HU205372B

HU205372B - Process for producing vaccines against cholera

Info

Publication number: HU205372B
Application number: HU883510A
Authority: HU
Inventors: John J Mekalanos; Ronald K Taylor
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1992-04-28
Also published as: HUT53915A; AU1725788A; AU629793B2; DE3856199T2; DE3856199D1; JP2777894B2; FI895108A0; EP0358692A1; JPH02503914A; ATE166880T1; EP0358692B1; WO1988008431A1; EP0358692A4

Description

A találmány tárgya eljárás Víbrio cholerae elleni immunológiai védelmet biztosító oltóanyag előállítására.

A V. cholerae olyan baktériumfajta, amely a vékonybélben megtelepedve protein toxin kiválasztásával az emberi szervezet hasmenéses betegségét okozza. A kolera toxin hatását részletesen tanulmányozták. A toxin két alegységet tartalmaz, ezek az A és B alegységek; a B alegységnek nincs ismert toxikus aktivitása, azonban oltóanyag komponenseként használva bizonyos fokú immunológiai védelmet biztosít (Black és munktatársa, 1986, Advances in Research on Cholera and Related Diarrheas, 3,271. szerk.: Kuwahara és munkatársai).

A B alegységet tartalmazó oltóanyagokon kívül a kolera elleni oltóanyagok tartalmaznak denaturált teljes kolera toxint, a V. cholerae általában szilárd táptalajon 7,5-8,0 pH-tartományban tenyésztett, elpusztított egész sejtjeit és elpusztított sejtek és inaktivált toxinmolekulák keverékét is. Más oltóanyagok tartalmaznak kolera toxin A alegységet nem termelő, gyengített V. cholerae törzseket és heterolőg nem V. cholerae hordozók gyengített törzseit, azaz nem-V. cholerae törzseket, például Salmonella typhi Ty21A-t, amely kolera ellen védő 01 antigént kódoló klónozott gént tartalmaz [J. Infectious Desease 131,553-558, (1975)].

Ehara és munkatársai [Trop. Med. 28, 21 (1986), és Vaccine, 1988] leírják a V. cholerae 16 kD körüli molekulatömegu protein szerkezeti alegységekből felépülő szálainak tisztítását Ezt a proteint a Coomassie blue színezék nem festi meg, hemagglutinációs (HA) titere mannőzérzékeny. AL-Kaissi és munkatársa [J. App. Back. 58, 221 (1985)1 szintén közölnek mannőzérzékeny HA titeru szálakat.

Kanoh [Nippon Saikingaku Zasshi, 36, 465, (1981)], Melnyikova és munkatársai [Mól. Bioi. Génét. Russian, 2.18, (1982)] és Kanoh [Jpn. J. Bacteriol. 36,465 (1981)] plazmidgének által kódolt V. cholerae ivarszálakat írnak le. Holmgren és munkatársai [Infect. Immun. 33, 136 (1981)] különböző E. coli szálakról számolnak be.

A találmány egy V. cholerae felületi antigénre (proteinre), úgynevezett ostorra, közelebbről toxin által is szabályozott (TcpA) ostorra vonatkozik, amelynek szerepe van a V cholerae bélhez tapadásában és ottani elterjedésében, és amelyet a kromoszómán található TcpA gén kódol. Bizonyos laboratóriumi tenyésztési feltételek jelentősen fokozzák ezeknek az ostoroknak a termelését, ezért a találmány tárgykörébe tartozik a V. cholerae tenyésztési eljárása is a TcpA ostorok termelése érdekében. A találmány tárgya továbbá eljárás a kolera toxin B alegységének termelésére, ezt a folyamatot és a TcpA ostorok termelését azonos tényezők befolyásolják; a kolera toxin B alegysége ugyancsak hasznos oltóanyag-komponensként. Ezenkívül klónoztuk a TcpA ostor alegységének szerkezeti génjét, és meghatároztuk a TcpA protein aminosav-sorrendjéL Ezeknek az anyagoknak és ismereteknek az alapján számos, különböző típusú kolera elleni oltóanyag előállítása lehetséges, amelyek fokozzák olyan antitestek termelését, amelyek felismerik a TcpA ostorokat, és ezáltal megakadályozzák a V. Cholerae emberi bélben való megtapadásátés elterjedését.

A találmány egyrészt az alábbi anyagok előállítási eljárására vonatkozik:

1. „tisztított” polipeptid, amely a V. cholerae TcpA ostorának (vagy azzal reakcióra hajlamos polipeptidnek) legalább egy immunológiai determinánsa,

2. a V. cholerae TcpA ostorának legalább nyolc szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotid és az oligonukleotid által kódolt polipeptid és

3. a V. cholerae TcpA ostorát kódoló gén egy részének nukleinsav-sorrendjével lényegében megegyező 15 bázispárt tartalmazó oligonukleotid.

A „tisztított” kifejezésen azt értjük, hogy a TcpA ostort vagy az ostor egy részét alkotó polipeptidet elválasztjuk a természetben vele együtt előforduló egy vagy több komponenstől, például az OmpU külső membránproteintől, amely a V. cholerae külső membrán egyik komponense. A polipeptidet előnyösen ezektől, a vele együtt előforduló, egyéb, természetes komponensektől mentesen nyerjük, a készítmény összes proteintartalmának több, mint 50%-a mennyiségben, amelyben az OmpU-tartalom kisebb a szokásos szint 50%-ánál.

Polipeptiden a TcpA-t felismerő antitest termelését előidéző, a TcpA egy részét kódoló aminosavszekvenciát értjük.

A találmány másrészt oltóanyagot termelő eljárást foglal magában, amelynek során V. cholerae sejteket tápközegben tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek esetén a TcpA termelése meghaladja a szokásos mértéket, előnyösen pH-6,5 vagy annál kisebb pH-jú tápközegben, vagy mutált htx géneket tartalmazó sejtek alkalmazásával. Az oltóanyag előnyösen egész elölt sejteket tartalmaz, ekkor az eljárás kiterjed a sejtek elpusztítására is; vagy az oltóanyag a TcpA ostorokat tartalmazza, ekkor az eljárás magában foglalja a V. cholerae összegyűjtését és a TcpA ostoroknak a sejtektől való megtisztítását; vagy az oltóanyag a kolera toxin B alegységét tartalmazza, ebben az esetben az eljárás kiterjed a V. cholerae sejtek összegyűjtésére és a kolera toxin B alegységének a sejtektől való megtisztítására.

