HU205372B - Process for producing vaccines against cholera - Google Patents
Process for producing vaccines against cholera Download PDFInfo
- Publication number
- HU205372B HU205372B HU883510A HU351088A HU205372B HU 205372 B HU205372 B HU 205372B HU 883510 A HU883510 A HU 883510A HU 351088 A HU351088 A HU 351088A HU 205372 B HU205372 B HU 205372B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cholerae
- tcpa
- polypeptide
- immunizing
- whip
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 39
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 89
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 46
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 31
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 26
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 5
- 101150087320 ctxB gene Proteins 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 7
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims 2
- 108700032605 Vibrio cholerae TcpA Proteins 0.000 claims 1
- 101100152632 Vibrio cholerae tcpA gene Proteins 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 34
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract 1
- 101100049740 Mus musculus Wrnip1 gene Proteins 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 8
- 229960005004 cholera vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282821 Hippopotamus Species 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101710084629 Major non-capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- YSMRWXYRXBRSND-UHFFFAOYSA-N TOTP Chemical compound CC1=CC=CC=C1OP(=O)(OC=1C(=CC=CC=1)C)OC1=CC=CC=C1C YSMRWXYRXBRSND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- -1 aspartic Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940031689 heterologous vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/107—Vibrio
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás Víbrio cholerae elleni immunológiai védelmet biztosító oltóanyag előállítására.
A V. cholerae olyan baktériumfajta, amely a vékonybélben megtelepedve protein toxin kiválasztásával az emberi szervezet hasmenéses betegségét okozza. A kolera toxin hatását részletesen tanulmányozták. A toxin két alegységet tartalmaz, ezek az A és B alegységek; a B alegységnek nincs ismert toxikus aktivitása, azonban oltóanyag komponenseként használva bizonyos fokú immunológiai védelmet biztosít (Black és munktatársa, 1986, Advances in Research on Cholera and Related Diarrheas, 3,271. szerk.: Kuwahara és munkatársai).
A B alegységet tartalmazó oltóanyagokon kívül a kolera elleni oltóanyagok tartalmaznak denaturált teljes kolera toxint, a V. cholerae általában szilárd táptalajon 7,5-8,0 pH-tartományban tenyésztett, elpusztított egész sejtjeit és elpusztított sejtek és inaktivált toxinmolekulák keverékét is. Más oltóanyagok tartalmaznak kolera toxin A alegységet nem termelő, gyengített V. cholerae törzseket és heterolőg nem V. cholerae hordozók gyengített törzseit, azaz nem-V. cholerae törzseket, például Salmonella typhi Ty21A-t, amely kolera ellen védő 01 antigént kódoló klónozott gént tartalmaz [J. Infectious Desease 131,553-558, (1975)].
Ehara és munkatársai [Trop. Med. 28, 21 (1986), és Vaccine, 1988] leírják a V. cholerae 16 kD körüli molekulatömegu protein szerkezeti alegységekből felépülő szálainak tisztítását Ezt a proteint a Coomassie blue színezék nem festi meg, hemagglutinációs (HA) titere mannőzérzékeny. AL-Kaissi és munkatársa [J. App. Back. 58, 221 (1985)1 szintén közölnek mannőzérzékeny HA titeru szálakat.
Kanoh [Nippon Saikingaku Zasshi, 36, 465, (1981)], Melnyikova és munkatársai [Mól. Bioi. Génét. Russian, 2.18, (1982)] és Kanoh [Jpn. J. Bacteriol. 36,465 (1981)] plazmidgének által kódolt V. cholerae ivarszálakat írnak le. Holmgren és munkatársai [Infect. Immun. 33, 136 (1981)] különböző E. coli szálakról számolnak be.
A találmány egy V. cholerae felületi antigénre (proteinre), úgynevezett ostorra, közelebbről toxin által is szabályozott (TcpA) ostorra vonatkozik, amelynek szerepe van a V cholerae bélhez tapadásában és ottani elterjedésében, és amelyet a kromoszómán található TcpA gén kódol. Bizonyos laboratóriumi tenyésztési feltételek jelentősen fokozzák ezeknek az ostoroknak a termelését, ezért a találmány tárgykörébe tartozik a V. cholerae tenyésztési eljárása is a TcpA ostorok termelése érdekében. A találmány tárgya továbbá eljárás a kolera toxin B alegységének termelésére, ezt a folyamatot és a TcpA ostorok termelését azonos tényezők befolyásolják; a kolera toxin B alegysége ugyancsak hasznos oltóanyag-komponensként. Ezenkívül klónoztuk a TcpA ostor alegységének szerkezeti génjét, és meghatároztuk a TcpA protein aminosav-sorrendjéL Ezeknek az anyagoknak és ismereteknek az alapján számos, különböző típusú kolera elleni oltóanyag előállítása lehetséges, amelyek fokozzák olyan antitestek termelését, amelyek felismerik a TcpA ostorokat, és ezáltal megakadályozzák a V. Cholerae emberi bélben való megtapadásátés elterjedését.
A találmány egyrészt az alábbi anyagok előállítási eljárására vonatkozik:
1. „tisztított” polipeptid, amely a V. cholerae TcpA ostorának (vagy azzal reakcióra hajlamos polipeptidnek) legalább egy immunológiai determinánsa,
2. a V. cholerae TcpA ostorának legalább nyolc szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotid és az oligonukleotid által kódolt polipeptid és
3. a V. cholerae TcpA ostorát kódoló gén egy részének nukleinsav-sorrendjével lényegében megegyező 15 bázispárt tartalmazó oligonukleotid.
A „tisztított” kifejezésen azt értjük, hogy a TcpA ostort vagy az ostor egy részét alkotó polipeptidet elválasztjuk a természetben vele együtt előforduló egy vagy több komponenstől, például az OmpU külső membránproteintől, amely a V. cholerae külső membrán egyik komponense. A polipeptidet előnyösen ezektől, a vele együtt előforduló, egyéb, természetes komponensektől mentesen nyerjük, a készítmény összes proteintartalmának több, mint 50%-a mennyiségben, amelyben az OmpU-tartalom kisebb a szokásos szint 50%-ánál.
Polipeptiden a TcpA-t felismerő antitest termelését előidéző, a TcpA egy részét kódoló aminosavszekvenciát értjük.
A találmány másrészt oltóanyagot termelő eljárást foglal magában, amelynek során V. cholerae sejteket tápközegben tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek esetén a TcpA termelése meghaladja a szokásos mértéket, előnyösen pH-6,5 vagy annál kisebb pH-jú tápközegben, vagy mutált htx géneket tartalmazó sejtek alkalmazásával. Az oltóanyag előnyösen egész elölt sejteket tartalmaz, ekkor az eljárás kiterjed a sejtek elpusztítására is; vagy az oltóanyag a TcpA ostorokat tartalmazza, ekkor az eljárás magában foglalja a V. cholerae összegyűjtését és a TcpA ostoroknak a sejtektől való megtisztítását; vagy az oltóanyag a kolera toxin B alegységét tartalmazza, ebben az esetben az eljárás kiterjed a V. cholerae sejtek összegyűjtésére és a kolera toxin B alegységének a sejtektől való megtisztítására.
