FR2780978A1 - Proteines de tube polaire de microsporidie, acides nucleiques codant pour ces proteines et leurs applications - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire (PTPs) de microsporidie et plus particulièrement les protéines dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No : 1, et SEQ ID No : 2, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci.La présente invention a également pour objet les gènes codant ces protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.
Description
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PROTEINES DE TUBE POLAIRE DE MICROSPORIDIE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS.
L'invention a pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire (PTPs) de microsporidie ainsi que les gènes codant ces protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.
E. cuniculi est une microsporidie, parasite intracellulaire obligatoire, fréquente chez de nombreux mammifères et impliquée dans diverses infections chez l'homme principalement chez les sujets immunodéprimés.
De manière générale, les microsporidies sont responsables chez les patients sidéens de pathologies digestives, mais aussi d'atteintes oculaires, musculaires, hépatiques, de rhinosinusites et d'infections systémiques (1). Des tests sérologiques ont également montré la présence importante des microsporidies chez les patients immunocompétents, puisque atteignant 8% de la population (2).
Actuellement, 4 genres de microsporidie sont responsables de maladies humaines : Enterocytozoon, Encephalitozoon, Vittaforma et Trachipleistophora. L'émergence de ces parasites en pathologie humaine suscite de la part des chercheurs un intérêt grandissant dans les domaines systématique, épidémiologique, clinique, du diagnostic et de la thérapeutique.
Actuellement, le diagnostic repose sur des tests PCR à partir d'oligonucléotides déterminés d'après les séquences d'ADN ribosomal, seules séquences connues chez la plupart des microsporidies. La thérapeutique, quant à elle, est limitée à l'utilisation de certaines molécules telles que l'albendazole ou la fumagilline.
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Ces eucaryotes unicellulaires présentent un mécanisme d'invasion unique. La spore, stade infectieux, renferme en effet un appareil d'extrusion constitué d'un tube polaire inséré à son extrémité antérieure dans un disque d'ancrage. Sous l'effet de certains stimuli, pouvant être liés in vitro à une variation du pH, à l'osmolarité, à la présence de cations ou d'anions, le tube polaire est extrudé de la spore microsporidienne et traverse la membrane plasmique d'une cellule-hôte. Le sporoplasme, expulsé à travers ce tube, est ainsi inoculé dans la cellule réceptrice. Cet appareil invasif, spécifique des microsporidies et unique dans le monde vivant, suscite donc un intérêt à la fois d'un point de vue fondamental mais aussi appliqué pour le diagnostic et la thérapeutique.
A ce jour, aucune séquence complète de protéines constituant ce tube polaire n'a été obtenue.
Selon Weidner (3) le tube polaire serait constitué d'une seule protéine de 23 kDa chez Ameson michaelis. Plus récemment, chez une microsporidie parasite de poisson, Glugea americanus, une extraction différentielle des protéines en présence d'un agent réducteur (DTT) a permis de mettre en évidence qu'une protéine de 43 kDa est constitutive du tube polaire, mais seule une partie de la séquence N-terminale de 16 acides aminés a été déterminée (4).
La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux a également été réalisée contre le tube polaire de différentes espèces (5,6, 7), montrant une possible hétérogénéité protéique de cette structure.
Les travaux de recherche ayant conduit à la présente invention ont tout d'abord consisté à produire des anticorps polyclonaux et monoclonaux contre le tube polaire d'E. cuniculi. Il a ainsi obtenu 2 anticorps polyclonaux (anti-55 kDa et anti-35 kDa) et un anticorps
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monoclonal (anti-55 kDa) réagissant spécifiquement avec le tube polaire en immunofluorescence et en microscopie électronique (6). Après séparation des protéines sporales par électrophorèse en 2 dimensions et transfert sur membrane PVDF une protéine ayant une masse moléculaire apparente proche de 55kDa et un point isoélectrique de 5 était reconnue par ces trois types d'anticorps. Sur ces gels de 2 dimensions, une autre protéine de masse moléculaire apparente proche de 35 kDa et avec un point isoélectrique de 9 était également reconnue par 2 anticorps anti-tube polaire, l'anticorps polyclonal anti-35 kDa et l'anticorps monoclonal.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis, pour la première fois, d'obtenir des protéines complètes de tube polaire de microsporidie. Les travaux présentés par les Inventeurs à l'occasion d'un congrès (Fifth International Workshops on Opportunitic Protists and Fifth General Meeting of the European Concerted Action on Pneumocystis Research, Lille 3-7 septembre 1997) sur l'obtention d'une protéine de tube polaire de 55 kDa sont insuffisants pour effectivement permettre l'obtention de cette protéine complète et purifiée et pour identifier, cloner et séquencer le gène correspondant. En effet, aucune donnée de séquence nucléique ou protéique n'apparaît dans le document relatant ce congrès (8). Le protocole expérimental qui y figure comprend des étapes classiques et bien connues de l'homme du métier (9), telles que l'extraction des protéines sporales, les électrophorèses (SDS-PAGE), la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux, le microséquençage de peptides ainsi que la détermination d'amorces dégénérées et leur amplification par PCR.
Compte-tenu du caractère synthétique du document relatant ce congrès, son enseignement est insuffisant
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pour permettre à l'homme du métier de reproduire les travaux des Inventeurs et de mettre en évidence la séquence complète d'une protéine complète de tube polaire de microsporidie.
L'invention a donc pour objet une protéine complète purifiée de tube polaire de microsporidie et plus particulièrement de la microsporidie E. cuniculi.
Plus particulièrement l'invention concerne : - une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 55 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 5, - une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 35 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 9.
Dans un second temps, les travaux réalisés sur les deux protéines purifiées ci-dessus ont consisté à les soumettre à un microséquençage interne après digestion par l'Endolysine C. Deux peptides ont ainsi été séquences (P1 ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ et P2 SATQYAMEACATPTP) pour la protéine de 55 kDa et un peptide P3: AVQGTDRCILAGIID) pour la protéine de 35 kDa, et ont permis à partir d'amorces dégénérées d'amplifier une partie des gènes correspondants.
En l'absence de banque génomique, les Inventeurs ont réussi à déterminer les séquences des gènes et leurs régions flanquantes par une technique de SSP-PCR (10). Ces différentes étapes ont permis de définir la structure complète des gènes, leurs particularités ainsi que les similitudes éventuelles avec d'autres gènes. Les structures primaires des protéines de 55 et 35 kDa ont également été déterminées.
L'invention concerne donc les protéines de tube polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en
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annexe sous les numéros SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No:2, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci.
On entend par dérivé fonctionnellement équivalent, les protéines dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie pas la fonction de ces protéines. De tels dérivés peuvent être analysés par l'homme du métier selon les techniques : - de criblage de banques d'expression à l'aide d'anticorps dirigés contre les protéines du tube polaire, ou - de criblage de banques génomiques à l'aide de sondes nucléiques capable de s'hybrider à un gène codant pour une protéine du tube polaire.
