CA2204511A1 - Production de peptides recombinants, analogues de peptides naturels hydrophobes - Google Patents
Production de peptides recombinants, analogues de peptides naturels hydrophobesInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de sécrétion d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules transformées par une construction d'acides nucléiques comportant des éléments assurant l'expression et la sécrétion dudit peptide par la cellule, et une séquence codant pour un peptide dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans une région hydrophobe non transmembranaire du peptide, et en ce que l'on récupère le peptide et/ou les cellules portant ledit peptide recombinant. L'invention concerne également un peptide recombinant susceptible d'être ainsi obtenu, une séquence d'ADN correspondante et une bactérie la contenant.
Description
CA 02204jll 1997-Oj-Oj WO 96/14409 ~ ~ 1ir~SJ'~,1464 PRODUCTION DE PEPTIDES RECOMBINANTS
La présente invention se rapporte à des peptides recombinants, analogues de peptides na~urels, et ayant conservé l'ac~ivité biologique de 5 ces peptides naturels. Ccs peptides peuvent être e.~;primés par différents types de cellules et leur production est améliorée par rapport à celle du peptide naturel.
Par peptide on entend toutc substance composée d'un enchaînement d'acides aminés, c'est-à-dire oligopeptide, polypeptide et protéine.
Les peptides possèdent une grande variétc de propriétés biologiques, et pour éviter les problèmes notamment de contamination liés au~; techniques de purification à partir de produits biologiques, on a été
amené à les produire par génie génétique.
Toutefois, la production de peptides par voie recombinante se heurte à des difficultés liées au système d'expression et à la cellule hote. En effet, pour faciliter leur récupération, il est souhaitable que les pcptides soient e,~;crétés à travers la membrane cellulaire, afin de les obtenir dans le milieu e~;tracellulaire ou, dans le cas de bactérie Gram négatif, dans l'espace périplasmique. On peut introduire dans une cellulc, cn particulier ~0 une bactérie, un système permcttant l'e.~pression du peptide sous forme fusionnée a~ec une séquencc d'ancrage mcmbranaire, de manière à
obtenir le produit de fusion lié de manièrc covalen~c, à la surface mem branaire.
C'est ainsi que dans le cadre de la prcparation de vaccin contre le VRS, les demandeurs ont mis au point un procédé de technique d'ADN
recombinant permettant de modifier ponctuellemellt par mutagénèse dirigée, des nucléotides dans Ull gène codant pour une séquence pol) peptidique, utile notamment pour l'obtention dc vaccins par voie orale contre le virus respiratoire syncitial (VRS) .
Le ~irus respiratoire s~ncytial (VRS) est 1~ c~use la plus frequente de maladies respiratoires chez Ic nouveau-nc: bronchopneumopathies (bronchiolites). I.'O~IS cstimc chaquc anlléc ~0 millions dc cas atleints du VRS, dont 160 000 dccès dans le monde entier. Il c~iste dcu~; sous groupes du virus (sous groupes A ct 13).
3~ Le VRS est classc dans la ramille d~s l'aram~ ~;oviridac, genre pneumovirus comportant un gellomc ARN 11011 segmenté, de polarité
né~ative, codant pour 10 pro~cincs spécifiques.
- ~ -CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCTtl;~95/01464 Il n'existe pas actuellement de vaccin disponible, contre le VRS. Les vaccins à virus inactivé se sont montrés inefficaces et ont même parfois aggravé les infections des nourrissons. Dans les années 60, les tentatives de vaccination avec le VRS inactivé à la formaline ont conduit à l'échec:
au lieu de conférer une protection lors de la réinfection due au VRS, le vaccin a eu pour effet d'aggraver la maladie chez l'enfant.
La demande WO 87/0~185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un VaCCill, comme les protéines d'enveloppc appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
1~ demande WO ~9/0~935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou désacétylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Toutefois les vaccins immunitaires testés ~i ce jour se sont montrés inefficaces ou ont induit une pathologie pulmonaire ( bronchiolite ou péribronchite) .
A l'heure actuelle il n'e~;iste pas de traitement de fond des infections dues au VRS.
Les infeccions au VRS des voies aéricnncs supérieures: le traitement repose essentiellement sur lcs médications symptomatiques identiques à celles des autres infcctions virales.
Les infections au VRS des voies aériennes inférieurcs: le traitement chez les nourrissons repose sur le maintiell d'une hydratation correcte, I'aspiration des sécrétions et l'admillistration d'o~;ygène si besoin. Un effet positif a été observé ~vec la ribavirine, nucléotide actif in vitro contre le VRS.
Afin de faciliter l'administration du VaCCill, il serait souhaitable de disposer d'un produit ac(if par voie oralc, générallt UllC bonlle immunité, avec des effets secondaires redui~s.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/IiRg5/01464 Les demandeurs ont construit un système vecteur original, appelé
encore vecteur navette, qui est fonctionnel dans Escherichia coli et Staphylococcus ~ylosus: le vecteur renferme un signal séquence de sécrétion S, et une région Xl~l d'ancrage membranaire d'origine de la S protéine A du Staphylococcus aureus, avec un site de clonage entre S et XM
permettant d'insérer un ou plusieurs gènes.
Afin de faciliter le passage transmembranaire du peptide, l'hydrophobicité de la molécule doit dans certains cas être modifiée.
Cependant, ces modifications ne doivent pas altérer les propriétés 10 biologiques, notamment immunogènes du produit.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé de production d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé
en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule 15 une construction d'ADN, codallt pour un peptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans ladite région hydrophobe, et comportant des éléments assurant l'e.~pression et la sécrétion dudit peptide par la cellule, et en ce que, après culture des cellules, on récupère le peptide et/ou les
La présente invention se rapporte à des peptides recombinants, analogues de peptides na~urels, et ayant conservé l'ac~ivité biologique de 5 ces peptides naturels. Ccs peptides peuvent être e.~;primés par différents types de cellules et leur production est améliorée par rapport à celle du peptide naturel.
Par peptide on entend toutc substance composée d'un enchaînement d'acides aminés, c'est-à-dire oligopeptide, polypeptide et protéine.
Les peptides possèdent une grande variétc de propriétés biologiques, et pour éviter les problèmes notamment de contamination liés au~; techniques de purification à partir de produits biologiques, on a été
amené à les produire par génie génétique.
Toutefois, la production de peptides par voie recombinante se heurte à des difficultés liées au système d'expression et à la cellule hote. En effet, pour faciliter leur récupération, il est souhaitable que les pcptides soient e,~;crétés à travers la membrane cellulaire, afin de les obtenir dans le milieu e~;tracellulaire ou, dans le cas de bactérie Gram négatif, dans l'espace périplasmique. On peut introduire dans une cellulc, cn particulier ~0 une bactérie, un système permcttant l'e.~pression du peptide sous forme fusionnée a~ec une séquencc d'ancrage mcmbranaire, de manière à
obtenir le produit de fusion lié de manièrc covalen~c, à la surface mem branaire.
C'est ainsi que dans le cadre de la prcparation de vaccin contre le VRS, les demandeurs ont mis au point un procédé de technique d'ADN
recombinant permettant de modifier ponctuellemellt par mutagénèse dirigée, des nucléotides dans Ull gène codant pour une séquence pol) peptidique, utile notamment pour l'obtention dc vaccins par voie orale contre le virus respiratoire syncitial (VRS) .
Le ~irus respiratoire s~ncytial (VRS) est 1~ c~use la plus frequente de maladies respiratoires chez Ic nouveau-nc: bronchopneumopathies (bronchiolites). I.'O~IS cstimc chaquc anlléc ~0 millions dc cas atleints du VRS, dont 160 000 dccès dans le monde entier. Il c~iste dcu~; sous groupes du virus (sous groupes A ct 13).
3~ Le VRS est classc dans la ramille d~s l'aram~ ~;oviridac, genre pneumovirus comportant un gellomc ARN 11011 segmenté, de polarité
né~ative, codant pour 10 pro~cincs spécifiques.
- ~ -CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCTtl;~95/01464 Il n'existe pas actuellement de vaccin disponible, contre le VRS. Les vaccins à virus inactivé se sont montrés inefficaces et ont même parfois aggravé les infections des nourrissons. Dans les années 60, les tentatives de vaccination avec le VRS inactivé à la formaline ont conduit à l'échec:
au lieu de conférer une protection lors de la réinfection due au VRS, le vaccin a eu pour effet d'aggraver la maladie chez l'enfant.
La demande WO 87/0~185 a proposé d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un VaCCill, comme les protéines d'enveloppc appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G, une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N).
1~ demande WO ~9/0~935 décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou désacétylée.
Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes.
Toutefois les vaccins immunitaires testés ~i ce jour se sont montrés inefficaces ou ont induit une pathologie pulmonaire ( bronchiolite ou péribronchite) .
A l'heure actuelle il n'e~;iste pas de traitement de fond des infections dues au VRS.
Les infeccions au VRS des voies aéricnncs supérieures: le traitement repose essentiellement sur lcs médications symptomatiques identiques à celles des autres infcctions virales.
Les infections au VRS des voies aériennes inférieurcs: le traitement chez les nourrissons repose sur le maintiell d'une hydratation correcte, I'aspiration des sécrétions et l'admillistration d'o~;ygène si besoin. Un effet positif a été observé ~vec la ribavirine, nucléotide actif in vitro contre le VRS.
Afin de faciliter l'administration du VaCCill, il serait souhaitable de disposer d'un produit ac(if par voie oralc, générallt UllC bonlle immunité, avec des effets secondaires redui~s.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/IiRg5/01464 Les demandeurs ont construit un système vecteur original, appelé
encore vecteur navette, qui est fonctionnel dans Escherichia coli et Staphylococcus ~ylosus: le vecteur renferme un signal séquence de sécrétion S, et une région Xl~l d'ancrage membranaire d'origine de la S protéine A du Staphylococcus aureus, avec un site de clonage entre S et XM
permettant d'insérer un ou plusieurs gènes.
Afin de faciliter le passage transmembranaire du peptide, l'hydrophobicité de la molécule doit dans certains cas être modifiée.
