WO2000001724A1 - Proteines de tube polaire de microsporidie, acides nucleiques codant pour ces proteines et leurs applications - Google Patents

Proteines de tube polaire de microsporidie, acides nucleiques codant pour ces proteines et leurs applications Download PDF

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WO2000001724A1
WO2000001724A1 PCT/FR1999/001630 FR9901630W WO0001724A1 WO 2000001724 A1 WO2000001724 A1 WO 2000001724A1 FR 9901630 W FR9901630 W FR 9901630W WO 0001724 A1 WO0001724 A1 WO 0001724A1
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WO
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proteins
seq
protein
represented
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Application number
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Inventor
Frédéric DELBAC
Christian Vivares
Antoine Danchin
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/56905—Protozoa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the subject of the invention is purified complete proteins of microsporidia polar tube (PTPs) as well as the genes encoding these proteins, and their use in the fields of diagnosis.
  • PTPs microsporidia polar tube
  • E. cun iculi is microsporidia, an obligate intracellular parasite, common in many mammals and involved in various infections in humans - mainly in immunocompromised individuals.
  • Two other species of the genus Encephali tozoon ⁇ E. intestinalis and E. hell em) are also involved in various opportunistic infections.
  • microsporidia is responsible in patients with AIDS for digestive pathologies, but also for ocular, muscular, hepatic damage, rhinosinusitis and systemic infections (1).
  • Serological tests have also shown the significant presence of microsporidia in the munocompetent patients, since reaching 8% of the population (2).
  • microsporidia 4 types are responsible for human diseases: En t erocyt oz o on, En cepha lit oz o on, Vi t ta f orma and Tra chipl ei st oph ora.
  • En t erocyt oz o on 4 types are responsible for human diseases: En t erocyt oz o on, En cepha lit oz o on, Vi t ta f orma and Tra chipl ei st oph ora.
  • the emergence of these parasites in human pathology arouses on the part of researchers a growing interest in the systematic, epidemiological, clinical, diagnostic and therapeutic fields.
  • diagnosis is based on PCR tests using oligonucleotides determined from ribosomal DNA sequences, the only sequences known in most microsporidia. Therapy, for its part, is limited to the use of certain molecules such as albendazole or fumagillin. These unicellular e
  • the spore an infectious stage, in fact contains an extrusion device consisting of a polar tube inserted at its anterior end in an anchoring disc.
  • an extrusion device consisting of a polar tube inserted at its anterior end in an anchoring disc.
  • the polar tube is extruded from the microsporidian spore and crosses the plasma membrane d 'a host cell.
  • the sporoplasm, expelled through this tube is thus inoculated into the receptor cell.
  • This invasive device specific to microsporidia and unique in the living world, therefore arouses interest both from a fundamental point of view but also applied for diagnosis and therapy. To date, no complete sequence of proteins constituting this polar tube has been obtained.
  • the polar tube is made up of a single 23 kDa protein in Ameson mi cha el is. More recently, in a parasitic microsporidia of fish, Glugea ameri canus, a differential extraction of proteins in the presence of a reducing agent (DTT) has made it possible to demonstrate that a protein of 43 kDa is constitutive of the polar tube, but only part of the N-terminal sequence of 16 amino acids has been determined (4).
  • DTT reducing agent
  • the research work which led to the present invention, firstly consisted in producing polyclonal and monoclonal antibodies against the polar tube of E. cuni cul i. He thus obtained 2 polyclonal antibodies (anti-55 kDa and anti-35 kDa) and an antibody monoclonal (anti-55 kDa) reacting specifically with the polar tube in immunofluorescence and electron microscopy (6). After separation of the spore proteins by 2-dimensional electrophoresis and transfer to the PVDF membrane, a protein having an apparent molecular mass close to 55 kDa and an isoelectric point of 5 was recognized by these three types of antibodies.
  • the experimental protocol included therein comprises conventional steps well known to those skilled in the art (9), such as the extraction of spore proteins, electrophoresis (SDS-PAGE), the production of polyclonal and monoclonal antibodies, the microsequencing of peptides as well as the determination of degenerate primers and their amplification by PCR.
  • steps well known to those skilled in the art 9
  • the extraction of spore proteins electrophoresis (SDS-PAGE)
  • SDS-PAGE electrophoresis
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies the microsequencing of peptides as well as the determination of degenerate primers and their amplification by PCR.
  • the subject of the invention is therefore complete proteins purified from microsporidia polar tube and more particularly from 3 microsporidian species of the genus Encephali tozoon: E. cuniculi, E. intestinalis and E. hellem. More particularly, the invention relates to:
  • the invention therefore relates to polar tube microsporidia proteins whose amino acid sequence is represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 and SEQ ID No: 5, a fragment or a functionally equivalent derivative of these.
  • the term “functionally equivalent derivative” is intended to mean proteins whose sequence comprises a modification and / or a deletion and / or an addition of one or more amino acid residues, since this modification and / or deletion and / or addition does not not affect the function of these proteins. Such derivatives can be analyzed by a person skilled in the art according to the techniques:
  • the protein of 395 amino acids hereinafter designated PTP55, represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 1 corresponds to the protein of 55 kDa of E cuniculi. It has a deduced molecular mass of 39,609 Da and 37,230 Da without the signal peptide, which is lower than that of 55,000 observed on polyacrylamide gels.
  • This protein is synthesized by
  • E. cuniculi as a larger precursor of which the signal sequence of 22 amino acids is removed when targeting to vesicle involved in the forma t ion of the pole tube.
  • the sequence of a mature protein of the polar tube of the invention therefore corresponds to the sequence between the amino acids in positions 23 and 395 of
  • N-terminal sequencing of the protein showed a sequence identical to that of the Pi peptide, confirming that the peptide of 22 amino acids was cleaved during maturation. It is further observed that PTP55 does not contain tryptophan, phenylalanine, or arginine residues. It has an isoelectric point deduced from 4.7 in agreement with that observed on 2-dimensional polyacrylamide gels which was of the order of 5. The study of these sequences of 395 amino acids and 373 amino acids in the mature protein , shows that it has no significant homology with other proteins already described in the databases.
  • a protein homologous to PTP55 has also been identified in the species E. intestinalis. This 371 amino acid protein is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 3. The sequence notably shows strong homologies with the N- and C-terminal regions of the PTP55 of E. cuniculi.
  • PTP35 The protein of 277 amino acids, hereinafter designated PTP35, represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 2 corresponds to the protein of 35 kDa of E. cuni ass i. It has a deduced molecular mass of 30,075 Da, therefore lower than that of 35,000 observed on polyacrylamide gels.
  • SEQ ID No: 2 The protein of 277 amino acids, hereinafter designated PTP35, represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 2 corresponds to the protein of 35 kDa of E. cuni ass i. It has a deduced molecular mass of 30,075 Da, therefore lower than that of 35,000 observed on polyacrylamide gels.
  • the N-terminal end of PTP35 also exhibits signal peptide characteristics:
  • PTP35 from E. cuni cul i would present a signal peptide.