La protéine de 395 acides aminés, ci-après désignée PTP55, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No: 1 correspond à la protéine de 55 kDa. Elle présente une masse moléculaire déduite de 39 609 Da et de 37 230 Da sans le peptide signal, qui est inférieure à celle de 55 000 observée sur gels de polyacrylamide. Cette protéine est synthétisée par E. cuniculi sous là forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est éliminée lors du ciblage vers des vésicules impliquées dans la formation du tube polaire. La séquence d'une protéine mature du tube polaire de l'invention correspond donc à la séquence comprise entre les acides aminés en position 23 et 395 de SEQ ID No:l.
Plusieurs caractéristiques de peptide signal sont en effet observées : - structure secondaire prédite comme formant une hélice a,
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- présence d'acides aminés hydrophobes ainsi que de résidus basiques proches de la partie Nterminale, - absence d'un résidu lysine en position 22, et - prédiction de peptide signal par l'algorithme de von Heijne (11).
De plus, le séquençage N-terminal de la protéine a montré une séquence identique à celle du peptide P1, confirmant que le peptide de 22 acides aminés était clivé lors de la maturation.
On observe en outre que la PTP55 ne contient pas de résidus tryptophane, phénylalanine, ni arginine.
Elle présente un point isoélectrique déduit de 4,7 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre de 5. L'étude de ces séquences de 395 acides aminés et de 373 acides aminés dans la protéine mature, montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'autres protéines déjà décrites dans les banques de données.
La protéine de 277 acides aminés, désignée ci-après PTP35, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2 correspond à la protéine de 35 kDa. Elle présente une masse moléculaire déduite de 30 075 Da, inférieure donc à celle de 35 000 observée sur gels de polyacrylamide. L'extrémité Nterminale de la PTP35 présente également des caractéristiques de peptide signal : - structure secondaire prédite comme formant une hélice a, - présence d'acides aminés hydrophobes ainsi que de résidus basiques, prédiction de peptide signal par l'algorithme de von Heijne (11).
De la même manière que pour la PTP55, la PTP 35 d'E. cuniculi présenterait un peptide signal. Des
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sites potentiels de clivage protéolytiques peuvent être prédits entre les résidus 12 et 13,13 et 14 ou 22 et 23. Cependant un tel clivage ne pourrait être confirmé que par le séquençage de la partie N-terminale de la protéine. Sur la base des données disponibles, la séquence d'une protéine de tube polaire selon l'invention est comprise entre les acides aminés 1 et 277 de la séquence donnée en annexe sous le numéro SEQ ID No :2.
La PTP35 ne contient pas de résidus tryptophane. Elle présente un point isoélectrique déduit de 8,6 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre de de 9. L'étude de cette séquence de 277 acides aminés montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'autres protéines déjà décrites dans les banques de données.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine de l'invention ou un fragment de celles-ci peuvent être préparés par les méthodes décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection des protéines, extraites à partir des spores d'E. cuniculi ou produites par transformation d'un hôte, à des animaux, puis récupération des antisérums et des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention. Ces anticorps sont utiles pour rechercher d'autres protéines de tubes polaires d'E. cuniculi, d'E. hellem ou d'E. intestinalis. et pour étudier la parenté entre les protéines de tubes polaires de différentes espèces, voire de différents genres. En
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effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E. intestinalis ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions immunologiques croisées avec les protéines du tube polaire d'E. cuniculi. Mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine diagnostique.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidie du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes : a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'invention sur un support d'analyse tel qu'une feuille de nitrocellulose ou une plaque ELISA, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, par exemple en présence de lait écrémé 5%, c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum du sujet à tester, de manière à ce que, si le sérum contient des anticorps dirigés contre une protéine de tube polaire de microsporidie, ceux-ci se complexent à ladite protéine, d) on élimine par lavage les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c), e) on incube le produit de l'étape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, comme par exemple un enzyme tel que la péroxydase ou à un fluorochrome, f) on élimine par lavage les anticorps antihumains qui ne sont pas liés spécifiquement et g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum protéine formés à l'étape (e).
Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est constitué par :
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- un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinantes de tube polaire de microsporidie, - une solution contenant des anticorps antihumains couplés à une molécule permettant leur révélation, et une notice comportant les étapes du procédé de diagnostic décrit plus haut.
L'invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire de microsporidie. Plus particulièrement, l'invention se rapporte aux séquences nucléotidiques codant pour les protéines de PTP55 et PTP35 correspondant respectivement aux protéine de 55 et 35 kDa de la microsporidie E. cuniculi.
L'invention envisage à titre spécifique, une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No:2 un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine PT55 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acide nucléique comprend la séquence comprise entre les nucléotides 411 et 1532 de SEQ ID No:l ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique de SEQ ID N0:1 est composée de 1830 nucléotides et comprend un cadre de lecture ouvert de 1188 paires de bases allant de la position 345 (codon d'initiation ATG) à la position 1532 (codon stop TAG).
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La région précédant la position 345 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PT55 telle qu'une région promotrice.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine PTP35 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acide nucléique comprend la séquence comprise entre les nucléotides 458 et 1291 de SEQ ID No:2 ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique II de l'invention est composée de 1740 nucléotides et comprend un cadre de lecture ouvert de 834 paires de bases allant de la position 458 (codon d'initiation ATG) à la position 1291 (codon stop TAA).
La région précédant la position 458 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PT35 telle qu'une région promotrice.
L'invention concerne les molécules d'acide nucléique dont les séquences nucléotidiques sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO: 2 ainsi que toutes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider avec celles-ci. En effet, l'invention concerne bien entendu aussi les séquences nucléotidiques dérivées de SED ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 par exemple du fait de la dégénérescence du code génétique, et qui code pour des protéines présentant des caractéristiques de tube polaire de microsporidie.
L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine de tube polaire de microsporidie de l'invention ou d'un fragment de celle-ci. La préparation de ces vecteurs
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ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des protéines de l'invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie, - à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression desdites protéines.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide.
L'invention concerne donc aussi les hôtes cellulaires et plus particulièrement les bactéries transformées comme E. coli, exprimant des protéines de tube polaire de microsporidie obtenues conformément aux procédés précédents.
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L'invention concernent également les sondes nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des molécules d'acide nucléique de l'invention.
Ces sondes, avantageusement marquées, sont utiles pour la détection par hybridation de séquences similaires chez d'autres microsporidies. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique. Différentes techniques d'hybridation peuvent être mises en oeuvre telles que l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur répliques (technique de Southern) ou autres techniques (DNA chips). De telles sondes constituent des outils permettant de détecter rapidement des séquences similaires dans les gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie ce qui permettrait d'étudier l'origine et la conservation de ces protéines constituant le tube polaire.
Les oligonucléotides sont utiles pour des expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes dans d'autres microsporidies ou dans un but de diagnostic.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par des microsporidies, comprenant les étapes suivantes : a) on extrait de l'ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques provenant des urines, des selles, ou d'une biopsie, b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen approprié tel qu'une PCR à l'aide d'oligonucléotides spécifiques déduits des séquences des gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, c) on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide
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d'une sonde nucléotidique marquée spécifique d'une microsporidie.