Ugyancsak a találmány tárgykörébe tartozik a TcpA ostorokat vagy azok immunizáló determinánsát tartalmazó oltóanyagok, előnyösen a fentiek szerint tisztítva; a TcpA ostorok immunizáló részletét kódoló nukleinsavat tartalmazó heterológ (nem-V cholerae) baktériumtörzsek; a V cholerae TcpA ostorának egyik immunizáló determinánsát és a protein B alegységének egyik immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid és az ezt kódoló nukleinsav előállítása. A találmány tárgyához tartozik olyan baktériumsejt előállítása is, amely teljes proteintartalmának legalább 1%-a TcpA alakjában van jelen. Előnyösen a sejtben hiányzik a kolera toxin mérgezést kiváltó szintje; még előnyösebben a sejt mutált htx gént tartalmazó V. cholerae sejt

Az 1. ábra mutatja a V. cholerae TcpA ostorát kódoló gén DNS- szekvenciáját és a megfelelő aminosavszekvenciát.

A TcpA ostor példa a V. cholerae sejtek szálas felületi komponensére (ostorára). A V. cholerae 0395 egész

HU 205 372 Β sejtjeitől elválasztva a TcpA ostor látszólagos molekulatömegeként SDS poliakrilamid gélelektroforézissel

20,5 kD határozható meg. A TcpA ostor összekapcsolódik a V. cholerae felületén lévő makromolekuláris szálas szerkezetekkel, és sűrűséggradiens-centrifugálással részlegesen megtisztítható. Az ostor jelentős mennyiségben csak a V. cholerae sejtek bizonyos környezeti feltételek között végzett tenyésztésével termelhető, legkedvezőbben alacsony pH-érték esetén, előnyösen 6,5-es vagy annál kisebb pH-tartományban, 7,5-es pHérték felett gyakorlatilag kimutathatatlan. Termelése szempontjából legkedvezőbb továbbá a csekély, 50100 mmól/dm³ nátrium-klorid-oldatával egyenértékű ionerősség. A TcpA ostor termelését befolyásoló egyéb tényezőkhöz tartozik aminosavak, így aszparagin, arginin, szerin, glutaminsav, illetve glutamin [például LBtápközeg (Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Láb. Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972] jelenléte a tápközegben, levegőztetés (a tápközeg 6 dm³-ére számítva percenként 0,5-2 dm³), a tápközeg típusa (előnyösen folyadék) és az inkubálás hőmérséklete (előnyösen 25-30 ’C). Ezenkívül a TcpA ostorok a V. cholerae sejtek növekedésének csak bizonyos szakaszában (állandósult fázisában) termelődnek. Ezek a tenyésztési körülmények általában nem optimálisak a sejtnövekedés szempontjából, inkább a TcpA ostor termeléséhez optimálisak.

A TcpA ostorok tisztítás után szálkötegeket alkotnak, a proteint a Coomassie blue színezék megfesti, és HA-aktivitását a mannóz nem változtatja meg.

Egy készítmény TcpA-tartalmának meghatározására a készítmény egy részét gélben futtatjuk, a TcpA-nak megfelelő proteinfolt lokalizálására TcpA antitestekkel reagáltatjuk, a proteinfoltot kivágjuk a gélből, és meghatározzuk a TcpA mennyiségét. A TcpA %-ban kifejezett tartalmának kiszámítását szokásos módon meghatározott teljes proteintartalom alapján végezzük.

A V. cholerae TcpA ostorát kódoló gént az alábbiakban leírtak szerint klónoztuk; DNS-szekvenciáját az 1. ábra mutatja. A TcpA gén helye rögzített a kromoszómában. Ezt a klónozott DNS-t, a V. cholerae más törzseiből származó hasonló DNS-t vagy az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát kódoló szintetikus DNS-t használva, TcpA ostort más baktériumtörzsekben is termelhetünk a szokásos eljárásokkal. így a „TcpA ostor” kifejezés olyan proteineket foglal magában, amelyek módosított aminosavszekvenciái lényegesen nem befolyásolják a molekula antigén képességét. Hasonlóan, a TcpA-kódoló génen ilyen módosított nukleotidokat vagy a „TcpA-antigén részleteit kódoló géneket értünk. A DNS-t bevihetjük például bármely szokásos vektorba, és transzformálhatjuk baktériumtörzsekbe, amelyek alkalmasak TcpA ostor kifejezésére.

A találmányt a következőkben példákkal illusztráljuk.

l.példa

A TcpA gén klónozása

TnphoA a Tn5 transzpozon származéka, amely megtartja azokat a tulajdonságait, hogy sokféle gazdaszervezettel rendelkezik, és véletlenszerűen képes beépülni, de ezentúl fúziót idézhet elő célgének és PhoA, az Escherichia coli (E. coli) alkalikus foszfatáz génje között [Manoli és munkatársai: Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82, 8129, (1986)]. Az ilyen génfúziók olyan hibrid proteineket kódolnak, amelyek az alkalikus foszfatáz (PhoA) karboxiterminálisán keresztül a céltermék aminoterminálisához kapcsolódnak (fuzionálnak). Ezeknek a hibrid proteineknek nincs PhoA-aktivitása, vagy az nagyon csekély, kivéve, ha a célgén rejtett vagy membránon áthatoló proteint kódol. Ezek az aktív fúziók könnyen azonosíthatók kék kolóniákként, ha kromogén alkalikus foszfatáz-szubsztrátot, 5-bróm-4klór-3-indolil-foszfátot (XP) keverünk az agar tápközegbe, amelyen a TnphoA betoldásokat tartalmazó baktériumsejteket szélesztjük. Mivel lényegében a virulencia-faktorokhoz sorolt összes baktériumprotein a sejtfallal, a sejt felületével kapcsolatos, vagy sejten kívüli, ez az eljárás a betoldásos mutációk erőteljes megnövekedését biztosítja, ami befolyásolhatja a baktériumok kórokozó tulajdonságait, mint a szaporodást vagy a toxintermelést.