  • Potential proteolytic cleavage sites can be predicted between residues 12 and 13, 13 and 14 or 22 and 23. However, such cleavage could only be confirmed by sequencing the N-terminal part of the protein.
  • the sequence of a polar tube protein according to the invention is between amino acids 1 and 277 of the sequence given in the annex under the number SEQ ID No: 2.
  • PTP35 does not contain tryptophan residues. It has an isoelectric point deduced from 8.6 in agreement with that observed on 2-dimensional polyacrylamide gels which was of the order of 9. The study of this sequence of 277 amino acids shows that it has no significant homology with other proteins already described in databases.
  • the inventors also obtained proteins homologous to PTP35 in the 2 other species of the genus Encephali tozoon, E. intestinalis and E. hellem.
  • the corresponding sequences are appended under the numbers SEQ ID No: 4 and SEQ ID No: 5.
  • the PTP35 of E. intestinalis and E. hellem are made up of 275 and 272 amino acids respectively and have around 80% identity.
  • sequence of a PT35 protein of the polar tube of the invention corresponds more particularly to a sequence consisting of or comprising:
  • Poly or monoclonal antibodies directed against at least one protein of the invention or a fragment thereof can be prepared by the methods described in the literature.
  • Polyclonal antibodies are formed according to conventional techniques by injection of proteins, extracted from the spores of E. cuniculi or produced by transformation of a host, in animals, then recovery of antisera and antibodies from antisera for example by affinity chromatography.
  • Monoclonal antibodies can be produced by fusing myeloma cells with spleen cells from animals previously immunized with the proteins of the invention. These antibodies are useful for finding other polar tube proteins in E. cuniculi, E. hellem or E. intestinalis and to study the kinship between polar tube proteins of different species, even different genera. Indeed, the antibodies formed against the polar tube of E. intestinalis or E. hellem giving rise to crossed immunological reactions with the proteins of the polar tube of E. c un i cu l i. But they can also find applications in the diagnostic field.
  • the invention therefore also relates to a method for diagnosing infections caused by microsporidia of the genus Encephali tozoon comprising the following steps: a) immobilizing a recombinant protein of microsporidial polar tube according to the invention on an analysis support such as a nitrocellulose sheet or an ELISA plate, b) the non-specific reaction sites are saturated, for example in the presence of 5% skimmed milk, c) the product obtained in step (b) is incubated with the antibodies of the serum of the test subject, so that, if the serum contains antibodies directed against a polar tube protein of microsporidia, these complex with said protein, d) washing the antibodies from the serum which are not complexed in step (c), e) incubating the product of step (d) with secondary anti-human antibodies coupled to a molecule allowing their revelation, such as for example an enzyme such as peroxidase or a fluorochrome, f) washing away anti-human antibodies which are not specifically linked and, g) revealing
  • a diagnostic kit for the implementation of such a method consists of: an analysis support on which are immobilized recombinant proteins of microsporidia polar tube,
  • the invention also relates to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic sequence coding for a polar tube protein of microsporidia. More particularly, the invention relates to the nucleotide sequences coding for the proteins of PTP55 and PTP35 corresponding respectively to the proteins of 55 and 35 kDa of the microsporidia E. cuniculi, E. intestinalis and E. hellem.
  • the invention envisages on a specific basis, a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic sequence coding for a polar tube protein of microsporidia whose amino acid sequence is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 or SEQ ID No: 5, a fragment or a functionally equivalent derivative of this protein.
  • a DNA molecule comprising the sequence coding for the protein PTP55 of E. cuniculi is represented in the attached sequence list under the number SEQ ID No: 1 or its complementary sequence. More particularly, such a nucleic acid sequence comprises the sequence between nucleotides 411 and 1532 of SEQ ID No: 1 or its complementary sequence.
  • the nucleic sequence of SEQ ID No: 1 is composed of 1830 nucleotides and includes an open reading frame of 1188 base pairs ranging from position 345 (start codon ATG) to position 1532 (stop codon TAG). The region preceding position 345 is likely to include elements useful for the transcription of the PTP55 protein such as a promoter region.
  • a DNA molecule comprising the sequence coding for a protein homologous to PTP55 identified in the species E. intestinalis is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 3.
  • a DNA molecule comprising the sequence coding for the protein PTP35 is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID No: 2 or its complementary sequence. More particularly, such a nucleic acid sequence comprises the sequence between nucleotides 458 and 1291 of SEQ ID No: 2 or its complementary sequence.
  • the nucleic acid sequence II of the invention is composed of 1740 nucleotides and comprises a open reading frame of 834 base pairs ranging from position 458 (ATG initiation codon) to position 1291 (TAA stop codon). The region preceding position 458 is likely to include elements useful for the transcription of the PTP35 protein such as a promoter region.
  • the invention therefore relates very particularly to nucleic acid molecules whose nucleotide sequences are represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No : 4 and SEQ ID No: 5 as well as all the nucleotide sequences capable of hybridizing with these.
  • the invention of course also relates to the nucleotide sequences derived from SED ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 and SEQ ID No: 5 for example due to the degeneration of the genetic code, which codes for proteins exhibiting polar tube characteristics of microsporidia.
  • the invention also relates to a vector comprising at least one preceding nucleic acid molecule, advantageously associated with suitable control sequences, as well as a process for the production or expression in a cellular host of a polar tube protein. microsporidia of the invention or a fragment thereof.
  • the preparation of these vectors as well as the production or the expression in a host of the proteins of the invention can be carried out by the techniques of. molecular biology and genetic engineering well known to those skilled in the art.
  • a method for producing a polar tube protein of microsporidia consists:
  • a method of expressing a polar tube protein of microsporidia according to the invention consists:
  • the cell host used in the above methods can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and in particular from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells.
  • the vector used is chosen according to the host to which it will be transferred; it can be any vector such as a plasmid.
  • the invention therefore also relates to cellular hosts and more particularly to transformed bacteria such as E. coli, expressing polar tube microsporidia proteins obtained in accordance with the preceding methods.
  • the invention also relates to the nucleic acid probes and oligonucleotides prepared from the nucleic acid molecules of the invention.
  • probes are useful for the detection by hybridization of similar sequences in other microsporidia.
  • these probes are brought into contact with a biological sample.
  • Different hybridization techniques can be implemented such as spot hybridization (Dot-blot) or hybridization on replicas (Southern technique) or other techniques (DNA chips).
  • Dot-blot spot hybridization
  • Southern technique hybridization on replicas
  • DNA chips DNA chips
  • the oligonucleotides are useful for PCR experiments, for example to search for genes in other microsporidia or for diagnostic purposes.
  • the invention therefore also relates to a method for diagnosing infections caused by microsporidia, comprising the following steps: a) DNA is extracted from microsporidian spores taken from biological samples obtained from urine, stool, or a biopsy , b) the DNA extracted is amplified by any appropriate means such as a PCR using specific oligonucleotides derived from the sequences of the genes coding for the microsporidium polar tube proteins, c) the products d are immobilized amplification on an analysis support, d) the microsporidian origin of the amplification products is determined by hybridization using a labeled nucleotide probe specific for microsporidia. It is possible to carry out step (c) by fixing the amplification products on an analysis support, such as a membrane or an ELISA plate.