Il est possible de réaliser l'étape (c) par fixation des produits d'amplification sur un support d'analyse, tel qu'une membrane ou une plaque ELISA.
Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un tel procédé est constitué par - les moyens nécessaires à l'amplification des séquences codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, tels que des oligonucléotides spécifiques de ces séquences, et tous les autres éléments nécessaires à la réalisation d'une PCR.
- un support d'analyse pour fixer les produits de l'amplification, et - des sondes marquées spécifiques d'une microsporidie-
L'invention se rapporte également à des compositions vaccinales capables de prévenir les infections provoquées par les microsporidie du genre Encephalitozoon comprenant à titre de principe actif une protéine de l'invention ou un fragment de celle-ci en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention se rapporte également à des compositions vaccinales capables de prévenir les infections provoquées par les microsporidie du genre Encephalitozoon comprenant à titre de principe actif une protéine de l'invention ou un fragment de celle-ci en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E. intestinalis ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions immunologiques croisées avec des protéines de tube polaire d'E. cuniculi, l'invention fournit avantageusement un vaccin potentiel contre les infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la production d'anticorps contre le
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tube polaire, le clonage et le séquençage des gènes codant pour des protéines de tube polaire chez E. cuniculi, et qui se rapportent aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 montre : # A : la séparation électrophorétique des protéines sporales par SDS-PAGE avec sur la piste 1 la fraction soluble dans SDS 2%, 2-mercaptoéthanol 10%, et sur la piste 2 la fraction résiduelle obtenue après incubation dans du 2-mercaptoéthanol 50% pendant 48 heures.
La figure 1 montre : # A : la séparation électrophorétique des protéines sporales par SDS-PAGE avec sur la piste 1 la fraction soluble dans SDS 2%, 2-mercaptoéthanol 10%, et sur la piste 2 la fraction résiduelle obtenue après incubation dans du 2-mercaptoéthanol 50% pendant 48 heures.
# B : l'analyse par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre la bande de 55 kDa séparée par SDS-PAGE (dilution 1/50e) sur des cellules MRC-5 infestées par Encephalitozoon cuniculi. Les spores avec leur tubes polaires extrudés sont fortement marquées.
# C : l'immunoblot avec l'anticorps polyclonal anti-55kDa (dilution 1/5000e, piste 1) et l'anticorps monoclonal Ec 102 (dilution 1/10000e, piste 2). Les marqueurs de poids moléculaires (M) sont indiqués sur la gauche et sont donnés en kDa. Les blots ont été révélés en utilisant un kit ECL (Amersham).
- La figure 2 montre l'immunoréactivité de la protéine de 55 kDa. L'électrophorèse sur gel deux dimensions a été réalisée en utilisant l'isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels de 12% dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec les anticorps polyclonaux dirigé contre le spot acide de 55 kDa (dilution 1/5000e) isolé par électrophorèse 2D (B).
Les poids moléculaires sont indiqués en kDa et les points isoélectriques numérotés de 4 à 8.
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On observe en (C) le marquage spécifique des tubes polaires extrudés en immunofluorescence avec ce même anticorps.
- la figure 3 illustre l'expression de la PTP55 chez Escherichia coli. On distingue en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP55. La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni-NTA.
On distingue en B un immunoblotting avec les sérums dirigés contre la PTP55 recombinante (dilution 1/1000e). Sur la piste 1, les protéines d'E. coli 4 heures après induction IPTG ; su la piste 2 les protéines d'Encephalitozoon cuniculi.
On distingue en C un marquage en immunofluorescence indirecte, avec les antisérums dirigés contre la PTP55 recombinante des tubes polaires d'E.cuniculi. Les tubes polaires extrudés sont indiqués par des flèches.
On distingue en D un immunomarquage à l'or colloïdal en microscopie électronique à transmission des sections de tube polaire.
La figure 4 montre un immunomarquage réalisé sur des gels d'électrophorèse en 2 dimensions avec l'anticorps monoclonal dirigé contre le tube polaire.
L'électrophorèse sur gel de deux dimensions a été réalisée en utilisant l'isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels de 12% dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec l'anticorps monoclonal (dilution 1/5000e) (B) . Les spots de 55 et 35 kDa sont indiqués par des flèches.
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La figure 5 illustre l'expression de la PTP35 chez Escherichia coli. La figure 5 montre : - en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30PTP35.. La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni-NTA.
Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués en kDa - en B, un immunoblotting avec les sérum dirigés contre la PTP35 recombinante (dilution 1/1000ème)
Sur la piste 1 on distingue le profil électrophorétique d'Encephalitozoon cuniculi coloré au bleu de Coomassie.
Sur la piste 1 on distingue le profil électrophorétique d'Encephalitozoon cuniculi coloré au bleu de Coomassie.
Sur la piste 2 est illustré le marquage d'une protéine de 35 kDa d'E. cuniculi avec l'anticorps dirigé contre la protéine recombinante de 35 kDa exprimée chez Escherichia coli.
- en C, le marquage en immunofluorescence indirecte, avec les antisérums dirigés contre la PTP35 recombinante, des tubes polaires d'E. cuniculi. La flêche indique un tube polaire extrudé.
1) Production d'anticorps contre le tube polaire d'E. cuniculi, analyses immunocytochimiques.
La souche d'E. cuniculi utilisée est un isolat de souris. Elle est entretenue sur culture cellulaire MDCK. Les spores libérées dans le surnageant de culture sont récupérées et stockées à 4 C dans du PBS. L'extraction des protéines sporales est réalisée par broyage des spores avec des billes de zirconium (0.1mm de diamètre) dans un tampon contenant 2.5% de SDS et 10% de 2-mercaptoéthanol en présence d'inhibiteurs de protéases. Après dénaturation par la chaleur 10 minutes
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à 100 C, les débris sporaux sont éliminés par centrifugation à 18000g pendant 5 minutes. Les protéines sont ensuite séparées par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide 12%.
Pour l'electrophorèse en 2 dimensions, les échantillons protéiques sont solubilisés dans un tampon à base d'urée 9M, de 2-mercaptoéthanol 5% et de CHAPS 40mM. L'isoélectrofocalisation est réalisée dans les conditions suivantes : heures à 400 V, 30 minutes à 600 V puis 30 minutes à 800 V avec la combinaison d'ampholines (Pharmacia) 40% pH 3-10, 60% pH 4-6.5.
Après équilibration des gels de première dimension dans du SDS 2-mercaptoéthanol pendant 10 minutes, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire par SDS-PAGE. Les gels correspondants sont colorés soit à l'argent soit au bleu de Coomassie, ou transférés sur membrane PVDF (Immobilon P, Polylabo) en utilisant un système semi-sec.
Les anticorps polyclonaux ont été produits contre différentes protéines d'E. cuniculi séparées par électrophorèse. Des injections intrapéritonéales sont réalisées chez des souris BALB/c pour chaque échantillon protéique. La bande protéique de 55 kDa a également été utilisée pour produire des anticorps monoclonaux. Ainsi, 3 anticorps dirigés contre le tube polaire ont été obtenus : 2 anticorps polyclonaux anti-35 kDa et anti-55 kDa et un anticorps monoclonal anti-55 kDa.
