储备液(例如抗小鼠)
·8μl的PLA探针PLUS储备液(例如抗兔)
·24μl的1％BSA
b.用洗涤缓冲液A洗涤样品(2×5min)
c.连接-每张盖玻片在40μl反应混合物中孵育(37℃，30min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的5x连接储备液(Sigma,Duolink,DUO82009)，
·31μl的无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水，
·1μl的连接酶(1U/μl)(Sigma,Duolink，DUO82027或DUO82029)
d.用洗涤缓冲液A洗涤样品(2×2min)
e.扩增-每张盖玻片在40μl反应混合物中孵育(37℃，100min，在潮湿室中的小滴上进行反应)：
·8μl的5x扩增储备液(Sigma,Duolink，DUO82060或DUO82011)，
·31.5μl的无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水，
·0.5μl的聚合酶(10U/μl)(Sigma,Duolink，DUO82028或DUO82030)
9.使用荧光显微镜对PBS中的样品成像。
实施例1
使用根据程序1的方法检测未处理和经DNA酶I处理的固定HeLa细胞中的游离DNA
端部。
在该实验中使用HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R.Cook)。将细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片0.2×106个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养3天。随后，将细胞在-20℃下在70％乙醇的水溶液中孵育12小时。然后，将细胞在室温下在0.5mMEDTA的水溶液中孵育30分钟。在处理DNA端部之前，将一些样品用DNA酶I处理以诱导DNA断裂。在室温下在由以下物质组成的反应混合物中以小滴执行反应30分钟：0.2或4单位的DNA酶I(Thermo Fisher Scientific,AM2222)、1x DNA酶I缓冲液(Thermo FisherScientific,AM8170G)和水。随后，使用APO-BRDU试剂盒(Phoenix Flow Systems,AU:1001)，使用TdT酶将BrdU连接至DNA的游离端部。然后将细胞与1％BSA的PBS溶液一起在4℃下孵育过夜。分别使用小鼠单克隆抗BrdU(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)和兔多克隆抗BrdU(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab 152095)执行根据程序1的步骤7与1型和2型一抗一起孵育。在最后一次洗涤之后，使用
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)、检测试剂绿(Sigma,DUO92014)、Duolink原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)，根据步骤8(PLA程序)处理细胞。将PLA探针在1％BSA中稀释。在处理后，将样品使用Leica TCSSP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：500-600nm)成像和分析。
结果：
经受程序1的大多数未处理的HeLa细胞表现为在细胞核内无表示游离DNA端部的荧光焦点。然而，在细胞子集(subset)的细胞核中检测到最多3个焦点(图2；第三行，右图)。在经DNA酶I处理的细胞中，检测到了比未处理的细胞中更多的焦点。对于较低和较高的DNA酶I浓度，检测到的焦点的最大数目分别是12和156。在未经处理和经DNA酶I处理(低浓度和高浓度)的细胞中检测到的焦点的平均数目是：0.4±0.1(N＝49)，2.4±0.3(N＝78)和62.2±4.6(N＝36)(图3)。未经处理和经DNA酶I处理(低浓度)的细胞中焦点的平均数目之间的差异是统计学上显著的，其中p值＝2.3×10-7(独立的两样品t检验)。
对比例1
使用标准的TUNEL测定法检测未处理和经DNA酶I处理的固定HeLa细胞中的游离
DNA端部。
将HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R Cook)接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片0.2×106个)，在补充有10％FBS的DMEM中培养3天，然后根据APO-BRDU(TUNEL测定)试剂盒说明书进行处理。在乙醇中固定后，将一些样品用DNA酶I处理以诱导DNA断裂。在室温下在由以下物质组成的反应混合物中以小滴执行反应30分钟：0.2或4单位的DNA酶I(Thermo Fisher Scientific,AM2222)、1x DNA酶I缓冲液(Thermo Fisher Scientific,AM8170G)和水。用于BrdU免疫荧光染色的抗体是：小鼠单克隆抗BrdU(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)和山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 488(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific，A-11029)。在处理后，使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：510-600nm)对样品进行成像。
将对比例1与实施例1的结果进行比较。
结果：
使用ImageJ软件分析显微镜图像。每个样品分析至少30个细胞核。对于标准的TUNEL测定(APO-BRDU)，信号是细胞核内像素的平均灰度值(荧光强度)。对于根据程序1的方法，确定每个细胞核中的焦点的数目。对于这两种测定(标准TUNEL和根据程序1的方法)，当与未处理的细胞相比时，在用高浓度DNA酶I(4U)处理的样品中观察到了显著的信号增加(标准TUNEL，荧光强度：在经DNA酶处理的细胞中为111.8±14.6a.u.(N＝34)对照在未经处理的细胞中为5.7±0.1a.u.(N＝40)，程序1：在经DNA酶处理的细胞中为62.2±4.6个焦点(N＝36)对比在未经处理的细胞中为0.4±0.1个焦点(N＝49))(图3)。然而，独立的两样品t检验已表明，经低浓度的DNA酶I(0.2U)处理的样品与未处理的样品之间的信号差异仅在根据程序1处理细胞后才是统计学上显著的(标准TUNEL，荧光强度：在经DNA酶处理的细胞中为6.0±0.2a.u.(N＝34)对照在未经处理的细胞中为5.7±0.1a.u.(N＝40)，p值＝0.2；程序1：在经DNA酶处理的细胞中为2.4±0.3个焦点(N＝78)对照在未经处理的细胞中为0.4±0.1个焦点(N＝49)，p值＝2.3×10-7)。代表性图像和定量分析在图2和图3中呈现。
结论：
根据程序1的方法的灵敏度显著高于比标准TUNEL测定的灵敏度。
实施例2
使用根据程序2的方法检测未处理的固定HeLa细胞中的游离DNA端部
在该实验中使用HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R.Cook)。将细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片0.2×106个)，在补充有10％FBS的DMEM中培养3天，然后在-20℃下在70％乙醇的水溶液中孵育12小时。在此之后，根据程序2的步骤3(封闭内源性生物素)(Molecular Probes，内源性生物素封闭试剂盒，E-21390)处理样品。在室温下使用0.5mM EDTA的水溶液执行提高DNA端部的可及性(步骤4)达30min。为了掺入未修饰的和经修饰的生物素缀合的核苷酸，将细胞浸入超纯蒸馏水(Invitrogen,Thermo FisherScientific,10977-035)中，然后与由以下物质组成的反应混合物一起孵育(在37℃下在潮湿室中孵育1小时)：lx NEBuffer2(NEBiolabs,B7002S)、30μM每种dNTP(Jena Bioscience，dATP：NU-1001，dCTP：NU-1002，dGTP：NU-1003，生物素-16-5-氨基烯丙基-dUTP：NU-803-BIO16)、每张盖玻片3个单位的DNA聚合酶I(大肠杆菌)(NEBiolabs,MO209)，以及超纯蒸馏水。为了终止反应，接下来如在程序2的步骤5(c)中所述孵育细胞，之后用1％BSA的PBS溶液执行封闭步骤(在4℃下过夜)。分别使用小鼠单克隆抗生物素(Abeam，ab201341)(1％BSA中1:100)和兔多克隆抗BrdU(Abeam，ab53494)(1％BSA中1:100)执行与1型和2型一抗一起孵育(程序2的步骤7)。在最后一次洗涤之后，使用
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)、检测试剂绿(Sigma,DUO92014)、Duolink原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)，根据步骤8(PLA程序)处理细胞。在处理后，使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：510-600nm)对样品进行成像。
结果
在根据程序2(使用步骤3-封闭内源性生物素)处理的(processed)未处理的(untreated)HeLa细胞中很容易检测到表示为明亮的荧光焦点的游离DNA端部(图4，第二行，右图)。每一个细胞核中检测到的焦点平均数是116±6个(N＝23)。
实施例3
