JPH02503914A

JPH02503914A - コレラワクチン

Info

Publication number: JPH02503914A
Application number: JP63504162A
Authority: JP
Inventors: メカラノス，ジョン　ジェイ．; テイラー，ロナルド，ケイ．
Original assignee: プレジデント　アンド　フェロウズ　オブ　ハーバード　カレッジ
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1990-11-15
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: EP0358692B1; FI895108A0; ATE166880T1; HUT53915A; HU205372B; WO1988008431A1; DE3856199D1; DE3856199T2; EP0358692A1; JP2777894B2; EP0358692A4; AU1725788A; AU629793B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】コレラワクチン［発明の背娯］この出願は本出願と同一の出願人による米国特許出願第０４３、９０７号の「二】レラワクブン」と題するメカラノスに係る部分継続出願で必り、１京出願の全明細書及び図面を参考の六−めここ（、：、引用する。

本発明はビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｌ’ｉ０　ｃｈｏｌｅｒａｅ　）に対する免疫学的保護じ関するものである。

Ｖ、　ｍコしノブエは、小腸内でコロニー形成しかつ蛋白毒素を分泌づることにより人間に下痢症状をもたらしうる種類の細菌で必る。コレラトキシンの作用は充分に特性化されている。

毒素は２種のサブ単位、すなわちＡ及びＢサブ中位を含む、。

Ｂサブ単位は既知の毒性作用を持たないが、ワクチンの成分として使用した際に成る程度の免疫学的保護を与える［ブラック等（１９８Ｂ＞、「コレラ及び関連下痢症に関する研究の進歩」、第３巻、第２７１頁、クワハラ等編］。

Ｂサブ単位のワクチンに加え、コレラ用のワクチンはさらに変性された全コレラ１〜キシン、一般に［：）Ｈ７，５〜８．０の固体培地で増殖したＶ、コレラエの死滅全菌体、及び死滅菌体と失活毒素分子との混合物を包含する。他のワクチンはＡサブ単位のコレラトキシンを産生しない生存の弱毒化Ｖ。コレラエ菌株、並びに異種非ビブリオ・コレラエキュリャの弱毒化菌株、すなわち非−Ｖ、］レラエ菌株、たとえばコレラ保護性０１抗原を、Ｊ・−斗するクローン化遺伝子を持ったりル七ネラ・ｆ”）　イ（Ｓａｌｍｏｒｉｅｌｌａ　ｒｙｐｈｉ）　Ｔ　ｙ２１　Ａの弱毒化菌株を包含する１ジヤーナル・インフエクチャス・ディシーズ、第１３１巻、第５５３〜５５８頁（１９７５）コ３゜■ハラ等［トロピカル・メジスン、第２８＠、第２１頁（ｉ９８６）：及びワクチン、（１９８８）　］は、約１６ＫＤの構造サブ単位蛋白を右りるＶ、」レラにの繊毛（ｆｉｒｎｉｒｉａｅ　）の精製を記載している。この蛋白はクー７シー青により染色されず、かつその血球凝集反応（ＨＡ）タイターはンンノース感受性である。ＡＬ−カイシ等［ジｉ’−ノル・アゾライド・バクテ゛リオ［］ジー、第５８巻、第２２１頁（１９８５）コも、マン、ノース感受性トＩＡタイターを有する繊毛を記載Ｌノでいる。

カノオ［日本細菌学雑誌、第３６巻、第４６５頁（１９８１）　］、メルニ一】八等［モ１）４］−ラ・バイオ〔］ジカル・ゼネテイツクス、ロシア、第２巻、第１８頁（１９８２）　］　、及びカノオ［ジャパニーズ・ジャーナル・バクテリオロジー、第３６巻、第４６５頁（１９８１）　］は、プラスミド遺伝子によりコードされるＶ。

コレラＴの有性繊毛を記載している。ホルムグレン等［インフエクション・アンド・イミューニテイー、第３３巻、第１３６頁（１９８１）　］は各種のイー・コリ繊毛を記載している。

［発明の要点］本発明は繊毛（ｇｉｌｕｓ　）　、待にＶ、コレラエを腸に付着させかつ腸内でコロニー形成するのに役立つトキシン・コレギュレーテッド・ビルス（ｒＴｃｐＡ繊毛」〉と呼ばれるＶ。

コレラエ表面蛋白構造を提供する。この繊毛の生産は成る種の実験至培養条件下で顕著に向上し、したがって本発明はざらにＴＣｐＡ繊毛を製造するためのＶ、コレラエの培養方法をも提供する。さらに本発明は、ＴＣＩ）Ａ繊毛の生産と共に同時調節（コレギュレート〉されかつワクヂン成分としても有用であるＢサブ単位のコレラトキシンの製造方法をも特徴とする。ざらに、本発明はＴＣｐＡ繊毛サブ単位に関する構造遺伝子をクローン化し、かつＴＣｐＡ蛋白の推定アミノ酸配列を決定した。これら物質及び情報を用いて、Ｔ（：ＤＡ繊毛を認識すると共にＶ、コレラエのヒト腸への付着及びコロニー形成を阻止するような保護抗体の産生を刺戟しうる数種の異なる種類のコレラワクチンを生産することができる。

第１の面において、本発明は（１）Ｖ、コレラエのＴｃｐＡｉｌｉ毛の少なくとも１つの免疫原決定子（若しくは前記繊毛と交差反応するポリペプチド）、好ましくはＴ　Ｃ，Ｉ）　Ａ繊毛の全体からなる精製ポリペプチド：（２）Ｖ、コレラエのＴＣｐＡＩ毛にお〔プる少なくとも５個の隣接アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド及びこのオリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（３）１５１基対からなりＶ、コレラエのＴｃｐＡ繊毛をコードする一対の遺伝子の核酸配列を実質的に有するオリゴヌクレオチドを特徴とする。

精製という用語は、用語ＴＣｐＡ繊毛又は繊毛の１部を形成するポリペプチドを天然に存在する１種若しくはそれ以上する。好ましくは、ポリペプチドはこれら天然の成分を実質的に含まず、製造に際し全蛋白の５０％以上を示し、かつ正常なｏｍｐｕ蛋白レベルの５０％未満を有する。