Cependant, ces modifications ne doivent pas altérer les propriétés 10 biologiques, notamment immunogènes du produit.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé de production d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé
en ce qu'il comprend une étape dans laquelle on introduit dans une cellule 15 une construction d'ADN, codallt pour un peptide dont la séquence d'acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans ladite région hydrophobe, et comportant des éléments assurant l'e.~pression et la sécrétion dudit peptide par la cellule, et en ce que, après culture des cellules, on récupère le peptide et/ou les
2~) cellules portant ledit peptide recombinallt.
De préférence, la séqucnce d'acides amines est modifiée au moins dans une région différente de la région transmembranairc du peptide naturel.
La modification devra de préférencc intcrvenir dans une région 25 non essentielle pour l'activité biologique d'intérêt du peptide, qui doit être maintenue.
Ce procédé met Cll jeu une construction d'ADN recombinallt dans laquelle une séquence signal de secrétion fonctionnelle est liée à un gène de structure qui a été altéré afin de modifier la structure qui permette au 30 produit recombinant de traverser la membrane de la cellule hôte, alors que le produit recombinall~ du gène de structurc d'origine ne l'est pas ~ quant il est lié à la même séquence signal dc secrétion; et les modificatiolls structurelles du produit recombinant devraient être réalisées par génic ~ génétique en altérant la localisation du produit recombinant c.~;primé dans 35 une cellule hôte.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCI'1:~95/01464 Les modifications, selon un aspect de l'invention, visent à modifier l'hydrophobicité du produit recombinant.
L'invention a donc pour objet un procédé de production de peptide recombinant dans lequel les modifications structurelles du gène 5 conduisent à un peptide dans lequel au moins un acide aminé hydrophobe de la séquence du peptide naturel est remplacé par un acide aminé non hydrophobe. Dans un autre mode de réalisation dans le peptide recombinant, au moins un acide aminé hydrophobe est délété de la séquence du peptide naturel.
Avantageusement, I'acide aminé hydrophobe est choisi dans le groupe suivant: Tryptophane, Phénylalanine, Proline, Valine, Alanine, Isoleucine, Leucine et Méthionine.
Les modifications structurelles du gène peuvent être faites par insertion de nucléotides, ou par délétion de nucléotides.
Les constructions dans lesquelles les modifications structurelles du gène sont faites par substitution de nucléotides par mutagénèse dirigée sont également comprises dans l'invention.
Les modifications structurelles du gène pourront changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit e,~;posé à la surface membranaire de la cellule par une liaison covalente à la partie d'ancrage membranaire.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, les modifications structurelles du gène peuvent changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit sécrété dans le milieu de culture.
L'invention a donc également pour objet la construction d'ADN qui comprend une séquence signal de sécrétion liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour le peptide recombinant, et assurant la translocation dudit peptide et sa sécrétion e~;tracellulaire.
Selon un autre aspect, I'invention se rapporte à un procédé
caractérisé en ce que la construction d'ADN comprcnd une séquence signal liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide et permettant la translocation du peptide ~i travers la membrane de la cellule hôte et son ancrage membranaire.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 Des peptides recombinants susceptibles d'être obtenus par le procédé caractérisés en ce qu'ils diffèrent du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel sont un autre des objets de l'invention. Ils peuvent se présenter ancrés à 1~
5 surface de la cellule hôte. Ces peptides seront notammcnt choisis parmi les analogues d'une protéine de structure du VRS ou d'un fragment d'une telle protéine; plus particulièrement, le peptide recombinant comprend une séquence analogue de la protéine G du VRS, sous groupc A ou B, notamment comprise entre les résidus 130 et 230 de la protéine G du VRS en présentant 10 au moins 80 % d'homologie.
La protéine G est une glycoprotéine d'enveloppe du VRS, de poids moléculaire compris entre 81 et 90 Kd, pauvre en méthionine. La séquence de la protéine G diffère pour les sous-groupes A et B du VRS; les termes ~séquence de la protéine G" lorsqu'ils sont employés dans la présente 15 demande, doivent s'entendre comme se référant à la fois à la séquence du sous-groupe A ou du sous-groupe B, lorsque cela n'est pas précisé
différemment.
La Demanderesse a mis en évidence que la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G naturellc est particulièrement 20 appropriée pour induire une protcction efricacc contrc l'infection par le VRS, sous-groupes A et 13, sans induire les pathologies observées avec les vaccins basés sur le virus cntier inactivé par Ic formol, ou observécs avec les protéines F et G entières.
Les moyens permettant l'expression du polypeptide sont COIlllUS de 2S l'homme du métier et sont adaplés en fonction de la bactérie utilisée.
De préférence, la séquence d'ADI~ esl introduite sous forme d'un plasmide, tel qu'un plasmide navette.
Les protéines du VRS ont été à ce jour c~;primées d~ns différents systèmes d'expression comme le virus de la vaccine, les baculovirus ou les 30 adénovirus. Cependan~, des problèmes potcntiels SOIIt associés à la présence de particules viralcs résiduelles.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO g6/14409 PCT/I;R95/01464 Dans un de ses modes de mise en oeuvre, le procédé selon la présente invention utilise une bactérie commensale de l'homme, apathogène et comestible. En particulier, la bactérie peut appartenir au genre Staphylococcus. Staphylococcus ~;ylosus qui esI une bactérie utilisée dans I'industrie alimentaire depuis de nombreuses années, et peut être administrée, vivante, par voie orale. Des systèmes d'e~;pression d'épitopes hétérologues à la surface de S. xylosus ont été notamment décrits par N'guyen et al dans Gene, 1993, 12~: 89-9~.
De préférence, le polypeptide hétérologue est exprimé à la surface de la membrane de la bactérie, sous une conformation essentiellement identique à celle de l'épitope correspondant de la protéine G naturelle.
La présentation de la protéine recombinante à la surface membranaire de la bactérie dépend de sa nature chimique et de son enchaînement peptidique.
On peut u~iliser la séquence naturelle de la protéine G du VRS et introduire une séquence d'ADN codant pour un peptide comportant la séquence ID n~ 1 ou la séquence ID n~ 2.
Selon un aspect de l'invelltion, dans la séquence correspondant à la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G, I'acide aminé cystéine en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par Ull acide aminé ne forman~ pas de pont disulrure, en particulier la serille.
Une telle mutation fa~orise la rormation du pont disulfure en~re Ies résidus cystéine restant en positions 176 et 182, qui est critique pour l'immunogénicilé de la séquence; elle évite la formation de ponts disulfures désordonnés.
Des peptides utiles pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont ceu~;
comportant notamment l'une des séquences ID n~ 3 ou ID n~ -l.
Selon un autre aspect de l'invelltioll dans la séquence du polypeptide hétérologue correspolldallt à la protéine G du VRS, les acides ~20 aminés phénylalanine correspolldallI au.~; pOSitiOllS lG3, 165, lG8 et/ou 170 de la séquence de la protéille G sont remplaces par Ull acide~ aminé polaire, en particulier la sérine Cette modification peut être associée au.~; mutations precédemmen~
citées. Un tel polypeptide peut notamment présenter la séquence ID n~ 5.
CA 02204jll 1997-Oj-Oj Lors de la mise en oeuvre du procédé, la suppression de la région hydrophobique située en amont de la boucle critique formée par le pont disulfure entre les acides aminés cystéine en positions 176 et 182, permet à
la protéine recombinante de mieu.~; traverser la membrane bactérienne et 5 d'e~cposer correctement la partie immunodominante à la surface membranaire.
Selon encore un autre aspect de l'invention, dans la séquence peptidique correspondant à la protéine G du VRS, la séquence comprise entre les acides aminés numérotés 162 et 170 est délétée.
Plus particulièrement la séquence du peptide hétérologue exprimée dans la bactérie peut comporter la séquence ID n~ 6.
L'invention comprend également une bactérie e~primant un peptide ou une protéine, susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit dans la présente demande. Ladite bactérie peut être utilisée vivante ou tuée.
Les polypeptides ou les bactéries présentant une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessus sont utiles à titre de médicament.
L'invention comprend des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un polypeptide ou unc bactérie selon l'invention en mélange avec des adjuvants pharmaceu~iquement acceptables Le vaccin oral à base de vecteur vi~ant doit comprcndre la protéine modifiée qui présente la conformation optimale pour induire la mcilleure protection contre le VRS.
C'est pourquoi la présente invention à également pour objet une application d'une telle composition pharmaccutiquc à la préparation d'un vaccin par voie orale destiné à prévenir Ics infcctiolls provoquées par le virus respiratoire syncytial.
Enfin, I'invention a pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un peptide recombinallt analogue d'un peplide naturel cel que décrit précédemment; ccs séquenccs peuvent comportcr en ou~re des élémen~s assurant l'e:;pressioll du pcptidc dans unc ou plusicurs cellules hotes spécifiques. Ces éléments permettcnt de cibler les cellules dans lesquelles CA 02204~11 1997-0~-0~
la construction va s'exprimer lors de son administration à un mammifère, humain ou animal. Il peut s'agir de constructions d'ADN ou d'ARN, qui seront de préférence incorporées dans un vecteur. Des vecteurs a~ o~liés sont notamment des plasmides ou des virus du ~ype Adenovirus, 5 qui pourront être formulés dans des compositions pharmaceutiques avec des excipients acceptables.
Selon l'un de ses aspects, I'invention a pour objet des séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine 10 G du virus respiratoire ou pour un polypeptide présentant au moins 80 %
d'homologie avec ladite séquence peptidique, et comportant en outre les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane d'une bactérie non pathogène du genre Staphylococcus.
Une séquence d'ADN qui comprend 1~ - une séquence signal de sécrétion fonctionnelle, - une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide recombinant présentant au moins une modification dans la région hydrophobe non trallsmembranaire du peptide naturel, 2~) fait partie de l'invention.
Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes:
a. transformer les cellules hôtes avec une constructioll d'ADN
recombinant renfermant une séquence signal qui est liée dc manière opérationnelle à un gène structurel, et que ce dernier soit modifié de telle ~5 sorte que le produit recombinant peut être translocaté à travers la membrane de la cellule hôte;
b. fermenter ladite cellule hôte pour e:~primer le produit recombinant;
c. récupérer les protéines extracellulaires, sécrétées par les cellules 30 transformées par les constructions.
CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96/14409 PCI~/FR95/01464 L'invention comprend également une cellule recombinante qui contient une séquence d'ADN ou une construction telle que définie précédemment Cette cellule hôte peut être une bactérie, Gram+ ou Gram-, une 5 cellule de levure ou une cellule de m~mmifère.
Des bactéries particulièrement adaptées sont choisies dans le groupe comprenant Escherichia coli, Staphylococcus ,~ylosus, Staphylococcus carnosus.
La séquence d'ADN peut être intégrée dans le chromosome de la 10 bactérie, Gram positif ou Gram négatif Cette construction d'ADN recombinant peut renfermer le gène codant pour la protéine G de l'amino-acide 130 à 230 du VRS humain sous-groupe A fusionnée en amont et/ou en aval de celle du sous-groupe B.
Un type de construction peut être réalisé avec le gène codant pour la protéine de l'amino-acide 130 à 230 du VRS bovin appartenant au sous-groupe A, ou sous sous-groupe B.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée~
Dans ces e~;emples, on se référera au~ figures suivantes:
- Figure 1: Construction par assemblage de gènes du plasmide pRlT28G2av;
- Figure 2: 1) Construction du gène G2 substitué par des résidus serine;
2) Construction du gène G2 délété des résidus 162 à 170;
- Figure 3: Schéma des constructions de vecteurs navettes, en haut 25 pSE'mlpl8BBXM, en (A) vecteur pSE'G2BBXM; (B) vecteur pSE'G2subBBXM;
et (C) vecteur pSE'G2delBBXM;
- Figure 4 :Analyse par cytométrie de flu~ des protéines recombinantes de surface;
- Figure 5: Analyse par SDS-Page des protéines e~:traites de la membrane 30 de S. Xylosus recombinant;
- Figure 6: Schéma du principe de construction dcs vecteurs de sécrétion à
partir des vecteurs navcttes respectifs pSE'G2subBBXI~1 e~ pSE'G2delBBXl~I
dont les descriptions sont détaillées dans l'e.~;emple ~. Sont illustrés les produits sécrétés à partir du milieu de culture dc S. .~;ylosus portant des 35 vecteurs dont le codon Stop (T) a été inséré en amont de la région d'ancrage membranaire Xl~
CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96tl4409 P~l/r~!i5lol464 - Figure 7: Analyse par SDS-Page et immunoblot des protéines de fusion secrétées par S. ~losus;
- Figure 8: Analyse par cytométrie de ~flux des protéines secrétées par S.
xylosus portant différents vecteurs navettes.
s EXEMP~l~S
E~EMPLE 1:
I) Construction de G2 Par assembla~e de gènes svnthétiaues:
Le gène codant pour la région en amino-acides 130-230 de la glycoprotéine G du virus RS, nommé G2, où nous avons en plus changé
deux résidus Cys en position 173 et 186 en Ser par rapport à la séquence d'origine, est obtenu par les techniques d'assemblage de gènes en phase solide (Stahl S. et coL,1993. BioTechniques, 14:12~ 431). La séquence des oligonucléotides a été optimisée en combinant les codons usuels de bactéries telles que Ecoli et Staphylococcus.
Les oligonucléotides ont été synthétisés par la chimie des phosphoramidites sur le s~nthétiseur d'ADN automatique (Gene Assembler Plus, Pharmacia Biotech) selon les recommandations du constructeur. Les oligonucléotides à fixer en phase solide sont biotin)~lés en extrémité 5' par le réactif Biotin-on phosphoramidite (Clontech). Les autres oligonucléotides sont phosphorylés en 5' par le réactif Phosphate-on amidite (Clontech) selon le protocole de Clontech. Les oligonucléotides sont déprotégés et SOIIt purifiés selon les recommandations de Pharmacia. Les oligonucléotides biotinylés sont purifiés par chromatographie liquide sur phase réverse (colonne PEP RPC, Pharmacia).
Le gène est assemblé en deux parties: G2am (amont) de l'aa 130 à
177 avec deux sites de restriction BamHI et Pstl en 5' et 3' du gène, G2av (aval) de l'aa 177 à 230 avec deux sites de restriction Pstl et Baml{l en 5' et en 3' du gène. Le gène G2 est reconstitué en ligaturant les deu~: fragments G2am et G2av par le site Pstl.
a) Assembla~e de ~ène de ('.2am (Fl(.URI~ l):
Dans un micro tube, deu\ oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': T~11 B = 5'-Biotin-CCGGATCCT ~TGACCGTGA ~-3' -CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96tl4409 rCI~/FRg~i/01464 et TH2 = S '-G l l l l l GGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3 ' sont hybridés et immobilisés sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Dynal, Oslo, Norway). Le double brin immobilisé comprend un site de restriction BamHI et le brin complémentaire à celui qui est biotinylé possède 6 à 15 nucléotides de dépassement de son côté 5' (phosphorylé) permettant à
l'oligonucléotide suivant de venir s'hybrider. L'hybridation de ce dernier oligonucléotide est effectuée en élevant la température du milieu à 70 C
pour éviter la formation de structures secondaires. La ligature est faite en ajoutant de la T4 D~IA ligasc (Gibco BRL). Ainsi le gène est construit successivement en prenant la précaution à chaque cycle de rincer le support solide afin d'élimincr l'e~icès d'oli~onucléotides non liés avant d'ajouter l'oligonucléotide suivant. Le dernier double brin ligaturé
contient un site de restriction Pstl.
Le double brin est ensuite libéré de son support solide en le digérant avec les enzymes de restrictions BamHI et Pstl puis ligaturé dans le vecteur de clonage et de séquençage prit28 (Hultman et col., 1988, Nucleosides Nucleotides 7:629-638~ digéré par les memes enzymes: le vecteur résultant est pRlT28G2am de taille 30G7pb. La séquence nucléotique de G2am est déterminée par séquencage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
b) Assembla~e de ~eène de G7av (FIGURE 1):
De la même manière lc gène G2av est asscmblé en phase solide sur billes magnétiques par les deu~; premiers oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotin~lé en 5': TH13B =
(5'-Biotin-TGTGAAGCl~ AGTCGACCGG l l-l'G-3') Ct Tl-112 = (S'-GCCGACCACC
AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'), ainsi de SUitC. Le double brin est libéré
du support solide par digestion enzymatique successivement par Pstl et Hindlll, cloné dans pRlT28: le vecteur résultant est nommé pRlT28G2av de ~aille 3091pb. La séquence nucléotique de G2av est déterminée par - séquençage d'ADN sur lc scquenceur automatiquc ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
c) Construction du ~ène G2 = G2am + G2av:
Les deu~; fragments G2am et G2a~ sont ligaturés par le site de restriction Pstl et le gène constitué est cloné dans pRlT28 par les sites BamHI en 5' et ~lindlll en 3': Ic vecteur résultant est nommé pRlT28G2 de taille 3220pb. La séquence nucléotique de G2 est déterminée par séquen~age d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2 est digéré par BamHI et Hindlll et cloné dans le vecteur navette: pSE'GZBBXM
(7666 pb) (FIGURE 3) Liste des oligonucléotides nécessaires pour l'~ssemblage de gènes G2:
BamHI
THlB (20mer): 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGA A-3' BamHI
TH2 (30mer): 5'~11111~iGTTTTCACGGTCATAGC,ATCCGG-3' TH3 (28mer): 5'-AACCAAAAAC ACCACGACCA CCCAGACC-3' TH I (3 lmer): 5'-Gl~TGCTCGG CTGGGTCTGG GTGGTCGTGG T-3' TH5 (3 lmer): 5'-CAGCCGAGCA AACCGACCAC CAAACAGCGTC-3' TH6 (29mer): 5'-CGG 1 11~ 1 I C l'GACGCTGTT TGGTGGTCG-3' TH7 (29mer): 5'-AGAACAAACC GCCGMCAAA CCGAACAAC-3' TH8 (3~mer): 5' CITCGAAATG GAAATCGTl G TTCG(~ I I I(; I l'CGG3' TH9 (27mer): 5'-GATlTCCATTTCGAAGTGTTCAACrl'C-3' Pst I
lH 10 (33mer): 5'-l'GCTGCAC.AT GCTGCTCGGC ACGMGTTGA ACA-3 ' Pst I
THll (22mer):5'-GTGCCGAGCAGCATCTGCAC.CA-3' I lindlll THl2 (33mer): 5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACl'AAC.Cl IC ACA-3' CA 02204511 1997-05-OC, WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 Hindlll TH13B (19mer): 5'-Biothl-CCCTGTGAAG CTTGGTTTG-3' TH14 (32mer): 5'-CATMACCGC AGACCACCAA ACCGAAAGAA GT-3' TH15 (32mer): 5'-GTGGTCGGCACTT(_I I ICGGTTTGGTGGTCTG-3' 5 TH16 (3lmer): 5'-AAAACCGACC TTCMAACCA CCMMAAGA T-3' TH17 (31mer): 5'-CGGTI IATGA I~-I I I I I IGGTGGI I I I~MG-3' TH18(30mer): 5'-GGGCMAAM ACCACGACCA MCCGACCAA-3' TH19 (31mer): 5'~TCGGI I-I I I TGGTCG~I I I GGTCGTGGTTT-3' TH20 (34mer): 5'-GGGCGATCAG CAMCGTATC CCGMCMAA MCC-3' TH2 1 (33mer): 5'-TTTTGCCCGG I I I I l I GTTC GGGATACGTT TGC-3' Pst I
TH22(25mer): 5'-ATC TGCAGCMCA ACCCGACCTG CT-3' Pst I
TH23 (34mer): 5'-TGATCGCCCA GCAGGTCGGG I I~ CTGC AGAT-3' II) Construction de G2sub par muta~énèse diri~ée:
Le fragment de gène où les quatre résidus Phenylalanine en position 163, 165, 168 et 170 sont remplacés par des Scrines, est généré par amplification génique (PCR), à partir du gène G2 inséré dans le vecteur pRlT28, en utilisant comme couples d'amorces RIT27/TNG73 et RIT28/TNG72 (voir FIGURE 2.(1)). Les amorccs l NG72 ct TNG73 sont complémentaires d'unc région de 19 nucléotides rcnfermant trois des quatres Phénylalanine:
Rit27 : S'-GCTTCCGGCr CGT~ I ~ I I (; I GTG-3 ' Rit28: 5'-MAGGGGGAT GTGCl'GCMG GCG-3' TNG72 5'- C CAT rcc GM GTG TCC MC I~C GTG CCG AGC AG-3' TNG73 3 '- GC TTG CTA AGG GTA AGG CTT CAC AGG TTG-5 ' D'une part, I'amorce TNG73 introduit les trois premières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en amont amplifié avec RIT27. D'autre part I'amorce TNG72 introduit les Irois dernières mu~alions (TTC en TCC) sur Ic fragment en aval amplific avec RIT28. Cinq cycles de tempcratures (96 c, 15 sec; 50~c, 1 min; 72 c, I min) suivis dc Villgl c~clcs (9G c, lS sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Lcs dcu:; fragments amplifiés sont mélangés dans un CA 02204~11 1997-0~-0~
seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorces et la réaction d'e~tension est faite en cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 51 c, 30 sec; 72 c, 1 min). Le produit d'extension est dilué a 1/100 d~ns du tampon PCR contellant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).