L'immunoblotting, l'immunolocalisation en IFA et en microscopie électronique à transmission sont réalisés selon les techniques classiques.
2) Microséquençage de PTPs de masses moléculaires apparentes 55 kDa et 35 kD.
La séquence N-terminal ainsi que 2 peptides internes (P1 et P2) ont été séquences pour la PTP55.
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N-terminal : ATALCSNAYG
P1 : ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ P2 : SATQYAMEACATPTP
Un peptide interne (P3) a été séquence pour la PTP35.
P1 : ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ P2 : SATQYAMEACATPTP
Un peptide interne (P3) a été séquence pour la PTP35.
P3 : AVQGTDRCILAGIID
Ces séquences ont été réalisées à partir des protéines de 55 kDa et de 35 kDa isolées par électrophorèse en 2 dimensions, par le laboratoire de microséquençage des protéines, Institut Pasteur, Département des biotechnologies.
Ces séquences ont été réalisées à partir des protéines de 55 kDa et de 35 kDa isolées par électrophorèse en 2 dimensions, par le laboratoire de microséquençage des protéines, Institut Pasteur, Département des biotechnologies.
Pour le séquençage interne des peptides P1, P2 et P3, les protéines ont été préalablement digérées par l'Endolysine C, enzyme protéolytique coupant après un résidu lysine.
3) Amplification PCR, clonage et séquencaqe des gènes codant pour les PTPs. a) Gène codant pour la PTP55.
A partir d'amorces dégénérées déduites des peptides P1 et P2, un fragment d'ADN d'environ 1 kpb a été amplifié, clone dans un vecteur plasmidique pCR2 (Invitrogen, TA cloning vector) et séquence selon la méthode de Sanger (12). L'amplification des régions 5' et 3' du gène de la PTP a été réalisée par une technique de PCR (SSP-PCR). L'analyse des séquences est réalisée sur le serveur de biologie moléculaire Infobiogen.
La séquence complète représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 comprend 1830 nucléotides et comporte un cadre de lecture de 1188pb. Ce dernier contient 395 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-T. La séquence en
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acides aminés traduite est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1. b) Gène codant pour la PTP35.
A partir d'amorces dégénérées déduites du peptide P3, différents fragments ont été amplifiés par la technique de SSP-PCR, clonés dans un vecteur plasmidique pGEMT (Promega, TA cloning vector), séquences selon la méthode de Sanger et analysés comme décrit ci-dessus.
La séquence complète représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2 comprend 1740 nucléotides. Le cadre de lecture comporte 834 pb. Ce dernier contient 277 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAA. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-T, similaire à celle de la PTP55. La séquence d'acides aminés traduite est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
4) Expression des PTPs chez Escherichia coli.
Une partie de la PTP55 correspondant à la région entre les peptides P1 et P2 a été clonée dans un vecteur d'expression pQE30 (Qiagen) et exprimée chez E. coli (souche M15). La protéine recombinante a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonnes de nickel et injectée à des souris. Les anticorps correspondants testés en immunoblotting, immunofluorescence et en microscopie électronique à transmission ont permis de confirmer que cette protéine était bien localisée au niveau du tube polaire d'E. cuniculi.
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Une partie de la PTP35 entre les résidus 27 et 277 a également été exprimée chez E. coli selon la même technique. Les anticorps produits contre cette protéine recombinante ont montré un marquage du tube polaire.
5) Analyse des séquences primaires des PTP55 et PTP35.
L'analyse Blast n'a montré aucune homologie significative avec d'autres protéines connues, si ce n'est avec le collagène, principalement dû au fait que la PTP55 est riche en résidus glycine et proline. a) La PTP55 est riche en résidus proline, glycine, glutamine, sérine et thréonine qui représentent à eux 5 plus de 55% du contenu en acides aminés. Le site de clivage (entre les résidus sérine et alanine) proposé est prédit comme tel par les caractéristiques suivantes: - absence de résidu lysine en position 22 précédant le peptide P1 séquence (23-42) après digestion de la protéine par l'Endolysine C, - séquençage N-terminal de la protéine correspondant à celui du peptide P1, - présence d'acides aminés hydrophobes dans cette région N-terminal, - algorithme de von Heijne, - structure secondaire en hélice a.
La PTP est vraisemblablement synthétisée par E. cuniculi sous forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est éliminée lors de la maturation. La protéine mature aurait donc une masse moléculaire de 37230 Da.
Des sites de N-glycosylation (NETS, NGTS et NISG) sont présents dans la séquence. La présence de
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nombreux résidus sérine et thréonine (21,6%) laisse également supposer des sites de O-glycosylation.
La région centrale de la protéine PTP55 est caractérisée par 4 répétitions en tandem de 26 acides aminés chacune avec une conservation au niveau nucléique. Cette région est partiellement encadrée par 2 autres répétitions de 9 acides aminés. b) La PTP35 est particulièrement riche en résidus lysine (11,5%) et acide glutamique (9%). 3 sites de clivages potentiels d'une séquence signal sont représentés entre les résidus 12 et 13, 13 et 14, et 22 et 23. Une séquence RGD est présente dans la PTP35, séquence que l'on retrouve dans des protéines telles que la fibronectine et qui intervient dans des phénomènes d'attachement cellulaire. Un site potentiel de Nglycosylation (NSTS) est également présent dans la séquence.
6) Localisation chromosomiaue et estimation du nombre de copies.
L'hybridation d'une sonde, correspondant à une partie du gène codant pour la PTP55, sur les chromosomes d'E. cuniculi séparés par électrophorèse en champs pulsé a montré une localisation unique de ce gène sur le chromosome VI.
La même sonde a été appliquée sur des Southern après digestion de l'ADN génomique d'E. cuniculi par différentes enzymes de restriction : Une seule bande est marquée sur chaque profil de digestion, ce qui permet d'affirmer que le gène existe en une seule copie.
Le gène codant pour la PTP35 est également localisé sur le chromosome VI.