ボッペプチドという用語は、抗原的に活性であり、したがって天然ＴＣｐＡを認識する抗体の形成を誘発するＴＣｐＡの１部をコードするアミノ酸の配列を意味する。

第２の面において、本発明はワクチンの製造方法を特徴とし、ＴＣｐＡを通常よりも高レベルで産生する条件下に増殖培地中で、好ましくは約６゜５若しくはそれ以下のｐＨを有する培地中で、■、コレラエ菌体の培養物を増殖させ、或いは突然変異したｈｔｘ遺伝子を有する菌体を用いることを特徴とする。好ましくはワクチンは仝菌体ワクチンであり、かつこの方法は菌体を死滅させることをさらに特徴とする。或いは、ワクチンはＴＣｐＡ繊毛からなり、方法はＶ、コレラエ菌体を収穫しかつ菌体からＴＣｐＡ繊毛を精製することをざらに特徴とする。或いは、ワクチンはコレラトキシンのＢサブ単位からなり、方法はＶ、コレラエ菌体を収穫しかつコレラトキシンのＢサブ単位を菌体から精製することをさらに特徴とする。

他の面において、本発明はＴＣＯＡ繊毛又はその免疫原決定子、好ましくは上記のように精製されたものからなるワクチン：ＴＣｐＡ繊毛の免疫原断片をコードする核酸を含む異種（非−■、コレラエ）細菌菌株：Ｖ、コレラエのＴＣＥ）Ａ繊毛の免疫原決定子と蛋白の８サブ単位の免疫原決定子とからなるハイブリッドポリペプチド：並びにこれをコードする核酸を特徴とする。ざらに本発明は、少なくとも１％の全蛋白をＴＣｌ）Ａとして有する細菌菌体を特徴とする。好ましくは菌体は毒性レベルのコレラトキシンを欠如し、特に好ましくは菌体は突然変異ｈｔｘ遺伝子を有するビブリオ・コレラ□　工である。

［好適実施例の説明］図面はＶ、コレラエにおけるＴＣＩ）Ａ繊毛をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、及び対応のアミノ酸配列を示している。

ＴｃｐＡＳｔｉ毛は、■、コレラエ菌体のフィラメント状表面成分（繊毛）の例である。■、コレラエ０３９５の仝菌体から分離すると、これは２０．５ＫＤのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動における見掛は分子量を有する。ＴＣｐＡ繊毛はＶ、コレラエの表面にあける巨大分子フィラメント構造に結合し、差別遠心分離により部分精製することができる。

繊毛は、■、コレラエ菌体の増殖に関する成る種の環境条件の下でのみ著量に生産される。たとえば、その生産は低ｐＨ１好ましくはｐＨ６，５若しくはそれ以下で最良であり、７．５以上のｐＨでは実質的に検出できない。ざらに、その生産は５０〜１００ｍＨのＮａＣ２に等しい低イオン強度にて最良である。

ＴＣｐＡ繊毛の生産を調節する他の因子は、増殖培地（たとえばＬ８、下記参照）にあけるアミノ酸の存在、通気（たとえば培地６で当り毎分０．５〜２で）、培地の種類（好ましくは液体）、並びに培養温度（好ましくは２５〜３０℃）を包含する。ざらに、ＴｃｐＡ４！！毛はＶ、コレラエ菌体の特定の増殖段階（たとえば定常期）においてのみ生産される。これらの増殖条件は一般に菌体増殖には最適でなく、寧ろこれらはＴＣＤＡ繊毛の生産につき最適である。

ＴｃｐＡ繊毛は精製されるとフィラメントの束を形成し、蛋白はクーマシー青により染色され、かつその血球凝集反応活性はマンノースにより影響されない。

作成に際しＴｃｐＡの比率を測定するには、作成の１部をゲルで行ない、ＴＣｌ）Ａに対する抗体と反応させてＴＣＩ）Ａに対応する蛋白バンドを位置決定し、このバンドをゲルから切除し、かつＴＣｐＡの量を測定する。全蛋白を標準法により決定し、かつこれを用いてＴＣｐＡ％を計算する。

■、コレラエにおけるＴＣｐＡ繊毛をコードする遺伝子を下記するようにクローン化させ、そのＤＮＡ配列を第１図に示す。ＴＣｐＡ遺伝子は染色体に位置する。このクローン化ＤＮＡ、Ｖ、コレラエの他の菌株からの関連ＤＮＡ、又は図示したと実質的に同じアミノ酸配列をコードする合成りＮＡを用いて、他の細菌菌株で常法によりＴｃｐＡ繊毛を生産することができる。したがってＴＣｐＡ繊毛という用語は、分子の抗原性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸改変を有する蛋白を包含する。同様に、ＴＣｐＡをコードする遺伝子はこの種のアミノ酸改変若しくはＴＣｐＡの抗原部分をコードする遺伝子を包含する。たとえば、ＤＮＡを任意の標準ベクターに導入してＴＣｐＡ繊毛を発瑛しうる細菌菌株に形質転換することができ、この例を以下に示す。

