DE19628067C2 - Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis von Mikrosporidien, insbesondere aus klinischem Material von Menschen und Tieren sowie aus Umweltproben und Nahrungsmitteln durch Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Es ist bekannt, daß Mikrosporidien eine ungewöhnlich schwer nachzuweisende Gruppe von Parasiten darstellen. Obwohl vor dem Auftreten von HIV-Infektionen klinische Manifestationen der Mikrosporidien selten waren, bzw. nicht als solche erkannt worden sind, deuten serologische Untersuchungen aus Schweden darauf hin, daß 12% immunkompetenter Erwachsener und 33% der AIDS-Patienten mit Mikrosporidien infiziert sind oder waren [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24: 13-18]. In Europa, Australien und den USA wurden sie bei 15 bis 30% von AIDS-Patienten, die an Durchfall litten, gefunden [Canning et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236]. Neuere Untersuchungen belegen, daß auch für Deutschland davon ausgegangen werden muß, daß die überwiegende Zahl der Mikrosporidiosen nicht als solche diagnostiziert werden [Franzen et al. (1994) Infection 22: 417-419]. Besondere Schwierigkeiten bereitet der Nachweis von Mikrosporidien der Gattung Enterozytozoon. E. bieneusi ist zusammen mit Encephalitozoon (Septata) intestinalis und Encephalitozoon hellem nicht nur am häufigsten für Mikrosporidieninfektionen bei AIDS- Patienten verantwortlich, sondern auch für die klinisch fulminantesten Verläufe [Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236; Garcia & Shimizo (1993) Lab. Med 24: 13-18]. E. bieneusi befällt vor allem Enterozyten des Dünndarms, aber auch den Dickdarm und führt zu unstillbaren, chronisch-sekretorischen Diarrhöen mit ausgeprägtem körperlichem Verfall. Über die Epidemiologie ist äußerst wenig bekannt, lediglich der Nachweis von E. bieneusi bei einem HIV-negativen Patienten mit schwerer Diarrhö [Sandfort et al. in: Curry & Canning (1993) J. Inf. 27: 229-236] läßt darauf schließen, daß zumindest diese Art beim Menschen verbreiteter ist als bisher angenommen wurde.