A V. cholerae kromoszómájába véletlen TnphoAbetoldást a pRT291 segítségével végeztük, amely a sokféle gázdaszervezetű, P- csoportba tartozó pRK290 plazmid származéka [Mekalanos: Natúré, 276, 633, (1978)], amely a TnphoA másolatát tartalmazza (ez a TnphoA-val végbement spontán transzpozíció útján keletkezett). Röviden, TnphoA-kromoszóma betoldását pRT291-et tartalmazó V. cholerae törzsekben hoztuk létre úgy, hogy pPhlJI (lásd az előző hivatkozást) plazmiddal felülfertőztük, és kanamicin- és gentamicin-rezisztenciára szelektáltuk. A TnphoA-betoldásokat tartalmazó V. cholerae telepeket osztályoztuk a PhoA⁺ fenotípus szempontjából 0,2% glükóz- és 20 mg/cm³ XP-tartalmú LB-agar tápközegen (Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Láb, Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972) 30 ’C hőmérsékleten.

Többezer, TnphoA-betoldást tartalmazó V. cholerae kolóniát vizsgáltunk át PhoA⁺ fúziós proteineket kódoló mutációk szempontjából. A TnphoA-betoldást tartalmazó kolóniáknak mintegy 1%-a volt ebben a közegben, jelezve azt, hogy rejtett vagy membránproteint kódoló génekhez kapcsolt TnphoA-másolatokat tartalmaznak, amely proteinek ebben a közegben kifejeződnek.

A kék kolóniák közül negyvenet megtisztítottunk, és poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) elemeztük teljes proteinprofiljukat. V. cholerae vad és mutáns törzseit tenyésztettük 6,5 pH-értékű LB-tápközegben, 30 ’C hőmérsékleten, levegőztetés mellett 18 óra időtartamig. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, pufferolt mintaoldatbari redukáló anyaggal roncsoltuk, és nátrium-dodecil-szulfát (NaDodSOí) jelenlétében, 12,5%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézissel elemeztük a Mekalanos és munkatársai által korábban ismertetett módon [Infect. Immun. 16,787 (1977)].

Hét mutánsnak a proteinprofiljában volt kimutatható egy vagy több proteinfolt elvesztésében megnyilvánuló

HU 205 372 Β eltérés. A mutánsok egy, az RT110.21 törzs által képviselt típusa egyetlen, 20,5 kD molekulatömegű proteint veszített.

20,5 kD proteinhiányos mutánst tenyészetképződési hibák szempontjából tanulmányoztunk kompetícióvizsgálattal oly módon, hogy 3-9 napos CD-I egereket a mutáns- és a szülőtörzzsel együtt fertőztünk meg lényegében a Freter és munkatársai által közölt módon [Infect. Immun. 34,234 (1981)]. A 20,5 kD proteinhiányos RT110.21 mutánstörzs észrevehetően csökkent versengési képességet mutatott a szülőtörzzsel szemben in vivő, azonban in vitro nem. Egy másik, függetlenül izolált, 20,5 kD proteinhiányos mutánssal végzett más kompetícióvizsgálatok igazolták, hogy ezek a mutánsok fiatal egerekben, valamint ivarérett nyulakban egyaránt lényegesen csekélyebb mértékben szaporodnak.

Sejtfrakcionálási vizsgálatok azt mutatták, hogy a

20,5 kD molekulatömegű protein a baktériumsejt felületén elhelyezkedő makromolekuláris szerkezetekkel függ össze. Egy, a 0395N1 törzsből származó nem csillós (mot-39) mutánst [Mekalanos: Natúré, 306, 551 (1983)] használtunk ezeknek a szerkezeteknek az ostortalanított sejtekből történő részleges megtisztítására többször megismételt differenciális ülepítés útján. A törzset 6,5 pH-értékűLB-tápközegben tenyésztettük. A 2 dm³ térfogatú lombikokban 400 cm³ tápközeget használtunk, és a kultúrát 30 °C hőmérsékleten 150 fordnlat/perc fordulatszámmal végzett forgatással 16 óra időtartamig tenyésztettük. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és 12,5 mmól/cm³ trisz-HCI (pH=7,0), 25 mmól/dm³ NaCl, 4 mmól/dm³ MgCl2 és 4 mmól/dm³ CaCl2-tartalmú pufferoldatban újraszuszpendáltuk. A baktériumsejteket egy 21-es kaliberű fúvókán történő áthaladás útján ostortalanítottuk, az ostorokat többször megismételt differenciális centrifugálással tisztítottuk, a sejtek és oldható proteinek eltávolítása céljából. Az ostortalanított sejtek eltávolítására végzett centrifugálás szokásos körülményei 20 perc időtartam és 3·1Ο³ g voltak. A felülúszót összegyűjtöttük, és az összegyűlt üledéket eldobtuk. A felülúszó folyadékot ezután 40 percig centrifugáltuk 1,5· 10⁴ g-vel. Ennél a műveletnél a felülúsző folyadékot dobtuk el, és az üledéket gyűjtöttük össze, és újraszuszpendáltattuk (trikrezil-foszfát) pufferoldatban. A differenciális centrifugálásnak ezt a két lépését kétszer újra megismételtük. A művelet végén összegyűjtött üledék az eljárás tisztított TcpA terméke (azaz a TcpA protein több, mint az összes sejtprotein 50%-a). Az ostorok izolálását a

20,5 kD molekulatömegű ostoralegység tisztítását követve PAGE vizsgálattal követtük nyomon. A tisztított ostorokat elektronmikroszkóppal figyeltük meg, miután 2%-os ammónium-molibdát-oldattal végzett festéssel a készítményeket előkészítettük a vizsgálathoz. Ezeknek a készítményeknek az elektromikroszkópos vizsgálata hosszú, párhuzamosan összekapcsolódó (7 nm átmérőjű) szálakat vagy ostorokat mutatott. Egyedi ostorfönalak láthatók voltak a 0395 törzs sejtjeinek felületén, a 20,5 kD-os proteinjét elvesztett, TnphoA által indukált mutánsok sejtjein azonban nem.

