FR2945042A1 - Nouveaux polypeptides pour l'evaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un compose test - Google Patents

Abstract

L'invention concerne de nouveaux polypeptides et à leur utilisation pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, ainsi que des trousses pour la mise en oeuvre de telles méthodes.

Description

La présente invention se rapporte à de nouveaux polypeptides et à leur utilisation pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, à une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, ainsi qu'à des trousses pour la mise en oeuvre de telles méthodes.

Les industries de la parfumerie et de la cosmétique se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. Or l'allergie de contact est l'un des risques majeurs associés à l'utilisation d'un parfum. L'allergie cutanée de contact (ou dermatite atopique) est un problème de santé publique majeur chez l'homme. Elle représente une manifestation immunotoxique environnementale sérieuse, contraignante, dont il est important d'anticiper les effets lorsque l'on met sur le marché des produits susceptibles de la provoquer. La sensibilisation cutanée et, par conséquent la manifestation allergique associée, est le résultat dans un premier temps de l'interaction d'une molécule allergénique avec des cellules spécialisées de l'épiderme, les cellules présentatrices de l'antigène (cellules de Langerhans, cellules dendritiques) puis dans un second temps de leurs présentations par ces cellules à des lymphocytes effecteurs T CD4+ et CD8+. Ce sont ces derniers qui sont à la base de la réaction allergique et inflammatoire. Néanmoins, les allergènes, en particulier ceux qui peuvent être présents dans un parfum, sont des petites molécules qui ne peuvent pas être reconnues directement. Leur reconnaissance nécessite leur association préalable avec des protéines du soi. Ainsi, c'est le complexe hétérodimérique néoformé dans la peau qui sera ultérieurement présenté aux cellules T dans les ganglions proximaux. Par conséquent, la faculté d'une molécule chimique (composé de parfum ou ingrédient cosmétique) à s'associer à une protéine de l'utilisateur de ce parfum est un préalable obligatoire à l'induction de la réaction pathologique consécutive.

Jusqu'à présent, des animaux étaient utilisés pour identifier les molécules sensibilisantes au niveau cutané et le LLNA (local lymph node assay) basé sur la prolifération induite des lymphocytes ganglionnaires après contact avec le sensibilisant a été développé. Ce test a été adopté comme Testing guideline 429 par l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et est considéré encore à ce jour comme le test de référence pour la détermination d'un agent chimique sensibilisant. Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition parfumante nouvelle est susceptible de représenter un danger pour l'homme par ses propriétés sensibilisantes.

De manière surprenante, les Inventeurs ont montré que des séquences de deux enzymes de la famille des lipocalines, présentes dans la peau et présentant des séquences homologues importantes, permettaient de cribler in vitro des composés susceptibles de se comporter comme des allergènes. Ces enzymes sont la neutrophil gelatinase associated lipocalin (NGAL, également appelée lipocaline 2) (SEO et al., Expression of neutrophil gelatinase- associated lipocalin in skin epidermis, J. Invest. Dermatol., 126, 510-412 ; 2006), et la prostaglandine D synthase (L-PGDS) (TAKEDA et al., Lipocalin-type prostaglandin D synthase as a melanocyte marker regulated by MTIF, BBRC, 339, 1098-1106 ; 2006).

NGAL a été identifiée à l'origine comme une protéine de 25kDa associée de manière covalente avec la neutrophil gelatinase de 92kDa (ou gélatinase B, MMP-9). L'analyse crystallographique a montré que les ligands naturels de cette enzyme sont une variété de sidérophores ferriques bactériens agissant ainsi comme un bactériostatique. Dans le rein, cette enzyme joue le même rôle en délivrant le fer dans les cellules du néphron. NGAL est induit par le calcium dans les kératinocytes en culture et sa présence dans la peau humaine et murine a été confirmée, particulièrement au niveau de l'épiderme (dans les kératinocytes exclusivement) et des follicules pileux, par hybridation in situ.

L-PGDS dont le rôle initialement décrit est d'isomériser la prostaglandine H2 en prostaglandine D2, fonctionne également comme une protéine lipophile des espaces extracellulaires dont les ligands connus sont la bilirubine, le rétinaldéhyde et l'acide rétinoïque. Des études récentes ont montré que LPGDS est présente dans les cellules de Langerhans, les mélanocytes, les mastocytes, les histiocytes et les macrophages (mais pas dans les kératinocytes) chez le rat.

