WO2015155018A1 - Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile - Google Patents

Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile Download PDF

Info

Publication number
WO2015155018A1
WO2015155018A1 PCT/EP2015/056545 EP2015056545W WO2015155018A1 WO 2015155018 A1 WO2015155018 A1 WO 2015155018A1 EP 2015056545 W EP2015056545 W EP 2015056545W WO 2015155018 A1 WO2015155018 A1 WO 2015155018A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
clostridium difficile
sample
culture medium
detecting
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/056545
Other languages
English (en)
Inventor
Alain Rambach
Original Assignee
Balel S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Balel S.A. filed Critical Balel S.A.
Publication of WO2015155018A1 publication Critical patent/WO2015155018A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/20—Coumarin derivatives
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)

Definitions

  • the present application relates to a new method for detecting and identifying Clostridium difficile based on the use of a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound.
  • Clostridium difficile is a gram-positive, strictly anaerobic, spore-forming bacillus found in the environment as well as in the digestive tract of humans and animals.
  • This bacterium is the main agent responsible for nosocomial diarrhea. In particular, it is responsible for 15-25 3 ⁇ 4 of post-antibiotic diarrhea and almost all pseudomembranous colitis, and can cause death in the most severe cases
  • a particular strain of Clostridium difficile called 027 / NAP1 / BI is particularly virulent and is found throughout the metropolitan area. In fact, the incidence of Clostridium difficile infections has increased significantly in recent years in North America and Europe, highlighting the importance of rapid and reliable diagnosis.
  • Clostridium difficile infection The main risk factors for Clostridium difficile infection (CDI) are the prescription of antibiotic therapy and the age of the patient (> 65 years). Factors that cause a change in the digestive ecosystem or intestinal motility (laxatives, transit slowing, gastrointestinal surgery ...) can also be the cause of the occurrence of an ICD. However, there are also risks of food contamination, which makes it all the more necessary to develop a sensitive and effective detection test for Clostridium difficile (Eckert et al., J Med Microbiol, 62 (Pt 9): 1435-1438, 2013).
  • Diagnosis of CDI is currently based on different techniques such as the detection of toxin activity (cytotoxicity activity, CTA).
  • CTA cytotoxicity activity
  • this technique has drawbacks, such as in particular its duration of implementation, and the need for the expertise of technicians to read the results.
  • this test has a low sensitivity.
  • CT toxigenic culture
  • FIRE REPLACEM ENT (RULE 26) cycloserine and cefoxitin. Colonies are usually identified after 48 hours of anaerobiosis incubation at 37 ° C based on appearance and odor. This culture step can also be carried out on an agar containing a chromogenic compound specific for C. difficile.
  • the application WO 2009/092982 thus describes a medium containing a substrate for beta-glucosidase whose hydrolysis indicates the presence of Clostridium difficile. However, the sensitivity of this test is only 94%.
  • the in vitro toxigenic character of the isolated strain is then determined in a second step, for example by an enzyme immunoassay method.
  • the toxigenic method is particularly sensitive for the diagnosis of CDI and allows the study of isolated colonies.
  • this method has disadvantages related to its duration (2 to 4 days) and the number of manipulations required.
  • proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound makes it possible to rapidly identify Clostridium difficile bacteria in a sensitive and specific manner and as early as in the culture stage. .
  • the detection method developed by the inventor can be carried out directly, for example from a sample from a patient, without requiring a step of prior isolation of the different strains present in this sample.
  • the method developed by the inventor allows direct and rapid detection of Clostridium difficile bacteria.
  • the present invention thus makes it possible to detect Clostridium difficile with a sensitivity of 100%, whereas the methods of the prior art only make it possible to obtain a sensitivity of 94%.
  • the inventor has observed that it is possible through fluorescence to detect and identify colonies of Clostridium difficile even in the dense region of isolation where colonies of commensal bacteria could have hidden the pathogen.
  • the present invention thus makes possible the detection and, advantageously, the identification at the level of the species or group of species, of a fluorescent colony of Clostridium difficile, even in the presence of thousands of other colonies susceptible to develop on the solid selective medium object of the invention.
  • the colonies of Clostridium difficile detected by the medium of the invention are fluorescent while the other microorganisms do not fluoresce.
  • the method according to the invention can be applied to the detection of strains of Clostridium difficile selected from the group consisting of strains 001, 002, 003, 005, 012, 014/020/077, 015, 017, 018, 019 , 023, 027, 029, 046, 048, 049, 050, 053, 056, 070, 075, 078/126, 081, 087, 094, 095, 106, 1 17, 131, 156, 168 and 169 (Eckert and al., Med Mal Infect, 43 (2): 67-74, 2013), and still more preferably in the group consisting of strains 027, 014/020/077, 078/126, 015, 002 and 005.