」土−ユ：工」しにへ玲、イみ丘９久す〕ン化下ｎｐｈ−ｏＡは、その広範な宿主範囲とランダムな挿入特性とを保持づ−るが、ざらに標的遺伝子と旦九氾Ａ、づ゛なわち大腸菌のノ′ルカリホスノアターゼ遺伝子との間に融合を形成しうる［−ランスボラン下「］５の誘Ｗ（本である［マノイル等、ブ１コシ−ディング・ナショナル・アカデミ−・ザイーＬンス゛ＵＳＡ、第８２巻、第８１２９頁（１９８６）　］。この種の遺伝子融合は、アルカリボスフ７ターゼ（ｐｈｏ△）のカルポギシ末端部分が枠内ひ標的遺伝子生産物のアミノ末端部分と融合して構成されたハイブリッド蛋白を−」−ドする。これらのハイブリッド蛋白は、標的遺伝子が分泌若しくはＩＩ！Ｊ離間蛋白を一コードしない限り殆んど又は仝りｐ　ｈ　ｏΔ活性を丞ざない８．これらの活性融合は、ｌ−ｒ＞見上＜？、Ａの挿入物を持った細菌菌体が塗抹された寒天培地に染色体ンフルカリボスフン・ターゼ基質５−ブ「１ムー４−りＩ」ルー３−インドリル小スフ］ニーｔ＝（ｘｐ＞を混入づることにより、青色層コＳ二、−どじて容易に同定される。為性因ｆと見なされる実：ａ的に仝での細菌蛋白はべり！ｆラスム、菌体外若しくは細胞表向に結合−りるので２．（：のブ〕法は細菌の病原特性、たどえ（、ｌ：’ＩＤバニー形成若しく、！ｃｔｉ索（１−産などに影響を及ぼしうる挿入突然変異を強力に増大させる１、り作成）をイｊする広宿十範囲１）一群プラスミドＩＴ）　ＲＫ　２９０Ｆメカラノス、ネイチャー、第２７６巻、第６ｊ３３頁（１９７８）コの誘導体であるｐＲＴ　２ε）１を用いて達成された。要約りれば、不適合プラスミドｐＰＨ１Ｊｌ　　りしり）を重感染さゼかつカナマイシン及びグンタンイシンに対する耐性につき選択することにより、ｐＲ丁２９１を右づるＶ、コレラ］二菌株にて”［ｒ１旦九旦Ａの染色体挿入物を得た。ｉ”−ｎ　ｐ、、、、、、、、、ｉ戻）−Ａの挿入物をイＪ−するＶ、コレラＴのコ１コー、−を、０部２％のグル」−又と２０ｍｇ／ｄのＸＰとを含有する１、　Ｂ寒天に−（３０°ＣＣｐ　ｈ　ｏギ表現型に′）きスクリーニングした。

丁ｆｌｌｌＴ１ｈＯＡの挿入物をｉづ−る数千個のＶ。コレラＴの］ロー−の保存物を、１つｉｌ　ＯＡ　　融合缶内４ト」−ドする突然変異につきスクリーニングした。Ｔｎ拮ｊ＞　−９−Ａの挿入物を持・）だこれら」１−に一の約１％がこの培地Ｃ″古色なり、これらか前記培地で辞世する分泌若しくは膜？ｂ白を −１−ドーツる遺伝子−１．′１虫合り、／　７’、＝　’Ｔ’　ｎ　ｐ　１ｊＱ−Ａの：］ピーをイｊ−することを示り、、、　ｔ：。

、゛これら青色−１口：１−の４０ｆｌ司を１１製し、か′）ポリノアクリルアミドグル電気泳動（Ｆ”ＡＧＥ＞に３１、りぞの全量自分イ１ｊに′）き分析した。野牛型及び突然Ｃ異菌株のＶ、３］１ノラ］二を−、Ｌ［３゛ゾ目ス（１）ト１６．５）に−Ｕ３０’Ｃぐ１８哨間）Ｃわたり通気しながら増殖さぜ１こ。

遠心分離により菌体を回収し、還元剤（己」、り試料緩衝液中で溶菌させ、か′ ）ＮａＤｏｄｓｏ４の存在下）Ｊ１２．５％のポリアクリルアミトスレゾゲルを用いる電気泳動によって分析し、これ１ついではメカラノス等により従来記載されているＥ９インノエクシ：ｊン・アンド・・イミ１−ニデイ４−１第１６＠、第７８７頁（１９７７）　］　。

゛７種の突然変異種は、１個若しくはぞれ以トのバンドの喪失を示すぞの張自分イｆｉ４．：おいて検出しうる。；４４：を有する。菌株ＲＴ１１０．２１により代表される突然変異種の１種は、分子量２０．５ＫＤの単一の蛋白を喪失して −いる。

２０．５ＫＤの蛋白を欠損する突然変異種を、３・−〇１」令のＣ１１，）−１ネズミに対でる突然変異種と親菌株どの同時接種を含む競合分析によりＴ］【」ニー形成の欠陥につぎ試、験し、これについてはノＩノータ・−等により実質的（，１記＄！、されている［インフ工りション・アンド・イミコーーーニテ゛イー、第３４巻、第２３４頁（１９８１）　］。２０゜乏５ＫＤの蛋白を喪失１．ノた突然Ｃ５異菌株１く−”ｆ”−１１０，２１は、インじボに−Ｃ親菌株と競合りるがインビト［１１１１１］では競合しないその能力の顕箸−な低下を示した。１２０゜５　Ｋ　［−）蛋白を欠損した他の独立しＣ分離された突然変異種を用い（−行なった他の競合実験は、この種の突然変異種が子ネズミ及び親ウサギの両者において〜］　［１１、Ｘ１ｉｉｉｉ：・−形成、　ｉ；″′重人な欠点を有することを確認した。

２０．５ＫＤの蛋白は細菌の菌体表面に位＠−する１−ｊ大分子構造に結合することを菌体分画は示した。菌株０３ε）！、）・Ｎ１から誘導された非鞭毛突然変異種（但ｏ　ｔ、−−３９＞１、メカラノス、ネイチャー、第３０６巻、第５５１真（１９８３）　］を用いて、数回の差別沈降により剪断菌体からこれら＠造体を部分精製した。この菌株をＬＢブロス（Ｌｌｌ−４６゜５）で増殖させた。２ｅのフラスコ１本当り容積４００ｍのブロスを用い４、かつ培養物を毎分１５０回転にて３０℃で１６時間培養し２だ。菌体を遠心分離により集め、かつ１２．５ｍＭのトリス−ＨＣｊ（１：）Ｈ？。０）と２５ｍ）ＩのＮａＣｌ２とｈ＋ＨのＭｇＣｆｆ２と４ｍＭのＣａＣｅ２とを含有する緩衝液に再懸濁した。２１番手の針に通過させることにより細菌菌体を剪断した後、繊毛を数回の差別遠心分離により精製して菌体と司溶性蛋白どを除去［７た。

典！Ｓ″ｊ的には、剪断された菌体を３０００　ｘｐに゛Ｕ２０分間遠心分離した。上澄液を集め、かつべ１ノツトを捨”Ｃた。次いＵ”、上澄ｎＥ１５，０００ｘ　ｇに′７４０分間遠心分離し’１’：ｏｉ：、、　（７）　、：１程からの」二澄液を捨（“、かつベレットを集め（“ＩＣ１つ緩衝液に再懸淘さ１ｔた。差別遠心分離のＪこれら２工稈ろ！・再び２回反復した。最終ベレッ［・は、このＪ、゛）へ作成（−７精製Ｉ−ｃ　ｐ　Ａを示Ｌ）ｌご（すｔ′Ｃわち１（Ｉｒ）Ａｆｆｉ白は全菌体車内の５０％以りを示す）。

