FR2862648A1

FR2862648A1 - Nouveau peptide immunogene et nouveaux epitopes et utilisations notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l 'hepatite c

Info

Publication number: FR2862648A1
Application number: FR0313649A
Authority: FR
Inventors: Anne Fournillier; Genevieve Inchauspe; Perrine Martin
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2005-05-27
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: FR2862648B1; WO2005051420A1

Abstract

La présente invention a pour objet un nouveau peptide de 86 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1096 à l'acide aminé 1181 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°104, ainsi que 6 nouveaux épitopes inclus dans ce peptide restreint HLA-B7.Elle concerne également les compositions comprenant ce peptide, le cas échéant avec 4 autres peptides A à D situés respectivement dans la protéine NS3 (A et B), dans la protéine NS4 (C) et dans la protéine NS5b (D).Ces compositions sont utiles notamment dans la préparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hépatite C.

Description

La présente invention a pour objet un nouveau peptide polyépitopique issu

de la polyprotéine du virus de l'hépatite C et comprenant au moins deux nouveaux épitopes restreints par la molécule HLA-B7, lesdits nouveaux épitopes, ainsi que leur utilisation notamment dans la préparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus

de l'hépatite C, utiles notamment dans la vaccination prophylactique et thérapeutique dirigée contre le virus de l'hépatite C. L'hépatite C est la cause principale des hépatites acquises par transfusion. L'hépatite C peut également être transmise par d'autres voies percutanées, par exemple par injection de drogues par voie intraveineuse. Le risque de contamination des professionnels de la santé n'est par ailleurs pas négligeable.

L'hépatite C se distingue des autres formes de maladies du foie associées à des virus, telles que les hépatites A, B ou D. Les infections par le virus de l'hépatite C (VHC ou HCV) sont majoritairement chroniques avec pour résultante des maladies du foie, telles que hépatite, cirrhose et carcinome dans un grand nombre de cas (5 à 20%).

Bien que le risque de transmission du virus par transfusion ait diminué du fait de la mise en place de tests de criblage dans les années 1990, la fréquence des hépatites C reste élevée. A titre d'exemple, une étude récente indique qu'il y aurait encore aujourd'hui 10 000 à 15 000 nouveaux cas d'infection par an en France (S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601). Actuellement, environ 170 millions de personnes à travers le monde sont infectées de manière chronique par le VHC. Les populations à risque élevé sont principalement le personnel hospitalier et les utilisateurs de drogues intraveineuses, mais il existe des donneurs de sang asymptomatiques qui n'appartiennent pas à ces groupes à risque élevé et chez lesquels des anticorps anti-VHC circulants ont été retrouvés. Pour ces derniers, la voie de l'infection n'a encore pas été identifiée.

Le VHC a été le premier virus hépatotrope isolé au moyen des techniques de biologie moléculaire. Les séquences du génome viral ont été clonées avant que la particule virale n'ait été visualisée.

Le VHC appartient à un nouveau genre de la famille des Flaviviridae, les hepacivirus. C'est un virus à ARN simple brin positif, de 9,5 kb, qui se réplique par une copie d'ARN complémentaire et dont le produit de la traduction est un précurseur polyprotéique unique d'environ 3 000 acides aminés. L'extrémité 5' du génome du VHC correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside, les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2, et une petite protéine appelée p7. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans les différents génotypes. Les protéines d'enveloppe El et E2 sont codées par des régions plus variables d'un isolat à un autre. La protéine p7 est une protéine extrêmement hydrophobe qui constituerait un canal ionique. L'extrémité 3' du génome du VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4, NS5 a et b) et pour une région 3' non codante possédant un domaine bien conservé (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, juin 1997, 25(6) : 1527-1538).

A l'heure actuelle, la thérapie la plus efficace pour le traitement de l'hépatite C associe l'interféron pégylé et la ribavirine (Manns MP et al. , The Lancet, 22 septembre 2001, Vol. 358, 958-965). Alors que cette thérapie est particulièrement efficace dans le cas des patients infectés par des souches virales appartenant aux génotypes 2 et 3, elle n'a encore qu'un effet limité sur les génotypes la, lb et 4 (Manns MP, supra). Moins de 50% des patients traités deviennent des répondeurs à long terme .

Il est donc nécessaire de mettre au point une composition vaccinale ciblant en priorité ces génotypes mauvais répondeurs .

Plusieurs études montrent aujourd'hui que le contrôle d'une infection due au VHC, soit naturellement ( résolution spontanée ), soit après traitement ( résolution thérapeutique ) est associé à l'induction ou la potentialisation de réponses immunes à médiation cellulaire faisant intervenir les lymphocytes T-CD4+ et T-CD8+ (Ward S., et al., 2002, Clin. Exp. Immunol., 128: 195-203).

Les vaccins basés sur l'utilisation de peptides ont généralement pour but d'induire des réponses immunes médiées par les lymphocytes T-CD4+ et/ou TCD8+.

Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH ou HLA pour l'homme) sont dites de classe I ou de classe II. Les molécules de classe I sont exprimées sur la quasi totalité des cellules nucléées et sont capables de présenter des épitopes ou peptides aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+. Les molécules de classe II sont capables de présenter des épitopes aux cellules T CD4+, mais leur expression est restreinte aux cellules présentatrices d'antigène.

Plusieurs épitopes de type T, c'est-à-dire capables d'induire des réponses immunes à médiation cellulaire, ont été décrits sur la polyprotéine du VHC. Ces épitopes sont restreints par des molécules HLA diverses, incluant des molécules HLA- A2, HLA-B7, HLA-A3, etc. (Ward S., et al., 2002, supra). Néanmoins, aucun épitope minimal restreint par la molécule HLA-B7 et situé dan la protéine NS3 n'a été identifié. Les seuls épitopes identifiés à ce jour et restreints par cet HLA, à savoir le deuxième HLA le plus représenté dans la population caucasienne (environ 10%) sont des épitopes situés dans la capside virale (Wond DK., et al., 1998, J. Immunology, 160: 1479; Gruener NH., et al., 2000, J. Infectious Diseases, 181: 1528; Chang KM. et al., 1999, 162: 1156).