Les Inventeurs ont alors identifié des séquences de ces lipocalines ou dérivées de celles-ci, pour la mise au point de méthodes d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant de composés susceptibles de se comporter comme des allergènes. Ainsi, la présente invention se rapporte à polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 et 15 et des dérivés celles-ci, de préférence à un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, et 4, encore plus préférentiellement un polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ ID NO :1 ou la séquence SEQ ID NO :3, et encore préférentiellement un polypeptide isolé comprenant la séquence SEQ ID NO :1. Lesdites séquences sont listées ci-dessous : XIACAX2DELX3EX4 XIEX2LEDX3ACAX4 ECGX 1 DELX2EX3 XlEX2LEDX3GCE LYGRTX 1 ELTSELX2ENFIRFSX3 SLGLPEN LY SRS QNPRAEVX 1 EHFTTFAX2SLGFTEE (SEQ ID NO :1) (SEQ ID NO :2) (SEQ ID NO :3) (SEQ ID NO :4), (SEQ ID NO :5) (SEQ ID NO :6) LYGRTX 1 ELSPELX2ERFTFAX3 SLGLX4 LYSRTQTLX1DELX2EX3FTTFSX4AQGLT RQNQCETX1 RFAACAA RFAAX1AA TLYGRTX1EL XIERFTRFAX2 X1EX2FTTFSX3 LYGRTX1 ELS où Xl, X2, X3 et X4 sont indépendamment choisis parmi la lysine, l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate, de préférence la lysine.

Avantageusement, les séquences SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 et 15 peuvent présenter un groupement acétyl à leur extrémité N-Terminale. De préférence, les séquences SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 11 présentent un groupement acétyl à leur extrémité N-Terminale.

Avantageusement, les séquences SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 et 15 peuvent présenter un groupement amine (NH2) ou amide (CONH2) à leur extrémité C-Terminale. De préférence, les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 1l, présentent un groupement amine ou amide à leur extrémité C-Terminale.

Ledit polypeptide isolé selon la présente invention peut être sous la forme L ou sous la forme D.

De préférence, les polypeptides selon la présente invention ont une longueur inférieure à 100 acides aminés, de manière préférée inférieure à 80, de manière encore préférée inférieure à 50, de manière encore préférée inférieure à 40 et de manière préférée entre toute inférieure à 30 acides aminés. (SEQ ID NO :7) (SEQ ID NO :8) (SEQ ID NO :9) (SEQ ID NO :10) (SEQ ID NO :11) (SEQ ID NO :12) (SEQ ID NO :13) (SEQ ID NO :14) (SEQ ID NO :15) On entend par dérivés , un polypeptide présentant une ou plusieurs mutations de séquence ne modifiant pas l'activité dudit polypeptide, notamment un polypeptide présentant une ou plusieurs mutations dites `conservatives' et les mutations n'affectant pas les valeurs de pKa du thiol du résidu de cystéine et/ou de lysine et/ou ayant un pourcentage d'identité d'au moins 80% avec la séquence complète de la séquence SEQ ID NO :1 à 15, de préférence au moins 90%, et encore préférentiellement d'au moins 95%. On entend par mutation conservative , une mutation choisie parmi la substitution d'un résidu d'acide aminé basique par un autre résidu d'acide aminé basique, d'un résidu d'acide aminé acide par un autre résidu d'acide aminé acide, d'un résidu d'acide aminé neutre par un autre résidu d'acide aminé neutre, d'un résidu d'acide aminé aliphatique par un autre résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique, d'un résidu d'acide aminé aromatique par un autre résidu d'acide aminé aromatique ou aliphatique, d'un résidu d'acide aminé amidé par un autre résidu d'acide aminé amidé, d'un résidu d'acide aminé alcoolique par un autre résidu d'acide aminé alcoolique.

On entend par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés, les pourcentages d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenus avec le meilleur alignement desdites séquences, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant aléatoirement réparties dans les séquences d'acides aminés. On entend par meilleur alignement , l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité est le plus élevé. La comparaison de séquence entre deux séquences d'acides aminés est en général réalisée en comparant ces séquences préalablement alignées selon le meilleur alignement ; cette comparaison est réalisée sur des segments de comparaison afin d'identifier et comparer les similarités de régions. Le meilleur alignement de séquences peut être réalisé, outre manuellement, par l'utilisation de l'algorithme d'homologie global développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), l'algorithme d'homologie local développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode des similarités développée par PEARSON et LIPMAN (Proc. Natl. Acd.

Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des logiciels utilisant de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA dans le "Wisconsin Genetics software Package , Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignements multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Afin d'obtenir le meilleur alignement local, il peut être préférable d'utiliser le logiciel BLAST, avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminée en comparant ces deux séquences alignées de façon optimales, les séquences d'acides aminés pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence afin d'obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, et en divisant ce nombre par le nombre total de positions comparées, et en multipliant ce nombre par cent.

Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide isolé consiste en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14 et 15 et des dérivés de celles-ci, de manière préférée en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3 et SEQ ID NO : 4, et des dérivés de celles-ci, de préférence en une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3, encore plus préférentiellement en la séquence SEQ ID NO :1. Le polypeptide isolé consistant en la séquence SEQ ID NO :1 est particulièrement préféré car sa synthèse et sa purification sont aisées, il présente une excellente solubilité et est facile à manipuler car peu électrostatique, il n'est que très faiblement dimérisé ce qui facilite son utilisation dans les méthodes selon la présente invention, et enfin il permet de détecter les allergènes fixés sur la séquence SEQ ID NO :1 en une seule étape réactionnelle. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une séquence nucléotidique comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus.

La séquence nucléotidique selon la présente invention peut être sous forme d'ARN ou d'ADN, de préférence sous forme d'ADN. Ledit ADN peut être sous forme double brin ou simple brin.

Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un polypeptide isolé comprenant une 10 séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci; b) mesure de la liaison éventuelle dudit composé test avec ledit polypeptide.

La séquence SEQ ID NO :16 représente la séquence polypeptidique de la 15 lipocaline 2 humaine : MPLGLLWLGLALLGALHAQAQDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFQG KWYVVGLAGNAILREDKDPQKMYATIYELKEDKSYNVTSVLFRKKKCD YWIRTFVPGCQPGEFTLGNIKSYPGLTSYLVRVVSTNYNQHAMVFFKKVS QNREYFKITLYGRTKELTSELKENFIRFSKYLGLPENHIV FPVPIDQCIDG 20 (SEQ ID NO :16)

La séquence SEQ ID NO :17 représente la séquence polypeptidique de la lipocaline 2 de souris : MALSVMCLGLALLGVLQSQAQDSTQNLIPAPSLLTVPLQPDFRSDQFRGR 25 WYVVGLAGNAVQKKTEGSFTMYSTIYELQENNSYNVTSILVRDQDQGCR YWIRTFVPSSRAGQFTLGNMHRYPQVQSYNVQVATTDYNQFAMVFFRKT SENKQYFKITLYGRTKELSPELKERFTRFAKSLGLKDDNIIFSVPTDQCIDN (SEQ ID NO :17) 7 La séquence SEQ ID NO :18 représente la séquence polypeptidique de la prostaglandine D synthase humaine : MATHHTLWMGLALLGVLGDLQAAPEAQVSVQPNFQQDKFLGRWFSAGL ASNSSWLREKKAALSMCKSVVAPATDGGLNLTSTFLRKNQCETRTMLLQ PAGSLGSYSYRSPHWGSTYSVSVVETDYDQYALLYSQGSKGPGEDFRMA TLYSRTQTPRAELKEKFTAFCKAQGFTEDTIVFLPQTDKCMTEQ (SEQ ID NO :18)

La séquence SEQ ID NO :19 représente la séquence polypeptidique de la prostaglandine D synthase de souris. MAALRMLWMGLVLLGLLGFPQTPAQGHDTVQPNFQQDKFLGRWYSAG LASNSSWFREKKAVLYMCKTVVAPSTEGGLNLTSTFLRKNQCETKIMVL QPAGAPGHYTYS SPHSGSIHSV SVVEANYDEYALLFSRGTKGPGQDFRMA TLYSRTQTLKDELKEKFTTFSKAQGLTEEDIVFLPQPDKCIQE (SEQ ID NO :19)

Avantageusement, un ou plusieurs des résidus lysine des séquences SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18 et SEQ ID NO :19 peuvent être remplacés par l'ornithine, le diaminobutyrate ou le diaminopropionate. De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 et des dérivés de celles-ci.