A 20,5 kD molekulatömegű proteint tovább tisztítottuk a PAGE módszer elve alapján végzett elektroelúcióval, és N-terminális aminosavszekvencia elemzésnek vetettük alá. A szekvenciaadatok megegyeznek az 1. ábrán feltűntetett adatokkal. Ez a szekvencia erősen hidrofób, és képviselheti egy kiválasztó jelszekvencia részét vagy egészét Ezzel a következtetéssel összhangban az RT110.21 törzsből származó TnphoA-fúzió szubklónozása és a DNS-szekvenciavizsgálat azt mutatta, hogy a PhoA-gén az ostort kódoló szekvenciájához kapcsolódott az aminosavak ezen hidrofób szakaszát kódoló szekvenciájától 92 kodonnal a molekula 3’ vége irányában. Két másik, 20,5 kD proteinhiányos mutáns is tartalmaz TnphoA-betoldásokat, amelyekben előforduló ugyanazon nyitott leolvasási keretnek megfelelően kapcsolódott PhoA, igazolva azt, hogy valóban ez a szekvencia képviseli a V. cholerae ostor struktúrgénjét

A TcpA szál génje számára két lépésben kiónoztuk a gént. Először az RT110.21 mutánstörzsben lévőTcpATnphoA génfúziót klónoztuk egy plazmidra az E. coliban lévő kanamicin-rezisztens fenotípusának kiválasztásával. Az ezzel a TnphoA-fúziőval szomszédos DNSszekvenciából származó génmintát használtuk a 0395 törzs vad típusú génjét tartalmazó kozmid klón azonosítására (lásd az előző hivatkozást). Ez a pCS 12G7-nek nevezett plazmid. a következő kísérletek bizonysága szerint aktív TcpA gént hordoz:

a) Ha a pCS12G6 plazmidot bevisszük a TcpA mutáns

RT110.21 törzsbe, az kijavítja ostorhibáját, és a plazmidot tartalmazó törzs újra termeli a TcpA ostort.

b) Az egész TcpA gén DNS-szekvenciájának meghatározása igazolja annak a helyzetét a pCS12G7 plazmidon. Ez a szekvencia látható az 1. ábrán.

c) A V. cholerae 0359-N1 vagy 569B-N1 törzsbe beépülve a pCS12G7 plazmid fokozott ostorképződéssel jellemzett fenotípust idéz elő, amennyiben ezek a törzsek 2-3-szor több TcpA ostort termelnek, mint egyébként szokásos a kifejező tápközegben. Az 596B-N1 a V. cholerae Inába szerotípusú törzse, amelynek ctxA génje hiányos, azonban ctxB+ típusú. A törzset a 395-NT törzs ctxAB KM^r mutációjának az 569B törzs spontán módon nagy mozgékonyságú származékába történő transzdukációjával hoztuk létre (az 569B törzs általában nem mozgékony). A transzduktánst (az 569B-NT törzset) aztán a pJM290.2 plazmiddal lejátszódó rekombinációjával 569B-N1 törzzsé alakítottuk (lásd az előző hivatkozást).

d) Az E. coli vagy Salmonella typhimuruim LB5000 baktériumokba beépülve a pCS12G7 plazmid olyan proteinalegységet termel, amely méretét és immunológiai tulajdonságait tekintve a Western biot analízis alapján azonos a TcpA proteinnel.

A kolera toxinB alegysége A kolera toxinban a B és A alegység 5:1 arányban van jelen. A B alegyéségnek nincs ismert toxikus aktivitása, és hasznos kolera elleni oltóanyagok kompo4

HU 205 372 Β nenseként. Ismertek V. cholerae törzsek, amelyekben mutációk inaktiválják az A alegységet. Az A és B alegységek tartalma jelentősen növelhető, ha a V. cholerae sejteket olyan tápközegben tenyésztjük, amely a fentiek szerint alkalmas a TpcA ostor termelése szempontjából. Inaktív A alegységet tartalmazó mutánsokat, például ctxA-hiányos törzseket használva (lásd az előző hivatkozást) lehetséges egyidejűleg nagy mennyiségű B alegységet és TcpA ostort termelő sejtek tenyésztése.

A B alegység és a TcpA ostor fokozott termelésének indítéka az, hogy ezeket a proteineket kódoló géneket ugyanazok a - toxR - gének szabályozzák, amelyeknek a szabályozását vagy aktivitását viszont a növekedés feltételei befolyásolják.

Továbbá egy TcpA-specifikus hibridizációs mintát (csak olyan nukleotidokat tartalmazó DNS-szakaszt, amelyek ismereteink szerint a TcpA protein aminosavait kódolják) használva kimutattuk, hogy a TcpA gén a V. cholerae összes olyan törzsében jelen van, amelyeket kolerabetegekből izoláltak. Ezzel szemben a V. cholerae számos, környezetből származó (például vizekből izolált) törzse nem tartalmazza a TcpA gént. Ezek a megfigyelések alátámasztják azt az állítást, hogy az emberek hasmenéses megbetegedésével kapcsolatos összes V. cholerae törzs szaporodási faktorát a TcpA kódolja. Ezenkívül a V. cholerae környezetből származó, a TcpA gént nem tartalmazó törzsei ismereteink szerint csekély mértékben szaporodnak el önként vállalkozó emberek szervezetében, és ha egyáltalán kialakul bennük immunitás, annak mértéke csekély (Levine és munkatársai: Acute Enteric Infections in Children, 26. fejezet, Elsevier, 1981.). Ennek az a magyarázata, hogy azok a törzsek nem termelnek TcpA ostort, és ezért nem tudnak emberekben elszaporodni, vagy nem tudják kiváltani a TcpA ostorral reagáló, védelmet nyújtó antitestek termelését.

Kolera-oltóanyag

Az a lehetőség, hogy mind TcpA ostort, mind nagy mennyiségű B alegységet termelhetünk, módot nyújt különféle kolera elleni oltóanyag készítésére.

a) Elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyag

Ehhez az oltóanyaghoz V. cholerae sejteket tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a TcpA ostor és/vagy a kolera toxin B alegységének kifejezését nagyobb mennyiségben. A 0395-N1, 569B-N1 törzsek és származékaik számára létesítettünk ilyen körülményeket (lásd a 2. példát), kimutattuk azonban, hogy ilyen körülmények elvileg a V. cholerae bármely törzse számára létrehozhatók, feltéve, hogy a TcpA és a kolera toxin B alegysége termelését használjuk a tenyésztési paraméterek optimalizálására. Hasonlóképpen, izolálhatók olyan mutáns V. cholerae törzsek, amelyek az itt bemutatottaktól eltérő tenyésztési körülmények között termelnek TpcA ostort és B alegységet (lásd a 2. példában az 569B htx-5 törzset). A találmány alapvető felismerése az, hogy bizonyos tenyésztési körülmények között a V. cholerae olyan sejteket hoz létre, amelyek nagy (az összes sejtprotein 1%át meghaladó) mennyiségben fejezik ki felületükön a TcpA ostorokat, és így alkalmasak kolera elleni oltóanyagként. Megfelelő törzsek alkalmas viszonyok között végzett tenyésztése után a sejteket szokásos eljárásokkal (például glutáraldehiddel vagy formaldehiddel végzett kezeléssel) elpusztítjuk. Ezeket a kezeléseket úgy kell végezni, hogy a TcpA ostor és a B alegység antigén tulajdonságait megőrizzük.