使用根据程序2的方法检测固定HeLa细胞中游离DNA端部—评估封闭内源性生物 素的影响。
如实施例2中那样处理HeLa 21-4细胞，但不使用程序2的步骤3(预封闭)。
结果：
在根据程序2(不使用步骤3-封闭内源性生物素)处理的未处理的HeLa细胞中很容易检测到表示为明亮的荧光焦点的游离DNA端部(图4，第二行，左图)。每一个细胞核中检测到的焦点平均数是128±6个(N＝24)。
结论(实施例2和3)：
在根据没有封闭内源性生物素(步骤3)的程序2处理的样品中检测到的游离DNA端部比在其中存在该步骤的样品中检测到的游离DNA端部略多(128±6个对比116±6个)。然而，独立的两样品t检验得出p值＝0.15，表明这两个样品之间的差异不是统计学上显著的。因此，能够得出结论，尽管仍建议封闭内源性生物素，但封闭内源性生物素对于通过根据程序2处理样品而获得的结果并不是至关重要的。
为了确定标准技术与本发明的方法之间的差异，执行以下对比例。
对比例2
使用DNA聚合酶I和标准切口平移法检测固定HeLa细胞中的游离DNA端部。
如实施例2或3中那样处理HeLa细胞，但是省略程序2的步骤7c-8。替代地，在步骤7b之后是与二抗一起孵育。所使用的二抗是：山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 488(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,A-11029)。在处理后，使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：510-600nm)对样品进行成像。
结果：
两种方案(标准和本发明的方法)均允许检测未处理的HeLa细胞中的游离DNA端部(图4)。在根据标准切口平移法处理的样品中很容易观察到封闭内源性生物素的影响—当与没有内源性生物素封闭步骤的样品相比时，预封闭导致荧光信号显著降低(荧光信号：在具有步骤3的样品中为11a.u.对照在没有步骤3的样品中为92a.u.)(图4，第一行)。在根据具有或不具有步骤3的程序2制备的样品中，平均焦点数目之间的差异不是统计学上显著的(116±6个焦点对照128±6个焦点，独立的两样品t检验：p值＝0.15)(图4，第二行)。
结论：
尽管两种利用DNA聚合酶I的测定都能够检测未处理细胞中的游离DNA端部，但是根据程序2的测定由于可以量化DNA断裂而是有利的。这源于以下事实：在根据该程序制备的样品中，游离DNA端部表示为易于在接近零的背景上检测到的明亮的荧光焦点。而且，对封闭内源性生物素对使用这些方法获得的结果的影响的比较显示，与标准测定相比，根据程序2的方法更具特异性，即导致更少的假阳性。这一结论得到了以下事实的有力支持：封闭内源性生物素不会导致通过根据程序2的方法检测到的焦点的平均数目的减少。
实施例4
根据程序1检测固定HeLa细胞中的游离DNA端部，以确定与由积累的修复蛋白X射
线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)分子形成的修复焦点的定位有关的内源性自发DNA断裂的定
位。
为了确认根据本发明的程序1的方法能够检测特定类型的断裂(即，单链空位)，使用程序1中所述的方法来检测细胞核内的自发DNA断裂。它们与由积累的修复蛋白X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)分子形成的修复焦点的定位相关地定位。已知该蛋白质参与单链DNA损伤修复途径(单链断裂修复，缩写为SSBR，或碱基切除修复，缩写为BER)。
在此实验中，使用HeLa 21-4细胞系(获自牛津大学的P.R.Cook教授)。将细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片3.5×104个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时，然后用质粒pmRFP-C1-XRCC1转染(转染剂：FuGene(Promega,E2311)，在OptiMEM(Gibco,Thermo Fisher Scientific,31985070)中制备的转染混合物，在补充有10％FBS的OptiMEM中培养的细胞)。转染后将细胞培养36小时。随后，将细胞在室温下与4％PFA(Electron Microscopy Sciences,15710-S)一起孵育15分钟，并在室温下用0.25％TritonX-100(Sigma,T8787)透化1小时。使用APO-BRDU试剂盒(Phoenix Flow Systems,AU:1001)，使用TdT酶将BrdU连接至DNA的游离端部。然后将细胞与5％BSA的PBS溶液一起在4℃下孵育过夜。分别使用针对BrdU的小鼠单克隆抗体(稀释度：在5％BSA中1:100)(Abeam，ab8039))和针对BrdU的兔多克隆抗体(稀释度：在5％BSA中1:100)(Abeam，ab 152095)，根据程序1的步骤7与1型和2型一抗一起孵育。在最后一步洗涤之后，使用
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)根据步骤8(PLA程序)处理细胞；将PLA探针在5％BSA中稀释。使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂绿(Sigma,DUO92014)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。在处理后，将样品使用LeicaTCS SP5共焦显微镜(针对检测结合到游离DNA端部的BrdU：激发：488nm，发射：498-540nm；针对检测XRCC1：激发：561nm，发射：600-700nm)成像和分析。使用SVI 3D Huygens去卷积和分析软件(Scientific Volume Imaging B.V.,Hilversum,荷兰)对3D堆栈图像进行去卷积。
结果：
BrdU分子的掺入标识了被TdT酶识别的特定类型的DNA 3'-OH端部，当双链平端断裂或双链3'-突出断裂或单链空位出现时会存在所述特定类型的DNA 3'-OH端部。空位发生在BER途径期间。因此，其中检测到BrdU以及相邻的XRCC1焦点的区域很可能仅是出现单链空位的位点。使用ImageJ软件(Abràmoff M.D.、
P.J.、Ram S.J.:Imageprocessing with imageJ.(Biophotonics Int.,2004；11:36-41))来分析图像，并找到和分配BrdU焦点的荧光极大点。对代表修复蛋白焦点并在荧光分布图中定位上述极大点的图像的荧光分布图的分析表明，在邻近XRCC1修复焦点处或在XRCC1修复焦点的周围区域中始终检测到DNA断裂(图5)。
结论：
结果证实了根据程序1的方法的特异性，表明仅在DNA断裂发生时才获得信号，DNA断裂发生由修复因子的积累所证实。当单链空位发生时，根据文献资料(Caldecott K.W.：XRCC1 and DNA strand break repair.DNA Repair(Amst).,2003；2:955-969；Hanssen-Bauer A.、Solvang-Garten K.、Akbari M.、Otterlei M.：X-ray Repair CrossComplementing protein 1in base excision repair.Int.J.Mol.Sci.,2012；13:17210-17229，Abbotts R.、Wilson D M.，第3版：Coordination of DNA single strand breakrepair.Free Radic.Biol.Med.,2017；107:228-244)，XRCC1响应于单链DNA断裂(包括那些需要参与碱基切除修复的蛋白质的活性的单链DNA断裂)的发生而特异性地在DNA损伤位点处积累。在掺入BrdU分子的位点处同时检测到该修复蛋白的积累提供了对以下的证实：从BrdU检测到的信号不是假象，并且根据程序1的方法导致对游离DNA端部的识别。此外，该实验的结果表明，根据程序1的方法适用于原位分析DNA断裂在细胞核中的定位。
实施例5
根据程序1检测固定HeLa细胞中的游离DNA端部，以确定与由积累的修复蛋白X射
线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)分子形成的修复焦点的定位有关并且与DNA复制区域的定位
有关的内源性自发DNA断裂的定位。
为了证实根据本发明的程序1的方法能够用于检测具有最小化的非特异性检测信号的在DNA复制区域内发生的特定类型的断裂，与由积累的修复蛋白X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)分子形成的修复焦点的定位有关并且与DNA复制区域的定位有关地定位内源性自发DNA断裂。
如在实施例4中那样使用相同的HeLa细胞系执行实验。为了标记复制叉，在用4％PFA固定之前，将活细胞与前体EdU(Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒，Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,C10337)根据制造商的使用说明在37℃下一起孵育30分钟。在检测PLA探针之后，利用“点击”反应(Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒，Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,C10337)根据制造商的使用说明检测掺入EdU的区域，例外是不是在试剂盒中提供Alexa Fluor 488叠氮化物试剂，而是用Atto 390叠氮化物(Sigma，68321)替换。在处理后，将样品使用Leica TCS SP5共焦显微镜(针对检测掺入复制DNA的区域的EdU：激发：405nm，发射：420-480nm；针对检测结合到游离DNA端部的BrdU：激发：488nm，发射：498-540nm；针对检测XRCC1：激发：561nm，发射：600-700nm)成像和分析。使用SVI 3D Huygens去卷积和分析软件(Scientific Volume Imaging B.V.,Hilversum,荷兰)对3D堆栈图像进行去卷积。