繊りの分離は、２Ｑ、５キ〔−〕ダルトン織しザ１中位の精製をＰ　Ａ　Ｇ　Ｅ −により追跡しく監視しｌこ５．精製された繊毛を、２％モリゾノ？ン酸ア〕／モニウムＣ調製物を染〔へした後に電子顕微鏡トＣ−観察した。“市、１′顕微鏡シ二お）、フるこ“れら調製物の検査（、よ、長い横方向に結合し１．：′繊毛（ｆ！ｌ１ｌ）Ｉ”！ａ　Ｗしくは［）　ｉ　ｔ　ｉ　）　　（ｉｉ径径口０ …を示した。個々の繊毛ノ（ンメント・は菌株０３９５の菌株の表面）、′：見られたが、２０．８）ＫＤの蛋白を喪失し１ζＴ　ｎ旦巾ｇＯ−Ａ誘発突然変異種の菌体には見られなか−ＣＬ　。

２０．５ＫＤの蛋白をＰ　Ａ　（’、’Ｅｌ　ｂ後）、′電気溶出によってさらに精製し、かつＮ　−・末端アミノ酸配列：・；、）’情にかけた。配列データは図面に示したものと一致する。この配列は高度に疎水性であり、か′つ分泌伏目配列の１部若しくは全部を示づこ（艷ができる。この結論と・一致して、菌株ＲＴ’１ｌＯ８２１からのＴｎｌ：）ＥｌｎｊＡ融合のり゛ブクローン化及びＤＮＡ配列決定は、この疎水性のアミノ酸範囲をニコードする配列から下流に位置した配列９２コドンをコードする繊毛にｐｈｏ、Ａ、ｉ信子が融合することを示した。２０．５ＫＤの蛋白を喪失した他の２種の突然変異種もこの同じ開放読枠にｐｈｏＡを融合した７−ｎｐｈｏＡ挿入物を有し、この配列がＶ、コレラエ繊毛に関する構造遺伝子を実際に示さないことを確認する。

次の２つの工程でｔｃｐＡ遺伝子に関する遺伝子をりａ−ン化させた。先ず最初に、ＲＴｌｌｏ、２１が有するｔｃｌ）Ａ−ＴｎｐｈｏＡ遺伝子融合体を、イー・コリにあけるカナマイシン耐性表現型につき選択することにより、プラスミドにクローン化させた。次いで、このＴ　ｎ　ｐ　ｈ　ｏ　Ａ　ｍ　合体に隣接したＤＮＡ配列から誘導される遺伝子プローブを用いて、菌株０３９５（ｊｄ＞の野生型ｔｃｐＡ遺伝子を有するコスミドクローンを同定した。Ｉ）Ｃ３１２Ｇ７と呼ばれるこのプラスミドは、以下の実験により示されるように活性８丁１１０．２１に導入すると、これはその繊毛欠陥を補って、このプラスミドを有する菌株は再びＴＣｐＡ繊毛を生産Ｇ７にあけるその位置を確認した。この配列を図面に示す。

Ｃ，Ｖ、コレラエ菌株０３５９−Ｎ１若しくは５６９Ｂ−Ｎ１に導入すると、ｐＣ３１２Ｇ７は高繊毛形成表現型を誘発し、これらの菌株は発現培地で通常生産されるよりも２〜３倍多いＴＣｐＡ繊毛を生産する。５６９Ｂ−Ｎ１Ｇ；ｔＶ。

コレラエのイナバ血清型菌株である。これはｃｔｘＡｉ伝子にお信子欠失を有するが、ＣｔＸＢ＋である。この菌株は、０３９５−ＮＴのｃｔｘＡ３　　）（ｍ　　突然変異種を５６９Ｂ、（菌株５６９Ｂは一般に非運動性で必る）の自然の高度運動性誘導体まで変換することにより作成した。この変換体く菌株５６９Ｂ −ＮＴ＞を、次いでｌ）ＪＭ２９０．２　（土す）での組換により５６９Ｂ−Ｎ１まで変換した。

ｄ、　イー・コリ若しくはサルモネラ・チフィムリウムし３５０００に導入すると、ｐｃ３１２Ｇ７はウェスタンプロット分析により寸法及び免疫学的性質においてＴｃｐＡ蛋白と同一である蛋白サブ単位を生産する。

Ｂ、コレラトキシンのサブ単位Ｂサブ単位はコレラトキシン中にＡサブ単位と共に５：１の比で存在する。これは既知の毒性活性を持たず、コレラに対するワクチンの成分として有用である。

Ａサブ単位を失活させる突然変異を持ったＶ、コレラエの菌株が知られている。

Ａ及びＢサブ単位の両者のレベルは、ＴＣｐＡ繊毛の生産に適する培地にて上記したように■、コレラエ菌体を増殖させることにより顕著に増加させることができる。不活性Ａサブ単位を有する突然変異種、たとえばｃｔｘＡ欠失菌株（コ）を用いることにより、菌体を増殖させてＢサブ単位とＴＣＩ）Ａ繊毛との両者を同時に多量に生産することができる。

Ｂサブ単位とＴＯｌ：）Ａ繊毛との生産増加の原因は、これら蛋白をコードする遺伝子が同じ遺伝子（ｔｏｘＲ）により制御され、その制御若しくは活性が増殖条件により影響されるためであると思われる。

ざらに、↑ＣｐＡ特異性ハイブリッド化プローブ（ＴｃｐＡ蛋白のアミノ酸をコードすることが知られたヌクレオチドのみを含有するＤＮＡ断片）を用いて、コレラに罹患した患者から分離された全てのＶ、コレラ菌株にはｔｃｐＡｉ伝子が存信子ることを示した。これに対し、数種の■、コレラエの環境菌株（すなわち患者からでなく水資源から分離された菌株）はｔｃｐＡ遺伝子を含有しない。これらの観察は、ｔｃｐＡがヒト下痢症状に含まれる全ゆるＶ。

