WO2000023804A1 - Procede de detection de l'activite enzymatique de l'enzyme poly(adp-ribose polymerase) - Google Patents

Procede de detection de l'activite enzymatique de l'enzyme poly(adp-ribose polymerase) Download PDF

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WO2000023804A1
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antibody
adp
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poly
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Patrice Decker
Gilbert De Murcia
Sylviane Muller
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Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)

Definitions

  • the subject of the invention is a method for detecting the enzymatic activity of the poly (ADP-ribose polymerase) enzyme and for detecting the inhibitory or activating activity of an inhibitor or activator of this enzyme.
  • Poly (ADP-ribosyl) ation is a major post-translational modification of nuclear proteins.
  • the poly (ADP-ribose) polymerase (PARP; EC 2.4.2.30), also called poly (ADP-ribose synthetase) (PARS) which catalyzes this reaction, is a basic nuclear enzyme of 113 kD whose structure has been relatively well preserved during evolution. From NAD +
  • PARP catalyzes the polymerization of residues of ADP-ribose into a more or less branched homopolymer, poly (ADP-ribose), which is linked to acceptor nuclear proteins ( Figure 1A) .
  • PARP itself represents the main acceptor of poly (ADP-ribose) (phenomenon of self-modification, the site of which is located at the level of the D domain of the enzyme; FIG. 1B).
  • nuclear proteins are poly (ADP-ribose) acceptors, for example histones H1 and H2B or topoisomerases I and LT which are modified on glutamic acid residues (heteromodification).
  • the binding of poly (ADP-ribose) to these nuclear proteins considerably affects their structure and functions, notably by reducing their affinity for DNA.
  • the basic activity of PARP is strongly stimulated by the presence of single strand (and on a smaller scale double strand) cuts in DNA which are generated by genotoxic agents such as ionizing radiation, monofunctional alkylating agents, anti-tumor agents and damage. oxidative.
  • XRCCl is specifically associated with poly (ADP-ribose) polymerase and negatively regulâtes its activity following DNA damage. Mol. Cell. Biol. 18, 3563-3571.
  • the basic principle of these tests consists in immobilizing PARP, or extracts containing PARP, on a filter (for example nitrocellulose) and incubating it with all the necessary reaction elements, including radioactive NAD.
  • the radioactivity incorporated into the ADP-ribose units is measured by autoradiography of the filter (activity test on membrane).
  • the test can also be carried out in the liquid phase, the mixture is filtered after precipitation with trichloroacetic acid (TCA) and the incorporated radioactivity is measured on the filter by conventional methods.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the tests are performed in the presence of an exogenous, poly-accepting protein (ADP-ribose). They are often histones (see for example the technical review written by Shah et al. (1995) Method for biochemical study of poly (ADP-ribose) metabolism in vitro and in vivo. Anal. Biochem. 227, 1- 13).
  • PARP inhibitors of the 3-amino benzamide (3-AB) type are generally used within a concentration range of mM.
  • These authors have described 4 inhibitors whose IC50 are ⁇ 1 ⁇ M (ie between 180 and 390 nM).
  • the test they used is a radioactive liquid phase test.
  • radioactive tests are more sensitive than immunoenzymatic tests.
  • ELISA tests are however often favored because they do not use radioactivity, considered to be restrictive with regard to safety, the costs generated by the purchase of reagents, their handling and their elimination. To increase the sensitivity of the tests
  • the subject of the invention is a method for detecting the enzymatic activity of PARP, by a test which is easy to carry out, rapid, specific and extremely sensitive.
  • the invention also relates to a method for detecting the enzymatic activity of PARP, by a test which does not use radioactivity.
  • the invention also relates to a method for studying large series of molecules, or a mixture of molecules, intended to inhibit and possibly increase the activity of PARP.
  • the invention also relates to a method for detecting inhibitors or activators of PARP in amounts which may be excessively weak, of the order of nanomolar.
  • PARP polymerase
  • the activity of PARP is defined by the evaluation of the quantity of poly (ADP-ribose) synthesized in the presence of all the reagents of the enzymatic reaction (in particular substrate and co-factor of the enzyme).
  • the invention relates to the use of an anti-poly (ADP-ribose) antibody for the detection of the enzymatic activity of PARP, with a view to quantifying the inhibitory or activating activity of an inhibitor or activator of PARP, by measuring the variation in PARP activity.
  • the inhibition of PARP is defined by the reduction in the quantity of poly (ADP-ribose) synthesized in the presence of all the reagents of the enzymatic reaction (in particular substrate and co-factor of the enzyme) and of a given inhibitor . As for the activation of PARP, it is dependent on cuts
  • Single strand (and to a lesser extent double strand) in DNA.
  • a synthesis of weak poly (ADP-ribose) is observed which corresponds to the so-called basal activity of the enzyme.
  • the synthesis of poly (ADP-ribose) is very strongly stimulated by the presence of DNA containing breaks or cuts.
  • “Intact” DNA is not a good activator.
  • the PARP inhibitor or the PARP activator is present in doses less than or equal to approximately 250 nM, in particular less than or equal to approximately 100 nM and advantageously between approximately 25 and around 100 nM.
  • the invention also relates to a method for detecting the activity of
  • PARP comprising a step of detecting the bond between PARP and the poly (ADP-ribose) using an anti-poly (ADP-ribose) antibody.
  • the method for detecting the activity of PARP with a view to detecting the inhibitory or activating activity of a PARP inhibitor or activator comprises:
  • the method for detecting the activity of PARP comprises the following steps: - adsorption of PARP contained in an adsorption medium, on a support,
  • the invention also relates to a method for detecting the activity of
  • PARP for the detection of the inhibitory or activating activity of a PARP inhibitor or activator comprising the following steps: - adsorption of PARP contained in an adsorption medium, on a support,
  • the poly (ADP-ribose) acceptor nuclear protein is PARP.
  • the poly (ADP-ribose) acceptor nuclear protein is chosen from histones, proteins
  • HMG High Mobility Group: proteins from the group of high mobility proteins
  • topoisomerases proteins from the group of high mobility proteins
  • DNA polymerases DNA polymerases
  • ligases preferably histones.
  • the adsorption of PARP takes place in an adsorption medium containing a compound capable of playing the role of screen between the damaged DNA and the poly (ADP-) polymer.
  • ribose such as spermine or spermidine, or advantageously MgCl 2 , and an agent promoting the formation of zinc fingers, advantageously ZnCl 2 .
  • the polymer Since the polymer has substantially the same charge as the injured DNA, the competition between the injured DNA and the polymer is reduced by the presence of Mg 2 + , advantageously in the form of MgCl 2 .
  • the reaction medium containing the elements necessary for the activation of PARP comprises: the substrate of PARP, advantageously ⁇ -NAD + ,
  • the poly (ADP-ribose) polymer such as spermine or spermidine, or advantageously MgCl 2 and an agent promoting the formation of zinc fingers, advantageously ZnCl 2 .
  • the anti-poly antibody when it is added to the medium containing PARP, is diluted in a dilution medium making it possible to avoid reactions non-specific, and advantageously containing serum albumin from beef (BSA).
  • the anti-poly antibody is a polyclonal antibody, for example the antibody LP 96-10 polyclonal marketed by BioMol Research Laboratories (Plymouth Meeting, PA, Cat N ° SA-276), or an antibody induced in guinea pigs (polyconal antibody: ref. SA-217, Plymouth Meeting, PA), or a non-commercial antibody, prepared in the laboratory, or a monoclonal antibody such as the 10H antibody marketed by Serotec (Cat n ° MCA 1480; Oxford, UK or by Travigen
  • the detection of the poly (ADP-ribose) -antibody anti-poly (ADP-ribose) complex can be carried out by conventional techniques such as: spectrophotometry, fluorescence, luminescence, using for example a second antibody coupled to an enzyme revealed by a substrate and a chromogen, or a fluorescent or chemiluminescent reagent.