结果：
通过掺入BrdU分子修饰的DNA断裂(很可能是单链切口)(如实施例4中所描述和说明的)位于复制位点内，并且同时邻近XRCC1修复焦点或在XRCC1修复焦点的周边区域中(图6)。BrdU焦点和DNA复制区域(EdU掺入区域)的共定位分析以及荧光分布图和荧光极大点定位的分析确定了三种类型的亚核对象之间的空间关联。此外，应该强调的是，并非每个DNA复制区域都与BrdU检测区域相关。
结论：
结果表明，根据程序1的方法适用于与复制压力有关的研究领域。该主题与细胞衰老和老化过程的情境有关。此外，EdU掺入区域与BrdU掺入区域的定位之间没有明显关联的事实表明，根据程序1的方法中的检测没有会导致对在该实验中使用的另一种核苷类似物(即EdU)的非特异性识别的交叉反应性。这证明了经修饰的DNA端部的识别的特异性。
实施例6
使用根据程序1的方法检测经受不同损伤剂(紫外线诱导的DNA损伤、H2O2诱导的
DNA损伤、用喜树碱衍生物-托泊替康(Tpt)诱导的DNA损伤)的固定HeLa细胞中的DNA端部。
该实验的目的是对使用根据程序1的方法在未处理的HeLa细胞中以及在DNA经受不同的损伤剂(紫外线诱导的DNA损伤、H2O2诱导的DNA损伤、喜树碱衍生物-托泊替康(Tpt)诱导的DNA断裂)的细胞中将BrdU掺入到游离的DNA端部后获得的荧光信号进行成像和比较。
将HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R.Cook教授)接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片0.12×106个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时。
随后，使HeLa细胞以下列方式经受不同的损伤剂(紫外线诱导的DNA损伤、H2O2诱导的DNA损伤、喜树碱衍生物-托泊替康(Tpt)诱导的DNA断裂)：
紫外线：
将补充有10％FBS的DMEM替换为补充有Mg2+离子和Ca2+离子的预热的PBS(37℃)，将样品置于在254nm下发射的Philips TUV PL-S5W/2P灯下，该灯放置在标准细胞培养箱中(无CO2控制)。如在距灯20cm处测量的，灯递送10W/m2s。将细胞暴露于UV-C 1分钟。然后将样品放在冰上，并立即用4％PFA固定。
H2O2：
将H2O2(终浓度为4mM)直接加入到生长培养基(补充有10％FBS的DMEM)中。将细胞在37℃下在具有CO2水平控制的标准细胞培养箱中孵育30分钟。孵育后，将样品立即在4％PFA中固定。
Tpt：
将Tpt(Sigma-Aldrich，T2705)以20μM的终浓度直接加入到生长培养基中。将细胞在37℃下在具有CO2水平控制的标准细胞培养箱中孵育30分钟。孵育后，将样品立即在4％PFA中固定。
实验的另一部分如实施例4中那样使用相同的HeLa细胞系执行，例外是事实上未用任何质粒转染细胞。在成像之前，将细胞中的DNA用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，在PBS中1μM，30min，室温)(Sigma-Aldrich，D9542)染色。在处理后，将样品使用Leica TCSSP5共焦显微镜(针对检测DAPF：激发：405nm，发射：420-480nm；针对检测结合至游离DNA端部的BrdU：激发：488nm，发射：498-540nm)成像并分析。
结果：
图7中呈现的HeLa细胞的细胞核的记录图像示例显示，在其中使用外源试剂诱导DNA损伤的细胞中检测到了比对照的正常未处理的细胞中显著更多的信号。检测到的内源性BrdU焦点的平均数目是0.4±0.1个(根据实施例1)。用不同的试剂处理导致可检测的BrdU分子掺入区域的平均数目增加，换句话说是游离DNA端部增加(用H2O2处理的细胞中的平均数目：31.57±8.61个，用紫外线处理的细胞中的平均数目：10.73±4.89个，用Tpt处理的细胞中的平均数目：16.39±4.92个)(图7)。另外，在正常的未处理的细胞培养物中的凋亡细胞的示例的图像显示，在此类细胞中存在更多可检测的BrdU掺入区域。它们的数目(超过100个)反映了细胞凋亡期间发生的DNA片段化的程度。显示出严重的DNA损伤迹象的野生型、未处理的HeLa细胞(凋亡细胞)通常占整个细胞群体的少于5％。在用不同损伤剂处理过的细胞群体中，它们的百分比在用H2O2处理过的细胞中增加了高达约30％，在用紫外线处理过的细胞中增加了高达约20％，并且在用Tpt处理过的细胞中增加了高达约18％。
结论：
根据程序1的方法适用于原位检测细胞中外源诱导的DNA损伤。它使得能够定位DNA断裂，该DNA断裂通过进一步应用图像分析技术呈现。荧光极大点的定位和荧光分布图的分析能够提供有关固定细胞核中与核内和染色质结构(使用DAPI染色)相关的双链平端断裂或双链3'-突出断裂或单链空位的定位的信息(此类分析的示例在图7C中示出)。此外，图7A中呈现的图像证明，根据程序1的方法还能够用于检测细胞凋亡。呈现的细胞显示出凋亡细胞典型的形态特征的迹象(参见透射光图像)。此外，所呈现的图像证明，作为应用该方法的结果而获得的荧光信号是特异性代表由于DNA断裂诱导而出现的DNA端部的信号。在未处理的细胞中可检测到的焦点的数目与在受损的细胞中检测到的焦点的数目之间的比较证明，所获得的信号不是标记技术的技术缺陷的假象效应。此外，结果证明根据程序1的方法之后可以是对获得的显微镜图像进行彻底的定量分析，并且能够提供有关被分析的生物材料的状况和质量的大量信息。此外，此类分析能够传递关于生物材料所经受的环境条件的信息。该数据可用于比较分析。
实施例7
检测在根据程序1处理的未处理的固定HeLa细胞中的信号，在所述程序1中省略了
程序1的整个步骤5(用TdT酶掺入BrdU)。
如实施例6中那样使用相同的HeLa细胞系执行实验，例外是细胞没有经受任何损伤因子，并且省略了程序1的整个步骤5。在处理后，将对照样品使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：498-540nm)成像并分析。
结果：
在整个盖玻片上检测到了极少的焦点。焦点被定义为荧光信号水平大于0a.u.的区域，并使用ImageJ软件的定位荧光极大点的嵌入特征来确定所述焦点的位置。大多数焦点定位于细胞核外，这是基于荧光极大点与用DAPI染色的细胞核的荧光图像的重叠确定的(图8)。对检测到的焦点的数目和观察到的细胞核的数目的分析表明，平均每个单细胞核仅检测到0.13±0.04(细胞核总数N＝63)个焦点。在未处理的HeLa细胞的情况下，期中游离DNA端部通过掺入BrdU而被修饰，每单个细胞核检测到的平均焦点数为0.4±0.1个(N＝49)，如实施例1中所述。
结论与解释：
根据程序1的方法中几乎没有非特异性抗体识别。根据程序1的方法具有极高的特异性，这是因为事实上只有当单克隆抗体和多克隆抗体彼此紧密结合时才能获得信号。换句话说：如果它们与相同的BrdU分子结合，或者如果它们与形成附接至DNA游离3'-OH端部的链的BrdU分子选择性地结合。则两种不同类型的一抗的使用增加了特异性。在不存在BrdU的情况下，几乎没有信号可检测到，这支持所应用的检测方法几乎没有交叉反应性的观点。
实施例8
使用根据程序1的方法检测固定HeLa细胞中由光动力学效应诱导的DNA断裂。
在该实验中，通过以下方式来诱导DNA断裂：用溴化乙锭(500μM)处理活细胞(HeLa21-4细胞，获自牛津大学的P.R.Cook教授)10min，然后将激光束(488nm)停在细胞核内的选定位置处(剂量：9mJ)2分钟，在照射之后执行程序1的步骤2。该实验的目的是直接检测通过光动力效应在细胞核特定区域处造成的DNA断裂。
首先将HeLa 21-4细胞接种在18mm盖玻片上，并在补充有10％FBS的DMEM中培养3天。在培养后，如先前所述，在选定的细胞中诱导DNA损伤，之后在70％乙醇的水溶液中在-20℃下孵育15h。在此之后，在室温下使用10mM EDTA的水溶液执行提高DNA端部的可及性(步骤4)达1h。根据试剂盒供应商的使用说明(APO-BRDU试剂盒，Phoenix Flow Systems)，执行通过末端脱氧核苷酸转移酶掺入经修饰的(BrdUTP)核苷酸(Phoenix Flow Systems)。然后将细胞与1％BSA的PBS溶液一起孵育(在4℃下过夜)。分别使用小鼠单克隆抗BrdU(Abeam，ab8039)和兔多克隆抗BrdU(Abeam，ab152095)(在1％BSA中1:100)，执行根据程序2的步骤7与1型和2型一抗一起孵育。在最后一次洗涤之后，使用Duolink原位PLA探针抗兔MINUS(Sigma，DUO92006)、Duolink原位PLA探针抗小鼠PLUS(Sigma，DUO92001)、检测试剂绿(Sigma，DUO92014)、Duolink原位洗涤缓冲液(DUO82049)，根据步骤8(PLA程序)处理细胞。在处理后，使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：510-600nm)对样品进行成像。
结果：
使用ImageJ软件(Abràmoff M.D.、
P.J.、Ram S.J.：Imageprocessing with imageJ.Biophotonics Int.,2004；11:36-41)来分析显微镜图像。在90％的受损细胞核中，荧光焦点在被照射的地方或其直接附近(direct proximity)是清晰可见的(例如：图10，右列)。
结论：
通过根据程序1的方法检测通过光和DNA嵌入剂(光敏剂)的相互作用诱导的少量DNA断裂是可行的。
对比例3