Ugyancsak a találmány tárgykörébe tartozik a TcpA ostorokat vagy azok immunizáló determinánsát tartalmazó oltóanyagok, előnyösen a fentiek szerint tisztítva; a TcpA ostorok immunizáló részletét kódoló nukleinsavat tartalmazó heterológ (nem-V cholerae) baktériumtörzsek; a V cholerae TcpA ostorának egyik immunizáló determinánsát és a protein B alegységének egyik immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid és az ezt kódoló nukleinsav előállítása. A találmány tárgyához tartozik olyan baktériumsejt előállítása is, amely teljes proteintartalmának legalább 1%-a TcpA alakjában van jelen. Előnyösen a sejtben hiányzik a kolera toxin mérgezést kiváltó szintje; még előnyösebben a sejt mutált htx gént tartalmazó V. cholerae sejt
Az 1. ábra mutatja a V. cholerae TcpA ostorát kódoló gén DNS- szekvenciáját és a megfelelő aminosavszekvenciát.
A TcpA ostor példa a V. cholerae sejtek szálas felületi komponensére (ostorára). A V. cholerae 0395 egész
HU 205 372 Β sejtjeitől elválasztva a TcpA ostor látszólagos molekulatömegeként SDS poliakrilamid gélelektroforézissel
20,5 kD határozható meg. A TcpA ostor összekapcsolódik a V. cholerae felületén lévő makromolekuláris szálas szerkezetekkel, és sűrűséggradiens-centrifugálással részlegesen megtisztítható. Az ostor jelentős mennyiségben csak a V. cholerae sejtek bizonyos környezeti feltételek között végzett tenyésztésével termelhető, legkedvezőbben alacsony pH-érték esetén, előnyösen 6,5-es vagy annál kisebb pH-tartományban, 7,5-es pHérték felett gyakorlatilag kimutathatatlan. Termelése szempontjából legkedvezőbb továbbá a csekély, 50100 mmól/dm3 nátrium-klorid-oldatával egyenértékű ionerősség. A TcpA ostor termelését befolyásoló egyéb tényezőkhöz tartozik aminosavak, így aszparagin, arginin, szerin, glutaminsav, illetve glutamin [például LBtápközeg (Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Láb. Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972] jelenléte a tápközegben, levegőztetés (a tápközeg 6 dm3-ére számítva percenként 0,5-2 dm3), a tápközeg típusa (előnyösen folyadék) és az inkubálás hőmérséklete (előnyösen 25-30 ’C). Ezenkívül a TcpA ostorok a V. cholerae sejtek növekedésének csak bizonyos szakaszában (állandósult fázisában) termelődnek. Ezek a tenyésztési körülmények általában nem optimálisak a sejtnövekedés szempontjából, inkább a TcpA ostor termeléséhez optimálisak.
A TcpA ostorok tisztítás után szálkötegeket alkotnak, a proteint a Coomassie blue színezék megfesti, és HA-aktivitását a mannóz nem változtatja meg.
Egy készítmény TcpA-tartalmának meghatározására a készítmény egy részét gélben futtatjuk, a TcpA-nak megfelelő proteinfolt lokalizálására TcpA antitestekkel reagáltatjuk, a proteinfoltot kivágjuk a gélből, és meghatározzuk a TcpA mennyiségét. A TcpA %-ban kifejezett tartalmának kiszámítását szokásos módon meghatározott teljes proteintartalom alapján végezzük.
A V. cholerae TcpA ostorát kódoló gént az alábbiakban leírtak szerint klónoztuk; DNS-szekvenciáját az 1. ábra mutatja. A TcpA gén helye rögzített a kromoszómában. Ezt a klónozott DNS-t, a V. cholerae más törzseiből származó hasonló DNS-t vagy az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát kódoló szintetikus DNS-t használva, TcpA ostort más baktériumtörzsekben is termelhetünk a szokásos eljárásokkal. így a „TcpA ostor” kifejezés olyan proteineket foglal magában, amelyek módosított aminosavszekvenciái lényegesen nem befolyásolják a molekula antigén képességét. Hasonlóan, a TcpA-kódoló génen ilyen módosított nukleotidokat vagy a „TcpA-antigén részleteit kódoló géneket értünk. A DNS-t bevihetjük például bármely szokásos vektorba, és transzformálhatjuk baktériumtörzsekbe, amelyek alkalmasak TcpA ostor kifejezésére.
A találmányt a következőkben példákkal illusztráljuk.
l.példa
A TcpA gén klónozása
TnphoA a Tn5 transzpozon származéka, amely megtartja azokat a tulajdonságait, hogy sokféle gazdaszervezettel rendelkezik, és véletlenszerűen képes beépülni, de ezentúl fúziót idézhet elő célgének és PhoA, az Escherichia coli (E. coli) alkalikus foszfatáz génje között [Manoli és munkatársai: Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82, 8129, (1986)]. Az ilyen génfúziók olyan hibrid proteineket kódolnak, amelyek az alkalikus foszfatáz (PhoA) karboxiterminálisán keresztül a céltermék aminoterminálisához kapcsolódnak (fuzionálnak). Ezeknek a hibrid proteineknek nincs PhoA-aktivitása, vagy az nagyon csekély, kivéve, ha a célgén rejtett vagy membránon áthatoló proteint kódol. Ezek az aktív fúziók könnyen azonosíthatók kék kolóniákként, ha kromogén alkalikus foszfatáz-szubsztrátot, 5-bróm-4klór-3-indolil-foszfátot (XP) keverünk az agar tápközegbe, amelyen a TnphoA betoldásokat tartalmazó baktériumsejteket szélesztjük. Mivel lényegében a virulencia-faktorokhoz sorolt összes baktériumprotein a sejtfallal, a sejt felületével kapcsolatos, vagy sejten kívüli, ez az eljárás a betoldásos mutációk erőteljes megnövekedését biztosítja, ami befolyásolhatja a baktériumok kórokozó tulajdonságait, mint a szaporodást vagy a toxintermelést.
A V. cholerae kromoszómájába véletlen TnphoAbetoldást a pRT291 segítségével végeztük, amely a sokféle gázdaszervezetű, P- csoportba tartozó pRK290 plazmid származéka [Mekalanos: Natúré, 276, 633, (1978)], amely a TnphoA másolatát tartalmazza (ez a TnphoA-val végbement spontán transzpozíció útján keletkezett). Röviden, TnphoA-kromoszóma betoldását pRT291-et tartalmazó V. cholerae törzsekben hoztuk létre úgy, hogy pPhlJI (lásd az előző hivatkozást) plazmiddal felülfertőztük, és kanamicin- és gentamicin-rezisztenciára szelektáltuk. A TnphoA-betoldásokat tartalmazó V. cholerae telepeket osztályoztuk a PhoA+ fenotípus szempontjából 0,2% glükóz- és 20 mg/cm3 XP-tartalmú LB-agar tápközegen (Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Láb, Press, Cold Spring Harbor, NY, 1972) 30 ’C hőmérsékleten.
Többezer, TnphoA-betoldást tartalmazó V. cholerae kolóniát vizsgáltunk át PhoA+ fúziós proteineket kódoló mutációk szempontjából. A TnphoA-betoldást tartalmazó kolóniáknak mintegy 1%-a volt ebben a közegben, jelezve azt, hogy rejtett vagy membránproteint kódoló génekhez kapcsolt TnphoA-másolatokat tartalmaznak, amely proteinek ebben a közegben kifejeződnek.