  • the detection of the poly (ADP-ribose) -antibody anti-poly (ADP-ribose) (first antibody) complex is carried out using a second antibody directed against the anti-poly antibody (ADP-ribose) and conjugated to an enzyme, and the bond between the anti-poly antibody (ADP-ribose) and the second antibody is for example revealed by colorimetric reaction, in particular caused by the addition of 'an enzyme substrate and a chromogen.
  • PARP is used at a rate of about 200 to about 600 ng / ml
  • the damaged DNA is used at a rate of about 1 to 1.5 ⁇ g / ml
  • ZnCl 2 is used at a rate of approximately 10 to 30 ⁇ M
  • MgCl 2 is used at a rate of approximately 3 to 5 mM
  • DTT is used at a rate of approximately 0, 8 to 1.2 mM
  • the anti-poly antibody (ADP-ribose) is used at a rate of approximately 1/500 to approximately 1/2000
  • BSA in the dilution medium of the anti-poly antibody (ADP -ribose) is used at a rate of about 0.2 to about 0.6% (w / v).
  • the method for detecting the enzymatic activity of PARP with a view to quantifying the inhibitory or activating activity of a PARP inhibitor or activator comprises the following steps:
  • the reaction medium containing the elements necessary for activating PARP also contains a compound capable of avoiding the oxidation of the cysteine residues of PARP, such as dithiothreitol (DTT).
  • a compound capable of avoiding the oxidation of the cysteine residues of PARP such as dithiothreitol (DTT).
  • DTT dithiothreitol
  • ELISA plates for example polyvinyl chloride (PNC), can be used.
  • MgCl 2 can be replaced by any compound capable of playing a role of "screen” between the injured AD ⁇ and poly (ADP-ribose), and therefore increases the synthesis of poly (ADP-ribose).
  • Spermine or spermidine can also be used.
  • ZnCl 2 can be replaced by any Zn salt capable of promoting the formation of zinc fingers.
  • Appropriate adsorption conditions are for example from 5 h to 16 h, at 4 ° C.
  • the washing buffer for elements not linked to PARP is generally PBS-T
  • Damaged DNA is a co-factor of PARP.
  • This DNA activated by incubation with DNAse I is 100-200 bp in length. It can be prepared according to the method described by Mazen A., Ménissier-de Murcia J., Molinete M., Simonin F., Gradkar G., Poirier G.G. and de Murcia G. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4689-4698.
  • Commercial DNA can also be used (ref. Ladder MIX, MBI Fermentas, parent company in Vilnius, Lithuania, distributed in France by Euromedex, ref. SM0331, lot AS05, length: 100 to 10000bp).
  • NAD + ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide is the substrate for PARP.
  • ⁇ -NAD is inactive and cannot replace ⁇ - NAD + .
  • anti-poly antibody a monoclonal antibody such as the 10H antibody or anti-poly rabbit serum (ADP-ribose) can be used.
  • the antibody dilution medium contains for example 0.4% serum bovine albumin (BSA) in order to avoid possible non-specific reactions.
  • BSA serum bovine albumin
  • the second antibody makes it possible to visualize and quantify the binding of the first antibody to poly (ADP-ribose).
  • the 10H monoclonal antibody it is an anti-mouse IgG3 conjugate linked to horseradish peroxidase; in the case of anti-poly rabbit serum (ADP-ribose), it is an anti-rabbit IgG conjugate linked to peroxidase.
  • the anti-mouse IgG3 conjugate linked to peroxidase can be replaced by a total anti-mouse Ig conjugate (recognizing IgG3) linked to peroxidase.
  • the substrate / chromogenic pair is H 2 O 2 -tetramethyl benzidine, TMB.
  • the peroxidase / H 2 O 2 -TMB system also allows the use of short reagent incubation times.
  • hydrochloric acid for example HC1, 1M
  • sulfuric acid for example H 2 SO 4
  • concentration ranges of the essential components of the test implemented in the method of the invention are advantageously the following:
  • anti-poly (ADP-ribose) antibodies do not react with either PARP or DNA.
  • anti-rabbit / mouse conjugate linked to peroxidase reacts neither with PARP, nor with damaged DNA, nor with poly (ADP ribose).
  • the invention also relates to a kit for the detection of the enzymatic activity of PARP, optionally for the detection of the inhibitory or activating activity of a PARP inhibitor or activator comprising: - the enzyme PARP,
  • At least one anti-poly antibody (ADP-ribose)
  • the media or buffers allowing the dilution of the above-mentioned antibody
  • the media or buffers allowing the formation of antigen-antibody complex between the poly (ADP-ribose) and the anti-poly antibody (ADP-ribose)
  • a second antibody capable of forming a complex with the anti-poly antibody (ADP-ribose), optionally labeled with an enzyme
  • Figure 1A corresponds to the metabolism of poly (ADP-ribose) and Figure 1B represents the modular structure of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP, 113 kDa).
  • Figure 1B represents the modular structure of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP, 113 kDa).
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • part A corresponds to the DNA binding domain
  • part B corresponds to the nuclear localization signal (NLS)
  • part C corresponds to a domain whose function is not yet known
  • part D corresponds to the domain self-modification
  • part E belongs to the catalytic domain
  • part F is the catalytic domain
  • N corresponds to the N-terminal end and C corresponds to the C-terminal end.
  • Figures 2A and 2B show inhibition of PARP activity using serial dilutions of inhibitor 3-MB (A) and NU 1025 (B), respectively. in ELISA.
  • the test conditions are described in Example 1 below.
  • the values of the absorbance (or optical density) were brought to 450 nm on the ordinate axis. Table 1 corresponding to this figure is given below.
  • FIG. 3 represents the detection in ELISA of the inhibition of the activity of PARP using a series of PARP inhibitors tested at 1 ⁇ M.
  • the test conditions are described in Example 1.
  • the background noise is ⁇ 0.15 OD units and corresponds to the average absorbance measured in wells in which all the steps of the ELISA test are carried out using all the reagents except NAD + .
  • Figure 4 represents the comparison of the activity levels measured using the 10H monoclonal antibody and polyclonal anti-poly antibodies (ADP-ribose) (see Example 3).
  • the first surface corresponds to the use of the 10H monoclonal antibody
  • the second surface corresponds to that of polyclonal antibodies
  • the third surface to that of a control without antibody.
  • the optical density is plotted on the ordinate at 450 nm.
  • Figure 5 shows the level of activity measured in the presence and absence of an exogenous acceptor protein (see Example 4).
  • the first two surfaces correspond to the use of PARP alone, and the last two surfaces correspond to the use of PARP and the histone H1.
  • the gray areas correspond to the reaction in the absence of an inhibitor, and the white areas correspond to the reaction in the presence of the 3 MB inhibitor (1 ⁇ M).
  • the optical density is plotted on the ordinate at 450 nm.
  • Recombinant human PARP 400 ng / ml in Tris buffer containing 50 mM Tris adjusted to pH 8 with HC1, 20 ⁇ M ZnCl 2 and 4 mM MgCl 2 ; 200 ⁇ l / well
  • Recombinant human PARP 400 ng / ml in Tris buffer containing 50 mM Tris adjusted to pH 8 with HC1, 20 ⁇ M ZnCl 2 and 4 mM MgCl 2 ; 200 ⁇ l / well
  • the same final result is obtained when the plates are covered by incubation overnight (16 hrs) or simply 5 hrs.
  • PBS-T Phosphate Buffered Saline-Tween
  • saline phosphate buffer containing Tween 20 150 mM pH 7.4
  • PBS-T KH 2 PO 4 (1.47 mM), Na j HPQ ⁇ 2H 2 O (8.09 mM), KC1 (2.68 mM), NaCl (0.14 M), Thimerosal 494 ⁇ M (antibacterial preservative), Tween 20 (0.05% v / v)] 1.25 ⁇ g / ml of injured DNA prepared as described according to the reference by Mazen et al.