使用标准TUNEL测定来检测固定HeLa细胞中由光动力学效应诱导的DNA断裂。
如实施例6中那样将HeLa 21-4细胞接种、培养和处理。对于进一步处理，根据制造商的使用说明执行标准TUNEL测定(APO BrdU Phoenix Flow Systems)。在处理后，将样品使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：488nm，发射：510-600nm)成像并分析。
已经将对比例3与实施例9的结果进行了比较。
结果：
使用ImageJ软件(Abràmoff M.D.、
P.J.、Ram S.J.：Imageprocessing with imageJ.Biophotonics Int.,2004；11:36-41)来分析显微镜图像。对于标准TUNEL测定，在被照射的地方没有可见的焦点。对于根据程序1的方法，焦点在被照射的地方或其直接附近是清晰可见的(图9)。
结论：
根据程序1的方法比标准TUNEL测定更灵敏，并且允许检测由于光和光敏剂之间的相互作用而诱导的少量DNA双链断裂。通过标准TUNEL测定未检测到相似数量的损伤。
实施例9
使用程序1和标准TUNEL测定来检测固定U2-OS细胞中由于核酸酶SpCas9的切割活
性而产生的DNA端部
为了确定程序1用于检测由于核酸酶SpCas9的切割活性而存在的DNA端部的适用性，使用CRISPR/Cas9技术。核酸酶靶向位于3号染色体上的子端粒区域，所述子端粒区域表征为存在重复序列。使用SpCas9来诱导多于几个(高达几十个)切割。
在本实施例中，在检测之前，将U2-OS细胞(HTB-96TM，ATCC)接种在具有14mm微孔的玻璃底35mm陪替氏培养皿(1.0号盖玻片，厚度：0.13-0.16mm)(MatTek Corporation，P35G-1.0-14-C)(每1个陪替氏培养皿3.5×104个细胞)中，并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时。24小时后，为了获得适合对细胞核内特定位点处的Cas9焦点进行成像的条件(CRISPR/Cas9技术)，用编码荧光标记的(3X mCherry)核酸酶SpCas9的质粒以及sgRNA的合适组合转染细胞(转染剂：FuGene(Promega，E2311)，用OptiMEM(Gibco，Thermo FisherScientific，31985070)制备的转染混合物，在补充有10％FBS的OptiMEM中培养的细胞)，并在补充有10％FBS的OptiMEM中培养细胞)。转染后，将细胞培养48小时。对于根据程序1处理的图10中所示的细胞，没有用Tris进行预制备(步骤1)。接下来，步骤2包括在室温下用1％PFA(Electron Microscopy Sciences，15710-S)孵育15分钟，并在室温下用0.25％TritonX-100(Sigma，T8787)透化1小时。在透化后，使用APO-BRDU试剂盒(Phoenix Flow Systems,AU:1001)，使用TdT酶将BrdU连接至DNA的游离端部。在潮湿室中的小滴上执行与酶一起孵育。在酶促反应(根据供应商的使用说明执行)之后，将样品用冲洗缓冲液(Phoenix FlowSystems，AU：1001)快速冲洗两次。之后，将样品在4℃下在5％BSA的PBS溶液中孵育过夜，随后执行与一抗[小鼠单克隆抗BrdU(稀释度：在5％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)、兔多克隆抗BrdU(稀释度：在5％BSA中1:100)(Abeam，ab152095)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在5％BSA中稀释；将PLA探针在5％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂红(Sigma,DUO92008)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。
对于TUNEL测定，如上所述将细胞接种并转染。转染后，还将图10所示的细胞培养48小时，然后在室温下用1％PFA(Electron Microscopy Sciences，15710-S)固定15分钟，并用0.25％Triton X-100(Sigma，T8787)在室温下透化1小时。至DNA游离端部的BrdU连接也以相同方式进行。然后，将细胞与一抗[小鼠单克隆抗BrdU(稀释度：在5％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)]在室温下在潮湿室中在小滴(50μl)上一起孵育1小时。在与一抗一起孵育之后，将样品在PBS中洗涤(将缓冲液更换四次，将样品在PBS中保持1小时)，然后执行与二抗[山羊抗小鼠IgG1二抗，
594缀合物(稀释度：在5％BSA中1:400)(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，A21125)]-在室温下在潮湿室中在小滴(50μl)上一起孵育1小时。接下来，将样品在PBS中洗涤(3×5min)，并在PBS中放置过夜。
在处理之后，对于所有样品，使用配备有汞弧灯、10位滤光轮(SutterInstrument)、CFP/YFP/HcRed滤光片组、GFP/DsRed滤光片组(Semrock)、CCD相机(Photometries)和MetaMorph采集软件(Molecular Devices)的Leica DM-IRB倒置显微镜执行相衬和荧光显微成像。将红色标记(
594和在
原位检测试剂红(Sigma，DUO92008)中使用的标记)在556/20nm(波长/带宽)处激发，并在630/91nm通道中收集其发射。将GFP在470/28nm处激发，并在512/23nm通道中收集其发射。使用MetaMorph采集软件(Molecular Devices)并使用ImageJ软件(Abràmoff MD，
P.J.、RamS.J.：Image processing with ImageJ.(Biophotonics Int.,2004；11:36-41))来获取和分析成像数据。基于核焦点信号与背景核质荧光的比值来设置阈值。
结果：
图10中呈现的图像和荧光强度分布图表明，当应用标准TUNEL测定来检测使用CRISPR/Cas9技术生成的游离DNA端部时未检测到信号，其中在人类基因组的一个位点处诱导了几十个切割。在与核酸酶SpCas9积累相关的区域中测量并由与BrdU的标准免疫荧光检测中使用的二抗缀合的Alexa
594发射的荧光强度的平均值是约0(分析了50个细胞核，并将值基于背景信号的水平归一化，所述背景信号的水平代表非特异性结合的抗体分子)。针对所记录的显微镜图像的代表性示例所测量的荧光分布图的示例鲜明地说明，无法检测到BrdU焦点。相比之下，当应用根据程序1的方法时，未检测到非特异性背景信号，并且BrdU掺入区域由在显微镜图像中可视化的独特焦点表示(图10)。这些焦点与SpCas9积累区域共定位。这些观察结果还另外通过使用ImageJ软件获得的代表性荧光强度分布图得到了证实(图10)。
结论：
结果证实，根据程序1的方法能够检测人细胞中由SpCas9诱导的DNA切割，这与标准TUNEL测定不同，标准TUNEL测定的灵敏度甚至不足以识别在人类基因组的特定位点处彼此紧邻定位的几十个双链DNA断裂。图像分析的结果为根据程序1的方法的特异性和灵敏性提供了另一证明，并强调了根据程序1的方法相对于迄今已用于检测DNA断裂的现有方法的优势。
实施例10
使用程序1来高度灵敏地检测固定U2-OS细胞中由于核酸酶SpCas9的切割活性而
产生的DNA端部
为了确定程序1用于检测因核酸酶SpCas9的切割活性而导致的DNA端部的适用性，使用CRISPR/Cas9技术。核酸酶靶向位于3号染色体上的子端粒区域，所述子端粒区域表征为存在重复序列。为此，以两种不同的方式制备U2-OS细胞(HTB-96TM，ATCC)，以获得以下细胞：
·其中SpCas9不会诱导任何缺刻的细胞，尽管事实上核酸酶分子结合在靶区域中
·其中SpCas9在位于基因组序列中的与重复序列区域紧邻定位的位点处诱导仅一个单一双链缺刻(断裂)的细胞。
在此实施例中，在检测之前，将U2-OS细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片3.5×104个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时。在24小时后，为了生成上述“细胞类型”并创建适合对细胞核内特定位点处的SpCas9焦点进行成像的条件(CRISPR/Cas9技术)，用编码荧光标记的(3X mCherry)SpCas9的质粒和sgRNA的合适组合转染细胞(转染剂：FuGene(Promega，E2311)，用OptiMEM(Gibco，Thermo Fisher Scientific，31985070)制备的转染混合物，在补充有10％FBS的OptiMEM中培养的细胞)。转染后，将细胞培养48小时，然后根据程序1进行处理。对于图11中呈现的细胞，没有用Tris进行预制备(步骤1)。步骤2仅包括用70％Et(OH)固定(过夜；-20℃)。在室温下将样品在10mM EDTA的水溶液中孵育30分钟后，仅将样品用洗涤缓冲液(Phoenix Flow Systems，AU：1001)快速冲洗两次。使用APO-BRDU试剂盒(Phoenix Flow Systems,AU:1001)，使用TdT酶将BrdU连接至DNA的游离端部。在潮湿室中的小滴上执行与酶一起孵育。在酶促反应(根据供应商的使用说明执行)之后，将样品用冲洗缓冲液(Phoenix Flow Systems，AU：1001)快速冲洗两次。之后，将样品在4℃下在1％BSA的PBS溶液中孵育过夜，随后执行与一抗[针对BrdU的小鼠单克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)、针对BrdU的兔多克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab152095)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在1％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂绿(Sigma,DUO92014)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。在处理后，将样品使用LeicaTCS SP5共焦显微镜(针对检测结合至DNA游离端部的BrdU：激发：488nm，发射：498-540nm；针对检测SpCas9：激发：594nm，发射：605-700nm)成像和分析。