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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LISTE DE SÉQUENCES (1) INFORMATION GÉNÉRALES: (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRIN : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT: (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES : ID NO: 1 : GAATTCAGAT GCCTCATACC TTGGGATTAA AAAATTGATG TTCATTTGTT ATATATCCTG 60 GGCGGACAGG CCGGCTCGTA TTCTTCAGGG GTGTCGCCTA CCCAGTGCAC AGGAGGTTCC 120 GGAGGTGTCT TGGATGGAAA GTAAGGCCAT TTGTGGGTTC TCATCCATGT CATCGTCCCT 180 TTCGGCTGTT TCACCAAGAT CCAATTATTC CTCCAGGACT TTCAACCCTC AGAATGGAAA 240 CAGAGATGAA ACTCTCTGTG CAAATCGTAG ATATCGATTG GAGACATTGA AACCACGGAG 300 TTTGAAATAA AAGTATAAAT ACCTCCGAAA ACGCAGAGTT TAAG ATG AAA GGT ATT 356
Met Lys Gly Ile
1 TCT AAG ATC CTC TCT GCC TCT ATT GCC CTG ATG AAG TTG GAG AAT GTC 404 Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ser Ile Ala Leu Met Lys Leu Glu Asn Val 5 10 15 20 TAT TCA GCA ACC GCA CTG TGC AGC AAT GCA TAT GGC CTA ACT CCG GGA 452 Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Cys Ser Asn Ala Tyr Gly Leu Thr Pro Gly
25 30 35 CAA CAG GGT ATG GCT CAG CAG CCG TCG TAT GTG CTG ATC CCC AGC ACC 500 Gln Gln Gly Met Ala Gln Gln Pro Ser Tyr Val Leu Ile Pro Ser Thr
40 45 50 CCG GGA ACC ATA GCA AAC TGT GCA AGC GGT TCA CAG GAC ACA TAT TCT 548 Pro Gly Thr Ile Ala Asn Cys Ala Ser Gly Ser Gln Asp Thr Tyr Ser
55 60 65 CCT TCT CCC GCT GCA CCC ACA TCT CCA GTG ACT CCG GGG AAA ACT AGC 596 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Val Thr Pro Gly Lys Thr Ser
70 75 80 GAG AAT GAG ACA TCT CCA TCG GCT CCT GCA GAA GAT GTA GGA ACA TGC 644 Glu Asn Glu Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Val Gly Thr Cys 85 90 95 100
Met Lys Gly Ile
1 TCT AAG ATC CTC TCT GCC TCT ATT GCC CTG ATG AAG TTG GAG AAT GTC 404 Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ser Ile Ala Leu Met Lys Leu Glu Asn Val 5 10 15 20 TAT TCA GCA ACC GCA CTG TGC AGC AAT GCA TAT GGC CTA ACT CCG GGA 452 Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Cys Ser Asn Ala Tyr Gly Leu Thr Pro Gly
25 30 35 CAA CAG GGT ATG GCT CAG CAG CCG TCG TAT GTG CTG ATC CCC AGC ACC 500 Gln Gln Gly Met Ala Gln Gln Pro Ser Tyr Val Leu Ile Pro Ser Thr
40 45 50 CCG GGA ACC ATA GCA AAC TGT GCA AGC GGT TCA CAG GAC ACA TAT TCT 548 Pro Gly Thr Ile Ala Asn Cys Ala Ser Gly Ser Gln Asp Thr Tyr Ser
55 60 65 CCT TCT CCC GCT GCA CCC ACA TCT CCA GTG ACT CCG GGG AAA ACT AGC 596 Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Val Thr Pro Gly Lys Thr Ser
70 75 80 GAG AAT GAG ACA TCT CCA TCG GCT CCT GCA GAA GAT GTA GGA ACA TGC 644 Glu Asn Glu Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Val Gly Thr Cys 85 90 95 100
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AAG ATT GCC GTA TTG AAG CAC TGC GAC GCA CCA GGA ACA ACA TCA GGG 692 Lys Ile Ala Val Leu Lys His Cys Asp Ala Pro Gly Thr Thr Ser Gly
105 110 115 ACG ACA CCA GGG TCA GGG CCT TGT GAA ACC CCA GAG CAG CAA CAG CCT 740 Thr Thr Pro Gly Ser Gly Pro Cys Glu Thr Pro Glu Gln Gln Gln Pro
120 125 130 TTG TCA GTG ATC TCC ACC ACT CCT GCC GTA CCG GTG ACT GTG GAG TCT 788 Leu Ser Val Ile Ser Thr Thr Pro Ala Val Pro Val Thr Val Glu Ser
135 140 145 GCA CAG TCT CCA TCT GTT GTG CCA GTT GTT CCT GTC GTT GCT CAC CAC 836 Ala Gln Ser Pro Ser Val Val Pro Val Val Pro Val Val Ala His His
150 155 160 CAG GCA GTT CCA GGC TAC TAC AAC AAT GGA ACA TCC GGT ATT CCT GGA 884 Gln Ala Val Pro Gly Tyr Tyr Asn Asn Gly Thr Ser Gly Ile Pro Gly 165 170 175 180 CAG CAA CAG ATC CTT TCT GGC ACT CTT CCC CCA GGA GCC ACT TTG TGT 932 Gln Gln Gln Ile Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Gly Ala Thr Leu Cys
185 190 195 CAG GGA CAG GCC ATG CCT AGC ACT CCT GGA CAG CAA CAG ATC CTT TCT 980 Gln Gly Gln Ala Met Pro Ser Thr Pro Gly Gln Gln Gln Ile Leu Ser
200 205 210 GGC ACT CTT CCC CCA GGG GTC ACT TTG TGT CAG GGA CAG GCC ACG CCT 1028 Gly Thr Leu Pro Pro Gly Val Thr Leu Cys Gln Gly Gln Ala Thr Pro
215 220 225 AGC ACT CCT GGG CAG CAA CAG GTC CTT TCT GGC ACT CTT CCC CCA GGA 1076 Ser Thr Pro Gly Gln Gln Gln Val Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Gly
230 235 240 GTC ACT TTG TGT CAG GGA CAG GCC ACG CCT AGC ACT CCT GGG CAG CAA 1124 Val Thr Leu Cys Gln Gly Gln Ala Thr Pro Ser Thr Pro Gly Gln Gln 245 250 255 260 CAG GTC CTT TCT GGC ACC CTT CTC CCA GGA GCC ACT TTG TGT CAG GAT 1172 Gln Val Leu Ser Gly Thr Leu Leu Pro Gly Ala Thr Leu Cys Gln Asp
265 270 275 CAA GGT ATG CCT GGA ACA TCC GGA GTT CCT GGA CAG CAG GGA CAG TCT 1220 Gln Gly Met Pro Gly Thr Ser Gly Val Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser
280 285 290 AGT GGA CAG TGT TGT GCC CCT CAG ATT CCA AAC CCT GTC ATG CCG CCA 1268 Ser Gly Gln Cys Cys Ala Pro Gln Ile Pro Asn Pro Val Met Pro Pro
295 300 305 TCC ATG AAC ATT AGT GGA AAT GGG TAT CCT TCT TCT ACC GCA TAC AGC 1316 Ser Met Asn Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Ser
310 315 320 CCA AAC CTC GGA TCA CTG GGA TCC TGT GTT GAC ATA CAG AAG ACG GGG 1364 Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gly Ser Cys Val Asp Ile Gln Lys Thr Gly @
105 110 115 ACG ACA CCA GGG TCA GGG CCT TGT GAA ACC CCA GAG CAG CAA CAG CCT 740 Thr Thr Pro Gly Ser Gly Pro Cys Glu Thr Pro Glu Gln Gln Gln Pro