Ezt az oltóanyagot kiegészíthetjük tisztított B alegységgel, amelyet szokásos eljárással termelünk, vágy úgy, hogy a sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek fokozzák a B alegység termelését, majd a proteint szokásos eljárással tisztítjuk.

2. példa

Kolera toxin B alegység; valamint TcpA ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtek termelése elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyaghoz vagy tisztított TcpA ostorok előállítására

A V. cholerae legalább három különböző törzse használható ostorokat tartalmazó sejtek és a kolera toxin B alegységének termelésére. A 0395-N1 és fokozott ostortermelésű származéka, a 0395-N1 (pCS12G7) törzsek Ogawa szerotípusúak, amíg az 569B-N1 és fokozott ostortermelésű, fokozottan toxinképző származéka, az 569-N1 htx-5 törzsek Inaba szerotípusúak. Az 569B-N1 htx-5 törzs az 569B-N1 törzs htx mutációt tartalmazó származéka, amelyet szokásos eljárásokkal izoláltak [Mekalanos: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 941, (1975)]. Megállapítottuk, hogy a fokozott kolera toxin termelésen túl a htx mutáció a TcpA ostorok fokozott termelését is előidézi mind az alább részletezett tenyésztési körülmények között, mind más tenyésztési feltételek között, amelyek általában nem megengedhetők a TcpA termelés szempontjából (nagy pH-érték, mint például 7,5). Elpusztított egész sejtet tartalmazó kolera elleni oltóanyagnak előnyösen tartalmaznia kell mind Ogawa, mind Inaba szerotípusú sejteket, és ezért rendszerint külön tenyészetet készítenek egy Ogawa és egy Inaba törzsből. A fokozott ostortermelésű származékok a szülőtörzsekhez képest 2-3szor több TcpA ostort termelnek, mivel vagy a 0395 törzs TcpA génjét tartalmazó nagy kópiaszámú pCS12G7 plazmidját (0395-N1 pCS12G6), vagy a htx mutációt (569B-N1 htx-5) hordozzák. Az összes törzset az alább leírt módon tenyésztjük azzal a különbséggel, hogy a 0395-N1 (pCS12G7) törzs esetén a tápközeghez ampicillint adagolunk 50 gg/cm³ végső koncentrációban.

A kiválasztott V. cholerae törzs kiinduló tenyészetét mintacsövekben készítjük el, amelyek 2 cm³ LB-6,5 tápközegét (10 g tripton, 5 g élesztőextraktum, 5 g nátrium-klorid, a pH értéke autoklávozás előtt 6,5-re beállítva) tartalmaznak, és 30 °C hőmérsékleten tartott, 30 fordulat/perc fordulatszámú forgóinkubátorban tartjuk 18 óra időtartamig. A kiinduló tenyészetben a kiindulási sejtsűrűség alacsony (friss agarlemez tenyészetről beoltva mintegy 10¹ sejt/cm³), és tenyésztés után a baktériumsejtek önagglutinációja szembetűnő a szabad

HU 205 372 Β szemmel is könnyen látható anyagcsomósodás formájában. Az összecsomósodott baktériumsejteket hagyjuk kiülepedni a függőleges helyzetben álló csőben, majd pipettával összegyűjtjük a cső aljáról. Az összecsomósodott sejteket használjuk egy megfelelően tervezett fermentációs edényben lévő 6 dm³ LB-6,5 tápközeg beoltására, a fermentációs edény a tápközegen keresztül áramoltatott levegőt kis buborékok alakjában oszlatja szét. A tenyészetet közepes (0,5-1 dm³/perc) levegőztetéssel 25 °C hőmérsékleten 24 óra időtartamig inkubáljuk, amely időtartam alatt a tenyészet állandósult állapotba juh és majdnem teljesen eléri az önagglutináció állapotát. A felületükön TcpA ostorokat tartalmazó, összecsomósodott sejteket centrifugálással öszszegyűjtjük, és 600 cm³,0,85%-os, 10 mmól/dm³ nátrium-foszfáttal pH=7,0-ra pufferolt nátrium-klorid-oldatban újraszuszpendáltatjuk.

Ezeket az ostorokat növesztett V. cholerae sejteket használjuk a tisztított TcpA ostorok vagy az elpusztított egész sejtek előállítására, míg a tenyészet sejtmentes, felülúszó folyadékából szokásos eljárásokkal megtisztítjuk a kolera toxin B alegységét [Mekalanos és munkatársai: Infection and Immunity 16, 789 (1977) és 20, 552(1978)].

Magától értetődik, hogy ezek az eljárások, amelyekkel az ostorokat növesztett sejteket elpusztítjuk és konzerváljuk az egész sejtet tartalmazó oltóanyaghoz történő felhasználáshoz, nem károsíthatják a TcpA ostorok immunizáló képességét. Ebben a vonatkozásban az ostorokat növesztett sejtek 24-48 óra időtartamú kezelése glutáraldehid vagy formaldehid 1%-os oldatával hatékonyan elpusztítja az organizmusokat, viszont a TcpA ostorok immunizáló képessége megőrződik. Ezen elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyag szájon keresztül alkalmazott vagy a gyomor-bél rendszert megkerülő készítményének egy dózisa előnyösen legalább 10¹⁰ elpusztított, Ogawa szerotípusú, ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtet [0395-N1 vagy 0395N1 (pCS12G7)] és legalább 10¹⁰ elpusztított, Inaba szerotípusú, ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtet (569B-N1 vagy 569B-N1 htx-5) tartalmaz.

Egy ilyen oltóanyaggal biztosítható védelem hatásosságát tovább fokozhatjuk 200-500 pg kolera toxin B alegység adagolásával, amelyet ugyanazon kultúrából készítünk, mint amelyet az ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtekhez használunk. Tekintetbe kell venni, hogy a toxin A alegysége mind a négy termelőtörzsből hiányzik, és hogy a fenti tenyésztési körülmények mind a TcpA, mind a B alegység kifejezése szempontjából optimálisak - ezek a termelőtörzsek és a tenyésztési viszonyok előnyös típusai.