Le fragment est ensuite digéré avcc les enzymes de restrictions BamHI/Hindlll et cloné dans le vecteur prit2 8 di~éré par les mêmes enzymes: pRlT28G2sub. La séquence nucléotiquc de G2Sub est déterminée par séquencage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2sub est digéré par Baml-ll et Hindlll et cloné dans le vecteur navette:
pSE'G2subBBXM (7666 pb)(FlGURE 3).
111) Construction de G2del: (voir FIGURE 2.(2)) De la même manière, le fragment de gène G2 délété de la partie renfermant les I résidus Phénylalanine de l'a~ 162 ;i l'aa 170 est généré
par PCR en deu~i fragments: en amont avec les amorces R11 27/TI-1 18 d'une part et en aval avec RIT28/T1111 d'autre part. Lcs amorces TH11 et TH48 sont complémentaires de 13 nucléotides.
TH11 5'-GTGCCGAGCA GCATC1'GCAG CA-3'
De préférence, la séqucnce d'acides amines est modifiée au moins dans une région différente de la région transmembranairc du peptide naturel.
La modification devra de préférencc intcrvenir dans une région 25 non essentielle pour l'activité biologique d'intérêt du peptide, qui doit être maintenue.
Ce procédé met Cll jeu une construction d'ADN recombinallt dans laquelle une séquence signal de secrétion fonctionnelle est liée à un gène de structure qui a été altéré afin de modifier la structure qui permette au 30 produit recombinant de traverser la membrane de la cellule hôte, alors que le produit recombinall~ du gène de structurc d'origine ne l'est pas ~ quant il est lié à la même séquence signal dc secrétion; et les modificatiolls structurelles du produit recombinant devraient être réalisées par génic ~ génétique en altérant la localisation du produit recombinant c.~;primé dans 35 une cellule hôte.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCI'1:~95/01464 Les modifications, selon un aspect de l'invention, visent à modifier l'hydrophobicité du produit recombinant.
L'invention a donc pour objet un procédé de production de peptide recombinant dans lequel les modifications structurelles du gène 5 conduisent à un peptide dans lequel au moins un acide aminé hydrophobe de la séquence du peptide naturel est remplacé par un acide aminé non hydrophobe. Dans un autre mode de réalisation dans le peptide recombinant, au moins un acide aminé hydrophobe est délété de la séquence du peptide naturel.
Avantageusement, I'acide aminé hydrophobe est choisi dans le groupe suivant: Tryptophane, Phénylalanine, Proline, Valine, Alanine, Isoleucine, Leucine et Méthionine.
Les modifications structurelles du gène peuvent être faites par insertion de nucléotides, ou par délétion de nucléotides.
Les constructions dans lesquelles les modifications structurelles du gène sont faites par substitution de nucléotides par mutagénèse dirigée sont également comprises dans l'invention.
Les modifications structurelles du gène pourront changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit e,~;posé à la surface membranaire de la cellule par une liaison covalente à la partie d'ancrage membranaire.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, les modifications structurelles du gène peuvent changer la localisation de telle manière que le produit recombinant soit sécrété dans le milieu de culture.
L'invention a donc également pour objet la construction d'ADN qui comprend une séquence signal de sécrétion liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour le peptide recombinant, et assurant la translocation dudit peptide et sa sécrétion e~;tracellulaire.
Selon un autre aspect, I'invention se rapporte à un procédé
caractérisé en ce que la construction d'ADN comprcnd une séquence signal liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide et permettant la translocation du peptide ~i travers la membrane de la cellule hôte et son ancrage membranaire.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 Des peptides recombinants susceptibles d'être obtenus par le procédé caractérisés en ce qu'ils diffèrent du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel sont un autre des objets de l'invention. Ils peuvent se présenter ancrés à 1~
5 surface de la cellule hôte. Ces peptides seront notammcnt choisis parmi les analogues d'une protéine de structure du VRS ou d'un fragment d'une telle protéine; plus particulièrement, le peptide recombinant comprend une séquence analogue de la protéine G du VRS, sous groupc A ou B, notamment comprise entre les résidus 130 et 230 de la protéine G du VRS en présentant 10 au moins 80 % d'homologie.
La protéine G est une glycoprotéine d'enveloppe du VRS, de poids moléculaire compris entre 81 et 90 Kd, pauvre en méthionine. La séquence de la protéine G diffère pour les sous-groupes A et B du VRS; les termes ~séquence de la protéine G" lorsqu'ils sont employés dans la présente 15 demande, doivent s'entendre comme se référant à la fois à la séquence du sous-groupe A ou du sous-groupe B, lorsque cela n'est pas précisé
différemment.
La Demanderesse a mis en évidence que la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G naturellc est particulièrement 20 appropriée pour induire une protcction efricacc contrc l'infection par le VRS, sous-groupes A et 13, sans induire les pathologies observées avec les vaccins basés sur le virus cntier inactivé par Ic formol, ou observécs avec les protéines F et G entières.
Les moyens permettant l'expression du polypeptide sont COIlllUS de 2S l'homme du métier et sont adaplés en fonction de la bactérie utilisée.
De préférence, la séquence d'ADI~ esl introduite sous forme d'un plasmide, tel qu'un plasmide navette.
Les protéines du VRS ont été à ce jour c~;primées d~ns différents systèmes d'expression comme le virus de la vaccine, les baculovirus ou les 30 adénovirus. Cependan~, des problèmes potcntiels SOIIt associés à la présence de particules viralcs résiduelles.
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO g6/14409 PCT/I;R95/01464 Dans un de ses modes de mise en oeuvre, le procédé selon la présente invention utilise une bactérie commensale de l'homme, apathogène et comestible. En particulier, la bactérie peut appartenir au genre Staphylococcus. Staphylococcus ~;ylosus qui esI une bactérie utilisée dans I'industrie alimentaire depuis de nombreuses années, et peut être administrée, vivante, par voie orale. Des systèmes d'e~;pression d'épitopes hétérologues à la surface de S. xylosus ont été notamment décrits par N'guyen et al dans Gene, 1993, 12~: 89-9~.
De préférence, le polypeptide hétérologue est exprimé à la surface de la membrane de la bactérie, sous une conformation essentiellement identique à celle de l'épitope correspondant de la protéine G naturelle.
La présentation de la protéine recombinante à la surface membranaire de la bactérie dépend de sa nature chimique et de son enchaînement peptidique.
On peut u~iliser la séquence naturelle de la protéine G du VRS et introduire une séquence d'ADN codant pour un peptide comportant la séquence ID n~ 1 ou la séquence ID n~ 2.
Selon un aspect de l'invelltion, dans la séquence correspondant à la séquence comprise entre les acides aminés 130 et 230 de la protéine G, I'acide aminé cystéine en positions 173 et/ou 186 a été remplacé par Ull acide aminé ne forman~ pas de pont disulrure, en particulier la serille.
Une telle mutation fa~orise la rormation du pont disulfure en~re Ies résidus cystéine restant en positions 176 et 182, qui est critique pour l'immunogénicilé de la séquence; elle évite la formation de ponts disulfures désordonnés.
Des peptides utiles pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont ceu~;
comportant notamment l'une des séquences ID n~ 3 ou ID n~ -l.
Selon un autre aspect de l'invelltioll dans la séquence du polypeptide hétérologue correspolldallt à la protéine G du VRS, les acides ~20 aminés phénylalanine correspolldallI au.~; pOSitiOllS lG3, 165, lG8 et/ou 170 de la séquence de la protéille G sont remplaces par Ull acide~ aminé polaire, en particulier la sérine Cette modification peut être associée au.~; mutations precédemmen~
citées. Un tel polypeptide peut notamment présenter la séquence ID n~ 5.
CA 02204jll 1997-Oj-Oj Lors de la mise en oeuvre du procédé, la suppression de la région hydrophobique située en amont de la boucle critique formée par le pont disulfure entre les acides aminés cystéine en positions 176 et 182, permet à
la protéine recombinante de mieu.~; traverser la membrane bactérienne et 5 d'e~cposer correctement la partie immunodominante à la surface membranaire.
Selon encore un autre aspect de l'invention, dans la séquence peptidique correspondant à la protéine G du VRS, la séquence comprise entre les acides aminés numérotés 162 et 170 est délétée.
Plus particulièrement la séquence du peptide hétérologue exprimée dans la bactérie peut comporter la séquence ID n~ 6.
L'invention comprend également une bactérie e~primant un peptide ou une protéine, susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit dans la présente demande. Ladite bactérie peut être utilisée vivante ou tuée.
Les polypeptides ou les bactéries présentant une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessus sont utiles à titre de médicament.
L'invention comprend des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent un polypeptide ou unc bactérie selon l'invention en mélange avec des adjuvants pharmaceu~iquement acceptables Le vaccin oral à base de vecteur vi~ant doit comprcndre la protéine modifiée qui présente la conformation optimale pour induire la mcilleure protection contre le VRS.
C'est pourquoi la présente invention à également pour objet une application d'une telle composition pharmaccutiquc à la préparation d'un vaccin par voie orale destiné à prévenir Ics infcctiolls provoquées par le virus respiratoire syncytial.