A kék kolóniák közül negyvenet megtisztítottunk, és poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) elemeztük teljes proteinprofiljukat. V. cholerae vad és mutáns törzseit tenyésztettük 6,5 pH-értékű LB-tápközegben, 30 ’C hőmérsékleten, levegőztetés mellett 18 óra időtartamig. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, pufferolt mintaoldatbari redukáló anyaggal roncsoltuk, és nátrium-dodecil-szulfát (NaDodSOí) jelenlétében, 12,5%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézissel elemeztük a Mekalanos és munkatársai által korábban ismertetett módon [Infect. Immun. 16,787 (1977)].
Hét mutánsnak a proteinprofiljában volt kimutatható egy vagy több proteinfolt elvesztésében megnyilvánuló
HU 205 372 Β eltérés. A mutánsok egy, az RT110.21 törzs által képviselt típusa egyetlen, 20,5 kD molekulatömegű proteint veszített.
20,5 kD proteinhiányos mutánst tenyészetképződési hibák szempontjából tanulmányoztunk kompetícióvizsgálattal oly módon, hogy 3-9 napos CD-I egereket a mutáns- és a szülőtörzzsel együtt fertőztünk meg lényegében a Freter és munkatársai által közölt módon [Infect. Immun. 34,234 (1981)]. A 20,5 kD proteinhiányos RT110.21 mutánstörzs észrevehetően csökkent versengési képességet mutatott a szülőtörzzsel szemben in vivő, azonban in vitro nem. Egy másik, függetlenül izolált, 20,5 kD proteinhiányos mutánssal végzett más kompetícióvizsgálatok igazolták, hogy ezek a mutánsok fiatal egerekben, valamint ivarérett nyulakban egyaránt lényegesen csekélyebb mértékben szaporodnak.
Sejtfrakcionálási vizsgálatok azt mutatták, hogy a
20,5 kD molekulatömegű protein a baktériumsejt felületén elhelyezkedő makromolekuláris szerkezetekkel függ össze. Egy, a 0395N1 törzsből származó nem csillós (mot-39) mutánst [Mekalanos: Natúré, 306, 551 (1983)] használtunk ezeknek a szerkezeteknek az ostortalanított sejtekből történő részleges megtisztítására többször megismételt differenciális ülepítés útján. A törzset 6,5 pH-értékűLB-tápközegben tenyésztettük. A 2 dm3 térfogatú lombikokban 400 cm3 tápközeget használtunk, és a kultúrát 30 °C hőmérsékleten 150 fordnlat/perc fordulatszámmal végzett forgatással 16 óra időtartamig tenyésztettük. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és 12,5 mmól/cm3 trisz-HCI (pH=7,0), 25 mmól/dm3 NaCl, 4 mmól/dm3 MgCl2 és 4 mmól/dm3 CaCl2-tartalmú pufferoldatban újraszuszpendáltuk. A baktériumsejteket egy 21-es kaliberű fúvókán történő áthaladás útján ostortalanítottuk, az ostorokat többször megismételt differenciális centrifugálással tisztítottuk, a sejtek és oldható proteinek eltávolítása céljából. Az ostortalanított sejtek eltávolítására végzett centrifugálás szokásos körülményei 20 perc időtartam és 3·1Ο3 g voltak. A felülúszót összegyűjtöttük, és az összegyűlt üledéket eldobtuk. A felülúszó folyadékot ezután 40 percig centrifugáltuk 1,5· 104 g-vel. Ennél a műveletnél a felülúsző folyadékot dobtuk el, és az üledéket gyűjtöttük össze, és újraszuszpendáltattuk (trikrezil-foszfát) pufferoldatban. A differenciális centrifugálásnak ezt a két lépését kétszer újra megismételtük. A művelet végén összegyűjtött üledék az eljárás tisztított TcpA terméke (azaz a TcpA protein több, mint az összes sejtprotein 50%-a). Az ostorok izolálását a
20,5 kD molekulatömegű ostoralegység tisztítását követve PAGE vizsgálattal követtük nyomon. A tisztított ostorokat elektronmikroszkóppal figyeltük meg, miután 2%-os ammónium-molibdát-oldattal végzett festéssel a készítményeket előkészítettük a vizsgálathoz. Ezeknek a készítményeknek az elektromikroszkópos vizsgálata hosszú, párhuzamosan összekapcsolódó (7 nm átmérőjű) szálakat vagy ostorokat mutatott. Egyedi ostorfönalak láthatók voltak a 0395 törzs sejtjeinek felületén, a 20,5 kD-os proteinjét elvesztett, TnphoA által indukált mutánsok sejtjein azonban nem.
A 20,5 kD molekulatömegű proteint tovább tisztítottuk a PAGE módszer elve alapján végzett elektroelúcióval, és N-terminális aminosavszekvencia elemzésnek vetettük alá. A szekvenciaadatok megegyeznek az 1. ábrán feltűntetett adatokkal. Ez a szekvencia erősen hidrofób, és képviselheti egy kiválasztó jelszekvencia részét vagy egészét Ezzel a következtetéssel összhangban az RT110.21 törzsből származó TnphoA-fúzió szubklónozása és a DNS-szekvenciavizsgálat azt mutatta, hogy a PhoA-gén az ostort kódoló szekvenciájához kapcsolódott az aminosavak ezen hidrofób szakaszát kódoló szekvenciájától 92 kodonnal a molekula 3’ vége irányában. Két másik, 20,5 kD proteinhiányos mutáns is tartalmaz TnphoA-betoldásokat, amelyekben előforduló ugyanazon nyitott leolvasási keretnek megfelelően kapcsolódott PhoA, igazolva azt, hogy valóban ez a szekvencia képviseli a V. cholerae ostor struktúrgénjét
A TcpA szál génje számára két lépésben kiónoztuk a gént. Először az RT110.21 mutánstörzsben lévőTcpATnphoA génfúziót klónoztuk egy plazmidra az E. coliban lévő kanamicin-rezisztens fenotípusának kiválasztásával. Az ezzel a TnphoA-fúziőval szomszédos DNSszekvenciából származó génmintát használtuk a 0395 törzs vad típusú génjét tartalmazó kozmid klón azonosítására (lásd az előző hivatkozást). Ez a pCS 12G7-nek nevezett plazmid. a következő kísérletek bizonysága szerint aktív TcpA gént hordoz:
a) Ha a pCS12G6 plazmidot bevisszük a TcpA mutáns
RT110.21 törzsbe, az kijavítja ostorhibáját, és a plazmidot tartalmazó törzs újra termeli a TcpA ostort.
b) Az egész TcpA gén DNS-szekvenciájának meghatározása igazolja annak a helyzetét a pCS12G7 plazmidon. Ez a szekvencia látható az 1. ábrán.
c) A V. cholerae 0359-N1 vagy 569B-N1 törzsbe beépülve a pCS12G7 plazmid fokozott ostorképződéssel jellemzett fenotípust idéz elő, amennyiben ezek a törzsek 2-3-szor több TcpA ostort termelnek, mint egyébként szokásos a kifejező tápközegben. Az 596B-N1 a V. cholerae Inába szerotípusú törzse, amelynek ctxA génje hiányos, azonban ctxB+ típusú. A törzset a 395-NT törzs ctxAB KMr mutációjának az 569B törzs spontán módon nagy mozgékonyságú származékába történő transzdukációjával hoztuk létre (az 569B törzs általában nem mozgékony). A transzduktánst (az 569B-NT törzset) aztán a pJM290.2 plazmiddal lejátszódó rekombinációjával 569B-N1 törzzsé alakítottuk (lásd az előző hivatkozást).
d) Az E. coli vagy Salmonella typhimuruim LB5000 baktériumokba beépülve a pCS12G7 plazmid olyan proteinalegységet termel, amely méretét és immunológiai tulajdonságait tekintve a Western biot analízis alapján azonos a TcpA proteinnel.