Egy másik eljárás szerint a fenti, ostorokat tartalmazó sejteket ostormentesíthetjük, és a TcpA ostorokat differenciális ülepítéssel vagy más módszerekkel tisztíthatjuk, és önmagában vagy tisztított kolera B alegységgel együtt oltóanyagként használhatjuk.

b) TcpA szálakat tartalmazó oltóanyag

Ez az oltóanyag a TcpA ostornak legalább egy immunizáló szakaszát (például olyan szakaszát, amelyben legalább egy TcpA ostor determináns és előnyösen legalább két vagy három ilyen determináns van) tartalmazza. Az ostorokat készíthetjük szintetikusan vagy megfelelő körülmények között tenyésztett egész sejtekből szokásos tisztítási eljárásokkal, vagy DNS rekombinációs eljárással. Például előállíthatunk szokásos eljárásokkal olyan szintetikus pohpeptidet, amely megfelel a TcpA ostor aminosavszekvenciája egy szakaszának, vagy kifejezhetünk expresszióra alkalmas rendszerben ilyen szakaszt kódoló nukleinsavszekvenciát, és a kapott polipeptidet megtisztítjuk. Ilyen szakaszok azonosítására használhatunk szokásos eljárásokat, például kialakíthatjuk a TcpA gén részleges törléseit, a fentiek szerint kifejezhetjük, és tanulmányozhatjuk ennek a részleges TcpA terméknek a hatásosságát. Azok a szakaszok, amelyeknek az immunizáló képessége hasonló a szülőtörzs TcpA ostoráéhoz, használhatók ilyen oltóanyagokban. Hasonlóképpen alkalmasak a találmány szerinti oltóanyagok szempontjából azok a polipeptidek, amelyek keresztreakcióra hajlamosak a TcpA ostorral. (Keresztreakciőra hajlamos polipeptiden olyan polipeptidet értünk, amely a TcpA ostorral szemben termelt antitestekkel immunreakcióban kicsapódnak [J. Mól. Immunoi. 19,1541-1549 (1982) és J. Moh Immunoi. 21, Ί85-Ί93 (1984)].

Ezt az oltóanyagot kiegészíthetjük V. cholerae elpusztított egész sejtjeivel vagy B alegységgel, vagy magát is használhatjuk meglévő oltóanyagok kiegészítésére.

A szintetikus peptidek is olcsó lehetőséget biztosítanak vakcinákban alkalmazható tiszta immunizáló anyagok termeléséhez. A TcpA ostorok (DNS-szekvenciájából levezetett) származtatott aminosavszekvenciája nyújtja az alapvető információt, ami szükséges olyan szintetizált peptid megtervezéséhez, amely a TcpA ostorral reagáló, és annak funkcióját (a sejtekhez kötődést) meggátló antitestek termelését kiváltó immunizáló anyagként szolgálhat. Ilyen immunizáló peptideket azonosíthatunk fokozatos megközelítés útján, amelynek során nem vagy részlegesen átlapolődó peptideket szintetizálunk, és aztán mindegyikhez antitesteket képzűnk. Azokat a peptideket azután azonosítjuk, amelyek vagy a TcpA ostorokkal reagáló vagy a TcpA szálak gazdasejtekhez való kapcsolódását megakadályozó antitesteket indukálnak, vagy az állatokat virulens V. cholerae sejtekkel szemben ténylegesen megvédik. Ezek a peptidek tartalmazzák a TcpA ostorok védelmét nyújtó epitopjait, és ezért kolera elleni oltóanyagként használhatók, előnyösen kémiailag, keresztkötéssel alkalmas immunizáló hordozóproteinhez kapcsolt állapotban. A hordozőprotein „T-sejt segédfunkciók” biztosításával fokozza a peptid immunizáló képességét. Peptidhordozóként számos különbözőproteint használtak, a legjobbak egyikének bizonyult a kolera B alegység vagy az E. coli hőérzékeny enterotoxinjának B alegysége [Infection and Immunity, 44, 268-273 (1984)].

3. példa

TcpA ostorral rokon, kiméra protein-oltóanyag

Ahogyan kémiailag, keresztkötéssel TcpA-val rokon

HU 205 372 Β peptid/hordozóprotein konjugátum immunizáló anyagként használható, ugyanúgy szolgálhatnak genetikailag származtatott fúziós proteinek is immunizáló anyagként kolera elleni oltóanyagokban. Ezeket a génfúziókat a TcpA ostor struktúrgénjeiből vagy a TcpA proteinnel rokon peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSoligonukleotidból és hordozóprotein génjéből állítjuk elő. Előidéztünk ilyen génfúziót a TcpA gén és az E. coli alkalikus foszfatáz (PhoA) génje között, és a fentiek szerint kimutattuk a fúziós protein termelését mind V. cholerae, mind E. coli sejtekben. Ezek a fúziós proteinek reagálnak a TcpA ostorok ellen termelt antitestekkel, és ezért valószínűleg stimulálnák a TcpA ostorral szembeni antitesteket, ha immunizáló anyagként fúziós proteint használnánk. Ezt a genetikai megközelítést használhatjuk más, TcpA-rokon DNS-szekvenciák és hordozóproteinek (LT-B alegység, kolera toxin B alegység, diftéria toxin és tetanusz toxin) génjei között létrejövő fúziós proteinek előállítására is [FEBS Letters, 208, 194-198 (1986)]:

c) Idegen eredetű, élő oltóanyag

Salmonella vagy E. coli élő sejtjeit és apatogén tehénhimlővírusokat transzformálunk vagy rekombináns DNS- technikával egyéb módon módosítunk a TcpA ostor proteinjének és előnyösen a kolera toxin B alegységének együttes kódolására. Ezeket a sejteket vagy részecskéket használhatjuk kolera elleni oltásra, ha serkenteni tudják az antitestek termelését TcpA ostorok és előnyösen B alegység ellen is. Ezeknek az organizmusoknak csak a két protein valamelyikének immunolőgiailag aktív szakaszát kell kódolniuk, és az oltóanyag a fenti vagy a korábban tárgyalt oltóanyagokkal együtt alkalmazható.