Der Nachweis von Mikrosporidieninfektionen im Rahmen der konventionellen parasitologischen und histologischen Diagnostik ist unverändert problematisch. Einerseits wird der lichtoptische Nachweis durch die geringe Größe der Sporen erschwert (1 bis 1,5 µm bei E. bieneusi); andererseits stehen derzeit noch keine spezifischen Färbemethoden für Mikrosporidien zur Verfügung. Die Sporen fallen nicht nur in die Größenordnung von Bakterien, sondern müssen auch von Hefesporen und anderen Pilzen unterschieden werden. Alle bisher verwendeten Färbemethoden (PAS, Versilberung, modifizierte Trichromfärbung, Trichrom-Blau, modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbungen, Chromotrop-Färbungen, Interferenz/Phasenkontrast) sowie die bisher untersuchten immunologischen Methoden haben nur den Stellenwert von Such- oder Screening-Methoden mit sehr begrenzter Sensitivität und Spezifität [Garcia & Shimizu (1993) Lab. Med. 24: 13-18; Weber et al. (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7: 426-461; Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52: 89-93]. Als immunologische Methoden wurden IFAT, Western-Blot und ELISA eingesetzt, wobei zur Erzeugung der mono- oder polyklonalen Antikörper stets Antigenpräparationen aus ganzen Sporen von E. cuniculi [Weiss et al. (1992) Am. J. Trop. Med. Hyg. 47: 456-462], E. intestinalis [Ombrouck et al. (1996) C. R. Acad. Sci. Paris 319: 39-43; Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 3138-3145; Beckers et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 282-285], E. hellem [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 2760-2768; Schwartz et al. (1993) J. Ophthal. 115: 285-292; Croppo et al. (1991) J. Protozool. 38 : 31S], Glugea atherinae [Ombrouck et al. (1995) Am. J. Trop. Med. Hyg. 52: 89-93] oder mehreren, kultivierbaren Mikrosporidienspezies [Didier et al. (1995) Parasitol. 111: 411-421; De Groote et al. (1995) J. Infect. Dis. 171: 1375-1378; Visvesvara et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 930-936; Zierdt et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 3071-3074; Aldras et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32 : 608-612; Visvesvara et al. (1991) J. Protozool. 38: 105S-111S; Sobottka et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 2948-2952] eingesetzt wurden. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Mikrosporidien wurden ebenfalls entweder Sporen oder ihr Gesamtantigen verwendet [Visvesvara et al. (1994) J. Clin. Microbiol. 32: 2760-2768; Schottelius et al. (1995) Folia Parasitol. 42: 169-172]. Eindeutige Identifikation und Artdifferenzierung waren bislang auf den elektronenmikroskopischen Direktnachweis angewiesen, der jedoch nur bei sehr hoher Parasitendichte erfolgversprechend ist und meist Biopsate und damit invasive Techniken voraussetzt. Der zweifelsfreie Nachweis im Sinne eines Goldstandards war somit nicht nur mit einem erheblichen methodischen Aufwand verbunden, sondern setzte außerdem noch eine ausreichende vorherige Anreicherung voraus, die direkt aus Stuhl oft nicht zu erreichen ist [Corcoran et al. (1995) J. Clin. Pathol. 48: 725-727]. Eine hierzu wünschenswerte Kultivierung ist jedoch gerade für die klinisch wohl bedeutendste Art, E. bieneusi, bislang noch nicht gelungen. Der Direktnachweis von Mikrosporiden-DNA mittels PCR brachte deshalb einen wichtigen methodischen Fortschritt, ist bisher aber auf Forschungslabors beschränkt und derzeit noch nicht umfangreich validiert [u. a.: Franzen et al. (1996) J. Infect. Dis. 173: 1038-1040; Weiss et al. (1994) Folia Parasitol. 41 : 81-90; Katzwinkel-Wladarsch et al. (1997) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16: 7-10]. Ein weiterer wichtiger Grund, der die Mikrosporidiendiagnostik bisher verhinderte, ist das Fehlen aussagekräftiger immundiagnostischer Tests. Die bisher untersuchten Antikörper zeigten noch kein ausreichendes diagnostisches Potential für einen sensitiven und spezifischen Nachweis von Mikrosporidien-Antigenen [Didier et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 3138-3145]. Dies gilt vor allem für E. bieneusi, da bislang nur unzureichend gereinigte Antigenpräparationen als Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen. Dadurch wird auch die Zuverlässigkeit ihres Einsatzes für seroepidemiologische Untersuchungen beeinträchtigt.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Nachweis von Mikrosporidien ohne vorherige Kultivierung des Erregers, ohne DNA-Amplifizierungstechniken und ohne mikroskopische Methoden zu ermöglichen.

Dieses Problem wird durch die Gegenstände der Ansprüche 1 bis 21 gelöst.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß damit auch nicht-spezialisierten Routinelabors der Nachweis von Mikrosporidien ermöglicht wird und damit dem Großteil der betroffenen Patienten zugute kommt. Der Nachweis wird dadurch vereinfacht, daß die zu untersuchenden Materialien zunächst mit einem sensitiven Suchtest untersucht, und nur die dort positiven Fälle mit artspezifischen Bestätigungstests genauer charakterisiert werden können. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß artspezifische Antigene und durch sie auch artspezifische Antikörper auch ohne Kultivierung der jeweiligen Mikrosporidienart erzeugt werden können.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden näher beschrieben:

Eine in Kultur vermehrungsfähige Mikrosporidienart ist E. cuniculi. Aus einer solchen Kultur werden die Mikrosporidien während der logarithmischen Phase und damit zu einer Zeit hoher Syntheseleistung, verbunden mit hoher Genexpression und damit einem großen Gehalt an mRNA, gewonnen und ihre mRNA nach Standardmethoden [z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Habor Laboratory Press, Plainview, USA] isoliert. Ebenfalls nach Standardmethoden wird aus dieser mRNA nach Überführen in cDNA eine cDNA-Bank angelegt und mit einem Antiserum "gescreent", das durch Immunisierung geeigneter Tiere, z. B. Kaninchen, gewonnen wurde. Für die Immunisierung können Mikrosporidien aus der gleichen Kultur verwendet werden wie für die Gewinnung der mRNA. Die immunogenen Klone werden aus der cDNA-Bank nach Standardmethoden isoliert und in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Vektor umkloniert und exprimiert [z. b. J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Habor Iaboratory Press, Plainview, USA].