La Demanderesse a maintenant isolé de façon inattendue de la protéine NS3 du VHC un nouveau peptide polyépitopique de 86 acides aminés contenant au moins deux nouveaux épitopes restreints par la molécule HLA-B7, ledit peptide ayant un fort pouvoir immunogène.

Ainsi, la présente invention a pour premier objet un peptide de 86 acides aminés situé dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1096 à l'acide aminé 1181 sur la polyprotéine du VHC.

Ce nouveau peptide est particulièrement efficace en association avec d'autres 20 peptides également polyépitopiques situés dans les protéines NS3, NS4 et NS5b du VHC, à savoir: - le peptide A situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 31 acides aminés allant de l'acide aminé 1244 à l'acide aminé 1274 sur la polyprotéine codée par le virus et au plus 46 acides aminés allant de l'acide aminé 1237 à l'acide aminé 1282, le peptide B encore situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 45 acides aminés allant de l'acide aminé 1038 à l'acide aminé 1082 sur ladite polyprotéine virale et au plus 63 acides aminés allant de l'acide aminé 1027 à l'acide aminé 1089, - le peptide C situé dans la protéine NS4, lequel comporte au moins 32 acides aminés allant de l'acide aminé 1789 à l'acide aminé 1820 sur ladite polyprotéine virale et au plus 57 acides aminés allant de l'acide aminé 1767 à l'acide aminé 1823, et enfin - le peptide D situé dans la protéine NS5b, lequel comporte au moins 29 acides aminés allant de l'acide aminé 2573 à l'acide aminé 2601 sur ladite polyprotéine virale et au plus 44 acides aminés allant de l'acide aminé 2570 à l'acide aminé 2613.

Ainsi, la présente invention a donc également pour objet les compositions peptidiques comprenant le nouveau peptide de l'invention et au moins un peptide choisi parmi les peptides A à D définis ci-dessus, ainsi que leur utilisation, notamment en tant que vaccin, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition ou la prévention d'une infection provoquée par le virus de l'hépatite C, et en tant que composition diagnostique.

La présente invention a également pour objet les nouveaux épitopes inclus dans le peptide de l'invention, ainsi que leur utilisation, notamment en tant que vaccin, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition ou la prévention d'une infection provoquée par le virus de l'hépatite C, et en tant que composition diagnostique.

Elle a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour le peptide et les épitopes de l'invention et les microorganismes ou cellules hôtes (co)transformés par ces vecteurs.

Elle a enfin pour objet les anticorps dirigés contre le peptide ou les épitopes de l'invention et un procédé de détection et/ou de quantification du virus de l'hépatite C dans un échantillon biologique en utilisant lesdits anticorps.

Le peptide de l'invention, présentant un fort pouvoir immunogène, est un 20 peptide de 86 acides aminés situé dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1096 à l'acide aminé 1181 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 1 à SEQ ID N 104.

Dans toute la suite, on entendra par peptide ou épitope bien entendu les peptides et épitopes ayant les séquences en acides aminés natives, provenant de toute souche et 25 isolat du VHC, telles que définies dans le listage de séquences, ainsi que leurs analogues, mutéines et homologues.

Les épitopes sont des peptides ayant environ de 8 à 15 acides aminés, de sorte qu'on utilisera dans les définitions ci-après indifféremment le terme peptide pour désigner un épitope ou un peptide.

Par analogues ou mutéines d'un peptide, on entend les dérivés biologiquement actifs des molécules de référence qui présentent l'activité souhaitée, à savoir la capacité à stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire comme défini ci-dessus.

De façon générale, le terme analogue se réfère à des composés ayant une séquence et une structure polypeptidique native présentant une ou plusieurs additions, substitutions (généralement conservatrice en termes de nature) et/ou délétions d'acide aminé, par rapport à la molécule native, dans la mesure où les modifications ne détruisent pas l'activité immunogène. Par le terme mutéine , on entend les peptides présentant un ou plusieurs éléments imitant le peptide ( peptoïdes ), tels que ceux décrits dans la demande de brevet PCT W091/04282. De préférence, l'analogue ou la mutéine ont au moins la même immunoactivité que la molécule native. Des procédés de préparation d'analogues et mutéines polypeptidiques sont connus de l'homme du métier et sont décrits cidessous.

Les analogues particulièrement préférés incluent les substitutions conservatrices en nature, c'est-à-dire les substitutions qui prennent place dans une famille d'acides aminés. Spécifiquement, les acides aminés sont généralement divisés en 4 familles, à savoir (1) les acides aminés acides tels que l'aspartate et le glutamate, (2) les acides aminés basiques tels que la lysine, l'arginine et l'histidine, (3) les acides aminés non polaires tels que l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et le tryptophane et (4) les acides aminés non chargés polaires tels que la glycine, l'asparagine, la glutamine, la cystéine, la sérine, la thréonine et la tyrosine. La phénylalanine, le tryptophane et la tyrosine sont parfois classés en acides aminés aromatiques. Par exemple, on peut prédire de façon raisonnable qu'un remplacement isolé de leucine par de l'isoleucine ou de la valine, d'un aspartate par un glutamate, d'une thréonine par une sérine, ou un remplacement conservateur similaire d'un acide aminé par un autre acide aminé ayant un rapport structurel, n'aura pas d'effet majeur sur l'activité biologique. L'homme du métier déterminera facilement les régions de la molécule peptidique d'intérêt qui peuvent tolérer un changement par référence aux plots Hopp/Woods et Kyte-Doolite, biens connus dans la technique.

Par homologie , on entend le pourcentage d'identité entre deux molécules peptidiques. Deux séquences d'acides aminés sont sensiblement homologues l'une par rapport à l'autre lorsque les séquences présentent au moins 60%, de préférence au moins 75%, de préférence encore au moins 80-85%, de préférence encore au moins 90% et d'avantage préféré au moins 95-98% ou plus d'identité de séquence sur une longueur définie des molécules peptidiques.