结果：
图11中呈现的图像显示，即使由于SpCas9切割活性而仅存在一个DNA双链断裂，也能够通过根据程序1的方法特异性识别该一个DNA双链断裂。这反映为存在相关荧光信号，所述相关荧光信号是积累的SpCas9分子和掺入的BrdU分子所特有的。当SpCas9不执行任何切割活性时，在核酸酶积累区域中无法检测到BrdU掺入(图11)。图11中的图像显示，当诱导仅一个单一的双链DNA断裂时，BrdU检测区域的定位位于与SpCas9焦点共定位的区域中(图11)。在一些情况下，能够在与SpCas9焦点相邻的区域中检测到BrdU焦点(数据未显示)。这很可能是由于以下事实造成的：引起染色质松弛的EDTA处理导致两个互补的(3'和5')DNA端部的转座，所述DNA端部在DNA被切割时出现并且被释放。在损害部位产生的两个不稳定的DNA片段被分开并彼此远离地移动。
结论：
结果证实，根据程序1的方法能够检测人细胞中由SpCas9诱导的DNA切割。此外，由于根据程序1的方法具有使得其能够检测单个损害的高灵敏度，因此它能够用作检测SpCas9诱导的DSB的高特异性标识物，而与切割的数目无关。在不诱导切割的情况下没有可检测信号的事实证实了该方法的高特异性。结果还证实了该技术的极高灵敏度：它提供了检测一个双链DNA断裂的可行性。
实施例11
使用步骤2检测固定U2-OS细胞中因切口酶SpCas9n(H840A)的产生切口活性而产
生的DNA端部
为了确定程序2用于检测因切口酶SpCas9n(H840A)的产生切口(nicking)活性而产生的DNA端部的适用性，使用CRISPR/Cas9技术。切口酶靶向位于3号染色体上的子端粒区域，所述子端粒区域表征为存在重复序列。为此，以三种不同的方式制备U2-OS细胞(HTB-96TM，ATCC)，以获得以下细胞：
·其中SpCas9n诱导多于几个(高达几十个)单链切口(所述切口是在同一条DNA链中诱导的)的细胞，
·其中SpCas9n不会诱导任何切口的细胞，尽管事实上SpCas9n分子结合在靶区域中，
·其中SpCas9n在位于基因组序列中的与重复序列区域紧邻定位的位点处诱导仅一个单一单链切口的细胞。
在该实验中，在检测之前，将U2-OS细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片3.5×104个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养24小时。在24小时后，为了生成上述“细胞类型”并创建适合对细胞核内特定位点处的SpCas9n焦点进行成像的条件(CRISPR/Cas9技术)，用编码荧光标记的(3X GFP)SpCas9n(H840A)的质粒和sgRNA的合适组合转染细胞(转染剂：FuGene(Promega，E2311)，用OptiMEM(Gibco，Thermo Fisher Scientific，31985070)制备的转染混合物，在补充有10％FBS的OptiMEM中培养的细胞)。然后，转染后将细胞培养48小时。随后，根据程序2处理细胞。在图12的图像中呈现的细胞的情况下，没有用Tris进行处理。下一步骤包括用70％Et(OH)进行固定(过夜孵育；-20℃)。之后，根据程序2中提供的说明，使用内源性生物素封闭试剂盒(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，E21390)对样品进行预封闭。在室温下将样品在10mM EDTA的水溶液中孵育30分钟后，将样品用蒸馏水快速冲洗，并与切口平移法反应混合物[1x NEBuffer2(NEBiolabs，B7002S)、30uM的每种dNTP(Jena Bioscience，N6-(6-氨基)己基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸-生物素(生物素-7-dATP)：NU-835-BIO-S、生物素-16-炔丙基氨基-dCTP：NU-809-BIO16、生物素-16-5-氨基烯丙基-dUTP：NU-803-BIO16，dGTP：NU-1003)、每张盖玻片3个单位的DNA聚合酶I(大肠杆菌)(NEBiolabs，MO209)、超纯蒸馏水(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,10977-035)]在37℃下在潮湿室中一起孵育1h。之后，将样品在4℃下在1％BSA的PBS溶液中孵育过夜。接下来，将样品在4℃下在1％BSA的PBS溶液中孵育过夜，随后执行与一抗[小鼠单克隆抗生物素[Hyb-8](稀释度：1％BSA中1:100)(Abeam，ab201341)、兔多克隆抗生物素(稀释度：1％BSA中1:100)(Abeam，ab53494)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在5％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂红(Sigma,DUO92008)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。在处理后，将样品使用Leica TCS SP5共焦显微镜(针对检测SpCas9n：激发：488nm，发射：498-540nm；针对检测结合至游离DNA端部的生物素化的或未修饰的核苷酸：激发：594nm，发射：605-700nm)成像和分析。
结果：
图12中呈现的图像显示，如果由于SpCas9n(H840A)的产生切口活性而出现了一个或多个单链DNA断裂，则该一个或多个单链DNA断裂通过DNA聚合酶I和根据程序2的方法被特异性识别。这反映为存在相关荧光信号，所述相关荧光信号是积累的荧光标记的SpCas9n分子和掺入的生物素化的核苷酸所特有的。当SpCas9n不执行任何切割活性时，在与切口酶积累区域共定位或部分共定位的区域中无法检测到经修饰的核苷酸的掺入(图12)。图12中的图像显示，当诱导了仅一个单链DNA断裂时，核苷酸掺入的定位与SpCas9n焦点共定位(图12)。如果切口的数目大于一个(高达几十个)，则核苷酸掺入区域和SpCas9n焦点也会共定位(图12)。
结论：
结果证实，根据程序2的方法能够检测人细胞中由SpCas9n诱导的DNA切口。此外，它能够用作检测SpCas9n诱导的单链断裂(SSB)的高特异性标识物，而与断裂的数目无关。在不诱导SSB的情况下没有可检测信号的事实证实了该方法的高特异性。结果还证实了超级TUNEL技术具有极高的灵敏度：其提供了检测直至仅一个单链DNA断裂的可行性。
实施例12
使用程序1检测悬浮液中的细胞中的DNA断裂，随后分离染色质。
在该实施例中，将HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R.Cook)接种在6孔板上，并在补充有10％FBS的DMEM中培养48小时，直到培养物达到100％的融汇度(细胞数目：每1个孔中1.2×106个)。接下来，用直接加入到生长培养基中的DNA损伤剂H2O2(终浓度：4mM)处理细胞。将细胞在37℃下在具有CO2水平控制的标准细胞培养箱中孵育30分钟。然后使用0.5ml胰蛋白酶收获未处理的对照细胞和受损细胞(H2O2)，并转移至1.5ml的埃彭道夫(eppendorf)管中。然后，通过加入0.5ml的补充有10％FBS的DMEM使胰蛋白酶失活。随后，将细胞在台式离心机(埃彭道夫离心机，5417C，转子：F45-30-11)中离心沉淀(spun down)(1700rpm，5分钟，室温)。将细胞沉淀重悬于PBS中，并再次离心沉淀(该洗涤步骤重复两次)。当上清液PBS被弃去时，将细胞重悬于剩余的PBS小滴中。随后，滴加冰冷的70％Et(OH)，并将细胞在-20℃下在Et(OH)中孵育30分钟。然后，根据程序1处理细胞，其中省略了步骤1、3、4、9，并且每个洗涤步骤和每个孵育之后进行离心。根据供应商的使用说明，使用APO-BRDU试剂盒(Phoenix Flow Systems,AU:1001)，使用TdT酶将BrdU连接至DNA的游离端部。接下来，将细胞在1％BSA的PBS溶液中封闭30分钟，随后执行与一抗[针对BrdU的小鼠单克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)、针对BrdU的兔多克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab152095)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在5％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂绿(Sigma,DUO92014)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。在标记后，将细胞沉淀重悬于50μl的10mM Tris(pH 8.8)中，并在台式离心机中离心沉淀(1分钟，14000rpm，室温)。将细胞重悬于10μl TE缓冲液(含1mM EDTA·Na2的10mM Tris-HCl)中，并煮沸15分钟(99℃)。将样品在冰上冷却，并在台式离心机中离心沉淀(1分钟，全速：14000rpm，室温)。收集全部上清液，在蒸馏水中稀释至总体积为40μl，并用于进一步的测量。
