JP7287395B2 - Ｄｎａ末端の検出方法及びその使用 - Google Patents

Ｄｎａ末端の検出方法及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は、分子診断及び生物医学の分野に含まれる。本発明は、ＤＮＡ損傷の検出及び／又は定量及び／又は定性分析の方法に関する。より正確には、本発明は、細胞核、又は単離された生体物質における一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断の誘導の結果として形成される異なる型の遊離ＤＮＡ末端の直接的な、高感度の、特異的及び効率的な認識及び／又は検出を可能にする。
生命が世代から世代へと継続していくためには、生物のゲノムはいかなる重大な変化もなく受け継がれなければならない。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を形成する核酸塩基の特有の配列の形態での遺伝情報の保存、及びその遺伝情報を、世代を通して伝達する能力は、全ての生きている生物の本質的な特徴である。細胞は、生きている生物の基本構造及び機能単位である。したがって、塩基の配列は、単一細胞の寿命の間、保存されなければならない。さらに、親細胞のＤＮＡは忠実にコピーされるべきであり、娘細胞に受け継がれる２つのコピーは同一であるべきである。しかしながら、ＤＮＡは確実に安定ではなく、生理学的条件下で発生する自然発生的な化学変化を受けやすい（Ｌｉｎｄａｈｌ Ｔ、Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｃａｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年４月２２日；３６２（６４２２）：７０９～１５頁）。ＤＮＡ損傷のようなＤＮＡ変化は種々の内因性及び外因性因子によって誘導され得る。内因性因子は細胞代謝及び呼吸の有害な副産物（例えば、活性酸素種）を含む。外因性因子には、種々の有害な化学物質（例えば、メチル化剤、酸化剤、又は架橋剤）、ＵＶ及び高エネルギー光子（Ｘ線、ガンマ線）、並びに重イオン及び粒子（例えば、ベータ又はアルファ粒子）が含まれる（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ Ｅｒｒｏｌ Ｃ．、Ｇｒａｈａｍ Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｗｏｌｆｒａｍ Ｓｉｅｄｅ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．Ｗｏｏｄ、ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ、２００５年）。
ＤＮＡは本質的に化学的に不安定であり、種々の因子によって絶えず損傷を受けているので、ゲノムの完全性を維持するには、特殊な監視及び修復機構が必要である。このような種々の保護機構は、地球上の遺伝情報をコードする主要及び特有の分子としてのＤＮＡと共に進化してきた。ＤＮＡが、高い割合のゲノム分解及び塩基配列の変化を誘導するその複雑な環境の有害な影響を受けるという事実にもかかわらず、単一の細胞分裂周期内に蓄積される突然変異の数は少ない（Ａｒａｔｅｎ ＤＪ、Ｇｏｌｄｅ ＤＷ、Ｚｈａｎｇ ＲＨ、Ｔｈａｌｅｒ ＨＴ、Ｇａｒｇｉｕｌｏ Ｌ、Ｎｏｔａｒｏ Ｒ、Ｌｕｚｚａｔｔｏ Ｌ、Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００５年９月１５日；６５（１８）：８１１１～７頁、Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００５年１１月１５日；６５（２２）：１０６３５頁）。突然変異率は、特殊な損傷検出及び修復機構の効率的な作用によって低く保たれる。修復機構の正確な作用を免れるゲノム分解のみが、体細胞突然変異をもたらし得る。修復されていないＤＮＡ損傷の蓄積はゲノムの完全性を損ない、種々の細胞機能不全、腫瘍性形質転換、又は死をもたらし得る。ゲノムの非致死的な変化は次の世代に受け継がれ、蓄積し、最終的に子孫の重篤な機能不全をもたらすことがある。形質転換細胞は、このような細胞のクローン及び悪性腫瘍の成長を生じ得るので、腫瘍性形質転換は最終的に生物全体のレベルに重大な結果を与え得る。
一部の場合、ＤＮＡ損傷から生じるごくわずかの細胞の死は、全生物に対して重大な結果、例えば、脳における他のものと置き換えられないニューロンの喪失をもたらし得る。ＤＮＡ損傷の蓄積はまた、ＤＮＡ複製ストレス、細胞の老化、及び細胞加齢として文献に記載されている種々の現象と直接関連している（Ｔｅｃｈｅｒ Ｈ、Ｋｏｕｎｄｒｉｏｕｋｏｆｆ Ｓ、Ｎｉｃｏｌａｓ Ａ、Ｄｅｂａｔｉｓｓｅ Ｍ、Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１７年７月１７日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ．２０１７．４６．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ Ｒｅｖｉｅｗ；Ｗｈｉｔｅ ＲＲ、Ｖｉｊｇ Ｊ、Ｄｏ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ Ｄｒｉｖｅ Ａｇｉｎｇ？ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、２０１６年９月１日；６３（５）：７２９～３８頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ、２０１６．０８．００４、Ｒｅｖｉｅｗ）。精子ＤＮＡの完全性は妊娠転帰に深刻な影響を及ぼすことがよく知られている（Ｅｖｅｎｓｏｎ ＤＰ、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｚ、Ｍｅｌａｍｅｄ ＭＲ：Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍａｌｉａｎ ｓｐｅｒｍ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｔｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８０年、２４０：１１３１～１１３３頁；Ｅｖｅｎｓｏｎ ＤＰ、Ｔｈｅ Ｓｐｅｒｍ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ（ＳＣＳＡ（登録商標））ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ、Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ、２０１６年６月；１６９：５６～７５頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｎｉｒｅｐｒｏｓｃｉ、２０１６．０１．０１７、Ｅｐｕｂ ２０１６年２月１７日；Ｒｅｘ ＡＳ、Ａａｇａａｒｄ Ｊ、Ｆｅｄｄｅｒ Ｊ、ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ：ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ、Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ、２０１７年７月；５（４）：６２２～６３０頁、ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｎｄｒ．１２３８１）。
多くの損傷因子はＤＮＡ切断を直接誘導するが、他の因子は、ＤＮＡ分子の不連続、すなわち、一本鎖及び二本鎖切断を最終的にもたらし得るＤＮＡ傷害を引き起こす。一本鎖切断又はニックは、ＤＮＡの一本鎖における２つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の破壊から生じる。二本鎖ＤＮＡ切断は、ＤＮＡの両方の相補鎖の不連続であり、ＤＮＡ鎖の対向する又は近接する位置においてヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合が切断される場合に生じる。二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）は最も危険なＤＮＡ傷害である一方で、一本鎖切断（ＳＳＢ）はより少ない有害作用をもたらすが、それらの数は二本鎖病変の数よりもはるかに多い。正常細胞における二本鎖切断はしばしば、両方の相補鎖において互いに近接して起こる１つより多くの一本鎖切断から生じる。二本鎖切断が誘導されると、ＤＮＡ末端は物理的に分離され得る。
いくつかの種類のＤＮＡ切断が知られている（Ｃｌａｒｋ Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｂ．、Ｍｉｎｚｈｉ Ｃｈｅｎ、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｍ．Ｋｏｃｈａｎｅｋ、Ｓｉｍｏｎ Ｃ．Ｗａｔｋｉｎｓ、Ｋｕｎ Ｌｉｎ Ｊｉｎ、Ｒｏｍｅｓｈ Ｄｒａｖｉａｍ、Ｐａｕｌａ Ｄ．Ｎａｔｈａｎｉｅｌ、Ｒｏｄｎｉｎａ Ｐｉｎｔｏ、Ｄｏｎａｌｄ Ｗ．Ｍａｒｉｏｎ、及びＳｔｅｖｅｎ Ｈ．Ｇｒａｈａｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、２００４年７月、１８（７）：６７５～６８９頁）。
一本鎖ニック（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
一本鎖ギャップ（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
単一のホスホジエステル結合の一本鎖切断（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
二本鎖平滑末端切断（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
二本鎖３’－突出切断（オーバーハング３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
二本鎖５’－突出切断（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在する場合）
ＤＮＡ鎖の「損傷した」末端を伴うＤＮＡ切断（３’－ＯＨ ＤＮＡ鎖末端が存在しない場合）
ＤＮＡ鎖切断は、ＤＮＡ複製、転写、スーパーコイルの緩和、遺伝子再構成、ＤＮＡ損傷修復などのような、多くの正常な内因性細胞プロセスの間に起こる。このような鎖切断は、通常、特殊な酵素によって直ちにライゲートされる。
修復されていないＤＳＢの発生は、ゲノムのいずれかの場所に位置する部分的相同性のＤＮＡ領域との組換えを開始し得る及び／又はそれに関与し得る、保護されていない反応性ＤＮＡ末端を生じる。これは、染色体の欠失、転座、融合及び切断、染色体の環化、ミニ染色体の出現などのような、ゲノムにおける様々な再構成を生じ得る。
ＤＮＡ鎖切断は、様々な種類の障害と関連し得るか、又は分子修復機構の突然変異及び機能不全に起因し得る、既存の基礎障害の徴候であり得る。ＤＮＡ鎖切断の蓄積は、がん、例えば結腸、乳房、皮膚又は前立腺、アルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病を含む神経変性障害、並びに疾患、例えば脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、２型糖尿病、クロイツフェルト・ヤコブ病、及び筋強直性ジストロフィー、並びに多くの他の障害を含む、種々の疾患の発生と関連し得る。
細胞核における一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ切断の存在、数及び位置についての認識、並びに特定の種類の病変を識別する能力が、生物の細胞及び組織のＤＮＡの質を評価するため、並びにＤＮＡ損傷誘導及びその修復の機構を研究し、理解するために必要とされる。ＤＮＡ切断の数の測定及びＤＮＡ切断の核内局在の決定が、種々の内因性及び外因性因子の遺伝毒性の可能性を評価するために必要とされる。さらに、ＤＮＡ断片化の程度に反映される生体物質の質の分析は、生物が生存する環境条件の分析におけるマーカーとして機能し得る。ＤＮＡ切断の決定は、ヒト及び他の生物の生殖細胞の質を評価するためのパラメーターとして機能し得る。
細胞ＤＮＡにおけるＤＮＡ切断は、当該技術分野において公知のいくつかの既存の方法、例えば以下によって検出することができる：
切断が誘導されたときに露出されるＤＮＡ末端の直接検出及びｉｎ ｓｉｔｕ同定（例えば、ポリメラーゼＩ媒介ニックトランスレーションアッセイ、ポリメラーゼＩ媒介ニック末端標識化アッセイのクレノウ断片、又はＴＵＮＥＬアッセイとして知られているターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識化アッセイ）
ＤＮＡ傷害に動員される修復因子の検出（例えば、ＤＳＢについては５３ＢＰ１又はＳＳＢについてはＸＲＣＣ１）
ＤＮＡ切断に特異的な後成的クロマチン修飾の検出（現在、γＨ２Ａ．Ｘ－セリン１３９におけるヒストンＨ２Ａ．Ｘのリン酸化のみ）
生化学的方法による抽出物質におけるＤＮＡ末端の検出（例えば、コメットアッセイ（Ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ）、又はアルカリ溶出アッセイ、又はフィルター溶出アッセイ（Ｋｏｈｎ Ｋｕｒｔ Ｗ．、Ｌｅｏｎａｒｄ Ｃ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、Ｒｅｇｉｎａ Ａ．Ｇ．Ｅｗｉｇ、及びＣｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｌｕｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７６年、１５（２１）、４６２９～４６３７頁；ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｓｉｔｕ，Ｅｘ Ｖｉｖｏ，ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ（２０１１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、編集者：Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｖ Ｄｉｄｅｎｋｏ）
ｉｎ ｓｉｔｕでの酸誘導ＤＮＡ変性に対するＤＮＡの感度の程度によって測定されるＤＮＡ断片化の全体的な程度の検出（例えばＳＣＳＡ試験）
間接アプローチ（γＨ２Ａ．Ｘ、ＸＲＣＣ１、５３ＢＰ１）は少数のＤＮＡ切断の検出を可能にするが、現在、生細胞又は固定細胞において、個々のＤＮＡ切断を直接的に検出する方法は存在しない。
ＤＮＡ末端の直接標識化及び検出に基づく方法は全て低い感度によって特徴付けられ、すなわち、それらの方法は無傷細胞又は処理された生体物質における個々のＤＮＡ切断を検出することができない。当業者に周知のＴＵＮＥＬアッセイはアポトーシスの間に多数（おそらく数百以上）のＤＮＡ切断を容易に検出することができるが、個々のＤＮＡ二本鎖切断、又は少数（１０程度）のこれらの切断からなる群さえも検出することができない。
典型的な毎日の内因性及び外因性因子により誘導される鎖切断に曝露された人体のほとんどの細胞は、少数の二本鎖切断（γＨ２Ａ．Ｘの免疫標識化によって検出される場合、任意の所与の時点においておよそ０～１０（Ｒｙｂａｋ Ｐ、Ｈｏａｎｇ Ａ、Ｂｕｊｎｏｗｉｃｚ Ｌら、Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２ＡＸ ｏｎ ｓｅｒｉｎｅ １３９（γＨ２ＡＸ）ｉｓ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１６年；７（３１）：４９５７４～４９５８７頁））、及びやや多い数の一本鎖切断を示す。抗体を産生する細胞においてのみ、ＤＮＡ切断は損傷の原因とならないが、遺伝子再構成の天然のプロセスの構成要素である。ＤＮＡ切断の数は、プログラム細胞死（アポトーシス）のプロセスを経ている細胞において非常に多い。二本鎖切断は通常、数時間も続くプロセスにおいて修復され、一方、一本鎖切断はしばしば数分以内に迅速に修復される。したがって、任意の所与の時点においてヒト体細胞に存在する両方の型のＤＮＡ切断の数は通常、３０を超えない（γＨ２Ａ．Ｘ及びＸＲＣＣ１修復因子の蓄積の免疫標識化によって検出された（Ｂｅｒｎｉａｋ Ｋ．、Ｒｙｂａｋ Ｐ．、Ｂｅｒｎａｓ Ｔ．、Ｚａｒｅｂｓｋｉ Ｍ．、Ｂｉｅｌａ Ｅ．、Ｚｈａｏ Ｈ．、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｚ．、Ｄｏｂｒｕｃｋｉ Ｊ．Ｗ．：Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ３Ｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ａ、２０１３年；８３：９１３～２４頁；Ｒｙｂａｋ Ｐ、Ｈｏａｎｇ Ａ、Ｂｕｊｎｏｗｉｃｚ Ｌら、Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２ＡＸ ｏｎ ｓｅｒｉｎｅ １３９（γＨ２ＡＸ）ｉｓ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６年；７（３１）：４９５７４～４９５８７頁；Ｓｏｌａｒｃｚｙｋ Ｋ．Ｊ．、Ｋｏｒｄｏｎ Ｍ．、Ｂｅｒｎｉａｋ Ｋ．、Ｄｏｂｒｕｃｋｉ Ｊ．Ｗ．：Ｔｗｏ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ＸＲＣＣ１ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｗｏ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ＸＲＣＣ１ ｆｏｃｉ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖｉｓｉｂｌｅ ｌｉｇｈｔ， ｏｒ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ、ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ （Ａｍｓｔ）．、２０１６年；３７：１２～２１頁）。生理学的条件下で体細胞において出くわす典型的な少数のＤＮＡ切断は、ＴＵＮＥＬ、又は任意の他の確立された直接検出アプローチによって検出することができず、定量することができない。既存の方法は全て、従来の免疫蛍光標識化（ＴＵＮＥＬを含む）に基づいており、したがって、それらの方法の特異性は限定され、一次及び二次抗体の特異性に大きく依存するが、これらの方法の感度はかなりの非特異的バックグラウンドシグナルの存在によって限定される（特異的シグナルの強度が非特異的シグナルの強度を十分に超えない）。
動員された細胞ＤＮＡ損傷応答因子（例えば５３ＢＰ１又はＸＲＣＣ１）を検出する手段によるＤＮＡ切断の間接的検出は以下の制限を有する：（ｉ）動員されたタンパク質分子の数が免疫蛍光のような一般的に使用される方法によって検出されるには少なすぎる場合がある、（ｉｉ）免疫蛍光は、抗体の制限された特異性に起因して、しばしば完全に特異的ではない、（ｉｉｉ）検出の感度は、種々の細胞成分に対する二次抗体の非特異的結合から生じるシグナルバックグラウンドの存在によって制限される、（ｉｖ）修復因子の動員は、ＤＮＡ切断の不在下で活性化され得るか、又は修復能力の飽和条件下で阻害され得るか若しくは不在であり得るか、又は修復系自体が損傷されるか若しくは損なわれる場合、それによって偽陽性若しくは偽陰性の結果が生じ得る。ＤＮＡ切断をマーキングする蛍光によりタグ化された修復タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ－５３ＢＰ１）の検出は、生細胞において実施することができるが、これは通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において、融合タンパク質の過剰発現の条件下で、高度に操作され、トランスフェクトされた細胞において行われる。患者の身体に由来する新鮮な細胞の損傷部位における蛍光によりタグ化されたタンパク質の蓄積を検出する手段によるＤＮＡ切断の数の測定は不可能である。
ヒストンＨ２Ａ．Ｘのリン酸化（γＨ２Ａ．Ｘ）の免疫検出に基づく二本鎖切断の検出は、天然の生体シグナル増幅に起因して高感度であるので、他の方法の中でも例外である。すなわち、１つのＤＳＢは切断の近くで最大で１００万個のヒストン残基のリン酸化を誘導する。しかしながら、今日まで、この増幅を利用する能力は、種々の細胞標的に対する一次及び二次抗体の非特異的結合、並びに結果として生じる非特異的シグナルを含む、免疫蛍光法の上述の欠点によって妥協されている。セリン１３９におけるヒストンＨ２Ａ．Ｘのリン酸化はＤＳＢの検出のためのゴールドスタンダードとして一般に使用されているが、最近、この方法はＤＮＡにおけるＤＳＢに関して限定された特異性を有することが知られるようになった。いくつかの研究グループによって、ヒストンＨ２Ａ．Ｘのヒストンリン酸化は二本鎖切断以外の病変によって誘導され得ることが実証されている（Ｃｌｅａｖｅｒ ＪＥ１．γＨ２Ａｘ：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｄａｍａｇｅ ｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ ｉｎ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ 「ａｌｌ ｔｈａｔ ｇｌｉｔｔｅｒｓ ｉｓ ｎｏｔ ｇｏｌｄ！」、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、２０１１年１１月～１２月；８７（６）：１２３０～９頁；Ｒｙｂａｋ Ｐ、Ｈｏａｎｇ Ａ、Ｂｕｊｎｏｗｉｃｚ Ｌら、Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２ＡＸ ｏｎ ｓｅｒｉｎｅ １３９（γＨ２ＡＸ）ｉｓ ｎｏｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１６年；７（３１）：４９５７４～４９５８７頁）。これら及び他の公開されたデータは、この方法がＤＳＢに対して限定された特異性しか示さないという事実を証明する。最後に、切断が近接して位置する場合、多数のリン酸化されたＨ２Ａ．Ｘ分子を表す免疫蛍光シグナルが、顕微鏡画像において大きなスポット（数百ナノメートルから１マイクロメートルまでの直径）として現れるため、切断は個々の実体として検出することができない。
ＤＮＡ損傷の分析において使用されるいくつかの生化学的方法もまた、当該技術水準において公知である。しかしながら、これらの公知の技術にはいくつかの制限がある。例えば、コメットアッセイは個々の細胞における多数のＤＮＡ切断を検出するために使用される。このコメットアッセイはＤＮＡ損傷の一般的なレベル、及び細胞集団内の損傷の分布の推定に有用であるが、個々のＤＮＡ切断を検出するのに十分な感度を有さない。このコメットアッセイは、細胞溶解を必要とするので、ＤＮＡ損傷の型、及び核構造に関するＤＮＡ切断の局在化に関する情報を全く提供しない。
ＤＮＡ損傷を評価する、広範に使用されているアルカリ溶出アッセイにはいくつかのバージョンがあるが、この方法はプロセスにＤＮＡ切断を導入することができることが知られている（Ｔｉｃｅ ＲＲ、Ａｇｕｒｅｌｌ Ｅ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｄ、Ｂｕｒｌｉｎｓｏｎ Ｂ、Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｈ、Ｍｉｙａｍａｅ Ｙ、Ｒｏｊａｓ Ｅ、Ｒｙｕ ＪＣ、Ｓａｓａｋｉ ＹＦ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｇｅｌ／ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ：ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｔｅｓｔｉｎｇ、Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ、２０００年；３５（３）：２０６～２１頁）。
当該技術水準の既存の知識に基づいて、個々のＤＮＡ切断の高感度かつ特異的な検出は、ＴＵＮＥＬアッセイにおいて行われるように、ＤＮＡ末端に特異的に付着した分子の検出を利用することを予想することは合理的である。このような付着した分子の数は少なくなり得る（１個又は数個のみ）ので、このような分子の検出の非常に高感度の方法が利用されなければならないことを予想することは論理的である。質量分析、マスサイトメトリー（フローサイトメトリーと組み合わせた質量分析）、エネルギー分散型Ｘ線微量分析（ＥＤＸＭＡ、ＥＤＸＡ）、又は免疫蛍光、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、二分子蛍光相補アッセイ（ＢｉＦｃ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、単一分子蛍光検出、分光法及び画像化を含む蛍光ベースの方法の種々の種類を含む、種々の分子、又は分子の複合体、又はそれらの相互作用の特異的検出を可能にする多数の非常に高感度の技術が、当該技術分野において公知である。これらのアプローチ（上記に説明したような免疫蛍光を含む）のいずれも、細胞内のクロマチン、又は単離されたクロマチンにおけるＤＮＡ末端に付着したタンパク質又はヌクレオチド類似体を含む、個々の分子の検出に直接適用することはできない。
ＤＮＡ切断の上述の検出方法、及びＤＳＢ又はＳＳＢの検出に適用できる可能性がある方法はまた、特許及び非特許文献に広範に記載されている。
例えば、国際公開第９７０８３４５号公報に記載されている発明は、基礎研究、医学診断試験、及び法医学試験のためのＤＮＡ検出の分野に関する。想起された公報に記載されている方法は、以前の段落において言及されているＴＵＮＥＬアッセイの基礎を構成する。この発明によれば、ＤＮＡ鎖は、臭素化デオキシウリジン三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）などのハロゲン化デオキシヌクレオチド三リン酸、及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの、ＤＮＡ鎖の３’－ＯＨ末端へのハロゲン化デオキシヌクレオチドの付加を触媒することができる酵素と最初にインキュベートされる。次いで、得られた修飾ＤＮＡ鎖は、ハロゲン化デオキシヌクレオチドと特異的に結合する、蛍光化されたモノクローナル抗体などの標識された抗体とインキュベートされる。次いで、標識が、フローサイトメトリー、顕微鏡法、又は多重パラメーターレーザー走査顕微鏡法によって検出される。この方法は、アポトーシス、ＤＮＡ合成及び／又は修復を検出するのに有用であり、ＤＮＡ末端標識化のための一般的な方法として有用であるが、個々又は少数のＤＮＡ末端を検出することはできない。以前の段落に記載されていることによれば、この発明は、細胞におけるＤＮＡ切断の検出のために使用される場合、細胞アポトーシスの間に生じる数百の二本鎖切断の検出に専用である。科学文献において実証されているように、その感度は、個々のＤＮＡ傷害の検出を可能にするには低すぎる。この低い感度の主な理由は、その文書の前半に説明されているように、このアッセイが高レベルの非特異的シグナルをもたらす免疫蛍光染色の標準的な方法に基づいているという事実である。