De manière générale, le terme identité se réfère à une correspondance exacte acide aminé par acide aminé de deux séquences peptidiques. Le pourcentage d'identité peut être déterminé par une comparaison directe de l'information de séquence entre deux molécules en alignant les séquences, en comptant le nombre exact de mésappariements entre les deux séquences alignées, en divisant par la longueur de la séquence la plus courte et en multipliant le résultat par 100. Le pourcentage d'identité peut également être déterminé à l'aide de programmes d'ordinateurs tels que ALIGN, Dayhoff, M.O. dans Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 1981, 5 Suppl., 3: 482-489.

Les peptides natifs inclus dans la portée de l'invention sont les peptides issus des virus de génotype 1 (SEQ ID N 1 à 3), de génotype la (SEQ ID N 4 à 14), de génotype lb (SEQ ID N 15 à 83), de génotype 2 (SEQ ID N 84 à 99), de génotype 3 (SEQ ID N 100 à 103) et de génotype 4 (SEQ ID N 104).

Selon un mode de réalisation préféré, le peptide de l'invention a la séquence SEQ ID N 15.

Le peptide de l'invention est particulièrement efficace en association avec 20 d'autres peptides également polyépitopiques situés dans les protéines NS3, NS4 et NS5b du VHC, à savoir avec: - le peptide A situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 31 acides aminés allant de l'acide aminé 1244 à l'acide aminé 1274 sur la polyprotéine codée par le virus et au plus 46 acides aminés allant de l'acide aminé 1237 à l'acide aminé 1282, - le peptide B encore situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 45 acides aminés allant de l'acide aminé 1038 à l'acide aminé 1082 sur ladite polyprotéine virale et au plus 63 acides aminés allant de l'acide aminé 1027 à l'acide aminé 1089, - le peptide C situé dans la protéine NS4, lequel comporte au moins 32 acides aminés allant de l'acide aminé 1789 à l'acide aminé 1820 sur ladite polyprotéine virale et au plus 57 acides aminés allant de l'acide aminé 1767 à l'acide aminé 1823, et enfin - le peptide D situé dans la protéine NS5b, lequel comporte au moins 29 acides aminés allant de l'acide aminé 2573 à l'acide aminé 2601 sur ladite polyprotéine virale et au plus 44 acides aminés allant de l'acide aminé 2570 à l'acide aminé 2613.

L'expression le peptide A comporte au moins 31 acides aminés allant de l'acide aminé 1244 à l'acide aminé 1274 sur la polyprotéine codée par le virus et au plus 46 acides aminés allant de l'acide aminé 1237 à l'acide aminé 1282 signifie que l'extrémité N-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1237 à 1244 de la polyprotéine virale et l'extrémité C-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1274 à 1282 de la polyprotéine virale.

Ainsi le peptide A a toujours au moins les 31 acides aminés consécutifs correspondant aux positions 1244-1274 et au plus 15 acides aminés supplémentaires distribués de part et d'autre de ces 31 acides aminés dans la limite des positions 1237-1282. Par exemple, un peptide A peut comporter 33 acides aminés constitués de 31 acides aminés correspondant aux positions 1244-1274 et soit 2 acides aminés N-terminaux (positions du peptide de 33 acides aminés: 1242-1274), soit 2 acides aminés C-terminaux (positions du peptide de 33 acides aminés: 1244-1276), soit un acide aminé N-terminal et un acide aminé C-terminal (positions du peptide de 33 acides aminés: 1243-1275).

L'expression le peptide B comporte au moins 45 acides aminés allant de l'acide aminé 1038 à l'acide aminé 1082 sur ladite polyprotéine virale et au plus 63 acides aminés allant de l'acide aminé 1027 à l'acide aminé 1089 signifie que l'extrémité N-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1027 à 1038 et l'extrémité C-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1082 à 1089.

Ainsi le peptide B a toujours au moins les 45 acides aminés consécutifs correspondant aux positions 1038-1082 et au plus 18 acides aminés supplémentaires distribués de part et d'autre de ces 45 acides aminés dans la limite des positions 1027-1089.

L'expression le peptide C comporte au moins 32 acides aminés allant de l'acide aminé 1789 à l'acide aminé 1820 sur ladite polyprotéine virale et au plus 57 acides aminés allant de l'acide aminé 1767 à l'acide aminé 1823 signifie que l'extrémité N-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1767 à 1789 et l'extrémité C-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 1820 à 1823.

Ainsi le peptide C de l'invention a toujours au moins les 32 acides aminés consécutifs correspondant aux positions 1789-1820 et au plus 25 acides aminés supplémentaires distribués de part et d'autre de ces 32 acides aminés dans la limite des positions 1767-1823.

L'expression le peptide D comporte au moins 29 acides aminés allant de l'acide aminé 2573 à l'acide aminé 2601 sur ladite polyprotéine virale et au plus 44 acides aminés allant de l'acide aminé 2570 à l'acide aminé 2613 signifie que l'extrémité N-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 2570 à 2573 et l'extrémité C-terminale est délimitée par l'acide aminé situé à l'une des positions 2601 à 2613.

Ainsi le peptide D de l'invention a toujours au moins les 29 acides aminés consécutifs correspondant aux positions 2573-2601 et au plus 15 acides aminés supplémentaires distribués de part et d'autre de ces 29 acides aminés dans la limite des positions 2570-2613.

L'association du peptide de l'invention et des peptides A à D permet d'induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques capables d'une vigueur et d'une efficacité supérieure à celle obtenue avec chacun des peptides utilisés séparément et/ou chacun des épitopes individuels contenus dans ces peptides utilisés seuls ou en association ainsi que de stimuler une production supérieure d'interféron 'y.