25 La mesure de la liaison éventuelle obtenue à l'étape b) peut éventuellement être comparée à un contrôle négatif réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant, comme par exemple le chlorobenzène (Cbz) ou l'acide lactique (LA), ou à un contrôle positif réalisé avec un ligand connu dudit polypeptide. 30 Ainsi, ladite méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel sensibilisant d'un composé test. Plus le20 pourcentage de liaison sera important, plus le potentiel sensibilisant sera important.

Ladite liaison peut par exemple être une liaison covalente, hydrogène, saline, 5 électrostatique, de Van der Waals, une attaque radicalaire... De préférence, ladite liaison est une liaison covalente.

La mesure de la liaison peut être réalisée par toute technique de mesure d'une liaison bien connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer la 10 mesure d'une liaison à l'aide d'un marquage, qui peut être de type antigénique, fluorescent, enzymatique, radioactif, une séparation par chromatographie en phase liquide (HPLC), l'utilisation de la technique de résonance plasmonique de surface, etc...

15 Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur antigénique et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par le biais d'un anticorps détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. Ce marqueur antigénique peut être tout type de marqueur connu de l'homme du 20 métier et peut être notamment choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou d'une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. La séquence polyHis contient de préférence de 4 à 6 résidus Histidine. Préférentiellement, le marqueur antigénique est une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis). 25 Les anticorps utilisés pour détecter ce marqueur antigénique peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils peuvent être produits par des techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'anticorps commerciaux. Parmi ceux-ci, on peut citer l'anticorps penta-His HRP conjugate (QIAGEN), l'anticorps de lapin anti-6x His Abcam 9108, l'anticorps de lapin -6x 30 His marqué à la HRP (peroxidase de raifort) Abcam 1187, l'anticorps de souris - anti- 5x His Qiagen 34698, l'anticorps de souris -anti-poly-His Sigma H-1029.

Les anticorps peuvent être couplés à des marqueurs détectables, connus de l'homme du métier, tels que des enzymes (par exemple la peroxidase de raifort HRP), des marqueurs radioactifs, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Préférentiellement, l'anticorps est couplé à la HRP (HorseRadish Peroxydase). L'immunodétection peut être réalisée par n'importe quelle technique adaptée, par exemple un Western Blot, Dot Blot, etc.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur fluorescent et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par fluorométrie. Le marquage fluorescent peut être direct ou indirect, le fluorophore étant fixé directement sur le polypeptide ou par l'intermédiaire d'un autre marqueur. Le marqueur fluorescent peut être par exemple la fluorescéine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (AlloPhycoCyanin), les cyanines ou l'Europium.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide est lié à un marqueur enzymatique et la mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide est réalisée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique. La mesure de la liaison dudit composé test avec ledit polypeptide peut notamment être effectuée à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-PhosTM), la mesure de l'interaction étant alors effectuée respectivement par spectrophotométrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence.

Le polypeptide peut être fixé sur un support. Le support préférentiellement utilisé pour la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention est une plaque, 30 une bille ou une puce.

Les polypeptides utilisés dans la méthode selon la présente invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par synthèse artificielle et plus particulièrement par synthèse en phase solide.

Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.

Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.

De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique. Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée en HTS (High 25 Throughput Screening) ou en MTS (Medium Throughput Screening).

Au sens de la présente invention, on entend par polypeptide une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes polypeptide , peptide et protéine peuvent être indifféremment utilisés. 30 On entend par potentiel sensibilisant , le risque pour le composé test de provoquer une réaction immunologique lors de sa mise en contact avec un mammifère, de préférence un humain. Ainsi, le potentiel sensibilisant peut être considéré comme le risque de développer une allergie au contact du composé test.

De préférence, ledit composé test est apte à être appliqué sur la peau. Ainsi, le potentiel sensibilisant correspond au risque de développer une allergie cutanée. De préférence, ledit composé test est apte à entrer dans la composition d'une composition dermatologique ou cosmétique.

De préférence, la méthode selon la présente invention permet d'évaluer si le composé test est susceptible de provoquer une allergie de contact ou dermatite atopique.

De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans une solution tampon ayant un pH compris entre 7.3 et 9.3, de manière encore préférée entre 7.8 et 8.8, et de manière particulièrement préférée la solution tampon ayant un pH de 8.3.