A kolera toxinB alegysége A kolera toxinban a B és A alegység 5:1 arányban van jelen. A B alegyéségnek nincs ismert toxikus aktivitása, és hasznos kolera elleni oltóanyagok kompo4
HU 205 372 Β nenseként. Ismertek V. cholerae törzsek, amelyekben mutációk inaktiválják az A alegységet. Az A és B alegységek tartalma jelentősen növelhető, ha a V. cholerae sejteket olyan tápközegben tenyésztjük, amely a fentiek szerint alkalmas a TpcA ostor termelése szempontjából. Inaktív A alegységet tartalmazó mutánsokat, például ctxA-hiányos törzseket használva (lásd az előző hivatkozást) lehetséges egyidejűleg nagy mennyiségű B alegységet és TcpA ostort termelő sejtek tenyésztése.
A B alegység és a TcpA ostor fokozott termelésének indítéka az, hogy ezeket a proteineket kódoló géneket ugyanazok a - toxR - gének szabályozzák, amelyeknek a szabályozását vagy aktivitását viszont a növekedés feltételei befolyásolják.
Továbbá egy TcpA-specifikus hibridizációs mintát (csak olyan nukleotidokat tartalmazó DNS-szakaszt, amelyek ismereteink szerint a TcpA protein aminosavait kódolják) használva kimutattuk, hogy a TcpA gén a V. cholerae összes olyan törzsében jelen van, amelyeket kolerabetegekből izoláltak. Ezzel szemben a V. cholerae számos, környezetből származó (például vizekből izolált) törzse nem tartalmazza a TcpA gént. Ezek a megfigyelések alátámasztják azt az állítást, hogy az emberek hasmenéses megbetegedésével kapcsolatos összes V. cholerae törzs szaporodási faktorát a TcpA kódolja. Ezenkívül a V. cholerae környezetből származó, a TcpA gént nem tartalmazó törzsei ismereteink szerint csekély mértékben szaporodnak el önként vállalkozó emberek szervezetében, és ha egyáltalán kialakul bennük immunitás, annak mértéke csekély (Levine és munkatársai: Acute Enteric Infections in Children, 26. fejezet, Elsevier, 1981.). Ennek az a magyarázata, hogy azok a törzsek nem termelnek TcpA ostort, és ezért nem tudnak emberekben elszaporodni, vagy nem tudják kiváltani a TcpA ostorral reagáló, védelmet nyújtó antitestek termelését.
Kolera-oltóanyag
Az a lehetőség, hogy mind TcpA ostort, mind nagy mennyiségű B alegységet termelhetünk, módot nyújt különféle kolera elleni oltóanyag készítésére.
a) Elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyag
Ehhez az oltóanyaghoz V. cholerae sejteket tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a TcpA ostor és/vagy a kolera toxin B alegységének kifejezését nagyobb mennyiségben. A 0395-N1, 569B-N1 törzsek és származékaik számára létesítettünk ilyen körülményeket (lásd a 2. példát), kimutattuk azonban, hogy ilyen körülmények elvileg a V. cholerae bármely törzse számára létrehozhatók, feltéve, hogy a TcpA és a kolera toxin B alegysége termelését használjuk a tenyésztési paraméterek optimalizálására. Hasonlóképpen, izolálhatók olyan mutáns V. cholerae törzsek, amelyek az itt bemutatottaktól eltérő tenyésztési körülmények között termelnek TpcA ostort és B alegységet (lásd a 2. példában az 569B htx-5 törzset). A találmány alapvető felismerése az, hogy bizonyos tenyésztési körülmények között a V. cholerae olyan sejteket hoz létre, amelyek nagy (az összes sejtprotein 1%át meghaladó) mennyiségben fejezik ki felületükön a TcpA ostorokat, és így alkalmasak kolera elleni oltóanyagként. Megfelelő törzsek alkalmas viszonyok között végzett tenyésztése után a sejteket szokásos eljárásokkal (például glutáraldehiddel vagy formaldehiddel végzett kezeléssel) elpusztítjuk. Ezeket a kezeléseket úgy kell végezni, hogy a TcpA ostor és a B alegység antigén tulajdonságait megőrizzük.
Ezt az oltóanyagot kiegészíthetjük tisztított B alegységgel, amelyet szokásos eljárással termelünk, vágy úgy, hogy a sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek fokozzák a B alegység termelését, majd a proteint szokásos eljárással tisztítjuk.
2. példa
Kolera toxin B alegység; valamint TcpA ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtek termelése elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyaghoz vagy tisztított TcpA ostorok előállítására
A V. cholerae legalább három különböző törzse használható ostorokat tartalmazó sejtek és a kolera toxin B alegységének termelésére. A 0395-N1 és fokozott ostortermelésű származéka, a 0395-N1 (pCS12G7) törzsek Ogawa szerotípusúak, amíg az 569B-N1 és fokozott ostortermelésű, fokozottan toxinképző származéka, az 569-N1 htx-5 törzsek Inaba szerotípusúak. Az 569B-N1 htx-5 törzs az 569B-N1 törzs htx mutációt tartalmazó származéka, amelyet szokásos eljárásokkal izoláltak [Mekalanos: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 941, (1975)]. Megállapítottuk, hogy a fokozott kolera toxin termelésen túl a htx mutáció a TcpA ostorok fokozott termelését is előidézi mind az alább részletezett tenyésztési körülmények között, mind más tenyésztési feltételek között, amelyek általában nem megengedhetők a TcpA termelés szempontjából (nagy pH-érték, mint például 7,5). Elpusztított egész sejtet tartalmazó kolera elleni oltóanyagnak előnyösen tartalmaznia kell mind Ogawa, mind Inaba szerotípusú sejteket, és ezért rendszerint külön tenyészetet készítenek egy Ogawa és egy Inaba törzsből. A fokozott ostortermelésű származékok a szülőtörzsekhez képest 2-3szor több TcpA ostort termelnek, mivel vagy a 0395 törzs TcpA génjét tartalmazó nagy kópiaszámú pCS12G7 plazmidját (0395-N1 pCS12G6), vagy a htx mutációt (569B-N1 htx-5) hordozzák. Az összes törzset az alább leírt módon tenyésztjük azzal a különbséggel, hogy a 0395-N1 (pCS12G7) törzs esetén a tápközeghez ampicillint adagolunk 50 gg/cm3 végső koncentrációban.