Ainsi, la présente invention a également pour objet les compositions peptidiques comprenant le peptide de l'invention et au moins également un peptide choisi parmi: - le peptide A situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 31 acides aminés allant de l'acide aminé 1244 à l'acide aminé 1274 sur la polyprotéine codée par le virus et au plus 46 acides aminés allant de l'acide aminé 1237 à l'acide aminé 1282, - le peptide B encore situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 45 acides aminés allant de l'acide aminé 1038 à l'acide aminé 1082 sur ladite polyprotéine virale et au plus 63 acides aminés allant de l'acide aminé 1027 à l'acide aminé 1089, - le peptide C situé dans la protéine NS4, lequel comporte au moins 32 acides aminés allant de l'acide aminé 1789 à l'acide aminé 1820 sur ladite polyprotéine virale et au plus 57 acides aminés allant de l'acide aminé 1767 à l'acide aminé 1823, et - le peptide D situé dans la protéine NS5b, lequel comporte au moins 29 acides aminés allant de l'acide aminé 2573 à l'acide aminé 2601 sur ladite polyprotéine virale et au plus 44 acides aminés allant de l'acide aminé 2570 à l'acide aminé 2613.

Les peptides A, B, C et D, ainsi que leurs séquences en acides aminés ont été décrits dans la demande de brevet, déposée par la Demanderesse, PCT/FR03/01478, à laquelle l'homme du métier pourra se référer.

De préférence, le peptide A a au moins la séquence en acides aminés SEQ ID N 105 et au plus la séquence en acides aminés SEQ ID N 106, le peptide B a au moins la séquence en acides aminés SEQ ID N 107 et au plus la séquence en acides aminés SEQ ID N 108, le peptide C a au moins la séquence en acides aminés SEQ ID N 109 et au plus la séquence en acides aminés SEQ ID N 110 et le peptide D a au moins la séquence en acides aminés SEQ ID N 111 et au plus la séquence en acides aminés SEQ ID N 112.

Le peptide A de séquence SEQ ID N 105, le peptide B de séquence SEQ ID N 107, le peptide C de séquence SEQ ID N 109 et le peptide D de séquence SEQ ID N 111 sont particulièrement préférés aux fins de l'invention.

Les compositions peptidiques de l'invention contiennent donc au moins deux peptides, l'un étant le peptide de l'invention, l'autre étant choisi parmi les peptides A à 20 D tels que définis ci-dessus.

Ainsi, les compositions de l'invention peuvent contenir deux peptides selon les combinaisons suivantes: peptide de l'invention et peptide A, peptide de l'invention et peptide B, peptide de l'invention et peptide C, et peptide de l'invention et peptide D. Les compositions de l'invention peuvent également contenir trois peptides selon les combinaisons suivantes: peptide de l'invention et peptides A et B, peptide de l'invention et peptides A et C, peptide de l'invention et peptides A et D, peptide de l'invention et peptides B et C, peptide de l'invention et peptides B et D, et peptide de l'invention et peptides C et D. De même, les compositions de l'invention peuvent contenir quatre peptides selon les combinaisons suivantes: peptide de l'invention et peptides A, B et C, peptide de l'invention et peptides A, B et D, peptide de l'invention et peptides A, C et D, et peptide de l'invention et peptides B, C et D. Enfin, les compositions de l'invention peuvent contenir cinq peptides, à savoir le peptide de l'invention et les quatre peptides A, B, C, D, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.

Le peptide de l'invention contient dans sa séquence, outre des épitopes connus tels que l'épitope MYTNVDQDL restreint par la molécule HLA-A24 (position 1100-1109 dans la polyprotéine virale; Ito et al, 2001, Journal of Gastroenterology and Hepatology, 16: 309-316) et l'épitope LLCPSGHVV restreint par la molécule HLA-A2 (position 1169-1177 dans la polyprotéine virale; Cerny et al, 1995, Journal of Clinical investigations, 95: 521530), six nouveaux épitopes T restreints par la molécule HLAB7 présentant un fort pouvoir immunogène.

Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'épitope T L10K de 10 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1153 à l'acide aminé 1162 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 113 à SEQ ID N 124 et de préférence la séquence SEQ ID N 115.

Cet épitope est appelé épitope L10K car il possède 10 acides aminés, commence par une leucine et termine par une lysine.

Les deux épitopes de 9 acides aminés contenus dans L10K, à savoir les épitopes L9L et S9K, situés respectivement de l'acide aminé 1153 à l'acide aminé 1161 et de l'acide aminé 1154 à l'acide aminé 1162, présentent également un fort pouvoir immunogène et constituent un autre objet de l'invention.

L'épitope L9L possède l'une des séquence en acides aminés SEQ ID N 125 à SEQ ID N 136, de préférence la séquence SEQ ID 127, et l'épitope S9K possède l'une des séquence en acides aminés SEQ ID N 137 à SEQ ID N 148, de préférence la séquence SEQ ID N 139.

Là encore, ces épitopes sont appelés respectivement L9L et S9K car ils possèdent 9 acides aminés, L9L commençant par l'acide aminé L et terminant par l'acide aminé L et S9K commençant par l'acide aminé S et terminant par l'acide aminé K. L'invention concerne également l'épitope T W10M de 10 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1111 à l'acide aminé 1120 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 149 à SEQ ID N 178, et de préférence la séquence SEQ ID N 155.

De même, cet épitope est appelé W 10M car il possède 10 acides aminés, commence par l'acide aminé W et termine par l'acide aminé M. Les deux épitopes de 9 acides aminés contenus dans W 10M, à savoir les épitopes W9S et P9M, situés respectivement de l'acide aminé 1111 à l'acide aminé 1119 et de l'acide aminé 1112 à l'acide aminé 1120, présentent également un fort pouvoir immunogène et constituent un autre objet de l'invention.

L'épitope W9S possède l'une des séquence en acides aminés SEQ ID N 179 à 10 SEQ ID N 203, de préférence la séquence SEQ ID 179, et l'épitope P9M possède l'une des séquence en acides aminés SEQ ID N 204 à SEQ ID N 232, de préférence la séquence SEQ ID N 204.