ＤＮＡ損傷検出のための改変された近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）の使用に関して特許及び特許出願においていくつかの開示が存在する。簡潔に述べると、ＰＬＡ技術は、一対のオリゴヌクレオチド標識化抗体、又は複合体を形成する２つの分析物の異なるエピトープ、若しくは同じ分析物に近接して（１０～４０ｎｍ離れて）結合する他の分子を利用する。このアッセイは一般に、タンパク質－タンパク質複合体の局在化された検出、可視化及び定量化、又はタンパク質の高感度の検出のために使用されることが主に推奨されている。２つの周知の方法を組み合わせるこの技術は、いわゆる「近接プロービング（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｐｒｏｂｉｎｇ）」の原理に依存し、ここで、分析物は２つのプローブの結合によって検出され、この２つのプローブが、分析物と結合することによって近接する場合（したがって、「近接」プローブ）、シグナルを生成することが可能となる（例えば、米国特許第８０１３１３４ Ｂ２号、米国特許第７３０６９０４ Ｂ２号、米国特許出願公開第２００８／０２９３０５１号、又は国際公開第１６１０６２９８ Ａ１号を参照のこと）。このアプローチはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応（例えば、欧州特許第１９９７９０９号、米国特許第７，８８，８４９号又は米国特許第７，７９０，３３８号を参照のこと）を利用し、このローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応は２つのプローブに由来するシグナルを増幅させる。近接プロービングとＲＣＡとの前記組合せもまた、当該技術分野において公知である。例えば、国際出願である国際公開第２０１２／１６００８３ Ａ１号は、多重近接ライゲーションアッセイによって、少なくとも３つの標的基質のうちのいずれか２つ、若しくは標的基質の少なくとも３つの特徴のうちのいずれか２つの間の相互作用若しくはそれらとの相互作用、又は標的基質の相互作用と特徴との組合せを検出するための方法を開示しており、前記方法は、ａ）少なくとも３つの標的基質又は特徴の各々について、前記基質における特徴又は結合部位に対する親和性を有する結合部分、及び結合部分と結合している近接プローブオリゴヌクレオチドを含む近接プローブを準備するステップであって、近接プローブオリゴヌクレオチドの各々は特有のタグ配列を有する、ステップ；ｂ）結合部分を介する前記基質の各々における近接プローブのそれぞれの結合部位又は特徴との各々の近接プローブの結合を可能にする条件下で、近接プローブを試料と混合するステップ、ｃ）工程ｂ）と同時に、又は工程ｂ）の後、任意の２つの近接プローブが基質において互いに十分に近接して結合する環状ＤＮＡ分子を形成するステップであって、環状ＤＮＡ分子の各々は、２つの近接プローブオリゴヌクレオチド由来の特有のタグ配列に対する相補的配列を含む、ステップ；ｄ）環状ＤＮＡを増幅するステップ；及びｅ）増幅したＤＮＡを特徴付けるステップを含む。ＰＬＡ技術に関する多くの異なる解決策に関しては、米国特許出願公開第２０１１２２３５８５Ａ号、米国特許出願公開第２０１４１９４３１１Ａ号、米国特許出願公開第２００４２４８１０３Ａ号、又は米国特許出願公開第２００３００８３１３Ａ号も参照のこと。
しかしながら、いずれかの型のＤＮＡ切断の結果として生じるＤＮＡ末端の直接検出のために、前記解決策、すなわちＰＬＡ技術を使用している実施形態は存在しない。さらに、ＤＮＡ損傷検出におけるＰＬＡ技術の簡単な適用は、唯一の型のＤＮＡ切断の部位においてのみ生じる特定のタンパク質を標的とするプローブを必要とし、上述のように、同じタンパク質が複数の機能を有し得るので、ＤＮＡ切断以外の部位でのタンパク質の存在の可能性が非常に高い。
刊行物「Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｇｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ（２０１７年）１６、４２２～４２７頁並びにＡｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｇａｌｂｉａｔｉ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ及びＦａｂｒｉｚｉｏ ｄ’Ａｄｄａ ｄｉ Ｆａｇａｇｎａは、細胞におけるＤＳＢの検出及び画像化に関する「ＤＮＡ損傷ｉｎ ｓｉｔｕライゲーション後の近接ライゲーションアッセイ（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）」（ＤＩ－ＰＬＡ）と名付けられた方法を開示している。ＤＩ－ＰＬＡは、抗ビオチン抗体によって次に認識される、ビオチン化二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとのライゲーションによる、ｉｎ ｓｉｔｕでの固定細胞における遊離ＤＮＡ末端の捕捉に基づく。検出は、上述の抗体と、ＤＳＢの部位におけるＤＮＡ損傷応答（γＨ２ＡＸ又は５３ＢＰ１）のプロセスに関与するパートナータンパク質を認識する抗体との組合せのためのＰＬＡ技術を使用することによって増強される。前記ＤＩ－ＰＬＡ法の検証は、培養した細胞及び組織において種々の遺伝子毒性損傷によって誘導されたＤＳＢを検出するその能力を実証することによって実施した。しかしながら、この方法は、ヒストンＨ２ＡＸリン酸化によってマークされたか、又は修復因子５３ＢＰ１が動員された二本鎖ＤＮＡ切断にのみ使用することができ、したがって、その使用は限定される。第１に、この方法は、ＤＮＡ損傷修復に関与するヒストン修飾又はタンパク質の同時検出を必要とするので、ＤＮＡ切断の直接検出の機会を提供する技術ではない。第２に、この方法は、細胞タンパク質修復機構によって認識されていないか、又は機能不全の修復機構に供されるＤＮＡ切断の検出において使用することができない。
Ｈａｎｉｆ Ｒａｓｓｏｏｌｚａｄｅｈ、Ｃｈｒｉｓｔｏｓ Ｃｏｕｃｏｒａｖａｓ ＆ Ｍａｒｉａｎｎｅ Ｆａｒｎｅｂｏ、「Ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ａｔ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ＷＲＡＰ５３β ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ γＨ２ＡＸ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＮＦ８ ａｎｄ ＭＤＣ１」、Ｎｕｃｌｅｕｓ、６：５、４１７～４２４頁、２０１５年の刊行物では、ＤＮＡ二本鎖切断においてＷＲＡＰ５３ｂがγＨ２Ａ．Ｘに近接して蓄積することを示すためにＰＬＡアッセイが使用された。より重要なことに、この文献は、従来の免疫蛍光を使用して検出することが困難である、修復因子の動員及びＤＮＡ切断における複合体形成の分析のためのより感度の高い方法としてＰＬＡを強調している。それにもかかわらず、二本鎖切断のみが、この改変されたＰＬＡ法によって検出され得る。さらに、二本鎖切断は、２つの特定の修復因子（ＲＮＦ８及びＭＲＣ１）がＤＮＡ損傷部位に存在する場合にのみ検出され得る。さらに、この修飾は、細胞内に天然に存在するタンパク質間の相互作用に基づいており、この修飾は、ＤＮＡ損傷部位とは異なる部位でのこれらのタンパク質及びそれらの複合体の存在の可能性に起因して偽陽性結果をもたらし得る。したがって、この刊行物に提示される方法は、十分に特異的ではなく、その適用は、修復機構によって認識されるという条件で、１つの特定の型のＤＮＡ二本鎖切断のみに限定される。
国際公開第１２０８０５１５Ａ１号に記載されている発明は、電離放射線に曝露された対象の細胞におけるＤＮＡ損傷のレベルを決定するための方法であって、（ａ）前記対象から得られた細胞を含む試料を、ＤＮＡ修復フォーカスに存在する同じ又は異なるタンパク質（複数可）におけるエピトープと結合する少なくとも２つの抗体、アプタマー、又はアンチカリンと接触させるステップ；（ｂ）前記試料を少なくとも第１及び第２の近接プローブと接触させるステップであり、第１及び第２の近接プローブの各々は、前記抗体、アプタマー、又はアンチカリンに対する親和性を有する結合部分、及びそれらに結合した反応性官能基として作用する核酸を含む、ステップ；（ｃ）前記近接プローブの結合部分が、前記抗体、アプタマー、又はアンチカリンと結合することを可能にし、近接プローブが互いに近接している場合、前記近接プローブの核酸が互いに相互作用することを可能にするステップ；及び（ｄ）核酸間の相互作用の程度を検出し、それによってＤＮＡ損傷のレベルを決定するステップを含む、方法を提供する。それにもかかわらず、この方法は、放射線誘発ＤＮＡ二本鎖切断を検出することによって放射線曝露をモニターするように設計された。他の型の切断は検出することができない。しかしながら、とりわけ、これはＤＮＡ切断の間接的な検出方法の別の例である。上記のものと同様に、この方法は、ＤＮＡ切断から生じるＤＮＡ末端の直接検出よりもむしろ、ＤＮＡ損傷修復のプロセスに関与するタンパク質（複数可）の検出に基づく。
〔発明の概要〕
既存の方法の調査により、固定若しくは生細胞、又は組織、並びに抽出ＤＮＡ、又は単離されたクロマチン、又は任意の種類の生体物質における二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ切断のいずれかの型を同定し、検出する、高感度、特異的及び直接的な方法に対する必要性が実証される。
利用可能なアプローチを考慮して、便利で同時に簡単であるＤＮＡ損傷ｉｎ ｓｉｔｕ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に適用可能である、より感度が高く、特異的、選択的及び普遍的な方法に対する要求が存在している。ＤＮＡ損傷の高感度及び選択的な検出は、薬物設計、患者の状態の診断及び／又はモニタリング、並びに疾患の進行においても非常に重要である。さらに、この検出はまた、発がん、変性及び自己免疫疾患、又は加齢、すなわち、主要な現代の健康問題に関連するプロセスについてのより良い洞察を提供することができる。
本発明は、当該技術分野において公知の方法の欠点を克服し、ＤＮＡ切断の研究、及びそれによるＤＮＡ損傷の検出に関連する診断に使用される方法の分野において大幅な進歩をもたらす。
本発明は、生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）の検出方法であって、以下のステップＩ～ＩＩＩ及びステップＩ～ＩＩＩの各々のサブステップａ～ｈ：
Ｉ．生体物質の調製
ａ．生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は溶解及び／又は単離及び／又は分画及び／又は固定化するステップ、
ｂ．ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を増加させるステップ、
ｃ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩ．ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシング
ｄ．化学的又は物理的プロセシングによりＤＮＡ末端（複数可）を修飾し、その後、触媒又は非触媒手段により分子１型のＤＮＡ末端（複数可）へ結合させるステップ、
ｅ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩＩ．修飾されたＤＮＡ末端（複数可）の認識及び検出
ｆ．ステップＩＩからの生体物質を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を導くステップを可能にするように分子１型と結合する少なくとも２つの分子２型及び３型とインキュベートするステップ、
ｇ．ＤＮＡ末端（複数可）を検出するステップであって、
ｉ．任意選択で、適切な分子４型及び／又は５型を分子２型及び３型と接触させるステップであり、分子４型及び／又は５型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている、ステップ、
ｉｉ．オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子４型及び／若しくは５型、又は分子２型及び３型がオリゴヌクレオチド１型と連結する場合、分子２型及び３型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
ｉｉｉ．酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、続いて、分子６型を添加して、分子６型を、このようにして得られたＲＣＡ反応産物とハイブリダイズさせるステップ
による、検出するステップ、
ｈ．分子６型を検出するステップ
のうちの少なくとも１つを含み、
ステップＩの１つより多くのサブステップａ～ｃが実施される場合、１つより多くのサブステップａ～ｃは任意の順序で行うことができる、検出方法に関する。
本発明によれば、ＤＮＡ末端（複数可）は、好ましくは、一本鎖切断又は二本鎖切断を含むいずれかのＤＮＡ切断（複数可）の結果（複数可）である。好ましくは、ＤＮＡ切断（複数可）は、一本鎖ニック、一本鎖ギャップ、単一のホスホジエステル結合の一本鎖切断、二本鎖平滑末端切断、二本鎖３’突出切断、二本鎖５’突出切断、３’－ＯＨ又は５’－リン酸ＤＮＡ末端が存在しないものを含むＤＮＡ鎖切断の型を含む群から選択される。
好ましくは、ＤＮＡ末端（複数可）の検出はｉｎ ｓｉｔｕで実施される。
好ましくは、生体物質は生きている。
好ましくは、生体物質は固定されている。
より好ましくは、生体物質は、動物、植物、原生動物、細菌細胞、ウイルス、組織並びにそれらの断片及び／又は成分を含む群から選択される。より好ましくは、動物はヒトである。
好ましくは、生体物質は、細胞若しくは組織又は膜によって囲まれたそれらの断片である。この実施形態では、好ましいサブステップｃはステップＩにおいて実施される。
好ましくは、ステップＩのサブステップａ）の前に、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるさらなるステップが実施される。
好ましくは、生体物質は溶液中又は多孔質表面若しくは固体支持体上に存在する。より好ましくは、固体支持体又は多孔質表面の種類は、ガラス、プラスチック、含水ゲル（ｗａｔｅｒ ｇｅｌ）、エアロゲル金属及びセラミックを含む群から選択される。
好ましくは、分子１型は、ハロゲン化ヌクレオチド若しくはヌクレオシド分子、例えばＢｒｄＵ、ＩｄＵ、ＣｌｄＵ、又はＤＮＡ前駆体類似体、例えばＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）、Ｆ－ａｒａ－ＥｄＵ、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、又はビオチン化ヌクレオチド分子、ＡＤＰ－リボース分子、又はタンパク質分子、ヌクレオチド、又は蛍光分子、若しくは化学発光分子、若しくは放射性同位体、若しくは酵素基質、若しくはビオチン分子を含む群から選択される標識により標識されたヌクレオシド分子を含む群から選択され、さらに、分子１型は、ＤＮＡ又はＲＮＡ末端（複数可）と結合することができ、分子２型、若しくは３型、若しくは酵素に対する任意の他の基質、若しくはそれらの類似体のいずれか、若しくはオリゴマー、若しくはポリマー、又はそれらの組合せを結合するための標的として作用することができる任意の他の分子を含む群から選択される。
好ましくは、分子２型及び分子３型は、抗体若しくはその断片、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン分子若しくはそれらの類似体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、アジドのような反応分子、オリゴマー、ポリマー、及び上述の任意の類似体又はそれらの組合せを含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子４及び分子５は、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２型）との相互作用（選択領域のハイブリダイゼーション）、それらのライゲーション、及びその後のＲＣＡ反応を可能にする配列の核酸（オリゴヌクレオチド１型）と共有結合している抗体を含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子４及び分子５は、抗体ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン類似体、ビオチン類似体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体断片、抗原、アジドのような反応分子、オリゴマー、ポリマー、上述の類似体又はそれらの組合せを含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子６型は、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されたＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合することができる標識されたオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３型）である。
好ましくは、分子７型は、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されたＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合することができ、分子シグネチャーを有するか又は生成することができる他の分子に対する結合標的として作用することができる分子である。
好ましくは、ステップＩＩＩにおけるサブステップｇ）の増幅は、分子６型と結合する分子７型の添加によって向上する。
好ましくは、分子７型は、蛍光化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン、ナノ粒子を含む群から選択される標識により標識される。
好ましくは、触媒手段は非酵素又は酵素手段を含む。より好ましい酵素手段は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴｄＴ、クレノウ断片、Ｐｈｕポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼを含む群から選択される。より好ましくは、非酵素手段は触媒特性を有する化学的因子を含む群から選択される。より好ましくは、非触媒手段は物理的又は生化学的因子を含む。
好ましくは、サブステップｈの検出は、顕微鏡法、多くの細胞数の自動分析方法、蛍光顕微鏡法（広視野、共焦点、多焦点、超解像、カタパルティングによる顕微鏡法、レーザー走査、ハイスループット、高含量）を含む分光法、蛍光測定、吸光検出のための透過型光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、細胞分類（ＦＡＣＳ）、質量分析法を含む群から選択される技術によって実施される。
好ましくは、分子２型及び３型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしていない。この実施形態によれば、適切な分子４型及び５型を分子２型及び３型と接触させることは、ステップＩＩＩのサブステップｇ（ｉ）において実施されることが好ましい。
好ましくは、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップは、ＤＮＡ損傷を誘導しない。
好ましくは、単一のＤＮＡ末端（複数可）の検出が達成される。
好ましくは、単一のＤＮＡ末端（複数可）の存在及び位置のマーキングが取得される。
好ましくは、細胞又は組織である生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）の検出は、以下：
Ｉ．物質を調製するステップ
ａ．生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は単離及び／又は固定化するステップ、
ｂ．ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ、
ＩＩ．ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシング
ｄ．化学的プロセシングによるＤＮＡ末端（複数可）の修飾、その後の触媒手段によるヌクレオチド又はその類似体である分子１型のＤＮＡ末端（複数可）への結合、
ｅ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩＩ．修飾されたＤＮＡ末端（複数可）の認識及び検出
ｆ．ステップＩＩからの生体物質を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を導くステップを可能にするように分子１型の結合部位の異なる型と結合する、一次抗体である少なくとも２つの分子２型及び３型とインキュベートするステップ、
ｇ．ＤＮＡ末端（複数可）を検出するステップであって、
ｉｉ．二次抗体である適切な分子４型及び５型を分子２型及び３型と接触させるステップであり、分子４型及び５型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている、ステップ、
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子４型及び５型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
ｉｖ．酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、続いて、分子６型を添加して、分子６型を、このようにして得られたＲＣＡ反応産物とハイブリダイズさせるステップ
による、検出するステップ、
ｈ．分子６型を検出するステップ
を含む。
好ましくは、細胞又は組織である生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）の検出は、以下：
Ｉ．生体物質の調製
ａ．生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は単離及び／又は固定化するステップ、
ｂ．ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ、
ｃ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩ．ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシング
ｄ．化学的プロセシングによるＤＮＡ末端（複数可）の修飾、その後の触媒手段による非修飾ヌクレオチド又はビオチン化ヌクレオチドである分子１型のＤＮＡ末端（複数可）への結合、
ｅ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩＩ．修飾されたＤＮＡ末端（複数可）の認識及び検出
ｆ．ステップＩＩからの生体物質を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を導くステップを可能にするように分子１型の結合部位の異なる型と結合する、一次抗体である少なくとも２つの分子２型及び３型とインキュベートするステップ、
ｇ．ＤＮＡ末端（複数可）を検出するステップであって、
ｉ．二次抗体である適切な分子４型及び５型を分子２型及び３型と接触させるステップであり、分子４型及び５型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている、ステップ、
ｉｉ．オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子４型及び５型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
ｉｉｉ．酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、続いて、分子６型を添加して、分子６型を、このようにして得られたＲＣＡ反応産物とハイブリダイズさせるステップ
による、検出するステップ、
ｈ．分子６型を検出するステップ
を含む。
好ましくは、細胞又は組織である生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）の検出が、以下：
Ｉ．生体物質の調製
ａ．生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は単離及び／又は固定化するステップ、
ｂ．ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ、
ｃ．生体物質において分子２～４型及び６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩ．ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシング
ｄ．化学的プロセシングによるＤＮＡ末端（複数可）の修飾、その後の触媒手段による非修飾ヌクレオチド又はビオチン化ヌクレオチドである分子１型のＤＮＡ末端（複数可）への結合、
ｅ．生体物質において分子２～４型及び６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩＩ．修飾されたＤＮＡ末端（複数可）の認識及び検出
ｆ．ステップＩＩからの生体物質を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を導くステップを可能にするように分子１型と結合する、少なくとも２つの分子：一次抗体である分子２型及びオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしているストレプトアビジンである分子３型とインキュベートするステップ、
ｇ．ＤＮＡ末端（複数可）を検出するステップであって、
ｉ．任意選択で、二次抗体である適切な分子４型を分子２型と接触させるステップであり、分子４型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている、ステップ、
ｉｉ．オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子２型及び３型、又はオリゴヌクレオチド１型が分子２とコンジュゲートしていない場合、３型及び４型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
ｉｉｉ．酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、続いて、分子６型を添加して、分子６型を、このようにして得られたＲＣＡ反応産物とハイブリダイズさせるステップ
による、検出するステップ、
ｈ．分子６型を検出するステップ
を含む。
本発明はまた、単一のＤＮＡ末端（複数可）の存在及び位置をマーキングするためのローリングサークル複製の使用に関する。
本発明はまた、適切に調製された生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）を検出するための、以下のステップ：
適切な分子４型及び／又は５型を分子２型及び３型と接触させるステップであり、分子４型及び／又は５型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている、ステップ、
オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子４型及び／若しくは５型、又は分子２型及び３型がオリゴヌクレオチド１型と連結する場合、分子４型及び／若しくは５型、又は分子２型及び３型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、分子６型を添加して、このようにして得られたＲＣＡ反応産物と分子６型とのその後のハイブリダイゼーションを可能にするステップ
の使用に関する。