  • An object of the present invention therefore consists of a method for the direct detection of Clostridium difficile bacteria in a sample comprising the successive steps of: a) inoculation, with said sample, of a culture medium comprising a fluorogenic compound substrate of proline -aminopeptidase,
  • the method according to the present invention further comprises a step d) making it possible to conclude whether or not there is a particular bacterium as a function of the fluorescence of the colonies formed. It is therefore a step d) identification of Clostridium difficile bacteria in said sample.
  • a fluorogenic compound greatly improves the detection limit of Clostridium difficile. Since the detection is based on the fluorescence-positive colony emission, it is possible even on very small colonies, which could not have been identified otherwise.
  • the method of the invention makes it possible to obtain a result after 12-18 hours of incubation only, whereas the methods of the prior art require 24 to 48 hours.
  • biological sample is meant any type of microbiological sampling, such as, for example, a sample of food materials (dairy products, meat, etc.), a soil sample, a sample taken from a mammal (skin, mucous membranes, etc.). ), preferably the man, or one of its derivatives as a preculture resulting from such a sampling.
  • said biological sample is a liquid biological sample, such as saliva, blood or urine, a solid biological sample, such as feces or a food product, or a derivative of a liquid or solid biological sample such as than a preculture of such a biological sample liquid or solid.
  • a liquid biological sample such as saliva, blood or urine
  • a solid biological sample such as feces or a food product
  • a derivative of a liquid or solid biological sample such as than a preculture of such a biological sample liquid or solid.
  • said biological sample comprises different microorganisms, which may belong to species or even to distinct genera.
  • said biological sample comprises at least two different microorganisms, preferably at least five different microorganisms and, particularly preferably, at least ten different microorganisms.
  • “Culture medium” means a medium for the growth of said at least one specific microorganism to be detected. Said culture medium in fact comprises the nutrients necessary for the growth of said at least one specific microorganism to be detected.
  • nutrients necessary for the growth of said at least one specific microorganism to be detected means the composition of a base medium necessary for said growth.
  • the skilled person knows perfectly the composition of such media and is able to adapt it if necessary depending on the specificity of certain microorganisms or constraints that could be related to certain cases of the present invention (transparency of the medium for example).
  • These nutrients are especially selected from the group consisting of carbon, nitrogen, sulfur, phosphorus, vitamins, growth promoters, carbohydrates, salts (for example calcium, magnesium, manganese, sodium, potassium ), nutrient complexes (eg amino acids, blood, serum, albumin) as well as peptones and extracts of animal and plant tissues.
  • the culture medium used in the context of the present invention for the detection of Clostridium difficile bacteria, and which constitutes another object according to the present invention can be in solid, semi-solid, liquid or freeze-dried form.
  • said culture medium is an agar medium, which culture medium is, for example, agar-based.
  • the culture media according to the present invention may optionally comprise one or more antimicrobial agents.
  • antimicrobial agent is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a microorganism. Without being limiting, a concentration of between 5 mg / l and 5 g / l is particularly suitable for the present invention.
  • An antimicrobial agent may be an antibiotic such as D-cycloserine, cephalosporins, such as cefoxitin or cefotaxime, colistin, polymixin, fosfomycin, tobramycin, gentamicin, aztreonam, trimethoprim, quinolones such as nalidixic acid, an antifungal such as in particular amphotericin B, fluconazole or itraconazole.
  • antibiotic is meant any compound capable of preventing or slowing the growth of a bacterium. They belong in particular to the groups of cephalosporins, aminoglycosides, polypeptides, sulphonamides, quinolones.
  • antifungal is meant any compound that can prevent or slow the growth of yeast or mold.
  • amphotericin B fluconazole, itraconazole, voriconazole, cycloheximide.
  • the effective amount of antimicrobial agent to be used can be determined simply by those skilled in the art in view of their general knowledge.
  • culturing is meant inoculation of said culture medium with all or part of the biological sample and incubation of said inoculated culture medium.
  • step b) is carried out anaerobically.
  • the incubation step may be carried out at a temperature of about 30 ° C to 43 ° C, preferably 37 ° C, for a period of about 12 to 24 hours.
  • a temperature of about 30 ° C to 43 ° C, preferably 37 ° C, for a period of about 12 to 24 hours.
  • the skilled person can adapt the temperature and duration of this incubation step in light of his general knowledge.