Là encore, ces épitopes sont appelés respectivement W9S et P9M car ils possèdent 9 acides aminés, W9S commençant par l'acide aminé W et terminant par 15 l'acide aminé S et P9M commençant par l'acide aminé P et terminant par l'acide aminé M. La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour le peptide et pour les épitopes de l'invention tels que définis précédemment.

Les peptides et épitopes de l'invention peuvent être soit d'origine native, soit 20 d'origine recombinante.

Les peptides et épitopes d'origine native sont obtenus à partir des souches ou isolats du VHC, par le biais de l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques synthétiques qui vont servir à amplifier les séquences virales natives, soit à partir de sera de patients infectés par le ou les génotypes viraux ciblés, soit à partir d'ARN viral déjà purifié, provenant par exemple de sang ou de foie de patients, soit à partir d'ADN complémentaire libre ou cloné au préalable dans un vecteur d'expression, soit encore à partir de particules virales purifiées à partir de prélèvements biologiques ou de système de propagation in vitro.

Les peptides et épitopes de l'invention d'origine recombinante peuvent être 30 obtenus par la technique du génie génétique qui comprend les étapes de: - culture d'un microorganisme ou de cellules eucaryotes transformé(es) à l'aide d'une séquence nucléotidique codant pour lesdits peptides ou épitopes et - récupération du peptide produit par ledit microorganisme ou lesdites cellules eucaryotes.

Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Pour plus de détails la concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être préparées par synthèse chimique et génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Là encore, on entend par séquence nucléotidique , toutes les séquences codant pour les peptides et épitopes, leur séquence complémentaire, ainsi les séquences codant pour leurs analogues, mutéines et homologues, tels que définis précédemment.

Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs d'expression, dans un système d'expression adapté, par exemple afin d'obtenir les compositions ou les peptides de l'invention.

Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en les vecteurs d'expression comprenant au moins une séquence nucléotidique de l'invention, ainsi que les moyens 20 nécessaires à son expression.

On entend par moyen nécessaire à l'expression d'un peptide, le terme peptide étant utilisé pour toute molécule peptidique, telle que peptide, épitope, protéine, etc., tout moyen qui permet d'obtenir le peptide, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une originede réplication et de préférence un marqueur de sélection.

Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide sont liés de façon opérationnelle à la séquence d'acide nucléotidique codant pour le peptide d'intérêt. Par liés de façon opérationnelle , on entend une juxtaposition desdits éléments nécessaires à l'expression et du gène codant pour le peptide d'intérêt, lesquels sont en une relation telle que cela leur permet de fonctionner de façon attendue. Par exemple, ils peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène d'intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée.

Les moyens nécessaires à l'expression d'un peptide peuvent être des moyens homologues, c'est-à-dire inclus dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec le peptide d'intérêt à exprimer.

Lesdites séquences contenues dans le vecteur d'expression peuvent être liées directement entre elles sous le contrôle d'un seul promoteur et/ou d'un seul élément régulateur de l'expression, ou bien elles peuvent être séparées en étant sous la dépendance chacune de promoteurs et/ou régulateurs de l'expression indépendants, identiques ou différents.

A titre de vecteur d'expression qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer par exemple les plasmides, les vecteurs viraux type adenovirus, poxvirus, virus de la vaccine, baculovirus, les vecteurs bactériens du type salmonelle, listéria, BCG.

Les vecteurs de l'invention peuvent également comprendre des séquences nécessaires au ciblage des peptides vers des compartiments cellulaires particuliers. Un exemple de ciblage peut être le ciblage vers le réticulum endoplasmique obtenu en utilisant des séquences d'adressage du type de la séquence leader issue de la protéine E3 de l'adénovirus (Ciernik I.F., et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925).

Les vecteurs d'expression de l'invention peuvent comprendre soit une seule séquence nucléotidique codant pour le peptide de l'invention uniquement, soit au moins deux séquences nucléotidiques, l'une codant pour le peptide de l'invention et l'autre codant pour un peptide choisi parmi les peptides A à D. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, les vecteurs d'expression comprennent une séquence nucléotidique codant pour le peptide de l'invention et au moins une séquence nucléotidique codant pour les peptides A à D, ainsi que les moyens nécessaires à leur expression.

Les vecteurs d'expression de l'invention peuvent donc contenir deux, trois, quatre ou cinq séquences nucléotidiques, étant entendu que l'une d'entre elles code pour le peptide de l'invention et les autres codent pour les peptides A, B, C et D, selon les combinaisons décrites précédemment pour les compositions peptidiques.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les vecteurs d'expression comprennent une séquence nucléotidique codant pour le peptide de l'invention et 4 séquences nucléotidiques codant respectivement pour les peptides A à D. Bien entendu, l'ordre des séquences nucléotidiques dans les vecteurs d'expression importe peu.

Lorsque les vecteurs d'expression de l'invention comprennent plusieurs séquences nucléotidiques, lesdites séquences peuvent être liées directement entre elles, ou bien par l'intermédiaire d'agents espaceurs ou lieurs qui sont typiquement constitués de petites molécules neutres telles que des acides aminés ou mimétiques d'acides aminés qui ont typiquement une charge neutre dans des conditions physiologiques.

A titre d'agents espaceurs, on peut citer les résidus Ala, Gly ou d'autres agents espaceurs neutres d'acides aminés non polaires ou d'acides aminés polaires neutres.

Ces acides aminés espaceurs ont au moins un ou deux résidus et habituellement de 3 à 6 résidus.

L'invention a également pour objet les microorganismes et les cellules hôtes ou eucaryotes transformés par un vecteur d'expression de l'invention.

A titre d'exemples de microorganisme qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer les levures, telles que celles des familles suivantes: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis et Kluveromyces lactis étant préférées; et les bactéries, telles que E. coli et celles des familles suivantes: Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Strptococcus, Bacillus et Streptomyces.

A titre d'exemples de cellules eucaryotes hôtes, on peut citer les cellules provenant d'animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes et équivalent. Les cellules eucaryotes préférées sont les cellules provenant du hamster chinois (cellules CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 15) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l'ostéosacorme (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l'hépatome (du type cellules Hep G2), ainsi que les lignées cellulaires d'insecte (par exemple de Spodoptera frugiperda).