好ましくは、分子２型及び３型は、オリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしていない。この実施形態では、好ましくは、適切な分子４型及び５型を分子２型及び３型と接触させるステップが実施される。
好ましくは、生体物質は、以下：
任意選択で、生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は単離及び／又は固定化するステップ、
ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ、
任意選択で、生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ
によって調製される。
本発明はまた、生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）を検出するための、以下のステップＩ～ＩＩＩ及びステップＩ～ＩＩＩの各々のサブステップａ～ｈ：
Ｉ．生体物質の調製
ａ．生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は溶解及び／又は単離及び／又は分画及び／又は固定化するステップ、
ｂ．ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ、
ｃ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩ．ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシング
ｄ．化学的又は物理的プロセシングによりＤＮＡ末端（複数可）を修飾し、その後、触媒又は非触媒手段により分子１型のＤＮＡ末端（複数可）へ結合させるステップ、
ｅ．生体物質において分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップ、
ＩＩＩ．修飾されたＤＮＡ末端（複数可）の認識及び検出
ｆ．ステップＩＩからの生体物質を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を導くステップを可能にするように分子１型と結合する少なくとも２つの分子２型及び３型とインキュベートするステップ、
ｇ．ＤＮＡ末端（複数可）を検出するステップであって、
ｉ．任意選択で、適切な分子４型及び／又は５型を分子２型及び３型と接触させるステップであり、分子４型及び／又は５型はオリゴヌクレオチド型１とコンジュゲートしている、ステップ、
ｉｉ．オリゴヌクレオチド２型及び酵素リガーゼを添加して、前記添加したオリゴヌクレオチド２型を、分子４型及び／若しくは５型、又は分子２型及び３型がオリゴヌクレオチド１型と連結する場合、分子２型及び３型と既に連結しているオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズさせ、続いてオリゴヌクレオチド２型のＤＮＡライゲーションを実施するステップ、
ｉｉｉ．酵素ポリメラーゼ及びヌクレオチド溶液を添加することによって増幅を実施してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応を起こし、続いて、分子６型を添加して、分子６型を、このようにして得られたＲＣＡ反応産物とハイブリダイズさせるステップ
による、検出するステップ、
ｈ．分子６型を検出するステップ
のうちの少なくとも１つを含む方法の使用であって、ステップＩからの１つより多くのサブステップａ～ｃが実施される場合、それらは任意の順序で行うことができる、使用に関する。
好ましくは、ＤＮＡ末端（複数可）は、一本鎖切断又は二本鎖切断を含むいずれかのＤＮＡ切断（複数可）の結果（複数可）である。より好ましくは、ＤＮＡ切断（複数可）は、一本鎖ニック、一本鎖ギャップ、単一のホスホジエステル結合の一本鎖切断、二本鎖平滑末端切断、二本鎖３’突出切断、二本鎖５’突出切断、３’－ＯＨ又は５’－リン酸ＤＮＡ末端が存在しないものを含むＤＮＡ鎖切断の型を含む群から選択される。
好ましくは、ＤＮＡ末端（複数可）の検出は、ｉｎ ｓｉｔｕで実施される。
好ましくは、生体物質は生きている。
好ましくは、生体物質は固定されている。
好ましくは、生体物質は、動物、植物、原生動物、細菌細胞、ウイルス、組織並びにそれらの断片及び／又は成分を含む群から選択される。より好ましくは、動物はヒトである。
好ましくは、生体物質は、細胞若しくは組織又は膜によって囲まれたそれらの断片である。この実施形態では、好ましくは、サブステップｃはステップＩにおいて実施される。
好ましくは、ステップＩのサブステップａ）の前に、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるさらなるステップが実施される。
好ましくは、生体物質は、溶液中、又は多孔質表面若しくは固体支持体上に存在する。より好ましくは、固体支持体又は多孔質表面の種類は、ガラス、プラスチック、含水ゲル、エアロゲル金属及びセラミックを含む群から選択される。
好ましくは、分子１型は、ハロゲン化ヌクレオチド若しくはヌクレオシド分子、例えばＢｒｄＵ、ＩｄＵ、ＣｌｄＵ、又はＤＮＡ前駆体類似体、例えばＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）、Ｆ－ａｒａ－ＥｄＵ、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、又はビオチン化ヌクレオチド分子、ＡＤＰ－リボース分子、又はタンパク質分子、ヌクレオチド、又は蛍光分子、若しくは化学発光分子、若しくは放射性同位体、若しくは酵素基質、若しくはビオチン分子を含む群から選択される標識により標識されたヌクレオシド分子を含む群から選択され、分子１型はまた、ＤＮＡ又はＲＮＡ末端（複数可）と結合することができ、分子２型、若しくは３型、若しくは酵素に対する任意の他の基質、若しくはそれらの類似体のいずれか、若しくはオリゴマー、若しくはポリマー、又はそれらの組合せを結合するための標的として作用することができる任意の他の分子を含む群からも選択される。
好ましくは、分子２型及び分子３型は、抗体若しくはその断片、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン分子若しくはそれらの類似体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、アジドのような反応分子、オリゴマー、ポリマー、及び上述のいずれかの類似体又はそれらの組合せを含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子４及び分子５は、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２型）との相互作用（選択領域のハイブリダイゼーション）、それらのライゲーション、及びその後のＲＣＡ反応を可能にする配列の核酸（オリゴヌクレオチド１型）と共有結合している抗体を含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子４及び分子５は、抗体ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン類似体、ビオチン類似体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体断片、抗原、アジドのような反応分子、オリゴマー、ポリマー、上述の類似体又はそれらの組合せを含む群から独立的に選択される。
好ましくは、分子６型は、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されたＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合することができる標識されたオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３型）である。
好ましくは、分子７型は、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されたＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合することができ、分子シグネチャーを有するか又は生成することができる他の分子に対する結合標的として作用することができる分子である。
好ましくは、ステップＩＩＩにおけるサブステップｇの増幅は、分子６型と結合する分子７型の添加によって向上する。
好ましくは、分子７型は、蛍光化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン、ナノ粒子を含む群から選択される標識により標識される。
好ましくは、触媒手段は非酵素又は酵素手段を含む。より好ましくは、酵素手段は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＴｄＴ、クレノウ断片、Ｐｈｕポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＲＮＡポリメラーゼを含む群から選択される。
より好ましくは、非酵素手段は、触媒特性を有する化学的因子を含む群から選択される。より好ましくは、非触媒手段は物理的又は生化学的因子を含む。
好ましくは、サブステップｈ）の検出は、顕微鏡法、多くの細胞数の自動分析方法、蛍光顕微鏡法（広視野、共焦点、多焦点、超解像、カタパルティングによる顕微鏡法、レーザー走査、ハイスループット、高含量）を含む分光法、蛍光測定、吸光検出のための透過型光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、細胞分類（ＦＡＣＳ）、質量分析法を含む群から選択される技術によって実施される。
好ましくは、分子２型及び３型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしていない。この実施形態では、適切な分子４型及び５型を分子２型及び３型と接触させることは、ステップＩＩＩのサブステップｇ（ｉ）において実施されることが好ましい。
好ましくは、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップは、ＤＮＡ損傷を誘導しない。
好ましくは、単一のＤＮＡ末端（複数可）の検出が達成される。
好ましくは、単一のＤＮＡ末端（複数可）の存在及び位置のマーキングが取得される。
ＨｅＬａ細胞におけるＤＮＡ末端を検出する手順の一例における一連の事象の概略図を示す。この概略図は方法の例示的な改変法の主要部分であり、すなわち、分子２及び３が一次抗体であり、分子４型及び５型が二次抗体であり、生体物質におけるＤＮＡ末端の検出をもたらす場合の実施形態であり、１１の以下の略図に記載することができる：１．ＤＮＡ切断が生細胞において生じる。このスキームは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断のいずれかの型を表す。２．細胞の固定後、酵素がＤＮＡ切断を認識する。３．酵素は、分子１型（ヌクレオチド類似体）をＤＮＡ末端に結合し始める。複数の１型分子が、略図に示される２つのＤＮＡ末端に付加される。４．酵素の作用により、２つの認識されたＤＮＡ末端の各々に付着した分子１型の鎖の形成が生じる。５．２つの型の分子である２型及び３型が、ＤＮＡ末端に付着した分子１型を認識し、それに付着する。付着分子２及び３の数及び力価は、多くの分子２型及び３型を分子１型の鎖において互いに近接して位置付けるのに十分に大きい（明確にするために、２つのＤＮＡ切断の一方に付着している種々の分子のみを示す）。６．分子１型の鎖に既に付着している分子２型及び３型は分子４型及び５型によって認識される。これらの分子４型及び５型は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１型、２つのクラス）とコンジュゲートし、分子２及び３と結合する。７．オリゴヌクレオチド（２型、２つの異なるオリゴヌクレオチドの溶液）は、オリゴヌクレオチド１型（分子４型及び５型の成分である）とハイブリダイズする。８．酵素リガーゼはハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２型の末端をライゲートし、それによってＲＣＡ反応において必要とされる環状オリゴヌクレオチドを調製する。９．ライゲーションの産物である、１型オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした環状オリゴヌクレオチドをＲＣＡ反応のために準備する。１０．ＲＣＡ反応産物－抗体４又は５のうちの１つに付着した長いオリゴヌクレオチド。１１．蛍光標識されたオリゴヌクレオチド３型はＲＣＡ反応産物とハイブリダイズし、それによってＤＮＡ切断の存在及び位置をマーキングする。このスキームは、例示が焦点を当てられている分子１～６型間の相互作用の説明には必要ではないので、生体物質を調製するためのステップを含まない。 標準的なＴＵＮＥＬアッセイの感度と手順１による方法の感度との比較－蛍光共焦点画像を示す図である。遊離ＤＮＡ末端を標準的なＴＵＮＥＬアッセイ（ＡＰＯ－ＢＲＤＵ）又は手順１に従って検出した、未処理及びＤＮａｓｅ Ｉにより処理したＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光共焦点画像を示す。手順１に従って調製した試料では、遊離ＤＮＡ末端は、明るく明確な蛍光フォーカスとして見ることができる（右側の列）。両方のアッセイでは、高濃度のＤＮａｓｅ Ｉ（４Ｕ、第１の行）による細胞の処理は、未処理の細胞（０Ｕ、第３の行）と比較して核におけるシグナルの有意な増加をもたらした。しかしながら、手順１に従って調製した試料についてのみ、低濃度のＤＮａｓｅ Ｉにより処理した細胞（第２の行、右側の画像）と未処理の細胞（第３の行、右側の画像）との間に差があり、検出された遊離ＤＮＡ末端の数は、ＤＮａｓｅにより処理した細胞において、より多い。標準的なＴＵＮＥＬアッセイでは、未処理の細胞（第３の行、左側の画像）と比較して低濃度のＤＮａｓｅ Ｉにより処理した試料（第２の行、左側の画像）において有意な蛍光シグナルは観察されない。スケールバー－２０μｍ。 ＴＵＮＥＬアッセイの感度と手順１による方法の感度との比較－ボックスプロットを示す図である。ボックスプロットは、ＤＮＡ切断の顕微鏡画像の分析の結果を表す。標準的なＴＵＮＥＬアッセイ（ＡＰＯ－ＢＲＤＵ）では、シグナルは核内のピクセルの平均濃淡値（蛍光強度）であった（ＴＵＮＥＬは個々のＤＮａ切断の画像をもたらさず、核全体にわたって粒子の粗いシグナルのみをもたらすことに留意されたい）。手順１による方法では、各々の核におけるフォーカスの数を決定した。各々のボックスの下部は２５パーセンタイルであり、上部は７５パーセンタイルであり、中央の線は５０パーセンタイルであり、ひげは１０及び９０パーセンタイルである。実線の水平線（ボックスよりも幅広い）は平均値を表す。独立２標本ｔ検定により、低濃度のＤＮａｓｅ Ｉ（０．２Ｕ）により処理した試料と未処理の試料（０Ｕ）との間の平均値の差が手順１に従って細胞をプロセシングした後にのみ統計的に有意であることが示された（右側のグラフ；ｐ値＝２．８×１０－７）。これは、手順１による方法が標準的なＴＵＮＥＬアッセイよりも有意に感度が高いことを示す。 標準的なニックトランスレーションアッセイ及び手順２による方法によるＤＮＡ末端の検出に対する内因性ビオチンのブロッキングの効果の評価を示す図である。遊離ＤＮＡ末端を、標準的なニックトランスレーションアッセイ（第１の行）又は手順２（第２の行）に従って検出した未処理のＨｅＬａ細胞の代表的な蛍光共焦点画像。試料を事前ブロッキングステップ（手順２におけるステップ３－内因性ビオチンのブロッキング）あり又はなしで調製した。標準的なニックトランスレーションアッセイに従って調製した試料では、内因性ビオチンのブロッキングは細胞の核における蛍光シグナルの有意な減少をもたらし、シグナルの差は記録した共焦点画像（第１の行）において明確に見ることができる。手順２に従って調製した試料では、事前ブロッキングは、得られた画像（第２の行）において大きな影響を及ぼさない。スケールバー－２０μｍ。 修復タンパク質ＸＲＣＣ１の蓄積領域に関連するＤＮＡ切断部位におけるＢｒｄＵ分子の組み込みの検出を示す図である。ＢｒｄＵ分子の組み込みは、二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断又は一本鎖ギャップが生じる場合に存在する、ＴｄＴ酵素によって認識された特定の型のＤＮＡ３’－ＯＨ末端をマークする。ギャップはＢＥＲ経路によって修復される。ＸＲＣＣ１タンパク質は、この修復プロセスに関与する主要な修復因子の１つである。ＢｒｄＵが、隣接するＸＲＣＣ１フォーカスと一緒に検出される部位は、一本鎖ギャップが生じる部位のみである可能性が高い。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、画像を分析し、ＢｒｄＵフォーカスの蛍光最大（正方形）を見出し、割り当てた。最大値はＢｒｄＵフォーカスの質量中心を表し、したがってＤＮＡ損傷の局在化をマークする。修復タンパク質フォーカスを表し、プロファイルにおける上述の最大値を局在化している画像の蛍光プロファイル（下部、顕微鏡画像のパネルの下）の分析は、ＤＮＡ切断がＸＲＣＣ１修復フォーカスの周辺領域に隣接して、又は周辺領域において一貫して検出されることを示す。顕微鏡画像において検出されるＸＲＣＣ１とＢｒｄＵフォーカスとの間には、明確な空間的関連性が存在する。画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。蛍光強度プロファイルは矢印の間の領域において測定した。 （ＥｄＵにより標識された）ＤＮＡ複製領域及びＸＲＣＣ１修復フォーカスに関連して（実施例４に記載され、説明されたように）一本鎖ギャップである可能性が高い、ＢｒｄＵ組み込みによって標識されたＤＮＡ切断の局在化を示す図である。修復タンパク質フォーカスを表し、プロファイルにおける蛍光最大（ＢｒｄＵフォーカス－正方形、ＤＮＡ複製領域－菱形）を局在化している画像の（下部における）蛍光プロファイルの分析により、３種類の核内対象物の間の空間的関連性が確認される。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、画像を分析し、蛍光最大を見出し、割り当て、蛍光強度プロファイルを生成した。ＤＮＡ複製の全ての領域が、手順１による検出方法の最小限の交差反応を証明するＢｒｄＵ検出領域と関連しているわけではない（この方法は、ＥｄＵのあらゆる非特異的検出がなく、ＢｒｄＵの検出のみを導く）。画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。蛍光強度プロファイルは矢印の間の領域において測定した。スケールバー：５μｍ又は１μｍ（画像の拡大部分において）。 対照、アポトーシス及び損傷したＨｅＬａ細胞の例を示す図である。Ａ）．ＢｒｄＵが手順１よる方法を使用して、組み込まれ、検出された細胞核の画像の例。この例は、細胞培養物におけるアポトーシス細胞の検出に対するこの方法の適用性を証明する。アポトーシス細胞の核は正常な対照細胞の核よりも有意に多くのＤＮＡ切断を含む。Ｂ）．異なる損傷剤（ＵＶ、トポテカン（Ｔｐｔ）及びＨ２Ｏ２）により処理した細胞の画像の例。ボックスプロットは、異なる薬剤による処理が、未処理の対照細胞と比較してＢｒｄＵ分子の組み込みの検出可能な領域の平均数の増加をもたらすことを示す。ＢｒｄＵの組み込み領域はＤＮＡの遊離末端の局在化領域を表す（Ｈ２Ｏ２により処理した細胞の平均数：３１．５７±８．６１、ＵＶ：１０．７３±４．８９、Ｔｐｔ：１６．３９±４．９２）。結果は、スチューデントのｔ検定（ｐ値）を使用して試験した。エラーバーは標準誤差を表す。Ｃ）．パネルは、核内及びクロマチン構造（ＤＡＰＩ）に関してＨ２Ｏ２により処理した細胞核における二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断又は一本鎖ギャップの局在化を例示する画像の例を提示する。蛍光強度プロファイルは、画像内の線でマークした領域からＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して得た。ＤＡＰＩの蛍光強度及びＤＮＡ切断を表す蛍光最大（ＢｒｄＵフォーカス）をより詳細に見ることにより、損傷領域におけるクロマチンの局所密度に関する情報を得ることができる。提示した画像において、ＢｒｄＵフォーカスは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して検出された蛍光最大により可視化された。画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。スケールバー：５μｍ。 ＢｒｄＵを組み込まずに手順１に従って処理したＨｅＬａ細胞において検出された蛍光シグナルのレベルの対照測定を示す図である。検出されたフォーカスの数及び観察された核の数により、平均して単一の細胞核当たり０．１３±０．０４（核の総数Ｎ＝６３）のフォーカスしか検出されなかったことが示される。フォーカスは蛍光シグナルのレベルが０ａ．ｕ．よりも高い領域として定義され、それらの局在化は、蛍光最大を局在化するＩｍａｇｅＪソフトウェアに内蔵の特徴を使用して決定した。フォーカスの大部分は、ＤＡＰＩで染色した細胞核の蛍光画像との蛍光最大のオーバーレイに基づいて決定した細胞核の外側に局在化した。提示した顕微鏡画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。 光力学作用（エチジウムブロマイド（５００ｎＭ）及び４８８ｎｍレーザー線）による細胞核の小さな選択領域に生じたＤＮＡ切断（複数可）の直接検出を示す図である。Ｈｅｌａ細胞をエチジウムブロマイド（５００ｎＭ）とインキュベートし、白丸によってマークした場所において４８８ｎｍレーザー線（９ｍＪ－損傷を誘導することが知られている線量（Ｚａｒｅｂｓｋｉ，Ｍ．、Ｗｉｅｒｎａｓｚ，Ｅ．及びＤｏｂｒｕｃｋｉ，Ｊ．Ｗ、（２００９年）、Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｔｏ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｓｉｔｅｓ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、７５Ａ：６１９～６２５頁、ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２０７３４））を使用して照射した（第１の行）。ＤＮＡ切断を標準的なＴＵＮＥＬ（左側の列）及び手順１（右側の列）に従って検出した。蛍光画像（第２の行）及び蛍光強度プロファイル（第３の行、蛍光強度プロファイルは矢印の間で測定した）に示すように、手順１による検出後にのみＤＮＡ切断（複数可）（フォーカス）を見ることができる。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、画像を分析し、蛍光最大を見出し、割り当て、蛍光強度プロファイルを生成した。 Ｕ２－ＯＳ細胞においてヌクレアーゼＳｐＣａｓ９によって誘導される数十の切断（第３染色体のサブテロメア領域において誘導される切断）の検出に使用される、標準的なＴＵＮＥＬ法と手順１による方法との比較を示す図である。蛍光強度の画像及びプロファイルは、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の蓄積と関連する領域において測定され、ＢｒｄＵの標準的な免疫蛍光検出（標準的なＴＵＮＥＬアッセイ）に使用される二次抗体とコンジュゲートしているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４によって放出された蛍光強度の平均値がおよそ０ａ．ｕ．であったことを示す（５０個の核を分析し、値を、非特異的に結合した抗体分子を表すバックグラウンドシグナルのレベルに基づいて正規化した）。記録した顕微鏡画像の代表的な例について測定した蛍光プロフファイルの例は、標準的なＴＵＮＥＬアッセイを適用した場合、標準的な蛍光広視野顕微鏡を使用して記録した顕微鏡画像においてＢｒｄＵフォーカスを検出することができないことを明確に例示する。それぞれ、手順１による方法を適用した場合、非特異的バックグラウンドシグナルは検出されず、ＢｒｄＵの組み込み領域は、顕微鏡画像において可視化された明確なフォーカスによって表された。これらのフォーカスはＳｐＣａｓ９の蓄積領域と共局在化し、これを蛍光強度のプロファイルにおいてさらに例示した。蛍光強度プロファイルは矢印の間の領域について生成した。画像サイズ：３０×３０μｍ。 ヒトＵ２－ＯＳ細胞におけるヌクレアーゼＳｐＣａｓ９によって誘導された単一切断の検出における手順１による方法の適用を示す図である。ＳｐＣａｓ９がいかなる切断活性も行わない場合、ＢｒｄＵフォーカスはヌクレアーゼの蓄積領域において検出することができない。次に、ＳｐＣａｓ９の蓄積部位における単一切断の誘導により、組み込まれたＢｒｄＵ分子の検出がもたらされる。別個のＢｒｄＵフォーカスはＳｐＣａｓ９フォーカスと空間的に関連し、これを蛍光強度プロファイルによってさらに例示する。プロファイルは矢印の間で測定した。結果は、手順１による方法が、ＤＮＡ切断の認識において非常に高い感度に達することができ、１つの単一の二本鎖ＤＮＡ切断のみでさえも検出することができることを証明する。提示した顕微鏡画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。 ヒトＵ２－ＯＳ細胞におけるニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）によって誘導された単一切断の検出における手順２による方法の適用を示す図である。ＳｐＣａｓ９ｎがいかなる切断活性も行わない場合、ビオチン化ヌクレオチドのフォーカスは、ニッカーゼの蓄積領域において検出することができない。これらの２つの核内対象物の間には空間的関連性は存在しない。次に、ＳｐＣａｓ９ｎの蓄積部位における単一のニック又は数十までのニックのいずれかの誘導により、組み込まれた修飾ヌクレオチドの検出がもたらされる。ビオチン化ヌクレオチドのフォーカスが局在化され、画像における蛍光最大によって表された。１つのみの一本鎖ＤＮＡ切断が誘導される場合、ヌクレオチドの組み込み部位はＳｐＣａｓ９ｎフォーカスと共局在化する。ニックの数が１より多い（数十まで）場合、ヌクレオチド及びＳｐＣａｓ９ｎフォーカスの組み込み領域もまた、共局在化する。提示した蛍光強度プロファイルはこの関連性（ＢｒｄＵ及びＳｐＣａｓ９ｎフォーカスの重なりを表す最大値）を明確に示す。この結果は、手順２に従って実施された方法の高い感度を証明する。この方法は、細胞核におけるｉｎ ｓｉｔｕでの単一の一本鎖ＤＮＡ切断の検出に適用することができる。提示した顕微鏡画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。蛍光強度プロファイルは、目的のＳｐＣａｓ９ｎフォーカスを横切って走る水平線に沿ってＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して得た。 単離された生体物質におけるＢｒｄＵの組み込みのレベルの測定を示す図である。物質は、未処理の対照ＨｅＬａ細胞及びＨ２Ｏ２（４ｍＭ、３０分）に供したＨｅＬａ細胞から単離した。遊離ＤＮＡ末端の数は、Ｈ２Ｏ２などの損傷剤による処理の結果として増加し、これにより、組み込まれたＢｒｄＵ分子の数の増加及び試料における全蛍光強度シグナルの増加が生じる（ＢｒｄＵは手順１による方法を使用して検出し、続いてクロマチン及びＤＮＡを含む細胞成分の抽出を行った）。グラフ（ボックスプロット）に提示する最終結果は、ＤＮＡ１ｎｇ当たりの蛍光強度である。各ボックスの下部は２５パーセンタイルであり、上部は７５パーセンタイルであり、ひげは１０及び９０パーセンタイルであり、中央の線は平均値である。対照試料におけるＤＮＡ単位（１ｎｇ）当たりの測定した蛍光強度は２．９±０．２×１０－４ａ．ｕであったが、Ｈ２Ｏ２により処理した試料におけるＤＮＡ１ｎｇ当たりの測定した蛍光強度は、より高かった（３．２±０．３×１０－４ａ．ｕ．）（表及びプロットを参照のこと）。独立２標本ｔ検定により、未処理の試料とＨ２Ｏ２により処理した試料との間のＤＮＡ１ｎｇ当たりの蛍光強度の差が統計的に有意であることが示された（ｐ値＜０．００１）。ＤＮＡの濃度は、マルチモードプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ）を使用して測定した。 ＤＮＡ末端のアクセス可能性が固定前に増加した、固定Ｕ２－ＯＳ細胞におけるＤＮＡ末端を検出するための手順２の使用を示す図である。右側の画像は修飾ＤＮＡ末端を表す蛍光フォーカスを提示する（手順２による）。この修飾ＤＮＡ末端は細胞核内で特異的に検出され（核が左側の透過光画像において局在化される）、それらの数は個々の細胞間で異なる。一本鎖ＤＮＡ切断を表す蛍光フォーカスの局在化に関して、得られた画像は信頼性があり、これにより、クロマチン及びＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させるための、トリス（この場合、１ｍＭ、３７℃にて２０分間のインキュベーション）との生細胞のインキュベーション（固定前）のステップの適用性が証明される。画像は３Ｄスタック画像の最大値投影像である。