  • direct detection method is meant a process that does not include a prior step of isolating the different bacterial strains present in the sample, preferably a process that does not include a prior isolation step of each bacterial strains present in the sample.
  • the method according to the invention makes it possible to avoid the step of isolating colonies of candidate bacteria which can then be subjected to a more precise test for confirming the identity of Clostridium difficile bacteria. It therefore applies to a raw sample comprising a mixture of bacteria.
  • fluorogenic compound is meant a compound bearing a fluorophore released after hydrolysis by a specific enzyme. The fluorophore thus released can thus emit light under appropriate conditions and thus makes it possible to identify the colonies comprising said enzyme.
  • said enzyme is proline aminopeptidase.
  • proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound is understood to mean here a proline derivative comprising a fluorophore bonded in such a way that the fluorophore is released as a result of cleavage of said proline derivative by proline aminopeptidase, cleavage of these compounds by proline aminopeptidase being necessary to observe fluorescence.
  • proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound is understood to mean here a proline derivative comprising a fluorophore bonded in such a way that the fluorophore is released as a result of cleavage of said proline derivative by proline aminopeptidase, cleavage of these compounds by proline aminopeptidase being necessary to observe fluorescence.
  • proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound is understood to mean here a proline derivative comprising a fluorophore bonded in such a way that the fluorophore is released as a result of clea
  • the fluorogenic substrate is typically used at a concentration of about 0.01 to 0.5 g / l. A preferred concentration is about 0.1 g / l. It is specified that the fluorogenic substrate present in the culture medium according to the present invention can be replaced, or associated, with at least one chromogenic substrate.
  • the present invention relates to a method for the direct detection of Clostridium difficile bacteria in a sample comprising the following steps: a) inoculation, with said sample, of a culture medium comprising a fluorogenic compound substrate of proline aminopeptidase and the cefoxitin and D-cycloserine, b) incubating said culture medium under conditions allowing the growth of Clostridium difficile bacteria, and c) detecting colonies of Clostridium difficile bacteria formed on said culture medium.
  • FR2926563 includes 2 product lists on page 4 lines 7-11:
  • Cephalosporins such as Cefoxitin or Cefotaxime, Colistin, Polymixin, Fosfomycin, Tobramycin, Gentamicin, Aztreonam, Trimethoprim and quinolones such as Nalidixic acid may be mentioned as a selective agent, an antifungal such as in particular amphotericin B, fluconazole or itraconazole.
  • antibiotics cefotaxime ceftazidime, cefoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztreonam, trimethoprim, tobramycin, moxalactam, fosfomycin, D-cycloserine, Polymixin, Colistine.
  • FR2926563 also includes a list of markers on page 4 lines 29-30: "Substrate: this marker part can be chromogenic, fluorogenic, luminescent ."
  • FR2926563 does not disclose the specific combination comprising a fluorogenic compound and cefoxitin and D-cycloserine since no phrase of FR2926563 includes the three characteristics in combination.
  • FR2926563 discloses a culture medium selected from a long list of selective agents and another list of 3 substrates.
  • the culture medium of the present invention is therefore a selection invention from 3 lists of a certain length and can not therefore be considered as being disclosed by FR2926563 because FR2926563 does not mention in any case the specific combination of a fluorogenic compound and cefoxitin and D-cycloserine.
  • the advantage of combining a proline-aminopeptidase substrate fluorogenic compound with cefoxitin and D-cycloserine is to improve the selectivity of the two antimicrobials and the fluorescence specificity to obtain essentially no false positives.
  • a second aspect of the present invention relates to a method for detecting and / or discriminating toxinogenic Clostridium difficile strains in a sample using a culture medium as defined above.
  • the Clostridium difficile strains are identified in said sample using the detection method described above.
  • the toxinogenicity of the strains thus identified is tested using an appropriate test.
  • Such tests are well known to those skilled in the art and include but are not limited to CTA, enzyme immunoassays and molecular biology tests (see, for example, Eckert et al., Journal of Antiinfectives, 13 (2): 67). -73, 201 1).
  • the invention relates to a selective culture medium for carrying out the method as described above.
  • the method according to the invention makes it possible, in a single culture step, to specifically detect and to differentiate Clostridium difficile bacteria, without the need for a prior isolation step or a subsequent differentiation step.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente demande a pour objet un nouveau procédé de détection et d'indentification de Clostridium difficile basé sur l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidaseet de la céfoxitine et de la D- cyclosérine.