Enfin, I'invention a pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un peptide recombinallt analogue d'un peplide naturel cel que décrit précédemment; ccs séquenccs peuvent comportcr en ou~re des élémen~s assurant l'e:;pressioll du pcptidc dans unc ou plusicurs cellules hotes spécifiques. Ces éléments permettcnt de cibler les cellules dans lesquelles CA 02204~11 1997-0~-0~
la construction va s'exprimer lors de son administration à un mammifère, humain ou animal. Il peut s'agir de constructions d'ADN ou d'ARN, qui seront de préférence incorporées dans un vecteur. Des vecteurs a~ o~liés sont notamment des plasmides ou des virus du ~ype Adenovirus, 5 qui pourront être formulés dans des compositions pharmaceutiques avec des excipients acceptables.
Selon l'un de ses aspects, I'invention a pour objet des séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide porté par une séquence peptidique comprise entre les résidus aminoacides 130 et 230 de la protéine 10 G du virus respiratoire ou pour un polypeptide présentant au moins 80 %
d'homologie avec ladite séquence peptidique, et comportant en outre les moyens permettant l'expression du polypeptide à la surface de la membrane d'une bactérie non pathogène du genre Staphylococcus.
Une séquence d'ADN qui comprend 1~ - une séquence signal de sécrétion fonctionnelle, - une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide recombinant présentant au moins une modification dans la région hydrophobe non trallsmembranaire du peptide naturel, 2~) fait partie de l'invention.
Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes:
a. transformer les cellules hôtes avec une constructioll d'ADN
recombinant renfermant une séquence signal qui est liée dc manière opérationnelle à un gène structurel, et que ce dernier soit modifié de telle ~5 sorte que le produit recombinant peut être translocaté à travers la membrane de la cellule hôte;
b. fermenter ladite cellule hôte pour e:~primer le produit recombinant;
c. récupérer les protéines extracellulaires, sécrétées par les cellules 30 transformées par les constructions.
CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96/14409 PCI~/FR95/01464 L'invention comprend également une cellule recombinante qui contient une séquence d'ADN ou une construction telle que définie précédemment Cette cellule hôte peut être une bactérie, Gram+ ou Gram-, une 5 cellule de levure ou une cellule de m~mmifère.
Des bactéries particulièrement adaptées sont choisies dans le groupe comprenant Escherichia coli, Staphylococcus ,~ylosus, Staphylococcus carnosus.
La séquence d'ADN peut être intégrée dans le chromosome de la 10 bactérie, Gram positif ou Gram négatif Cette construction d'ADN recombinant peut renfermer le gène codant pour la protéine G de l'amino-acide 130 à 230 du VRS humain sous-groupe A fusionnée en amont et/ou en aval de celle du sous-groupe B.
Un type de construction peut être réalisé avec le gène codant pour la protéine de l'amino-acide 130 à 230 du VRS bovin appartenant au sous-groupe A, ou sous sous-groupe B.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée~
Dans ces e~;emples, on se référera au~ figures suivantes:
- Figure 1: Construction par assemblage de gènes du plasmide pRlT28G2av;
- Figure 2: 1) Construction du gène G2 substitué par des résidus serine;
2) Construction du gène G2 délété des résidus 162 à 170;
- Figure 3: Schéma des constructions de vecteurs navettes, en haut 25 pSE'mlpl8BBXM, en (A) vecteur pSE'G2BBXM; (B) vecteur pSE'G2subBBXM;
et (C) vecteur pSE'G2delBBXM;
- Figure 4 :Analyse par cytométrie de flu~ des protéines recombinantes de surface;
- Figure 5: Analyse par SDS-Page des protéines e~:traites de la membrane 30 de S. Xylosus recombinant;
- Figure 6: Schéma du principe de construction dcs vecteurs de sécrétion à
partir des vecteurs navcttes respectifs pSE'G2subBBXI~1 e~ pSE'G2delBBXl~I
dont les descriptions sont détaillées dans l'e.~;emple ~. Sont illustrés les produits sécrétés à partir du milieu de culture dc S. .~;ylosus portant des 35 vecteurs dont le codon Stop (T) a été inséré en amont de la région d'ancrage membranaire Xl~
CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96tl4409 P~l/r~!i5lol464 - Figure 7: Analyse par SDS-Page et immunoblot des protéines de fusion secrétées par S. ~losus;
- Figure 8: Analyse par cytométrie de ~flux des protéines secrétées par S.
xylosus portant différents vecteurs navettes.
s EXEMP~l~S
E~EMPLE 1:
I) Construction de G2 Par assembla~e de gènes svnthétiaues:
Le gène codant pour la région en amino-acides 130-230 de la glycoprotéine G du virus RS, nommé G2, où nous avons en plus changé
deux résidus Cys en position 173 et 186 en Ser par rapport à la séquence d'origine, est obtenu par les techniques d'assemblage de gènes en phase solide (Stahl S. et coL,1993. BioTechniques, 14:12~ 431). La séquence des oligonucléotides a été optimisée en combinant les codons usuels de bactéries telles que Ecoli et Staphylococcus.
Les oligonucléotides ont été synthétisés par la chimie des phosphoramidites sur le s~nthétiseur d'ADN automatique (Gene Assembler Plus, Pharmacia Biotech) selon les recommandations du constructeur. Les oligonucléotides à fixer en phase solide sont biotin)~lés en extrémité 5' par le réactif Biotin-on phosphoramidite (Clontech). Les autres oligonucléotides sont phosphorylés en 5' par le réactif Phosphate-on amidite (Clontech) selon le protocole de Clontech. Les oligonucléotides sont déprotégés et SOIIt purifiés selon les recommandations de Pharmacia. Les oligonucléotides biotinylés sont purifiés par chromatographie liquide sur phase réverse (colonne PEP RPC, Pharmacia).
Le gène est assemblé en deux parties: G2am (amont) de l'aa 130 à
177 avec deux sites de restriction BamHI et Pstl en 5' et 3' du gène, G2av (aval) de l'aa 177 à 230 avec deux sites de restriction Pstl et Baml{l en 5' et en 3' du gène. Le gène G2 est reconstitué en ligaturant les deu~: fragments G2am et G2av par le site Pstl.
a) Assembla~e de ~ène de ('.2am (Fl(.URI~ l):
Dans un micro tube, deu\ oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': T~11 B = 5'-Biotin-CCGGATCCT ~TGACCGTGA ~-3' -CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96tl4409 rCI~/FRg~i/01464 et TH2 = S '-G l l l l l GGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3 ' sont hybridés et immobilisés sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Dynal, Oslo, Norway). Le double brin immobilisé comprend un site de restriction BamHI et le brin complémentaire à celui qui est biotinylé possède 6 à 15 nucléotides de dépassement de son côté 5' (phosphorylé) permettant à
l'oligonucléotide suivant de venir s'hybrider. L'hybridation de ce dernier oligonucléotide est effectuée en élevant la température du milieu à 70 C
pour éviter la formation de structures secondaires. La ligature est faite en ajoutant de la T4 D~IA ligasc (Gibco BRL). Ainsi le gène est construit successivement en prenant la précaution à chaque cycle de rincer le support solide afin d'élimincr l'e~icès d'oli~onucléotides non liés avant d'ajouter l'oligonucléotide suivant. Le dernier double brin ligaturé
contient un site de restriction Pstl.