  • an analysis support such as a membrane or an ELISA plate.
  • a diagnostic kit for the implementation of such a process consists of
  • the invention also relates to vaccine compositions capable of preventing infections caused by microsporidia of the genus Encephali tozoon comprising, as active principle, a protein of the invention or a fragment thereof in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention advantageously provides a potential vaccine against infections caused by microsporidia of the genus Encephalitozoon.
  • A the trophoretic separation of the spore proteins by SDS-PAGE with on track 1 the fraction soluble in SDS 2%, 2-mercaptoethanol 10%, and on track 2 the residual fraction obtained after incubation in 2-mercaptoethanol 50% for 48 hours.
  • FIG. 2 shows the immunoreactivity of the 55 kDa protein.
  • Two-dimensional gel electrophoresis was performed using isoelectric focusing in the first dimension and 12% gels in the second dimension.
  • the separated proteins were either stained with silver nitrate (A) or transferred to PVDF membranes and incubated with polyclonal antibodies directed against the 55 kDa acid spot (dilution l / 5000 e ) isolated by 2D electrophoresis (B) .
  • the molecular weights are indicated in kDa and the isoelectric points numbered from 4 to 8.
  • FIG. 4 shows an immunostaining performed on 2-dimensional electrophoresis gels with the monoclonal antibody directed against the polar tube.
  • Two-dimensional gel electrophoresis was performed using isoelectric focusing in the first dimension and 12% gels in the second dimension.
  • the separated proteins were either stained with silver nitrate (A) or transferred to PVDF membranes and incubated with the monoclonal antibody (dilution 1/5000 e ) (B).
  • the spots of 55 and 35 kDa are indicated by arrows.
  • Figure 5 illustrates the expression of PTP35 in Escherichia coli.
  • Figure 5 shows: • in A, analysis on polyacrylamide gels (SDS-PAGE) of proteins extracted from bacteria transformed with the plasmid construction pQE30-PTP35.
  • Lane 1 shows production without induction; lane 2 after induction with IPTG and lane 3 recombinant PTP purified on Ni-NTA resin.
  • the molecular weight markers are indicated in kDa.
  • E. cuniculi Production of antibodies against the polar tube of E. cuniculi, immunocytochemical analyzes.
  • the strain of E. cuniculi used is a mouse isolate. It is maintained on MDCK cell culture. The spores released in the culture supernatant are recovered and stored at 4 ° C in PBS.
  • the extraction of spore proteins is carried out by grinding the spores with zirconium beads (0.1 mm in diameter) in a buffer containing 2.5% SDS and 10% 2-mercaptoethanol in the presence of protease inhibitors. After heat denaturation for 10 minutes at 100 ° C, the sporal debris is removed by centrifugation at 18000 g for 5 minutes. The proteins are then separated by SDS-PAGE on 12% polyacrylamide gels.
  • the protein samples are dissolved in a buffer based on 9 M urea, 5% 2-mercaptoethanol and 40 mM CHAPS.
  • the isoelectric focusing is carried out under the following conditions: 4 hours at 400 V, 30 minutes at 600 V then 30 minutes at 800 V with the combination of ampholines (Pharmacia) 40% pH 3-10, 60% pH 4-6, 5.
  • the proteins are separated according to their molecular mass by SDS-PAGE.
  • the corresponding gels are stained either with silver or Coomassie blue, or transferred onto a PVDF membrane (Immobilon P, Polylabo) using a semi-dry system.
  • Polyclonal antibodies have been produced against different proteins of E. cuniculi separated by electrophoresis. Intraperitoneal injections are performed in BALB / c mice for each protein sample. The 55 kDa protein band has also been used to produce monoclonal antibodies. Thus, 3 antibodies directed against the polar tube were obtained: 2 polyclonal anti-35 kDa and anti-55 kDa antibodies and a monoclonal anti-55 kDa antibody. Immunoblotting, immunolocation in IFA and in transmission electron microscopy are carried out according to conventional techniques.
  • N-terminal sequence as well as 2 internal peptides (PI and P2) were sequenced for the PTP55 of E. cuniculi.
  • ATALCSNAYG PI ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ
  • P2 SATQYAMEACATPTP
  • P3 An internal peptide (P3) has been sequenced for PTP35.
  • P3 AVQGTDRCILAGIID These sequences were produced from 55 kDa and 35 kDa proteins isolated by 2-dimensional electrophoresis, by the protein microsequencing laboratory, Institut Pasteur, Department of biotechnology. For the internal sequencing of the peptides PI, P2 and P3, the proteins were previously digested with Endolysin C, a proteolytic enzyme which cuts after a lysine residue.
  • the complete sequence represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 1 comprises 1830 nucleotides and comprises a reading frame of 1188 bp.
  • the latter contains 395 codons ranging from the site considered to be the site of initiation of translation to the TAG termination codon.
  • the codon considered as starting ATG codon is preceded by a region particularly rich in A-T.
  • the translated amino acid sequence is shown in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 1.
  • the gene coding for a protein homologous to PTP55 has been sequenced and is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 3. This sequence includes a reading frame of 1113 bp. The latter contains 371 codons ranging from the site considered to be the site of initiation of translation to the TAG termination codon.
  • the complete PTP35 sequence of E. cuniculi represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID No: 2 comprises 1740 nucleotides.
  • the reading frame includes 834pb.
  • the latter contains 277 codons ranging from the site considered to be the site of translation initiation to the TAA termination codon.
  • the codon considered as starting ATG codon is preceded by a region particularly rich in A-T, similar to that of PTP55.
  • the translated amino acid sequence is represented in the attached sequence list under the number SEQ ID No: 2.
  • the PTP35 sequences of E. intestinalis and E. hel l em represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID No: 4 and SEQ ID No: 5 contain 825 and 816 nucleotides respectively, not including the stop codon.
  • the corresponding proteins consist of 277 and 272 amino acids.
  • Part of the PTP35 between residues 27 and 277 was also expressed in E. col i using the same technique.
  • the antibodies produced against this recombinant protein showed labeling of the polar tube.
  • cun i cul i) is predicted as such by the following characteristics: - absence of lysine residue in position 22 preceding the peptide PI sequence (23-42 ) after digestion of the protein with Endolysin C, N-terminal sequencing of the protein corresponding to that of the PI peptide, - presence of hydrophobic amino acids in this N-terminal region,
  • PTP is probably synthesized by E. cuniculi (or E. in tes tinalis) in the form of a larger precursor whose signal sequence of 22 amino acids is eliminated during maturation.
  • the mature protein would therefore have a molecular mass of 37,230 Da.
  • N-glycosylation sites NETS, NGTS and
  • NISG NISG
  • the central region of the PTP55 protein of E. cuniculi is characterized by 4 tandem repeats of 26 amino acids each with conservation at the nucleic level. This region is partially surrounded by 2 other repeats of 9 amino acids. No repetition is observed in the PTP55 sequence of E. intestinalis, but the 2 PTP55s show strong homologies in the N- and C-terminal parts.