Description

Procédé de détection et d'identification de Clostridium difficile
La présente demande a pour objet un nouveau procédé de détection et d'indentification de Clostridium difficile basé sur l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase.
Clostridium difficile est un bacille à Gram positif, anaérobie strict, sporulé, qui est retrouvé dans l'environnement tout comme dans le tube digestif de l'homme et de l'animal.
Cette bactérie est le principal agent responsable des diarrhées nosocomiales. En particulier, elle est responsable de 15 à 25 ¾ des diarrhées post-antibiotiques et de la quasi-totalité des colites pseudo-membraneuses, et peut entraîner la mort dans les cas les plus graves Une souche particulière de Clostridium difficile dénommée 027/NAP1 /BI est particulièrement virulente et se retrouve sur l'ensemble du territoire métropolitain. De fait, l'incidence des infections à Clostridium difficile a beaucoup augmenté ces dernières années, en Amérique du Nord et en Europe, mettant au premier plan l'importance d'un diagnostic rapide et fiable.
Les principaux facteurs de risque d'infection à Clostridium difficile (ICD) sont la prescription d'un traitement antibiotique et l'âge du patient (> 65 ans). Les facteurs qui entraînent une modification de l'écosystème digestif ou la motilité intestinale (laxatifs, ralentisseurs du transit, chirurgie gastro-intestinale...) peuvent également être à l'origine de la survenue d'une ICD. Cependant, il existe aussi des risques de contamination alimentaire, ce qui rend d'autant plus nécessaire le développement d'un test de détection de Clostridium difficile sensible, et efficace (Eckert et al., J Med Microbiol, 62(Pt 9): 1435-1438, 2013).
Le diagnostic des ICD repose actuellement sur différentes techniques telles que la détection de l'activité toxine (cytotoxicity activity, CTA). Toutefois, cette technique présente des inconvénients, telles que notamment sa durée de mise en œuvre, et la nécessité de l'expertise de techniciens pour la lecture des résultats. En outre, ce test présente une faible sensibilité.
Il est aussi possible d'utiliser un autre test diagnostic, la culture toxigénique (CT). Dans une première étape, les souches de Clostridium difficile sont isolées sur des milieux sélectifs comprenant une base gélosée additionnée d'antibiotiques comme
FEU ILLE DE REMPLACEM ENT (RÈGLE 26) le cyclosérine et la céfoxitine. Les colonies sont habituellement identifiées après 48 heures d'incubation en anaérobiose à 37° C sur la base de leur aspect et de leur odeur. Cette étape de culture peut aussi être mise en œuvre sur une gélose contenant un composé chromogène spécifique de C. difficile. La demande WO 2009/092982 décrit ainsi un milieu contenant un substrat de la bêta-glucosidase dont l'hydrolyse indique la présence de Clostridium difficile. Cependant, la sensibilité de ce test n'est que de 94 %.
Le caractère toxinogène in vitro de la souche isolée est ensuite déterminé dans une deuxième étape, par exemple par une méthode immuno-enzymatique. La méthode toxigénique est particulièrement sensible pour le diagnostic d'ICD et permet d'étudier les colonies isolées. Toutefois, cette méthode présente des inconvénients liés à sa durée (2 à 4 jours) et au nombre de manipulations requises.
Il existe donc un réel besoin de disposer d'une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et moins coûteuse et permettant d'identifier C. difficile dans les échantillons des patients tout en évitant de combiner plusieurs tests générant un délai supplémentaire pour l'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la dissémination de la bactérie.
De manière surprenante et inattendue, le présent inventeur a montré que l'utilisation d'un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase, permet d'identifier rapidement les bactéries Clostridium difficile de façon sensible et spécifique et ce, dès l'étape de culture.
En particulier, lorsqu'il est mis en œuvre sur un milieu solide gélosé, le procédé de détection développé par l'inventeur est réalisable directement, par exemple à partir d'un échantillon issu d'un patient, sans nécessiter d'étape d'isolement préalable des différentes souches présentes dans cet échantillon. Par rapport aux procédés antérieurs, le procédé développé par l'inventeur permet une détection directe et rapide des bactéries Clostridium difficile. De façon remarquable, la présente invention permet ainsi de détecter des Clostridium difficile avec une sensibilité de 100 %, alors que les méthodes de l'art antérieur ne permettent au mieux que d'obtenir une sensibilité de 94 %. En effet, l'inventeur a observé qu'il est possible grâce à la fluorescence de détecter et d'identifier des colonies de Clostridium difficile même dans la région dense de l'isolement où les colonies de bactéries commensales auraient pu cacher le pathogène. La présente invention rend ainsi possible la détection et, avantageusement, l'identification au niveau de l'espèce ou du groupe d'espèces, d'une colonie fluorescente de Clostridium difficile et ce, même en présence de milliers d'autres colonies susceptibles de se développer sur le milieu sélectif solide objet de l'invention. En fait, les colonies de Clostridium difficile détectées par le milieu de l'invention sont fluorescentes tandis que les autres microorganismes ne fluorescent pas.