A kiválasztott V. cholerae törzs kiinduló tenyészetét mintacsövekben készítjük el, amelyek 2 cm3 LB-6,5 tápközegét (10 g tripton, 5 g élesztőextraktum, 5 g nátrium-klorid, a pH értéke autoklávozás előtt 6,5-re beállítva) tartalmaznak, és 30 °C hőmérsékleten tartott, 30 fordulat/perc fordulatszámú forgóinkubátorban tartjuk 18 óra időtartamig. A kiinduló tenyészetben a kiindulási sejtsűrűség alacsony (friss agarlemez tenyészetről beoltva mintegy 101 sejt/cm3), és tenyésztés után a baktériumsejtek önagglutinációja szembetűnő a szabad
HU 205 372 Β szemmel is könnyen látható anyagcsomósodás formájában. Az összecsomósodott baktériumsejteket hagyjuk kiülepedni a függőleges helyzetben álló csőben, majd pipettával összegyűjtjük a cső aljáról. Az összecsomósodott sejteket használjuk egy megfelelően tervezett fermentációs edényben lévő 6 dm3 LB-6,5 tápközeg beoltására, a fermentációs edény a tápközegen keresztül áramoltatott levegőt kis buborékok alakjában oszlatja szét. A tenyészetet közepes (0,5-1 dm3/perc) levegőztetéssel 25 °C hőmérsékleten 24 óra időtartamig inkubáljuk, amely időtartam alatt a tenyészet állandósult állapotba juh és majdnem teljesen eléri az önagglutináció állapotát. A felületükön TcpA ostorokat tartalmazó, összecsomósodott sejteket centrifugálással öszszegyűjtjük, és 600 cm3,0,85%-os, 10 mmól/dm3 nátrium-foszfáttal pH=7,0-ra pufferolt nátrium-klorid-oldatban újraszuszpendáltatjuk.
Ezeket az ostorokat növesztett V. cholerae sejteket használjuk a tisztított TcpA ostorok vagy az elpusztított egész sejtek előállítására, míg a tenyészet sejtmentes, felülúszó folyadékából szokásos eljárásokkal megtisztítjuk a kolera toxin B alegységét [Mekalanos és munkatársai: Infection and Immunity 16, 789 (1977) és 20, 552(1978)].
Magától értetődik, hogy ezek az eljárások, amelyekkel az ostorokat növesztett sejteket elpusztítjuk és konzerváljuk az egész sejtet tartalmazó oltóanyaghoz történő felhasználáshoz, nem károsíthatják a TcpA ostorok immunizáló képességét. Ebben a vonatkozásban az ostorokat növesztett sejtek 24-48 óra időtartamú kezelése glutáraldehid vagy formaldehid 1%-os oldatával hatékonyan elpusztítja az organizmusokat, viszont a TcpA ostorok immunizáló képessége megőrződik. Ezen elpusztított egész sejteket tartalmazó oltóanyag szájon keresztül alkalmazott vagy a gyomor-bél rendszert megkerülő készítményének egy dózisa előnyösen legalább 1010 elpusztított, Ogawa szerotípusú, ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtet [0395-N1 vagy 0395N1 (pCS12G7)] és legalább 1010 elpusztított, Inaba szerotípusú, ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtet (569B-N1 vagy 569B-N1 htx-5) tartalmaz.
Egy ilyen oltóanyaggal biztosítható védelem hatásosságát tovább fokozhatjuk 200-500 pg kolera toxin B alegység adagolásával, amelyet ugyanazon kultúrából készítünk, mint amelyet az ostorokat tartalmazó V. cholerae sejtekhez használunk. Tekintetbe kell venni, hogy a toxin A alegysége mind a négy termelőtörzsből hiányzik, és hogy a fenti tenyésztési körülmények mind a TcpA, mind a B alegység kifejezése szempontjából optimálisak - ezek a termelőtörzsek és a tenyésztési viszonyok előnyös típusai.
Egy másik eljárás szerint a fenti, ostorokat tartalmazó sejteket ostormentesíthetjük, és a TcpA ostorokat differenciális ülepítéssel vagy más módszerekkel tisztíthatjuk, és önmagában vagy tisztított kolera B alegységgel együtt oltóanyagként használhatjuk.
b) TcpA szálakat tartalmazó oltóanyag
Ez az oltóanyag a TcpA ostornak legalább egy immunizáló szakaszát (például olyan szakaszát, amelyben legalább egy TcpA ostor determináns és előnyösen legalább két vagy három ilyen determináns van) tartalmazza. Az ostorokat készíthetjük szintetikusan vagy megfelelő körülmények között tenyésztett egész sejtekből szokásos tisztítási eljárásokkal, vagy DNS rekombinációs eljárással. Például előállíthatunk szokásos eljárásokkal olyan szintetikus pohpeptidet, amely megfelel a TcpA ostor aminosavszekvenciája egy szakaszának, vagy kifejezhetünk expresszióra alkalmas rendszerben ilyen szakaszt kódoló nukleinsavszekvenciát, és a kapott polipeptidet megtisztítjuk. Ilyen szakaszok azonosítására használhatunk szokásos eljárásokat, például kialakíthatjuk a TcpA gén részleges törléseit, a fentiek szerint kifejezhetjük, és tanulmányozhatjuk ennek a részleges TcpA terméknek a hatásosságát. Azok a szakaszok, amelyeknek az immunizáló képessége hasonló a szülőtörzs TcpA ostoráéhoz, használhatók ilyen oltóanyagokban. Hasonlóképpen alkalmasak a találmány szerinti oltóanyagok szempontjából azok a polipeptidek, amelyek keresztreakcióra hajlamosak a TcpA ostorral. (Keresztreakciőra hajlamos polipeptiden olyan polipeptidet értünk, amely a TcpA ostorral szemben termelt antitestekkel immunreakcióban kicsapódnak [J. Mól. Immunoi. 19,1541-1549 (1982) és J. Moh Immunoi. 21, Ί85-Ί93 (1984)].
Ezt az oltóanyagot kiegészíthetjük V. cholerae elpusztított egész sejtjeivel vagy B alegységgel, vagy magát is használhatjuk meglévő oltóanyagok kiegészítésére.
A szintetikus peptidek is olcsó lehetőséget biztosítanak vakcinákban alkalmazható tiszta immunizáló anyagok termeléséhez. A TcpA ostorok (DNS-szekvenciájából levezetett) származtatott aminosavszekvenciája nyújtja az alapvető információt, ami szükséges olyan szintetizált peptid megtervezéséhez, amely a TcpA ostorral reagáló, és annak funkcióját (a sejtekhez kötődést) meggátló antitestek termelését kiváltó immunizáló anyagként szolgálhat. Ilyen immunizáló peptideket azonosíthatunk fokozatos megközelítés útján, amelynek során nem vagy részlegesen átlapolődó peptideket szintetizálunk, és aztán mindegyikhez antitesteket képzűnk. Azokat a peptideket azután azonosítjuk, amelyek vagy a TcpA ostorokkal reagáló vagy a TcpA szálak gazdasejtekhez való kapcsolódását megakadályozó antitesteket indukálnak, vagy az állatokat virulens V. cholerae sejtekkel szemben ténylegesen megvédik. Ezek a peptidek tartalmazzák a TcpA ostorok védelmét nyújtó epitopjait, és ezért kolera elleni oltóanyagként használhatók, előnyösen kémiailag, keresztkötéssel alkalmas immunizáló hordozóproteinhez kapcsolt állapotban. A hordozőprotein „T-sejt segédfunkciók” biztosításával fokozza a peptid immunizáló képességét. Peptidhordozóként számos különbözőproteint használtak, a legjobbak egyikének bizonyult a kolera B alegység vagy az E. coli hőérzékeny enterotoxinjának B alegysége [Infection and Immunity, 44, 268-273 (1984)].