  • PTP35 are particularly rich in lysine (11.5%) and glutamic acid (9%) residues.
  • 3 potential cleavage sites of a signal sequence are represented between residues 12 and 13, 13 and 14, and 22 and 23.
  • An RGD sequence is present in the PTP35 of E. cuniculi and E. in tes tinal i s, a sequence found in proteins such as fibronectin and which intervenes in cell attachment phenomena.
  • a potential N-glycosylation site (NSTS) is also present in the PTP35 sequence of E. cuniculi.
  • the same probe was applied to Southern after digestion of the genomic DNA of E. cuni cul i by different restriction enzymes: a single band is marked on each digestion profile, which confirms that the gene exists in a single copy.
  • the gene encoding E. cuni cul i is also located on chromosome VI.

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Abstract

L'invention a pour objet des proteines complètes purifiées de tube polaire de microsporidie et plus particulièrement les protéines dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:5. L'invention a également pour objet les gènes codant ses protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.

Description

PROTEINES DE TUBE POLAIRE DE MICROSPORIDIE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS .
L'invention a pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire (PTPs) de microsporidie ainsi que les gènes codant ces protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.
E. cun i c u l i est une microsporidie, parasite intracellulaire obligatoire, fréquente chez de nombreux mammifères et impliquée dans diverses infections chez - l'homme principalement chez les sujets immunodéprimés . Deux autres espèces du genre Encephali tozoon { E. intestinalis et E . h e l l em ) sont aussi impliquées dans différentes infections opportunistes. De manière générale, les microsporidies sont responsables chez les patients sidéens de pathologies digestives, mais aussi d'atteintes oculaires, musculaires, hépatiques, de rhinosinusites et d'infections systémiques (1) . Des tests sérologiques ont également montré la présence importante des microsporidies chez les patients i munocompétents , puisque atteignant 8% de la population (2) . 4 genres de microsporidie sont responsables de maladies humaines : En t erocyt oz o on , En cepha l i t oz o on , Vi t ta f orma et Tra chipl ei s t oph ora . L'émergence de ces parasites en pathologie humaine suscite de la part des chercheurs un intérêt grandissant dans les domaines systématique, épidémiologique , clinique, du diagnostic et de la thérapeutique. Actuellement, le diagnostic repose sur des tests PCR à partir d' oligonucléotides déterminés d'après les séquences d'ADN ribosomal, seules séquences connues chez la plupart des microsporidies. La thérapeutique, quant à elle, est limitée à l'utilisation de certaines molécules telles que 1 ' albendazole ou la fumagilline. Ces eucaryotes unicellulaires présentent un mécanisme d'invasion unique. La spore, stade infectieux, renferme en effet un appareil d'extrusion constitué d'un tube polaire inséré à son extrémité antérieure dans un disque d'ancrage. Sous l'effet de certains stimuli, pouvant être liés in vi tro à une variation du pH, à 1 ' osmolarité, à la présence de cations ou d'anions, le tube polaire est extrudé de la spore microsporidienne et traverse la membrane plasmique d'une cellule-hôte. Le sporoplasme, expulsé à travers ce tube, est ainsi inoculé dans la cellule réceptrice. Cet appareil invasif, spécifique des microsporidies et unique dans le monde vivant, suscite donc un intérêt à la fois d'un point de vue fondamental mais aussi appliqué pour le diagnostic et la thérapeutique. A ce jour, aucune séquence complète de protéines constituant ce tube polaire n'a été obtenue. Selon Weidner (3) le tube polaire serait constitué d'une seule protéine de 23 kDa chez Ameson mi cha el i s . Plus récemment, chez une microsporidie parasite de poisson, Glugea ameri canus , une extraction différentielle des protéines en présence d'un agent réducteur (DTT) a permis de mettre en évidence qu'une protéine de 43 kDa est constitutive du tube polaire, mais seule une partie de la séquence N-terminale de 16 acides aminés a été déterminée (4).
La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux a également été réalisée contre le tube polaire de différentes espèces (5, 6, 7), montrant une possible hétérogénéité protéique de cette structure.
Les travaux de recherche, ayant conduit à la présente invention, ont tout d'abord consisté à produire des anticorps polyclonaux et monoclonaux contre le tube polaire d ' E. cuni cul i . Il a ainsi obtenu 2 anticorps polyclonaux (anti-55 kDa et anti-35 kDa) et un anticorps monoclonal (anti-55 kDa) réagissant spécifiquement avec le tube polaire en immunofluorescence et en microscopie électronique (6) . Après séparation des protéines sporales par electrophorese en 2 dimensions et transfert sur membrane PVDF une protéine ayant une masse moléculaire apparente proche de 55 kDa et un point isoélectrique de 5 était reconnue par ces trois types d'anticorps. Sur ces gels de 2 dimensions, une autre protéine de masse moléculaire apparente proche de 35 kDa et avec un point isoélectrique de 9 était également reconnue par 2 anticorps anti-tube polaire, l'anticorps polyclonal anti-35 kDa et l'anticorps monoclonal.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis, pour la première fois, d'obtenir des protéines complètes de tube polaire de microsporidie. Les travaux présentés par les Inventeurs à l'occasion d'un congrès (Fifth International Workshops on Opportunitic Protists and Fifth General Meeting of the European Concerted Action on Pneumocystis Research, Lille 3-7 septembre 1997) sur l'obtention d'une protéine de tube polaire de 55 kDa sont insuffisants pour effectivement permettre l'obtention de cette protéine complète et purifiée et pour identifier, cloner et séquencer le gène correspondant. En effet, aucune donnée de séquence nucléique ou protéique n'apparaît dans le document relatant ce congrès (8) . Le protocole expérimental qui y figure comprend des étapes classiques et bien connues de l'homme du métier (9), telles que l'extraction des protéines sporales, les électrophorèses (SDS-PAGE), la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux, le microséquençage de peptides ainsi que la détermination d'amorces dégénérées et leur amplification par PCR. Compte-tenu du caractère synthétique du document relatant ce congrès, son enseignement est insuffisant pour permettre à l'homme du métier de reproduire les travaux des Inventeurs et de mettre en évidence la séquence complète d'une protéine complète de tube polaire de microsporidie.
L'invention a donc pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire de microsporidie et plus particulièrement de 3 espèces microsporidiennes du genre Encephali tozoon : E. cuniculi , E . intestinalis et E . hellem . Plus particulièrement l'invention concerne :
- une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 55 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 5, de E. cuniculi et E. intestinalis ,
- une protéine de masse moléculaire apparente d'environ 35 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 9, de E. cuniculi , E. intestinalis et E. hellem.
Dans un second temps, les travaux réalisés sur les deux protéines purifiées d' E. cuniculi (55 et 35 kDa) ont consisté à les soumettre à un microséquençage interne après digestion par l'Endolysine C. Deux peptides ont ainsi été séquences (Pi : ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ et P2 :
SATQYAMEACATPTP) pour la protéine de 55 kDa et un peptide
(P3 : AVQGTDRCILAGIID) pour la protéine de 35 kDa, et ont permis à partir d'amorces dégénérées d'amplifier une partie des gènes correspondants.