En particulier, le procédé selon l'invention peut être appliqué à la détection de souches de Clostridium difficile choisie dans le groupe constitué des souches 001 , 002, 003, 005, 012, 014/020/077, 015, 017, 018, 019, 023, 027, 029, 046, 048, 049, 050, 053, 056, 070, 075, 078/126, 081 , 087, 094, 095, 106, 1 17, 131 , 156, 168 et 169 (Eckert et al. , Med Mal Infect, 43(2): 67-74, 2013), et encore préférentiellement dans le groupe constitué des souches 027, 014/020/077, 078/126, 015, 002 et 005.
Un objet de la présente invention consiste donc en un procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase,
b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et
c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture.
Avantageusement, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape d) permettant de conclure à la présence ou non d'une bactérie particulière en fonction de la fluorescence des colonies formées. Il s'agit par conséquent d'une étape d) d'identification de bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon. On notera à cet égard que l'utilisation d 'un composé fluorogène améliore grandement la limite de détection des Clostridium difficile. La détection étant basée sur l'émission par les colonies positives de fluorescence, elle est possible même sur des colonies de très petite taille, qui n'auraient pu être identifiées autrement. De ce fait, la méthode de l'invention permet d 'obtenir un résultat après 12-18 heures d 'incubation seulement, alors que les méthodes de l'art antérieur requièrent de 24 à 48 heures.
Par « échantillon biologique », on entend tout type de prélèvement microbiologique, tel que par exemple un prélèvement de matières alimentaires (produits laitiers, viande, etc. ), un prélèvement de sol, un prélèvement sur un mammifère (peau, muqueuses, etc. ), de préférence l'homme, ou l'un de ses dérivés comme une préculture issue d'un tel prélèvement.
Avantageusement, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang ou de l'urine, un échantillon biologique solide, comme des fèces ou un produit alimentaire, ou encore un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide.
Avantageusement encore, ledit échantillon biologique comprend différents microorganismes, lesquels peuvent appartenir à des espèces voire à des genres distincts. À titre d 'exemple, ledit échantillon biologique comprend au moins deux microorganismes différents, de préférence au moins cinq microorganismes différents et, de manière particulièrement préférée, au moins dix microorganismes différents.
Par « milieu de culture », on entend un milieu permettant la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter. Ledit milieu de culture comprend en effet les nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter.
Par « nutriments nécessaires à la croissance dudit au moins un microorganisme spécifique à détecter », on entend la composition d'un milieu de base nécessaire à ladite croissance. L'homme du métier connaît parfaitement la composition de tels milieux et est à même de l'adapter si nécessaire en fonction de la spécificité de certains microorganismes ou de contraintes qui pourraient être liées à certains cas de la présente invention (transparence du milieu par exemple). Ces nutriments sont notamment choisis dans le groupe comprenant du carbone, de l'azote, du soufre, du phosphore, des vitamines, des inducteurs de croissance, des hydrates de carbone, des sels (par exemple calcium, magnésium, manganèse, sodium, potassium), des complexes nutritifs (par exemple des acides aminés, du sang, du sérum, de l'albumine) ainsi que des peptones et des extraits de tissus animaux et végétaux.
Le milieu de culture utilisé dans le cadre de la présente invention pour la détection des bactéries Clostridium difficile, et qui constitue un autre objet selon la présente invention, peut être sous forme solide, semi-solide, liquide ou lyophilisée. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu gélosé, lequel milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agar. Parmi les présentations des milieux de culture utilisables, on peut ainsi citer les boîtes de Pétri sur lesquelles se développent des microorganismes. Les milieux de culture selon la présente invention peuvent éventuellement comprendre un ou plusieurs agents antimicrobiens. Par « agent antimicrobien», on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'un microorganisme. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 5 mg/l et 5 g/l est particulièrement adaptée à la présente invention. On peut citer comme agent antimicrobien, un antibiotique tel que la D-cyclosérine, les céphalosporines, telles que la céfoxitine ou le céfotaxime, la colistine, la polymixine, la fosfomycine, la tobramycine, la gentamicine, l'aztréonam, le triméthoprime, les quinolones telles que l'acide nalidixique, un antifongique tel que notamment l'amphotéricine B, le fluconazole ou l'itraconazole. Par antibiotique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une bactérie. Ils appartiennent notamment aux groupes des céphalosporines, des aminosides, des polypeptides, des sulfamides, des quinolones. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques céfotaxime, ceftazidime, céfoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, triméthoprime, tobramycine, moxalactam, fosfomycine, D-cyclosérine, polymixine, colistine. Par antifongique, on entend tout composé susceptible d'empêcher ou de ralentir la croissance d'une levure ou d'une moisissure. A titre indicatif, on peut citer notamment l'amphotéricine B, le fluconazole, l'itraconazole, le voriconazole, la cycloheximide. En particulier, il est très avantageux d'utiliser des milieux de culture comprenant de la cefoxitine et de la D-cyclosérine.
La quantité efficace d'agent antimicrobien à utiliser peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. Par « mise en culture », on entend l'inoculation dudit milieu de culture par tout ou partie de l'échantillon biologique et incubation dudit milieu de culture inoculé.
L'homme du métier adaptera les conditions d'incubation en fonction du milieu de culture, de l'échantillon biologique et du microorganisme spécifique à détecter en fonction de ses connaissances générales. En particulier, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'incubation de l'étape b) est effectuée en anaérobiose.
L'étape d'incubation peut être réalisée à une température d'environ 30° C à 43 ° C, de préférence 37° C, et ce pendant une durée d'environ 12 à 24 h. Cependant, en fonction des moyens dont il disposera, l'homme du métier pourra adapter la température et la durée de cette étape d'incubation au regard de ses connaissances générales.
Par « procédé de détection directe », on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon.
En effet, le procédé selon l'invention permet d'éviter l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation de l'identité des bactéries Clostridium difficile. Il s'applique donc à un échantillon brut comprenant un mélange de bactéries. Par « composé fluorogène », on entend un composé portant un fluorophore libéré après une hydrolyse par une enzyme spécifique. Le fluorophore ainsi libéré peut ainsi émettre de la lumière dans des conditions appropriées et permet ainsi d'identifier les colonies comprenant ladite enzyme. Avantageusement, ladite enzyme est la proline-aminopeptidase. Plus spécifiquement, par « composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase », on entend donc ici un dérivé de proline comprenant un fluorophore lié de telle façon que le fluorophore est libéré à la suite du clivage dudit dérivé de proline par la proline-aminopeptidase, le clivage de ces composés par la proline-aminopeptidase étant nécessaire pour observer la fluorescence. De tels composés sont déjà connus : on citera notamment la L-proline 7-amido-4-méthylcoumarine. A cet égard, l'homme du métier saura déterminer sans peine les longueurs d'ondes d'excitation optimales entraînant l'émission de lumière par le fluorophore. A titre d'exemple, on mentionnera qu'une fluorescence peut être détectée à 460 nm quand la L-Proline 7-amido-4-methylcoumarine est excitée à 365 nm.
Le substrat fluorogène est typiquement utilisé à une concentration allant de 0,01 à 0,5 g/l environ. Une concentration préférée se situe à 0,1 g/l environ. Il est précisé que le substrat fluorogène présent dans le milieu de culture selon la présente invention peut être remplacé, ou associé, à au moins un substrat chromogène.
La présente invention concerne un procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives : a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase et de la céfoxitine et de la D-cyclosérine, b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture.
La présente invention est nouvelle par rapport à FR2926563 car nous sommes en présence d'une invention de sélection. En effet, FR2926563 comprend 2 listes de produits à la page 4 lignes 7-11 :
« On peut citer comme agent sélectif, les céphalosporines, telles que la Céfoxitine ou le Céfotaxime, la Colistine, la Polymixine, la Fosfomycine, la Tobramycine, la Gentamicine, l'Aztréonam, le Triméthoprime, les quinolones telles que l'acide Nalidixique, un antifongique tel que notamment l'amphotéricine B, le fluconazole ou l'itraconazole. A titre indicatif, on peut citer notamment les antibiotiques cefotaxime, ceftazidime, cefoxitine, ceftriaxone, cefpodoxime, aztréonam, Triméthoprime, tobramycine, moxalactam, fosfomycine, D-cyclosérine, Polymixine, Colistine. »