3. példa
TcpA ostorral rokon, kiméra protein-oltóanyag
Ahogyan kémiailag, keresztkötéssel TcpA-val rokon
HU 205 372 Β peptid/hordozóprotein konjugátum immunizáló anyagként használható, ugyanúgy szolgálhatnak genetikailag származtatott fúziós proteinek is immunizáló anyagként kolera elleni oltóanyagokban. Ezeket a génfúziókat a TcpA ostor struktúrgénjeiből vagy a TcpA proteinnel rokon peptidszekvenciát kódoló szintetikus DNSoligonukleotidból és hordozóprotein génjéből állítjuk elő. Előidéztünk ilyen génfúziót a TcpA gén és az E. coli alkalikus foszfatáz (PhoA) génje között, és a fentiek szerint kimutattuk a fúziós protein termelését mind V. cholerae, mind E. coli sejtekben. Ezek a fúziós proteinek reagálnak a TcpA ostorok ellen termelt antitestekkel, és ezért valószínűleg stimulálnák a TcpA ostorral szembeni antitesteket, ha immunizáló anyagként fúziós proteint használnánk. Ezt a genetikai megközelítést használhatjuk más, TcpA-rokon DNS-szekvenciák és hordozóproteinek (LT-B alegység, kolera toxin B alegység, diftéria toxin és tetanusz toxin) génjei között létrejövő fúziós proteinek előállítására is [FEBS Letters, 208, 194-198 (1986)]:
c) Idegen eredetű, élő oltóanyag
Salmonella vagy E. coli élő sejtjeit és apatogén tehénhimlővírusokat transzformálunk vagy rekombináns DNS- technikával egyéb módon módosítunk a TcpA ostor proteinjének és előnyösen a kolera toxin B alegységének együttes kódolására. Ezeket a sejteket vagy részecskéket használhatjuk kolera elleni oltásra, ha serkenteni tudják az antitestek termelését TcpA ostorok és előnyösen B alegység ellen is. Ezeknek az organizmusoknak csak a két protein valamelyikének immunolőgiailag aktív szakaszát kell kódolniuk, és az oltóanyag a fenti vagy a korábban tárgyalt oltóanyagokkal együtt alkalmazható.
4. példa
Elő, heterológ hordozó-oltóanyag, amely kifejezi a
TcpA ostor alegységét
Számos organizmus, közöttük a Salmonella typhi Ty21A [J. Infect. Dis. 131, 553 (1975), Inf. and Immunity, 46, 564-569 (1984)], más Salmonella fajok [Natúré, 291, 238-239 (1981), E. coli-Shigella hibridek [Inf. and Immunity, 46, 465-469 (1984)] és tehénhimlővírus [Natúré 311, 67 (1984); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7155 (1983)], potenciálisan élő hordozó-oltóanyagok, amelyek nemcsak homológ betegségek (tífuszos láz, sigellozis, himlő) ellen immunizálnak, hanem más betegségek ellen is, amelyek elleni, megfelelő védelmet nyújtó immunizáló anyagokat kifejező géneket tartalmaz az élő hordozótörzs. A pCS12G7 vagy azzal rokon plazmidokat (mint a pCS12G10 plazmidot) tartalmazó E. coli és S. typhimurium törzsek olyan proteint termelnek, amelyek immunolőgiailag azonosak a TcpA ostorokkal. így ez a plazmid vagy származékai biztosítják az élő hordozó-oltóanyag törzsek számára a TcpA-rokon immunizáló anyagok kifejezéséhez szükséges genetikai információt.
Ennek az oltóanyagnak a készítéséhez alkalmazandó eljárás függ az élő hordozó-oltóanyag törzsként használt organizmustól. Baktériumhordozók esetén szokásos eljárásokkal, transzformáció vagy konjugáció útján visszük be a TcpA ostorokat kifejező plazmidokat. Ezeket a plazmidokat a TcpA ostorgének stabilabb genetikai öröklődésének érdekében bevihetjük a hordozó törzs kromoszómájába. Vírushordozók esetén a TcpA génszekvenciát géntechnológiai úton a rekombináns vírussal megfertőzött (állati vagy emberi) gazdasejtekben fejezhetjük ki.
A TcpA ostorokat kifejező élő, heterológ hordozóoltóanyag hatásossága megnő, ha az a kolera toxin B alegységét is kifejezi. Ezért előnyös a ctxB, valamint a TcpA gén együttes bevitele a hordozó organizmus ugyanazon törzsébe.
Miután létrehoztuk az élő, heterológ oltóanyagtörzset, szokásos eljárásokkal oltóanyag-készítménnyé alakítjuk, és szájon keresztül vagy a gyomor-bél rendszert megkerülő úton adjuk be olyan dózisban, amely elég nagy az organizmusok szaporodásához, de nem okoz szemmel látható kórtüneteket a beoltott gazdaszervezetben (például dózisonként ΙΟ6-1010 sejt- vagy vírusrészecske).
A találmány szerinti oltóanyagok kolera- és azzal rokon fertőzések meggátlására irányuló alkalmazása magában foglalja azoknak emberi vagy állati szervezetbe juttatását. Az oltóanyagokat szokásos módon adhatjuk be, előnyösen szájon keresztül, de védőoltással is beadható. A dózisok 109-10J0 élő vagy 1010 elpusztított baktériumot, és az állat 1 kg testtömegére vonatkoztatva 10-1000 mg TcpA ostort vagy B alegységet tartalmaznak.
A) példa
Vemhes egereket immunizáltunk TcpA ostorokat (TCP) tartalmazó vakcinával, amelyet a leírás 11. oldalán ismertetett módon készítettünk. Az utódokat V. cholerae három törzsével teszteltük. Az utódok 24 vagy 44 órás %os túlélési adatai alapján megállapíthatjuk, hogy a TcpA ostor olyan immunválaszt eredményezett, amely az anyaállat utódait mindhárom (Ogawa 395, Ogawa E7946 és nem-Ogawa szerotípusú CA401) törzzsel szemben megvédte. A %-os túlélési arányt sóoldatinjekcióval kezelt anyaállatok utódaihoz viszonyítva határoztuk meg. A vizsgálati eredményeket az 1. táblázat mutatja.
1. táblázat
TCP-vakcinával kezelt vemhes egerek utódainak védelme virulens koleratörzsekkel szemben
Anyaállat | Tesztelő törzs | Túlélők/összes állat |
ellenőrző | 0395 | 1/6 |
immunizált | 0395 | 8/9 |
ellenőrző | CA401 | 0/6 |
immunizált | CA401 | 10/11 |
ellenőrző | E7946 | 1/6 |
immunizált | E7946 | 7/10 |
Az anyaállatokat TCP-vel immunizáltuk (100 pg, teljes Freund típusú hatásfokozó szerben) a vemhesség
I
HU 205 372 Β kezdetén és egyszer a vemhesség félidejében (20 gg, nem teljes Freund típusú hatásfokozó szerben). A virulens V. cholerae törzsekkel végzett tesztelést 24 óra (0395) vagy 44 óra (CA401 és E7946) időtartamig kísértük figyelemmel.