En l'absence de banque génomique, les Inventeurs ont réussi à déterminer les séquences des gènes et leurs régions flanquantes par une technique de SSP-PCR (10) . Ces différentes étapes ont permis de définir la structure complète des gènes, leurs particularités ainsi que les similitudes éventuelles avec d'autres gènes. Les structures primaires des protéines de 55 et 35 kDa ont également été déterminées .
L'invention concerne donc les protéines de tube polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci. On entend par dérivé fonctionnellement équivalent, les protéines dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie pas la fonction de ces protéines . De tels dérivés peuvent être analysés par l'homme du métier selon les techniques :
- de criblage de banques d'expression à l'aide d'anticorps dirigés contre les protéines du tube polaire, ou - de criblage de banques génomiques à l'aide de sondes nucléiques capable de s'hybrider à un gène codant pour une protéine du tube polaire.
La protéine de 395 acides aminés, ci-après désignée PTP55, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 correspond à la protéine de 55 kDa d ' E cuniculi . Elle présente une masse moléculaire déduite de 39 609 Da et de 37 230 Da sans le peptide signal, qui est inférieure à celle de 55 000 observée sur gels de polyacrylamide . Cette protéine est synthétisée par
E. cuniculi sous la forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est éliminée lors du ciblage vers des vésicules impliquées dans la formation du tube polaire. La séquence d'une protéine mature du tube polaire de l'invention correspond donc à la séquence comprise entre les acides aminés en position 23 et 395 de
SEQ ID No :1. Plusieurs caractéristiques de peptide signal sont en effet observées :
- structure secondaire prédite comme formant une hélice oc, - présence d'acides aminés hydrophobes ainsi que de résidus basiques proches de la partie N-terminale,
- absence d'un résidu lysine en position 22, et
- prédiction de peptide signal par l'algorithme de von Heijne (11) .
De plus, le séquençage N-terminal de la protéine a montré une séquence identique à celle du peptide Pi, confirmant que le peptide de 22 acides aminés était clivé lors de la maturation. On observe en outre que la PTP55 ne contient pas de résidus tryptophane, phénylalanine , ni arginine . Elle présente un point isoélectrique déduit de 4,7 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre de 5. L'étude de ces séquences de 395 acides aminés et de 373 acides aminés dans la protéine mature, montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'autres protéines déjà décrites dans les banques de données .
Une protéine homologue de PTP55 a été également identifiée chez l'espèce E. intestinalis . Cette protéine de 371 acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :3. La séquence présente notamment de fortes homologies avec les régions N- et C- terminales de la PTP55 d ' E. cuniculi .
La protéine de 277 acides aminés, désignée ci- après PTP35, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :2 correspond à la protéine de 35 kDa d ' E . cuni cul i . Elle présente une masse moléculaire déduite de 30 075 Da, inférieure donc à celle de 35 000 observée sur gels de polyacrylamide. L'extrémité N-terminale de la PTP35 présente également des caractéristiques de peptide signal :
- structure secondaire prédite comme formant une hélice α, - présence d'acides aminés hydrophobes ainsi que de résidus basiques,
- prédiction de peptide signal par l'algorithme de von Heijne (11) . De la même manière que pour la PTP55, la PTP35 d'E. cuni cul i présenterait un peptide signal. Des sites potentiels de clivage proteolytiques peuvent être prédits entre les résidus 12 et 13, 13 et 14 ou 22 et 23. Cependant un tel clivage ne pourrait être confirmé que par le séquençage de la partie N-terminale de la protéine. Sur la base des données disponibles, la séquence d'une protéine de tube polaire selon l'invention est comprise entre les acides aminés 1 et 277 de la séquence donnée en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2. La PTP35 ne contient pas de résidus tryptophane. Elle présente un point isoélectrique déduit de 8,6 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide en 2 dimensions qui était de l'ordre de 9. L'étude de cette séquence de 277 acides aminés montre qu'elle ne présente aucune homologie significative avec d'autres protéines déjà décrites dans les banques de données .
Les inventeurs ont également obtenus des protéines homologues de PTP35 chez les 2 autres espèces du genre Encephali tozoon, E. intestinalis et E. hellem . Les séquences correspondantes sont en annexe sous les numéros SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5. Les PTP35 d'E. intestinalis et d'E. hellem sont respectivement constituées de 275 et 272 acides aminés et présentent environ 80% d'identité.
La séquence d'une protéine PT35 du tube polaire de l'invention correspond plus particulièrement à une séquence constituée par ou comprenant :
- la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 275 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 4. - la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 272 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 5.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine de l'invention ou un fragment de celles-ci peuvent être préparés par les méthodes décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection des protéines, extraites à partir des spores d'E. cuniculi ou produites par transformation d'un hôte, à des animaux, puis récupération des antiserums et des anticorps à partir des antiserums par exemple par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention. Ces anticorps sont utiles pour rechercher d'autres protéines de tubes polaires d'E. cuniculi , d' E. hellem ou d'E. intestinalis et pour étudier la parenté entre les protéines de tubes polaires de différentes espèces, voire de différents genres. En effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E. intestinalis ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions immunologiques croisées avec les protéines du tube polaire d ' E . c un i cu l i . Mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine diagnostique.
L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephali tozoon comprenant les étapes suivantes : a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'invention sur un support d'analyse tel qu'une feuille de nitrocellulose ou une plaque ELISA, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, par exemple en présence de lait écrémé 5%, c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum du sujet à tester, de manière à ce que, si le sérum contient des anticorps dirigés contre une protéine de tube polaire de microsporidie, ceux-ci se complexent à ladite protéine, d) on élimine par lavage les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c) , e) on incube le produit de l'étape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, comme par exemple un enzyme tel que la péroxydase ou à un fluorochrome, f) on élimine par lavage les anticorps antihumains qui ne sont pas liés spécifiquement et, g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum / protéine formés à l'étape (e) .
Un kit de diagnostic pour la mise en œuvre d'un tel procédé est constitué par : un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinantes de tube polaire de microsporidie ,
- une solution contenant des anticorps antihumains couplés à une molécule permettant leur révélation, et - une notice comportant les étapes du procédé de diagnostic décrit plus haut.