  • Example 2 Recombinant human PARP (400 ng / ml in the "Tris buffer” defined above (200 ⁇ l / well) is immobilized by adsorption on microtiter plates made of polyvinyl chloride (Falcon, ref. 3912). continues overnight at 4 ° C.
  • the synthesis of poly (ADP-ribose) by activated PARP is then detected by adding 10H monoclonal Ac (culture supernatant diluted 1/1600 in PBS-T additionally containing 0.4% BSA; 200 ⁇ l / cup ). An incubation is carried out for 1 hour at 37 ° C. Three (3) washes of the plate are then carried out with PBS-T (cf. 13.1.2).
  • the final reaction is visualized by adding the chromogen 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) in the presence of H2O2 (150 ⁇ l / well). Incubation is carried out for 15 min at 37 ° C. The reaction is stopped by adding 50 ⁇ l HCl (final concentration 0.25 M).
  • TMB chromogen 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • the absorbance is measured at 450 nm using a spectrophotometer.
  • This example is a comparative example between the implementation of the method described in Example 1 and using a polyclonal or monoclonal antibody for the detection of poly (ADP-ribose) (see Figure 4).
  • Example 4 This example relates to the comparison of the implementation of the method of the invention respectively in the presence or in the absence of an acceptor protein (other than PARP itself) (see Figure 5).
  • heterologous acceptor protein pure histone H1, which is the main histone which may be poly (ADP-ribosyl), has been tested.
  • the histone Hl 400ng / ml
  • the PARP are adsorbed on the plate.
  • the activity signal (DO) is significantly reduced. This may affect the sensitivity and variability of detection of signal inhibition in the presence of an inhibitor to be tested.
  • This example concerns the implementation of the method of the invention in which one of the essential components of the test is omitted.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) pour la détection de l'activité enzymatique de l'enzyme poly (ADP-ribose polymérase) (PARP) et de détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de cette enzyme.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE DE L'ENZYME POLY(ADP-RIBOSE POLYMERASE)
L'invention a pour objet un procédé de détection de l'activité enzymatique de l'enzyme poly(ADP-ribose polymérase) et de détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de cette enzyme.
La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle majeure des protéines nucléaires. La poly(ADP-ribose) polymérase (PARP; EC 2.4.2.30), aussi appelée poly(ADP-ribose synthétase) (PARS) qui catalyse cette réaction, est une enzyme nucléaire basique de 113 kD dont la structure a été relativement bien conservée au cours de l'évolution. A partir du NAD+
(β-mcotinarnide adénrne dinucléotide) son substrat, la PARP catalyse la polymérisation de résidus d'ADP-ribose en un homopolymère plus ou moins branché, le poly(ADP-ribose), qui est lié à des protéines nucléaires acceptrices (Figure 1A). Parmi les protéines acceptrices connues, on relèvera que la PARP elle-même représente le principal accepteur de poly(ADP-ribose) (phénomène d' automodification dont le site se situe au niveau du domaine D de l'enzyme; Figure 1B). Quelques autres protéines nucléaires sont des accepteurs de poly(ADP-ribose), par exemple les histones Hl et H2B ou les topoisomérases I et LT qui sont modifiées sur des résidus d'acide glutamique (hétéromodification). La liaison du poly(ADP-ribose) à ces protéines nucléaires affecte considérablement leur structure et leurs fonctions en réduisant notamment leur affinité pour l'ADN. L'activité de base de la PARP est fortement stimulée par la présence de coupures simple brin (et à moindre échelle double brin) dans l'ADN qui sont générées par des agents génotoxiques tels que radiations ionisantes, agents alkylants monofonctionnels, agents antitumoraux et dommages oxydatifs. La reconnaissance de ces interruptions du squelette sucre- phosphate de l'ADN par l'enzyme s'effectue par l' intermédiaire de deux motifs en doigt de zinc, appelés FI et F2, localisés dans le domaine N-teπninal (domaine A; Figure 1B). Du fait de ces propriétés de reconnaissance de "cassures" ou de lésions de l'ADN, on a attribué à la PARP toute une série de fonctions potentielles dans les grandes voies métaboliques cellulaires telles que transcription, réplication et réparation. En particulier, des données récentes indiquent très clairement que la PARP participe activement à la réparation par excision de bases (BER). Au cours de la mort cellulaire programmée, son clivage par les caspases au niveau du domaine B (résidu d'acide aspartique 214; Figure 1B), survenant en même temps que celui d'autres enzymes de réparation et de protéines structurales nucléaires, empêche une réparation futile et assure l'irréversibilité rapide de la phase d'exécution de l'apoptose.
S 'agissant de la détection de l'activité enzymatique de la PARP ou de la détection d'inhibiteurs ou d'activateurs de la PARP, les techniques actuellement décrites dans la littérature utilisent du NAD radioactif (32P, 14C ou 3H-NAD) (Niedergang C, Okazaki H. and Mandel P. (1979) Properties of purified calf thymus poly (Adenosine diphosphate ribose) polymérase. Eur. J. Biochem. 102, 43-57).
On peut citer également d'autres auteurs qui utilisent toujours des tests similaires basés sur l'emploi du NAD radioactif, par exemple :
- Banasik et al. (1992) Spécifie i hibitors of poly(ADP-ribose) synthétase and mono(ADP-ribosyl)transferase. J.Biol. Chem. 267, 1569-1575. - Panzeter and Althaus (1994) DNA strand break-mediated partioning of poly(ADP-ribose) polymérase function. Biochemistry 33, 9600-9605.
- Shah et al. (1995) Review: Method for biochemical study of poly(ADP- ribose) metabolism in vitro and in vivo. Anal. Biochem. 227, 1-13.
- Shah et al. (1996) Complète inhibition of poly(ADP-ribose) polymérase activity prevents the recovery of C3H10T1/2 cells from oxidative stress. Biochim.
Biophys. Acta 1312 1-7.
- Masson M. , Niedergang C, Schreiber V., Mufler S., Ménissier de Murcia J. and de Murcia G. (1998) XRCCl is specifically associated with poly(ADP-ribose) polymérase and negatively régulâtes its activity following DNA damage. Mol. Cell. Biol. 18, 3563-3571. Le principe de base de ces essais consiste à immobiliser la PARP, ou des extraits contenant la PARP, sur un filtre (par exemple de la nitrocellulose) et de l'incuber avec tous les éléments réactionnels nécessaires, dont du NAD radioactif. La radioactivité incorporée dans les unités d' ADP-ribose (voir figure 1A) est mesurée par autoradiographie du filtre (test d'activité sur membrane). Le test peut aussi être réalisé en phase liquide, le mélange est filtré après précipitation à l'acide trichloracétique (TCA) et la radioactivité incorporée est mesurée sur le filtre par des méthodes classiques. En règle générale, lorsque les utilisateurs testent la PARP purifiée, les tests sont réalisés en présence d'une protéine exogène, acceptrice de poly(ADP-ribose). Il s'agit souvent d'histones (voir par exemple la revue technique rédigée par Shah et al. (1995) Method for biochemical study of poly(ADP-ribose) metabolism in vitro and in vivo. Anal. Biochem. 227, 1-13).
Par ailleurs, les inhibiteurs de la PARP du type 3-amino benzamide (3-AB) sont généralement utilisés dans une fourchette de concentration du mM. On peut noter page 1573 de l'article de Banasik et al. (1992) intitulé "Spécifie inhibitors of poly(ADP-ribose) synthétase and mono(ADP-ribosyl)transferase" J.Biol.Chem. 267 (pages 1569-1575) que ces auteurs classent les inhibiteurs en 5 catégories dont ceux qui ont des IC50 < 25 μM qui sont considérées comme "très fortes". Ces auteurs ont décrit 4 inhibiteurs dont les IC50 sont < lμM (à savoir entre 180 et 390 nM). Le test qu'ils ont utilisé est un test radioactif en phase liquide.