コレラエ菌株につきコロニー形成因子をコードするという見解を支持する。ざらに、ｔｃｌ）Ａ遺伝子を含まないＶ、コレラエの環境菌株は、ヒト志願者のコロニー形成が貧弱でありかつこれら志願者には免疫性をあったにしても僅かしか誘発しないことが知られている［レビン等、「小児における急性腸感染」、第２６章（１９８１）　、エルセビール出版］。これに対する説明は、これらの菌株がＴＣｐＡ繊毛を形成できず、したがってヒトをコロニー化できず或いはＴＣＤＡ繊毛と反応する保護抗体を誘発しえないことである。

コレラワクチンＴＯｉ）Ａ！毛と多量のＢサブ単位との両者とを生産する能力は、各種のコレラワクチンの作成を可能にする。

ａ、死滅仝菌体ワクチンこのワクチンを得るには、Ｖ、］レラエ菌体をＴｃｐＡ繊毛及び（又は〉コレラトキシンのＢサブ単位の高度発現を可能にする条件下で増殖させる。菌株０３９５−Ｎｌ、５６９Ｂ−Ｎ１及びその誘導体につきこの種の条件を確立したが（下記実施例２参照）、これら条件はＶ、コレラエの理論上全ての菌株につき同様に確立しうろことも示したが、ただしＴｃｐＡ及びコレラトキシンＢサブ単位の生産を用いて増殖パラメータを最適化する。同様に、ここに示したとは異なる増殖条件下でＴＣｐＡと８サブ単位とを生産するＶ、コレラエの突然変異菌株を分離することもできる（下記実施例２における菌株５６９Ｂ　　ｈｔｘ−５）。本発明の本質的特徴は、成る種の増殖条件下におけるＶ、Ｔｌレラエの培養がその表面上にＴＣｐＡｍ毛を高レベル（すなわち全国体蛋白の１％以上）で発現する菌体を生産することができ、したがって適するコレラワクチンを形成することである。適する菌株を適する条件下で増殖させた後、菌体を次いで常法により、たとえばグルタルアルデヒド若しくはホルマリンでの処理により死滅させる。これらの処理は、たとえばＴＣＩ）Ａ繊毛及びＢサブ単位の抗原特性を保持するものでなければならない。

このワクチンには、常法により或いはその生産を向上させる条件下で菌体を増殖させ、かつ次いで常法により蛋白を精製することにより生産された精製Ｂサブ単位を補充することこの実施例は、死滅仝菌体ワクチンに使用するための或いは精製ＴｃｐＡ繊毛を製造するためのコレラＢサブ単位及び繊毛形成■、コレラエ菌体の製造を示している。

■、コレラエの少なくとも３種の異なる菌株を、繊毛形成した菌体及び二ｉｎｉ］　１ノラ１〜ヤシンのＢサシ単位の製造に使用覆ることができる。菌株ｏ　３９５−　Ｎ　１及びぞの高繊毛形成誘導体０３９５−Ｎ１　（ｐＣ３１２Ｇ７）は血清型にＣΔガワ型である一方、菌株５６９　Ｆ３−Ｎ　１及びその高繊毛形成された誘導−イ本である［メカラ、ノス、ゾ１−］シーディング・ナンヨ］ナルトノ７カデミー　・１ノ、イエンス・ＵＳＡ、第７５巻、第９４１頁］５、゛」シラ１〜ギシンを高度生産く′８ぜる弛（、こ、力」、−４入突然変巽はト記（、−要約りる増殖条イ′１、及びｉ’−ｃ　ｐＡＡｒ１ζ（よ通常許容しえない他の増殖条件（たとえば７．５のような高１）Ｈ）の両者り丁τ丁ＩＣＤＡ繊、毛の高度生産を司能にづる。７好まＬ）　＜　ＧＪ：、刊ノラ死滅全菌体ワクチンはオガワ型及びイ太バ型の両血清さ°４の菌体を含有すべぎ（・市り、しまたがって１種のオガソ型及び１種の一イナバ型菌株の別々の培養物を一般（こ作成−復る、２高度繊毛形成した誘導体は、そのＩ京ＸＪ体Ｊ、りち２〜３倍多いＴ−ｃ　ｐ　Ａ繊毛を生産する。伺故なら、これらは菌株０３９５の１ＣＩ；　、、ｐ−Ａ遺伝子を含有づる高二Ｉビー数プラスミドｐｃｓ１２Ｇ７をイｊＬ（すなわち０３９５−Ｎ１記するＪ、うに培養（きれるが、ただしアンビシリ〕／を菌株０３９５−Ｎｌ　（Ｌ）Ｃ３１２Ｇ７Ｘ；二ついでは１　ｒｎ１当り５０）４の岐路は度まで培地に添加する。

選択されたＶ、コレラエ菌株の出発培養物を２ｄのＬ−Ｂ、　−６，５培地（１０ｑのトリゾ］・ン、５Ｑの酵母抽出物、５ｇの塩化すトリウム、オー１〜クレープ処理前にｐ［４を６．５に調整）を含０りる試験管ひ作成し、かつローラ培養器に７１−３Ｏｒｐｍ　（ｒ）速度−（：ｌ”３０’Ｃｋ：で１８時間培養した。出発培養物の出発１メ［体密葭（よ低く（新鮮寒天板培養物から接種し／　 ”’（’、’、”　１　ｍｌ！　：＝、＃≦り杓１０７　（ｐ、］　）　、かつ増殖後に細菌菌体の自己凝集物が肉眼で容易に児える物質の塊とし”Ｃ出現した。牌となった細菌菌体を直＼１静車管から沈降させ、次いで底部からビペッ［・により集めた９、洩とな′）だ菌体を用いて、適当し二段６１された醗酵槽（、含まれる６ｅのＬ　Ｂ　−６，５培地（、：接種し７．１？テ気を培地中（、ニポンノ°吹込りると共（微細な気泡としく一分散さぜだ１．この培養物を緩徐に通気（０，５〜Ｎ！／ｍｉ＋ｉ　）　Ｌ／ながら２５°に）、−て２４時間培養し、その間に培養物は定゛帛期に達し１．かつほぼ完全（１：Ｔ自己凝集した。