120 125 130 TTG TCA GTG ATC TCC ACC ACT CCT GCC GTA CCG GTG ACT GTG GAG TCT 788 Leu Ser Val Ile Ser Thr Thr Pro Ala Val Pro Val Thr Val Glu Ser
135 140 145 GCA CAG TCT CCA TCT GTT GTG CCA GTT GTT CCT GTC GTT GCT CAC CAC 836 Ala Gln Ser Pro Ser Val Val Pro Val Val Pro Val Val Ala His His
150 155 160 CAG GCA GTT CCA GGC TAC TAC AAC AAT GGA ACA TCC GGT ATT CCT GGA 884 Gln Ala Val Pro Gly Tyr Tyr Asn Asn Gly Thr Ser Gly Ile Pro Gly 165 170 175 180 CAG CAA CAG ATC CTT TCT GGC ACT CTT CCC CCA GGA GCC ACT TTG TGT 932 Gln Gln Gln Ile Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Gly Ala Thr Leu Cys
185 190 195 CAG GGA CAG GCC ATG CCT AGC ACT CCT GGA CAG CAA CAG ATC CTT TCT 980 Gln Gly Gln Ala Met Pro Ser Thr Pro Gly Gln Gln Gln Ile Leu Ser
200 205 210 GGC ACT CTT CCC CCA GGG GTC ACT TTG TGT CAG GGA CAG GCC ACG CCT 1028 Gly Thr Leu Pro Pro Gly Val Thr Leu Cys Gln Gly Gln Ala Thr Pro
215 220 225 AGC ACT CCT GGG CAG CAA CAG GTC CTT TCT GGC ACT CTT CCC CCA GGA 1076 Ser Thr Pro Gly Gln Gln Gln Val Leu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Gly
230 235 240 GTC ACT TTG TGT CAG GGA CAG GCC ACG CCT AGC ACT CCT GGG CAG CAA 1124 Val Thr Leu Cys Gln Gly Gln Ala Thr Pro Ser Thr Pro Gly Gln Gln 245 250 255 260 CAG GTC CTT TCT GGC ACC CTT CTC CCA GGA GCC ACT TTG TGT CAG GAT 1172 Gln Val Leu Ser Gly Thr Leu Leu Pro Gly Ala Thr Leu Cys Gln Asp
265 270 275 CAA GGT ATG CCT GGA ACA TCC GGA GTT CCT GGA CAG CAG GGA CAG TCT 1220 Gln Gly Met Pro Gly Thr Ser Gly Val Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser
280 285 290 AGT GGA CAG TGT TGT GCC CCT CAG ATT CCA AAC CCT GTC ATG CCG CCA 1268 Ser Gly Gln Cys Cys Ala Pro Gln Ile Pro Asn Pro Val Met Pro Pro
295 300 305 TCC ATG AAC ATT AGT GGA AAT GGG TAT CCT TCT TCT ACC GCA TAC AGC 1316 Ser Met Asn Ile Ser Gly Asn Gly Tyr Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Ser
310 315 320 CCA AAC CTC GGA TCA CTG GGA TCC TGT GTT GAC ATA CAG AAG ACG GGG 1364 Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gly Ser Cys Val Asp Ile Gln Lys Thr Gly @
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GGG ACA TCC TGC GAG CAA AAA CCC GAG AAG TCC GCC ACG CAG TAT GCC 1412 Gly Thr Ser Cys Glu Gln Lys Pro Glu Lys Ser Ala Thr Gln Tyr Ala
345 350 355 ATG GAG GCC TGT GCA ACA CCA ACA CCA ACG GTT ATT ATA GGC AAC AGC 1460 Met Glu Ala Cys Ala Thr Pro Thr Pro Thr Val Ile Ile Gly Asn Ser
360 365 370 GAG TAT CTT GTT GGA CCA GGA ATG TAC AAT GCA ATT AAC TCT CCA TGC 1508 Glu Tyr Leu Val Gly Pro Gly Met Tyr Asn Ala Ile Asn Ser Pro Cys
375 380 385 AAC ACT GCT GTC CAA TGC TGC TAG GCTAAAATAA AACGAGTTTA ATCTTCTTTT 1562 Asn Thr Ala Val Gln Cys Cys
390 395 TCTTCGGTCT TTTGGAACGT TGGATGGGGA TGGAGGAGTC TATGGGCTGA AGTGAAATGC 1622 CAACACTTCT TCTGCCCAAG AACACATTCG GATGTTCTTC CTGTGGCCAG GAGTTTGGTA 1682 ACAGGATTCC CCGAGGATTT AGCAGCCTTG GAGTACCATG ATTGAATCAG TATTAAACTT 1742 CTCAAATTAT TTTATTCTTT CTGTTTTATA TCCCGAGCCA ATCTGAGAAG AATGCCTCGA 1802 ATTCAAGCTC CCTTAGAAGT GTGGGATC 1830 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2 : (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRIN : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN(ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES : ID NO:2 : AAGCTTCTGA ACAAGCGCTA ACCCTCTTTC AGAATATATA AAGCAATCCA TACAACTTCT 60 CCATCCATCC CGGTGCTGTT TCTTTGGAGG CAAAACAGAG GAGGTGGCGA TATCGATGGT 120 GCATCCATAA TATATACAAG ACACTCCAGG CTGCAACTGA ATCAACACAC TCCATCCCCT 180 CAGGAAGTCG GTAAACTTGC CTTGAAAATA GCCAATGGAT GTCTCCAGGC TTTATACCAT 240 GCACAGCTAT ATCTTGGCCT GAAGTGCACT TTCAGGTGGG GCTTTGTTAC ATTGCGGTGT 300 TTTGGATTAC CTGATATAAT TTGTTACCCA CTGAGTCAAG TCGAAACCAG TAGTCCGCAG 360 ATTTCTAACA GAGAGGAAAG ACTGGAGGTA ATTTGTGGCT TTTGAAACAT GCACAGCAAA 420 ATAAAATATA AAAGAAGCCT TTTGCACACT ACCAAAG ATG TTG TTA CTT CTC GCC 475
Met Leu Leu Leu Leu Ala
345 350 355 ATG GAG GCC TGT GCA ACA CCA ACA CCA ACG GTT ATT ATA GGC AAC AGC 1460 Met Glu Ala Cys Ala Thr Pro Thr Pro Thr Val Ile Ile Gly Asn Ser
360 365 370 GAG TAT CTT GTT GGA CCA GGA ATG TAC AAT GCA ATT AAC TCT CCA TGC 1508 Glu Tyr Leu Val Gly Pro Gly Met Tyr Asn Ala Ile Asn Ser Pro Cys
375 380 385 AAC ACT GCT GTC CAA TGC TGC TAG GCTAAAATAA AACGAGTTTA ATCTTCTTTT 1562 Asn Thr Ala Val Gln Cys Cys
390 395 TCTTCGGTCT TTTGGAACGT TGGATGGGGA TGGAGGAGTC TATGGGCTGA AGTGAAATGC 1622 CAACACTTCT TCTGCCCAAG AACACATTCG GATGTTCTTC CTGTGGCCAG GAGTTTGGTA 1682 ACAGGATTCC CCGAGGATTT AGCAGCCTTG GAGTACCATG ATTGAATCAG TATTAAACTT 1742 CTCAAATTAT TTTATTCTTT CTGTTTTATA TCCCGAGCCA ATCTGAGAAG AATGCCTCGA 1802 ATTCAAGCTC CCTTAGAAGT GTGGGATC 1830 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2 : (i) CARACTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRIN : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN(ix) CARACTERISTIQUES (A) NOM/CLE: (B) EMPLACEMENT : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCES : ID NO:2 : AAGCTTCTGA ACAAGCGCTA ACCCTCTTTC AGAATATATA AAGCAATCCA TACAACTTCT 60 CCATCCATCC CGGTGCTGTT TCTTTGGAGG CAAAACAGAG GAGGTGGCGA TATCGATGGT 120 GCATCCATAA TATATACAAG ACACTCCAGG CTGCAACTGA ATCAACACAC TCCATCCCCT 180 CAGGAAGTCG GTAAACTTGC CTTGAAAATA GCCAATGGAT GTCTCCAGGC TTTATACCAT 240 GCACAGCTAT ATCTTGGCCT GAAGTGCACT TTCAGGTGGG GCTTTGTTAC ATTGCGGTGT 300 TTTGGATTAC CTGATATAAT TTGTTACCCA CTGAGTCAAG TCGAAACCAG TAGTCCGCAG 360 ATTTCTAACA GAGAGGAAAG ACTGGAGGTA ATTTGTGGCT TTTGAAACAT GCACAGCAAA 420 ATAAAATATA AAAGAAGCCT TTTGCACACT ACCAAAG ATG TTG TTA CTT CTC GCC 475