使用荧光分光光度计(配备有Xe灯的Hitachi F-7000)测量从未处理的对照细胞和受H2O2损伤的细胞获得的细胞提取物的荧光强度水平。测量荧光强度30秒(激发为480nm，发射为520nm)。
结果：
BrdU的掺入标识了被TdT酶识别的特定类型的DNA 3'-OH端部，当双链平端断裂或双链3'-突出断裂或单链空位出现时会存在所述特定类型的DNA 3'-OH端部。作为使用诸如H2O2等损伤剂处理的结果，游离DNA端部的数目增加，这导致掺入的BrdU分子的数目增加，并且根据程序1处理的样品中的总荧光强度信号增加(图13)。对照样品中测得的每DNA单位(1ng)的荧光强度是2.9×10-4a.u.，而用H2O2处理的样品中测得的每1ng DNA的荧光强度更高—3.19×10-4a.u.(表1)。
结论：
根据程序1的方法适用于定量检测和比较分析悬浮液中的细胞中的DNA损伤，然后提取染色质。
表1
实施例13
使用程序1和程序2的组合检测分离的染色质中的DNA断裂。
在该实施例中，将HeLa 21-4细胞(获自牛津大学的P.R.Cook)接种在6孔板上，并在补充有10％FBS的DMEM中培养48小时，直到培养物达到100％的融汇度(细胞数目：每1个孔中1.2×106个)。接下来，用直接加入到生长培养基中的DNA损伤剂H2O2(终浓度：4mM)处理细胞。将细胞在37℃下在具有CO2水平控制的标准细胞培养箱中孵育30分钟。然后使用0.5ml胰蛋白酶收获未处理的对照细胞和受损细胞(H2O2)，并转移至1.5ml的埃彭道夫管中。然后，通过加入0.5ml的补充有10％FBS的DMEM使胰蛋白酶失活。随后，将细胞在台式离心机(埃彭道夫离心机，5417C，转子：F45-30-11)中离心沉淀(1700rpm，5分钟，室温)。将细胞沉淀重悬于10mM Tris(pH 8.8)中，将一小份在悬浮液中的细胞(50μl)转移至新的1.5ml埃彭道夫管中，并在台式离心机中离心沉淀(1分钟，14000rpm，室温)。弃去上清液，并重复在相同体积(50μl)的10mM Tris(pH 8.8)中的洗涤步骤(在台式离心机中离心(1分钟，14000rpm，室温))。将细胞重悬于10μl TE缓冲液(含1mM EDTA·Na2的10mM Tris-HCl)中，并煮沸15分钟(99℃)。将样品在冰上冷却，并在台式离心机中离心沉淀(1分钟，全速：14000rpm，室温)。收集全部上清液(包含从细胞中提取的染色质)。通过加入8μl异丙醇来沉淀上清液中的DNA，然后在台式离心机中离心(1分钟，全速：14000rpm，室温)。将DNA重悬于5μl的70％Et(OH)中，并在台式离心机中离心沉淀(1分钟，全速：14000rpm，室温)。弃去上清液。根据程序1处理样品，其中步骤1是上述步骤的一部分，该部分导致生物材料的分离，从而导致DNA端部的可及性提高。省略了步骤2、3和4。在步骤5中，通过以下方式来修饰DNA端部：将分离的DNA重悬在含有以下物质的改良反应混合物中：DNA聚合酶I(大肠杆菌)(NEBiolabs，MO209)、1x NEBuffer2(NEBiolabs，B7002S)、TdT(Phoenix Flow Systems，AU：1001)以及反应缓冲液(Phoenix Flow Systems，AU：1001)、dNTP混合物(Jena Bioscience，N6-(6-氨基)己基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸-生物素(生物素-7-dATP)：NU-835-BIO-S，生物素-16-炔丙基氨基-dCTP：NU-809-BIO16，dGTP：NU-1003)和BrdU(Phoenix Flow Systems，AU：1001)、超纯蒸馏水(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，10977-035)。将该悬浮液在37℃下孵育30分钟。如程序2的步骤5c中所述，使用Tris-HCl终止聚合酶反应。将悬浮液转移到用链霉亲和素预孵育、覆盖生物素的玻璃盖片(cover glass)(Bio-02，MicroSurfaces,Inc.)，并在室温下孵育30分钟以将分离的经修饰的DNA(具有掺入的BrdU和生物素化的核苷酸)在玻璃盖玻片上固定化。接下来，将固定化的DNA在1％BSA的PBS溶液中封闭30分钟，随后执行与一抗[针对BrdU的小鼠单克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab8039)、针对BrdU的兔多克隆抗体(稀释度：在1％BSA中1:100)(Abeam，ab152095)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在5％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂绿(Sigma,DUO92014)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo FisherScientific)，10977-035)中准备酶促反应。在处理后，使用Leica TCS SP5共焦显微镜，通过对在玻璃盖片上固定化的固定化的经修饰的DNA的荧光图像进行成像，来测量从未处理的对照细胞和受H2O2损伤的细胞获得的细胞提取物的荧光强度水平(针对检测结合至DNA游离端部的BrdU：激发：488nm，发射：498-540nm)。
结果：
作为使用诸如H2O2等损伤剂处理的结果，游离DNA端部的数目增加。这导致根据程序1和程序2的组合处理的样品中掺入的BrdU分子的数目增加并且总的整合荧光强度信号增加。对于每个样品，使用ImageJ软件确定平均灰度值(荧光强度)。对照样品中测得的荧光强度为6.0±0.1a.u.，而用H2O2处理的样品中测得的荧光强度为8.9±0.1a.u.。未配对的两样品t检验表明，对照样品和经H2O2处理的样品之间的均值差异是统计学上显著的(p值<0.001)。
结论：
根据程序1和程序2的组合的方法适用于对分离的染色质中的DNA损伤进行定量检测和比较分析。
实施例14
使用程序2来检测固定的U2-OS细胞中的DNA端部，其中在固定之前提高了DNA端部
的可及性。
在该实验中，在检测之前，将U2-OS细胞接种在18mm盖玻片上(细胞数目：每1张盖玻片3.5×104个)，并在补充有10％FBS的DMEM中培养。将细胞培养72小时。随后，根据程序2处理细胞。在固定之前，将细胞与1mM Tris在37℃下一起孵育20分钟。在孵育期间，监测细胞的形态。下一步骤包括用70％Et(OH)进行固定(过夜孵育；-20℃)。之后，根据程序2中提供的说明，使用内源性生物素封闭试剂盒(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，E21390)对样品进行预封闭。在室温下将样品在10mM EDTA的水溶液中孵育30分钟后，将样品用蒸馏水快速冲洗，并与切口平移法反应混合物[1x NEBuffer2(NEBiolabs，B7002S)、30uM的每种dNTP(Jena Bioscience，N6-(6-氨基)己基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸-生物素(生物素-7-dATP)：NU-835-BIO-S、生物素-16-炔丙基氨基-dCTP：NU-809-BIO16、生物素-16-5-氨基烯丙基-dUTP：NU-803-BIO16，dGTP：NU-1003)、每片盖玻片3个单位的DNA聚合酶I(大肠杆菌)(NEBiolabs，MO209)、超纯蒸馏水(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,10977-035)]在37℃下在潮湿室中一起孵育1h。之后，将样品在4℃下在1％BSA的PBS溶液中孵育过夜。接下来，将样品在4℃下在1％BSA的PBS溶液中孵育过夜，随后执行与一抗[小鼠单克隆抗生物素[Hyb-8](稀释度：1％BSA中1:100)(Abeam，ab201341)、兔多克隆抗生物素(稀释度：1％BSA中1:100)(Abeam，ab53494)]一起孵育。对于进一步处理，使用以下试剂：PLA探针：
原位
探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG(H+L)(Sigma,DUO82004，试剂盒：DUO92004)和
原位
探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG(H+L)(Sigma,DUO82002，试剂盒：DUO92002)；将PLA探针在5％BSA中稀释。PLA检测：使用
原位洗涤缓冲液(Sigma,DUO82049)洗涤样品。荧光信号是使用
原位检测试剂红(Sigma,DUO92008)生成的。在无RNA酶/DNA酶的超纯蒸馏水(Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)，10977-035)中准备酶促反应。在处理后，将样品使用Leica TCS SP5共焦显微镜(激发：594nm，发射：605-700nm)成像并分析。
结果：
在获得的图像(图14)中，能够检测到不同数目的荧光焦点。焦点特异性定位在细胞核内。
结论：
通过将活细胞用Tris溶液孵育能够获得提高活细胞中染色质的可及性的方式。所述程序中的该步骤能够通过显著的染色质松弛而显著提高细胞中DNA损伤检测的效率。结果证实，在程序2中加入此步骤会导致可靠的数据，所述可靠的数据证明了在固定之前用Tris处理活细胞能够作为提高样品中DNA端部的可及性的替代方式。
上述实施例公开了本发明的方法。如在另一方面中，本发明还提供了滚环复制用于标识单个DNA端部的存在和位置的用途，以及所述方法用于检测生物材料中的一个或多个DNA端部的用途，对于本领域技术人员而言应该清楚的是，上述实施例是本发明的与用途有关的方面的等同代表，并且为了描述的简洁性，不再对它们进行赘述。