B) példa
Különböző nyűlszérumokat adtunk be szoptató egereknek annak megállapítására, hogyan képesek a szérumok megvédeni az egereket Ogawa 0395 típusú V. cholerae törzssel szemben. Az alkalmazott vakcinák az alábbiak voltak:
a) ellenőrző (a nyulaknak nem adtunk be Top A-t),
b) a nyulaknak TcpA-t adtunk be,
c) a nyulaknak TcpA-t adtunk be, és a nyulak szérumát
Ogawa 0395 organizmusokkal abszorbeáltuk az antitestek anti-TcpA antitesteket tartalmazó szervezetekbe történő eltávolítására,
d) a nyulaknak TcpA-t adtunk be, és olyan Ogawa
0395 mutánsszervezettel abszorbeáltuk (RT110.21), amely a TcpA ostorokat nem fejezi ki.
Az ellenőrző [,,a)”] és az Ogawa 0395 által abszorbeált [„c)”J szérumok nem nyújtottak védelmet A módosítatlan [,,b)”J vagy a nem-TcpA mutánsokkal abszorbeált [,,d)”j TcpA-generált szérumok védelmet adtak. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat
Egérszaporulat védelme Vibrio cholerae tesztelő törzzsel szemben TCP elleni antitestek útján Az eredmények egyedi kísérletekből származnak, amelyek összesített adatait a vastagon szedett számok mutatják.
Tesztelő törzs Antiszérum Túlélő/összes állat 20-24 36 óra után
0395 | normálszérum | 0/3 | 0/3 |
1/4 | 0/4 | ||
2/3 | 0/3 | ||
1/4 | 0/6 | ||
4/14 | 0/14 | ||
0395 | Anti-TCP | 1/3 | 3/3 |
4/4 | 4/4 | ||
3/3 | 3/3 | ||
4/4 | 4/4 | ||
14/14 | 14/14 | ||
0395 | Anti-TCP/0395 | 1/4 | 1/4 |
organizmusokkal | 1/4 | 0/4 | |
abszorbeálva | 2/8 | 1/8 | |
0395 | Anti-TCP/RTl 10.21 | 3/4 | 3/4 |
organizmusokkal | 3/3 | 3/3 | |
abszorbeálva | 4/4 | 4/4 | |
10/11 | 10/11 |
1987. április 29-én a következő organizmusokat helyeztük letétbe az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél, amelyben azok a kővetkező deponálási számot kapták:
Letétbehelyezve Deponálási szám
V cholerae 0395-N1 (pCS12G7) 67 396
V. cholerae 569B-N1 htx-5 53 613
S. typhimurium LB5000 (pCS12G10) 67 397
Claims (26)
1. Eljárás egy, a Vibrio cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó, az 1. ábra szerinti aminosavszekvencíájú polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) V. cholerae sejtkultúrából a TcpA ostorokat elválasztjuk, és adott esetben a TcpA ostorok egy polipeptidjét vagy annak egy immunizáló fragmentumát megtisztítjuk, vagy
b) a Y cholerae TcpA ostorát vagy annak egy immunizáló fragmentumát kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy
c) a V. cholerae TcpA szálat vagy annak egy immunizáló fragmentumát alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8—199 szomszédos aminosavát tartalmazó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) valamely, az adott polipeptidet természetes úton termelő sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük, és adott esetben tisztítjuk, vagy
b) az adott polipeptidet kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy
c) az alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk..
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidje előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet az 569B-N1 htx-5 vagy a 0395-N1 (pCS12G7) V. cholerae törzs vagy a S. typhimurium (pCS12G10) törzs sejtkultúrájábólnyeijükki.
4. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) valamely, az adott polipeptidet természetes úton termelő sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük és tisztítjuk, vagy
b) valamely, az adott polipeptidet kódoló nukleinsavat kifejezzük, és a kifejezett polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy
c) a polipeptidet alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk.
5. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciájú polipeptidet vagy annak egy immunizáló fragmentumátkódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) egy V. cholerae sejt kromoszómájából a TcpA gént kinyerjük, és a kapott gént vagy annak egy immuni1
HU 205 372 Β záló fragmentumát kódoló oligonukleotidot tisztítjuk, vagy
b) a TpcA gént vagy annak egy immunizáló fragmentumát kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) egy V. cholerae sejt kromoszómájából a TcpA gént kinyerjük, és a génnek tisztítjuk azt a fragmentumát, amely kódolja az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát, vagy
b) valamely, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidjét kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot az 569B-N1 htx-5 vagy a 0395-N1 V. cholerae törzs egy sejtjének kromoszómájából nyerjük ki.
8. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) a keresztreakciót adó polipeptidet kódoló nukleinsavat kinyerjük, és adott esetben tisztítjuk, vagy
b) a keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotidot in vitro szintetizáljuk.
9. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor génjének immunizáló determinánsát kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot kifejeződőképesen beépítjük egy rekombínáns vektorba.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás egy, az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciának 8-199 szomszédos aminosavát kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 6. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot épütjük be.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostor egy polipeptidjét kódoló oligonukleotidot tartalmazó pCS12G7 vagy pCS12G10 plazmidvektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot betoldunk egy rekombínáns vektorba.
12. Eljárás egy, a V. cholerae TcpA ostorával keresztreakciót adó polipeptidet kódoló oligonukleotidot tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotidot kifejeződóképesen beépítünk egy rekombínáns vektorba. (
13. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát kódoló oligonukleotidot tartalmazó gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet valamely, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy V. cholerae sejtet valamely, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 396 deponálási számú törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy V. cholerae 0395-N1 sejtet pCS12G7 plazmiddal transzformálunk.
16. A 13. igénypont szerinti eljárás az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 397 deponálási számú törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy S. typhimurium LB5000 sejtet pCS12G10 plazmiddal transzformálunk.
17. Eljárás V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, a V. cholerae TcpA ostor immunizáló determinánsát tartalmazó polipeptidet gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.
18. Eljárás egész sejtet tartalmazó V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy V. cholerae sejtkultúrát tenyésztünk legfeljebb 6,5 pH-jú tápközegben, a sejteket kívánt esetben elpusztítjuk, és gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.
19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állandósult növekedési fázisban lévő V. cholerae sejtkultúrát alkalmazunk, tápközegként az aszparagin, arginin, szerin, glutaminsav aminosavak legalább egyikét vagy glutamint tartalmazó, 50100 mmól/dm3 koncentrációjú NaCl-oldattal egyenértékű ionerősségű és legfeljebb 6,5 pH-jú, 22-30 °C hőmérsékletű, oxigénnel érintkező oldatot használunk.
20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC töizsgyűjteményben letétbe helyezett 53 613 vagy 67 396 deponálási számú V. cholerae törzsek közül legalább az egyik törzs sejtkultúráját tenyésztjük.
