CA2333919A1 - Proteines de tube polaire de microsporidie, acides nucleiques codant pour ces proteines et leurs applications - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet des proteines complètes purifiées de tube polaire d e microsporidie et plus particulièrement les protéines dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5. L'invention a également pour objet les gènes codant ses protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.

Description

WO 00!01724 PCTIF1t99101630 PROTEINES DE TUBE POLA=CRE DE MTCROSPORIDIE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES PROTEINES ET LEURS
APPLICATIONS.
L'invention a pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire (PTPs) de microsporidie ainsi que les gènes codant ces protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.
E. cuniculi est une m_Lcrosporidie, parasite intracellulaire obligatoire, fréquente chez de nombreux mammifères et impliquée dans divE:rses infections che z l'homme principalement chez les sujeta immunodéprimés. Deux autres espèces du genre Encephal.itozoon (E. ~.ntestinalis et E. h ellem) sont aussi impliquées dans différentes infections opportunistes. De manière générale, les microsporidies sont responsables chez les patients sidéens de pathologies digestives, mais aussi d'atteintes oculaires, musculaires, hépatiques, de rhinosinusites et d'infections s~stémiques (1). Des tests sérologiques ont également montré la présence importante des microsporidies chez les patients immunocompétents , puisque atteignant 8~
de la population (2). 4 genres de: microsporidie sont responsables de maladies humaines . Enterocytozoon, Encephalitozoon, Vittaforma et TrachipZeistophôra.
L'émergence de ces parasites en pathologie humaine suscite de 1a part des chercheurs un intérêt grandissant dans les domaines systématique, épidémiologique, clinique, du diagnostic et de la thérapeutique.
Actuellement, le diagnostic repose su.r des tests PCR à partir d'oligonucléotides déterminés d'après les séquences d'ADN ribosomal, seules séquences connues chez la plupart des microsporidies. La thérapeutique, quant à elle, est limitée à l'utilisation de certaines molécules telles que l'albendazole ou la fumagilline.

2 - Ces eucaryotes unicellulaires présentent un mécanisme d'invasion unique. La spore, stade infectieux, renferme en effet un appareil d'extrusion constitué d'un tube polaire inséré à son extrémité antérieure dans un disque d'ancrage. Sous l'effet de certains stimuli, pouvant être liés in vitro à une variation du pH, à l'osmolarité, à
la présence de cations ou d'anions, le tube polaire est extrudé de la spore microsporidienne et traverse la membrane plasmique d'une cellule-hôte. Le sporoplasme, expulsé à travers ce tube, est ainsi inoculé dans la cellule réceptrice. Cet appareil invasif, spécifique des microsporidies et unique dans le monde vivant, suscite donc un intérêt à la fois d'un point dE~ vue fondamental mais aussi appliqué pour le diagnostic et la thérapeutique.
A ce jour, aucune séquence complète de protéines constituant ce tube polaire n'a été obtenue.
Selon Weidner (3) le tube polaire serait constitué d'une seule protéine de 23 kDa chez Am~eson rn.ichaelis. Plus récemment, chez une microsporidie parasite de poisson, Glugea americanus, une extraction différentielle des protéines en présence d'un agent réducteur (DTT) a permis de mettre en évidence qu'une protéine de 43 kDa est constitutive du tube polaire, mais seule une partie de la séquence N-terminale de 16 acides aminés a été déterminée (4) .
La production d'anticorps palyclonaux et monoclonaux a également été réalisée contre le tube polaire de différentes espèces (5, 6, 7), montrant une passible hétérogénéité protéique de cette structure.
Les travaux de recherche, ayant conduit à. la présente invention, ont tout d'abord consisté à produire des anticorps polyclonaux et monoclonaux contre le tube polaire d'E. cuniculi. I1 a ainsi obtenu 2 anticorps polycïonaux (anti-55 kDa et anti-35 kDa) et un anticorps WO 00/01?24 PCT/FR99/01630

3 monoclonal (anti-55 kDa) réagissant spécifiquement avec le tube polaire en immunofluorescenc:e et en microscopie électronique (6). Après séparation des protéines sparales par électrophorèse en 2 dimensions et transfert sur membrane PVDF une protéine ayant une masse moléculaire apparente proche de 55 kDa et un point isoélectrique de 5 était reconnue par ces trois types d'anticorps. Sur ces gels de 2 dimensions, une autrs=_ protéine de masse moléculaire apparente proche de 35 kDa et avec un point isoélectrique de 9 était également reconnue par 2 anticorps anti-tube polaire, l'anticorps polyclonal anti-35 kDa et l'anticorps monoclonal.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis, pour la première fois, d'obtenir des protéines complètes de tube polaire de microsporidie. Les travaux présenté:> par les Inventeurs à
l'occasion d'un congrès (Fifth International Workshops on Opportunitic Protists and Fifth Gs~neral Meeting af the European Concertecl Action on Pneurno~~yst.zs Research, Lille 3-7 septembre 1997) sur l'obtention d'une protéine de tube polaire de 55 kDa sont insuffisants pour effectivement permettre l'obtention de cette protéine complète et purifiée et pour identifier, cloner et séquencer le gène correspondant. En effet, aucune donnée de séquence nucléique ou protéique n'apparaît dans le document relatant ce congrès (8). Le protocole expérimental qui y figure comprend des étapes classiques et bien connues de l'homme du métier (9), telles que l'extraction des protéines sporales, les électrophorèses (SDS-PAGE), la production d'anticorps polyclonaux et: monoclonaux, ie microséquençage de peptides ainsi que la déterminatic>n d'amorces dégénérées et leur amplification par PCR. Comp te-tenu du caractère synthétique du document relatant ce congrèsP son enseignement est insuffisant pour permettre à l'homme du

4 métier de reproduire les travaux des Inventeurs et de mettre en évidence la Séquence complète d'une protéine complète de tube polaire de microsporidie.
L'invention a donc pour' objet des protéines complètes purifiées de tube polaire de microsporidie et plus particulièrement de 3 espèces microsporidiennes du genre Encephali.tozoon . E. cuniculi, E. intestinalis et E.
hellem.
Plus particulièrement l'invention concerne .
- une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 55 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 5, de E. cunicu2i et E. intestinalis, - une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 35 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 9, de E. cuniculi, E. intestinalis et E. hellem.
Dans un second temps, le:~ travaux réalisés sur les deux protéines purifiées d'E. cuniculi {55 et 35 kDa) ont consisté à les soumettre à un mi.croséquençage interne après digestion par l'Endolysine C. Deux peptides ont ainsi été séquencés (P1 . ATALCSNAYGI~TPGQQGMAQ et P2 .
SATQYAMEACATPTP) pour la protéine de 55 kDa et un peptide {P3 . AVQGTDRCILAGIïD) pour la protéine de 35 kDa, et ont permis à partir d'amorces dégénérées d'amplifier une partie des gènes correspondants.
En l'absence de banque génomique, les Inventeurs ont réussi à déterminer les séquences des gènes et leurs régions flanquantes par une technique de SSP-PCR
(10). Ces différentes étapes ont permis de définir la structure complète des gènes, leurs particularités ainsi que les similitudes éventuelles avec d'autres gènes. Les structures primaires des protéines de 55 et 35 kDa ont également été déterminées.
L'invention concerne donc les protéines de tube polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés WO 00/01724 PCT/F1~99/01630 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 1 , SEQ ID No : 2 , SEQ ID No : 3 , SEQ
ID No :4 et SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé
fonctionnellement équivalent de celles-ci.