Les cellules hôtes peuvent être fournies dans des cultures en suspension ou en flacon, dans des cultures tissulaires, des cultures d'organe et équivalent. Les cellules hôtes peuvent également être des animaux transgéniques.

Lorsqu'on veut obtenir une composition de l'invention contenant au moins deux peptides, dont l'un est le peptide de l'invention et l'autre est choisi parmi les peptides A à D, les microorganismes ou cellules eucaryotes sont transformés par un vecteur d'expression contenant au moins deux séquences nucléotidiques, ou bien ils sont cotransformés par au moins deux vecteurs d'expression contenant une seule séquence l0 nucléotidique, chaque vecteur codant pour un peptide de type différent.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les microorganismes et cellules hôtes sont cotransformés avec deux vecteurs d'expression, l'un codant pour le peptide de l'invention et l'autre codant pour au moins un peptide A à D. Selon un mode de réalisation préféré, les microorganismes ou cellules hôtes sont 15 cotransformés par deux vecteurs d'expression, l'un codant pour le peptide de l'invention et l'autre codant pour les quatre peptides A à D. L'invention concerne également des anticorps dirigés contre le peptide ou contre l'un des épitopes de l'invention tels que définis précédemment.

Les anticorps selon l'invention sont soit des anticorps polyclonaux, soit 20 monoclonaux.

Les anticorps polyclonaux sus-mentionnés peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec le peptide ou épitope d'intérêt à titre d'antigène, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment le peptide ou l'épitope d'intérêt.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.

Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec le peptide ou épitope d'intérêt à titre d'antigène, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis du peptide ou épitope d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.

Le peptide, les compositions peptidiques, les épitopes, les séquences nucléiques et les vecteurs de l'invention, sont particulièrement efficaces pour l'inhibition, la prévention et le traitement du virus ou de l'infection des patients porteurs du virus, de sorte que son utilisation pour la préparation d'un médicament constitue un autre objet de l'invention.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un peptide de l'invention, d'une composition peptidique de l'invention, d'au moins un épitope de l'invention, d'une séquence nucléotidique de l'invention ou d'un vecteur d'expression de l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement d'une infection provoquée par le virus de l'hépatite C chez un animal, de préférence l'homme.

Les séquences nucléotidiques et les vecteurs d'expression seront utilisés selon les critères de la thérapie génique. Par exemple, les séquences nucléotidiques pourront être liées à des polymères biocompatibles largement connus de l'homme du métier La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques, notamment vaccin, contenant à titre de substance active au moins un peptide de l'invention, ou une composition peptidique de l'invention, ou au moins un épitope de l'invention, ou au moins une séquence nucléotidique de l'invention, placée sous le contrôle d'éléments nécessaires à une expression constitutive et/ou inductible du ou des peptides d'intérêt codée par ladite séquence, ou un vecteur de l'invention, ou bien au moins un anticorps de l'invention, en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Par éléments nécessaires à une expression constitutive des peptides, on entend 5 un promoteur ubiquitaire ou spécifique des cellules eucaryotes.

A titre d'éléments nécessaires à une expression inductible des peptides, on peut citer les éléments de régulation de l'opéron de E. colt pour la résistance à la tétracycline (Gossen M. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 5547-5551 (1992).

La quantité et la nature de l'excipient peuvent être facilement déterminées par 10 l'homme du métier. Elles sont choisies selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités.

Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d' administration.

Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques ( patch ), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.

Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés.

Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique.

Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la présente invention concerne également une méthode de traitement des pathologies associées au virus de l'hépatite C qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un médicament de l'invention.

Outre une application thérapeutique, l'invention a également une application diagnostique en ce sens que les peptides, les séquences nucléotidiques et les anticorps de l'invention peuvent être utilisés à titre de partenaire de liaison dans lesdits tests.

Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation d'un peptide, d'une séquence nucléotidique ou d'un anticorps de l'invention pour le diagnostic in vitro du virus de l'hépatite C dans un échantillon ou un prélèvement biologique.

Le peptide et les anticorps de l'invention peuvent être utilisés dans des tests de dosage immunologique, tel que le dosage ELISA, et les séquences nucléotidiques 15 peuvent être utilisées dans des tests de d'hybridation.

Des exemples de procédés diagnostiques comprennent, sans aucune limitation, les blots, les techniques dites sandwich, les techniques de compétition et les techniques de détection par PCR, notamment celles dites en temps réel .

Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification du virus de l'hépatite C dans un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par ledit virus, tel que plasma, sérum ou tissu, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon biologique avec les anticorps selon l'invention dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le virus et 25 l'anticorps, et - détecter et/ou quantifier la formation dudit complexe par tout moyen approprié.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à XX 30 annexées, sur lesquelles: - la figure 1 représente l'alignement, en fonction du génotype, du peptide de l'invention, - la figure 2 représente l'alignement, en fonction du génotype, des épitopes LIOK, L9L et S9K de l'invention, - la figure 3 représente l'alignement, en fonction du génotype, des épitope W10M, W9S et P9M de l'invention et - la figure 4 donne la réponse cellulaire induite par l'épitope L9L (figure 4A)ou par l'épitope S9K (figure 4B) selon le test CTL où on a utilisé l'épitope d'intérêt approprié pour stimuler les splénocytes en culture et pour charger les cibles du CTL et dont le résultat est exprimé en pourcentage de lyse spécifique en fonction du rapport effecteur/cible, la figure 5 donne la réponse cellulaire induite par l'épitope L9L ou par l'épitope S9K selon le test ELISPOT spécifique pour l'épitope d'intérêt approprié, où le résultat est donné en nombre de spots/106 cellules, - la figure 6 donne la réponse cellulaire induite par l'épitope W10M selon le test ELISPOT spécifique pour cet épitope, où le résultat est donné en nombre de spots/106 cellules, - la figure 7 donne la réponse cellulaire induite par l'épitope W I OM selon le test CTL où on a utilisé l'épitope W10M pour stimuler les splénocytes en culture et pour charger les cibles du CTL et dont le résultat est exprimé en pourcentage de lyse spécifique en fonction du rapport effecteur/cible.