L'invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire de microsporidie. Plus particulièrement, l'invention se rapporte aux séquences nucléotidiques codant pour les protéines de PTP55 et PTP35 correspondant respectivement aux protéine de 55 et 35 kDa des microsporidies E. cuniculi , E. intestinalis et E. hellem . L'invention envisage à titre spécifique, une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 ou SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine PTP55 d'E. cuniculi est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acide nucléique comprend la séquence comprise entre les nucléotides 411 et 1532 de SEQ ID No :1 ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique de SEQ ID No :1 est composée de 1830 nucléotides et comprend un cadre de lecture ouvert de 1188 paires de bases allant de la position 345 (codon d'initiation ATG) à la position 1532 (codon stop TAG) . La région précédant la position 345 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PTP55 telle qu'une région promotrice.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour une protéine homologue de PTP55 identifiée chez l'espèce E. intestinalis est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine PTP35 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :2 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle séquence d'acides nucléiques comprend la séquence comprise entre les nucléotides 458 et 1291 de SEQ ID No :2 ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique II de l'invention est composée de 1740 nucléotides et comprend un cadre de lecture ouvert de 834 paires de bases allant de la position 458 (codon d'initiation ATG) à la position 1291 (codon stop TAA) . La région précédant la position 458 est susceptible de comprendre des éléments utiles à la transcription de la protéine PTP35 telle qu'une région promotrice .
Deux molécules d'ADN comprenant chacune une séquence codant pour une protéine homologue de PTP35 chez deux autres espèces du genre Encephal i t ozoon , E. in testinalis et E. hell em sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No :4 et SEQ ID No : 5.
L'invention concerne donc tout particulièrement les molécules d'acide nucléique dont les séquences nucléotidiques sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5 ainsi que toutes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider avec celles-ci. En effet, l'invention concerne bien entendu aussi les séquences nucléotidiques dérivées de SED ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID No : 5 par exemple du fait de la dégénérescence du code génétique, et qui code pour des protéines présentant des caractéristiques de tube polaire de microsporidie.
L ' invention concerne également un vecteur comprenant au mo ins une molécule d ' acide nucléique précédente , avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés , ainsi qu ' un procédé de production ou d' expression dans un hôte cellulaire d' une protéine de tube polaire de microsporidie de l ' invention ou d ' un fragment de celle-ci . La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l ' expression dans un hôte des protéines de l ' invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste :
- à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie,
- à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'invention consiste :
- à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression desdites protéines.
L'hôte cellulaire mis en œuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d' insectes .
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré ; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide. L'invention concerne donc aussi les hôtes cellulaires et plus particulièrement les bactéries transformées comme E. coli , exprimant des protéines de tube polaire de microsporidie obtenues conformément aux procédés précédents . L'invention concerne également les sondes nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des molécules d'acide nucléique de l'invention.
Ces sondes, avantageusement marquées, sont utiles pour la détection par hybridation de séquences similaires chez d'autres microsporidies. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique. Différentes techniques d'hybridation peuvent être mises en œuvre telles que l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur répliques (technique de Southern) ou autres techniques (DNA chips) . De telles sondes constituent des outils permettant de détecter rapidement des séquences similaires dans les gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie ce qui permettrait d'étudier l'origine et la conservation de ces protéines constituant le tube polaire.
Les oligonucléotides sont utiles pour des expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes dans d'autres microsporidies ou dans un but de diagnostic. L'invention concerne donc aussi un procédé de diagnostic des infections provoquées par des microsporidies, comprenant les étapes suivantes : a) on extrait de 1 ' ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques provenant des urines, des selles, ou d'une biopsie, b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen approprié tel qu'une PCR à l'aide d' ol igonucléot ides spécifiques déduits des séquences des gènes codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, c) on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide d'une sonde nucléotidique marquée spécifique d'une microsporidie. Il est possible de réaliser l'étape (c) par fixation des produits d'amplification sur un support d'analyse, tel qu'une membrane ou une plaque ELISA.
Un kit de diagnostic pour la mise en œuvre d'un tel procédé est constitué par
- les moyens nécessaires à l'amplification des séquences codant pour les protéines de tube polaire de microsporidie, tels que des oligonucléotides spécifiques de ces séquences, et tous les autres éléments nécessaires à la réalisation d'une PCR,
- un support d'analyse pour fixer les produits de l'amplification, et des sondes marquées spécifiques d'une microsporidie.
L'invention se rapporte également à des compositions vaccinales capables de prévenir les infections provoquées par les microsporidies du genre Encephali tozoon comprenant à titre de principe actif une protéine de l'invention ou un fragment de celle-ci en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En effet, les anticorps formés contre le tube polaire d'E. intestinalis ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions immunologiques croisées avec des protéines de tube polaire d'E. c un i c u l i , l'invention fournit avantageusement un vaccin potentiel contre les infections provoquées par les microsporidies du genre Encephalitozoon .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la production d'anticorps contre le tube polaire, le clonage et le sequençage des gènes codant pour des protéines de tube polaire chez E. cuniculi , et qui se rapportent aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 montre :
• A : la séparation élec trophorét ique des protéines sporales par SDS-PAGE avec sur la piste 1 la fraction soluble dans SDS 2%, 2-mercaptoéthanol 10%, et sur la piste 2 la fraction résiduelle obtenue après incubation dans du 2-mercaptoéthanol 50% pendant 48 heures.
• B : l'analyse par immuno fluorescence indirecte à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre la bande de 55 kDa séparée par SDS-PAGE (dilution l/50e) sur des cellules MRC-5 infestées par En cepha l i t ozoon cuni culi . Les spores avec leurs tubes polaires extrudés sont fortement marquées .
• C : 1 ' immunoblot avec l'anticorps polyclonal anti-55 kDa (dilution l/5000e, piste 1) et l'anticorps monoclonal Ec 102 (dilution l/10000e, piste 2). Les marqueurs de poids moléculaires (M) sont indiqués sur la gauche et sont donnés en kDa. Les blots ont été révélés en utilisant un kit ECL (Amersham) .
- la figure 2 montre 1 ' immunoréactivité de la protéine de 55 kDa. L ' electrophorese sur gel deux dimensions a été réalisée en utilisant 1 ' isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels de 12% dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec les anticorps polyclonaux dirigés contre le spot acide de 55 kDa (dilution l/5000e) isolé par electrophorese 2D (B) . Les poids moléculaires sont indiqués en kDa et les points isoélectriques numérotés de 4 à 8.
On observe en (C) le marquage spécifique des tubes polaires extrudés en immunofluorescence avec ce même anticorps . - la figure 3 illustre l'expression de la PTP55 chez Escheri chia col l . On distingue en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP55. La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni-NTA.
On distingue en B un immunoblotting avec les sérums dirigés contre la PTP55 recombinante (dilution l/1000e) . Sur la piste 1, les protéines d'E. coli 4 heures après induction IPTG ; sur la piste 2 les protéines d' Encephali tozoon cuniculi .
On distingue en C un marquage en immunofluorescence indirecte, avec les antiserums dirigés contre la PTP55 recombinante des tubes polaires d'E. cuniculi . Les tubes polaires extrudés sont indiqués par des flèches .
On distingue en D un immunomarquage à l'or colloïdal en microscopie électronique à transmission des sections de tube polaire.
- la figure 4 montre un immunomarquage réalisé sur des gels d' electrophorese en 2 dimensions avec l'anticorps monoclonal dirigé contre le tube polaire. L' electrophorese sur gel de deux dimensions a été réalisée en utilisant 1 ' isoélectrofocalisation dans la première dimension et des gels de 12% dans la deuxième dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de PVDF et incubées avec l'anticorps monoclonal (dilution l/5000e) (B) . Les spots de 55 et 35 kDa sont indiqués par des flèches.