5 On entend par dérivé fonctionnellement équivalent, les protéines dont la :séquence comprend une modification et/ou une suppression et:/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminéa, dès lors que cette modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie pas la fonction de ces protéines. De tels dérivés peuvent être analysés par L'homme du métier selon les techniques .
- de criblage de banques d'expression à L'aide d'anticorps dirigés contre les protéïnes du tube polaire, ou - de criblage de banques génomiques à l'aide de sondes nucléiques capable de s'hybri.der à un gène codant pour une protéine du tube polaire.
La protéine de 395 acides aminés, ci-après désignée PTP55, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :1 correspond à la protéine de 55 kDa d'E cuniculi. Elle présente une masse moléculaire déduite de 39 609 Da et de 37 230 Da sans le peptide signal, qui est inférieure à celle de 55 OOO observée sur gels de polyacrylamide. Cette protéine est synthétisée. par E. cuniculi sous la forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminé: est éliminée lors du ciblage vers des vésicules impliquées dans la formâyion du tube polaire. La séquence d'une protéine mature du tube polaire de l'invention correspond donc à la séquence comprisé entre les acides aminés en :position 23 et 395 de SEQ ID Na :1. Plusieurs caractéristiques de peptide signal sont en effet observées .
- structure secondaire prédite comme formant une hélice tx,

6 - - présence d'acides aminés hydrophobes ainsi que de résidus basiques proches de la partie N-terminale, - absence d'un résidu lysine en position 22, et - prédiction de peptide :signal par l'algorithme de von Heijne (11).
De plus, le séquençage N-terminal de la.
protéine a montré une séquence ident~_que à celle du peptide P1, confirmant que le peptide de 22 acides aminés était clivé lors de la maturation.
On observe en outre que la PTP55 ne contient pas de résidus tryptophane, phénylalanine, ni arginine.
Elle présente un point isoélectrique déduit de 4,7 en accord avec celui observé sur gels <ie polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre c~e 5. L'étude d.e ces séquences de 395 acides aminés et de 373 acides aminés dans la protéine mature, montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'autres protéines déjà
décrites dans les banques de données.
Une protéine homologue des PTP55 a été également identifiée chez l'espèce E. intestinalis. Cette protéine de 371 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :3. La séquence présente notamment de fortes homologies avec les régions N- et C- terminales de la PTP55 d'E. cun.iculi.
La protéine de 277 acides aminés, désignée ci-après PTP35, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :2 correspond à la pratéine de 35 kDa d'E. cuniculi. Elle présente une masse moléculaire déduite de 30 075 Da' inférieure donc à celle de 35 000 observée sur gels de polyacrylamide. L'extrémité
N-terminale de la PTP35 préseante également des caractéristiques de peptide signal .
- structure secondaire prédite comme farmant une hélice oc,

7 - présence d'acides aminÉa hydrophobes ainsi que de résidus basiques, - prédiction de peptide signal par l'algorithme de von Heijne (11).
~ De la même maniére que pour 1a PTP55, la PTP35 d'E. cun,iculi présenterait un peptide signal. Des sites potentiels de clivage protéolytiques ;peuvent être prédits entre les résidus 12 et 13, 13 et 14 ou 22 et 23. Cependant un tel clivage ne pourrait être confirmé que par le séquençage de la partie N-terminale de~ la protéine. Sur la base des données disponibles, 1a séquence d'une protéine de tube polaire selon l'invention est comprise entre les acides aminés 1 et 277 de la séquence donnée en annexe sous le numéro SEQ ID No :2.
La PTP35 ne contient pas de résidus tryptophane. Elle présente un point isoélectrique déduit de

8,6 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre de 9. L'étude de cette séquence de 277 acides aminés montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'<~.utres protéines dêjà
décrites dans les banques de données.
Les inventeurs ont éga:Lement obtenus des protéines homologues de PTP35 chez les, 2 autres espèces du genre Encephalitozoon, E. intestina.I~is et E. hellem. Les séquences correspondantes sont en annexe sous les numéros SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5. Les PTP35 d'E. intestina..~is et d'E. hellem sont respectivement constituées de 275 et 272 acides aminés et présentent environ 80~ d'identité.
La séquence d'une protéine PT35 du tube polaire de l'invention correspond plus pari~iculièrement à une séquence constituée par ou comprenant .
- la séquence comprises eni:re les acides aminés en position 1 et 275 de la séquence représentëe dans la liste de séquences en annexe sous le niunéro SEQ TD No:4..

WO OO/O1i24 PCTIFR99/O1b30 - - la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 272 de la séquence' représentée dans la liste de séquences en annexe sous le :numéro SEQ ID No:5.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine de l'invention ou un fragment de celles-ci peuvent être préparés par les méthodes décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection des protéines, extraites à partir des spores d'E. cunicu.Ii ou produites par transformation d'un hôte, à des animaux, puis récupération des antisérums et des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l aide des protéines de l'invention. Ces anticorps sont utiles pour rechercher d'autres protéines de tubes polaires d'E.
cuniculi, d'E. hellem ou d'E. intest~inalis et pour étudier la parenté entre les protéines de tubes polaires de différentes espèces, voire de différents genres. En effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E.
intestina3is ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions immunologiques cxoisées avec les protéines du tube polaire d'E.cuniculi. Mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine diagnostique.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes .
a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'invention sur un support d'analyse tel qu'une feuille de nitrocellulose ou une plaque ELISA, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, par exemple en présence de lait écrémé 5~,

9 c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum du sujet à tester, de manière à
ce que, si le sérum contient des anticorps dirigés contre une protéine de tube polaire de microsporidie, ceux-ci se complexent à ladite protéine, d) on élimine par lavage .Les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c,), e) on incube le produit de l'ëtape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, comme par exemple un enzyme tel que ia péroxydase ou à un fluorochrome, f) on élimine par lavage les anticorps anti-humains qui ne sont pas liés spécifiquement et, g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum /
protéine formés à l'étape (e).
Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est constitué par .
- un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinant:es de tube polaire de microsporidie, - une solution contenant des anticorps anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, et - une notice comportant les étapes du procédé
de diagnostic décrit plus haut.
L'invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire de microsporidie. Plus particulièrement, l'inventian se rapporte aux séquences nucléotidiques codant pour les protéines de PTP55 et PTP35 correspondant respectivement aux protéine de 55 et 35 kDa de=.s microsporidies E.
cuniculi, E. intestinalis et E. hellem.