Die einzelnen, rekombinanten Antigene werden anschließend in Immunoassays, beispielsweise nach Beschichtung einer Titerplatte in einem ELISA-Assay, zum Nachweis von Antikörpern gegen Mikrosporidien und damit zum Nachweis einer Mikrosporidieninfektion eingesetzt. Es ist mit Antigenen unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität zu rechnen: Für einen möglichst sensitiven Suchtest werden diejenigen Antigene ausgewählt, die mit Antiseren gegen eine möglichst große Zahl verschiedener Mikrosporidienarten reagieren. Für die möglichst spezifischen Bestätigungstests werden diejenigen Antigene ausgewählt, die möglichst ausschließlich mit der zu ihrer Herstellung verwendeten Mikrosporidienart reagieren.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist die Verwendung dieser sensitiven, bzw. spezifischen Antigene zur Immunisierung von Tieren, z. B. von Kaninchen und/oder Mäusen, und der dadurch möglichen Erzeugung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen diese Antigene. Diese werden nach Beschichtung einer Titerplatte in einem Antigen- "Capture"-Assay, z. B. einem Koproantigen-ELISA, zum Nachweis von Antigenen von Mikrosporidien aus klinischem Material und Umweltproben verwendet. Es ist mit Antikörpern unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität zu rechnen: Für einen möglichst sensitiven Suchtest werden diejenigen Antikörper ausgewählt, die mit Antigenen einer möglichst großen Zahl verschiedener Mikrosporidienarten reagieren. Für die möglichst spezifischen Bestätigungstests werden diejenigen Antikörper ausgewählt, die möglichst ausschließlich mit der zu ihrer Herstellung verwendeten Mikrosporidienart reagieren.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ist die Erzeugung rekombinanter Antigene weiterer, auch nicht-kultivierbarer Mikrosporidienarten, ohne daß diese zur Antigengewinnung kultiviert oder angereichert werden müssen. Vielmehr werden zu den flankierenden Bereichen der DNA, die für ein bereits charakterisiertes Antigen einer anderen Mikrosporidienart, z. B. E. cuniculi, kodiert, PCR-Primer synthetisiert und damit in einer PCR-Amplifikation der homologe Genabschnitt der anderen, u. U. nicht kultivierbaren Mikrosporidienart, z. B. E. bieneusi, isoliert. Dazu wird genomische DNA dieser Spezies verwendet, die aus klinischem Material, z. B. aus dem Stuhl eines infizierten Patienten, ohne vorherige Anreicherung oder Kultivierung gewonnen werden kann [z. B. gem. Katzwinkel-Wladarsch et al. (1996) Trop. Med. Int. Health 1: 373-378]. Alternativ kann die homologe DNA-Sequenz der zweiten Mikrosporidienart auch durch Hybridisierung einer genomischen DNA oder einer cDNA mit dem Genabschnitt der ersten Mikrosporidienart identifiziert und isoliert werden, wozu aber eine größere Menge an genomischer DNA oder mRNA notwendig ist und deshalb von einer Anreicherung oder einer Kultivierung der Mikrosporidien abhängig ist.