Il est d'usage courant pour l'homme de métier de dire que les tests radioactifs (RIA) sont plus sensibles que les tests immunoenzymatiques. Les tests ELISA sont cependant souvent favorisés car ils n'utilisent pas de radioactivité, considérée comme contraignante au regard de la sécurité, des coûts engendrés par l'achat des réactifs, de leur manipulation et de leur élimination. Pour augmenter la sensibilité des tests
ELISA, de nouveaux systèmes de détection ont été introduits, tels que des révélations par fluorescence et chimiluminescence, par exemple. Même si des formats d'ELISA élaborés peuvent être utilisés, dans le meilleur des cas on prétend à des sensibilités similaires en ELISA et RIA (voir la préface du livre de J.R. Crowther "ELISA, theory andpractice" dans "Methods in Molecular Biology", vol. 42, Humana Press, (1995). On notera de plus que les tests "radioactifs" de type test d'activité sur membrane sont certes visuels, puisqu'on dispose d'un film d'autoradiographie, mais ne sont pas du tout quantitatifs.
Par ailleurs, à ce jour, la sensibilité des tests de mesure d'activité enzymatique de la PARP ne permet pas de détecter des inhibiteurs spécifiques de la PARP ayant une activité lorsqu'ils sont testés à des concentrations de l'ordre de quelques nanomoles/litre. ou de quelques dizaines de nanomoles/litre.
L'invention a pour objet un procédé de détection de l'activité enzymatique de la PARP, par un test facile à mettre en œuvre, rapide, spécifique et extrêmement sensible.
L'invention a également pour objet un procédé de détection de l'activité enzymatique de la PARP, par un test qui ne fait pas appel à la radioactivité.
L'invention a également pour objet un procédé permettant d'étudier des séries importantes de molécules, ou un mélange de molécules, destinés à inhiber et éventuellement augmenter l'activité de la PARP.
L'invention a également pour objet un procédé permettant de détecter des inhibiteurs ou des activateurs de la PARP en quantités qui peuvent être excessivement faibles, de l'ordre du nanomolaire.
Ces différents aspects ont été obtenus par l'utilisation d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) pour la détection de l'inhibition (ou de l'activation) de l'activité enzymatique de l'enzyme poly (ADP-ribose polymérase) (PARP).
On a trouvé, contre toute attente, que l'utilisation d'un anticorps anti-poly (ADP-ribose) pour la détection de l'inhibition ou de l'activation de l'activité enzymatique de la PARP s'avérait être une méthode plus sensible que les méthodes de l'art antérieur faisant appel à la radioactivité.
On définit l'activité de la PARP par l'évaluation de la quantité de poly(ADP-ribose) synthétisé en présence de tous les réactifs de la réaction enzymatique (notamment substrat et co-facteur de l'enzyme).
L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) pour la détection de l'activité enzymatique de la PARP, en vue de la quantification de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou activateur de la PARP, par mesure de la variation de l'activité de la PARP. On définit l'inhibition de la PARP par la diminution de la quantité de poly(ADP-ribose) synthétisé en présence de tous les réactifs de la réaction enzymatique (notamment substrat et co-facteur de l'enzyme) et d'un inhibiteur donné. Quant à l'activation de la PARP, elle est sous la dépendance de coupures
"simple brin" (et dans une moindre mesure double brin) dans l'ADN. En l'absence de l'activateur, on observe une synthèse de poly(ADP-ribose) faible qui correspond à l'activité dite basale de l'enzyme. La synthèse de poly(ADP-ribose) est très fortement stimulée par la présence de ADN contenant des cassures ou coupures. L'ADN "intact" n'est pas un bon activateur.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l' inhibiteur de la PARP ou l'activateur de la PARP est présent à des doses inférieures ou égales à environ 250 nM, notamment inférieures ou égales à environ 100 nM et avantageusement comprises entre environ 25 et environ 100 nM. L'invention concerne également un procédé de détection de l'activité de la
PARP comprenant une étape de détection de la liaison entre la PARP et le poly(ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose).
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de détection de l'activité de la PARP en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP, comprend :
- une étape de mesure de l'activité de la PARP, en l'absence d' activateur et d'inhibiteur de PARP, par détection de la liaison entre la PARP et le poly (ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly (ADP-ribose),
- une étape de mesure de l'activité de la PARP, en présence d'un activateur ou d'un inhibiteur de la PARP, par détection de la liaison entre la PARP et le poly(ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose), les deux étapes de mesure définies ci-dessus étant effectuées dans un ordre quelconque,
- et une étape de comparaison des activités de la PARP obtenues respectivement dans chacune des deux étapes définies ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de détection de l'activité de la PARP comprend les étapes suivantes : - adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur un support,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et résultant en la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison du poly(ADP-ribose) à au moins une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu, ou adsorbée
- addition au milieu contenant la PARP d'un anticorps anti-poly (ADP-ribose) dans des conditions permettant la formation d'un complexe anticorps-antigène avec le poly(ADP-ribose) lié à la PARP, - détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps et mesure de l'activité enzymatique correspondante de la PARP.
L'invention concerne également un procédé de détection de l'activité de la
PARP en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP, comprenant les étapes suivantes : - adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur un support,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant
. un inhibiteur ou un activateur de la PARP,
. les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et résultant en la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison du poly(ADP-ribose) à au moins une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu,
- addition, au milieu contenant la PARP, d'un anticorps anti-poly (ADP-ribose) dans des conditions permettant la formation d'un complexe anticorps-antigène avec le poly(ADP-ribose) lié à la PARP,
- détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps, et mesure de l'activité enzymatique correspondante de la PARP,
- comparaison de la mesure de l'activité enzymatique de la PARP obtenue lors de la détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps avec la mesure de l'activité enzymatique de la PARP obtenue lors de la détection de la formation du complexe antigène-anticorps obtenu selon la mise en œuvre du procédé de détection de l'activité de la PARP qui fait l'objet du paragraphe précédent. De façon avantageuse, dans le procédé de l'invention, la protéine nucléaire acceptrice de poly(ADP-ribose) est la PARP. En d'autres termes, selon un mode de réalisation avantageux, il n'y a pas de protéine nucléaire acceptrice exogène.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de l'invention, la protéine nucléaire acceptrice de poly(ADP-ribose) est choisie parmi des histones, des protéines
HMG ("High Mobility Group" : protéines du groupe des protéines de haute mobilité), des topoisomérases, des ADN polymérases et des ligases, et de préférence des histones.
De façon avantageuse, dans le procédé de l'invention, l' adsorption de la PARP a lieu dans un milieu d'adsorption contenant un composé susceptible de jouer le rôle d'écran entre l'ADN lésé et le polymère de poly(ADP-ribose) tel que la spermine ou la spermidine, ou avantageusement du MgCl2, et un agent favorisant la formation de doigts de zinc, avantageusement ZnCl2.
Le polymère ayant sensiblement la même charge que l'ADN lésé, la compétition entre l'ADN lésé et le polymère est diminuée par la présence de Mg2 +, avantageusement sous forme MgCl2.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de l'invention, le milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP comprend: - le substrat de la PARP, avantageusement du β-NAD+,
- un co-facteur de la PARP, avantageusement de l'ADN lésé,
- un agent réducteur, notamment du DTT,
- un composé susceptible de jouer le rôle d'écran entre l'ADN lésé et le polymère de poly (ADP-ribose) tel que la spermine ou la spermidine, ou avantageusement MgCl2 et un agent favorisant la formation de doigts de zinc, avantageusement ZnCl2.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de l'invention, l'anticorps anti-poly(ADP-ribose), lors de son addition au milieu contenant la PARP, est dilué dans un milieu de dilution permettant d'éviter les réactions non spécifiques éventuelles, et avantageusement contenant de l' albumine sérique de bœuf (BSA).