〔代表的な実施形態〕
本発明による方法は、この記述によって支持されている特許請求の範囲によって記載されているので、特許請求の範囲に基づく種々の実施形態を強調することができる。
本発明の一実施形態では、方法の全てのサブステップはａからｈの順序で使用され、１つのステップの後に別のステップが続く（ａの後にｂ、ｂの後にｃなど）。
他の実施形態では、サブステップａ～ｃからの１つのみが使用され、続いてサブステップｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｈが開示された順序で使用される。それにもかかわらず、別の好ましい実施形態では、サブステップａ～ｃからの少なくとも２つが方法で使用される。
本発明によれば、方法のある特定の実施形態は、前述のサブステップａ～ｃに関するバリエーションを考慮して、サブステップｄ又はｄ及びｅを含む。
同様に、サブステップｆ～ｈに関連して種々の実施形態を特定することができる。
好ましい実施形態では、全てのサブステップｆ、ｇ、及びｈが方法で使用される。ある特定の実施形態では、全ての二次サブステップｉ～ｉｉｉをサブステップｇについて使用することができるが、他の実施形態では、二次サブステップｉは省略することができる。
さらなるサブステップにおいて生体物質を処理するためのステップＩにおける物質の調製は、例えば、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップ及び／又は分子２～６型に対する非特異的結合部位（複数可）をブロッキングするステップの前に、固定、透過、溶解、単離、分画、固定化の群から選択される１つ又は複数のプロセスに従って実施され得る。
異なる実施形態では、当業者は、例えば、使用される生体物質の種類に基づいて、上記から適切な方法を予測し、使用する。
例えば、一実施形態では、生体物質が細胞又は組織である場合、生体物質を、固定及び／又は透過及び／又は単離及び／又は固定化するステップが実施される。
ステップＩのサブステップｂにおけるＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップは、トリス、又は低浸透圧ストレスを引き起こす任意の他の薬剤との前記生体物質のインキュベーションによって、生細胞又は組織において実施され得る。
ステップＩのサブステップｂにおけるＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させるステップは、ＥＤＴＡ、又はクロマチン弛緩及び／若しくは細胞核の拡大を引き起こす任意の他の薬剤との生体物質のインキュベーションによって実施され得る。
分子１～７型及びヌクレオチド１～３のバリエーションが、本発明によるＤＮＡ末端（複数可）の検出方法において使用され得る。当業者は、サブステップａ～ｈ及び２次サブステップｉ～ｉｉｉのどの組合せ及び順序をどの適用に使用すべきかを知っている。
本発明の目的のために、分子２型及び３型は常に、分子１型における異なる結合部位との親和性の態様及び／又は分子１型における異なる結合部位を認識し、それと結合する態様において異なる、２つの異なる型の分子である。
１つの特定の実施形態では、ステップＩにおけるサブステップｃは省略され、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは分子１型としてＢｒｄＵを使用して実施され、触媒手段は酵素ＴｄＴである。この場合、分子２型及び３型は抗体、具体的には、それぞれマウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ抗体及びウサギポリクローナル抗ＢｒｄＵ抗体である。
別の特定の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは、分子（複数可）１型としてビオチンコンジュゲートヌクレオチド（複数可）を使用して実施され、触媒手段は酵素ＤＮＡポリメラーゼＩである。この場合、分子２型及び３型は抗体、具体的には、それぞれマウスモノクローナル抗ビオチン抗体及びウサギポリクローナル抗ビオチン抗体である。
別の特定の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは、分子（複数可）１型としてビオチンコンジュゲートヌクレオチド（複数可）を使用して実施され、触媒手段は酵素ＤＮＡポリメラーゼＩであるが、この場合、分子２型は抗体、例えば、マウスモノクローナル抗ビオチン抗体であり、分子３型はストレプトアビジン分子であり、両方ともオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートする。二次サブステップｉは省略されるべきである。
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは分子１型としてビオチンコンジュゲートヌクレオチドも使用して実施されたが、触媒手段は酵素クレノウ断片である。
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは最初に、試料におけるＤＮＡ末端の型を調整し、修飾するためにＤＮＡポリメラーゼＩ（ヌクレオチドの存在なし）のエキソヌクレアーゼ活性を使用し、次に、分子（複数可）１型として非修飾ヌクレオチド及び触媒手段として酵素クレノウ断片と組み合わせたビオチンコンジュゲートヌクレオチドを使用して実施された。
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは分子１型としてＡＤＰ－リボースモノマーを使用して実施され、触媒手段は酵素ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼであり、ステップＩＩにおいて、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングは、ポリ（ＡＤＰ－リボース）グリコヒドロラーゼを使用する内因性ポリ（ＡＤＰ）－リボースポリマーの分解、及び例えばプロテイナーゼＫを使用するタンパク質の消化により予測される。
さらに別の実施形態では、サブステップａ～ｄの後、生体物質の単離が実施される。別の実施形態では、分子２型及び３型は、異なるレベルの親和性によって特徴付けられ、分子１型に存在する異なる抗原と結合する、異なる宿主由来の一次抗体である。この実施形態では、適切な分子４型及び５型は、分子１型に存在する抗原と結合している分子２型及び３型である一次抗体を特異的に標的とする二次抗体である。より具体的には、この実施形態に関して、分子２型及び３型はマウス及びウサギ一次抗体であり、分子４型及び５型はそれぞれ、抗マウス及び抗ウサギ二次抗体である。
さらに別の実施形態では、分子２型は分子１型に存在する１つの抗原又は複数の抗原に結合する一次抗体であり、分子１型はビオチン化ヌクレオチドを含み、分子３型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしているストレプトアビジン分子である。次いでステップＩＩＩのサブステップｇにおいて、二次サブステップｉは、分子２型を、ある特定の宿主由来の一次抗体をターゲティングする適切な二次抗体と接触させることを含み、このことは、分子４型がオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートすることを意味する。
さらに別の実施形態では、分子２型は分子１型に存在する１つの抗原又は複数の抗原と結合する一次抗体であり、分子１型はビオチン化ヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートし、分子３型はオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしているストレプトアビジン分子である。この実施形態では、ステップｇにおける第２のサブステップｉは省略される。
別の実施形態では、分子２型及び３型は、異なるレベルの親和性によって特徴付けられ、分子１型に存在する異なるエピトープと結合し、オリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートする、異なる宿主由来の一次抗体である。この実施形態では、サブステップｇにおける二次サブステップｉは省略される。
さらに別の実施形態では、分子２型は分子１型に存在する１つの抗原又は複数の抗原と結合する一次抗体であり、分子１型はビオチン化ヌクレオチドを含み、分子３型はストレプトアビジン分子である。この実施形態では、二次ステップｉにおけるサブステップｇにおいて、分子２型は、ある特定の宿主由来の一次抗体をターゲティングする適切な二次抗体と接触し、このことは分子４型がオリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしていることを意味し、一方、分子３型はストレプトアビジンに特有の抗原を認識し、それと結合し、オリゴヌクレオチド１型とコンジュゲートしている分子５型を構成する適切な一次抗体と接触する。
他の実施形態では、分子１型が任意のビオチン化分子を含む場合、ステップｃは省略することができない。
別の特定の実施形態では、分子１型は、遊離ＤＮＡ末端（複数可）の部位において結合し、架橋しているＤＮＡ末端（複数可）プロセシングに関与する酵素手段であるタンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＴｄＴ又はＰＡＲＰ１）である。分子２及び３は、異なるレベルの親和性によって特徴付けられ、分子１型に存在する異なる抗原を認識し、それと結合する、つまり同じ分子の酵素に存在する異なるエピトープを標的とする、異なる宿主由来の一次抗体である。この特定の実施形態では、ＤＮＡ末端（複数可）のプロセシングに続いて、架橋反応が起こり、続いて透過反応が起こる。
別の実施形態では、方法は、培養物又は組織における細胞から単離された細胞核に適用され得、ここで、核は市販の試薬のキットのうちの１つ、又は任意の他の単離方法、例えばスクロース法を使用して抽出され得る。単離後、核は固定化されなければならず、例えば、核は、１×ＨＢＳＳ（１３７ｍＭ Ｎａ＋、１ｍＭ Ｍｇ２＋）中でポリ－Ｄ－リシン表面に付着することができる。サブステップｂはこの実施形態では省略されなければならないが、クロマチンにおけるＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加のために使用され得るトリス緩衝液は、物質の単離のために使用される成分のうちの１つである。
別の実施形態では、核は細胞から単離されてもよく、サブステップｄの後であるがサブステップｅの前に付着されてもよい。サブステップｂはこの実施形態では省略されなければならず、細胞は単離の前に架橋に供されるべきではない。
別の実施形態では、方法が培養物又は組織における細胞を含む生体物質から単離されたＤＮＡ又は抽出されたクロマチンに適用される場合、サブステップａは生体物質の溶解及び／又は単離、及び／又は分画、及び／又は固定化を含むことを意味し、物質は、例えばガラスに固定化されるか、又は物質はビオチンにより覆われたガラスに固定化することができ、ビオチン化ヌクレオチドがＤＮＡ末端の固定化及び修飾のさらなるステップの前にニックトランスレーションアッセイを使用して組み込まれる場合、ストレプトアビジンによりブロッキングされる。或いは、ＤＮＡ末端を修飾する場合、酵素並びに修飾及び非修飾ヌクレオチドの混合物は、例えば、ポリメラーゼＩと、非修飾ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド及びＢｒｄＵの混合物と共にＴｄＴを使用することができる。これらの実施形態はビオチン化ヌクレオチドのさらなる検出の可能性を排除し；ＤＮＡ末端の修飾が溶液中で実施される場合、物質の固定化の前に、ＤＮＡはイソプロパノールを使用して沈殿され、７０％エタノールにより洗浄され；サブステップｂは省略される。
他の実施形態では、ＤＮＡ又はクロマチンは、懸濁液中の接着細胞若しくは細胞、又は組織から単離され、サブステップｄの後であるがサブステップｅの前に固定化される（細胞は単離の前にいかなる架橋反応にも供されるべきではない）。
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ又はクロマチンは、接着細胞、又は懸濁液中の細胞、又は組織から単離され、サブステップａ～ｇの後に固定化される。
上述の実施形態はまた、単一のＤＮＡ末端（複数可）の存在及び位置をマーキングするためのローリングサークル複製の使用、及び生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）を検出するための方法の使用も反映する。
〔定義〕
方法、方法に使用される技術及び薬剤、例えば、本発明の化合物、組成物、溶液、緩衝液を記載する場合、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有する。さらに、本明細書に使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、使用の文脈が別段の指示を明確に示さない限り、対応する複数形を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加の要素が存在してもよいことを意味する。本明細書に使用される成分の量、処理条件のような特性などを表す全ての数は、全ての場合、本発明の目的に関して同等であり、別段の指示がない限り、交換可能に使用され得る、「約」又は「およそ」という用語によって修飾されることは理解される。少なくとも、及び特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数字は、報告された有効数字に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
本発明はＤＮＡ末端（複数可）の検出方法に関するので、本明細書において「ＤＮＡ末端」は、ヌクレオチドが１つの他のヌクレオチドのみと連結されるか、又はデオキシリボースが１つのリン酸基のみと連結されるか、又はリン酸基が２つのデオキシリボース分子の代わりに１つと連結されるＤＮＡ分子における部位として定義される。一般に、このような末端は、（生）化学的（例えば、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ）又は物理的（例えば、電離放射線）因子によって生成され得る。ＤＮＡ末端（テロメア又はトポイソメラーゼによって生じる一過性を除く）はＤＮＡの機能を妨げ、したがって細胞機能に対する有害作用を引き起こす。
「ＤＮＡ損傷（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ）」という用語は、ＤＮＡの塩基組成、塩基構造又は一次若しくは二次構造におけるあらゆる変化と理解され、限定されないが、塩基欠失、塩基酸化、ホスホジエステル結合の切断を含み、これにより、ＤＮＡ分子は、損傷剤の作用の前に生きている生物の正常で健康な細胞において見出される元のものとは異なるものになる。典型的な損傷剤は、例えば、電離放射線、ＵＶ、酸化剤、メチル化剤、及び当該技術分野において周知の他のものである。
「ＤＮＡ切断（ＤＮＡ ｂｒｅａｋ）」は、共有結合のあらゆる切断、例えば、ホスホジエステル結合の切断又はデオキシリボース環の切断としてこの記述において定義され、ＤＮＡポリマーの不連続性を生じる。ＤＮＡ切断は典型的にＤＮＡ損傷をもたらし、本発明の目的に関して、ＤＮＡ末端の形成をもたらすと理解される。ＤＮＡ分子において観察されるＤＮＡ切断の代表的な型には、限定されないが、一本鎖ニック、一本鎖ギャップ、単一のホスホジエステル結合の一本鎖切断、二本鎖平滑末端切断、二本鎖３’突出切断、二本鎖５’突出切断など、及び３’－ＯＨ又は５’－リン酸ＤＮＡ末端が存在しないものを含む、他の型のＤＮＡ鎖切断が含まれる。
「ＤＮＡ鎖（複数可）」、「ＤＮＡ分子」、「ＤＮＡポリマー」、ＤＮＡは、本明細書において等価物として使用され、交換可能に使用される。
本発明による方法は生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）の検出に関するので、本発明の目的に関して、「生体物質」には、限定されないが、例えば、ヒト、植物、原生動物、又は細菌細胞を含む動物、ウイルス、組織及びそれらの断片、並びに前記物質の成分を含む群から選択され生きている又は固定された物質が含まれる。前記物質の全て又は一部は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で切除又は成長されてもよく、抽出、分画、クロマトグラフィー又は他の単離方法によって得られてもよい。
本発明による「生体物質の調製」は、生体物質の固定、透過、溶解、単離、分画、ＤＮＡ末端（複数可）のアクセス可能性を増加させること、非特異的結合部位をブロッキングすることを含む群から選択される処理方法を含む。
「生体物質の固定」という用語は、その構造及び／又は化学的成分の保存を引き起こすことを意図した生体物質の変化をもたらす化学的及び／又は物理的手順を意味する。例には、限定されないが、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドによるタンパク質及びＤＮＡの架橋、エチルアルコール、アセトン又は他の化学物質（したがって固定剤と呼ばれる）への曝露による生体物質の保存が含まれる。
「生体物質の透過」という用語は、細胞又は組織に侵入する能力が限定されている分子のアクセスを可能にするために、生体膜（原形質及び細胞内）及び／又は細胞壁の完全性を損なう結果となる化学的及び／又は物理的手順を意味する。
「溶解」という用語は、さらなる分析のための可溶性成分を抽出するために生体物質の完全性の破壊を意味する。溶解は、限定されないが、均質化、浸透圧ショック、又は界面活性剤及び他の化学物質を含有する溶解緩衝液を含む、化学的又は物理的手段によって実施され得る。
単離ステップが、適切に調製された生体物質を達成するために本発明に従って必要とされ得る。本発明の目的に関して、「単離」という用語は、物質からの特定の成分の分離を導く、生体物質において実施される任意のプロセスを意味する。特定の成分には、限定されないが、組織由来の細胞、細胞由来のオルガネラ、オルガネラの断片、核由来のクロマチンが含まれる。
「生体物質の分画」という用語は、この生体物質から１つ又は複数の所望の成分を分離することを意味する。分画は、粗（未処理）生体物質に適用されてもよく、例えば、溶解のプロセスにおいて獲得された物質のように処理されてもよい。
「ＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させる」は、立体障害を除去し、別様でこれらの末端と接触する能力が限定されている分子（例えばタンパク質）のＤＮＡ末端へのアクセスを可能にするのに十分な空間を提供するプロセスである。
生体物質における非特異的結合部位に関して、「ブロッキングする」という用語は、アッセイにおいて使用される重要な分子、例えば、抗体の、選択された分子がアッセイにおいて有用な親和性を示すもの以外の分子標的への結合の阻止をもたらす手順を意味する。ブロッキングの典型的な例は、生体物質における目的の分子の抗体検出（免疫検出）において使用される手順である。抗体は明確な定義された抗原に対するものであるが、弱い化学的相互作用を介して種々の細胞成分と結合することもできる。この非特異的結合は、このような結合部位を塞ぐブロッキング剤（アルブミンなど）の事前添加によって最小化される。
本発明の解決策をより良く理解するための本発明の目的のために、「分子１～７型」という用語を取り入れた。
「分子１型」は、ＤＮＡ末端と結合することができ、限定されないが、（ａ）ハロゲン化ヌクレオチド若しくはヌクレオシド分子、例えばＢｒｄＵ、ＩｄＵ、ＣｌｄＵ、又はＤＮＡ前駆体類似体、例えばＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）、Ｆ－ａｒａ－ＥｄＵ、５－エチニル－２’－デオキシシチジン、又はビオチン化ヌクレオチド分子、（ｂ）蛍光分子、若しくは化学発光分子、若しくは放射性同位体、若しくは酵素基質、若しくはビオチン分子を含む群から選択される標識により標識されたヌクレオチド、又はヌクレオシド分子、（ｃ）ＤＮＡ又はＲＮＡ末端（複数可）と結合することができるＡＤＰ－リボース分子、又はタンパク質、又は任意の他の分子を構成要素とすることができ、分子２型、若しくは３型、若しくは酵素に対する任意の他の基質、若しくはそれらの類似体のいずれか、若しくはオリゴマー、若しくはポリマー、又はそれらの組合せを結合するための標的として作用することができる、任意の分子として定義される。
「分子２型」及び「分子３型」は、限定されないが、分子１型と相互作用及び／又は結合する能力を有する、抗体若しくはその断片、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン分子、若しくはそれらの類似体、若しくはリガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、アジドのような反応分子、オリゴマー、ポリマー、及び上述のいずれかの類似体、又はそれらの組合せを含む分子として定義される。
「分子４型」及び「分子５型」は、限定されないが、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２型）との相互作用（選択領域のハイブリダイゼーション）、それらのライゲーション、及びその後のＲＣＡ反応を可能にする配列の核酸（オリゴヌクレオチド１型）と共有結合している抗体を含む分子として定義される。分子４型及び５型は、分子２型及び３型と相互作用及び／又は結合する能力を有する。
「ライゲーション」という用語は、触媒反応によって２つの分子間に共有化学結合を形成することを意味する。本発明によれば、ライゲーションとは、ＲＣＡ反応における鋳型として作用する環状オリゴヌクレオチドを生成するために、オリゴヌクレオチド１型、すなわち分子４型及び５型（抗体と結合しているオリゴヌクレオチド）の成分を構成するオリゴヌクレオチドとのこれらのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのプロセス後にオリゴヌクレオチド２型の末端を結合することを指す。
「ハイブリダイゼーション」（核酸ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）は、本発明の記述に使用される場合、核酸の２つの相補的なストレッチ（２つのオリゴヌクレオチド）の間に水素結合を形成するプロセス（アニーリング）を指す。
「分子６型」は、限定されないが、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されるＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合する（ハイブリダイズする）ことができるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３型）を含む分子として定義される。分子６型は、分子シグネチャー、例えば、蛍光発光を有し、この蛍光発光は、適切な機器、例えば、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、レーザー走査サイトメーター又は蛍光分光計によって検出される。
ＲＣＡ反応後の増幅ステップ（ステップ３、サブステップｇ、ｉｉｉ）において使用される「分子６型（オリゴヌクレオチド３型）」という用語における「オリゴヌクレオチド」は、ＲＣＡ反応産物とハイブリダイズすることを意図し、一般的な知識（例えば、ＦＩＳＨ－蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのように）に基づいて当業者によって選択され得る。
「分子７型」は、鋳型としてライゲートされたオリゴヌクレオチド２型の選択配列を使用して形成されるＲＣＡ反応産物を認識し、それと結合することができ、分子シグネチャー、例えば、質量分析によって検出可能な標識と連結している相補的オリゴヌクレオチド、又は後にライゲートされ、検出可能な産物をもたらすＲＣＡ反応についての基質として作用するオリゴヌクレオチドを有するか、又は生成することができる他の分子に対する結合標的として作用することができる分子として定義される。
例えば、分子１～７型の定義に使用される「結合」という用語は、１つの共有結合若しくは複数の共有結合の形成を誘導することによって、又は弱い化学的相互作用、若しくは結合（水素、イオン、疎水性、ファンデルワールスを含む）を誘導することによって、種々の分子を永久的又は一時的に接触させることを意味し、ここで、前記分子を接触させること、連結させること又は付着させることは、酵素的又は非酵素的手段によって達成される。本発明による結合プロセスの例は、分子１型をＤＮＡ末端と接触させること、又は分子２型及び３型を分子１型と接触させて、これらの分子の間に新たな連結を形成することである。
本発明の目的に関して、「触媒手段」という用語は、自発的には起こらない系の化学変化を引き起こす方法又は作用物質を意味するが、それらは、特定の酵素（タンパク質触媒）、ＲＮＡ又は他の因子、例えば表面（例えば白金表面）又は低分子量化学物質の作用を利用することによって可能となる。
「ＲＣＡ反応」又は「ローリングサークル増幅反応」は、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）を利用する、当業者に公知の反応である。ＲＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡの環状分子の複数のコピーを合成することができる核酸の迅速な複製である。このＲＣＲは、いくつかのバクテリオファージ及びウイルスによって使用される天然の生体系に由来する。本発明において使用される「ＲＣＡ反応」は、ＤＮＡ末端に関する情報を伝達する検出可能なシグナルの生成を可能にする。
本発明による方法の検出ステップを理解するために、本明細書に使用される「シグナル」という用語は、ＲＣＡ反応の定義及び本明細書に提供される他の定義において、１つの分子又は複数の分子の検出可能なシグネチャー、例えば、特徴的な蛍光発光、又は他の特徴的な吸光、又は電磁波のエネルギーの放出、又は磁気共鳴特性又は他の分光、化学的、若しくは物理的特徴を意味する。
「シグナルの増幅」は、この目的の分子の存在及び／又は特性に関する情報を伝達する、より強く、より容易に検出可能なシグナルを生じるように目的の分子又はその分子環境を修飾することをもたらす１つの手順又は複数の手順である。本発明によれば、増幅は多数の分子を生成するＲＣＡ反応によって可能になり、この多数の分子は、続いて、「増強した」シグナル、例えば、典型的な手段によって検出可能であり得る蛍光シグナルを生じる多数の標識された分子によって認識される。
「検出」は、当業者に明らかであるように、環境における対象物又は特性の存在に関する情報を取得する能力であり、この対象物又は特性は隠されているか、又は容易に気付くことはできない。本発明によれば、情報は、試料から得られる蛍光又は他のシグナルにコード化され、専用の機器によって記録され得る。本発明に使用され得る検出技術には、限定されないが、顕微鏡法、多くの細胞数の自動分析方法、蛍光顕微鏡法（広視野、共焦点、多焦点、超解像、カタパルティングによる顕微鏡法、レーザー走査、ハイスループット、高含量）を含む分光法、蛍光測定、吸光検出（組織構造）のための透過型光学顕微鏡法、フローサイトメトリー、細胞分類（ＦＡＣＳ）、質量分析法の種々の種類が含まれる。