L'invention envisage à titre spécifique, une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée 'par une séquence nucléique codant pour une ~>rotéine de tube ,polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés est 5 représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID
No :4 ou SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé
fonctionnellement équivalent de cette protéine.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence

10 codant pour la protéine PTP55 d'E, cuniculi est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID
No :1 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acide nucléique comprend la séquence comprise entre les nucléotides 411 et 1532 de SEQ ID No :1 ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique de SEQ
ID No :1 est composée de 1830 nucléotides et comprend un cadre de lecture ouvert de 1188 paires de bases allant de la position 345 tcodon d'initiation ATG) à la position 1532 (codon stop TAG). La région précédant la position 345 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PTP55 telle qu'une région promotrice.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour une protéine homologue de PTP55 identifiée chez l'espèce E. intestinalis est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ TD No :3.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine PTP35 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le nums;ro SEQ ID No :2 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acides nucléiques comprend la séquence comprise entre les nucléotides 458 et 1291 de SEQ ID No :2 ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique II de l'invention est composée de 1740 nucléotides et comprend un WO 00/01724 PCT/FR99/O1b30

11 cadre de lecture ouvert de 834 paire~~ de bases allant de la position 458 (codon d'initiation ATG) à la position 1291 (codon stop TAA). La région précédant la position 458 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PTP35 telle qu'une région promotrice.
Deux molécules d'ADN comprenant chacune une séquence codant pour une protéine homologue de PTP35 chez deux autres espèces du genre Encephalitozoon, E.
intestinales et E. hellem sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No :4 et SEQ
ID No :5.
L'invention concerne donc tout particulièrement les molécules d'acide nucléique dont les séquences nucléotidiques sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ
ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5 ainsi que toutes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider avec celles-ci. En effet, l'invention concerne bien entendu aussi les séquences nucléotidiques dérivées de SED ID
No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID
No :5 par exemple du fait de la dégénérescence du code génétique, et qui code pour des protéines prësentant des caractéristïques de tube polaire de m.icrosporidie.
L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins urne molécule d'acide nucl.éigue précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine de tube polaire de microsporidie de l'invention ou d'un fragment de celle-ci. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des protéines de l'invention peuvent être réalisées épar les techniques de

12 biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste .
- à transférer une molécule d' acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte' cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie, - à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste .
- à transférer une molécule d' acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression desdites protéines.
L'hôte cellulaire mis en aeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi. les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammif~~res, de plantes ou d'insectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré ; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide.
L'invention concerne donc aussi les hôtes cellulaires et plus particulièrement les bac~:éries transformées comme E. coZi, exprimant. des protéines de tube polaire de microsporidie obtenues conformément aux procédés précédents.

13 L'invention concerne également les sondes nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des molécules d'acide nucléique de l'invention.
Ces sondes, avantageux>ement marquées, sont utiles pour la détection par hybridation de séquences similaires chez d'autres microsporidies. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique. Différentes techniques d'hybridation peuvent être mises en oeuvre telles que l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur répliques (technique de Southern) ou autres techniques (DNA
chips). De telles sondes constituent: des outils permettant de détecter rapidement des séquences similaires dans les gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie ce qui permettrait d'étudier l'origine et la conservation de ces protéines constituant le tube polaire.
Les oligonucléotides sont utiles pour des expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes dans d'autres microsporidies ou dans un but de diagnostic.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par des microsporidies, comprenant les étape: suivantes .
a) on extrait de l'ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques provenant des urines, des selles, ou d'une biopsie, b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen approprié teï qu'une PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques déduits des séquences de:~ gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, c} on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide d'une sonde nucléotidique marquée spécifique d'une microsporidie. '

14 Il est possible de réaliser l'étape (cj par fixation des produits d'amplific:ation sur un support d'analyse, tel qu'une membrane ou une plaque ELISA.
~ Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est constitué par - les moyens nécessaires à l'amplification des séquences codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, tels que des oligonucléotides spécifiques de ces séquences, et tous les autres éléments nécessaires à la réalisation d'une PCR, - un support d'analyse ~aour fixer les produits de l'amplification, et - des sondes marquées spécifiques d'une microsporidie.
L'invention se rapporte également à des compositions vaccinales capables de prévenir les infections provoquées par les mïc~osporidies du genre Encephal.~tozoon comprenant à titre de principe, actif une protéine de l'invention ou un fragment de celle-ci en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E. intestinalis ou d'E.. he~llem donnant lieu à des réactions immunologiques croisées avec des protéines de tube polaîre d'E. cuniculi, l'invention fournït avantageusement un vaccin potentiel contre les infections provoquées par les mïcrosporidies du genre Encephalitozoon.
D'autres caractéristig;ues et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la production d'anticorps contre le tube polaire, le clonage et le séquençage des gènes codant pour des protéines de tube polaire chez E. cuniculi, et qui se rapportent aux dessins en annexe dans lesquels .

15 PCT/FR99/01630 - la figure 1 montre .
~ A . la séparation électrophorétique des protéines sporales par SDS-PAGE avec sur la piste l la fraction soluble dans SDS 2%, 2-mercaptoéthanol 10%, et sur la piste 2 la fraction résiduelle obtenue après incubation dans du 2-mercaptoéthanol 50~ pendant 48 heures.
~ B . l'analyse pair immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre la bande de 55 kDa séparée par SD~S-PAGE {dilution 1/50e) sur des cellules MRC-5 infestées par Encephalitozoon cuniculi. Les spores avec, leurs tubes polaires extrudés sont fortement marquées.
~ C . l'immunoblot avec l'anticorps polyclonal anti-55 kDa (dilution 1/5000e, piste 1) et l'anticorps monoclonal Ec 102 (dilution 1/1~DOOOe, piste 2). Les marqueurs de poids moléculaires {M) sont indiqués sur la gauche et sont donnés en kDa. Les b:lots ont été révélés en utilisant un kit ECL (Amersham).
- la figure 2 montre l'immunoréactivité de la protéine de 55 kDa. L'électrophorèse sur gel deux dimensions a été réalisée en utilisant l'isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels de 12~ dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVI)F et incubées avec les anticorps polyclonaux dirigés contre le spot acide de 55 kDa {dilution 1/5000e) isolé par élec:trophorèse 2D (~).
Les poids moléculaires sont indiqués en kDa et les points isoélectriques numérotés de 4 à 8.
On observe en (C) le m<~rquage spécifique des tubes polaires extrudés en immunofluorescence avec ce même anticorps.