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de l'invention, l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est un anticorps polyclonal, par exemple l'anticorps LP 96-10 polyclonal commercialisé par BioMol Research Laboratories (Plymouth Meeting, PA, Cat N° SA-276), ou un anticorps induit chez le cochon d'Inde (anticorps polyconal : réf. SA-217, Plymouth Meeting, PA), ou un anticorps non commercial, préparé au laboratoire, ou un anticorps monoclonal tel que l'anticorps 10H commercialisé par Serotec (Cat n° MCA 1480 ; Oxford, UK ou par Travigen
Inc. , Gaithersburg, MD, USA).
La détection du complexe poly(ADP-ribose)-anticorps anti-poly(ADP-ribose) peut être effectuée par des techniques classiques tel que : spectrophotométrie, fluorescence, ch rùluminescence, en utilisant par exemple un deuxième anticorps couplé à une enzyme révélée par un substrat et un chromogène, ou un réactif fluorescent ou chimiluminescent.
De façon avantageuse, dans le procédé de l'invention, la détection du complexe poly(ADP-ribose)-anticorps anti-poly(ADP-ribose) (premier anticorps) est effectué à l'aide d'un deuxième anticorps dirigé contre l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) et conjugué à une enzyme, et la liaison entre l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) et le deuxième anticorps est par exemple révélé par réaction colorimétrique, notamment provoquée par l'addition d'un substrat de l'enzyme et d'un chromogène.
L'importance de la réaction colorée (densité optique) est mesurée par spectrophotométrie . Dans le cas particulier visé ci-dessus, il s'agit d'un test ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) (imunoenzymatique).
Les tests ELISA sont par exemple définis dans le livre J.R. Crowther "ELISA, theory and practice" dans "Methods in Molecular Biology" , vol. 42, Humana Press, (1995). Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé de l'invention, la PARP est utilisée à raison d'environ 200 à environ 600 ng/ml, l'ADN lésé est utilisé à raison d'environ 1 à 1,5 μg/ml, le ZnCl2 est utilisé à raison d'environ 10 à 30 μM, MgCl2 est utilisé à raison d'environ 3 à 5 mM, le NAD+ 25 à 75 μM, le DTT est utilisé à raison d'environ 0,8 à 1,2 mM, l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est utilisé à raison d'environ 1/500 à environ 1/2000, la BSA dans le milieu de dilution de l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est utilisée à raison d'environ 0,2 à environ 0,6 % (p/v). De façon plus détaillée, le procédé de l'invention de détection de l'activité enzymatique de la PARP comprend les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur des plaques de microtitration en plastique, et lavage de la PARP non adsorbée,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et notamment de l'ADN lésé, du NAD+, et un composé susceptible d'éviter l'oxydation des résidus de cysteine, conduisant à la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison de celui-ci sur une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu ou adsorbée, notamment la PARP, et lavage des éléments non liés à la PARP, addition, au milieu contenant de la PARP, d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) contenu dans un milieu de dilution pour former un complexe antigène-anticorps avec le poly(ADP-ribose) lié sur la PARP ou sur la protéine acceptrice et lavage de l'anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition d'un 2ème anticorps spécifique de l'espèce d'origine de l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) conjugué à une enzyme pour former un complexe antigène- anticorps avec l'anticorps anti-poly( ADP-ribose) et lavage du deuxième anticorps qui n'a pas formé de complexe, - addition du substrat au susdit enzyme et d'un chromogène,
- développement de la réaction colorimétrique puis arrêt de cette réaction par addition d'une solution acide,
- détermination de l'activité enzymatique de la PARP en mesurant l'intensité de la réaction par exemple par mesure de la densité optique (DO). Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention le procédé de détection de l'activité enzymatique de la PARP en vue de la quantification de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou activateur de PARP comprend les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption sur des plaques de microtitration en plastique, et lavage de la PARP non adsorbée,
- addition à la PARP adsorbée d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et notamment de l'ADN lésé, du NAD+ et un composé susceptible d'éviter l'oxydation des résidus de cysteine, conduisant à la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison de celui-ci sur une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu, ou adsorbée, notamment la PARP, et un inhibiteur ou un activateur de la PARP et lavage des éléments non liés à la PARP, - addition, au milieu contenant de la PARP, d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) contenu dans un milieu de dilution pour former un complexe antigène-anticorps avec le poly(ADP-ribose) lié sur la PARP ou sur n'importe quelle protéine acceptrice et lavage de l'anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition d'un 2ème anticorps spécifique de l'espèce d'origine de l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) conjugué à une enzyme pour former un complexe antigène- anticorps avec l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) et lavage du deuxième anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition du substrat du susdit enzyme et d'un chromogène,
- développement de la réaction colorimétrique puis arrêt de cette réaction par addition d'une solution acide,
- détermination de l'activité enzymatique de la PARP en mesurant l'intensité de la réaction par exemple par mesure de la densité optique (DO),
- comparaison des activités enzymatiques de la PARP respectivement obtenues à l'étape précédente et à l'issue du procédé sus-défini de détection de l'activité enzymatique de la PARP, qui fait l'objet du paragraphe précédent.
Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP contient également un composé susceptible d'éviter l'oxydation des résidus de cysteine de la PARP, tel que le dithiothreitol (DTT). Comme support d'adsorption de la PARP, on peut utiliser des plaques ELISA, par exemple en chlorure de polyvinyle (PNC).
Le milieu utilisé, d'une part pour l'adsorption de la PARP (milieu d'adsorption) et, d'autre part, comme milieu de réaction à la composition suivante : 50 mM Tris-
HC1, pH 8, contenant 4mM MgCl2 et 20 μM ZnCl2. MgCl2 peut être remplacé par tout composé susceptible de jouer un rôle d' "écran" entre l'ADΝ lésé et le poly (ADP-ribose), et donc augmente la synthèse de poly (ADP-ribose). On peut utiliser également la spermine ou la spermidine. Du ZnCl2 peut être remplacé par tout sel de Zn susceptible de favoriser la formation des doigts de zinc.
Des conditions d'adsorption appropriées sont par exemple de 5h à 16h, à 4°C. Le tampon de lavage des éléments non liés à la PARP est généralement PBS-T
(composition saline tamponnée au phosphate, voir exemple 1), et contient un détergent doux évitant la liaison faible de certaines molécules, tel que Tween 20 (commercialisé par Sigma- Aldrich, Steinheim, Allemagne, NO CAT 27, 434-8 ou Sigma référence P1379). L' ADN lésé est un co-facteur de la PARP. Cet ADN activé par incubation avec de la DNAse I a une longueur de 100-200 pb. Il peut être préparé selon le procédé décrit par Mazen A., Ménissier-de Murcia J., Molinete M., Simonin F., Gradwohl G., Poirier G.G. and de Murcia G. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4689-4698. On peut également avoir recours à de l'ADN commercial (réf. Ladder MIX, MBI Fermentas, maison-mère à Vilnius, Lithuanie, distribué en France par Euromedex, réf. SM0331, lot AS05, longueur: 100 à lOOOOpb).
Le NAD+, le β-nicotinamide adénine dinucléotide est le substrat de la PARP. L'α-NAD est inactif et ne peut remplacer le β- NAD+.
Comme anticorps anti-poly(ADP-ribose), on peut utiliser un anticorps monoclonal tel que l'anticorps 10H ou du sérum de lapin anti-poly(ADP-ribose).
Le milieu de dilution de l'anticorps contient par exemple 0,4% d'albumine sérique de bœuf (BSA) afin d'éviter les réactions non spécifiques éventuelles.
Le deuxième anticorps permet de visualiser et quantifier la liaison du premier anticorps au poly(ADP-ribose). Dans le cas de l'anticorps monoclonal 10H, il s'agit d'un conjugué anti-IgG3 de souris lié à la peroxydase de raifort; dans le cas du sérum de lapin anti-poly (ADP-ribose), il s'agit d'un conjugué anti-IgG de lapin lié à la peroxydase. Le conjugué anti-IgG3 de souris lié à la peroxydase peut être remplacé par un conjugué anti-Ig totales de souris (reconnaissant les IgG3) lié à la peroxydase.