その表面に丁ＣｐＡ繊毛をイｊ“°づ゛る塊となつｌＪ細菌菌体を遠心分離により集め、かつ６００ｎｆの０．８５％塩化Ｊ」〜す１ツム、１０［１１Ｍリン酸すｌ・リウム緩衝液（ｐ１１７．０）に再懸濁させた。

次いで１．これらの繊毛形成した＼／　、　Ｘ１ｉｉｉｉｉｌ　ｌノラ丁菌体を精製ＴｃｏＡ繊毛若しくは死滅全菌体の製造に使用ツる一方、菌体を含まない培養上）ａ液を用い＋７　ｍ’ｌし、７［〜ヤシ〕、／のＢサブ単位を常法により精製した［メカ［ラノス３、インノＪクシミ１ン・アンド・イミコーニブイー、第１（５巻、第７ｊ１９頁（１９７７）及び第２０巻、第５！〕２真（１９’７８）　］　、、仝菌全菌クブンに使用リベくこれら繊毛形成菌株を死滅さゼ、゛かつ保持ターるために用いる方法は、１−ｃｐ△繊毛の免疫性を破壊しζ（、末ならない（〕とが予想さ−れる１、く二の点１５〜閏（・、１％グルタルシ′ルデじド若しく　Ｇｔ　１％ホルマリンに３１、る繊−＋：影形成菌体の？４〜・ −４８時間にわたる処理はこの微生物を効果的（、′。

死滅させるど共（、二、Ｔ　ＣｐＡ繊毛の免疫性を維持・Ａる１、（二のタヒ滅全菌体ワクブンを経口若しくは非経し］投与すイ）ための和牛物は、好ま１ツクはオガワ血清型の少なくとも１Ｇ１０個の＋１．ｉ　’を戯。

した繊毛形成＼、仁−］レラ菌体（０３９５−Ｎ１若しくは０：３９５−Ｎ　１　（Ｌ）Ｃ３１２Ｇ　７））どイナバ血清脳ｊ９の少なくとも１０１０個の死滅ｌ、ノた繊毛形成＼／、　］レラ工菌体（５６９＋、３この種のワクチンの保護効果は、繊モ形成＼仁゛、コレラ、丁７菌体を作成すべく使用した同じ培養物から製造される」１人ｌントキシンの精製Ｂサブ単位を２００〜５００ａ含ませる＜、□二とによりざらに改善することができる。４種全ての生産菌株がＡ→ｔ− ７単位の毒素を欠如すること、並びに上記培養条件がＴＣ：ｌ：）Ａ繊毛及びＢサブ単位の両者を発現するのに最適であることｌ−６、注目される。これらは好適種類の生産菌株及び条（１′ｃある。

代案として、繊毛形成菌株を剪断しかつ差別沈降若しくはその伯の方法によりＴ　ＣｐＡ繊毛を精製し、次いでこれを単独で或いは精製コレラＢサブ単位と組合せてワクチンとして使用することができる。

ｂ１皿旦旦八へ−４，，７２−チーンこの一ツクチンはＴＣｐＡ繊毛の少なくとも１個の免疫原断片（たとえば少なくとも１個のＴＣＩ）Ａ繊毛決定子、好ましく）は少なくとも２個簀しくは３個のＪの種の決定子をイ）づ−る断ハ）−ζ゛構成−れる。繊毛は合成的（、、Ｔ或いは適する条件１ζで増殖されかつ次い（゛常法によ、り精製された全菌体から作成する。ニーとが（゛さ、或いは組換Ｄ　Ｎへ技術を用いＣ作成りる（、−とかで−きる５、たとえば、丁ｃｐ△繊１）ノアミノ酪配列の断ハ）こ対応する合成ポリベブノードを常法（Ｃより作成−づることがＣさ“、或いは（＝の種の断ハを一し〜ド９′る核酸配列を発現シスラ１＼Ｃ発現さぜ−ると共（、二得られたポリペプチドを精製づ゛ることＧ　（″きる。常法を用いてこの種の断ｊ１を同定り−るＪ二どができ、１．、：とえば」ニーｇ、、、−リＡ遺伝子−の部分欠失体を作成しハ上記のように発現させ、かつこの部分”ｒｃｐＡ生産物の効果を試験することかで゛きる。原１””’　ＣＬ）　Ａ繊毛と同様な免疫性を有する断片がこの種のワクチンに有用である。同様に、丁ｃｏＡ繊毛に対し交差反応するポリペブリードも本発明に適している（交差反応どは、ＴｃｐＡ繊毛に対し生産された抗体により免疫沈澱しつるポリペプチドを意味づる）。、一般に、ジャーナル・［−レキュラ・イミュノＤジー、第１９巻、第１５４１〜１５４９頁（１９８２）及びジＡ・−太ル・Ｅレキュレ・ゴミ１ノ１コシー１第２１巻、第７８５〜７９３頁（１９８４）を参照りることができる。

このワクチンにＶ。コレラ丁の死滅全菌体又はＢサブ単位を補充したり或いはこれを用いＣ現存ワクチンを補うこともできる。

さらに、合成ペプチドはワク′ノーンに使用するための純灸疫原を製ｉ６ｖる安価な手段を提供する。丁ＣＤＡ繊毛の推定アミノ酸配列（そのＤＮＡ配列から得られる）は、ＴＯＤＡ繊毛と反応してその機能（細胞結合性）を阻止する抗体を生成させる免疫原として作用するような合成ペプチドを設計するのに必要な必須情報を与える。この種の免疫原ペプチドは系統的な手段により同定することができ、この場合は非単なり若しくは部分型なりペプチドを合成し、次いで抗体をそれぞれにつき生成させる。ＴｃｐＡ繊毛と反応して宿主細胞に対するその結合を阻止する或いは有毒Ｖ、コレラエから動物を実際に保護する抗体を誘発するようなペプチドを、次いで同定する。これらペプチドはＴＣｐＡ繊毛の保護エピトープを有し、したがって好ましくはこれらを適当な免疫キャリヤ蛋白に化学架橋ざぜた後にコレラワクチンとして使用することができる。このキャリヤ蛋白は、［Ｔ−細胞ヘルプ機能」を与えることによりペプチドの免疫性を向上させる。多くの異なる蛋白がペプチドキャリヤとして使用されているが、最良のものはコレラＢサブ単位又はイー・コリの感熱性エンテロ１〜キシンのＢサブ単位である［インフエクション・アンド・イミューニティー、第４４巻、第２６８〜２７３頁（１９８４）　］。