FR2926563 comprend aussi une liste de marqueurs à la page 4 lignes 29-30: « Substrat : cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... »
Il est évident que FR2926563 ne divulgue pas la combinaison spécifique comprenant un composé fluorogène et de la céfoxitine et de la D-cyclosérine car aucune phrase de FR2926563 ne comprend les trois caractéristiques en combinaison.
Au contraire FR2926563 divulgue un milieu de culture sélectionné à partir d'une longue liste d'agents sélectifs et d'une autre liste de 3 substrats. Le milieu de culture de la présente invention est par conséquent une invention de sélection à partir de 3 listes d'une certaine longueur et ne peut donc pas être considérée comme étant divulguée par FR2926563 car FR2926563 ne mentionne en aucun cas la combinaison spécifique d'un composé fluorogène et de la céfoxitine et de la D- cyclosérine.
L'avantage de combiner un composé fluorogène substrat de la proline- aminopeptidase avec de la céfoxitine et de la D-cyclosérine est d'améliorer la sélectivité des deux antimicrobiens et la spécificité de fluorescence pour n'obtenir essentiellement aucun faux positifs.
Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de discrimination des souches de Clostridium difficile toxinogènes dans un échantillon à l'aide d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus. Dans une première étape de ce procédé, les souches des Clostridium difficile sont identifiées dans ledit échantillon à l'aide du procédé de détection décrit plus haut. Dans une deuxième étape, le pouvoir toxinogénique des souches ainsi identifiées est testé à l'aide d'un test approprié. De tels tests sont bien connus de l'homme du métier et comprennent entre autres le test CTA, les tests immuno- enzymatiques et les tests de biologie moléculaire (voir par exemple Eckert et al. , Journal des Antiinfectieux, 13(2) : 67-73, 201 1 ).
Selon un troisième aspect, l'invention porte sur un milieu de culture sélectif permettant de mettre en œuvre le procédé tel que décrit ci-dessus.
L'objet de la présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus. D'autres modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir de l'exemple ci-dessous, fourni ici à titre purement illustratif. Il est clair que ni l'objet ni la portée de la présente invention ne sont limités par cet exemple.
Exemple
Détection directe de bactéries Clostridium difficile à l'aide d'un milieu selon la présente invention :
Différents échantillons contenant des suspensions de bactéries sont étalés directement sur boîte de Pétri comprenant un milieu gélosé comprenant:
• Peptones et yeast extract 25 g/L
• NaCl 5 g/L
• Agar 15 g/L
• Pyruvate 2 g/L
· K2HP04 g/L
• Fructose 1 g/L
• Cysteine 0,1 g/L
• Taurocholate 0,5 g/L
• Amphotericine 0,01 g/L
· Cycloserine 0,3 g/L
• Cefoxitine 0,005 g/L
• AMC-proline 0,075 g/L
Après incubation pendant 12 à 24 heures, l'analyse visuelle des boîtes de Pétri permet d'identifier directement celles comprenant des colonies Clostridium difficile.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet, en une seule étape de culture, de détecter spécifiquement et de différencier les bactéries Clostridium difficile, sans nécessité d'une étape préalable d'isolement ni étape ultérieure de différenciation.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Procédé de détection directe de bactéries Clostridium difficile dans un échantillon comprenant les étapes successives :
a) d'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant un composé fluorogène substrat de la proline-aminopeptidase et de la céfoxitine et de la D-cyclosérine,
b) d'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries Clostridium difficile, et
c) de détection des colonies de bactéries Clostridium difficile formées sur ledit milieu de culture.
2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une étape d) d'identification de bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit composé fluorogène est la L-proline 7-amido-4-méthylcoumarine. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le milieu de culture est un milieu gélosé 6) Procédé de détection et/ou de discrimination des souches de Clostridium difficile toxinogènes dans un échantillon, comprenant des étapes consistant à :
a) Détecter les bactéries Clostridium difficile dans ledit échantillon à l'aide du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et b) Tester le pouvoir toxinogénique des souches ainsi identifiées.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le test de l'étape b) est un test CTA, un test immuno-enzymatique ou un test de biologie moléculaire. Milieu de culture pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'une quelconq des revendications 1 à 5.
PCT/EP2015/056545 2014-04-11 2015-03-26 Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile WO2015155018A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1453272 2014-04-11
FR1453272A FR3019833A1 (fr) 2014-04-11 2014-04-11 Procede de detection et d'identification de clostridium difficile