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß gentechnisch/rekombinant hergestellte Mikrosporidienantigene verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß cDNA aus einer cDNA- Bank von einer Mikrosporidienkultur eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur einer vermehrungsfähigen Mikrosporidienart angelegt wird, aus der Kultur mRNA isoliert wird, diese in cDNA überführt und damit die cDNA-Bank angelegt wird und anschließend die immunogensten Klone ausgewählt und isoliert werden und diese cDNA zu Expression von Antigenen verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß entweder in einer Immunreaktion entstandene, gegen die Mikrosporidien gerichtete Antikörper mit den gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen nachgewiesen werden, oder daß die Mikrosporidien, oder Teile von ihnen, mit durch Immunisierung mit den gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen gewonnen Antikörpern direkt nachgewiesen werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Immunisierung mit den gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen gewonnenen Antikörper polyklonale oder monoklonale Antikörper sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß entweder Antikörper, die für einen sensitiven Suchtest mit möglichst vielen Mikrosporidienspezies reagieren können oder Antikörper, die für einen spezifischen Test und/oder zur Artbestimmung mit möglichst wenigen Mikrosporidienspezies reagieren können, eingesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß entweder Mikrosporidienantigene, die für einen sensitiven Suchtest zu einer Reaktion für möglichst viele Mikrosporidienspezies führen oder Mikrosporidienantigene, die für einen spezifischen Test und/oder zur Artbestimmung zu einer Reaktion für möglichst wenige Mikrosporidienspezies führen, eingesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von der cDNA, oder Teilen davon, Nukleinsäuresonden oder PCR-Primer für einen homologen Genabschnitt einer weiteren Mikrosporidienart gewonnen werden, mit diesen Nukleinsäuresonden eine Isolierung oder mit den PCR-Primern eine PCR-Amplifikation des homologen Genabschnittes der weiteren Mikrosporidienart durchgeführt und dieser Genabschnitt zur Expression des homologen Antigens der weiteren Mikrosporidienart verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA, oder Teile davon, mit einer genomischen DNA oder einer cDNA einer weiteren Mikrosporidienart hybridisiert wird und damit die weitere Mikrosporidienart nachgewiesen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der weiteren Mikrosporidienart um eine nicht oder nur schwierig kultivierbare Mikrosporidienart handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine nicht oder nur schwierig kultivierbare Mikrosporidienart Enterocytozoon bieneusi ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNA zur Gewinnung der cDNA aus einer kultivierbaren Mikrosporidienart stammt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine kultivierbare Mikrosporidienart Encephalitozoon cuniculi ist.

14. Verfahren zum Gewinnen von Mikrosporidienantigenen, mit den Schritten:
Gewinnen einer cDNA, die für ein Mikrosporidienantigen kodiert, aus der mRNA einer Mikrosporidienkultur;
ausgehend von dieser cDNA Gewinnen von Nukleinsäuresonden oder PCR-Primern für homologe Genabschnitte einer weiteren Mikrosporidienart;
damit Gewinnen des homologen Genabschnitts der weiteren Mikrosporidienart durch Hybridisierung mit der Nukleinsäuresonde oder in einer PCR-Amplifikation;
Gewinnen gentechnisch hergestellter Antigene der weiteren Mikrosporidienart durch Expression des homologen Genabschnitts.

15. Verfahren zum Gewinnen von Mikrosporidienantigenen, mit den Schritten:
Gewinnen einer cDNA, die für ein Mikrosporidienantigen kodiert, aus der mRNA einer Mikrosporidienkultur;
Hybridisieren der cDNA mit genomischer DNA oder einer cDNA-Bank einer weiteren Mikrosporidienart zum Gewinnen des homologen Genabschnitts der weiteren Mikrosporidienart;
Gewinnen gentechnisch hergestellter Antigene der weiteren Mikrosporidienart durch Expression des homologen Genabschnitts der weiteren Mikrosporidienart.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Mikrosporidienart eine nicht, oder nur schwierig, kultivierbare Mikrosporidienart ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Mikrosporidienart Enterocytozoon bieneusi ist.

18. Reagenziensatz zum Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen, mit:
gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen, die über eine cDNA-Bank aus einer Mikrosporidienkultur gewonnen werden, oder
Antikörpern, die durch Immunisierung mit diesen gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen gewonnen werden.

19. Reagenziensatz zum Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen, mit:
gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen, die nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 gewonnen werden, oder
Antikörpern, die durch Immunisierung mit diesen gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen gewonnen werden.

20. Reagenziensatz nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Komponenten zur Durchführung eines ELISA vorhanden sind.

21. Verwendung von gentechnisch hergestellten Mikrosporidienantigenen zum Nachweis von Mikrosporidien und Mikrosporidieninfektionen, wobei die Mikrosporidienantigene durch Expression von Genen, oder Teilen davon, aus einer cDNA-Bank von einer Mikrosporidienkultur oder gemäß den Ansprüchen 14 bis 17 gewonnen werden.