De façon avantageuse, le couple substrat/chromogène est H2O2-tétramethyl benzidine, TMB. Le système peroxydase/ H2O2-TMB permet également d'utiliser des temps courts d'incubation des réactifs. Pour arrêter la réaction colorimétrique entre le chromogène et le substrat de l'enzyme lié au susdit deuxième anticorps, on peut utiliser l'acide chlorhydrique (par exemple HC1, 1M), ou de l'acide sulfurique (par exemple H2SO4 , 0.5M).
S 'agissant des gammes de concentration des composants essentiels du test mis en œuvre dans le procédé de l'invention, elles sont avantageusement les suivantes :
- PARP 400 ± 200 ng/ml
- ADN "lésé" 1,25 ± 0,25 μg/ml
- NAD+ additionné au milieu de réaction de la PARP 50 ± 25 μM
- ZnCl2 dans le milieu de réaction et d'adsorption de la PARP 20 ± 10 μM
- MgCl2 dans le milieu de réaction et d'adsorption de la PARP 4+ 1 mM
- DTT additionné au milieu de réaction de la PARP 1 ± 0.2 mM
- Anticorps monoclonal anti-poly(ADP-ribose) 1/1600 (1/500 à 1/2000)
(surnageant de culture, donc à calibrer pour chaque nouveau lot).
- BSA dans le milieu d'incubation du 1er anticorps 0,4 ± 0,2 % (p/v)
(dépend du lot de BSA utilisé, donc à calibrer pour chaque nouveau lot).
La spécificité étroite des réactifs immunologiques suivants a été particulièrement étudiée :
- anticorps monoclonal anti-poly (ADP-ribose),
- sérum de lapin anti-poly (ADP-ribose), - conjugué anti-IgG de lapin/souris lié à la peroxydase.
On a pu montrer que les anticorps anti-poly(ADP-ribose) ne réagissent ni avec la PARP, ni avec l'ADN. Le conjugué anti-IgG de lapin/souris lié à la peroxydase ne réagit ni avec la PARP, ni avec l' ADN lésé, ni avec le poly(ADP ribose).
L'invention concerne également un kit pour la détection de l'activité enzymatique de la PARP, éventuellement en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP comprenant : - l'enzyme PARP,
- les milieux ou tampons nécessaires à l' adsorption de la PARP sur un support utilisable dans un procédé ELISA, - les milieux ou tampons permettant la mise en activité de l'enzyme PARP,
- au moins un anticorps anti-poly (ADP-ribose),
- les milieux ou tampons permettant la dilution du susdit anticorps, - les milieux ou tampons permettant la formation de complexe antigène- anticorps entre le poly (ADP-ribose) et l'anticorps anti-poly(ADP-ribose),
- éventuellement un deuxième anticorps susceptible de former un complexe avec l'anticorps anti-poly (ADP-ribose), éventuellement marqué par une enzyme,
- éventuellement le substrat de la susdite enzyme, et un chromogène ainsi que l'acide stoppant la réaction,
- éventuellement les milieux ou tampon permettant la formation d'un complexe antigène-anticorps entre l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) et le susdit deuxième anticorps,
- éventuellement au moins un inhibiteur ou un activateur de la PARP susceptible d'être utilisé comme témoin interne.
LEGENDE DES FIGURES
La Figure 1A correspond au métabolisme du poly(ADP-ribose) et la Figure 1B représente la structure modulaire de la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP, 113 kDa). Dans la Figure 1B :
- la partie A correspond au domaine de liaison de l'ADN, la partie B correspond au signal de localisation nucléaire (NLS), la partie C correspond à un domaine dont la fonction n'est pas encore connue, la partie D correspond au domaine d'auto modification, la partie E appartient au domaine catalytique, et la partie F est le domaine catalytique,
- FI et F2 sont respectivement des doigts de zinc,
- N correspond à l'extrémité N-terminale et C à l' extrémité C-terminale.
Les Figures 2A et 2B représentent l'inhibition de l'activité de la PARP en utilisant des dilutions en série respectivement de l'inhibiteur 3-MB (A) et NU 1025 (B) en ELISA. Les conditions de tests sont décrites dans l'exemple 1 ci-après. On a porté, sur l'axe des ordonnées, les valeurs de l'absorbance (ou densité optique) à 450 nm. On donne ci-après le Tableau 1 correspondant à cette figure.
Tableau 1
Figure imgf000016_0001
La Figure 3 représente la détection en ELISA de l'inhibition de l'activité de la PARP en utilisant une série d'inhibiteurs de PARP testés à lμM. Les conditions de tests sont décrites dans l'exemple 1. L'étendue de l'activité inhibitrice des composés testés est exprimée sur l'axe des ordonnées en pourcentage d'inhibition =
100 - [(valeur de DO avec inhibiteur - valeur de DO du bruit de fond/valeur de DO sans inhibiteur - valeur de DO du bruit de fond) x 100]. Le bruit de fond est < à 0,15 unité de DO et correspond à l'absorbance moyenne mesurée dans des puits dans laquelle toutes les étapes du test ELISA sont effectuées en utilisant tous les réactifs sauf le NAD+.
Références des composés testés : benzamide (Sigma B-2009), 3-AB (Sigma A- 0788), 4-AB (Sigma A-1658), 3-MB (Sigma- Aldrich, Ml, 005-0), NU1025 (don du Dr. D. Newell), 1,5-dihydroxyisoquinoline (DHIQ ; Sigma- Aldrich 28-191- 3), nicotmamide ou niacinamide (NAM ; Sigma N-3376). II faut noter que pour déterminer la valeur IC50 de chacun des inhibiteurs, ceux- ci ont été testés à des valeurs dans la gamme allant de 10 nM à 8000 nM. Dans ce qui précède et dans ce qui suit, DO signifie densité optique. La Figure 4 représente la comparaison des niveaux d'activités mesurés en utilisant l'anticorps monoclonal 10H et des anticorps polyclonaux anti-poly(ADP-ribose) (voir Exemple 3). La première surface correspond à l'utilisation de l'anticorps monoclonal 10H, la deuxième surface correspond à celle d'anticorps polyclonaux, et la troisième surface à celle d'un témoin sans anticorps. La densité optique est portée en ordonnées, à 450 nm.
La Figure 5 représente le niveau d'activité mesuré en présence et en absence d'une protéine acceptrice exogène (voir Exemple 4).
Les deux premières surfaces correspondent à l'utilisation de la PARP seule, et les deux dernières surfaces correspondent à l'utilisation de PARP et de l'histone Hl.
Les surfaces en gris correspondent à la réaction en l'absence d'inhibiteur , et les surfaces en blanc correspondent à la réaction en présence de l'inhibiteur 3 MB (1 μM). La densité optique est portée en ordonnées, à 450 nm.