Exemple 1: Mise en évidence de l'immunogénicité de l'épitope L9L de l'invention chez la souris 1. Immunisation des souris On a immunisé des souris transgéniques pour la molécule HLA-B7 (Rohrlish et al., 2003, International Immunology, 15(6) : 765-772) avec un plasmide codant pour les protéines NS3 et NS4 (pgWiz NS3NS4; Himoudi et al., 2002, J. Virol., 76: 12735-12746), puis boosté ces mêmes souris avec un Adénovirus exprimant les protéines NS3 et NS4 (pIV317 tel que décrit dans la demande FR03/06772 déposée par la Demanderesse).

Pour ce faire, chaque souris a reçu, en injection intramusculaire au niveau de la cuisse, 50 L de cardiotoxine à 10 M à J-5, puis 100 g de pgWiz NS3NS4 à JO puis 109 IU d'Adénovirus NS3NS4 à J15.

Les souris témoins (S neg) ont reçu une injection de cardiotoxine à J-5, comme les souris précédemment décrites, une injection de pgWiz vide (Himoudi et al., 2002, supra) à JO (100 g) et une injection de 109 IU d'Adénovirus a-gal (Transgène, Strasbourg, France) à J15, en injection intramusculaire.

Quinze jours après l'injection de l'adénovirus, on a observé la réponse cellulaire en isolant les cellules de la rate des souris en réalisant un test de cytotoxicité (CTL) et 10 un test ELISPOT.

2. Test CTL Le test CTL a pour but d'évaluer la lyse spécifique par les lymphocytes T CD8+ provenant de la rate de cellules cibles chargées avec des épitopes potentiels du VHC.

Pour réaliser ce test, on a cultivé ces splénocytes en plaque 24 puits en présence de 5 M de l'épitope L9L de séquence SEQ ID N 127 et en présence d'interleukine 2 recombinante murine 10 U par mL dans du milieu modifié essentiel alpha (aMEM) pendant 5 jours. Au 5eme jour, on a effectué l'étape de restimulation qui consiste à rajouter aux splénocytes en culture des splénocytes de souris naïves en présence de l'épitope potentiel pendant 2 jours. Au 7eme jour, on a réalisé le test CTL en luimême qui consiste à mettre en présence les splénocytes des souris immunisées après les 7 jours de culture (cellules effectrices) et des cellules CEM B7 B7 Kd chargées avec 101.tM de l'épitope L9L et marquées au Cr51 (cellules cibles). L'activité cytotoxique des cellules effectrices, spécifique de l'épitope potentiel chargé sur les cellules cibles, est déterminée par la mesure, après 4h d'incubation avec les cellules cibles, du Cr51 libéré suite à la lyse des cellules cibles en utilisant un appareil de comptage 'y-Cobra II (Perkin Elmer, France).

On a déterminé la libération spontanée et maximale de Cr51 par les cellules cibles à partir des puits ne contenant que les cellules cibles et du milieu seul ou du tampon de lyse (HC1 1N). On a calculé le pourcentage spécifique de cytotoxicité par la formule: (libération dans l'essai-libération spontanée)/(libération maximale-libération spontanée) X100.

On a déterminé la lyse spécifique de l'épitope potentiel par la différence entre le pourcentage de lyse obtenu en présence des cellules cibles chargées avec l'épitope L9L et le pourcentage de lyse obtenu en présence des cellules cibles non chargées.

Les résultats sont indiqués sur la figure 4 A qui représente un graphe donnant le rapport effecteur/cible en fonction du pourcentage de lyse spécifique et où S1 est la souris 1, S2 est la souris 2, S3 est la souris 3, ces trois souris ayant été immunisées par le plasmide pgWiz NS3NS4 puis par l'Adénovirus NS3NS4, et S neg est la souris témoin ayant été immunisée par le plasmide pgWiz vide et l'Adénovirus a-gal.

Ces résultats montrent que cet épitope est la cible d'une réponse cytotoxique après injection à des souris transgéniques pour la molécule HLA-B7 d'un plasmide pgWizNS3NS4 et d'un adénovirus NS3NS4 et est capable d'induire une forte réponse CTL.

3. Test ELISPOT Le test ELISPOT a pour but de mesurer le nombre de cellules spécifiques d'un 15 épitope produisant de l'IFNy lorsqu'elles sont stimulées par cet épitope.

Pour réaliser ce test, on a cultivé les splénocytes des souris immunisées pendant 48H dans des plaques 96 puits MultiScreen (Millipore) préalablement coatées avec un anticorps anti-interféron-y murin (IFNy) (BD Biosciences, 10 g/mL au final).

Les splénocytes sont mis en culture en présence de 10 M de l'épitope L9L de séquence SEQ ID N 127 et en présence de 10 U d'interleukine 2 recombinante murine par mL dans du aMEM. Pour le contrôle positif, les splénocytes sont cultivés en présence de concanavaline A (5 g/mL). Pour le contrôle négatif, les splénocytes sont cultivés soit en présence d'un peptide non-spécifique (ou peptide irrelevant) appartenant à la protéine de capside du VHC, dont la séquence est DLMGYIPLV, soit en milieu seul, sans aucun peptide.

Après les 48H de culture, les puits sont lavés une fois avec du PBS 1X, puis 3 fois avec du PBS-Tween 0,05%, puis sont incubés 2H avec un anticorps biotinylé anti-IFNy murin (BD Biosciences, 1 gg/mL au final). Les puits sont ensuite lavés 3 fois avec du PBS-Tween 0,05%, puis incubés pendant 1h avec un conjugué streptavidine-HRP (Southern Biotechnology Associates).

L'activité enzymatique est ensuite révélée par dégradation d'un substrat, l'AEC.