4. példa

Elő, heterológ hordozó-oltóanyag, amely kifejezi a

TcpA ostor alegységét

Számos organizmus, közöttük a Salmonella typhi Ty21A [J. Infect. Dis. 131, 553 (1975), Inf. and Immunity, 46, 564-569 (1984)], más Salmonella fajok [Natúré, 291, 238-239 (1981), E. coli-Shigella hibridek [Inf. and Immunity, 46, 465-469 (1984)] és tehénhimlővírus [Natúré 311, 67 (1984); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7155 (1983)], potenciálisan élő hordozó-oltóanyagok, amelyek nemcsak homológ betegségek (tífuszos láz, sigellozis, himlő) ellen immunizálnak, hanem más betegségek ellen is, amelyek elleni, megfelelő védelmet nyújtó immunizáló anyagokat kifejező géneket tartalmaz az élő hordozótörzs. A pCS12G7 vagy azzal rokon plazmidokat (mint a pCS12G10 plazmidot) tartalmazó E. coli és S. typhimurium törzsek olyan proteint termelnek, amelyek immunolőgiailag azonosak a TcpA ostorokkal. így ez a plazmid vagy származékai biztosítják az élő hordozó-oltóanyag törzsek számára a TcpA-rokon immunizáló anyagok kifejezéséhez szükséges genetikai információt.

Ennek az oltóanyagnak a készítéséhez alkalmazandó eljárás függ az élő hordozó-oltóanyag törzsként használt organizmustól. Baktériumhordozók esetén szokásos eljárásokkal, transzformáció vagy konjugáció útján visszük be a TcpA ostorokat kifejező plazmidokat. Ezeket a plazmidokat a TcpA ostorgének stabilabb genetikai öröklődésének érdekében bevihetjük a hordozó törzs kromoszómájába. Vírushordozók esetén a TcpA génszekvenciát géntechnológiai úton a rekombináns vírussal megfertőzött (állati vagy emberi) gazdasejtekben fejezhetjük ki.

A TcpA ostorokat kifejező élő, heterológ hordozóoltóanyag hatásossága megnő, ha az a kolera toxin B alegységét is kifejezi. Ezért előnyös a ctxB, valamint a TcpA gén együttes bevitele a hordozó organizmus ugyanazon törzsébe.

Miután létrehoztuk az élő, heterológ oltóanyagtörzset, szokásos eljárásokkal oltóanyag-készítménnyé alakítjuk, és szájon keresztül vagy a gyomor-bél rendszert megkerülő úton adjuk be olyan dózisban, amely elég nagy az organizmusok szaporodásához, de nem okoz szemmel látható kórtüneteket a beoltott gazdaszervezetben (például dózisonként ΙΟ⁶-10¹⁰ sejt- vagy vírusrészecske).

A találmány szerinti oltóanyagok kolera- és azzal rokon fertőzések meggátlására irányuló alkalmazása magában foglalja azoknak emberi vagy állati szervezetbe juttatását. Az oltóanyagokat szokásos módon adhatjuk be, előnyösen szájon keresztül, de védőoltással is beadható. A dózisok 10⁹-10^J0 élő vagy 10¹⁰ elpusztított baktériumot, és az állat 1 kg testtömegére vonatkoztatva 10-1000 mg TcpA ostort vagy B alegységet tartalmaznak.

A) példa

Vemhes egereket immunizáltunk TcpA ostorokat (TCP) tartalmazó vakcinával, amelyet a leírás 11. oldalán ismertetett módon készítettünk. Az utódokat V. cholerae három törzsével teszteltük. Az utódok 24 vagy 44 órás %os túlélési adatai alapján megállapíthatjuk, hogy a TcpA ostor olyan immunválaszt eredményezett, amely az anyaállat utódait mindhárom (Ogawa 395, Ogawa E7946 és nem-Ogawa szerotípusú CA401) törzzsel szemben megvédte. A %-os túlélési arányt sóoldatinjekcióval kezelt anyaállatok utódaihoz viszonyítva határoztuk meg. A vizsgálati eredményeket az 1. táblázat mutatja.

1. táblázat

TCP-vakcinával kezelt vemhes egerek utódainak védelme virulens koleratörzsekkel szemben

Anyaállat	Tesztelő törzs	Túlélők/összes állat
ellenőrző	0395	1/6
immunizált	0395	8/9
ellenőrző	CA401	0/6
immunizált	CA401	10/11
ellenőrző	E7946	1/6
immunizált	E7946	7/10

Az anyaállatokat TCP-vel immunizáltuk (100 pg, teljes Freund típusú hatásfokozó szerben) a vemhesség

I

HU 205 372 Β kezdetén és egyszer a vemhesség félidejében (20 gg, nem teljes Freund típusú hatásfokozó szerben). A virulens V. cholerae törzsekkel végzett tesztelést 24 óra (0395) vagy 44 óra (CA401 és E7946) időtartamig kísértük figyelemmel.

B) példa

Különböző nyűlszérumokat adtunk be szoptató egereknek annak megállapítására, hogyan képesek a szérumok megvédeni az egereket Ogawa 0395 típusú V. cholerae törzssel szemben. Az alkalmazott vakcinák az alábbiak voltak:

a) ellenőrző (a nyulaknak nem adtunk be Top A-t),

b) a nyulaknak TcpA-t adtunk be,

c) a nyulaknak TcpA-t adtunk be, és a nyulak szérumát

Ogawa 0395 organizmusokkal abszorbeáltuk az antitestek anti-TcpA antitesteket tartalmazó szervezetekbe történő eltávolítására,

d) a nyulaknak TcpA-t adtunk be, és olyan Ogawa

0395 mutánsszervezettel abszorbeáltuk (RT110.21), amely a TcpA ostorokat nem fejezi ki.

Az ellenőrző [,,a)”] és az Ogawa 0395 által abszorbeált [„c)”J szérumok nem nyújtottak védelmet A módosítatlan [,,b)”J vagy a nem-TcpA mutánsokkal abszorbeált [,,d)”j TcpA-generált szérumok védelmet adtak. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

Egérszaporulat védelme Vibrio cholerae tesztelő törzzsel szemben TCP elleni antitestek útján Az eredmények egyedi kísérletekből származnak, amelyek összesített adatait a vastagon szedett számok mutatják.