16 - la figure 3 illustre l'expression de la PTP55 chez Escherichia coli. On distingue en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP55. La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à 1'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni~NTA.
On distingue en B un i.mmunoblotting avec les sérums dirigés contre 1a PTP55 recombinante (dilution 1/1000e). Sur la piste 1, les protéines d'E. coli 4 heures après induction IPTG ; sur la piste 2 les protéines d'Encephalitozoon cuniculi.
On distingue en C un marquage en immunofluorescence indirecte, avec les antisérums dirigés contre la PTP55 recombinante de;s tubes polaires d'E.
cun3culi. Les tubes polaires extrude''=_s sont indiqués par des flèches.
On distingue en D un immunomarquage à l'or colloïdal en microscopie électronique à transmission des sections de tube polaire.
- la figure 4 montre un immunomarquage réalisé
sur des gels d'électrophorèse ~en 2 dimensions avec l'anticorps monoclonal dirigé contre' le tube polaïre.
L' electrophorèse sur ge:l de deux dimensions a été réalisée en utilisant 1'isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels des 12~ dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec l'anticorps monoclonal (dilution 1/5000e) (B). Les spots de 55 et 35 kDa sont indiqués par des flèches.
- la figure 5 illustre l'expression de 1a PTP35 chez Escherichia coli. La figure 5 montre .

17 ~ en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE} des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP35.
La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni-NTA.
Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués en kDa.
en B, un immunoblot:ting avec les sérums dirigés contre la PTP35 recombinante (dilution 1/1000e}.
Sur la piste 1 on distingue le profil électrophorétique d'Encephalitozoon cunicu.Zi coloré au bleu de Coomassie.
Sur la piste 2 est illustré le marquage d'une protéine de 35 kDa d'E. cuniculi avec l'anticorps dirigé
contre la protéine recombinante de 35 kDa exprimée chez Escherichia coli.
en C, le marquage en immunofluorescence indirecte, avec les antisérums dirigés contre la PTP35 recombinante; des tubes polaires d'E. cunzculi. La flêche indique un tube polaire extrudé.
1) Production d'anticorps contre le tube polaire d'E. cuniculi, analyses immunocytochimictues.
La souche d'E. cuniculi utilisée est un isolat de souris. Elle est entretenue sur culture cellulaire MDCK.
Les spores libérées dans le surnageant de culture sont récupérées et stockées à 4°C dans du PBS. L'extraction des protéines sporales est réalisée par broyage des spores avec des billes de zirconium (0,1 mm de diamètre) dans un tampon contenant 2.5~ de SDS et 10ô de 2-mercaptoéthanol en présence d'inhibiteurs de protéases. Après dénaturation par la chaleur 10 minutes à 100°C, les débris sporaux sont éliminés par centrifugation à 18000 g pendant 5 minutes.

WO OOI01724 PCT/F'R99/01630

18 Les protéines sont ensuite séparées par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide 12%.
Pour l'électrophorèse en 2 dimensions, les échantillons protéiques sont solubilisés dans un tampon à
base d'urée 9 M, de 2-mercaptoéthanol 5% et de CHAPS 40 mM.
L'isoélectrofocalisation est réali:~ée dans les conditions suivantes . 4 heures à 400 V, 30 minutes à 600 V puis 30 minutes à 800 V avec la combinaison d'ampholines (Pharmacia) 40% pH 3-10, 60% pH 4-f.,5. Après équilibration des gels de première dimension dans du SDS / 2-mercaptoéthan:ol pendant 10 minutes, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire par SDS-PACiE. Les gels correspondants sont colorés soit à l'argent soit au bleu de Coomassie, ou transférés sur membrane PVDF
(Immobilon P, Polylabo) en utilisant: un système semi-sec.
Les anticorps polyclonaux ont été produits contre différentes protéines d~E. cuni.cu3i séparées par électrophorèse. Des injections i:ntrapéritonéales sont réalisées chez des souris BALB/c pour chaque échantillon protéique. La bande protéique de 55 kDa a également été
utilisée pour produire des anticorps monoclonaux. Ainsi, 3 anticorps dirigés contre Ie tube polaire ont été obtenus .
2 anticorps polyclonaux anti-35 kDa et anti-55 kDa et un anticorps monoclonal anti-55 kDa.
L'immunoblotting, l'ïmmunolocalisation en IFA
et en microscopie électronique à transmission sont réalisés selon les techniques classiques.
2) Microséquença e c~e PTPs de masses moléculaires apparentes 55 kDa et 35 kDa.
La séquence N-terminale ainsi que 2 peptides internes (P1 et P2) ont été séquencés pour la PTP55 d'E.
cuniculi.
N-terminal . ATALCSNAYG
P1 . ATALCSNAYGLTPGQQGMAS)