本领域技术人员还应意识到，本发明容许进行多种修改、变更、改变、替换，并且实施例中所示的特征可以根据特定需要适当地组合，所有这些都将被如所附权利要求所限定的保护范围所涵盖。
Claims (68)
1.一种检测生物材料中的一个或多个DNA端部的方法，所述方法包括以下步骤I-III和所述步骤I-III中的每一者的子步骤a-h中的至少一者：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或裂解和/或分离和/或分级和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰，进行化学或物理处理，随后藉由催化手段或非催化手段使1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的所述生物材料与至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与所述1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使合适的4型和/或5型分子与所述2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子，
其中当执行步骤I的多于一个子步骤a-c时，它们可以以任何次序发生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个DNA端部是包括单链断裂或双链断裂在内的任何一个或多个DNA断裂的结果。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一个或多个DNA断裂选自单链切口、单链空位、单个磷酸二酯键的单链断裂、双链平端断裂、双链3'突出断裂、双链5'突出断裂、包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA链断裂在内的DNA链断裂类型。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个DNA端部的检测是原位执行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料是活的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料被固定。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述生物材料选自包括以下的组：动物、植物、原生动物、细菌细胞、病毒、组织，以及它们的片段和/或组分。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述生物材料是由膜包围的细胞或组织或它们的片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其中子步骤c在步骤I中执行。
10.根据权利要求5所述的方法，其中在步骤I的子步骤a之前，执行提高一个或多个DNA端部的可及性的附加步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物材料存在于溶液中或存在于多孔表面或固体支持物上。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述固体支持物或多孔表面的类型选自包括以下的组：玻璃、塑料、水凝胶、气凝胶金属和陶瓷。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述1型分子选自包括以下的组：卤代核苷酸或核苷分子，诸如BrdU，IdU，CldU，或DNA前体类似物，诸如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，F-ara-EdU，5-乙炔基-2'-脱氧胞苷，或生物素化的核苷酸分子，ADP-核糖分子，或用标记物标记的蛋白质分子、核苷酸或核苷分子，所述标记物选自包括以下的组：荧光分子，或化学发光分子，或放射性同位素，或酶底物，或生物素分子，1型分子还选自包括以下的组：能够与一个或多个DNA或RNA端部结合并用作结合2型或3型分子的靶标的任何其他分子，或任何其他酶底物，或它们的类似物，或寡聚物，或聚合物中的任何，或其组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述2型分子和3型分子独立地选自包括以下的组：抗体或其片段、链霉亲和素、亲和素、生物素分子或其类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗原、反应性分子如叠氮化物、寡聚物、聚合物，以及上述物质的任何类似物，或它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：与具有这样的序列的核酸(1型寡核苷酸)共价连接的抗体，所述序列允许与其他寡核苷酸(2型寡核苷酸)相互作用(所选区域的杂交)，它们的连接，以及随后的RCA反应。
16.根据权利要求1所述的方法，其中4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：抗体链霉亲和素、亲和素、生物素、链霉亲和素类似物、生物素类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗体片段、抗原、反应性分子如叠氮化物、寡聚物、聚合物，上述物质的类似物，或它们的组合。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述6型分子是标记的寡核苷酸(3型寡核苷酸)，所述标记的寡核苷酸能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中7型分子是这样的分子，所述分子能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物，并且能够用作携带分子特征码或能够生成分子特征码的其他分子的结合靶标。
19.根据权利要求1所述的方法，其中通过加入与所述6型分子结合的所述7型分子来改善步骤III中子步骤g的扩增。
20.根据权利要求19所述的方法，其中将所述7型分子用选自包括以下的组的标记物标记：荧光化学发光分子、放射性同位素、酶底物、生物素、纳米粒子。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化手段包括非酶促手段或酶促手段。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶促手段选自包括以下的组：DNA聚合酶I、TdT、克列诺片段、Phu聚合酶、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、RNA聚合酶。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述非酶促手段选自包括以下的组：具有催化特性的化学因子。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述非酶促手段包括物理因子或生化因子。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述子步骤h的检测通过选自包括以下的组的技术执行：显微术，自动分析高细胞数目的方法，光谱学，包括荧光显微镜法(宽视野、共焦、多焦点、超分辨率、带弹射的显微镜法、激光扫描、高通量、高含量)，荧光测定法，用于吸收检测的透射光光学显微术，流式细胞术，细胞分选(FACS)，质谱法。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤III的子步骤g(i)中执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
28.根据权利要求1所述的方法，其中提高一个或多个DNA端部的可及性不引起DNA损伤。
29.根据权利要求1所述的方法，其中获得对单个DNA端部的检测。
30.根据权利要求1所述的方法，其中获取对单个DNA端部的存在和位置的标识。
31.根据权利要求1所述的方法，其中对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为核苷酸或其类似物的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与为一抗的至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子的不同类型的结合位点结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.使为二抗的合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与4型和5型分子连接的1型寡核苷酸杂交，随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
32.根据权利要求1所述的方法，其中对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为未修饰的核苷酸或生物素化的核苷酸的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与为一抗的至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子的不同类型的结合位点结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.使为二抗的合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与4型和5型分子连接的1型寡核苷酸杂交，随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