本発明に関して、方法の特徴を理解することが極めて重要であり、検出感度は、少数若しくは多数の目的の対象物、又は低レベル若しくは高レベルの目的の特性を検出する能力としてさらに定義され；高感度とは、少数又は低レベルの目的の対象物又は特性を検出する能力を指す。本発明の目的に関して、検出手段の能力に関連する高感度は、単一（１つ）のＤＮＡ末端でさえも適切な技術によって検出可能であることを意味する。明らかなことであるが、任意の他のより多くの数の単一の末端（多くの末端）が、本発明による方法によって検出可能である。上記の事実は以下の記述に示される実施例に例示される。
本発明による特許請求の範囲において、他の用語も本発明の保護範囲を記載するために導入された。
「修飾ヌクレオチド」という用語は、通常、生きている生物のＤＮＡ又はＲＮＡに存在しない、１つの官能基若しくは複数の官能基、又は他の化学修飾を有することによってＤＮＡ又はＲＮＡの構成単位であるヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを意味する。非限定的な例には、ブロモデオキシウリジン、エチニルデオキシウリジン又はビオチン化ヌクレオチドが含まれる。
「オリゴヌクレオチド１型」という用語は、限定されないが、抗体に連結されて分子４型及び分子５型を形成し、オリゴヌクレオチド２型とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと定義される。
「オリゴヌクレオチド２型」という用語は、（ｉ）分子４型及び分子５型の成分であるオリゴヌクレオチド１型とハイブリダイズし、（ｉｉ）ライゲーションを受け、したがって（ｉｉｉ）その後のＲＣＡ反応のための基質を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。
「オリゴヌクレオチド３型」という用語は、１つのフルオロフォア若しくは複数のフルオロフォア、又は当該技術分野において公知の方法によって検出可能な他の標識により標識され、ＲＣＡ反応によって形成された得られたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。
増幅ステップ（ステップ３、サブステップｇ、ｉｉｉ）において言及される「ヌクレオチド溶液」は、生きている生物のＤＮＡの典型的な成分である４つのヌクレオチドの溶液である。
本発明の方法をより良く理解するために、請求項１において以下のシステムを使用した。本発明による方法は３つの主要なステップＩ～ＩＩＩを含み、各ステップはさらなるサブステップａ～ｇを含む。さらに、サブステップｇは３つの二次サブステップｉ～ｉｉｉを含む。ステップは示された順序で実施されることが義務付けられ、すなわち、ステップＩＩはステップＩの後に続かなければならず、ステップＩＩＩはステップＩＩの後に続かなければならず、これらの主要なステップの各々は少なくとも１つのサブステップを含まなければならない。別段の指示がない限り、特許請求の範囲に示されるように、他のサブステップが使用されてもよく、又は使用されなくてもよく、それらの複数の組合せが使用されてもよい。「任意選択で」という用語は、サブステップ（例えば、二次サブステップ）が方法において使用されてもよく、又は使用されなくてもよいことを意味する。主要ステップＩ～ＩＩＩの名称は定義された意味を有さず、方法を理解し、明確にするステップ順序を構築するために導入された。
本発明による、上記の分子１～７型、オリゴヌクレオチド１～３若しくは他の型の分子、又はそれらの溶液は、商業的供給源から得ることができ、及び／又は任意の簡便な方法を使用して調製することができる。一般的な知識に基づき、この記述の定義に従う、上述の分子の選択は、別段の記載がない限り、当業者には当然かつ自明であると考慮されるべきである。
本発明による方法は、分子診断分野において公知である改変されていない方法、例えば、タンパク質の検出のために慣例的に使用されることが推奨される標準的なＴＵＮＥＬ、又はＰＬＡ法の使用を含まないが、それらのアプローチの部分、要素又は態様のみを使用するので、一般的に定義される分子１～７、オリゴヌクレオチド１～３、若しくは他の型の分子、又はそれらの溶液及び緩衝液のような媒体のいくつかを、市販のキットから本発明を実現するために個々に又は群（複数可）で利用することができる。したがって、供給業者がそれらの特徴を提供しないので、本発明において分子１～７として指定された特定の化合物の一覧を提供することができないこと、及び実施例においてその仕様を提供することができないことは明らかである。
例えば、分子６型は、ＲＣＡ産物とのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有さなければならず、付着した蛍光分子を有さなければならない。一般に、このような配列及び蛍光分子型は、それらの製造業者によって開示されていない。上記についての別の例は、さらなるＲＣＡ反応に適した別のヌクレオチド（基質）であり得るか、又は特定の蛍光を発する蛍光標識された分子であり得るか、又は別の分子とＦＲＥＴを示すことができるなどの分子７型である。
市販のキット、試薬及びそれらの供給業者の例は、ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（ＡＵ：１００１、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＣＳ ＤＮＡ損傷キット（Ｈ１０２９２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、比色ＴＵＮＥＬアポトーシスアッセイ（＃８０８８、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）コメットアッセイキット（ＳＴＡ－３５０、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂ７００２Ｓ）、Ｎ６－（６－アミノ）ヘキシル－２’－デオキシアデノシン－５’－トリホスフェート－ビオチン（ビオチン－７－ｄＡＴＰ）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－８３５－ＢＩＯ－Ｓ）、ビオチン－１６－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－８０９－ＢＩＯ１６）、ビオチン－１６－５－アミノアリル－ｄＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－８０３－ＢＩＯ１６）、ｄＧＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＵ－１００３）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ））（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、ＭＯ２０９）、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡプローブ抗マウスマイナス（Ｐｒｏｂｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＭＩＮＵＳ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００４）、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡプローブ抗ウサギプラス（Ｐｒｏｂｅ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＰＬＵＳ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００２）、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬グリーン（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｇｒｅｅｎ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬レッド（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｒｅｄ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００８）、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒｓ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）である。
〔発明の利点〕
技術水準に照らして本発明の主な利点の例を以下に記載する。
本発明による方法は、当該技術分野からの任意の公知の方法を使用して達成されなかったＤＮＡ末端（複数可）の直接検出及びその後の可視化を可能にする。本発明は、単一のＤＮＡ切断の存在及び位置をマーキングすることを可能にする。これらの特徴は、本発明が当該技術分野に存在する本質的な技術的問題を解決すること、すなわち、本発明が核内の一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ切断の存在、数、及び位置を決定することを可能にし、切断（複数可）の型を区別する能力を与えることを考慮することを可能にする。このことは、対象のＤＮＡの質を評価するため、及びＤＮＡ損傷誘導、感度及び修復の機構のさらなる研究のために必要とされる。
さらに、決定自体が本発明の方法によって達成され得るだけでなく、ＤＮＡ末端の数の定量アッセイを得ることもできる。上述の特徴は、生体物質の質、又は環境危険因子の存在を評価する際に使用され得る。
上記に述べられ、特許請求の範囲に公開され、また、実施例に示されるように、本発明による方法は、非常に感度が高く；当該技術分野において公知の他の方法よりも感度が高い。本発明は、単一のＤＮＡ切断でさえも直接的に検出することを可能にする。
本発明はさらに、高度に特異的であり、特定の型のＤＮＡ傷害を検出することを可能にする方法に関する。本明細書で得られた知識は、例えば、ＤＮＡ切断の形成の原因及び遺伝的障害におけるその役割に関する情報の適切な組合せと共に使用される場合、診断目的のために使用され得る。
方法はまた、本発明の範囲に関して普遍的である。方法は、ＤＮＡ切断型、ＤＮＡ末端の型、生体物質の種類、分子、試薬及び使用される技術を考慮して、使用される種々の実施形態の能力に関係する。
本発明は、本発明の範囲をいかなる様式においても限定することを意図しない以下の実施例を用いて、より詳細に説明される。
実施例は、この記述に提示される主な実施形態に関する一般的なプロトコールに基づいて記載される。
比較目的のために、以下の実施例は、ほとんどの場合、ＤＮＡ切断を検出するための標準的な方法、すなわちＴＵＮＥＬアッセイを使用する。ＴＵＮＥＬアッセイ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化）は、固定細胞におけるＤＮＡ末端を検出する技術であり、このＴＵＮＥＬアッセイは、特許出願である国際公開第１９９７００８３４５ Ａ１号、及びコミュニケーションである、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｚ、Ｇａｌｋｏｗｓｋｉ Ｄ、Ｚｈａｏ Ｈ、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｕｓｉｎｇ ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００８年３月；４４（３）：２５０～４頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ、２００７．１１．００８に開示されているように、ポリメラーゼＴｄｔ、ヌクレオチド類似体及び抗類似体抗体、並びに蛍光検出を利用する。
一般的手順
手順１
酵素ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）を使用して実施されるｉｎ ｓｉｔｕＤＮＡ損傷検出の一般的手順－一本鎖ギャップ、二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断の検出。
試料調製：使用する細胞の種類についての標準的な条件下でカバースリップ又はガラス底を有するペトリ皿において培養した細胞。細胞培養物の密度は手順の開始時におよそ５０～６０％のコンフルエンシーに到達させなければならない。
手順：
１．事前調製（任意選択）：
０．５～１０ｍＭトリスとの生細胞のインキュベーション（室温（ＲＴ）にて５分～１時間）、細胞を形態学的異常についてモニターしなければならない。
２．固定及び透過：
ａ．１％～４％ホルムアルデヒド溶液とのインキュベーション、１０～１５分、４℃。（任意選択）
ｂ．イオン性界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（０．２５～３％）とのインキュベーション、１０分～１時間、ＲＴ。（任意選択）
ｃ．７０％エタノール水溶液でのインキュベーション、最低１時間であるが、好ましくは１２～１８時間、－２０℃、試料は数か月間安定でなければならない。（任意選択であるが、最も好ましい）
３．事前ブロッキング（任意選択）：
ａ．洗浄（ＰＢＳ１×５分）
ｂ．ストレプトアビジン溶液－液滴で実施したインキュベーション、３０分、ＲＴ
ｃ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
ｄ．ビオチン溶液－液滴で実施したインキュベーション、３０分、ＲＴ
ｅ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
４．ＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加：
０．５～１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液とのインキュベーション、１０分～１時間、ＲＴ。
５．組み込み手順：
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用した非修飾及び修飾ヌクレオチド（例えばＢｒｄＵ）の組み込み：
ａ．インキュベーションを湿潤チャンバ内の液滴で実施する
ｂ．試料を洗浄緩衝液ですすぐ
６．ブロッキング：
ＰＢＳ中の１～５％ＢＳＡ溶液とのインキュベーション（４℃、ＲＴにおいて１時間から一晩）。
７．一次抗体とのインキュベーション－湿潤チャンバ内の液滴で実施した：
ａ．一次抗体１型（例えば、ＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体）、好ましい希釈１～５％ＢＳＡ中で１：１００、１時間、ＲＴ
ｂ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
ｃ．一次抗体２型（例えば、ＢｒｄＵに対するウサギポリクローナル）、好ましい希釈１～５％ＢＳＡ中で１：１００、１時間、ＲＴ
ｄ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
８．ＰＬＡ手順：
ａ．１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物における１％ＢＳＡ中で希釈したＰＬＡプローブとのインキュベーション（３７℃、６０分、湿潤チャンバ内の液滴での反応）：
８μｌのＰＬＡプローブマイナスストック（例えば抗マウス）
８μｌのＰＬＡプローブプラスストック（例えば抗ウサギ）
２４μｌの１％ＢＳＡ
ｂ．洗浄緩衝液Ａで試料を洗浄する（２×５分）
ｃ．ライゲーション－１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物におけるインキュベーション（３７℃、３０分、湿潤チャンバ内の液滴での反応）：
８μｌの５×ライゲーションストック（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２００９）、
３１μｌの超高純度、ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有、蒸留水、
１μｌのリガーゼ（１Ｕ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０２７又はＤＵＯ８２０２９）
ｄ．洗浄緩衝液Ａで試料を洗浄する（２×２分）
ｅ．増幅－１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物におけるインキュベーション（３７℃、１００分、湿潤チャンバ内の液滴で実施した反応）：
８μｌの５×増幅ストック（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０６０又はＤＵＯ８２０１１）、
３１．５μｌの超高純度、ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有、蒸留水、
０．５μｌのポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０２８又はＤＵＯ８２０３０）
９．蛍光顕微鏡を使用したＰＢＳ中での試料の画像化。
手順２
酵素ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して実施したＤＮＡ損傷検出の一般的手順－一本鎖ニック、一本鎖ギャップ及び二本鎖３’の凹んだ末端の検出。
試料調製：使用する細胞の種類についての標準的な条件下でカバースリップ又はガラス底を有するペトリ皿において培養した細胞。細胞培養物の密度は手順の開始時におよそ５０～６０％のコンフルエンシーに到達させなければならない。
手順：
１．事前調製（任意選択）：
ａ．０．５～１０ｍＭトリスとの生細胞のインキュベーション（室温（ＲＴ）にて５分～１時間）、細胞を形態学的異常についてモニターしなければならない。
２．固定及び透過：
ａ．１％～４％ホルムアルデヒド溶液とのインキュベーション、１０～１５分、４℃。（任意選択）
ｂ．イオン性界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（０．２５～３％）とのインキュベーション、１０分～１時間、ＲＴ。（任意選択）
ｃ．７０％エタノール水溶液でのインキュベーション、最低１時間であるが、好ましくは１２～１８時間、－２０℃、試料は数か月間安定でなければならない。（任意選択であるが、最も好ましい）
３．事前ブロッキング（任意選択）：
ａ．洗浄（ＰＢＳ１×５分）
ｂ．ストレプトアビジン溶液－液滴で実施したインキュベーション、３０分、ＲＴ
ｃ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
ｄ．ビオチン溶液－液滴で実施したインキュベーション、３０分、ＲＴ
ｅ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
４．ＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加：
０．５～１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液とのインキュベーション、１０分～１時間、ＲＴ。
５．ＤＮＡポリメラーゼＩを使用した非修飾及び修飾（例えばビオチンがコンジュゲートした）ヌクレオチドの組み込み：
ａ．試料を蒸留水ですすぐ
ｂ．以下からなる反応混合物におけるインキュベーション（湿潤チャンバ内の液滴で５～６０分、ＲＴ）：
反応緩衝液
ｄＮＴＰ（修飾ヌクレオチド対非修飾ヌクレオチドの比は３：１から１：３で変わる）
ＤＮＡポリメラーゼＩ
超高純度、ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有、蒸留水
ｃ．反応停止：
５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４８）とのインキュベーション、２×１０分、ＲＴ
０．５ｍＭトリスＨＣｌとのインキュベーション、１×１分、ＲＴ
６．ブロッキング：
ＰＢＳ中の１～５％ＢＳＡ溶液（４℃、ＲＴにおいて１時間から一晩）。
７．一次抗体とのインキュベーション－湿潤チャンバ内の液滴で実施した：
ａ．一次抗体１型（例えば、ビオチンに対するマウスモノクローナル）、好ましい希釈１～５％ＢＳＡ中で１：１００、１時間、ＲＴ
ｂ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
ｃ．一次抗体２型（例えば、ビオチンに対するウサギポリクローナル）、好ましい希釈１～５％ＢＳＡ中で１：１００、１時間、ＲＴ
ｄ．洗浄（ＰＢＳ３×５分）
８．ＰＬＡ手順：
ａ．１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物における１％ＢＳＡ中で希釈したＰＬＡプローブとのインキュベーション（３７℃、６０分、湿潤チャンバ内の液滴での反応）：
８μｌのＰＬＡプローブマイナスストック（例えば抗マウス）
８μｌのＰＬＡプローブプラスストック（例えば抗ウサギ）
２４μｌの１％ＢＳＡ
ｂ．洗浄緩衝液Ａで試料を洗浄する（２×５分）
ｃ．ライゲーション－１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物におけるインキュベーション（３７℃、３０分、湿潤チャンバ内の液滴での反応）：
８μｌの５×ライゲーションストック（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２００９）、
３１μｌの超高純度、ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有、蒸留水、
１μｌのリガーゼ（１Ｕ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０２７又はＤＵＯ８２０２９）
ｄ．洗浄緩衝液Ａで試料を洗浄する（２×２分）
ｅ．増幅－１つのカバースリップ当たり４０μｌの反応混合物におけるインキュベーション（３７℃、１００分、湿潤チャンバ内の液滴で実施した反応）：
８μｌの５×増幅ストック（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０６０又はＤＵＯ８２０１１）、
３１．５μｌの超高純度、ＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有、蒸留水、
０．５μｌのポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｕｏｌｉｎｋ、ＤＵＯ８２０２８又はＤＵＯ８２０３０）
９．蛍光顕微鏡を使用したＰＢＳ中での試料の画像化。
実施例１
手順１による方法を使用して未処理及びＤＮａｓｅ Ｉにより処理した固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出
この実験では、ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄから得た）を使用した。細胞を１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり０．２×１０６）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で３日間培養した。続いて、細胞を７０％エタノール水溶液で－２０℃にて１２時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液で室温にて３０分間インキュベートした。ＤＮＡ末端のプロセシングの前に、ＤＮＡ切断を誘導するためにいくつかの試料をＤＮａｓｅ Ｉにより処理した。０．２又は４単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ２２２２）、１×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ８１７０Ｇ）及び水からなる反応混合物において室温にて３０分間、液滴で反応を実施した。続いて、ＢｒｄＵを、ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）を使用したＴｄＴ酵素を使用してＤＮＡの遊離末端と連結した。次いで、細胞をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液と４℃にて一晩インキュベートした。手順１のステップ７による一次抗体１型及び２型とのインキュベーションを、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）及びウサギポリクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）をそれぞれ使用して実施した。最後の洗浄後、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）、検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用してステップ８（ＰＬＡ手順）に従って細胞を処理した。ＰＬＡプローブを１％ＢＳＡ中で希釈した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５００～６００ｎｍ）を使用して画像化し、分析した。
結果：
手順１に供した未処理のＨｅＬａ細胞のほとんどは、細胞核内に、遊離ＤＮＡ末端を表す蛍光フォーカスを示さなかった。しかしながら、最大で３つのフォーカスが細胞のサブセットの核内に検出された（図２；第３の行、右側の画像）。ＤＮａｓｅ Ｉにより処理した細胞では、未処理の細胞においてよりも多くのフォーカスが検出された。より低い及びより高いＤＮａｓｅ Ｉ濃度では、検出されたフォーカスの最大数はそれぞれ１２及び１５６であった。未処理及びＤＮａｓｅ Ｉにより処理した（低濃度及び高濃度）細胞において検出されたフォーカスの平均数は、０．４±０．１（Ｎ＝４９）、２．４±０．３（Ｎ＝７８）及び６２．２±４．６（Ｎ＝３６）であった（図３）。未処理及びＤＮａｓｅ Ｉにより処理した（低濃度）細胞におけるフォーカスの平均数の間の差は統計的に有意であり、ｐ値＝２．３×１０－７（独立２標本ｔ検定）である。
比較例１
標準的なＴＵＮＥＬアッセイを使用した未処理及びＤＮａｓｅ Ｉにより処理した固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出。
ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄから得た）を、１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり０．２×１０６）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で３日間培養し、次いでＡＰＯ－ＢＲＤＵ（ＴＵＮＥＬアッセイ）キットの説明書に従って処理した。エタノールで固定した後、ＤＮＡ切断を誘導するためにいくつかの試料をＤＮａｓｅ Ｉにより処理した。０．２又は４単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ２２２２）、１×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ８１７０Ｇ）及び水からなる反応混合物において室温にて３０分間、液滴で反応を実施した。ＢｒｄＵの免疫蛍光染色のために使用した抗体は、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度に交差吸着した二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ－１１０２９）であった。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５００～６００ｎｍ）を使用して画像化した。
比較例１を実施例１の結果と比較した。
結果：