実施例　３：ＴｃｐＡ−関連キメラ蛋白ワクチン化学架橋したＴｃｐＡ−関連ペプチドキャリヤ蛋白結合体を免疫原として使用しうると同様に、遺伝的に誘導した融合蛋白もコレラワクチンにて免疫原として作用することができる。これら遺伝子融合体は、ＴｃｐＡ繊毛用の構造遺伝子から或いはＴＣｐＡ蛋白に関するペプチド配列及びキャリヤ蛋白の遺伝子をコードする合成りＮＡオリゴヌクレオチドから作成される。本出願人はｔｃｐＡｍ伝子とイ信子コリのアルカリホスファターゼの遺伝子（ｉ）ｈＯＡ＞との間の遺伝子融合体を作成し、かつ上記のようにＶ、コレラエ及びイー・コリの両者で融合蛋白の産生を示した。これらの融合蛋白はＴｃｐＡ１毛に対し生成された抗体と反応し、したがって恐らく融合蛋白を免疫原として使用すればＴｃｐＡ繊毛に対し抗体を刺戟すると思われる。この遺伝子操作を用いて、ｔｃｐＡ−関連ＤＮ、Ａ配列とＬＴ−８サブ単位コレラトキシンＢサブ単位に類似したキャリヤ蛋白（すなわちジフテリャトキシン及びテタヌストキシンのようなキャリヤ蛋白）の遺伝子との間における他の融合蛋白を作成することもできる［ＦＥＢＳレタース、第２０８巻、第１９４〜１９８頁（１９８６）　］。

Ｃ０異種生ワクチン比較的非病原性となるよう改変されたサルモネラ、イー・コリ若しくはワクチニアウィルスの生存菌体を組換ＤＮＡ技術により形質転換させ或いは改変して、ＴｃｐＡ繊毛蛋白、好ましくはさらにコレラトキシンのＢサブ単位をコードする。

これら国体若しくは粒子を用いて、これらがＴｃｐＡ繊毛及び好ましくはＢサブ単位に対しても抗体生産を刺戟することができれば、コレラに対し接種することができる。蛋白の免疫学上活性な断片のみをこれら微生物によりコードすれば良く、このワクチンを上記ワクチンと組合せて或いは従来のワクチンと組合せて使用することができる。

実施例　４：この実施例は、ＴＣＯＡ’ｍ、毛サブ単位を発現する異種キャリヤ生ワクチンの作成を説明する。Ｓ、チフィ　ＴＶ２１Ａ［ジャーナル・インフエクチャス・ディシーズ、第１３１巻、第５５３頁（１９７５）　：インフエクション・アンド・イミューニティー、第４６巻、第５６４〜５６９頁（１９８４）　］　、他のサルモネラ・スペシーズ［ネイチャー、第２９１巻、第２３８〜２３９頁（１９８１）　］　、イー・コリーシゲラ・ハイブリッド［インフエクション・アンド・イミューニテイー、第４６巻、第４６５〜４６９頁（１９８４）　］及びワクチニア・ウィルス［ネイチャー、第３１１巻、第６７頁（１９８４）　；プロシープインク・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８０巻、第７１５５頁（１９８３）　］を包含する数種の生物は潜在的な生キャリヤワクチンで市って、同質の病気（腸チフス熱、赤痢、＠癒など）に対し免疫化するだけでなく、生存キャリヤ菌株により運ばれかつ適する保護免疫原に関する遺伝子により発現される他の病気に対しても免疫化する。プラスミドｐｃ３１２Ｇ７若しくは関連プラスミド、たとえばｐＣ３１２Ｇ１０を有するイー・コリ及びＳ・チフイムリウムの両菌株は、ＴｃｐＡ繊毛と免疫学上同一でおる蛋白を生産する。したがって、このプラスミド又はこのプラスミドの誘導体は、生存キャリヤワクチン菌株がＴＣｐＡ−関連免疫原を発現するための必要な遺伝情報を提供する。

このワクチンの製造方法は、生存キャリヤワクチン菌株として用いる微生物に依存する。細菌キャリヤについては、ＴＣＤＡ繊毛を発現するプラスミドが形質転換若しくは結合により常法を用いて導入される。この種のプラスミドをキャリヤ菌株の染色体に組込んで、より安定なＴＣｐＡ繊毛遺伝子の遺伝形質を与えることができる。ウィルスキャリヤについては、ｔ　ｃ　ｐＡ遺伝子配列を、組換ウィルスで感染される宿主（動物若しくはヒト）細胞にて発現するよう遺伝子処理する。

ＴｃｐＡＩ毛を弁環する異種キャリヤ生ワクチンの効果は、これがざらにコレラトキシンのＢサブ単位を発現すれば改善される。したがって、キャリヤ微生物の同じ菌株にｃｔｘＢ遺伝子及びｔＣＯＡＲ伝子を導信子ることが好適である。

作成した後、生存異種ワクチン菌株を常法によりワクチン中に配合し、かつ微生物を増殖させるがワクチン接種された宿主に明瞭な病気を生ぜしめないよう充分多最の投与量にて経口若しくは非経口投与する（たとえば投与１回当り約１０６〜１０１０個の菌体若しくはウィルス粒子）。

侠■ 上記ワクチンの使用は、ヒト若しくはその他の動物に接種してコレラ及び関連感染を防止することを含む。ワクチンは常法を用いて好ましくは経口ルートによるが注射によっても投与することができる。投与量は約１０９〜１０１０生存細菌若しくは１０１０死滅細菌、或いは動物体重１ｋＯ当り１０〜１０００ｍｇのＴｃｐＡＩ毛若しくはＢサブ単位の範囲で変化する。