19 Un peptide interne (P3) a été séquencé pour la PTP35.
P3 . AVQGTDRCILAGIID
Ces séquences ont été réalisées à partir des protéines de 55 kDa et de 35 kDa isolées par électrophorèse en 2 dimensions, par le laboratoire de microséquençage des protéines, Institut Pasteur, Département des biotechnologies.
Pour le séquençage interne des peptides P1, P2 et P3, les protéines ont été préalablement digérées par l'Endolysine C, enzyme protéolytique coupant après un résidu lysine.
3) Amplification PCR, clonage et séguença e des gènes codant pour les PTPs.
a) Gènes codant our les PTP55 d'E. cuniculi et d'E. intestinalis.
A partir d'amorces dégénérées déduites des peptides P1 et P2, un fragment d'ADN d'environ 1 kpb a été
amplifié, cloné dans un vecteur plasmidique pCR2 (Invitrogen, TA cloning vector) et séquencé selon la méthode dë Songer ( 12 ) . L' amplificai~ion des régions 5' et 3' du gène de la PTP a été réaliséE~ par une technique de PCR (SSP-PCR). L'analyse des séquences est réalisée sur le serveur de biologie moléculaire Infobiogen.
La séquence complète représentée dans la liste de séquence en annexe sous Ie numéro SEQ ID No :1 comprend 1830 nucléotides et comporte un cadre de lecture de 1188 pb. Ce dernier contient 395 codons allant du site considéré
comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-T. La séquënce en acides aminés traduite est représentée WO 00/01724 PCT/F'R99/01630 dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID
No :1.
A l'aide d'amplifications par PCR et SSP-PCR, le gène codant pour une protéine homologue de PTP55 a été
5 séquencé et est représenté dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No :3. Cette séquénce comporte un cadre de lecture de 1113 pb. Ce dernier contient 371 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG.
b) Gènes codant pour 1.=s PTP35 d'E. cuniculi, d'E. intestinalis et d'E. hellem.
A partir d'amorces dégénérées déduites du peptide P3, différents fragments ont été amplifiés par la technique de SSP-PCR, clonés dans un vecteur piasmidique pGEMT (Promega, TA cloning vectoi.°), séquencés selon la méthode de Sanger et analysés comme décrit ci-dessus.
La séquence complète de la PTP35 d'E. cuniculi représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No :2 comprend 1740 nucléotides. Le cadre de lecture comprend 834pb. Ce derniE:r contient 277 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAA. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-'T, similaire à celle de la PTP55. La séquence d'acides aminés traduite est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :2.
Les séquences des PTP35 d'E. intestinalis et d'E. hellem représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID DJo :4 et SEQ ID No :5 contiennent respectivement 825 et: 816 nucléotides non compris le codon stop. Les protéineas correspondantes sont constituées de 277 et 272 acides aminés.

WO 00/01724 PCT/F'R99/01630 4) Expression des PTPs chez Escherichia coli.
Une partie de la PTP55 d'E. cuniculi correspondant à la région entre les peptides P1 et P2 a été
clonée dans un vecteur d'expres:~ion pQE30 (Qiagen) et exprimée chez E. soli (souche M15). La protéine recombinante a été purifiée par chromatographie d'affinité
sur colonnes de nickel et injectée à des souris. Les anticorps correspondants testés en immunoblotting, immunofluorescence et en microscopie électronique à
transmission ont permis de confirmer que cette protéine était bien localisée au niveau du tube polaire d'E.
cuniculi.
Une partie de la PTP35 entre les résidus 27 et 277 a également été exprimée chez E. soli selon la même technique. Les anticorps produits contre cette protéine recombinante ont montré un marquage du tube polaire.
5) Analyse des séauence:~ primaires des PTP55 et PTP35.
L'analyse Blast n'a montré aucune homologie significative avec d'autres protéixnes connues, si ce n'est avec le collagène, principalement dû au fait que la PTP55 est riche en résidus glycine et pro:Line.
a) Les PTP55 sont riches en résidus proline, glycine, glutamine, sérine et thréonine qui représentent à
eux 5 plus de 55~ du contenu en acides aminés. Le site de clivage (entre les résidus sérine et alanine de la PTP55 d'E. cuniculi) proposé est prédit comme tel par les caractéristiques suivantes .
, - absence de résidu lysine en position 22 précédant le peptide P1 séquencé (23-42) après digestion de la protéine par l'Endolysine C, - séquençage N-terminal de la protéine correspondant à celui du peptide P1, présence d'acides aminés hydrophobes dans cette région N-terminale, - algorithme de von Heijne, - structure secondaire en hélice a.
La PTP est vraisemblablement synthétisée par E.
cuniculi (ou E. intestinalis) sous forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est éliminée lors de la maturation. La protéine mature aurait donc une masse moléculaire de 37230 Da.
Des sites de N-glycosylation (NETS, NGTS et NISG) sont présents dans la séquence. La présence de nombreux résidus sérine et thréonine (21,6ô) laisse également supposer des sites de O-glycosylation.
La région centrale de la protéine PTP55 d'E.
cunicu~i est caractériséé par 4 répétitions en tandem de 26 acides aminés chacune avec une conservation au niveau nucléique. Cette région est partiE~llement encadrée par 2 autres répétitians de 9 acides aminés. Aucune répétition n'est observée dans la séquence PrCP55 d'E. intestinalis, mais les 2 PTP55 présentent de fortes homologies dans les parties N- et C- terminales.
b) Les PTP35 sont particulièrement riches en résidus lysine (11.50 et acide glutamique (9~). 3 sites de clivages potentiels d'une séquence signal sont représentés entre les résidus 12 et 13, 13 et: 14, et 22 et 23. Une séquence RGD est présente dans la PTP35 d'E. cuniculi et d'E. intestinalis, séquence que l'on retrouve dans des protéines telles que la fibronectine~ et qui intervient dans des phénomènes d'attachement cellulaire. Un site potentiel de N-glycosylation (NSTS) est également présent dans la séquence PTP35 d'E. cuniculi.
6) Localisation chromosomique et estimation du nombre de co ies.

L'hybridation d'une sonde, correspondant à une partie du gène codant pour la PTP55, sur les chromosomes d'E, cuniculi séparés par électrophorèse en champs pulsé a montré une localisation unique de ce gène sur le chromosome VI.
La même sonde a été app:Liquée sur des Southern après digestion de l'ADN génomique d'E. cuniculi par différentes enzymes de restriction . une seule bande est marquée sur chaque profil de digestion, ce qui permet d'affirmer que le gène existe en une seule copie.
Le gène codant pour la PTP35 d'E. cuniculi est également localisé sur le chromosome VI.

i:i' REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1) Desportes-Livages, Parasite (1996) 3 . 107-113.

2) Van Gool et al, J Infect Dis (1997) 175 1020-1024.

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4) Keohane et al, Mol B:i.ochem Parasitol (1996) 79 . 255-259.

5) Beckers P.J.A. et a7_, J. Clin. Micr~abiol.

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7) Keohane et al, J Euk Microbiol (1996) 43 26-31.

8)Delbac et al, J Euk Microbiol (1997) 44 .

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13) Land et al, Parasitology Today (1995) 11 .

19-23.

WO 00!01724 PCT/FR99/01630 LISTE DE SÉQUENCES
(1)INFORMATION GÉNÉRALES:
(iii)NOMBRE DE SEQUENCES: 5 (2)INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:1 ., (i) CARCTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR:

(B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRIN: doube (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUES

(A) NOM/CLE:

(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID N0:1 .