Exemple 1
De la PARP recombinante humaine (400 ng/ml dans un tampon Tris contenant 50 mM Tris ajusté à pH 8 avec HC1, 20 μM ZnCl2 et 4 mM de MgCl2 ; 200 μl/puits) est immobilisé sur des plaques de microtitration en chlorure de polyvinyle (Falcon, réf. 3912). Le même résultat final est obtenu lorsque les plaques sont recouvertes par incubation toute la nuit (16h) ou simplement 5h. Après 3 lavages avec du PBS-T ("Phosphate Buffered Saline-Tween") (tampon phosphate salin contenant du Tween 20), 150 mM pH 7,4 [PBS-T = KH2PO4 (1,47 mM), NajHPQ^ 2H2O (8,09 mM), KC1 (2,68 mM), NaCl (0,14 M), Thimerosal 494 μM (préservatif antibactérien), Tween 20 (0,05% v/v)], 1,25 μg/ml d'ADN lésé préparé comme décrit selon la référence de Mazen et al. (Mazen, A., Ménissier-de Murcia, J., Molinete, M., Simonin, F., Gradwohl, G., Poirier, G.G. and de Murcia, G., 1989, "Nucleic Acids Res. ", 17, pp.4689-4698) et dilué dans du tampon Tris décrit ci-dessus et additionné de 50 ± 25 μM β-NAD+ (Boehringer-Manheim, réf. 127965) et 1 mM de
DTT fraîchement préparé est incubé pendant lh (200 μl/puits) = "milieu réactionnel" . Après 3 lavages avec PBS-T, la synthèse de poly (ADP-ribose) par la PARP activée est détectée en utilisant l'anticorps monoclonal 10H (surnageant de culture dilué à 1/1600 dans du PBS-T contenant 0,4 % de BSA ; 200 μl/puits). Après lh d'incubation à 37°C et 3 lavages avec PBS-T, du conjugué chèvre anti-IgG3 de souris couplé à la peroxydase (Nordic) dilué à 1/5000 dans du PBS-T (200 μl/puits) est ajouté pendant 30mn à 37°C. Après une série finale de lavages (2 fois avec PBS-T et une fois avec H2O), la réaction positive est visualisée par TMB (3,3', 5,5'- tétraméthyl-benzidine) en présence de H2O2 pendant 15 mn à 37°C (150 μl/puits). La réaction est arrêtée par addition de 50 μl HCl (concentration finale à 0,25 M) et l'absorbance est mesurée à 450nm. Pour l'étude d'inhibiteurs/activateurs potentiels de la PARP, les composés à tester sont ajoutés dans le milieu réactionnel.
Toutes les étapes de test d' ELISA sont effectuées à 4°C, sauf lorsque c'est indiqué différemment.
Exemple 2 La PARP recombinante humaine (400 ng/ml dans le "tampon Tris" défini ci- dessus (200 μl/cupule) est immobilisée par adsorption sur des plaques de microtitration en chlorure de polyvinyle (Falcon, réf. 3912). La réaction se poursuit en une nuit à 4°C.
On effectue ensuite trois (3) lavages de la plaque avec du PBS-T (pH 7,4). La composition du tampon est celle donnée à l'exemple 1.
On additionne 1,25 μg/ml ADN "lésé", préparé comme décrit par Mazen et al. (réf. ci-dessus) et dilué dans le "tampon Tris" défini ci-dessus contenant en plus 50 ± 25 μM β-NAD+ (Boehringer-Manheim, réf. 127965), 1 mM de DTT (fraîchement préparé) et l'inhibiteur à tester (200 μl/cupule). L'inhibiteur à tester est ajouté dans la gamme de 10 nM à 8000 nM. L'incubation à lieu pendant 1 heure à
4°C.
On effectue ensuite trois (3) lavages de la plaque avec du PBS-T ayant la composition donnée ci-dessus.
La synthèse de poly(ADP-ribose) par la PARP activée est ensuite détectée par addition de l'Ac monoclonal 10H (surnageant de culture dilué 1/1600 dans du PBS-T contenant en plus 0,4% BSA; 200 μl/cupule). On effectue ensuite une incubation 1 heure à 37°C. On effectue ensuite trois (3) lavages de la plaque avec du PBS-T (cf 13.1.2).
On additionne du conjugué chèvre anti-IgG3 de souris couplé à la peroxydase (Nordic) dilué 1/5000 dans du PBS-T (200 μl/cupule). On fait incuber 30 min à 37°C, puis on effectue deux (2) lavages de la plaque avec du PBS-T (et un (1) lavage à l'eau.
On visualise la réaction finale en ajoutant le chromogène 3,3',5,5'-tétramethyl- benzidine (TMB) en présence de H2O2 (150 μl/cupule). On effectue une incubation 15 min à 37°C. La réaction est arrêtée en ajoutant 50 μl HCl (concentration finale 0,25M).
L'absorbance est mesurée à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
Exemple 3
Cet exemple est un exemple comparatif entre la mise en œuvre du procédé décrit à l'Exemple 1 et utilisant un anticorps polyclonal ou monoclonal pour la détection du poly(ADP-ribose) (voir Figure 4).
Les résultats obtenus dans chaque cas sont identiques.
Exemple 4 Cet exemple concerne la comparaison de la mise en œuvre du procédé de l'invention respectivement en présence ou en l'absence d'une protéine acceptrice (autre que la PARP elle-même) (voir Figure 5).
Comme protéine acceptrice hétérologue, on a testé l'histone Hl pure qui est la principale histone qui peut être poly(ADP-ribosyl)ée. Dans ce cas, l'histone Hl (400ng/ml) et la PARP sont adsorbées sur la plaque. On note sur la figure qu'en présence d'une protéine acceptrice hétérologue le signal d'activité (DO) est sensiblement diminué. Ceci peut affecter la sensibilité et la variabilité de la détection de l'inhibition du signal en présence d'un inhibiteur à tester. On aura donc de préférence recours à l'utilisation de la PARP seulement, sans protéine acceptrice hétérologue. Exemple 5
Cet exemple concerne la mise en œuvre du procédé de l'invention dans lequel l'un des composants essentiels du test est omis.
L'effet de l'absence des différents composants suivants a été testé : PARP, ADN "lésé", NAD+, anticorps anti-poly (ADP-ribose), et DTT. Dans tous les cas, la réaction finale s'avère complètement négative (Tableau 2). On a observé qu'en l'absence de ZnCl2+MgCl2 dans le milieu, la réaction (DO) est nettement diminuée (0,45 unité DO, au lieu de 1,37).
Les résultats sont donnés dans le Tableau 2 ci-après.
Tableau 2
Figure imgf000020_0001

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Utilisation d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) pour la détection de l'activité enzymatique de l'enzyme poly (ADP-ribose polymérase) (PARP).
2. Utilisation d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) pour la détection de l'activité enzymatique de la PARP selon la revendication 1, en vue de la quantification de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou activateur de la PARP, par mesure de la variation de l'activité de la PARP.
3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle l'inhibiteur de la PARP ou l'activateur de la PARP est présent à des doses inférieures ou égales à environ 250 nM, notamment inférieures ou égales à environ 100 nM et avantageusement comprises entre environ 25 et environ 100 nM.
4. Procédé de détection de l'activité de la PARP comprenant une étape de détection de la liaison entre la PARP et le poly(ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) .
5. Procédé de détection de l'activité de la PARP selon la revendication 4, en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP, comprenant :
- une étape de mesure de l'activité de la PARP, en l'absence d' activateur et d'inhibiteur de PARP, par détection de la liaison entre la PARP et le poly(ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose),
- une étape de mesure de l'activité de la PARP, en présence d'un activateur ou d'un inhibiteur de la PARP, par détection de la liaison entre la PARP et le poly (ADP-ribose) à l'aide d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose), les deux étapes de mesure définies ci-dessus étant effectuées dans un ordre quelconque, - et une étape de comparaison des activités de la PARP obtenues respectivement dans chacune des deux étapes définies ci-dessus.
6. Procédé de détection de l'activité de la PARP selon la revendication 4, comprenant les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur un support,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et résultant en la synthèse de poly (ADP-ribose) et à la liaison du poly(ADP-ribose) à au moins une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu, ou adsorbée,
- addition au milieu contenant la PARP d'un anticorps anti-poly (ADP-ribose) dans des conditions permettant la formation d'un complexe anticorps-antigène avec le poly(ADP-ribose) lié à la PARP, - détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps et mesure de l'activité enzymatique correspondante de la PARP.