Le double brin est ensuite libéré de son support solide en le digérant avec les enzymes de restrictions BamHI et Pstl puis ligaturé dans le vecteur de clonage et de séquençage prit28 (Hultman et col., 1988, Nucleosides Nucleotides 7:629-638~ digéré par les memes enzymes: le vecteur résultant est pRlT28G2am de taille 30G7pb. La séquence nucléotique de G2am est déterminée par séquencage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
b) Assembla~e de ~eène de G7av (FIGURE 1):
De la même manière lc gène G2av est asscmblé en phase solide sur billes magnétiques par les deu~; premiers oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotin~lé en 5': TH13B =
(5'-Biotin-TGTGAAGCl~ AGTCGACCGG l l-l'G-3') Ct Tl-112 = (S'-GCCGACCACC
AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'), ainsi de SUitC. Le double brin est libéré
du support solide par digestion enzymatique successivement par Pstl et Hindlll, cloné dans pRlT28: le vecteur résultant est nommé pRlT28G2av de ~aille 3091pb. La séquence nucléotique de G2av est déterminée par - séquençage d'ADN sur lc scquenceur automatiquc ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
c) Construction du ~ène G2 = G2am + G2av:
Les deu~; fragments G2am et G2a~ sont ligaturés par le site de restriction Pstl et le gène constitué est cloné dans pRlT28 par les sites BamHI en 5' et ~lindlll en 3': Ic vecteur résultant est nommé pRlT28G2 de taille 3220pb. La séquence nucléotique de G2 est déterminée par séquen~age d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2 est digéré par BamHI et Hindlll et cloné dans le vecteur navette: pSE'GZBBXM
(7666 pb) (FIGURE 3) Liste des oligonucléotides nécessaires pour l'~ssemblage de gènes G2:
BamHI
THlB (20mer): 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGA A-3' BamHI
TH2 (30mer): 5'~11111~iGTTTTCACGGTCATAGC,ATCCGG-3' TH3 (28mer): 5'-AACCAAAAAC ACCACGACCA CCCAGACC-3' TH I (3 lmer): 5'-Gl~TGCTCGG CTGGGTCTGG GTGGTCGTGG T-3' TH5 (3 lmer): 5'-CAGCCGAGCA AACCGACCAC CAAACAGCGTC-3' TH6 (29mer): 5'-CGG 1 11~ 1 I C l'GACGCTGTT TGGTGGTCG-3' TH7 (29mer): 5'-AGAACAAACC GCCGMCAAA CCGAACAAC-3' TH8 (3~mer): 5' CITCGAAATG GAAATCGTl G TTCG(~ I I I(; I l'CGG3' TH9 (27mer): 5'-GATlTCCATTTCGAAGTGTTCAACrl'C-3' Pst I
lH 10 (33mer): 5'-l'GCTGCAC.AT GCTGCTCGGC ACGMGTTGA ACA-3 ' Pst I
THll (22mer):5'-GTGCCGAGCAGCATCTGCAC.CA-3' I lindlll THl2 (33mer): 5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACl'AAC.Cl IC ACA-3' CA 02204511 1997-05-OC, WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 Hindlll TH13B (19mer): 5'-Biothl-CCCTGTGAAG CTTGGTTTG-3' TH14 (32mer): 5'-CATMACCGC AGACCACCAA ACCGAAAGAA GT-3' TH15 (32mer): 5'-GTGGTCGGCACTT(_I I ICGGTTTGGTGGTCTG-3' 5 TH16 (3lmer): 5'-AAAACCGACC TTCMAACCA CCMMAAGA T-3' TH17 (31mer): 5'-CGGTI IATGA I~-I I I I I IGGTGGI I I I~MG-3' TH18(30mer): 5'-GGGCMAAM ACCACGACCA MCCGACCAA-3' TH19 (31mer): 5'~TCGGI I-I I I TGGTCG~I I I GGTCGTGGTTT-3' TH20 (34mer): 5'-GGGCGATCAG CAMCGTATC CCGMCMAA MCC-3' TH2 1 (33mer): 5'-TTTTGCCCGG I I I I l I GTTC GGGATACGTT TGC-3' Pst I
TH22(25mer): 5'-ATC TGCAGCMCA ACCCGACCTG CT-3' Pst I
TH23 (34mer): 5'-TGATCGCCCA GCAGGTCGGG I I~ CTGC AGAT-3' II) Construction de G2sub par muta~énèse diri~ée:
Le fragment de gène où les quatre résidus Phenylalanine en position 163, 165, 168 et 170 sont remplacés par des Scrines, est généré par amplification génique (PCR), à partir du gène G2 inséré dans le vecteur pRlT28, en utilisant comme couples d'amorces RIT27/TNG73 et RIT28/TNG72 (voir FIGURE 2.(1)). Les amorccs l NG72 ct TNG73 sont complémentaires d'unc région de 19 nucléotides rcnfermant trois des quatres Phénylalanine:
Rit27 : S'-GCTTCCGGCr CGT~ I ~ I I (; I GTG-3 ' Rit28: 5'-MAGGGGGAT GTGCl'GCMG GCG-3' TNG72 5'- C CAT rcc GM GTG TCC MC I~C GTG CCG AGC AG-3' TNG73 3 '- GC TTG CTA AGG GTA AGG CTT CAC AGG TTG-5 ' D'une part, I'amorce TNG73 introduit les trois premières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en amont amplifié avec RIT27. D'autre part I'amorce TNG72 introduit les Irois dernières mu~alions (TTC en TCC) sur Ic fragment en aval amplific avec RIT28. Cinq cycles de tempcratures (96 c, 15 sec; 50~c, 1 min; 72 c, I min) suivis dc Villgl c~clcs (9G c, lS sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Lcs dcu:; fragments amplifiés sont mélangés dans un CA 02204~11 1997-0~-0~
seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorces et la réaction d'e~tension est faite en cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 51 c, 30 sec; 72 c, 1 min). Le produit d'extension est dilué a 1/100 d~ns du tampon PCR contellant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).
Le fragment est ensuite digéré avcc les enzymes de restrictions BamHI/Hindlll et cloné dans le vecteur prit2 8 di~éré par les mêmes enzymes: pRlT28G2sub. La séquence nucléotiquc de G2Sub est déterminée par séquencage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2sub est digéré par Baml-ll et Hindlll et cloné dans le vecteur navette:
pSE'G2subBBXM (7666 pb)(FlGURE 3).
111) Construction de G2del: (voir FIGURE 2.(2)) De la même manière, le fragment de gène G2 délété de la partie renfermant les I résidus Phénylalanine de l'a~ 162 ;i l'aa 170 est généré
par PCR en deu~i fragments: en amont avec les amorces R11 27/TI-1 18 d'une part et en aval avec RIT28/T1111 d'autre part. Lcs amorces TH11 et TH48 sont complémentaires de 13 nucléotides.
TH11 5'-GTGCCGAGCA GCATC1'GCAG CA-3'
3'-GG( I1~;IIIGGCT~r.lrGCACGGCrCCICGl:5' = n~
Cinq cycles de tempcratures (96 c, 15 scc; 52 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Les deu~;
fragments amplifiés SOllt mclangés dans un seul tubc dilué dans du tampon de PCR sans amorce et la réaction d'e,~;tension est faite en cinq cvcles de températures (96 ~ c, 15 sec; ~2 ~ c, 30 sec; 72 ~ c, 1 min). Lc produit d'e.~tension est dilué à 1/100 dans du tampon PCR contenallt les amorces RIT27 et RIT28 et l'ampliricatioll géniquc est faite en 30 cvcles de températures (96 c, 15 sec; 60 c, 15 scc; 72 c, 30 sec). Ie fr~gmcnt est ensuite digéré avec Ics en~yMcs de rcstrictions l~ml-ll/l-lindlll ct CIOIlC
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCTtFR95/01464 dans le vecteur prit28 digéré par les memes enzymes: pRlT28G2del. La séquence nucléotique de G2del est déterminée par séquencage d'ADN sur I'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2del est digéré par Bam~ll et HindIII et cloné dans le vecteur navette: pSE'G2delBBXM (7639 pb)(FlGURE 3).
IV) Construction du vecteur navette:
Un linker d'oligonucléotides ( 5 '-AGCTTGGCTG TTCCGCCATG
GCTCGAG-3', avec le brin complémentaire) est inséré dans le site Hindlll du plasmide pSZZmpl8XM (I{ansson et col, 1992, J.Bacteriol 17~: ~239-12~5), créant ainsi deux sites de restriction supplémentaires Ncol et Xhol en aval du site Hindlll du vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)XM. Un fragment de gène codant 198 acides aminés, nommé BB, de la région de fi.~;ation du sérum albumine de la protéine G streptococcique (Nygren et col, ]988.
J.~lol.Reconig., 1:69-71), est généré par l'CR avec les amorces ( 1 =
5'-CCGAATICAA GCITAGATGC TCrAGCMAA GCCAA~3' et 2 = 5'~CCCrGCAGT
TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCAGCTAAA Al-l-lCATC-3') sur le template plasmidique pSPG1 (Guss et col, 1986,E~IBO J., 5: 1567-1575). Le fragment est digéré avec Hindlll et Xhol et cloné en aval du site multiple de clonage mpl8 du vecteur pSZZmpl8(Xhol)X~I; le vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)BBXI~I est digére par Notl el l-lindlll. Le fragment renfermant ZZ est remplacé p~r Ull autre fragmellt digéré par les mêmes enzymes de restriction du vec~eur pE'mpl8 (Sophia l-lober, non publié). Le vecteur navette résultant est nommé pSE'mpl8BBXI\1 (EIGURE 3).
EXEMPLE 2:
Extraction et analvse de protéilles membranaire~s des ~S. .~lo.sus recombinants:
Dans un erlenme~er de 1 litre, Oll inocule 250 ml de milieu (7,5 g de TSB, 12,5 g de Yeast e.~;tract) contell;lllt du Chloramphellicol (20 ~g/ml) ~vec 5 ml de préculture (o~ ernight) de S. ~-~losus transformé par le vecteur navette pSE'G2BBX~1 ou pSE'G2subBBX~1 ou pSE'G2delB13X~I selon le CA 02204jll 1997-0j-0j protocole de Gotz et col, 1981, J Bacteriol., 1~5:7 1-81. Incuber sous agitationà température = 32~ C pendant une durée de 6 heures. Centrifuger le milieu à 5000 rpm, 12 min e~ à température = 1~ C. Le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de TST, on rajoute 200 IJI de solution contenant de la S lysostaphine (1 mg/ml) et 200 IJI de Iysozymc (50 mg/ml). Incuber pendant une heure à température = 37~ C sous agitation modérée. Soniquer la solution pendant 2 min, avec l'appareil Vibra cell équipé d'une sonde dont la puissance est réglée à 7. Centriruger à 13 500 rpm, pendant 20 min, à température = 4~ C. Les protéines sont purifiées par affinité: le 10 surnageant est passé sur colonne d'affinité IlSA-Sépharose (Sérum Albumine Humaine). Après avoir rincé la colonne, les protéines sont éluées avec un tampon acide pH 2,7 et Iyophilisées.
Les protéines sont séparées sur deu.~ gels SDS-PAGE (12%) identiques avec les marqueurs de tailles moléculaires standard (Gibco BRL) 15 précolorés. Un gel est coloré au Bleu de Coomassie. Le deuxième est transféré sur membrane ProblotT~1 (Applied Biosystem) pour l'immunoblot avec l'anticorps spécifique anti-G 1 (obtenu à partir du sérum de lapin immunisé avec le peptide Gl(aal7 1-187) selon les protocoles courants d'immunisation). Voir Figure 5.
EXEMPLE 3:
Analvse r)ar C~tométrie dc flu~; (FACScallT~I) dcs protéinc~s recombinalltcs à la surface de S. ~ivlosus:
Les cultures des bactérics rccombinalltcs ~S. xylosus SOllt fai~es 25 comme décrit précédemment. Pour constituer une solution stoc~;, resuspend la bactérie dans une SOlUIiOIl de PBS ~i 0,1% de Sodium Azide (p/v) à la concentration finale estimée par densilc oplique (600nm) égale à l'unité. On aliquote 30 1ll de solution stocl; dans chaque puits cdnique d'une plaque de microtitrcs, Oll centrifuge à 550 g pendant 10 minutes à ~~
30 C. On resuspend Ic culot bactérien dans un volumc dc 150 IJI de SOlU~iOIl de PBS contenant du ~scrum lapill polvclollal allti-G_ (~ilrc 1/1 ~t~() 000) diluc CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96/14409 PCTIF'R95/01464 au 1/200ème, incubation pendant 30 minutes. On rince deu~ fois les cellules bactériennes avec du PBS et on incube dans 150 ~I d'une solution de PBS renfermant de l'anti-lapin FITC ~Sigma) dilué au 1/lOOème pendant une durée de 30 minutes. Après avoir rincé les cellules deu~; fois avec du 5 tampon PBS, on resuspend dans un tube Falcon contenant 1 ml de tampon PBS-Paraformaldéhyde lYo tp/v). Les échantillons préparés sont analysés sur l'appareil FACScanTM (Becton Dic};inson). La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel LYSIS IITM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir 10 Figure 4.