GGCGGACAGG CCGGCTCGTA TTCTTCAGGG GTGTCGCCTA CCCAGTGCAC AGGAGGTTC'C120 GGAGGTGTCT TGGATGGAAA GTAAGGCCAT TTGTGGGTTC TCATCCATGT CATCGTCCC'T1$0 O

GGT ATT

Met Lys Gly Ile Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ser Ile Ala Leu Met Lys Leu Glu Asn Val CCG GGA

Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Cys Ser Asn Ala Tyr Gly Leu Thr Pro Gly AGC ACC

Gln Gln Gly Met Ala Gln Gln Pro Ser Tyr Val Leu Ile Pro Ser Thr TAT TCT

3 Pro Gly Thr Ile Ala Asn Cys Ala Ser Gly Ser ~Gln Asp Thr 5 Tyr Ser ACT AGC

Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Val Thr Pro Gly Lys Thr Ser 70 75 g0 ACA TGC

Glu Asn Glu Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Val Gly Thr Cys AAG ATT GCC GTA TTG AAG CAC TGC GAC GCA CCA c,;GA ACA ACA 692 TCA GGG

Lys Tle Ala Val Leu Lys His Cys Asp Ala Pro Gly Thr Thr Ser Gly FEUILLE DE REMPLACEMENT (RErGLE 26j GGG GGG CAG
CCT CCT
TGT
GAA
ACC
CCA
GAG
CAG

Thr ThrProGlySer GIy GluThr GlnGln Pro Pro Pro Cys Glu Gln CCT CCG
GTG
ACT

Leu SerValIleSer ThrThr AlaValProVal ThrValGlu Ser Pro Ala GlnSerProSer ValValPro ValValProVal ValAlaHis His O

Gln AlaValProGly TyrTyrAsn AsnGlyThrSer GlyIlePro Gly 165 170 . 175 180 Gln GlnGlnIleLeu SerGlyThr LeuProProGly AlaThrLeu Cys G1n GlyG1nAlaMet ProSerThr ProGlyGlnGln Gln21eLeu Ser 2 Gly ThrLeuProPro GlyValThr LeuCysGlnGly GlnAlaThr Pro Ser ThrProGlyGln GlnGlnVal LeuSerGlyThr LeuProPro Gly 2 GTC ACTTTGTGTCAG GGACAGGCC ACGCCTAGC.ACTCCTGGGCAG CAA 1124 Val ThrLeuCysGln GlyGlnAla ThrProSer'~hrProGlyGln Gln CAG GTCCTTTCTGGC ACCCTTCTC CCAGGAGCCACT TTGTGfiCAG GAT 1172 Gln VaILeuSerGly ThrLeuLeu ProGlyAla'rhrLeuCysGln Asp Gln GlyMetPro-Gly ThrSerGly ValProGlyGln GlnGlyGln Ser AGT GGACAGTGTTGfiGCCCCTCAG ATTCCAAACCCT GTCATGCCG CCA 1268 3 Ser GlyGlnCysCys AlaProGln IleProAsnI?roValMetPro Pro Ser MetAsnIleSer GlyAsnGly TyrProSerSer ThrAlaTyr Ser AAC AAG

Pro LeuGlySer LeuGlySer CysValAspTle Gln Thr Gly Asn Lys ACA CAG
TCC TAT

Gly SerCysGlu LysPro LysSerF~laThr Thr Gln Glu Gln Tyr Ala FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE13LE 26) AAC AGC

Met Glu Ala Cys Ala Thr Pro Thr Pro Thr Val Ile Ile Gly Asn Ser 360 365 37p GAG TAT CTT GTT GGA CCA GGA ATG TAC AAT GCA ATT AAC TCT 150$
CCA TGC

Glu Tyr Leu Val Gly Pro Gly Met Tyr Asn Ala Ile Asn Ser Pro Cys Asn Thr Ala Val Gln Cys Cys AGTGAAATGC

GAGTTTGGTA

ACAGGATTCC CCGAGGATTT AGCAGCCTTG GAGTACCATG .ATTGAATCAG 1742 TATTAAACTT

CTCAAATTAT TTTATTCTTT CTGTTTTATA TCCCGAGCCA .ATCTGAGAAG 1802 AATGCCTCGA

ATTCAAGCTC CCTTAGAAGT GTGGGATC 1$30 (2)INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:2 .

(i) CARACTRERISTIQUES DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEUR:

(B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFTGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLCULE: ADN

(ix) CARACTRISTIQUES

(A) NOM/CLE:

(xi)DESCRIPTION DE LA SQUENCES: SEQ ID N0,:2 .

TACAACTTCT

TATCGATGGT

TCCATCCCCT

O TTTATACCAT

GCACAGCTAT ATCTTGGCCT GAAGTGCACT TTCAGGTCzGG GCTTTGTTAC 300 ATTGCGGTGT

TTTGGATTAC CTGATATAAT TTGTTACCCA-CTGAGTCAAG TCGAAACCAG "360 TAGTCCGCAG

GCACAGCAAA

CTC GCC

3 Met Leu Leu Leu Leu Ala ATA ACT GCT GTT GTT AGC GCC ACG ATG GTC CAT C'CT TCA GCT 523 GTT GTT

Ile Thr Ala Val Val Ser Ala Thr Met Val His F~ro Ser Ala Val Val 4O CCA CAG CCC GCA GCA CCT CTC CAT GTC GTT CCC C.'CA CAG CAG 571 CAA ATG

Pro Gln Pro Ala Ala Pro Leu His Val Val Pro F~ro Gln Gln Gln Met GGC ATG GTT AAC GGA TGC ACC AGC AAG AAA CTA GAG CsGT~GCA 619 GAA ATA

Gly Met Val Asn Gly Cys Thr Ser Lys Lys Leu Glu Gly Ala Glu Ile FEUfLLE DE REMPLACEMENT (RECiLE 26) GAG .AGC
TGC

Met Arg Arg Asn MetIleGlu GlnLys Arg Ser Glu Ala Thr Cys ,Ser AAT GTA

Lys Ala Met Ile GluArgAla GluLys Ala Gl.u Ser Phe Asn 'Val Asn AGC GGA

Lys Glu Val Ser LysGlyPro GlnLys Asp Gly Gln Cys Ile Ser Gly GAT (~TC

Glu Lys Ala Val GlnGlyThr ArgCys Ile Ala Gly Tle Ile Asp Leu AAG 'CCA

Asp Lys Ala Val AsnLysArg TyrArg Ile Asp Val Glu Asn Lys Ser 120 125 _L30 GAC GCC