7. Procédé de détection de l'activité de la PARP en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP selon la revendication 6, comprenant les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur un support,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant
. un inhibiteur ou un activateur de la PARP,
. les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et résultant en la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison du poly(ADP-ribose) à au moins une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu,
- addition, au milieu contenant la PARP, d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) dans des conditions permettant la formation d'un complexe anticorps-antigène avec le poly(ADP-ribose) lié à la PARP, - détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps, et mesure de l'activité enzymatique correspondante de la PARP, - comparaison de la mesure de l'activité enzymatique de la PARP obtenue lors de la détection de la formation du susdit complexe antigène-anticorps avec la mesure de l'activité enzymatique de la PARP obtenue lors de la détection de la formation du complexe antigène-anticorps obtenu selon la revendication 6.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, dans lequel la protéine nucléaire acceptrice de poly(ADP-ribose) est la PARP.
9. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, dans lequel la protéine nucléaire acceptrice de poly(ADP-ribose) est choisie parmi : - PARP,
- histone(s), - HMG, - topoisomérases,
- ADN polymérases,
- ADN ligases.
10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel l'adsorption de la PARP a lieu dans un milieu d'adsorption contenant un composé susceptible de jouer le rôle d'écran entre l'ADN lésé et le polymère de poly(ADP-ribose) tel que la spermine ou la spermidine, ou avantageusement du MgCl2, et un agent favorisant la formation de doigts de zinc, avantageusement ZnCl2.
11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, dans lequel le milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP comprend:
- le substrat de la PARP, avantageusement du β -NAD+,
- un co-facteur de la PARP, avantageusement de l'ADN lésé, - un agent réducteur, notamment du DTT,
- un composé susceptible de jouer le rôle d'écran entre l'ADN lésé et le polymère de poly (ADP-ribose) tel que la spermine ou la spermidine, ou avantageusement MgCl2 et un agent favorisant la formation de doigts de zinc, avantageusement ZnCl2.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, dans lequel l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) lors de son addition au milieu contenant la PARP est dilué dans un milieu de dilution permettant d'éviter les réactions non spécifiques éventuelles, et avantageusement contenant de la BSA.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, dans lequel l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est un anticorps polyclonal, par exemple l'anticorps
LP 96-10 polyclonal commercialisé par BioMol Research Laboratories (Plymouth Meeting, PA, Cat N° SA-276), ou un anticorps induit chez le cochon d'Inde (anticorps polyconal : réf. SA-217, Plymouth Meeting, PA), ou un anticorps non commercial, préparé au laboratoire, ou un anticorps monoclonal tel que l'anticorps 10H commercialisé par Serotec (Cat n° MCA 1480 ; Oxford, UK ou par Travigen
Inc., Gaithersburg, MD, USA).
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 13, dans lequel la détection du complexe poly(ADP-ribose)-anticorps anti-poly(ADP-ribose) (premier anticorps) est effectué à l'aide d'un deuxième anticorps dirigé contre l'anticorps anti- poly(ADP-ribose) et conjugué à une enzyme, et dans lequel la liaison entre l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) et le deuxième anticorps est révélé par exemple par réaction colorimétrique, provoquée par l'addition d'un substrat de l'enzyme et d'un chromogène.
15. Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, dans lequel la PARP est utilisée à raison d'environ 200 à environ 600 ng/ml, l' ADN lésé est utilisé à raison d'environ 1 à 1,5 μg/ml, ZnCl2 est utilisé à raison d'environ 10 à 30 μM, MgCl2 est utilisé à raison d'environ 3 à 5 mM, NAD+ 25 à 75 μM, DTT est utilisé à raison d'environ 0,8 à 1,2 mM, l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est utilisé à raison d'environ 1/500 à environ 1/2000, BSA dans le milieu de dilution de l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) est utilisé à raison d'environ 0,2 à environ 0,6 % (p/v).
16. Procédé selon l'une des revendications 6 à 15, de détection de l'activité enzymatique de la PARP comprenant les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption, sur des plaques de microtitration en plastique, et lavage de la PARP non adsorbée,
- addition, à la PARP adsorbée, d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et notamment du ADN lésé, du NAD+, et un composé susceptible d'éviter l'oxydation des résidus de cysteine, conduisant à la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison de celui-ci sur une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu ou adsorbée, notamment la PARP, et lavage des éléments non liés à la PARP,
- addition, au milieu contenant de la PARP, d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) contenu dans un milieu de dilution pour former un complexe antigène-anticorps avec le poly(ADP-ribose) lié sur la PARP ou sur la protéine acceptrice et lavage de l'anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition d'un 2ème anticorps spécifique de l'espèce d'origine de l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) conjugué à une enzyme pour former un complexe antigène- anticorps avec l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) et lavage du deuxième anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition du substrat au susdit enzyme et d'un chromogène,
- développement de la réaction colorimétrique puis arrêt de cette réaction par addition d'une solution acide, - détermination de l'activité enzymatique de la PARP en mesurant l'intensité de la réaction par exemple par mesure de la densité optique (DO).
17. Procédé selon l'une des revendications 6 à 16, de détection de l'activité enzymatique de la PARP en vue de la quantification de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou activateur de PARP comprenant les étapes suivantes :
- adsorption de la PARP contenue dans un milieu d'adsorption sur des plaques de microtitration en plastique, et lavage de la PARP non adsorbée, - addition à la PARP adsorbée d'un milieu de réaction contenant les éléments nécessaires à la mise en activité de la PARP, et notamment du ADN lésé, du NAD+, et un composé susceptible d'éviter l'oxydation des résidus de cysteine, conduisant à la synthèse de poly(ADP-ribose) et à la liaison de celui-ci sur une protéine nucléaire acceptrice présente dans le milieu, ou adsorbée, notamment la PARP, et un inhibiteur ou un activateur de la PARP et lavage des éléments non liés à la PARP, addition, au milieu contenant de la PARP, d'un anticorps anti-poly(ADP-ribose) contenu dans un milieu de dilution pour former un complexe antigène-anticorps avec le poly(ADP-ribose) lié sur la PARP ou sur n'importe quelle protéine acceptrice et lavage de l'anticorps qui n'a pas formé de complexe,
- addition d'un 2ème anticorps spécifique de l'espèce d'origine de l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) conjugué à une enzyme pour former un complexe antigène- anticorps avec l'anticorps anti-poly(ADP-ribose) et lavage du deuxième anticorps qui n ' a pas formé de complexe ,
- addition du substrat du susdit enzyme et d'un chromogène,
- développement de la réaction colorimétrique puis arrêt de cette réaction par addition d'une solution acide,
- déterrriination de l'activité enzymatique de la PARP en mesurant l'intensité de la réaction par exemple par mesure de la densité optique (DO),
- comparaison des activités enzymatiques de la PARP respectivement obtenues à l'étape précédente et selon la revendication 16.
18. Kit pour la détection de l'activité enzymatique de la PARP, éventuellement en vue de la détection de l'activité inhibitrice ou activatrice d'un inhibiteur ou d'un activateur de la PARP comprenant :
- l'enzyme PARP,
- les milieux ou tampons nécessaires à l' adsorption de la PARP sur un support utilisable dans un procédé ELISA, - les milieux ou tampons permettant la mise en activité de l'enzyme PARP,
- au moins un anticorps anti-poly(ADP-ribose),
- les milieux ou tampons permettant la dilution du susdit anticorps, - les milieux ou tampons permettant la formation de complexe antigène- anticorps entre le poly(ADP-ribose) et l'anticorps anti-poly(ADP-ribose),
- éventuellement un deuxième anticorps susceptible de former un complexe avec l'anticorps anti-poly(ADP-ribose), éventuellement marqué par une enzyme,
- éventuellement le substrat de la susdite enzyme, et un chromogène ainsi que l'acide stoppant la réaction,
- éventuellement les milieux ou tampons permettant la formation d'un complexe antigène-anticorps entre l'anticorps anti-poly (ADP-ribose) et le susdit deuxième anticorps,
- éventuellement au moins un inhibiteur ou un activateur de la PARP susceptible d'être utilisé comme témoin interne.
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