EXEMPLE 4:
Modulation secrétion-insertion en secrétion:
A partir des différents vecteurs navettes, il est possible d'insérer des 15 codons de terminaison en amont de la région codant pour l'ancrage membranaire X~l, comme le montre la figure G. Un site unique de restriction Xhol entre BB et XM a été utilisé pour insérer un double brin d'oligonucléotides codant pour trois codons terminaison (Ter) dans les deu.~;
sens d'orientation, avec introduction d'un site de restricliOn Aat ll:
Aat ll l'er Tcr Ter -->
5'-TC GAC GTC T~A TGA TAA TT~ TCA TTA G-3' 3'-G CAG ATT ACT Al~ MT AGT AAT CAG CT-5' <-- Ter Ter Ter 25 Les vecteurs pSE'G2subBBXI~I et pSE'G2delBBX~I SOllt ainsi digérés par Xho I
et sont ligaturés avec le double brin d'oligonucléotides pre~lablement phosphorylés en 5'. Les vecteurs résultants sont respectivement pSE'G2subBB[Ter]X~I (7693 pb) et pSE'G2delBB [ler~X~I (766G pb). La culture des E.coli ou des S.,~ylosus transFormées respectivement avec ces deu.~;
30 vecteurs suivie d'une purirication sur colonnc d'~ffinité (I-ISA Sépharose) permet d'obtenir des protéillcs G2subB13 e~ G2delBI3. La figure 7 montre: en CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/1i~95/01464 A) le gel SDS-PAGE, la séparation des protéines secrétées à partir des S.~ylosus, dans des conditions réduites, en 1 et en 2 représentent respectivement les protéines G2subBB et G2delBB à la taille attendue: 35,23 Kda et 34,28 Kda; en B) I'immunoblot des protéines montre que l'anticorps S spécifique à la région G(aal7~-187) ou Gl du VRS reconnaît bicn les deux protéines secrétées. Très peu de dégradations protéolytiques ont été
observées. De plus, I'analyse l:ACSCAN avec l'anticorps polyclonal anti-lapin, anti-BB a été réaliséc sur les différents S..~;,vlosus. 1~ figure 8 montre que les spectres de S.,~;ylosus portant des vecteurs navettes pSE'mpl8BBXM, 10 pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont déplacés dans l'axe de l'intensité de fluorescence vers la droite, c'est-a-dire vers la présence des an~igènes hétérologues à la surface de la bactérie. Alors que les spectres de S..~losus portant des vecteurs navettes pSE'G2subBBTerXI~1 et pSE'G2delBB l'erXM n'y sont pas déplacés, ceci indique que les antigènes hétérologues SOllt absents 15 à la surface de la baclérie et que l'on les a re~rouvés et purifiés à partir du milieu de culture.
WO 96/14409 PCT/FR9~i101464 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: PIERRE FABRE MEDICAMENT
(B) RUE: 45 PLACE ABEL GANCE
(C) VILLE: BOULOGNE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92100 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PRODUCTION DE PEPTIDES ANALOGUES DE
PEPTIDES ~YDROPHOBES, PEPTIDE RECOMBINANT, SEQUENCE D'ADN
CORRESPONDANTE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 94133~7 (B) DATE DE DEPOT: 07-NOV-1994 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96114409 PCTIIiR95/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Thr Vol Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe V~l Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Vol Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de b~ses (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: liné~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCI~/FRgS/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997 - 0~ - 05 WO 96/14409 PCTIFRg5/01464 Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: S:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Ser His Ser Glu Val Ser Asn Ser Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 276 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..276 CA 02204~11 1997-0~-0~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/F~g5/01464 LEGENDE DES FIC'.URES
Figure 5:
A) Coloration au bleu de Comassie: Gel SDS-Page des proteines de ~sion extraites de membrane bacterienne et purifiees par affinite sur colonne Albumine des differents constructions:
- Puits HW: Marqueurs de taille moleculaire (en Kda).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2BBXM].
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3: S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
B) Immunoblot des proteines de fusion extraites de membrane bacterienne e~ purifiees par affinité sur colonne Albumine des differen~s construc~ions avec anticorps polyclonal apin an~i-Gl.
- Puits HW: Marqueurs de taille moleculaire precolores (en Kda).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2BBXM~.
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3: S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
Figure 7:
A) Coloration au bleu de Comassie: Gel SDS-Page des proteines de fusion secré~ees et purifees par affinité sur colonne Albumine des differentes constructions:
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW: Marqueurs de taille moleculaire (en Kda).
B) Immunoblot des protéines de fusion secretées et purifees par affinite sur colonne Alburnine des différentes constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-Gl(VRS).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW: Marqueurs de taille moleculaire précoiores (en Kda).
Cinq cycles de tempcratures (96 c, 15 scc; 52 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c, 15 sec; 60 c, 15 sec; 72 c, 15 sec) Les deu~;
fragments amplifiés SOllt mclangés dans un seul tubc dilué dans du tampon de PCR sans amorce et la réaction d'e,~;tension est faite en cinq cvcles de températures (96 ~ c, 15 sec; ~2 ~ c, 30 sec; 72 ~ c, 1 min). Lc produit d'e.~tension est dilué à 1/100 dans du tampon PCR contenallt les amorces RIT27 et RIT28 et l'ampliricatioll géniquc est faite en 30 cvcles de températures (96 c, 15 sec; 60 c, 15 scc; 72 c, 30 sec). Ie fr~gmcnt est ensuite digéré avec Ics en~yMcs de rcstrictions l~ml-ll/l-lindlll ct CIOIlC
CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCTtFR95/01464 dans le vecteur prit28 digéré par les memes enzymes: pRlT28G2del. La séquence nucléotique de G2del est déterminée par séquencage d'ADN sur I'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2del est digéré par Bam~ll et HindIII et cloné dans le vecteur navette: pSE'G2delBBXM (7639 pb)(FlGURE 3).
IV) Construction du vecteur navette:
Un linker d'oligonucléotides ( 5 '-AGCTTGGCTG TTCCGCCATG
GCTCGAG-3', avec le brin complémentaire) est inséré dans le site Hindlll du plasmide pSZZmpl8XM (I{ansson et col, 1992, J.Bacteriol 17~: ~239-12~5), créant ainsi deux sites de restriction supplémentaires Ncol et Xhol en aval du site Hindlll du vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)XM. Un fragment de gène codant 198 acides aminés, nommé BB, de la région de fi.~;ation du sérum albumine de la protéine G streptococcique (Nygren et col, ]988.
J.~lol.Reconig., 1:69-71), est généré par l'CR avec les amorces ( 1 =
5'-CCGAATICAA GCITAGATGC TCrAGCMAA GCCAA~3' et 2 = 5'~CCCrGCAGT
TAGGATCCCT CGAGAGGTAA TGCAGCTAAA Al-l-lCATC-3') sur le template plasmidique pSPG1 (Guss et col, 1986,E~IBO J., 5: 1567-1575). Le fragment est digéré avec Hindlll et Xhol et cloné en aval du site multiple de clonage mpl8 du vecteur pSZZmpl8(Xhol)X~I; le vecteur résultant pSZZmpl8(Xhol)BBXI~I est digére par Notl el l-lindlll. Le fragment renfermant ZZ est remplacé p~r Ull autre fragmellt digéré par les mêmes enzymes de restriction du vec~eur pE'mpl8 (Sophia l-lober, non publié). Le vecteur navette résultant est nommé pSE'mpl8BBXI\1 (EIGURE 3).
EXEMPLE 2:
Extraction et analvse de protéilles membranaire~s des ~S. .~lo.sus recombinants:
Dans un erlenme~er de 1 litre, Oll inocule 250 ml de milieu (7,5 g de TSB, 12,5 g de Yeast e.~;tract) contell;lllt du Chloramphellicol (20 ~g/ml) ~vec 5 ml de préculture (o~ ernight) de S. ~-~losus transformé par le vecteur navette pSE'G2BBX~1 ou pSE'G2subBBX~1 ou pSE'G2delB13X~I selon le CA 02204jll 1997-0j-0j protocole de Gotz et col, 1981, J Bacteriol., 1~5:7 1-81. Incuber sous agitationà température = 32~ C pendant une durée de 6 heures. Centrifuger le milieu à 5000 rpm, 12 min e~ à température = 1~ C. Le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de TST, on rajoute 200 IJI de solution contenant de la S lysostaphine (1 mg/ml) et 200 IJI de Iysozymc (50 mg/ml). Incuber pendant une heure à température = 37~ C sous agitation modérée. Soniquer la solution pendant 2 min, avec l'appareil Vibra cell équipé d'une sonde dont la puissance est réglée à 7. Centriruger à 13 500 rpm, pendant 20 min, à température = 4~ C. Les protéines sont purifiées par affinité: le 10 surnageant est passé sur colonne d'affinité IlSA-Sépharose (Sérum Albumine Humaine). Après avoir rincé la colonne, les protéines sont éluées avec un tampon acide pH 2,7 et Iyophilisées.
Les protéines sont séparées sur deu.~ gels SDS-PAGE (12%) identiques avec les marqueurs de tailles moléculaires standard (Gibco BRL) 15 précolorés. Un gel est coloré au Bleu de Coomassie. Le deuxième est transféré sur membrane ProblotT~1 (Applied Biosystem) pour l'immunoblot avec l'anticorps spécifique anti-G 1 (obtenu à partir du sérum de lapin immunisé avec le peptide Gl(aal7 1-187) selon les protocoles courants d'immunisation). Voir Figure 5.