顕微鏡画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。各試料について少なくとも３０個の核を分析した。標準的なＴＵＮＥＬアッセイ（ＡＰＯ－ＢＲＤＵ）については、シグナルは核内のピクセルの平均濃淡値（蛍光強度）であった。手順１による方法については、各核におけるフォーカスの数を決定した。両方のアッセイ（標準的なＴＵＮＥＬ及び手順１による方法）について、高濃度のＤＮａｓｅ Ｉ（４Ｕ）により処理した試料では、未処理の細胞（標準的なＴＵＮＥＬ、蛍光強度：ＤＮａｓｅ処理において１１１．８±１４．６ａ．ｕ．（Ｎ＝３４）対未処理において５．７±０．１ａ．ｕ．（Ｎ＝４０）、手順１：ＤＮａｓｅ処理において６２．２±４．６のフォーカス（Ｎ＝３６）対未処理において０．４±０．１のフォーカス（Ｎ＝４９））と比較してシグナルの有意な増加が観察された（図３）。しかしながら、独立２標本ｔ検定により、低濃度のＤＮａｓｅ Ｉ（０．２Ｕ）により処理した試料と未処理の試料との間のシグナルの差は、手順１に従って細胞をプロセシングした後にのみ統計的に有意であったことが示された（標準的なＴＵＮＥＬ、ＤＮａｓｅ処理において蛍光強度６．０±０．２ａ．ｕ．（Ｎ＝３４）対未処理において５．７±０．１ａ．ｕ．（Ｎ＝４０）、ｐ値＝０．２；手順１：ＤＮａｓｅ処理において２．４±０．３のフォーカス（Ｎ＝７８）対未処理において０．４±０．１のフォーカス（Ｎ＝４９）、ｐ値＝２．３×１０－７）。代表的な画像及び定量分析を図２及び図３に提示する。
結論：
手順１による方法は標準的なＴＵＮＥＬアッセイよりも有意に感度が高い。
実施例２
手順２による方法を使用した未処理の固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出
この実験では、ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄから得た）を使用した。細胞を１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり０．２×１０６）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で３日間培養し、次いで７０％エタノール水溶液で－２０℃にて１２時間インキュベートした。その後、試料を手順２のステップ３（内因性ビオチンのブロッキング）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、内因性ビオチンブロッキングキット、Ｅ－２１３９０）に従って処理した。ＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加（ステップ４）を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液でＲＴにて３０分間実施した。非修飾及び修飾されたビオチンがコンジュゲートしたヌクレオチドを組み込むために、細胞を超高純度蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０９７７－０３５）に浸漬し、次いで１つのカバースリップ当たり１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂ７００２Ｓ）、３０μＭの各ｄＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｄＡＴＰ：ＮＵ－１００１、ｄＣＴＰ：ＮＵ－１００２、ｄＧＴＰ：ＮＵ－１００３、ビオチン－１６－５－アミノアリル－ｄＵＴＰ：ＮＵ－８０３－ＢＩＯ１６）、３単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、ＭＯ２０９）からなる反応混合物及び超高純度蒸留水とインキュベートした（湿潤チャンバ内で３７℃にて１時間のインキュベーション）。反応を停止させるために、次に細胞を手順２のステップ５（ｃ）に記載されるようにインキュベートし、続いてブロッキングステップをＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液により実施した（４℃にて一晩）。一次抗体１型及び２型とのインキュベーション（手順２のステップ７）を、マウスモノクローナル抗ビオチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１３４１）（１％ＢＳＡ中で１：１００）及びウサギポリクローナル抗ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３４９４）（１％ＢＳＡ中で１：１００）をそれぞれ使用して実施した。最後の洗浄後、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）、検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用してステップ８（ＰＬＡ手順）に従って細胞を処理した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５１０～６００ｎｍ）を使用して画像化した。
結果
明るい蛍光フォーカスとして表される遊離ＤＮＡ末端は、手順２（ステップ３－内因性ビオチンのブロッキングを行う）に従って処理された未処理のＨｅＬａ細胞において容易に検出された（図４、第２の行、右側の画像）。１つの核当たりに検出されたフォーカスの平均数は１１６±６（Ｎ＝２３）であった。
実施例３
手順２による方法を使用した固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出－内因性ビオチンのブロッキングの効果の評価。
ＨｅＬａ２１－４細胞を、手順２からのステップ３（事前ブロッキング）を行わずに実施例２のように処理した。
結果：
明るい蛍光フォーカスとして表される遊離ＤＮＡ末端は、手順２（ステップ３－内因性ビオチンのブロッキングは行わない）に従って処理された未処理のＨｅＬａ細胞において容易に検出された（図４、第２の行、左側の画像）。１つの核当たりに検出されたフォーカスの平均数は１２８±６（Ｎ＝２４）であった。
結論（実施例２及び３）：
内因性ビオチンのブロッキングを行わずに手順２（ステップ３）に従って処理した試料では、このステップが存在した試料よりもわずかに多くの遊離ＤＮＡ末端が検出された（１２８±６対１１６±６）。しかしながら、独立２標本ｔ検定により、ｐ値＝０．１５がもたらされ、これらの２つの試料の間の差が統計的に有意ではないことが示された。したがって、内因性ビオチンのブロッキングは依然として推奨されるが、手順２に従って試料を処理することによって得られる結果については重要ではないと結論付けることができる。
標準的な技術と本発明の方法との差を決定するために、以下の比較例を実施した。
比較例２
ＤＮＡポリメラーゼＩ及び標準的なニックトランスレーションアッセイを使用した固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出。
ＨｅＬａ細胞を実施例２又は３のように処理したが、手順２からのステップ７ｃ～８は省略した。代わりに、ステップ７ｂに続いて二次抗体とのインキュベーションを行った。使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高度に交差吸着した二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ－１１０２９）であった。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５１０～６００ｎｍ）を使用して画像化した。
結果：
両方のプロトコール（標準及び本発明の方法）は未処理のＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端を検出することを可能にした（図４）。内因性ビオチンをブロッキングする効果は、標準的なニックトランスレーションアッセイに従って処理した試料において容易に見ることができ、事前ブロッキングにより、内因性ビオチンブロッキングステップを行っていない試料と比較して蛍光シグナルの有意な減少がもたらされ（蛍光シグナル：ステップ３を行った試料の１１ａ．ｕ．対ステップ３を行っていない試料の９２ａ．ｕ．）（図４、第１の行）。ステップ３を行った又は行っていない手順２に従って調製した試料では、フォーカスの平均数の間の差は統計的に有意ではなかった（１１６±６対１２８±６のフォーカス、独立２標本ｔ検定：ｐ値＝０．１５）（図４、第２の行）。
結論：
ＤＮＡポリメラーゼＩを利用する両方のアッセイは未処理の細胞における遊離ＤＮＡ末端を検出することができるが、手順２によるアッセイはＤＮＡ切断の定量化の可能性に起因して有利である。このことは、この手順に従って調製した試料では、遊離ＤＮＡ末端はゼロに近いバックグラウンドにおいて容易に検出可能な明るい蛍光フォーカスとして表されるという事実に由来する。また、これらの方法を使用して得られた結果に対する内因性ビオチンのブロッキングの効果の比較は、手順２による方法が標準的なアッセイよりも特異的である、すなわち偽陽性が少なくなることを示す。この結論は、内因性ビオチンのブロッキングが、手順２による方法によって検出されたフォーカスの平均数の減少をもたらさないという事実によって強く支持される。
実施例４
修復タンパク質であるＸ線修復交差補完タンパク質１（ＸＲＣＣ１）の蓄積された分子によって形成された修復フォーカスの局在化に関連する内因性の自発的ＤＮＡ切断の局在化を決定するための手順１による固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出。
本発明の手順１による方法が、特定の型の切断、すなわち一本鎖ギャップを検出することができることを確認するために、手順１に記載される方法を使用して細胞核内で自発的ＤＮＡ切断を検出した。それらのＤＮＡ切断は、修復タンパク質であるＸ線修復交差補完タンパク質１（ＸＲＣＣ１）の蓄積された分子によって形成された修復フォーカスの局在化に関連して局在化した。このタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ損傷修復経路（一本鎖切断修復、略称ＳＳＢＲ、又は塩基除去修復、略称ＢＥＲ）に関与することが知られている。
この実験では、ＨｅＬａ２１－４細胞株（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ教授、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た）を使用した。細胞を１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり３．５×１０４）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養し、次いでプラスミドｐｍＲＦＰ－Ｃ１－ＸＲＣＣ１をトランスフェクトした（トランスフェクション剤：ＦｕＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８５０７０）中で調製したトランスフェクションミックス、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中で培養した細胞）。細胞をトランスフェクション後３６時間培養した。続いて、細胞を、４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０－Ｓ）と室温にて１５分間インキュベートし、室温にて１時間、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）により透過した。ＢｒｄＵを、ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）を使用したＴｄＴ酵素を使用してＤＮＡの遊離末端と連結した。次いで細胞をＰＢＳ中の５％ＢＳＡ溶液と４℃にて一晩インキュベートした。手順１のステップ７による一次抗体１型及び２型とのインキュベーションを、ＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体（希釈：５％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）及びＢｒｄＵに対するウサギポリクローナル抗体（希釈：５％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）をそれぞれ使用して実施した。洗浄の最後のステップの後、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）を使用してステップ８（ＰＬＡ手順）に従って細胞を処理し；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して試料を洗浄した。Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）を使用して蛍光シグナルを生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して画像化し、分析した（ＤＮＡの遊離末端と結合しているＢｒｄＵの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ；ＸＲＣＣ１の検出に関して：励起：５６１ｎｍ、発光：６００～７００ｎｍ）。３Ｄスタック画像を、ＳＶＩ ３Ｄホイヘンスデコンボルーション＆分析ソフトウェア（Ｈｕｙｇｅｎｓ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂ．Ｖ．、Ｈｉｌｖｅｒｓｕｍ、オランダ）を使用してデコンボリューションした。
結果：
ＢｒｄＵ分子の組み込みは、二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断又は一本鎖ギャップが生じる場合に存在する、ＴｄＴ酵素によって認識される特定の型のＤＮＡ３’－ＯＨ末端をマークする。ギャップはＢＥＲ経路の間に生じる。したがって、ＢｒｄＵが隣接するＸＲＣＣ１フォーカスと共に検出される領域は、一本鎖ギャップが生じる部位のみである可能性が高い。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ａｂｒａｍｏｆｆ Ｍ．Ｄ．、Ｍａｇａｌｈａｅｓ Ｐ．Ｊ．、Ｒａｍ Ｓ．Ｊ．：ｉｍａｇｅＪを用いた画像処理（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｔ．、２００４年；１１：３６～４１頁）を使用して、画像を分析し、ＢｒｄＵフォーカスの蛍光最大を見出し、割り当てた。修復タンパク質フォーカスを表し、プロファイルにおける上述の最大値を局在化している画像の蛍光プロファイルの分析は、ＤＮＡ切断がＸＲＣＣ１修復フォーカスの周辺領域に隣接して、又は周辺領域において一貫して検出されることを示す（図５）。
結論：
この結果により、修復因子の蓄積によって確認されるＤＮＡ切断が起こる場合にのみシグナルが得られることを示す手順１による方法の特異性が確認される。文献（Ｃａｌｄｅｃｏｔｔ Ｋ．Ｗ．：ＸＲＣＣ１ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）．、２００３年；２：９５５～９６９頁；Ｈａｎｓｓｅｎ－Ｂａｕｅｒ Ａ．、Ｓｏｌｖａｎｇ－Ｇａｒｔｅｎ Ｋ．、Ａｋｂａｒｉ Ｍ．、Ｏｔｔｅｒｌｅｉ Ｍ．：Ｘ－ｒａｙ Ｒｅｐａｉｒ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｉｎ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１２年；１３：１７２１０～１７２２９頁、Ａｂｂｏｔｔｓ Ｒ．、Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ．Ｍ．３ｒｄ：Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２０１７年；１０７：２２８～２４４頁）によると、ＸＲＣＣ１は、一本鎖ギャップが生じる場合に、塩基除去修復に関与するタンパク質の活性を必要とするものを含む、一本鎖ＤＮＡ切断の発生に応答して、ＤＮＡ損傷部位に特異的に蓄積する。ＢｒｄＵ分子が組み込まれる部位におけるこの修復タンパク質の蓄積の同時検出により、ＢｒｄＵから検出されるシグナルがアーチファクトではないという確認が行われ、手順１による方法により、遊離ＤＮＡ末端の認識がもたらされる。さらに、この実験の結果は、手順１による方法が細胞核におけるｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡ切断局在化の分析に適用可能であることを示す。
実施例５
修復タンパク質であるＸ線修復交差補完タンパク質１（ＸＲＣＣ１）の蓄積された分子によって形成される修復フォーカスの局在化に関連する、及びＤＮＡ複製領域の局在化に関連する内因性の自発的ＤＮＡ切断の局在化を決定するための手順１による固定ＨｅＬａ細胞における遊離ＤＮＡ末端の検出。
本発明の手順１による方法が、最低限の非特異的検出シグナルでＤＮＡ複製領域内で生じる特定の型の切断の検出に使用できることを確認するために、内因性の自発的ＤＮＡ切断を、修復タンパク質であるＸ線修復交差補完タンパク質１（ＸＲＣＣ１）の蓄積された分子によって形成される修復フォーカスの局在化に関連して、及びＤＮＡ複製領域の局在化に関連して局在化させた。
この実験は、同じＨｅＬａ細胞株を使用して実施例４のように実施した。複製フォークを標識するために、生細胞を、４％ＰＦＡによる固定の前に製造業者の説明書に従って前駆体ＥｄＵ（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ１０３３７）と３７℃にて３０分間インキュベートした。ＰＬＡプローブの検出後、ＥｄＵの組み込み領域を、キットに提供されているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８アジド試薬をＡｔｔｏ ３９０アジド（Ｓｉｇｍａ、６８３２１）と置き換えたことを除いて、製造業者の説明書に従って、「クリック」反応（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ１０３３７）を使用して検出した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（複製ＤＮＡ領域に組み込まれたＥｄＵの検出に関して：励起：４０５ｎｍ、発光：４２０～４８０ｎｍ；ＤＮＡの遊離末端と結合しているＢｒｄＵの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ；ＸＲＣＣ１の検出に関して：励起：５６１ｎｍ、発光：６００～７００ｎｍ）を使用して画像化し、分析した。３Ｄスタック画像を、ＳＶＩ ３Ｄホイヘンスデコンボルーション＆分析ソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂ．Ｖ．、Ｈｉｌｖｅｒｓｕｍ、オランダ）を使用してデコンボリューションした。
結果：
一本鎖ギャップである可能性が高い、ＢｒｄＵ分子の組み込みによって修飾されたＤＮＡ切断（実施例４に記載され、説明されている）は、複製部位内に、及び同時にＸＲＣＣ１修復フォーカスの周辺領域に隣接して、又は周辺領域内に位置する（図６）。共局在化の分析及び蛍光プロファイルの分析並びにＢｒｄＵフォーカスの蛍光最大及びＤＮＡ複製領域（ＥｄＵの組み込み領域）の局在化により、３種類の核内対象物の間の空間的関連性が確認される。さらに、ＤＮＡ複製の全ての領域がＢｒｄＵ検出の領域と関連しているわけではないことが強調されなければならない。
結論：
この結果は、手順１による方法が複製ストレスに関連する研究の分野に適用可能であることを示す。この対象は細胞老化及び加齢プロセスの文脈において関連する。さらに、ＥｄＵの組み込み領域の局在化とＢｒｄＵの組み込み領域の局在化との間に明確な関連がないという事実は、ＥｄＵである、この実験に使用される別のヌクレオシド類似体の非特異的認識をもたらす手順１による方法における検出の交差反応性がないことを示す。このことは修飾ＤＮＡ末端の認識の特異性を証明する。
実施例６
手順１による方法を使用した異なる損傷剤（ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷、Ｈ ２ Ｏ ２ 誘導性ＤＮＡ損傷、カンプトテシン誘導体－トポテカン（Ｔｐｔ）により誘導したＤＮＡ切断）に供した固定ＨｅＬａ細胞におけるＤＮＡ末端検出。
この実験の目的は、未処理のＨｅＬａ細胞及びＤＮＡが異なる損傷剤（ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷、Ｈ２Ｏ２誘導性ＤＮＡ損傷、カンプトテシン誘導体－トポテカン（Ｔｐｔ）により誘導したＤＮＡ切断）に供された細胞において手順１による方法を使用して、遊離ＤＮＡ末端へのＢｒｄＵの組み込み後に得られた蛍光シグナルを画像化し、比較することであった。
ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ教授、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た）を、１８ｍｍのカバースリップ（細胞数：１つのカバースリップ当たり０．１２×１０６）に播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。
続いて、ＨｅＬａ細胞を、異なる損傷剤（ＵＶ誘導性ＤＮＡ損傷、Ｈ２Ｏ２誘導性ＤＮＡ損傷、カンプトテシン誘導体－トポテカン（Ｔｐｔ）により誘導したＤＮＡ切断）に以下のように供した：
ＵＶ：
１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋イオンを補充した予め加温したＰＢＳ（３７℃）と置き換え、試料を、２５４ｎｍにて発光するＰｈｉｌｉｐｓ ＴＵＶ ＰＬ－Ｓ ５Ｗ／２Ｐランプの下に置き、標準的な細胞培養インキュベーター（ＣＯ２制御していない）内に置いた。ランプは、ランプから２０センチメートルで測定して１０Ｗ／ｍ２ｓを送達した。細胞を１分間ＵＶ－Ｃに曝露した。次いで試料を氷上に置き、４％ＰＦＡにより直ちに固定した。
Ｈ ２ Ｏ ２ ：
Ｈ２Ｏ２（最終濃度は４ｍＭであった）を成長培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）に直接添加した。ＣＯ２レベルを制御した標準的な細胞培養インキュベーター内で細胞を３７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を４％ＰＦＡ中で直ちに固定した。
Ｔｐｔ：
Ｔｐｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ２７０５）を２０μＭの最終濃度にて成長培地に直接添加した。ＣＯ２レベルを制御した標準的な細胞培養インキュベーター内で細胞を３７℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を４％ＰＦＡ中で直ちに固定した。
実験のさらなる部分は、細胞にいかなるプラスミドもトランスフェクトしなかったという事実を除いて、同じＨｅＬａ細胞株を使用して実施例４のように実施した。画像化の前に、細胞内のＤＮＡをＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ＰＢＳ中に１μＭ、３０分、ＲＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ９５４２）で染色した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（ＤＡＰＩの検出に関して：励起：４０５ｎｍ、発光：４２０～４８０ｎｍ；ＤＮＡの遊離末端と結合しているＢｒｄＵの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ）を使用して画像化し、分析した。
結果：
図７に提示したＨｅＬａ細胞の核の記録した画像の例は、対照の正常な未処理の細胞より、ＤＮＡ損傷が外因性剤を使用して誘導された細胞において有意に多くのシグナルが検出されていることを示す。検出された内因性ＢｒｄＵフォーカスの平均数は０．４±０．１である（実施例１による）。異なる薬剤による処理により、ＢｒｄＵ分子の組み込みの検出可能な領域、つまりＤＮＡの遊離末端の平均数の増加がもたらされる（Ｈ２Ｏ２により処理した細胞の平均数：３１．５７±８．６１、ＵＶ：１０．７３±４．８９、Ｔｐｔ：１６．３９±４．９２）（図７）。さらに、正常な未処理の細胞培養物におけるアポトーシス細胞の例の画像は、このような細胞において、ＢｒｄＵの組み込みのより多くの検出可能な領域が存在することを示す。それらの領域の数（１００超）は、アポトーシスの間に生じるＤＮＡ断片化の程度を反映している。大きなＤＮＡ損傷の徴候を示す野生型の未処理のＨｅＬａ細胞（アポトーシス細胞）は、通常、細胞集団全体の５％未満を構成する。異なる損傷剤により処理した細胞の集団では、それらのパーセンテージは、Ｈ２Ｏ２により処理した細胞の中でおよそ３０％まで増加し、ＵＶ光により処理した細胞の中でおよそ２０％まで増加し、Ｔｐｔにより処理した細胞の中でおよそ１８％まで増加した。
結論：
手順１による方法は、細胞内のｉｎ ｓｉｔｕで外因的に誘導されたＤＮＡ損傷の検出に適用可能である。この方法は、画像分析技術のさらなる適用によって提示されるＤＮＡ切断の局在化を可能にする。蛍光最大の局在化及び蛍光プロファイルの分析は、核内及びクロマチン構造（ＤＡＰＩ使用して染色した）に関して固定細胞核における二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断又は一本鎖ギャップの局在化に関する情報を提供することができる（そのような分析の例を図７Ｃに示す）。さらに、図７Ａに提示した画像は、手順１による方法がアポトーシスの検出にも使用することができることを証明する。提示した細胞は、アポトーシス細胞に特徴的な形態学的特性の徴候を示す（透過光画像を参照のこと）。さらに、提示した画像は、この方法の適用の結果として得られた蛍光シグナルが、ＤＮＡ切断誘導の結果として生じるＤＮＡ末端を特異的に表すシグナルであることを証明する。未処理の細胞において検出可能なフォーカスの数と、損傷細胞において検出されたフォーカスの数との比較により、得られたシグナルが標識化技術の技術的欠陥による人為的効果ではないことが証明される。さらに、この結果により、手順１による方法に続いて、得られた顕微鏡画像の徹底的な定量分析を行うことができ、分析される生体物質の状態及び質に関する多くの情報を与えることができることが証明される。さらに、このような分析は、生体物質が供される環境条件に関する情報を伝えることができる。このデータは比較分析に使用することができる。
実施例７
手順１のステップ５全て（ＴｄＴ酵素によるＢｒｄＵの組み込み）を省略した手順１に従って処理した未処理の固定ＨｅＬａ細胞におけるシグナルの検出。
この実験は、細胞をいかなる損傷因子にも供さず、手順１のステップ５全てを省略したことを除いて、同じＨｅＬａ細胞株を使用して実施例６のように実施した。処理後、対照試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ）を使用して画像化し、分析した。
結果：
カバースリップ全体にはほとんどフォーカスが検出されなかった。フォーカスは蛍光シグナルのレベルが０ａ．ｕ．よりも高い領域として定義され、それらの局在化は、蛍光最大を局在化するＩｍａｇｅＪソフトウェアに内蔵の特徴を使用して決定した。フォーカスの大部分は、ＤＡＰＩで染色した細胞核の蛍光画像との蛍光最大のオーバーレイに基づいて決定した細胞核の外側に局在化した（図８）。検出したフォーカスの数及び観察した核の数の分析により、平均して単一の細胞核当たり０．１３±０．０４（核の総数Ｎ＝６３）のフォーカスしか検出されないことが示される。ＤＮＡの遊離末端がＢｒｄＵの組み込みによって修飾された未処理のＨｅＬａ細胞の場合、単一の核当たりに検出されたフォーカスの平均数は、実施例１に記載されるように０．４±０．１（Ｎ＝４９）であった。
結論及び解釈：