Met Leu Leu Leu Leu Ala
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ATA ACT GCT GTT GTT AGC GCC ACG ATG GTC CAT CCT TCA GCT GTT GTT 523 Ile Thr Ala Val Val Ser Ala Thr Met Val His Pro Ser Ala Val Val
10 15 20 CCA CAG CCC GCA GCA CCT CTC CAT GTC GTT CCC CCA CAG CAG CAA ATG 571 Pro Gln Pro Ala Ala Pro Leu His Val Val Pro Pro Gln Gln Gln Met
25 30 35 GGC ATG GTT AAC GGA TGC ACC AGC AAG AAA CTA GAG GGT GCA GAA ATA 619 Gly Met Val Asn Gly Cys Thr Ser Lys Lys Leu Glu Gly Ala Glu Ile
40 45 50 ATG AGA AGG AAC ATG ATT GAG TGC CAG AAA AGA AGC TCG GAG GCA ACA 667 Met Arg Arg Asn Met Ile Glu Cys Gln Lys Arg Ser Ser Glu Ala Thr 55 60 65 70 AAG GCG ATG ATT GAA AGG GCA AAT GAA AAG GCT GTA GAA TCA TTC AAC 715 Lys Ala Met Ile Glu Arg Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Ser Phe Asn
75 80 85 AAG GAA GTT AGC AAA GGA CCT AGC CAA AAG GAT GGA GGC CAG TGC ATA 763 Lys Glu Val Ser Lys Gly Pro Ser Gln Lys Asp Gly Gly Gln Cys Ile
90 95 100 GAA AAA GCT GTA CAA GGT ACC GAT AGG TGT ATT CTC GCT GGA ATA ATC 811 Glu Lys Ala Val Gln Gly Thr Asp Arg Cys Ile Leu Ala Gly Ile Ile
105 110 115 GAT AAG GCG GTG AAC AAG CGC AAG TAC AGA ATC TCA GAT GTG GAG AAC 859 Asp Lys Ala Val Asn Lys Arg Lys Tyr Arg Ile Ser Asp Val Glu Asn
120 125 130 AGC ACC TCG CTC TAC AGA GGA GAC AAG CTA ATT GCC CTA ATT GTC AAT 907 Ser Thr Ser Leu Tyr Arg Gly Asp Lys Leu Ile Ala Leu Ile Val Asn 135 140 145 150 GTC GAC TAT GGG CTG CAG CCG ATC ACT AAG CCA AAG AAG AAG AAG TCC 955 Val Asp Tyr Gly Leu Gln Pro Ile Thr Lys Pro Lys Lys Lys Lys Ser
155 160 165 AAG ATA ATG GCG AAT CTC CCT CAG CCG AAG AGA GAG ATG TAT TTC AAC 1003 Lys Ile Met Ala Asn Leu Pro Gln Pro Lys Arg Glu Met Tyr Phe Asn
170 175 180 CAA ATC GGT CAG CTT GTT GGA GCA AGA GGA ACG TTC CCC CAG GAA AAC 1051 Gln Ile Gly Gln Leu Val Gly Ala Arg Gly Thr Phe Pro Gln Glu Asn
185 190 195 AAG GAG GAC TGC AAG CCT TGT GAG GGT CCC AAG AAG ACT GTT GAA ACT 1099 Lys Glu Asp Cys Lys Pro Cys Glu Gly Pro Lys Lys Thr Val Glu Thr
200 205 210 ACT TCT GAG AAA TGT AAT CTT GGG TGC GAG CTT AAA GGA ACA TCT GCT 1147 Thr Ser Glu Lys Cys Asn Leu Gly Cys Glu Leu Lys Gly Thr Ser Ala 215 220 225 230 CTG ATA AGC AAG GCC ATA CAG AAG AAG GAA GTC AAG GAC ACG AAG GAA 1195 Leu Ile Ser Lys Ala Ile Gln Lys Lys Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu @
10 15 20 CCA CAG CCC GCA GCA CCT CTC CAT GTC GTT CCC CCA CAG CAG CAA ATG 571 Pro Gln Pro Ala Ala Pro Leu His Val Val Pro Pro Gln Gln Gln Met
25 30 35 GGC ATG GTT AAC GGA TGC ACC AGC AAG AAA CTA GAG GGT GCA GAA ATA 619 Gly Met Val Asn Gly Cys Thr Ser Lys Lys Leu Glu Gly Ala Glu Ile
40 45 50 ATG AGA AGG AAC ATG ATT GAG TGC CAG AAA AGA AGC TCG GAG GCA ACA 667 Met Arg Arg Asn Met Ile Glu Cys Gln Lys Arg Ser Ser Glu Ala Thr 55 60 65 70 AAG GCG ATG ATT GAA AGG GCA AAT GAA AAG GCT GTA GAA TCA TTC AAC 715 Lys Ala Met Ile Glu Arg Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu Ser Phe Asn
75 80 85 AAG GAA GTT AGC AAA GGA CCT AGC CAA AAG GAT GGA GGC CAG TGC ATA 763 Lys Glu Val Ser Lys Gly Pro Ser Gln Lys Asp Gly Gly Gln Cys Ile
90 95 100 GAA AAA GCT GTA CAA GGT ACC GAT AGG TGT ATT CTC GCT GGA ATA ATC 811 Glu Lys Ala Val Gln Gly Thr Asp Arg Cys Ile Leu Ala Gly Ile Ile
105 110 115 GAT AAG GCG GTG AAC AAG CGC AAG TAC AGA ATC TCA GAT GTG GAG AAC 859 Asp Lys Ala Val Asn Lys Arg Lys Tyr Arg Ile Ser Asp Val Glu Asn
120 125 130 AGC ACC TCG CTC TAC AGA GGA GAC AAG CTA ATT GCC CTA ATT GTC AAT 907 Ser Thr Ser Leu Tyr Arg Gly Asp Lys Leu Ile Ala Leu Ile Val Asn 135 140 145 150 GTC GAC TAT GGG CTG CAG CCG ATC ACT AAG CCA AAG AAG AAG AAG TCC 955 Val Asp Tyr Gly Leu Gln Pro Ile Thr Lys Pro Lys Lys Lys Lys Ser
155 160 165 AAG ATA ATG GCG AAT CTC CCT CAG CCG AAG AGA GAG ATG TAT TTC AAC 1003 Lys Ile Met Ala Asn Leu Pro Gln Pro Lys Arg Glu Met Tyr Phe Asn
170 175 180 CAA ATC GGT CAG CTT GTT GGA GCA AGA GGA ACG TTC CCC CAG GAA AAC 1051 Gln Ile Gly Gln Leu Val Gly Ala Arg Gly Thr Phe Pro Gln Glu Asn
185 190 195 AAG GAG GAC TGC AAG CCT TGT GAG GGT CCC AAG AAG ACT GTT GAA ACT 1099 Lys Glu Asp Cys Lys Pro Cys Glu Gly Pro Lys Lys Thr Val Glu Thr
200 205 210 ACT TCT GAG AAA TGT AAT CTT GGG TGC GAG CTT AAA GGA ACA TCT GCT 1147 Thr Ser Glu Lys Cys Asn Leu Gly Cys Glu Leu Lys Gly Thr Ser Ala 215 220 225 230 CTG ATA AGC AAG GCC ATA CAG AAG AAG GAA GTC AAG GAC ACG AAG GAA 1195 Leu Ile Ser Lys Ala Ile Gln Lys Lys Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu @
<Desc/Clms Page number 27>
GGG GAG AAA AGT GCA AGC CAG GAC TCT GAT GGC GAG GGC ACT GCT GAG 1243 Gly Glu Lys Ser Ala Ser Gln Asp Ser Asp Gly Glu Gly Thr Ala Glu
250 255 260 GAT GCG GAA GTA CAG CAA CCT TCT GCG GAC GGC GAG GGT CTA GAG TAA 1291 Asp Ala Glu Val Gln Gln Pro Ser Ala Asp Gly Glu Gly Leu Glu