Ser Thr Ser Leu TyrArgGly LysLeu Ile Leu Ile al Asn Asp Ala ATC AAG

Val Asp Tyr Gly LeuGlnPro ThrLys Pro Lys Lys Lys Ser Ile Lys CAG GTAG

Lys Ile Met Ala AsnLeuPro ProLys Arg Met Tyr Phe Asn Gln Glu GCA 'l'TC

Gln Ile Gly Gln LeuValGly ArgGy Thr Pro Gln Glu Asn Ala Phe GAG F,AG

Lys Glu Asp Cys LysProCys GlyPro Lys Thr Val Glu Thr Glu Lys GGG A,AA

Thr Ser Glu Lys CysAsnLeu CysGlu Leu Gly Thr Ser Ala Gly Lys AAG AAG

3 5 Leu Tle Ser Lys AlaIleGln LysGlu Val Asp Thr Lys Glu Lys Lys GAC GAG

Gly Glu Lys Ser AlaSerGln SerAsp Gly Gly Thr Ala Glu Asp Glu TCT GAG

Asp Ala Glu Val GInGlnPro AIaAsp Gly Gly Leu Glu Ser Glu TGGATTGAAT TTTTGTGAAA
GACTTTGGGA

TAAATTGTTA ACTCGATGGA
ATAGTCAATT

GGTCTGCCCC TCCTGGCAGT
TATCGCATCG

GAATCCATAT T~CTTCTTGTA
TTGGTCGTAG

CAGTATCTCA CCTTGAGAAG
GTCTCTAACG

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE(3LE 26) WO 00/01724 PCT/FR99/OIb30 5 {2}INFORMATION POUR SEQ .
LA TD
N0:3 {i) CARACTRERISTIQUES DE J~:
LA
SEQUENC

(A) LONGUEUR:

(B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATTON: lin aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

{ix) CARACTERISTIQU ES

(A) NOM/CLE:

(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ :3 .
ID

1:5 AAG TCA

Met Lys Gly Ile Ser Val Leu Ala SerIleValLeu MetLys Lys Ser TCT GTG

Leu Lys Gly Val Tyr Thr Thr Leu CysG1yAspSer ThrGln Ser Val

20 25 30 ACC TCA

Gly Leu Gln Gly Thr Gln Pro Tyr ValLeuValPro SerAla Thr Ser AAC TAC

Pro Glu Thr Ile Ala Cys Gly Ser ProGlnAsnMet TyrVal Asn Tyr ACC TCC

Pro Ser Thr Pro Thr Met Pro Thr ValProGlyThr ThrGly Thr Ser 65 70 75 g0 ACT ACA

Glu Ser GIu Thr Pro Ser Pro Ser SerProThrGlu AspVal Thr Thr GCT AAG

3 5 Gly Thr Cys Lys I1e Va1 Va1 His CysAspAlaPro GlyThr Ala Lys TCA TCA ACA CCT TGC CCG GAA ACT TTGGCCCCCTCT CAGCCA 3$4 GAA CAG

Ser Ser Thr Pro Cys Pro Glu Thr LeuAlaProSer GlnPro Glu Gln GCC CTG

Val Ala Ala Thr Ile Thr Pro Val ValAlaSerVal GlnThr Ala Leu ACC ACT

Pro Gln Ala Ala Val Ile Leu Pro LysAlaValSer AlaGln Thr Thr FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26) WO 00101724 PCT/F'R99I01630 TCT TTC CCA GGC AAT
AAC

Pro Ala Thr Ile IIe Pro Asn Gln A1a GlyTyrTyrAsn Ser Phe Pro CAA CTT GTT

Ser Ala Ile Pro Gly Ile Thr Gly Asn LeuSerProSer Gln Leu Val GTG CCC GGA

Ala Ser Ser Cys Gln Val Gly Thr Thr SerSerThrPro Val Pro Gly GCT TCA ATT

G1n Gln Leu Pro Gly Val Ser G1y Thr ProCysGlnIle Ala Ser Ile AGT GGA GGA

Val Gln Gly Thr Gln Ser Asn Thr Pro GlnGlnPheLeu Ser Gy Gly GTT AGC GAT

Pro Gly Ile Val Pro Gly Leu Gln Pro GlnAlaThrSer Val Ser .Asp TCT AGC 'rCT

2 0 Gly Thr Pro Thr Pro Val Gln Ser Gln GlyGlnGlnCys Ser Ser Ser ATC AAC c~CA

Cys Cys Thr Pro Pro Thr Pro Val Met ThrProMetGIy Ile Asn 1?ro TAT AGC TAC

Ile Ser Ser Asn Gly Pro Ser Thr Ala AlaProThrLeu Tyr Ser ':L'yr TGC GAC TCA

Gly Gln Leu Gly Pro Ile Thr Gln Lys ThrSerSerCys Cys Asp Ser CCT GCA AfiG

Glu Pro Lys Glu Lys Val Gln Tyr Gly GluAlaCysAla Pro Ala Met GCT CTA GAG

3 5 Ala Pro Thr Pro Thr Val Gly Asn Ala TyrLeuLeuSer Ala Leu C3lu TCA AAC AAC

Pro Gly Met Tyr Asn Leu Ser Pro Cys CysCysGln Ser Asn A,sn Ala Gln Gln Cys (2)INFORMATION LA ID N0:4 .
POUR SEQ

45 (i) CARACTRERISTTQUES
DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR:

(B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRIN: double FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE(~LE 26) (D) CONFIGURATION:
linaire (ii) TYPE DE MOLECULE:
ADN

(ix) CARACTERISTIQUES

(A) NOM/CLE:

(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SE!
ID
N0:4 .

GCT GCA

Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Val PheValSer Ala Thr Val Ala Ala ACA CTT

Gln Ser Gly Val Val Ser Gln Pro ThrProIle Pro Ile Pro Thr Leu AAC AAA

Gly Gln Pro Met Gly Gly Met Ala GlyCysThr Asn Lys Leu Asn Lys 1.5 35 40 45 AAC AAG

Asp Gly Val Glu Ile Met Arg Arg MetValGlu Cys Gln Arg Asn Lys GTT AAG

2 Asn Ala Glu Ala Thr Lys Ala Met GluArgAla Asn Glu Ala 0 Va1 Lys AGT GAA

Val Glu Thr Phe Asn Lys Glu Val LysGlyPro Gln Lys Ser Ser Glu Gly Gln Cys Ile Glu Lys Ala Val GlyThrAsp Arg Cys Leu Gln Ile 100 1.05 110 GCA GGA ATA ATT GAT AAG GCT GTG AAGCGT.AAG TAC AGA TCG 384 AAC ATC

Ala Gly Ile Ile Asp Lys Ala Val LysArgLys Tyr Arg Ser Asn Ile TAT ATT

Asp Val Glu Asn Ser Thr Ser Leu ArgGly,Asp Lys Leu Ala Tyr Ile CTA ATT GTC AAT GTT GAC TAT GGA CAGCCAATT ATC AAA AAG 4$0 CTT CCA