21. Eljárás nem-V. cholerae baktériumtörzset tartalmazó V. cholerae vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy nem-V. cholerae baktériümsejtet egy, az 5, igénypont szerinti eljárással előállított oligonukleotiddal vagy egy, a 9. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk, a sejteket tenyésztjük, összegyűjtjük és kívánt esetben elpusztítjuk, majd gyógyászatilag alkalmas hordozóban vakcinává alakítjuk.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATCC törzsgyűjteményben letétbe helyezett 67 397 deponálási számú S. typhimurium (pCS12G10) sejtkultúrát alkalmazunk.
23. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptidet kódoló nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) az 5. igénypont szerinti eljárással előállítunk egy első oligonukleotidot, amely a TcpA ostor immunizáló determinánsát kódolja,
b) V. cholerae sejt kromoszómájából a ctxB gént kinyerve egy második oligonukleotidot állítunk elő, amely a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát kódolja, majd az immunizáló deter9
HU 205 372 Β minánst kódoló oligonukleotidot kinyerjük vagy szintetikusan, in vitro állítjuk elő, és
c) az első és második oligonukleotidot kovalens kötéssel összekapcsolva előállítunk egy hibrid polipeptidet kódoló oligonukleotidot.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első oligonukleotidot pCS12G7 vagy pCS12G10 plazmidban állítjuk elő.
25. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy 10 immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) az 1. igénypont szerinti eljárással előállítunk egy első polipeptidet, amely a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát tartalmazza,
b) előállítunk egy második, a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát kódoló polipeptidet oly módon, hogy
i) V cholerae sejtkultúrából a polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk, vagy ii) kifejezzük a V. cholerae ctxB gént egy sejtben, és a polipeptidet kinyerjük és adott esetben tisztítjuk,
5 vagy iii) a B alegység polipeptidjét alkotó aminosavakat szintetikusan, in vitro peptidszintézissel összekapcsoljuk, és
c) az első és második polipeptidet kovalens kötéssel összekapcsolva hibrid polipeptidet állítunk elő.
26. Eljárás a V. cholerae TcpA ostor egy immunizáló determinánsát és a kolera toxin B alegységének egy immunizáló determinánsát tartalmazó hibrid polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely hibrid po15 Iipeptidet egy, a 23. igénypont szerinti eljárással előállított hibrid nukleinsavból kifejezzük, és adott esetben tisztítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4390787A | 1987-04-29 | 1987-04-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT53915A HUT53915A (en) | 1990-12-28 |
HU205372B true HU205372B (en) | 1992-04-28 |
Family
ID=21929523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU883510A HU205372B (en) | 1987-04-29 | 1988-04-29 | Process for producing vaccines against cholera |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0358692B1 (hu) |
JP (1) | JP2777894B2 (hu) |
AT (1) | ATE166880T1 (hu) |
AU (1) | AU629793B2 (hu) |
DE (1) | DE3856199T2 (hu) |
FI (1) | FI895108A0 (hu) |
HU (1) | HU205372B (hu) |
WO (1) | WO1988008431A1 (hu) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU616662B2 (en) * | 1987-04-27 | 1991-11-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Peptide production by protein engineering |
SE462285B (sv) * | 1988-09-16 | 1990-05-28 | Jan Roland Holmgren | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer |
KR102107332B1 (ko) * | 2019-03-20 | 2020-05-07 | (주)제이비바이오텍 | CRISPR/Cas9 기반 Bacillus subtillis 유전체 편집 메커니즘을 이용한 콜레라 백신 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60243025A (ja) * | 1984-05-17 | 1985-12-03 | Eiken Kagaku Kk | コレラトキシンサブユニツトbの製造法 |
-
1988
- 1988-04-29 AT AT88904351T patent/ATE166880T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 HU HU883510A patent/HU205372B/hu unknown
- 1988-04-29 DE DE3856199T patent/DE3856199T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 JP JP63504162A patent/JP2777894B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 WO PCT/US1988/001409 patent/WO1988008431A1/en active IP Right Grant
- 1988-04-29 EP EP88904351A patent/EP0358692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 AU AU17257/88A patent/AU629793B2/en not_active Expired
-
1989
- 1989-10-27 FI FI895108A patent/FI895108A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUT53915A (en) | 1990-12-28 |
AU1725788A (en) | 1988-12-02 |
AU629793B2 (en) | 1992-10-15 |
DE3856199T2 (de) | 1999-02-04 |
DE3856199D1 (de) | 1998-07-09 |
JP2777894B2 (ja) | 1998-07-23 |
FI895108A0 (fi) | 1989-10-27 |
EP0358692A1 (en) | 1990-03-21 |
JPH02503914A (ja) | 1990-11-15 |
ATE166880T1 (de) | 1998-06-15 |
EP0358692B1 (en) | 1998-06-03 |
WO1988008431A1 (en) | 1988-11-03 |
EP0358692A4 (en) | 1990-07-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU767143B2 (en) | Lactobacilli harboring aggregation and mucin binding genes as vaccine delivery vehicles | |
JP2974028B2 (ja) | アドヒシン抗原類 | |
US4888170A (en) | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes | |
JP3253327B2 (ja) | 髄膜炎菌外層膜蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびワクチン組成物 | |
JP5566684B2 (ja) | Clostridiumdifficileに対する、組換え毒素A/毒素Bワクチン | |
JPH07507688A (ja) | ジフテリア毒素ワクチン | |
JPH08503602A (ja) | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 | |
EA015561B1 (ru) | НОВЫЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ БЕЛОК HAEMOPHILUS INFLUENZAE (БЕЛОК E; pE) | |
JP4583607B2 (ja) | 感染症の治療のための弱毒化微生物 | |
JPH09500104A (ja) | 中耳炎ワクチン | |
KR100628657B1 (ko) | AroC, OmpF 및 OmpC 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 | |
JP5745731B2 (ja) | サルモネラワクチン | |
US5098998A (en) | Cholera vaccines and peptides | |
ES2381973T3 (es) | Vacuna viva atenuada contra la pleuroneumonia porcina | |
JPH04504656A (ja) | ボルデテラワクチン | |
DK175831B1 (da) | Neisseria gonorrhoeae-relaterede nucleinsyrer, rekombinantvektorer, værtsorgaismer, encellede organismer, polypeptidfremstillingsmetoder, polypeptidsammensætninger, vaccinepræparater, DNA-sonder, påvisningsmetoder og diagnostiske prövesæt, ......... | |
JP2009022299A (ja) | 変異Shigellaflexneri2a | |
JP2004337175A (ja) | 無毒性微生物及びその使用:サルモネラ | |
US5330753A (en) | Cholera vaccines | |
US6861507B1 (en) | Screening of neisserial vaccine candidates and vaccines against pathogenic neisseria | |
MXPA02010407A (es) | Aislamiento y caracterizacion del operante csa (etec-cs4-pili) y metodos para su uso. | |
US6309648B1 (en) | Protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly), their application to the treatment or to the prevention of bordetella infections | |
CA2067469C (en) | Recombinant vaccine against marek's disease | |
US20030165526A1 (en) | Vaccines and agents for inducing immunity against rickettsial diseases, and associated preventative therapy | |
HU205372B (en) | Process for producing vaccines against cholera |