33.根据权利要求1所述的方法，其中对为细胞或组织的生物材料中的一个或多个DNA端部的检测包括以下步骤：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2型至4型和6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰：进行化学处理，随后藉由催化手段使为未修饰的核苷酸或生物素化的核苷酸的1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2型至4型和6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的生物材料与以下与1型寡核苷酸缀合的至少两种分子：为一抗的2型分子和为链霉亲和素的3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使为二抗的合适4型分子与2型分子接触，其中所述4型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与2型和3型分子连接的1型寡核苷酸杂交，或如果1型寡核苷酸未与2型分子缀合的话，则与3型和4型分子杂交，并随后执行2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子。
34.滚环复制用于标识单个DNA端部的存在和位置的用途。
35.以下步骤用于检测适当制备的生物材料中的一个或多个DNA端部的用途：
-使合适的4型和/或5型分子与2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与1型寡核苷酸缀合，
-加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
-通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。
37.根据权利要求36所述的用途，其中执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
38.根据权利要求35所述的用途，其中通过以下步骤制备所述生物材料：
-任选地，将所述生物材料固定和/或透化和/或分离和/或固定化，
-提高一个或多个DNA端部的可及性，
-任选地，封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点。
39.包括以下步骤I-III和所述步骤I-III的每一者的子步骤a-h中的至少一者的方法用于检测生物材料中的一个或多个DNA端部的用途：
I.制备所述材料
a.将所述生物材料固定和/或透化和/或裂解和/或分离和/或分级和/或固定化，
b.提高一个或多个DNA端部的可及性，
c.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
II.处理一个或多个DNA端部
d.通过以下方式对一个或多个DNA端部进行修饰，进行化学或物理处理，随后藉由催化手段或非催化手段使1型分子与所述一个或多个DNA端部结合，
e.封闭所述生物材料中2-6型分子的一个或多个非特异性结合位点，
III.识别和检测所述一个或多个经修饰的DNA端部
f.将来自步骤II的所述生物材料与至少两种分子：2型分子和3型分子一起孵育，所述至少两种分子以允许导致滚环扩增(RCA)反应的步骤的方式与所述1型分子结合，
g.通过以下方式检测一个或多个DNA端部：
i.任选地使合适的4型和/或5型分子与所述2型和3型分子接触，其中所述4型和/或5型分子与所述1型寡核苷酸缀合，
ii.加入2型寡核苷酸和连接酶，以允许所述加入的2型寡核苷酸与已经与所述4型和/或5型分子连接的所述1型寡核苷酸杂交，或如果所述2型和3型分子与所述1型寡核苷酸连接的话，则与所述2型和3型分子杂交，以及然后执行所述2型寡核苷酸的DNA连接，
iii.通过以下方式来执行扩增：加入聚合酶和核苷酸溶液以允许进行滚环扩增(RCA)反应，以及加入6型分子以允许所述6型分子与由此获得的RCA反应产物进行后续杂交，
h.检测所述6型分子，
其中当执行来自步骤I的多于一个子步骤a-c时，它们可以以任何次序发生。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述一个或多个DNA端部是包括单链断裂或双链断裂在内的任何一个或多个DNA断裂的结果。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述一个或多个DNA断裂选自单链切口、单链空位、单个磷酸二酯键的单链断裂、双链平端断裂、双链3'突出断裂、双链5'突出断裂、包括其中不存在3'-OH或5'-磷酸DNA端部的那些DNA链断裂在内的DNA链断裂类型。
42.根据权利要求39所述的用途，其中所述一个或多个DNA端部的检测是原位执行的。
43.根据权利要求39所述的用途，其中所述生物材料是活的。
44.根据权利要求39所述的用途，其中所述生物材料是固定的。
45.根据权利要求43或44所述的用途，其中所述生物材料选自包括以下的组：动物、植物、原生动物、细菌细胞、病毒、组织，以及它们的片段和/或组分。
46.根据权利要求43或44所述的用途，其中所述生物材料是由膜包围的细胞或组织或它们的片段。
47.根据权利要求46所述的用途，其中子步骤c在步骤I中执行。
48.根据权利要求43所述的用途，其中在步骤I的子步骤a之前，执行提高一个或多个DNA端部的可及性的附加步骤。
49.根据权利要求39所述的用途，其中所述生物材料存在于溶液中或存在于多孔表面或固体支持物上。
50.根据权利要求39所述的用途，其中所述固体支持物或多孔表面的类型选自包括以下的组：玻璃、塑料、水凝胶、气凝胶金属和陶瓷。
51.根据权利要求39所述的用途，其中所述1型分子选自包括以下的组：卤代核苷酸或核苷分子，诸如BrdU，IdU，CldU，或DNA前体类似物，诸如EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，F-ara-EdU，5-乙炔基-2'-脱氧胞苷，或生物素化的核苷酸分子，ADP-核糖分子，或用标记物标记的蛋白质分子、核苷酸或核苷分子，所述标记物选自包括以下的组：荧光分子，或化学发光分子，或放射性同位素，或酶底物，或生物素分子，1型分子还选自包括以下的组：能够与一个或多个DNA或RNA端部结合并用作结合2型或3型分子的靶标的任何其他分子，或任何其他酶底物，或它们的类似物，或寡聚物，或聚合物中的任何，或其组合。
52.根据权利要求39所述的用途，其中所述2型分子和3型分子独立地选自包括以下的组：抗体或其片段、链霉亲和素、亲和素、生物素分子或其类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗原、反应性分子如叠氮化物、寡聚物、聚合物，以及上述物质的任何类似物，或它们的组合。
53.根据权利要求39所述的用途，其中4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：与具有这样的序列的核酸(1型寡核苷酸)共价连接的抗体，所述序列允许与其他寡核苷酸(2型寡核苷酸)相互作用(所选区域的杂交)，它们的连接，以及随后的RCA反应。
54.根据权利要求39或53所述的用途，其中4型分子和5型分子独立地选自包括以下的组：抗体链霉亲和素、亲和素、生物素、链霉亲和素类似物、生物素类似物、配体、蛋白质、肽、核酸、抗体片段、抗原、反应性分子如叠氮化物、寡聚物、聚合物，上述物质的类似物，或它们的组合。
55.根据权利要求39所述的用途，其中所述6型分子是标记的寡核苷酸(3型寡核苷酸)，所述标记的寡核苷酸能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物。
56.根据权利要求39所述的用途，其中所述7型分子是这样的分子，所述分子能够识别并结合使用连接的2型寡核苷酸的选定序列作为模板形成的RCA反应产物，并且能够用作携带分子特征码或能够生成分子特征码的其他分子的结合靶标。
57.根据权利要求39所述的用途，其中通过加入与所述6型分子结合的所述7型分子来改善步骤III中子步骤g的扩增。
58.根据权利要求57所述的用途，其中将所述7型分子用选自包括以下的组的标记物标记：荧光化学发光分子、放射性同位素、酶底物、生物素、纳米粒子。
59.根据权利要求39所述的用途，其中所述催化手段包括非酶促手段或酶促手段。
60.根据权利要求59所述的用途，其中所述酶促手段选自包括以下的组：DNA聚合酶I、TdT、克列诺片段、Phu聚合酶、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、RNA聚合酶。
61.根据权利要求59所述的用途，其中所述非酶促手段选自包括以下的组：具有催化特性的化学因子。
62.根据权利要求39所述的用途，其中所述非酶促手段包括物理因子或生化因子。
63.根据权利要求39所述的用途，其中所述子步骤h的检测通过选自包括以下的组的技术执行：显微术，自动分析高细胞数目的方法，光谱学，包括荧光显微镜法(宽视野、共焦、多焦点、超分辨率、带弹射的显微镜法、激光扫描、高通量、高含量)，荧光测定法，用于吸收检测的透射光光学显微术，流式细胞术，细胞分选(FACS)，质谱法。
64.根据权利要求39所述的用途，其中所述2型和3型分子不与1型寡核苷酸缀合。
65.根据权利要求64所述的用途，其中在步骤III的子步骤g(i)中执行使合适的4型和5型分子与2型和3型分子接触。
66.根据权利要求39所述的用途，其中提高一个或多个DNA端部的可及性不引起DNA损伤。
67.根据权利要求39所述的用途，其中获得对单个DNA端部的检测。
68.根据权利要求39所述的用途，其中获取对单个DNA端部的存在和位置的标识。
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