De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée à une température comprise entre 20°C et 40°C, de manière encore préférée entre 25°C et 35°C, de manière encore préférée entre 28°C et 32°C, et de manière préférée entre toute à 30°C.

De préférence, la méthode selon la présente invention est réalisée dans l'obscurité.

De préférence, la concentration de polypeptide utilisée pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention est comprise entre 0.2 et 1.5 mM, de manière encore préférée entre 0.4 et 1.2 mM, de manière encore préférée de 1 mM.

De préférence, la concentration du composé test pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention est comprise entre 1 et 10 mM, de manière encore préférée entre 3 et 7 mM, de manière encore préférée entre 4 et 6 mM et de manière préférée entre toute de 5mM. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le composé test peut être mis au contact de plusieurs polypeptides isolés présentant des séquences différentes.

10 Dans mode de réalisation particulier, la méthode d'évaluation selon la présente invention peut être un test de compétition, dans laquelle le composé test entre en compétition avec un composé identifié comme sensibilisant. Ledit composé identifié comme sensibilisant pourra être mis en contact avec ledit polypeptide isolé préalablement à l'étape a), ou simultanément à l'étape a). Un tel mode de 15 réalisation permet de comparer le potentiel sensibilisant d'un composé test à celui d'un composé identifié comme sensibilisant.

Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à une méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, comprenant les 20 étapes de : a) mise en contact d'un composé identifié comme sensibilisant, d'un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci, et d'un composé candidat pour diminuer la sensibilisation; 25 b) mesure de la liaison éventuelle du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide.

Ladite méthode pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation peut être réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment 30 pour la méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.5 On entend par composé apte à diminuer la sensibilisation , un composé capable de réduire le potentiel sensibilisant d'un composé identifié comme sensibilisant. En d'autres termes, on entend par composé apte à diminuer la sensibilisation , un composé diminuant le risque de provoquer une réaction immunologique en présence d'un composé identifié comme sensibilisant.

On entend notamment par composé identifié comme sensibilisant , un composé susceptible d'être identifié par la méthode de la présente invention, soit, en d'autres termes, un composé identifié comme présentant un potentiel allergène.

Le composé susceptible d'être identifié à l'aide de la méthode selon l'invention peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.

De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone (DPCP), le lauryl gallate (LG), la 3-3-dimethylaminopropylamine (3-DMAPA), l'aldéhyde cinnamique (CA), le citral (Cal), la 1,4-hydroquinone (HQ), le glutaraldéhyde (GA), la 1,2-benzisothiazolin-3-one (Ben), la phénylacetaldéhyde (PA) et le lilial (Li), préferentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4-hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée est la diphénylcyclopropénone. La diphénylcyclopropénone est un sensibilisant extrêmement fort ; le lauryl gallate, la 1,4-hydroquinone et le glutaraldéhyde sont des sensibilisants forts ; la 3-3-dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1,2- benzisothiazolin-3-one et la phénylacetaldéhyde sont des sensibilisants modérés, et le lilial est un sensibilisant faible.

Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé candidat pour diminuer la sensibilisation peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.

Le composé test peut être d'origine naturelle ou synthétique.

La capacité d'un composé candidat à diminuer ou à inhiber la liaison, peut être évaluée en comparant la capacité de liaison d'un polypeptide comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci, avec un composé identifié comme sensibilisant en présence dudit composé candidat, à la capacité de liaison dudit polypeptide avec ledit composé identifié comme sensibilisant en l'absence dudit composé candidat. Ainsi, si une diminution ou une inhibition de la capacité de liaison est observée en présence dudit composé candidat, on pourra en conclure que ledit composé candidat est un composé diminuant la sensibilisation.

De préférence, ledit composé candidat est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique.

L'étape a) peut être réalisée : i) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et du polypeptide isolé tel que défini précédemment, suivi optionnellement d'une première mesure de la liaison du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide isolé, puis mise en contact avec le composé candidat pour diminuer la sensibilisation avec le composé identifié comme sensibilisant lié au polypeptide isolé ; ii) par mise en contact préalable du composé identifié comme sensibilisant et du composé candidat pour diminuer la sensibilisation puis mise en contact polypeptide isolé tel que défini précédemment avec le composé identifié comme sensibilisant et le composé candidat pour diminuer la sensibilisation ; ou iii) par mise en contact simultanée du composé identifié comme sensibilisant, du composé candidat pour diminuer la sensibilisation et du polypeptide isolé tel que défini précédemment.