手順１による方法では、非特異的抗体の認識はほとんどない。手順１による方法の非常に高い特異性は、モノクローナル及びポリクローナル抗体が互いに近接して結合している場合にのみシグナルを得ることができるという事実から生じる。つまりそれらが同じＢｒｄＵ分子と結合している場合、又はそれらがＤＮＡ遊離３’－ＯＨ末端に付着した鎖を形成するＢｒｄＵ分子と選択的に結合している場合である。２つの異なる型の一次抗体の使用は特異性を増加させる。ＢｒｄＵが存在しない場合、ほんの少しのシグナルしか検出可能ではなく、このことは、適用される検出方法の交差反応性が非常に少ないという概念を支持する。
実施例８
手順１による方法を使用した光力学作用によって誘導された固定ＨｅＬａ細胞におけるＤＮＡ切断の検出。
この実験では、エチジウムブロマイド（５００μＭ）により１０分間生細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ教授、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得たＨｅＬａ２１－４細胞）を処理し、次いで手順１の照射ステップ２を実施してから２分後に、核内の選択した場所にレーザービーム（４８８ｎｍ）を留めること（線量：９ｍＪ）によってＤＮＡ切断を誘導した。この実験の目的は、光力学作用によって細胞核の特定の領域に生じたＤＮＡ切断（複数可）を直接検出することであった。
ＨｅＬａ２１－４細胞を最初に１８ｍｍのカバースリップに播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で３日間培養した。培養後、ＤＮＡ損傷を、以前に記載されているように、選択した細胞において誘導し、続いて７０％エタノール水溶液で－２０℃にて１５時間インキュベートした。その後、ＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加（ステップ４）を、１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液、１時間、ＲＴにより実施した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる修飾（ＢｒｄＵＴＰ）ヌクレオチド（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の組み込みを、キット供給業者の説明書（ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って実施した。次いで細胞をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液とインキュベートした（４℃にて一晩）。手順２のステップ７に従った一次抗体１型及び２型とのインキュベーションを、マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）及びウサギポリクローナル抗ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）（１％ＢＳＡ中で１：１００）をそれぞれ使用して実施した。最後の洗浄後、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡプローブ抗ウサギマイナス（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００６）、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡプローブ抗マウスプラス（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００１）、検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液、ＤＵＯ８２０４９を使用してステップ８（ＰＬＡ手順）に従って細胞を処理した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５１０～６００ｎｍ）を使用して画像化した。
結果：
顕微鏡画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ａｂｒａｍｏｆｆ Ｍ．Ｄ．、Ｍａｇａｌｈａｅｓ Ｐ．Ｊ．、Ｒａｍ Ｓ．Ｊ．：Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｍａｇｅＪ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｔ．、２００４年；１１－３６～４１頁）を使用して分析した。蛍光フォーカスは、照射した場所において、又は損傷した核の９０％のその直近で正確にはっきりと見ることができる（例：図１０、右側の列）。
結論：
光とＤＮＡインターカレーター（光増感剤）との相互作用によって誘導される少数のＤＮＡ切断は、手順１による方法によって検出することが可能である。
比較例３
標準的なＴＵＮＥＬアッセイを使用した光力学作用によって誘導した固定ＨｅＬａ細胞におけるＤＮＡ切断の検出。
ＨｅＬａ２１－４細胞を実施例６のように播種し、培養し、処理した。さらなる処理のために、標準的なＴＵＮＥＬアッセイ（ＡＰＯ ＢｒｄＵ Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の説明書に従って実施した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（励起：４８８ｎｍ、発光：５１０～６００ｎｍ）を使用して画像化し、分析した。
比較例３を実施例９の結果と比較した。
結果：
顕微鏡画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ａｂｒａｍｏｆｆ Ｍ．Ｄ．、Ｍａｇａｌｈａｅｓ Ｐ．Ｊ．、Ｒａｍ Ｓ．Ｊ．：Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｉｍａｇｅＪ．Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｔ．、２００４年；１１：３６～４１頁）を使用して分析した。標準的なＴＵＮＥＬアッセイでは、照射した場所ではフォーカスを見ることができなかった。手順１による方法では、フォーカスは、照射した場所において、又はその直近で正確にはっきりと見ることができた（図９）。
結論：
手順１による方法は、標準的なＴＵＮＥＬアッセイよりも感度が高く、光と光増感剤との間の相互作用によって誘導される少数のＤＮＡ二本鎖切断の検出を可能にする。同様の数の損傷は標準的なＴＵＮＥＬアッセイによって検出されない。
実施例９
固定Ｕ２－ＯＳ細胞におけるヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の切断活性の結果として生じたＤＮＡ末端を検出するための手順１及び標準的なＴＵＮＥＬアッセイの使用
ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の切断活性の結果として生じるＤＮＡ末端を検出するための手順１の適用性を決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用した。ヌクレアーゼを、反復配列の存在によって特徴付けられる第３染色体に位置するサブテロメア領域に対して標的化した。ＳｐＣａｓ９を使用して数回より多く（数十回まで）の切断を誘導した。
この実施例では、検出前に、Ｕ２－ＯＳ細胞（ＨＴＢ－９６（商標）、ＡＴＣＣ）を、１４ｍｍのマイクロウェル（Ｎｏ．１．０カバーガラス、厚さ：０．１３～０．１６ｍｍ）（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐ３５Ｇ－１．０－１４－Ｃ）（１つのペトリ皿当たり３．５×１０４細胞）を有するガラス底の３５ｍｍペトリ皿に播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。２４時間後、細胞核内の特定の部位においてＣａｓ９フォーカスを画像化するのに適した条件を得るために（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術）、蛍光標識（３Ｘ ｍＣｈｅｒｒｙ）ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの適切な組合せをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし（トランスフェクション剤：ＦｕＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８５０７０）により調製したトランスフェクションミックス、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中で培養した細胞）、細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中で培養した）。トランスフェクション後、細胞を４８時間培養した。手順１に従って処理した、図１０に提示した細胞に関しては、トリスによる事前調製はしなかった（ステップ１）。次にステップ２は、１％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０－Ｓ）との室温にて１５分間のインキュベーション及び室温にて１時間の０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）での透過により構成した。透過後、ＢｒｄＵを、ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）を使用してＴｄＴ酵素によりＤＮＡの遊離末端と連結した。酵素とのインキュベーションを湿潤チャンバ内の液滴で実施した。酵素反応（供給業者の説明書に従って実施した）の後、試料をリンス緩衝液（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）で迅速に２回すすいだ。その後、試料をＰＢＳ中の５％ＢＳＡ溶液で４℃にて一晩インキュベートし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：５％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）、ウサギポリクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：５％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬レッド（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００８）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。
ＴＵＮＥＬアッセイのために、細胞を上述のように播種し、トランスフェクトした。図１０に提示したトランスフェクション後の細胞をまた、４８時間培養し、続いて１％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０－Ｓ）により室温にて１５分間固定し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）により室温にて１時間透過させた。ＤＮＡの遊離末端へのＢｒｄＵ連結も同様に実施した。その後、細胞を、湿潤チャンバ内の液滴（５０μｌ）で一次抗体［マウスモノクローナル抗ＢｒｄＵ（希釈：５％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）］と室温にて１時間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、試料をＰＢＳ中で洗浄し（緩衝液を４回交換し、試料をＰＢＳ中に１時間保持した）、二次抗体とのインキュベーションを、湿潤チャンバ内の液滴（５０μｌ）で室温にて１時間実施した［ヤギ抗マウスＩｇＧ１二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４コンジュゲート（希釈：５％ＢＳＡ中で１：４００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２１１２５）］。次に、試料をＰＢＳ中で洗浄し（３×５分）、ＰＢＳ中で一晩静置させた。
処理後、全ての試料について、水銀アークランプ、１０位置フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、ＣＦＰ／ＹＦＰ／ＨｃＲｅｄフィルターセット、ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）、ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）、及びＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭ－ＩＲＢ倒立顕微鏡を用いて位相差及び蛍光顕微鏡画像化を実施した。赤色標識（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬レッド（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００８）で使用される標識）を、５５６／２０ｎｍ（波長／帯域幅）にて励起し、その発光を６３０／９１ｎｍチャネルで収集した。ＧＦＰを４７０／２８ｎｍにて励起し、その発光を５１２／２３ｎｍチャネルで収集し、画像化データを、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ取得ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ａｂｒａｍｏｆｆ Ｍ．Ｄ．、Ｍａｇａｌｈａｅｓ Ｐ．Ｊ．、Ｒａｍ Ｓ．Ｊ．：Ｉｍａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ＩｍａｇｅＪ．（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｔ．、２００４年；１１：３６～４１頁）を用いて取得し、分析した。バックグラウンド核質蛍光に対する核フォーカスシグナルの比に基づいて閾値を設定した。
結果：
図１０に提示した蛍光強度の画像及びプロファイルにより、標準的なＴＵＮＥＬアッセイを、数十の切断がヒトゲノムの１つの部位で誘導されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して生成した遊離ＤＮＡ末端の検出に適用した場合、シグナルが検出されなかったことが示される。ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の蓄積に関連する領域において測定され、ＢｒｄＵの標準的な免疫蛍光検出において使用される二次抗体とコンジュゲートしたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４によって放出された蛍光強度の平均値は、およそ０であった（５０個の核を分析し、値は、非特異的に結合した抗体分子を表すバックグラウンドシグナルのレベルに基づいて正規化した）。記録した顕微鏡画像の代表的な例について測定した蛍光プロファイルの例は、ＢｒｄＵフォーカスを検出することができなかったことを明確に示す。対照的に、手順１による方法を適用した場合、非特異的バックグラウンドシグナルは検出されず、ＢｒｄＵの組み込み領域は、顕微鏡画像において可視化された別個のフォーカスによって表された（図１０）。これらのフォーカスはＳｐＣａｓ９の蓄積領域と共局在化した。これらの観察は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して得られた代表的な蛍光強度プロファイルによってさらに確認される（図１０）。
結論：
この結果により、手順１による方法が、ヒトゲノムにおける特定の部位で互いに近接して位置する数十の二本鎖ＤＮＡ切断を認識するのに十分な感度でさえない標準的なＴＵＮＥＬアッセイと異なり、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９によって誘導されたＤＮＡ切断を検出することができることが確認される。画像分析の結果は、手順１による方法の特異性及び感度についての別の証拠を提供し、これまでＤＮＡ切断の検出において使用されてきた既存の方法を上回るその利点を強調する。
実施例１０
固定Ｕ２－ＯＳ細胞におけるヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の切断活性の結果として生じるＤＮＡ末端の高感度検出のための手順１の使用
ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９の切断活性から生じるＤＮＡ末端を検出するための手順１の適用性を決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用した。ヌクレアーゼを、反復配列の存在によって特徴付けられる第３染色体に位置するサブテロメア領域に対して標的化した。この目的のために、Ｕ２－ＯＳ細胞（ＨＴＢ－９６（商標）、ＡＴＣＣ）を２つの異なる様式において調製して以下を得た：
ヌクレアーゼ分子が標的とした領域において結合したという事実にもかかわらず、ＳｐＣａｓ９がいかなる切断も誘導しなかった細胞
ＳｐＣａｓ９が、反復配列の領域に近接して局在化したゲノム配列に位置する部位において１つのみの単一の二本鎖切断（ｃｕｔ）（切断（ｂｒｅａｋ））しか誘導しなかった細胞。
この実施例では、検出前に、Ｕ２－ＯＳ細胞を１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり３．５×１０４）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。２４時間後、上述の「細胞型」を生成し、細胞核内の特定の部位においてＳｐＣａｓ９フォーカスを画像化するのに適した条件を作り出すために（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術）、蛍光標識（３Ｘ ｍＣｈｅｒｒｙ）ＳｐＣａｓ９をコードするプラスミド、及びｓｇＲＮＡの適切な組合せを細胞にトランスフェクトした（トランスフェクション剤：ＦｕＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）、ＯｐｔｉＭＥＭにより調製したトランスフェクションミックス（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８５０７０）、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中で培養した細胞）。トランスフェクション後、細胞を４８時間培養し、続いて手順１に従って処理した。図１１に提示した細胞に関しては、トリスによる事前調製（ステップ１）は行わなかった。ステップ２は７０％Ｅｔ（ＯＨ）（一晩；－２０℃）による固定のみを含んだ。１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液中で試料を室温にて３０分間インキュベートした後、その試料を洗浄緩衝液（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）で迅速に２回だけすすいだ。ＢｒｄＵを、ＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）を使用してＴｄＴ酵素によりＤＮＡの遊離末端と連結した。酵素とのインキュベーションを湿潤チャンバ内の液滴で実施した。酵素反応（供給業者の説明書に従って実施した）後、試料をリンス緩衝液（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）で迅速に２回すすいだ。その後、試料をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で４℃にて一晩インキュベートし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［ＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）、ＢｒｄＵに対するウサギポリクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを１％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０９７７－０３５）中で調製した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して画像化し、分析した（ＤＮＡの遊離末端と結合しているＢｒｄＵの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ；ＳｐＣａｓ９の検出に関して：励起：５９４ｎｍ、発光：６０５～７００ｎｍ）。
結果：
図１１に提示した画像は、ＳｐＣａｓ９切断活性の結果としてただ１つのＤＮＡ二本鎖切断が生じたとしても、そのＤＮＡ二本鎖切断は手順１による方法によって特異的に認識され得ることを示す。これは、蓄積したＳｐＣａｓ９分子及び組み込まれたＢｒｄＵ分子に特徴的である関連する蛍光シグナルの発生によって反映される。ＳｐＣａｓ９がいかなる切断活性も行わない場合、ヌクレアーゼの蓄積領域においてＢｒｄＵの組み込みを検出することはできない（図１１）。図１１の画像は、１つのみの単一の二本鎖ＤＮＡ切断が誘導される場合、ＢｒｄＵ検出領域の局在化がＳｐＣａｓ９フォーカスと共局在化する領域にあることを示す（図１１）。一部の場合、ＢｒｄＵフォーカスはＳｐＣａｓ９フォーカスに隣接する領域において検出することができる（データは示さず）。このことは、クロマチン緩和を引き起こすＥＤＴＡによる処理が、ＤＮＡが切断されるときに起こり、解放される２つの相補的（３’及び５’）ＤＮＡ末端の転位を導くという事実によって引き起こされる可能性が高い。病変部位において生じる２つの非安定化ＤＮＡ断片を分離し、互いから離す。
結論：
この結果により、手順１による方法が、ヒト細胞においてＳｐＣａｓ９によって誘導されたＤＮＡ切断を検出することができることが確認される。さらに、その方法は、単一の病変を検出することができるような高感度を有するので、切断の数にかかわらず、ＳｐＣａｓ９誘導性ＤＳＢの検出における高度に特異的なマーカーとして使用することができる。切断が誘導されない場合に検出可能なシグナルが存在しないという事実により、この方法の高い特異性が確認される。また、この結果により、この技術の非常に高い感度が確認される：この結果は１つの二本鎖ＤＮＡ切断を検出する可能性を与える。
実施例１１
固定Ｕ２－ＯＳ細胞におけるニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）のニックを入れる活性の結果として生じるＤＮＡ末端を検出するための手順２の使用
ニッカーゼＳｐＣａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）のニックを入れる活性から生じるＤＮＡ末端を検出するための手順２の適用性を決定するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用した。ニッカーゼは、反復配列の存在によって特徴付けられる第３染色体に位置するサブテロメア領域に対して標的とされた。この目的のために、Ｕ２－ＯＳ細胞（ＨＴＢ－９６（商標）、ＡＴＣＣ）を３つの異なる様式において調製して以下を得た：
ＳｐＣａｓ９ｎが少なくない（数十まで）一本鎖ニックを誘導した細胞（ニックは同じＤＮＡ鎖において誘導された）、
ＳｐＣａｓ９ｎ分子が、標的とされた領域において結合したという事実にもかかわらず、ＳｐＣａｓ９ｎがニックを全く誘導しなかった細胞、
ＳｐＣａｓ９ｎが、反復配列の領域に近接して局在化したゲノム配列に位置する部位において１つのみの単一の一本鎖ニックを誘導した細胞。
この実験では、検出前に、Ｕ２－ＯＳ細胞を１８ｍｍのカバースリップ（細胞数：１つのカバースリップ当たり３．５×１０４）に播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。２４時間後、上述の「細胞型」を生成し、細胞核内の特定の部位においてＳｐＣａｓ９フォーカスを画像化するのに適した条件を作り出すために（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術）、蛍光標識（３Ｘ ＧＦＰ）ＳｐＣａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）をコードするプラスミド、及びｓｇＲＮＡの適切な組合せを細胞にトランスフェクトした（トランスフェクション剤：ＦｕＧｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）、ＯｐｔｉＭＥＭにより調製したトランスフェクションミックス（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８５０７０）、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉＭＥＭ中で培養した細胞）。次いで、細胞を、トランスフェクション後、４８時間培養した。続いて細胞を手順２に従って処理した。図１２の画像に提示した細胞の場合、トリスによる処理は行わなかった。次のステップは、７０％Ｅｔ（ＯＨ）による固定を含んだ（一晩のインキュベーション；－２０℃）。その後、手順２において与えられた説明に従って、内因性ビオチンブロッキングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅ２１３９０）を使用して試料を事前ブロッキングした。１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液中で試料を室温にて３０分間インキュベートした後、試料を蒸留水で迅速にすすぎ、湿潤チャンバ内で３７℃での１時間のインキュベーションにより、ニックトランスレーションアッセイ反応混合物［１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂ７００２Ｓ）、３０ｕＭの各ｄＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ６－（６－アミノ）ヘキシル－２’－デオキシアデノシン－５’－トリホスフェート－ビオチン（ビオチン－７－ｄＡＴＰ）：ＮＵ－８３５－ＢＩＯ－Ｓ、ビオチン－１６－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ：ＮＵ－８０９－ＢＩＯ１６、ビオチン－１６－５－アミノアリル－ｄＵＴＰ：ＮＵ－８０３－ＢＩＯ１６、ｄＧＴＰ：ＮＵ－１００３）、１つのカバースリップ当たり３単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、ＭＯ２０９）、超高純度の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０９７７－０３５）］とインキュベートした。その後、試料をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で４℃にて一晩インキュベートした。次に、試料をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で４℃にて一晩インキュベートし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［マウスモノクローナル抗ビオチン［Ｈｙｂ－８］（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１３４１）、ウサギポリクローナル抗ビオチン（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３４９４）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬レッド（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００８）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して画像化し、分析した（ＳｐＣａｓ９ｎの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ；ＤＮＡの遊離末端と結合しているビオチン化又は非修飾ヌクレオチドの検出に関して：励起：５９４ｎｍ、発光：６０５～７００ｎｍ）。