265 270 275 TTTTTAAATT AAAATCTCCC TGGATTGAAT CTTCAAGTGC TTTTGTGAAA GACTTTGGGA 1351 ACATTTCGTG AAGGCTAACA TAAATTGTTA ATCTCAGGTC ACTCGATGGA ATAGTCAATT 1411 CGTATTTCCT TTCCTTGGAT GGTCTGCCCC ACCAGCCTGT TCCTGGCAGT TATCGCATCG 1471 TCGACAGAGT CAAACTGAAC GAATCCATAT CCTTTGGACA TCTTCTTGTA TTGGTCGTAG 1531 ACTATTACTA CCCGATAGTT CAGTATCTCA CTGATCCTCT CCTTGAGAAG GTCTCTAACG 1591 TCGTCTTCGG TTATGTGTGC TCCCAGCCCA AATATCCCTA TCGCCCTGGA GGGAGACCCG 1651 TTTCTCTTTG CTTTAAGTGC ATATCTTTCG TTTTTATAGG AGCTTGGATC TGTTCCTTCG 1711 TATCCCCTTG TCGGGCGCTC CACCTCGAG 1740
250 255 260 GAT GCG GAA GTA CAG CAA CCT TCT GCG GAC GGC GAG GGT CTA GAG TAA 1291 Asp Ala Glu Val Gln Gln Pro Ser Ala Asp Gly Glu Gly Leu Glu
265 270 275 TTTTTAAATT AAAATCTCCC TGGATTGAAT CTTCAAGTGC TTTTGTGAAA GACTTTGGGA 1351 ACATTTCGTG AAGGCTAACA TAAATTGTTA ATCTCAGGTC ACTCGATGGA ATAGTCAATT 1411 CGTATTTCCT TTCCTTGGAT GGTCTGCCCC ACCAGCCTGT TCCTGGCAGT TATCGCATCG 1471 TCGACAGAGT CAAACTGAAC GAATCCATAT CCTTTGGACA TCTTCTTGTA TTGGTCGTAG 1531 ACTATTACTA CCCGATAGTT CAGTATCTCA CTGATCCTCT CCTTGAGAAG GTCTCTAACG 1591 TCGTCTTCGG TTATGTGTGC TCCCAGCCCA AATATCCCTA TCGCCCTGGA GGGAGACCCG 1651 TTTCTCTTTG CTTTAAGTGC ATATCTTTCG TTTTTATAGG AGCTTGGATC TGTTCCTTCG 1711 TATCCCCTTG TCGGGCGCTC CACCTCGAG 1740
Claims (19)
1) Protéine complète purifiée de tube polaire de microsporidie.
2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa masse moléculaire apparente est d'environ 55 kDa et son point isoélectrique de l'ordre de 5.
3) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa masse moléculaire apparente est d'environ 35 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 9.
4) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
5) Protéine selon la revendication 4, constituée par ou comprenant le séquence comprise entre les acides aminés en position 23 et 395 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:l.
6) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
7) Protéine selon la revendication 6, constituée par ou comprenant le séquence comprise entre les acides aminés en position 1 et 277 de la séquence
<Desc/Clms Page number 29>
représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:2.
8) Anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidie du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes : a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendiations 1 à 7 sur un support d'analyse, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum d'un sujet à tester, d) on élimine par lavage les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c), e) on incube le produit de l'étape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, f) on élimine par lavage les anticorps antihumains qui ne sont pas liés spécifiquement et g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains/ anticorps du sérum protéine formés à l'étape (e).
10) Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est constitué par ... un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinantes de tube polaire de microsporidie,
<Desc/Clms Page number 30>
- une solution contenant des anticorps antihumains couplés à une molécule permettant leur révélation, et - une notice décrivant les étapes du procédé de diagnostic selon la revendication 9.
11) Molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
12) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 11 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1830 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:1 ou sa séquence complémentaire.
13) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 11 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1740 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2 ou sa séquence complémentaire.
14) Vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, avantageusement associée à des séquences de contrôle.
15) Un hôte transformé par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou par un vecteur selon la revendication 14.
<Desc/Clms Page number 31>
16) Procédé de production ou d'expression dans un hôte d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il consiste : - à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou un vecteur selon la revendication 14 dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie, - à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines.
17) Une sonde nucléique éventuellement marquée constituée de tout ou partie d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconques des revendications 11 à 13.
18) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon, comprenant les étapes suivantes : a) on extrait de l'ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques, b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen approprié, c) on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide d'une sonde nucléotidique marquée spécifique d'une microsporidie.
<Desc/Clms Page number 32>
19) Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est constitué par : - les moyens nécessaires à l'amplification des séquences codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, - un support d'analyse pour fixer les produits de l'amplification, et - des sondes marquées spécifiques d'une microsporidie.
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