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015155018A1 true WO2015155018A1 (fr) 2015-10-15

Family

ID=51293073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2015/056545 WO2015155018A1 (fr) 2014-04-11 2015-03-26 Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3019833A1 (fr)
WO (1) WO2015155018A1 (fr)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041138A2 (fr) * 1996-05-01 1997-11-06 Idg (Uk) Limited Derives d'esculetine
FR2926563A1 (fr) * 2008-01-21 2009-07-24 Biomerieux Sa Procede de detection et/ou d'identification de clostridium difficile

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997041138A2 (fr) * 1996-05-01 1997-11-06 Idg (Uk) Limited Derives d'esculetine
FR2926563A1 (fr) * 2008-01-21 2009-07-24 Biomerieux Sa Procede de detection et/ou d'identification de clostridium difficile

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D P FEDORKO ET AL: "Use of cycloserine-cefoxitin-fructose agar and L-proline-aminopeptidase (PRO Discs) in the rapid identification of Clostridium difficile", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 1 May 1997 (1997-05-01), UNITED STATES, pages 1258 - 1259, XP055159504, Retrieved from the Internet <URL:http://jcm.asm.org/content/35/5/1258.abstract> *
DRUGGAN P ET AL: "Culture media for the isolation of Cronobacter spp", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 136, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 169 - 178, XP026761627, ISSN: 0168-1605, [retrieved on 20090922], DOI: 10.1016/J.IJFOODMICRO.2009.09.008 *
HARRIS J L ET AL: "Rapid and general profiling of protease specificity by using combinatorial fluorogenic substrate libraries", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 97, no. 14, 5 July 2000 (2000-07-05), pages 7754 - 7759, XP002161192, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.140132697 *
MANAFI M ED - HEPERKAN DILEK ET AL: "New developments in chromogenic and fluorogenic culture media", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 60, no. 2-3, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 205 - 218, XP002177549, ISSN: 0168-1605, DOI: 10.1016/S0168-1605(00)00312-3 *
NOV: "Letters to the Editor Proline-Aminopeptidase Test for Rapid Screening of Clostridium difficile", J. CLIN. MICROBIOL, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 30071258 - 1259, XP055159501, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC230110/pdf/353007.pdf> [retrieved on 20141218] *

Also Published As

Publication number Publication date
FR3019833A1 (fr) 2015-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2465939B1 (fr) Milieux pour la détection spécifique de microorganismes résistants
EP1546366B1 (fr) Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon
EP1543147B1 (fr) Procede de detection de staphylococcus aureus resistants a la meticilline
FR2929291A1 (fr) Composition de permeabilisation cellulaire comprenant nog, hmp, chlorure de rubidium et/ou chlorure de lithium pour la detection sur membrane de cellules vivantes.
EP2235202B1 (fr) Procédé de détection et/ou d&#39;identification de clostridium difficile
EP2331702B1 (fr) Milieu de culture permettant de differencier staphylococcus aureus des staphylococcus a coagulase negative
FR2924127A1 (fr) Milieu reactionnel pour la detection et/ou l&#39;identification de staphyloccocus aureus
EP3094738B1 (fr) Utilisation d&#39;au moins un substrat de carboxylestérase et/ou de triacylglycérol-lipase pour la détection des bactéries du groupe bacillus cereus
WO2015155018A1 (fr) Procédé de détection et d`identification de clostridium difficile
FR2881754A1 (fr) Milieux pour la detection specifique de micro-organismes resistants
EP2041298B1 (fr) Milieu de culture solide pour la detection et/ou la discrimination au niveau de l&#39;espece des enterocoques resistants aux glycopeptides
EP2785857B1 (fr) Procede de detection de bacteries yersinia enterocolitica pathogenes
WO2018130775A1 (fr) Milieu de transport et/ou conservation pour mycobacterium tuberculosis
WO2011058065A1 (fr) Procede et milieu de detection de bacteries escherichia coli producteurs de shigatoxines
WO2012028816A1 (fr) Utilisation d&#39;un activateur de beta-glucosidase pour la détection et/ou l&#39;identification de c.difficile
RU2636005C2 (ru) Штаммы Gardnerella vaginalis (варианты), потенциально значимые для диагностики бактериального вагиноза, и включающая их коллекция штаммов для диагностики бактериального вагиноза
FR2921670A1 (fr) Milieu de culture specifique pour la croissance, la detection, l&#39;identification et/ou la numerotation des bacteries staphylocoques a coagulase positive.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15712891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15712891

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1