結果：
図１２に提示した画像は、１つ又は複数の一本鎖ＤＮＡ切断がＳｐＣａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）ニックを入れる活性の結果として生じる場合、それらの一本鎖ＤＮＡ切断が、ＤＮＡポリメラーゼＩ及び手順２による方法によって特異的に認識されることを示す。これは、蓄積された蛍光標識ＳｐＣａｓ９ｎ分子及び組み込まれたビオチン化ヌクレオチドに特徴的な関連する蛍光シグナルの発生によって反映される。ＳｐＣａｓ９ｎがいかなる切断活性も行わない場合、ニッカーゼの蓄積領域と共局在化するか、又は部分的に共局在化する領域において、修飾ヌクレオチドの組み込みは検出することができない（図１２）。図１２の画像は、１つのみの一本鎖ＤＮＡ切断が誘導される場合、ヌクレオチドの組み込みの局在化がＳｐＣａｓ９ｎフォーカスと共局在化することを示す（図１２）。ニックの数が１より多い（数十まで）場合、ヌクレオチド及びＳｐＣａｓ９ｎフォーカスの組み込み領域も共局在化する（図１２）。
結論：
この結果により、手順２による方法が、ヒト細胞においてＳｐＣａｓ９ｎによって誘導されたＤＮＡニックを検出することができることが確認される。さらに、その方法は、切断の数にかかわらず、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導された一本鎖切断（ＳＳＢ）の検出における高度に特異的なマーカーとして使用することができる。ＳＳＢが誘導されない場合に検出可能なシグナルが存在しないという事実により、この方法の高い特異性が確認される。また、この結果により、優れたＴＵＮＥＬ技術の非常に高い感度が確認される：その結果は、最大で１つのみの一本鎖ＤＮＡ切断の検出の可能性を提供する。
実施例１２
後のクロマチンの単離を伴う懸濁液中の細胞におけるＤＮＡ切断を検出するための手順１の使用
この実施例では、ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄから得た）を６ウェルプレートに播種し、培養物が１００％コンフルエンシー（細胞数：１ウェル当たり１．２×１０６）に達するまで、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間培養した。次に、細胞を、成長培地に直接添加したＤＮＡ損傷剤Ｈ２Ｏ２により処理した（最終濃度：４ｍＭ）。細胞を、ＣＯ２レベルを制御した標準的な細胞培養インキュベーターにおいて３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、対照、未処理の細胞及び損傷細胞（Ｈ２Ｏ２）を、０．５ｍｌトリプシンを使用して回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。その後、トリプシンを、１０％ＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＤＭＥＭを添加することによって不活性化した。続いて、細胞を卓上遠心分離機（エッペンドルフ遠心分離機、５４１７Ｃ、ローター：Ｆ４５－３０－１１）（１７００ｒｐｍ、５分、室温）において沈降させた。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、再び沈降させた（この洗浄ステップを２回繰り返した）。上清ＰＢＳを捨てて、細胞をＰＢＳの残りの液滴に再懸濁した。続いて、氷冷７０％Ｅｔ（ＯＨ）を滴下して加え、細胞をＥｔ（ＯＨ）中で－２０℃にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞を手順１に従って処理し、ここで、ステップ１、３、４、９は省略し、全ての洗浄ステップ及び全てのインキュベーションに続いて遠心分離を行った。ＢｒｄＵを、供給業者の説明書に従ってＡＰＯ－ＢＲＤＵキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）を使用したＴｄＴ酵素を使用してＤＮＡの遊離末端と連結した。次に、細胞をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液において３０分間ブロッキングし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［ＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）、ＢｒｄＵに対するウサギポリクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。標識化後、細胞ペレットを５０μｌの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）に再懸濁し、卓上遠心分離機（１分、１４０００ｒｐｍ、室温）において沈降させた。細胞を１０μＬのＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ２を含有する１０ｍＭトリス－ＨＣｌ）に再懸濁し、１５分間沸騰させた（９９℃）。試料を氷上で冷却し、卓上遠心分離機（１分、最高速度：１４０００ｒｐｍ、室温）において沈殿させた。上清全体を回収し、蒸留水中で４０μｌの総体積に希釈し、さらなる測定に使用した。
未処理の対照細胞及びＨ２Ｏ２により損傷した細胞から得られた細胞抽出物の蛍光強度のレベルを、蛍光分光光度計（Ｘｅランプが搭載されているＨｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００）を使用して測定した。蛍光強度を３０秒間測定した（励起４８０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）。
結果：
ＢｒｄＵの組み込みは、二本鎖平滑末端切断又は二本鎖３’突出切断又は一本鎖ギャップが生じる場合に存在する、ＴｄＴ酵素によって認識される特定の型のＤＮＡ３’－ＯＨ末端をマークする。遊離ＤＮＡ末端の数は、Ｈ２Ｏ２などの損傷剤による処理の結果として増加し、これにより、方法１に従って処理した試料において、組み込まれたＢｒｄＵ分子の数の増加及び全蛍光強度シグナルの増加が生じる（図１３）。対照試料におけるＤＮＡ単位（１ｎｇ）当たりの測定した蛍光強度は、２．９×１０－４ａ．ｕ．であったが、Ｈ２Ｏ２により処理した試料におけるＤＮＡ１ｎｇ当たりの測定した蛍光強度は、より高く、３．１９×１０－４ａ．ｕ．であった（表１）。
結論：
手順１による方法は、懸濁液中の細胞におけるＤＮＡ損傷の定量的検出及び比較分析、その後のクロマチンの抽出に適用可能である。
Figure 0007287395000001
実施例１３
単離されたクロマチンにおけるＤＮＡ切断を検出するための手順１及び２の組合せの使用。
この実施例では、ＨｅＬａ２１－４細胞（Ｐ．Ｒ．Ｃｏｏｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄから得た）を６ウェルプレートに播種し、培養物が１００％コンフルエンシー（細胞数：１ウェル当たり１．２×１０６）に達するまで、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間培養した。次に、細胞を、成長培地に直接添加したＤＮＡ損傷剤Ｈ２Ｏ２により処理した（最終濃度：４ｍＭ）。細胞を、ＣＯ２レベルを制御した標準的な細胞培養インキュベーターにおいて３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、対照、未処理の細胞及び損傷細胞（Ｈ２Ｏ２）を、０．５ｍｌトリプシンを使用して回収し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。その後、トリプシンを、１０％ＦＢＳを補充した０．５ｍｌのＤＭＥＭを添加することによって不活性化した。続いて、細胞を卓上遠心分離機（エッペンドルフ遠心分離機、５４１７Ｃ、ローター：Ｆ４５－３０－１１）（１７００ｒｐｍ、５分、室温）において沈降させた。細胞ペレットを１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）に再懸濁し、懸濁液（５０μｌ）中の少量のアリコートの細胞を新たな１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機（１分、１４０００ｒｐｍ、室温）において沈降させた。上清を捨て、同じ体積（５０μｌ）の１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）での洗浄ステップを繰り返した（卓上遠心分離機での遠心分離（１分、１４０００ｒｐｍ、室温））。細胞を１０μＬのＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ２を含有する１０ｍＭトリス－ＨＣｌ）に再懸濁し、１５分間沸騰させた（９９℃）。試料を氷上で冷却し、卓上遠心分離機（１分、最高速度：１４０００ｒｐｍ、室温）において沈降させた。全ての上清（細胞から抽出されたクロマチンを含有する）を回収した。上清中のＤＮＡを、８μｌのイソプロパノールを添加することによって沈殿させ、続いて卓上遠心分離機（１分、最高速度：１４０００ｒｐｍ、室温）において遠心分離した。ＤＮＡを５μｌの７０％Ｅｔ（ＯＨ）に再懸濁し、卓上遠心分離機（１分、最高速度：１４０００ｒｐｍ、室温）において沈降させた。上清を捨てた。試料を手順１に従って処理し、ここで、ステップ１は生体物質の単離をもたらす上述のステップの一部であり、したがってＤＮＡ末端のアクセス可能性の増加をもたらした。ステップ２、３及び４は省略した。ステップ５では、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、ＭＯ２０９）、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂ７００２Ｓ）、反応緩衝液（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）とのＴｄＴ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）、ｄＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ６－（６－アミノ）ヘキシル－２’－デオキシアデノシン－５’－トリホスフェート－ビオチン（ビオチン－７－ｄＡＴＰ）：ＮＵ－８３５－ＢＩＯ－Ｓ、ビオチン－１６－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ：ＮＵ－８０９－ＢＩＯ１６、ｄＧＴＰ：ＮＵ－１００３）及びＢｒｄＵ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＵ：１００１）、超高純度の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０９７７－０３５）の混合物を含有する修飾反応混合物に単離されたＤＮＡを再懸濁することによってＤＮＡ末端を修飾した。懸濁液を３７℃にて３０分間インキュベートした。手順２のステップ５ｃに記載されるようにトリス－ＨＣｌを使用してポリメラーゼ反応を停止させた。懸濁液を、ストレプトアビジンによりプレインキュベートし、ビオチンを被覆したカバーガラス（Ｂｉｏ－０２、ＭｉｃｒｏＳｕｒｆａｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に移し、室温にて３０分間インキュベートして、単離された修飾ＤＮＡ（ＢｒｄＵ及びビオチン化ヌクレオチドを組み込んだ）をガラスカバースリップに固定化した。次に、固定化したＤＮＡをＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液において３０分間ブロッキングし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［ＢｒｄＵに対するマウスモノクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０３９）、ＢｒｄＵに対するウサギポリクローナル抗体（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２０９５）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬グリーン（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２０１４）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。処理後、未処理の対照細胞及びＨ２Ｏ２損傷細胞から得られた細胞抽出物の蛍光強度のレベルを、カバーガラスに固定化した固定化修飾ＤＮＡの蛍光画像を画像化することによって、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して測定した（ＤＮＡの遊離末端と結合しているＢｒｄＵの検出に関して：励起：４８８ｎｍ、発光：４９８～５４０ｎｍ）。
結果：
遊離ＤＮＡ末端の数は、Ｈ２Ｏ２などの損傷剤による処理の結果として増加する。これにより、手順１及び２の組合せに従って処理した試料において、組み込まれたＢｒｄＵ分子の数の増加及び総積分蛍光強度シグナルの増加が生じる。各試料に関して、平均濃淡値（蛍光強度）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して決定した。対照試料において測定した蛍光強度は６．０±０．１ａ．ｕであったが、Ｈ２Ｏ２により処理した試料において測定した蛍光強度は８．９±０．１ａ．ｕであった。不対２標本ｔ検定により、対照とＨ２Ｏ２により処理した試料との間の平均の差が統計的に有意であることが示される（ｐ値＜０．００１）。
結論：
手順１及び２の組合せによる方法は、単離されたクロマチンにおけるＤＮＡ損傷の定量的検出及び比較分析に適用可能である。
実施例１４
ＤＮＡ末端のアクセス可能性が固定前に増加した、固定Ｕ２－ＯＳ細胞におけるＤＮＡ末端を検出するための手順２の使用。
この実験では、検出前に、Ｕ２－ＯＳ細胞を１８ｍｍのカバースリップに播種し（細胞数：１つのカバースリップ当たり３．５×１０４）、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞を７２時間培養した。続いて、細胞を手順２に従って処理した。固定前に、細胞を１ｍＭのトリスと３７℃にて２０分間インキュベートした。インキュベーションの間、細胞の形態をモニターした。次のステップは７０％Ｅｔ（ＯＨ）による固定を含んだ（一晩のインキュベーション；－２０℃）。その後、手順２に提供される説明に従って内因性ビオチンブロッキングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅ２１３９０）を使用して試料を事前ブロッキングした。１０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液中での試料の室温での３０分間のインキュベーション後、試料を蒸留水で迅速にすすぎ、湿潤チャンバ内で３７Ｃでの１時間のインキュベーションにより、ニックトランスレーションアッセイ反応混合物［１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、Ｂ７００２Ｓ）、３０ｕＭの各ｄＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ６－（６－アミノ）ヘキシル－２’－デオキシアデノシン－５’－トリホスフェート－ビオチン（ビオチン－７－ｄＡＴＰ）：ＮＵ－８３５－ＢＩＯ－Ｓ、ビオチン－１６－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ：ＮＵ－８０９－ＢＩＯ１６、ビオチン－１６－５－アミノアリル－ｄＵＴＰ：ＮＵ－８０３－ＢＩＯ１６、ｄＧＴＰ：ＮＵ－１００３）、１つのカバースリップ当たり３単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ、ＭＯ２０９）、超高純度の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０９７７－０３５）］とインキュベートした。その後、試料をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液中で４℃にて一晩インキュベートした。次に、試料をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液中で４℃にて一晩インキュベートし、続いて一次抗体とのインキュベーションを実施した［マウスモノクローナル抗ビオチン［Ｈｙｂ－８］（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１３４１）、ウサギポリクローナル抗ビオチン（希釈：１％ＢＳＡ中で１：１００）（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３４９４）］。さらなる処理のために、以下の試薬を使用した：ＰＬＡプローブ：Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗マウスマイナス、アフィニティ精製したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００４、キット：ＤＵＯ９２００４）及びＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ（登録商標）プローブ抗ウサギプラス、アフィニティ精製したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２００２、キット：ＤＵＯ９２００２）；ＰＬＡプローブを５％ＢＳＡ中で希釈した。ＰＬＡ検出：試料を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ洗浄緩衝液（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ８２０４９）を使用して洗浄した。蛍光シグナルを、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ検出試薬レッド（Ｓｉｇｍａ、ＤＵＯ９２００８）を使用して生成した。酵素反応を、超高純度のＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ非含有の蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０９７７－０３５）中で調製した。処理後、試料を、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して画像化し、分析した（励起：５９４ｎｍ、発光：６０５～７００ｎｍ）。
結果：
得られた画像（図１４）において、異なる数の蛍光フォーカスを検出することができた。フォーカスは細胞核内で特異的に局在化した。
結論：
生細胞におけるクロマチンのアクセス可能性を増加させる手段は、生細胞とトリス溶液とのインキュベーションによって得ることができる。その手順におけるこのステップは、有意なクロマチン緩和による細胞におけるＤＮＡ損傷検出の効率を有意に向上させることができた。この結果により、このステップを手順２に加えることが、固定前のトリスによる生細胞の処理が試料におけるＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させるための代替の手段であり得ることを証明する信頼できるデータをもたらすことが確認される。
上記の例は本発明の方法を開示している。別の態様において、主題発明はまた、単一のＤＮＡ末端（複数可）の存在及び位置をマーキングするためのローリングサークル複製の使用、並びに生体物質におけるＤＮＡ末端（複数可）を検出するための方法の使用を提供するが、上述の実施例は本発明の使用に関連する態様について同等に代表的であり、それらは記述の簡潔さのために再度記載されないことは当業者に明らかであるはずである。
当業者はまた、主題発明は、多数の修飾、変更、変化、置換を受け、実施例に提示された特徴は特定の必要性に適切に組み合わされてもよく、これらの全ては添付の特許請求の範囲に定義されるような保護範囲に包含されることを理解するであろう。

Claims (11)

  1. 生体物質におけるＤＮＡ末端の検出方法であって、
    ｉ．前記生体物質の調製、
    ｉｉ．触媒又は非触媒手段により第１の分子を前記ＤＮＡ末端へ結合させることによりＤＮＡ末端をプロセシングすること、ここで、第１の分子は、ハロゲン化ヌクレオチド分子若しくはハロゲン化ヌクレオシド分子、又はビオチン化ヌクレオチド分子であり；
    ｉｉｉ．前記ＤＮＡ末端に結合した第１の分子に結合し、且つオリゴヌクレオチドに連結する第２及び第３の結合分子を添加すること、ここで、第２及び第３の結合分子は、前記ＤＮＡ末端に結合した第１の分子における異なる結合部位を認識する抗体であり、第２及び第３の結合分子は、前記オリゴヌクレオチドにコンジュゲートする第４及び第５の結合分子との結合相互作用を介して前記オリゴヌクレオチドに連結し、第４及び第５の結合分子は抗体であり；
    ｉｖ．前記連結したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを添加して、前記連結したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした環状オリゴヌクレオチドを形成するためにライゲーションするライゲーション可能な末端を作り出すこと；
    ｖ．増幅を実施すること；及び
    ｖｉ．増幅産物を検出して前記ＤＮＡ末端を検出すること
    を含む、方法。
  2. 前記増幅が、ローリングサークル増幅を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生体物質の調製が、
    （ａ）前記生体物質を、固定及び／若しくは透過及び／若しくは溶解及び／若しくは単離及び／若しくは分画及び／若しくは固定化すること；並びに／又は
    （ｂ）ＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させること；並びに／又は
    （ｃ）結合分子に対する非特異的結合部位をブロッキングすること
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＤＮＡ末端をプロセッシングすることに続いて、結合分子に対する非特異的結合部位をブロッキングする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記増幅産物の検出が、前記増幅産物とハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドの検出を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＤＮＡ末端が、
    （ａ）一本鎖切断若しくは二本鎖切断を含むいずれかのＤＮＡ切断の結果である；並びに／又は
    （ｂ）一本鎖ニック、一本鎖ギャップ、単一のホスホジエステル結合の一本鎖切断、二本鎖平滑末端切断、二本鎖３’突出切断、二本鎖５’突出切断、３’－ＯＨ若しくは５’－リン酸ＤＮＡ末端が存在しないものを含むＤＮＡ鎖切断の型を含む群から選択される；並びに／又は
    （ｃ）ｉｎ ｓｉｔｕで検出される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生体物質が、
    （ａ）生きているか固定されている；並びに／又は
    （ｂ）動物、植物、原生動物、細菌細胞、ウイルス、組織並びにそれらの断片及び／若しくは成分を含む群から選択される；並びに／又は
    （ｃ）細胞若しくは組織又は膜によって囲まれたそれらの断片である；並びに／又は
    （ｄ）溶液中又は多孔質表面若しくは固体支持体上に存在し、前記固体支持体又は前記多孔質表面の種類が、ガラス、プラスチック、含水ゲル、エアロゲル金属及びセラミックを含む群から選択されてもよい、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ハロゲン化ヌクレオチド分子若しくはハロゲン化ヌクレオシド分子が、ＢｒｄＵ、ＩｄＵ、又はＣｌｄＵである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 単一のＤＮＡ末端が検出されるか、又は
    単一のＤＮＡ末端の存在及び位置が決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 生体物質におけるＤＮＡ末端の検出方法であって、
    ｉ．前記ＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させること；
    ｉｉ．ハロゲン化ヌクレオチド又はハロゲン化ヌクレオシドを含む第１の分子の前記ＤＮＡ末端への結合により、前記ＤＮＡ末端をプロセシングすること；
    ｉｉｉ．前記ＤＮＡ末端に結合した前記ハロゲン化ヌクレオチド又はハロゲン化ヌクレオシドを含む第１の分子に結合する２つの異なる結合分子である第２及び第３の結合分子を添加すること、ここで、前記第２及び第３の結合分子は、前記ＤＮＡ末端に結合した前記第１の分子における異なる結合部位を認識する抗体であり；
    ｉｖ．それぞれが前記第２及び第３の結合分子のうちの一つに結合し、且つオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするさらなる２つの異なる結合分子である第４及び第５の結合分子を添加すること、ここで、第４及び第５の結合分子は抗体であり；
    ｖ．前記コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、前記コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした環状オリゴヌクレオチドを形成するためにライゲーションするライゲーション可能な末端を作り出すオリゴヌクレオチドを添加すること、
    ｖｉ．増幅を実施すること；並びに
    ｖｉｉ．増幅産物を検出して前記ＤＮＡ末端を検出すること、
    を含む、方法。
  11. 生体物質におけるＤＮＡ末端の検出のための試薬のキットであって、
    ｉ．前記ＤＮＡ末端のアクセス可能性を増加させるための試薬；
    ｉｉ．前記ＤＮＡ末端に結合することができるハロゲン化ヌクレオチド又はハロゲン化ヌクレオシドを含む第１の分子；
    ｉｉｉ．前記ＤＮＡ末端に結合した前記ハロゲン化ヌクレオチド又はハロゲン化ヌクレオシドを含む第１の分子に結合する２つの異なる結合分子である第２及び第３の結合分子であって、前記ＤＮＡ末端に結合した前記第１の分子における異なる結合部位を認識する抗体である第２及び第３の結合分子；
    ｉｖ．それぞれが前記第２及び第３の結合分子のうちの一つに結合し、且つオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするさらなる２つの異なる結合分子である第４及び第５の結合分子であって、抗体である第４及び第５の結合分子；
    ｖ．前記コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、前記コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした環状オリゴヌクレオチドを形成するためにライゲーションするライゲーション可能な末端を作り出すオリゴヌクレオチド；並びに
    ｖｉ．増幅試薬
    を含む、キット。
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