- la figure 5 illustre l'expression de la PTP35 chez Escherichia coli . La figure 5 montre : • en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites de bactéries transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP35. La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2 après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni-NTA.
Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués en kDa.
• en B, un immunoblotting avec les sérums dirigés contre la PTP35 recombinante (dilution l/1000e) .
Sur la piste 1 on distingue le profil électrophorétique d ' Encephali tozoon cuniculi coloré au bleu de Coomassie.
Sur la piste 2 est illustré le marquage d'une protéine de 35 kDa d'E. cuni cul i avec l'anticorps dirigé contre la protéine recombinante de 35 kDa exprimée chez Escherichia coli .
• en C, le marquage en immunof luorescence indirecte, avec les antiserums dirigés contre la PTP35 recombinante, des tubes polaires d'E. cuni culi . La flèche indique un tube polaire extrudé .
1) Production d'anticorps contre le tube polaire d'E. cuniculi , analyses immunocytochimiques . La souche d'E. cuniculi utilisée est un isolât de souris. Elle est entretenue sur culture cellulaire MDCK. Les spores libérées dans le surnageant de culture sont récupérées et stockées à 4°C dans du PBS . L'extraction des protéines sporales est réalisée par broyage des spores avec des billes de zirconium (0,1 mm de diamètre) dans un tampon contenant 2.5% de SDS et 10% de 2 -mercaptoéthanol en présence d'inhibiteurs de proteases. Après denaturation par la chaleur 10 minutes à 100°C, les débris sporaux sont éliminés par centrifugation à 18000 g pendant 5 minutes. Les protéines sont ensuite séparées par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide 12%.
Pour 1 ' electrophorese en 2 dimensions, les échantillons protéiques sont solubilisés dans un tampon à base d'urée 9 M, de 2-mercaptoéthanol 5% et de CHAPS 40 mM. L ' isoélectrofocalisation est réalisée dans les conditions suivantes : 4 heures à 400 V, 30 minutes à 600 V puis 30 minutes à 800 V avec la combinaison d'ampholines (Pharmacia) 40% pH 3-10, 60% pH 4-6,5. Après équilibration des gels de première dimension dans du SDS / 2- mercaptoéthanol pendant 10 minutes, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire par SDS-PAGE. Les gels correspondants sont colorés soit à l'argent soit au bleu de Coomassie, ou transférés sur membrane PVDF (Immobilon P, Polylabo) en utilisant un système semi-sec.
Les anticorps polyclonaux ont été produits contre différentes protéines d'E. cuniculi séparées par electrophorese. Des injections intrapéritonéales sont réalisées chez des souris BALB/c pour chaque échantillon proteique. La bande proteique de 55 kDa a également été utilisée pour produire des anticorps monoclonaux. Ainsi, 3 anticorps dirigés contre le tube polaire ont été obtenus : 2 anticorps polyclonaux anti-35 kDa et anti-55 kDa et un anticorps monoclonal anti-55 kDa. L ' immunoblotting, 1 ' immunolocalisation en IFA et en microscopie électronique à transmission sont réalisés selon les techniques classiques.
2 ) Microséquençage de PTPs de masses moléculaires apparentes 55 kDa et 35 kDa.
La séquence N-terminale ainsi que 2 peptides internes (PI et P2 ) ont été séquences pour la PTP55 d'E. cuniculi .
N-terminal : ATALCSNAYG PI : ATALCSNAYGLTPGQQGMAQ P2 : SATQYAMEACATPTP
Un peptide interne (P3) a été séquence pour la PTP35.
P3 : AVQGTDRCILAGIID Ces séquences ont été réalisées à partir des protéines de 55 kDa et de 35 kDa isolées par electrophorese en 2 dimensions, par le laboratoire de microséquençage des protéines, Institut Pasteur, Département des biotechnologies . Pour le sequençage interne des peptides PI, P2 et P3 , les protéines ont été préalablement digérées par l'Endolysine C, enzyme protéolytique coupant après un résidu lysine.
3 ) Amplification PCR, clonage et sequençage des gènes codant pour les PTPs .
a) Gènes codant pour les PTP55 d'E. cuniculi et d'E. intestinalis . A partir d'amorces dégénérées déduites des peptides Pi et P2 , un fragment d'ADN d'environ 1 kpb a été amplifié, clone dans un vecteur plasmidique pCR2
(Invitrogen, TA cloning vector) et séquence selon la méthode de Sanger (12) . L'amplification des régions 5' et 3 ' du gène de la PTP a été réalisée par une technique de PCR (SSP-PCR). L'analyse des séquences est réalisée sur le serveur de biologie moléculaire Infobiogen.
La séquence complète représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 comprend 1830 nucléotides et comporte un cadre de lecture de 1188 pb. Ce dernier contient 395 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-T. La séquence en acides aminés traduite est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No :1.
A l'aide d'amplifications par PCR et SSP-PCR, le gène codant pour une protéine homologue de PTP55 a été séquence et est représenté dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No :3. Cette séquence comporte un cadre de lecture de 1113 pb . Ce dernier contient 371 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG.
b) Gènes codant pour les PTP35 d'E. cuniculi , d ' E. intestinalis et d'E. hellem.
A partir d'amorces dégénérées déduites du peptide P3 , différents fragments ont été amplifiés par la technique de SSP-PCR, clones dans un vecteur plasmidique pGEMT (Promega, TA cloning vector) , séquences selon la méthode de Sanger et analysés comme décrit ci-dessus.
La séquence complète de la PTP35 d'E. cuniculi représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No :2 comprend 1740 nucléotides. Le cadre de lecture comprend 834pb. Ce dernier contient 277 codons allant du site considéré comme étant le site d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAA. Le codon considéré comme codon ATG de départ est précédé par une région particulièrement riche en A-T, similaire à celle de la PTP55. La séquence d'acides aminés traduite est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2.
Les séquences des PTP35 d'E. intestinalis et d'E. hel l em représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 4 et SEQ ID No :5 contiennent respectivement 825 et 816 nucléotides non compris le codon stop. Les protéines correspondantes sont constituées de 277 et 272 acides aminés. 4 ) Expression des PTPs chez Escherichia coli . Une partie de la PTP55 d'E. c un i c u l i correspondant à la région entre les peptides PI et P2 a été clonée dans un vecteur d'expression pQE30 (Qiagen) et exprimée chez E. c o l i (souche M15) . La protéine recombinante a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonnes de nickel et injectée à des souris. Les anticorps correspondants testés en immunoblotting, immunofluorescence et en microscopie électronique à transmission ont permis de confirmer que cette protéine était bien localisée au niveau du tube polaire d'E. cuniculi .
Une partie de la PTP35 entre les résidus 27 et 277 a également été exprimée chez E. col i selon la même technique. Les anticorps produits contre cette protéine recombinante ont montré un marquage du tube polaire.