De préférence, le polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 et des dérivés de celles-ci.

La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test selon la présente invention, comprenant au moins un polypeptide isolé comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci. De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.

Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet une trousse pour la mise en oeuvre d'une méthode de la sélection de composés aptes à diminuer la sensibilisation selon la présente invention, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1l, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci, et au moins un composé identifié comme sensibilisant.30 De préférence, le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 3-3-dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1,4-hydroquinone, le glutaraldéhyde, la 1,2-Benzisothiazolin-3-one, la phénylacetaldéhyde et le lilial, préferentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4-hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée est la diphénylcyclopropénone.

De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15, et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.

Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.

De préférence, ledit polypeptide isolé comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15, et des dérivés de celles-ci, préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et encore plus préférentiellement parmi les séquences SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.

Exemples Exemple 1 Un test avec 0.5mM de polypeptide et 5 mM de composé test a été réalisé dans les conditions suivantes : Le mélange réactionnel contenant 40 L de solution peptidique (solution mère à 1.25mM dans un tampon acétate d'ammonium à l00mI à pH 10,2 et le polypeptide de séquence SEQ ID NO :11, SEQ ID NO : 7, ou SEQ ID NO : 8), 35 L de solution tampon acétate d'ammonium à loomM, à pH 10,2, 20 L d'acétonitrile et 5 L de solution à tester (solution mère à 100mI dans de l'acétonitrile ou un mélange 50% acétonitrile 50% DMSO) a été préparé puis mis sous agitation. Le mélange réactionnel a ensuite été mis à incuber à 30°C pendant 4h et dans l'obscurité. Une analyse par HPLC a ensuite été réalisée à un gradient de 10% à 45% de tampon B (acétonitrile + 0.08% de acide trifluoroacetique (TFA)) en 20 min (tampon A : eau + 0.1% de TFA), débit 1 ml/min. La détection a été réalisée sous UV à 230 nm. Le contrôle sans allergène est constitué de 40 L de solution tampon. Les réactifs de synthèse (Fmoc-acides aminés, résine de synthèse) ont été obtenus chez IRIS BIOTECH (Allemagne), les solvants organiques ont été obtenus chez SDS/CARLO ERBA (France) et l'acétonitrile a été obtenu chez FISHER BIOBLOCK (France).

Tableau 1 % de fixation SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO:11 NO:7 NO:8 LG (lauryl gallate) 62% 100% 63% CA (aldéhyde cinnamique) 17% 100% 30% Cbz (contrôle négatif) 0% 0% 0% On observe un pourcentage élevé de fixation du lauryl gallate qui possède un pouvoir sensibilisant fort pour les 3 séquences étudiées, un pourcentage élevé de fixation de l'aldéhyde cinnamique, qui possède un pouvoir sensibilisant modéré, pour la séquence SEQ ID NO : 7 et modéré pour les séquences SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 11.

Exemple 2 Un test avec 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 10 et 5 mM de composé test a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.

Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100mI à pH8.3.

Tableau 2 % de fixation SEQ ID NO : 10 DPCP 96% LG 100% 3-DMAPA 25% CA n/a Cal 70% Cbz (contrôle 0% négatif) Exemple 3 Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 8 et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.

Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100mM à pH8.3, pH 9.2 et pH8.8.20 Tableau 3 pH 8.3 pH 9.2 pH 8.8 SEQ ID SEQ ID ID Q NO SEQ ID SEQ ID ID Q NO:10 NO:8 :10 NO:8 NO:10 NO:8 HQ 100% 100% n/a Fixation n/a 100% GA 22% 50% 33% 50% Fixation 100% Ben Fixation 100% n/a 0% Fixation 100% PA 100% Fixation 86% 21% n/a 0% Li 36% 0% 0% n/a n/a n/a LA 0% 0% 0% 0% 0% 0% (contrôle négatif) Le terme fixation indique qu'une fixation existe, mais que celle-ci n'est pas quantifiable. nia : fixation non déterminable à un temps de rétention identique. On observe que de meilleurs résultats sont obtenus à un pH de 8.3. 10 Exemple 4 Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 8 et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1. Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100ml. 15 20 Tableau 4 % de fixation (moyenne) SEQ ID NO : 10 SEQ ID NO : 8 HQ 90% 100% GA 33% 50% Ben 90% n/a PA 81% Fixation Li 18% 0% LA (contrôle négatif) 0% 0% DPCP 100% n/a LG 100% 62% DMAPA 15% 6% CA n/a 30% Cal 46% 70% Cbz (contrôle négatif) 0% 0% Exemple 5 Un test avec deux fois 0.5mM de polypeptide de séquence SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 8 et 5 mM de composé test, a été réalisé selon le même protocole que celui décrit pour l'exemple 1.