Tesztelő törzs Antiszérum Túlélő/összes állat 20-24 36 óra után

0395	normálszérum	0/3	0/3
		1/4	0/4
		2/3	0/3
		1/4	0/6
		4/14	0/14
0395	Anti-TCP	1/3	3/3
		4/4	4/4
		3/3	3/3
		4/4	4/4
		14/14	14/14
0395	Anti-TCP/0395	1/4	1/4
	organizmusokkal	1/4	0/4
	abszorbeálva	2/8	1/8
0395	Anti-TCP/RTl 10.21	3/4	3/4
	organizmusokkal	3/3	3/3
	abszorbeálva	4/4	4/4
		10/11	10/11

1987. április 29-én a következő organizmusokat helyeztük letétbe az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél, amelyben azok a kővetkező deponálási számot kapták:

Letétbehelyezve Deponálási szám

V cholerae 0395-N1 (pCS12G7) 67 396

V. cholerae 569B-N1 htx-5 53 613

S. typhimurium LB5000 (pCS12G10) 67 397

Claims

1. Eljárás egy, a Vibrio cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó, az 1. ábra szerinti aminosavszekvencíájú polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) V. cholerae sejtkultúrából a TcpA ostorokat elválasztjuk, és adott esetben a TcpA ostorok egy polipeptidjét vagy annak egy immunizáló fragmentumát megtisztítjuk, vagy

b) a Y cholerae TcpA ostorát vagy annak egy immunizáló fragmentumát kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy

c) a V. cholerae TcpA szálat vagy annak egy immunizáló fragmentumát alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8—199 szomszédos aminosavát tartalmazó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely, az adott polipeptidet természetes úton termelő sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük, és adott esetben tisztítjuk, vagy

b) az adott polipeptidet kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy

c) az alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk..

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidje előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet az 569B-N1 htx-5 vagy a 0395-N1 (pCS12G7) V. cholerae törzs vagy a S. typhimurium (pCS12G10) törzs sejtkultúrájábólnyeijükki.

4. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely, az adott polipeptidet természetes úton termelő sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük és tisztítjuk, vagy

b) valamely, az adott polipeptidet kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy

c) a polipeptidet alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk.

5. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciájú polipeptidet vagy annak egy immunizáló fragmentumátkódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy V. cholerae sejt kromoszómájából a TcpA gént kinyerjük, és a kapott gént vagy annak egy immuni1

HU 205 372 Β záló fragmentumát kódoló oligonukleotidot tisztítjuk, vagy

b) a TpcA gént vagy annak egy immunizáló fragmentumát kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy V. cholerae sejt kromoszómájából a TcpA gént kinyerjük, és a génnek tisztítjuk azt a fragmentumát, amely kódolja az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát, vagy

b) valamely, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidjét kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot az 569B-N1 htx-5 vagy a 0395-N1 V. cholerae törzs egy sejtjének kromoszómájából nyerjük ki.

8. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a keresztreakciót adó polipeptidet kódoló nukleinsavat kinyerjük, és adott esetben tisztítjuk, vagy

b) a keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.

9. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor génjének immunizáló determinánsát kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot kifejeződőképesen beépítjük egy rekombínáns vektorba.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 6. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot épütjük be.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidjét kódoló oligonukleotidot tartalmazó pCS12G7 vagy pCS12G10 plazmidvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot betoldunk egy rekombínáns vektorba.

12. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot kifejeződóképesen beépítünk egy rekombínáns vektorba. ₍

13. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát kódoló oligonukleotidot tartalmazó gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet valamely, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy V. cholerae sejtet valamely, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 396 deponálási számú törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy V. cholerae 0395-N1 sejtet pCS12G7 plazmiddal transzformálunk.

16. A 13. igénypont szerinti eljárás az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 397 deponálási számú törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy S. typhimurium LB5000 sejtet pCS12G10 plazmiddal transzformálunk.

17. Eljárás V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, a V. cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó polipeptidet gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.

18. Eljárás egész sejtet tartalmazó V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy V. cholerae sejtkultúrát tenyésztünk legfeljebb 6,5 pH-jú tápközegben, a sejteket kívánt esetben elpusztítjuk, és gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.

19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állandósult növekedési fázisban lévő V. cholerae sejtkultúrát alkalmazunk, tápközegként az aszparagin, arginin, szerin, glutaminsav aminosavak legalább egyikét vagy glutamint tartalmazó, 50100 mmól/dm³ koncentrációjú NaCl-oldattal egyenértékű ionerősségű és legfeljebb 6,5 pH-jú, 22-30 °C hőmérsékletű, oxigénnel érintkező oldatot használunk.

20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC töizsgyűjteményben letétbe helyezett 53 613 vagy 67 396 deponálási számú V. cholerae törzsek közül legalább az egyik törzs sejtkultúráját tenyésztjük.

21. Eljárás nem-V. cholerae baktériumtörzset tartalmazó V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy nem-V. cholerae baktériümsejtet egy, az 5, igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk, a sejteket tenyésztjük, összegyűjtjük és kívánt esetben elpusztítjuk, majd gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 397 deponálási számú S. typhimurium (pCS12G10) sejtkultúrát alkalmazunk.

23. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptidet kódoló nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) az 5. igénypont szerinti eljárással előállítunk egy első oligonukleotidot, amely a TcpA ostor immunizáló determinánsát kódolja,

b) V. cholerae sejt kromoszómájából a ctxB gént kinyerve egy második oligonukleotidot állítunk elő, amely a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát kódolja, majd az immunizáló deter9

HU 205 372 Β minánst kódoló oligonukleotidot kinyerjük vagy szintetikusan, in vitro állítjuk elő, és

c) az első és második oligonukleotidot kovalens kötéssel összekapcsolva előállítunk egy hibrid polipeptidet kódoló oligonukleotidot.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotidot pCS12G7 vagy pCS12G10 plazmidban állítjuk elő.

25. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy 10 immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) az 1. igénypont szerinti eljárással előállítunk egy első polipeptidet, amely a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát tartalmazza,

b) előállítunk egy második, a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát kódoló polipeptidet oly módon, hogy

i) V cholerae sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy ii) kifejezzük a V. cholerae ctxB gént egy sejtben, és a polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk,

5 vagy iii) a B alegység polipeptidjét alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk, és

c) az első és második polipeptidet kovalens kötéssel összekapcsolva hibrid polipeptidet állítunk elő.

26. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely hibrid po15 Iipeptidet egy, a 23. igénypont szerinti eljárással előállított hibrid nukleinsavból kifejezzük, és adott esetben tisztítjuk.