EXEMPLE 3:
Analvse r)ar C~tométrie dc flu~; (FACScallT~I) dcs protéinc~s recombinalltcs à la surface de S. ~ivlosus:
Les cultures des bactérics rccombinalltcs ~S. xylosus SOllt fai~es 25 comme décrit précédemment. Pour constituer une solution stoc~;, resuspend la bactérie dans une SOlUIiOIl de PBS ~i 0,1% de Sodium Azide (p/v) à la concentration finale estimée par densilc oplique (600nm) égale à l'unité. On aliquote 30 1ll de solution stocl; dans chaque puits cdnique d'une plaque de microtitrcs, Oll centrifuge à 550 g pendant 10 minutes à ~~
30 C. On resuspend Ic culot bactérien dans un volumc dc 150 IJI de SOlU~iOIl de PBS contenant du ~scrum lapill polvclollal allti-G_ (~ilrc 1/1 ~t~() 000) diluc CA 02204~11 1997-0~-05 WO 96/14409 PCTIF'R95/01464 au 1/200ème, incubation pendant 30 minutes. On rince deu~ fois les cellules bactériennes avec du PBS et on incube dans 150 ~I d'une solution de PBS renfermant de l'anti-lapin FITC ~Sigma) dilué au 1/lOOème pendant une durée de 30 minutes. Après avoir rincé les cellules deu~; fois avec du 5 tampon PBS, on resuspend dans un tube Falcon contenant 1 ml de tampon PBS-Paraformaldéhyde lYo tp/v). Les échantillons préparés sont analysés sur l'appareil FACScanTM (Becton Dic};inson). La distribution de fluorescence de chaque suspension cellulaire est analysée par le logiciel LYSIS IITM et est représentée par des histogrammes de fluorescence. Voir 10 Figure 4.
EXEMPLE 4:
Modulation secrétion-insertion en secrétion:
A partir des différents vecteurs navettes, il est possible d'insérer des 15 codons de terminaison en amont de la région codant pour l'ancrage membranaire X~l, comme le montre la figure G. Un site unique de restriction Xhol entre BB et XM a été utilisé pour insérer un double brin d'oligonucléotides codant pour trois codons terminaison (Ter) dans les deu.~;
sens d'orientation, avec introduction d'un site de restricliOn Aat ll:
Aat ll l'er Tcr Ter -->
5'-TC GAC GTC T~A TGA TAA TT~ TCA TTA G-3' 3'-G CAG ATT ACT Al~ MT AGT AAT CAG CT-5' <-- Ter Ter Ter 25 Les vecteurs pSE'G2subBBXI~I et pSE'G2delBBX~I SOllt ainsi digérés par Xho I
et sont ligaturés avec le double brin d'oligonucléotides pre~lablement phosphorylés en 5'. Les vecteurs résultants sont respectivement pSE'G2subBB[Ter]X~I (7693 pb) et pSE'G2delBB [ler~X~I (766G pb). La culture des E.coli ou des S.,~ylosus transFormées respectivement avec ces deu.~;
30 vecteurs suivie d'une purirication sur colonnc d'~ffinité (I-ISA Sépharose) permet d'obtenir des protéillcs G2subB13 e~ G2delBI3. La figure 7 montre: en CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/1i~95/01464 A) le gel SDS-PAGE, la séparation des protéines secrétées à partir des S.~ylosus, dans des conditions réduites, en 1 et en 2 représentent respectivement les protéines G2subBB et G2delBB à la taille attendue: 35,23 Kda et 34,28 Kda; en B) I'immunoblot des protéines montre que l'anticorps S spécifique à la région G(aal7~-187) ou Gl du VRS reconnaît bicn les deux protéines secrétées. Très peu de dégradations protéolytiques ont été
observées. De plus, I'analyse l:ACSCAN avec l'anticorps polyclonal anti-lapin, anti-BB a été réaliséc sur les différents S..~;,vlosus. 1~ figure 8 montre que les spectres de S.,~;ylosus portant des vecteurs navettes pSE'mpl8BBXM, 10 pSE'G2subBBXM et pSE'G2delBBXM sont déplacés dans l'axe de l'intensité de fluorescence vers la droite, c'est-a-dire vers la présence des an~igènes hétérologues à la surface de la bactérie. Alors que les spectres de S..~losus portant des vecteurs navettes pSE'G2subBBTerXI~1 et pSE'G2delBB l'erXM n'y sont pas déplacés, ceci indique que les antigènes hétérologues SOllt absents 15 à la surface de la baclérie et que l'on les a re~rouvés et purifiés à partir du milieu de culture.
WO 96/14409 PCT/FR9~i101464 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: PIERRE FABRE MEDICAMENT
(B) RUE: 45 PLACE ABEL GANCE
(C) VILLE: BOULOGNE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92100 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PRODUCTION DE PEPTIDES ANALOGUES DE
PEPTIDES ~YDROPHOBES, PEPTIDE RECOMBINANT, SEQUENCE D'ADN
CORRESPONDANTE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 94133~7 (B) DATE DE DEPOT: 07-NOV-1994 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96114409 PCTIIiR95/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Thr Vol Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe V~l Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Vol Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de b~ses (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: liné~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/FRg5/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn C2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCI~/FRgS/01464 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997 - 0~ - 05 WO 96/14409 PCTIFRg5/01464 Cxi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Ile Thr Thr Ser Thr Gln Thr Asn Lys Pro Ser Thr Lys Ser Arg Ser Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Ser Ser Ile Cys Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Ser Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Ile Lys Pro Thr Asn Lys Pro Thr Thr Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Met Pro Lys Lys Glu Ile Ile Thr Asn (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 303 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..303 CA 02204~11 1997-0~-0~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: S:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Asp Ser His Ser Glu Val Ser Asn Ser Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA) LONGUEUR: 276 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..276 CA 02204~11 1997-0~-0~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn Asn Val Pro Ser Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Ser Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Asp His Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro CA 02204~11 1997-0~-0~
WO 96/14409 PCT/F~g5/01464 LEGENDE DES FIC'.URES
Figure 5:
A) Coloration au bleu de Comassie: Gel SDS-Page des proteines de ~sion extraites de membrane bacterienne et purifiees par affinite sur colonne Albumine des differents constructions:
- Puits HW: Marqueurs de taille moleculaire (en Kda).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2BBXM].
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3: S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
B) Immunoblot des proteines de fusion extraites de membrane bacterienne e~ purifiees par affinité sur colonne Albumine des differen~s construc~ions avec anticorps polyclonal apin an~i-Gl.
- Puits HW: Marqueurs de taille moleculaire precolores (en Kda).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2BBXM~.
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBBXM].
- puits 3: S.xylosus [pSE'G2delBBXM].
Figure 7:
A) Coloration au bleu de Comassie: Gel SDS-Page des proteines de fusion secré~ees et purifees par affinité sur colonne Albumine des differentes constructions:
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW: Marqueurs de taille moleculaire (en Kda).
B) Immunoblot des protéines de fusion secretées et purifees par affinite sur colonne Alburnine des différentes constructions avec anticorps polyclonal lapin anti-Gl(VRS).
- puits 1: S.xylosus [pSE'G2delBB] (34,28 Kda).
- puits 2: S.xylosus [pSE'G2subBB] (35,23 Kda).
- puits HW: Marqueurs de taille moleculaire précoiores (en Kda).
Claims (28)
1. Procédé de sécrétion d'un peptide recombinant biologiquement actif, analogue d'un peptide naturel présentant au moins une région hydrophobe, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules transformées par une construction d'acides nucléiques comportant - des éléments assurant l'expression et la sécrétion dudit peptide par la cellule, et - une séquence codant pour un peptide dont la séquence en acides aminés diffère de la séquence du peptide naturel par au moins une modification dans une région hydrophobe non transmembranaire du peptide, et en ce que l'on récupère le peptide et/ou les cellules portant ledit peptide recombinant.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un acide aminé hydrophobe de la séquence du peptide naturel est remplacé par un acide aminé non hydrophobe.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins un acide aminé hydrophobe est délété de la séquence du peptide naturel.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide aminé hydrophobe est choisi dans le groupe suivant: Tryptophane, Phénylalanine, Proline, Valine, Alanine, Isoleucine, Leucine et Méthionine.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la construction d'ADN comprend une séquence signal de sécrétion liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour le peptide recombinant, et assurant la translocation dudit peptide et sa sécrétion extracellulaire.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la construction d'ADN comprend une séquence signal liée de manière opérationnelle à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide et permettant la translocation du peptide à travers la membrane de la cellule hôte et son ancrage membranaire.
7. Peptide recombinant susceptible d'être obtenu par le procédé
selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il diffère du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel.
selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il diffère du peptide naturel par au moins une modification dans la région hydrophobe du peptide naturel.
8. Peptide recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est ancré à la surface de la cellule hôte.
9. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un analogue d'une protéine de structure du VRS ou d'un fragment d'une telle protéine.
10. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence analogue de la protéine G
du VRS, sous groupe A ou B.
du VRS, sous groupe A ou B.
11. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 a 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence analogue de la séquence comprise entre les résidus 130 et 230 de la protéine G du VRS.
1 2. Peptide recombinant selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'il présente l'une des séquences ID n°1, n°2, n°3, n°
4, n°5 ou n°6.
4, n°5 ou n°6.
13. Séquence nucléotidique codant pour un peptide selon l'une des revendications 7 à 12.
14. Séquence nucléotidique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre des éléments assurant l'expression du peptide dans une ou plusieurs cellules hôtes spécifiques.
15. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'ADN.
16. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'ARN.
17. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 16.
18. Composition pharmaceutique destiné à être administrée à un mammifère pour provoquer la production in situ d'un peptide, caractérisée en ce qu'elle contient un vecteur d'expression selon la revendication 17.
19. Séquence d'ADN susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- une séquence signal de sécrétion fonctionnelle, - une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide recombinant présentant au moins une modification dans une région hydrophobe non transmembranaire du peptide naturel.
- une séquence signal de sécrétion fonctionnelle, - une séquence d'ADN codant pour un peptide recombinant analogue d'un peptide naturel, la séquence de peptide recombinant présentant au moins une modification dans une région hydrophobe non transmembranaire du peptide naturel.
20. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence d'ADN selon l'une des revendications 15 à 16 ou 19.
21. Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie Gram-négatif.
22. Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie Gram-positif.
23. Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure,
24. Cellule selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de mammifère.
25. Bactérie selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi Escherichia coli, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus.
26. Bactérie Gram-négatif selon la revendication 21, caractérisée en ce que la séquence d'ADN recombinant, s'est intégrée dans le chromosome de l'hôte,
27. Bactérie Gram-positif selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence d'ADN recombinant, qui s'est intégrée dans le chromosome de l'hôte.
28. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une cellule selon l'une des revendications 20 à 27.
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