5) Analyse des séquences primaires des PTP55 et PTP35. L'analyse Blast n'a montré aucune homologie significative avec d'autres protéines connues, si ce n'est avec le collagène, principalement dû au fait que la PTP55 est riche en résidus glycine et proline. a) Les PTP55 sont riches en résidus proline, glycine, glutamine, serine et threonine qui représentent à eux 5 plus de 55% du contenu en acides aminés. Le site de clivage (entre les résidus serine et alanine de la PTP55 d'E. cun i cul i ) proposé est prédit comme tel par les caractéristiques suivantes : - absence de résidu lysine en position 22 précédant le peptide PI séquence (23-42) après digestion de la protéine par l'Endolysine C, sequençage N-terminal de la protéine correspondant à celui du peptide PI, - présence d'acides aminés hydrophobes dans cette région N-terminale,
- algorithme de von Heijne,
- structure secondaire en hélice α. La PTP est vraisemblablement synthétisée par E. cuniculi (ou E. in tes tinalis) sous forme d'un plus grand précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est éliminée lors de la maturation. La protéine mature aurait donc une masse moléculaire de 37230 Da. Des sites de N-glycosylation (NETS, NGTS et
NISG) sont présents dans la séquence. La présence de nombreux résidus serine et threonine (21,6%) laisse également supposer des sites de O-glycosylation.
La région centrale de la protéine PTP55 d'E. cuniculi est caractérisée par 4 répétitions en tandem de 26 acides aminés chacune avec une conservation au niveau nucléique. Cette région est partiellement encadrée par 2 autres répétitions de 9 acides aminés. Aucune répétition n'est observée dans la séquence PTP55 d'E. intestinalis , mais les 2 PTP55 présentent de fortes homologies dans les parties N- et C- terminales. b) Les PTP35 sont particulièrement riches en résidus lysine (11.5%) et acide glutamique (9%). 3 sites de clivages potentiels d'une séquence signal sont représentés entre les résidus 12 et 13, 13 et 14, et 22 et 23. Une séquence RGD est présente dans la PTP35 d'E. cuniculi et d'E. in tes tinal i s , séquence que l'on retrouve dans des protéines telles que la fibronectine et qui intervient dans des phénomènes d'attachement cellulaire. Un site potentiel de N-glycosylation (NSTS) est également présent dans la séquence PTP35 d'E. cuniculi .
6) Localisation chromosomique et estimation du nombre de copies . L'hybridation d'une sonde, correspondant à une partie du gène codant pour la PTP55, sur les chromosomes d'E. cuniculi séparés par electrophorese en champs puisé a montré une localisation unique de ce gène sur le chromosome VI.
La même sonde a été appliquée sur des Southern après digestion de 1 ' ADN génomique d'E. cuni cul i par différentes enzymes de restriction : une seule bande est marquée sur chaque profil de digestion, ce qui permet d'affirmer que le gène existe en une seule copie.
Le gène codant pour la PTP35 d' E . cuni cul i est également localisé sur le chromosome VI.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Protéine complète purifiée de tube polaire de microsporidie.
2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa masse moléculaire apparente est d'environ 55 kDa et son point isoélectrique de l'ordre de 5.
3) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa masse moléculaire apparente est d'environ 35 kDa et son point isoélectrique de l'ordre de 9.
4) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:l, un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
5) Protéine selon la revendication 4, constituée par ou comprenant la séquence comprise entre les acides aminés 23 et 395 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No:l.
6) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3 , un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
7) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2 , un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci. 8) Protéine selon la revendication 7, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 277 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2.
9) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 4 un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
10) Protéine selon la revendication 9, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 275 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 4.
11) Protéine selon la revendication 1, dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 5 un fragment ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celle-ci.
12) Protéine selon la revendication 11, constituée par ou comprenant la séquence comprises entre les acides aminés en position 1 et 272 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 5.
13) Anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 14) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephali tozoon comprenant les étapes suivantes : a) on immobilise une protéine recombinante de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendications 1 à 12 sur un support d'analyse, b) on sature les sites aspécifiques de réaction, c) on incube le produit obtenu à l'étape (b) avec les anticorps du sérum d'un sujet à tester, d) on élimine par lavage les anticorps du sérum qui ne sont pas complexés à l'étape (c) , e) on incube le produit de l'étape (d) avec des anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule permettant leur révélation, f) on élimine par lavage les anticorps antihumains qui ne sont pas liés spécifiquement et, g) on révèle par tout moyen approprié les complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum / protéine, formés à l'étape (e) .
15) Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est constitué par: - un support d'analyse sur lequel sont immobilisées des protéines recombinantes de tube polaire de microsporidie ,
- une solution contenant des anticorps antihumains couplés à une molécule permettant leur révélation, et,
- une notice décrivant les étapes du procédé de diagnostic selon la revendication 14. 16) Molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
17) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1830 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou sa séquence complémentaire.
18) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1113 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3 ou sa séquence complémentaire.
19) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 1740 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2 ou sa séquence complémentaire.
20) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 825 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 4 ou sa séquence complémentaire .
21) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 comprenant ou constituée par la séquence comprise entre les nucléotides 1 et 816 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 5 ou sa séquence complémentaire. 22 ) Vecteur comprenant au moins une molécule d ' acide nucléique selon l ' une quelconque des revendications 16 à 21 , avantageusement associée à des séquences de contrôle .
23) Un hôte transformé par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 16 à 21 ou par un vecteur selon la revendication 22.
24) Procédé de production ou d'expression dans un hôte d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon l'une des revendications 1 à 12 , caractérisé en ce qu ' il consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 16 à 21 ou un vecteur selon la revendication 22 dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine de tube polaire de microsporidie,
- à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines .
25) Une sonde nucléique éventuellement marquée constituée de tout ou partie d'une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 16 à 21.
26) Procédé de diagnostic des infections provoquées par les microsporidies du genre Encephali tozoon comprenant les étapes suivantes : a) on extrait de 1 ' ADN de spores microsporidiennes prélevées dans des échantillons biologiques, b) on amplifie 1 'ADN extrait par tout moyen approprié, c) on immobilise les produits d'amplification sur un support d'analyse, d) on détermine l'origine microsporidienne des produits d'amplification par hybridation à l'aide d'au moins une sonde nucléo t idique marquée selon la revendication 25 spécifique d'une microsporidie.
27) Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il est constitué par:
- les moyens nécessaires à l'amplification des séquences à analyser, - un support d'analyse pour fixer les produits de l'amplification, des sondes génériques et/ou spécifiques marquées, et
- une notice décrivant les étapes du procédé de diagnostic selon la revendication 26.
PROTEINES DE TUBE POLAIRE DE MICROSPORIDIE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES PROTEINES ET LEURS APPLICATIONS .
L'invention a pour objet des protéines complètes purifiées de tube polaire de microsporidie et plus particulièrement les protéines dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No : 1 , SEQ ID No : 2 , SEQ ID No:3, SEQ ID No : 4 , SEQ ID No : 5.
L'invention a également pour objet les gènes codant ses protéines, et leur utilisation dans les domaines du diagnostic.
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