亙丘１９８７年４月２９日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に次の菌株を寄託して、次の受託番号を受けた：奇託菌　　　　　　　　　　　　　之圧蚤屋Ｖ、　コｔ、、’ラエ０３９５−Ｎｌ　　　　　　　　６７３９６（ｐＣ３１２Ｇ７）Ｖ、］［］／ラエ５６９Ｂ−Ｎ１　　　　　　５３６１３ｔＸ−５Ｓ・チフイムリウムＬＢ５０００　　　　　６７３９７（ｐｃ８１２Ｇ１０）本出願人は、ＡＴＣＣが上記奇託菌を永久保存しかつ本出願が特許された際には第三者に分譲しうろことを承認する。

第三者に対する寄託物の分譲に関する全ての制限は、特許の付与と同時に不可逆的に取除かれる。この物質は、特許期間にわたり米国特許法の下で権限を有する者により決定された人に分譲できる。寄託された物質は、寄託微生物の試料を提供するよう最も新しく要求されてから少なくとも５年間、かついずれの場合にも寄託臼から少なくとも３０年間若しくは特許の有効期間のいずれか長い期間にわたり、これを生存状態かつ非汚染状態に保つのに必要な全ゆる注意を払って維持される。出願人は、寄託物の状態に応じて、要求された際に試料を寄託機関が供給し得なければ、この寄託物を交換する義務を負うことを了承する。

他の実施態様については以下の請求の範囲に記載する。

ＦＩＧ、　ｆ入１ａ、Ａｌａ　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　Ａｌａ　　ＸＬｅ　　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌ氏@Ａｌａ　　Ｇｉｎｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌａｕ　ｍｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｇａｙ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙ秩@　工１ε　入１ａ　工１ｅ国際調査報告１戸１ｅｕｕｌＩＩ＃Ｉｌ鼻１畦＋Ｉｔ’０ＦＮｏ、　　ＰＣ”、　７０５９８１０１４０９１＾嘗−苧藺−−（シー−−１＾ｏｓ１１ｃｊｌ自６＋Ｎ６？／− ｆｆｉ／ｊ、＋（ζ１８／ｎ１ｊ０９゛″゛″゛パ°〜゛Ａｅ″ｗｏｌ゛ｅｓ　Ｎｏｐｒ−、／ＩＩＣ那／ｌ’＋１ｊＯＱ

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｖ．コレラエのＴＣＰＡ繊毛の免疫原決定子からなる精製ポリペプチド。
２．ポリペプチドがＶ．コレラエのＴＣＰＡ繊毛に対し交差反応性である請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
３．Ｖ．コレラエのＴＣＰＡ繊毛からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
４．図示したアミノ酸配列の少なくとも５個の隣接アミノ酸からなる請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
５．請求の範囲第３項記載のＴＣＰＡ繊毛の少なくとも５個の隣接アミノ酸をコードする精製オリゴヌクレオチド。
６．請求の範囲第３項記載のＴＣＰＡ繊毛をコードする１対の遺伝子における１５塩基対配列からなるオリゴヌクレオチド。
７．遺伝子が、それぞれＡＴＣＣに菌株６７３９６及び６７３９７として寄託されたＰＣＳ１２Ｇ７若しくはＰＣＳ１２Ｇ１０によりコードされる請求の範囲第６項記載のオリゴヌクレオチド。
８．Ｖ．コレラエ菌体の培養物を約６．５若しくはそれ以下のＰＨを有する増殖培地にて増殖させることを特徴とするワクチンの製造方法。
９．培養物が、ＡＴＣＣに受託番号５３６１３若しくは６７３９６として寄託された菌株の少なくとも１種からなる請求の範囲第８項記載の方法。
１０．アミノ酸：アスパラギン、アルギニン、セリン、グルタミン酸若しくはグルタミンの１種若しくはそれ以上を含有する増殖培地にてＶ．コレラエ菌体の培養物を定常期まで増殖させ、前記培地は５０〜１００ｍＨＮａＣｌに等しいイオン強度を有すると共に、前記培地を酸素に露出しながら２２〜３０℃の温度に維持することをさらに特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
１１．菌体を死滅させ、かつ死滅した菌体を医薬上許容しうるビヒクルに供給することをさらに特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチンの製造方法。
１２．請求の範囲第１１項記載の方法により製造されたＶ．コレラエの全菌体ワクチン。
１３．ワクチンがＴＣＰＡ繊毛からなり、Ｖ．コレラエ菌体を回収すると共に前記菌体から前記ＴＣＰＡ繊毛を精製することをさらに特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチンの製造方法。
１４．ワクチンがコレラトキシンのＢサブ単位からなり、かつＶ．コレラエ菌体を回収すると共に前記菌体から前記Ｂサブ単位を精製することをさらに特徴とする請求の範囲第８項記載のワクチンの製造方法。
１５．請求の範囲第１項記載のポリペプチドからなるワクチン。
１６．コレラトキシンのＢサブ単位をさらに含む請求の範囲第１５項記載のワクチン。
１７．非一ビブリオコレラ細菌菌株からなり、この菌株が請求の範囲第２項記載のポリペプチドをコードずる核酸を含むことを特徴とするワクチン。
１８．ＡＴＣＣに受託番号６７３９７として寄託した菌株からなる請求の範囲第１７項記載のワクチン。
１９．Ｖ．コレラエのＴＣＰＡ繊毛の免疫原決定子と、コレラトキシンのＢサブ単位の免疫原決定子とからなるハイブリッドポリペプチド。
２０．請求の範囲第１９項記載のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸。
２１．ＴＣＰＡ繊毛が全菌体蛋白の１％若しくはそれ以上を示す濃度で存在する条件下にＶ．コレラエ菌体の培養物を増殖培地中で増殖させ、かつ前記培養物からの菌体若しくは菌体成分を動物に接種することを特徴とするワクチンの製造方法。
２２．菌体１個当り少なくとも１％のＴＣＰＡを全蛋白として有する精製された全細菌菌体を含む溶液。
２３．菌体が突然変異ｈｔｘ遺伝子を有する請求の範囲第２１項記載の方法。
２４．菌体が非毒性レベルのコレラトキシンを有する請求の範囲第２１項記載の方法。
２５．少なくとも１％の全蛋白をＴＣＰＡとして含み、毒性レベルのコレラトキシンを欠如してなる細菌菌体。
２６．菌体がビブリオ・コレラエである請求の範囲第２５項記載の菌体。
２７．菌体が突然変異ｈｔｘ遺伝子を有する請求の範囲第２６項記載の菌体。