3 Leu Ile Val Asn Val Asp Tyr Gly GlnProIle Ile Lys Lys 5 Leu Pro AAT AGA

Lys Lys Lys Ser Lys Ile Met Ala LeuProGln Pro Lys Glu Asn Arg CTT ACA

Met Tyr Phe Asn Gln Ile Gly Gln ValGlyAla Lys Gly Phe Leu Thr AAG AAG

Pro Gln Asp Asn Lys Asp Gu Cys ProCysGlu Pro Lys Thr Lys Lys AAT AAG

Val Glu Thr Ala Ser Glu Arg Cys LeuGlyCys Glu Leu Gly Asn Lys FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26) AGT CAA AAG ATC

Thr Ser Ala Leu Ile Lys Ala Ile Lys GluIle LysGlu Ser Gln Lys GAC ACC GAA

Ser Pro Lys Glu Gly Arg Asn Thr Gln TyrAsp GlyGlu Asp Thr Glu GCT CAA TC:T

Gly Ser Ala Glu Asp Glu Gly Gln Pro AlaAsp GlyGlu Ala Gln Ser Gly Leu Glu (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID :5 .

(i} CARACTRERISTIQUES
DE LA SEQUENCE:

l5 (A) LONGUEUR:

(B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) CONFIGURATION:
linaire (ii } TYPE DE MOLECULE:
ADN

20 (ix}
CARACTERISTTQUES

(A) NOM/CLE:

(xi}DESCRIPTION SEQ :5 DE ID .

SEQUENCES:

ACC CTT AGC

25 Met Leu Leu Leu Phe Val Val Thr Val AlaAla GlnVal Thr Leu Ser GCA CCT GTA .ACT CCG GCA GCT GTA ACA TTCCTT CCTGGT 96 CAG CCT C.AA

Ala Pro Val Thr Pro Ala Ala Val Thr PheLeu ProGly Gln Pro Gln GGC AAC TGT

Ala Gln Gln Lys Ile Gly Val Asp Arg AlaAsn LysGln Gly Asn Cys ATA GAC GCC

Val Glu Gly Val Gln Phe Gln Gly Met AspCys ProLys Ile Asp Ala GCA GTT AGA

Arg Asn Ser Glu Ala Asn Ala Met Gln AlaLys GlnLys Ala Val Arg AAT AGC GGC

4O Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Glu Ile Lys ProThr ProLys Asn Ser Gly 85 . 90 95 ATA GTA GGT

Asp Ser Gly Gln Cys Glu Arg Ala Gln ThrAsp ArgCys Ile Val Gly ATC GTG ATG

Ile Leu Ala Lys Ile Asp Lys Ala Asn LeuLys TyrArg Ile Val Met FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~GLE 26) GCT GCA GGA
CTC AAC

Ile Ser Lys Val Gly Asn Thr AlaLeuPheArgGly Lys Leu Ala Asn AT'T TCT CTA ATT CTT AAT GAT TATGGACTTAA.GCCA TTT ACT 480 GTT TTC

Ile Ser Leu Ile Leu Asn Asp TyrGlyLeuLysPro Phe Thr Val Phe AAG GAT

Val Val Lys Lys Lys Thr Arg ValPheProGlnGly Glu Leu Lys Asp CAG ACA

Asn Phe Asn Gly Ile Gly Leu IleGlyVal:LysGly Phe Pro Gln Thr CAA GAC AAT AAT GAT GAA AAG CCGTGTGAC'rCTCCA AAG ACT 624 TGC AAG

Gln Asp Asn Asn~Asp Glu Lys ProCysAspSerPro Lys Thr Cys Lys GAA CTT

Val Glu Thr Val Ala Glu Cys AsnLeuGlyCysGln Lys Gly Glu Leu AGA GTC

2 0 Thr Pro Gly Leu Ile Ser Ala IleGlnLysLysGlu Lys Glu Arg Val AGC TCA AAG GAC GGA GAA AGC TCAACCCAGAACGGC GGC ACC 76$
AAA GAA

Ser Ser Lys Asp Gly Glu Ser SerThrGlnAsnGly Gly Thr Lys Glu CAG GGA

Thr Asp Asp Glu Asp Gly Gln SerProAspGlyAsn Pro Glu Gln Gly FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)

Claims (24)

REVENDICATIONS

1) Protéine complète purifiée recombinante de tube polaire de microsporidie choisie dans le groupe comprenant les protéines dont les séquences en acides aminés sont représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 , SEQ ID
No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5, ou un fragment de celle-ci.

2) Protéine selon la revendication 2, constituée par ou comprenant la séquence comprise entre les acides aminés 23 et 395 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:1.

3) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:3, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.

4) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.

5) Protéine selon la revendication 7, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 277 de la séquence représentée dans 1a liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2.

6) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:4 un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.

7) Protéine selon la revendication 6, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 275 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:4.

8) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:5 un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.

9) Protéine selon la revendication 8, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 272 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:5.

10) Anticorps poly ou monoclonaux préparé à
partir d'au moins une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

11) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes:
a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendications 1 à 9 sur un support d'analyse, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum d'un sujet à tester, d) on élimine par lavage les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c), e) on incube le produit de l'étape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, f) on élimine par lavage les anticorps anti-humains qui ne sont pas liés spécifiquement et, g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum /
protéine, formés à l'étape (e).

12) Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est constitué par:
- un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinantes de tube polaire de microsporidie, - une solution contenant: des anticorps anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, et, - une notice décrivant les étapes du procédé de diagnostic selon la revendication 11.

13) Molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

14) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 13 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1830 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:1 ou sa séquence complémentaire.

15) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 13 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1113 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:3 ou sa séquence complémentaire.

16) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 13 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1740 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2 ou sa séquence complémentaire.

17) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 13 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 825 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:4 ou sa séquence complémentaire.

18) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 13 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 816 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:5 ou sa séquence complémentaire.

19) Vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, avantageusement associée à des séquences de contrôle.

20) Un hôte transformé par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 à 18 ou par un vecteur selon la revendication 19.

21) Procédé de production ou d'expression dans un hôte d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste:

- à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 à 18 ou un vecteur selon la revendication 19 dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie, - à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines;

22) Une sonde nucléique éventuellement marquée constituée de tout ou partie d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 13 à
18.

23) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes:
a) on extrait de l'ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques, b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen approprié, c) on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide d'au moins une sonde nucléotidique marquée selon la revendication 22 spécifique d'une microsporidie.

24) Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il est constitué par:
- les moyens nécessaires à l'amplification des séquences à analyser, - un support d'analyse pour fixer les produits de l'amplification, - des sondes génériques et/ou spécifiques marquées, et - une notice décrivant les étapes du procédé de diagnostic selon la revendication 23.