Le tampon utilisé était le TRIS-HC1 à 100ml. 20 Tableau 5 % de fixation SEQ ID NO : 10 SEQ ID NO : 8 SEQ ID NO : 1 HQ 90% 100% 82.5% GA 33% 50% 83% Ben 90% n/a n/a PA 81% Fixation 54% Li 18% 0% 12% LA (contrôle 0% 0% 1% négatif) DPCP 100% n/a 83.5% LG 100% 62% 41.5% DMAPA 15% 6% 3% CA n/a 30% n/a Cal 46% 70% 64% Cbz (contrôle 0% 0% 7.5% négatif) A noter dans le cas des tests de SEQ ID NO : 1, le signal a été perturbé, empêchant des mesures supérieures à 82-83% de fixation. Ces valeurs 5 représentent par conséquent un minima. Lors d'une série de mesure réalisée avec la séquence SEQ ID NO : 1, le lauryl gallate et le phénylacetaldéhyde ont très fortement précipités, expliquant ainsi les résultats moyens obtenus. Une coélution du polypeptide avec les allergènes Cinnamic aldehyde et 1,2-10 Benzisothiazolin-3-one a été observée.

Les résultats montrent que le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1 permet d'obtenir des résultats similaires à l'emploi des 2 polypeptides de séquence SEQ ID NO : 10 et SEQ ID NO : 8, tout en présentant les avantages suivants : 15 - peptide court, 11 résidus, synthèse et purification sans difficultés - faible dimérisation - excellente solubilité, aisé à manipuler (peu électrostatique) - test et conditions uniques

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de: a) mise en contact d'un composé test avec un polypeptide isolé comprenant une séquence dérivée de lipocaline choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci ; b) mesure de la liaison éventuelle dudit composé test avec ledit polypeptide.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit composé test est apte à être appliqué sur la peau.
3. 3. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle ledit composé test est apte à entrer dans la composition d'une composition dermatologique ou cosmétique.
4. 4. Méthode in vitro pour la sélection d'un composé apte à diminuer la sensibilisation, comprenant les étapes de : a) mise en contact d'un composé identifié comme sensibilisant, d'un polypeptide isolé comprenant une séquence dérivée de lipocaline choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19, et des dérivés de celles-ci, et d'un composé candidat pour diminuer la sensibilisation; b) mesure de la liaison éventuelle du composé identifié comme sensibilisant avec ledit polypeptide.
5. 5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle le composé identifié comme sensibilisant est choisi parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 3-3-Dimethylaminopropylamine, l'aldéhyde cinnamique, le citral, la 1,4-hydroquinone, le glutaraldéhyde, la 1,2-Benzisothiazolin-3-one, la phénylacetaldéhyde et le lilial.
6. 6. Polypeptide isolé comprenant une séquence dérivée de lipocaline choisie parmi la séquence SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15, et des dérivés de celles-ci.
7. 7. Polypeptide isolé selon la revendication 6, dans lequel ladite séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 présente un groupement acétyl à son extrémité N-Terminale.
8. 8. Polypeptide isolé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel ladite séquence SEQ ID NO :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 présente un groupement amine ou amide à son extrémité C-Terminale.
9. 9. Acide nucléique comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.
10. 10. Utilisation d'un polypeptide isolé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test.
11. 11. Trousse pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant d'un composé test selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide isolé comprenant une séquence d'une lipocaline ou dérivée de celle-ci, choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci.
12. 12. Trousse pour la mise en oeuvre d'une méthode de la sélection de composés aptes à diminuer la sensibilisation selon la revendication 4 ou 5, ladite trousse comprenant au moins un polypeptide comprenant une séquence d'une lipocaline ou dérivée de celle-ci, choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 et 19 et des dérivés de celles-ci, et au moins un composé identifié comme sensibilisant.