Les spots obtenus sont ensuite comptés grâce à un lecteur ELISpot Zeiss (microscope Zeiss couplé au logiciel KS-ELISpot).

Le nombre de spots spécifiques, correspondant à la production d' IFNy par les cellules spécifiques de l'épitope potentiel, est déterminé pour un million de cellules et on retranche au nombre de spots observés dans le puits où les cellules sont en présence de l'épitope L9L le nombre de spots observés dans le puits où les cellules sont en milieu seul. Chaque condition est réalisée en triplicate.

Les résultats sont indiqués sur la figure 5 qui donne le nombre de spots pour 106 splénocytes de souris notamment en présence de l'épitope L9L (LSPRPVSYL) et en présence d'un peptide irrelevant, le nombre de spots étant indiqué au-dessus de chaque barre de l'histogramme.

Ces résultats montrent clairement que l'épitope L9L est un épitope situé dans la protéine NS3 du VHC, restreint par la molécule HLA-B7, est capable d'induire une forte production d' IFNy, outre la forte réponce CTL mise en évidence au point 2 ci- dessus.

Exemple 2: Mise en évidence de l'immunogénicité de l'épitope S9K de l'invention chez la souris On a repris le mode opératoire indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus, à ceci près qu'on a remplacé l'épitope L9L par l'épitope S9K de séquence SEQ ID N 139.

Les résultats du test CTL et ceux du test ELISPOT sont donnés respectivement sur la figure 4B et la figure 5. Ces résultats mettent en évidence que l'épitope S9K est un épitope situé dans la protéine NS3 du VHC, restreint par la molécule HLA-B7 et capable d'induire à la fois une forte réponse CTL (figure 4B) et une forte production d'IFNy (figure 5).

Exemple 3: Mise en évidence de l'immunogénicité de l'épitope W10M de l'invention chez la souris On a repris le mode opératoire indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus, à ceci près 30 qu'on a remplacé l'épitope L9L par l'épitope W1OM de séquence SEQ ID N 155.

Les résultats du test ELISPOT sont donnés sur la figure 6 et du test CTL sont donnés sur la figure 7. Ces résultats mettent en évidence que l'épitope W10M est un épitope situé dans la protéine NS3 du VHC, restreint par la molécule HLA-B7 et capable d'induire à la fois une forte production d'IFNy (figure 6) et une forte réponse CTL (figure 7).

Claims

REVENDICATIONS

1. Peptide de 86 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1096 à l'acide aminé 1181 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des 5 séquences en acides aminés SEQ ID N 1 à SEQ ID N 104.

2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a la séquence SEQ ID N 15.

3. Composition peptidique caractérisée en ce qu'elle comprend le peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 et au moins également un peptide choisi parmi: - le peptide A situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 31 acides aminés allant de l'acide aminé 1244 à l'acide aminé 1274 sur la polyprotéine codée par le virus et au plus 46 acides aminés allant de l'acide aminé 1237 à l'acide aminé 1282, - le peptide B encore situé dans la protéine NS3, lequel comporte au moins 45 acides aminés allant de l'acide aminé 1038 à l'acide aminé 1082 sur ladite polyprotéine virale et au plus 63 acides aminés allant de l'acide aminé 1027 à l'acide aminé 1089, - le peptide C situé dans la protéine NS4, lequel comporte au moins 32 acides aminés allant de l'acide aminé 1789 à l'acide aminé 1820 sur ladite polyprotéine virale et au plus 57 acides aminés allant de l'acide aminé 1767 à l'acide aminé 1823, et - le peptide D situé dans la protéine NS5b, lequel comporte au moins 29 acides aminés allant de l'acide aminé 2573 à l'acide aminé 2601 sur ladite polyprotéine virale et au plus 44 acides aminés allant de l'acide aminé 2570 à l'acide aminé 2613.

4. Composition peptidique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend le peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 et lesdits peptides A à D.

5. Epitope T L10K de 10 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1153 à l'acide aminé 1162 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 113 à SEQ ID N 124, de préférence SEQ ID N 115.

6. Epitope T L9L de 9 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1153 à l'acide aminé 1161 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 125 à SEQ ID N 136, de préférence SEQ ID N 127.

7. Epitope T S9K de 9 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1154 à l'acide aminé 1162 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 137 à SEQ ID N 148, de préférence SEQ ID N 139.

8. Epitope T W 10M de 10 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1111 à l'acide aminé 1120 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 149 à SEQ ID N 178, de préférence SEQ ID N 155.

9. Epitope T W9S de 9 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1111 à l'acide aminé 1119 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 179 à SEQ ID N 203, de préférence SEQ ID N 179.

10. Epitope T P9M de 9 acides aminés situés dans la protéine NS3 du VHC, allant de l'acide aminé 1112 à l'acide aminé 1120 sur la polyprotéine du VHC et ayant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N 204 à SEQ ID N 232, de préférence SEQ ID N 204.

11. Séquences nucléotidiques codant pour le peptide tel que défini dans l'une 30 des revendications 1 ou 2.

12. Séquences nucléotidiques codant pour l'un quelconque des épitopes tels que définis dans les revendications 5 à 10.

13. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend au moins une 5 séquence nucléotidique telle que définie dans l'une des revendications 11 ou 12, ainsi que les moyens nécessaires à son expression.

14. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 11 et au moins une séquence 10 nucléotidique codant pour les peptides A à D tels que définis dans la revendication 3, ainsi que les moyens nécessaires à leur expression.

15. Vecteur d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend, une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 11 et 4 15 séquences nucléotidiques codant respectivement pour les peptides A à D.

16. Microorganisme ou cellule hôte transformé par un vecteur d'expression tel que défini dans l'une quelconque des revendications 13 à 15.

17. Microorganisme ou cellule hôte cotransformé par au moins deux vecteurs d'expression, l'un codant pour le peptide tel que défini dans les revendications 1 ou 2 et l'autre codant pour au moins un peptide A à D tels que définis dans la revendication 3.

18. Microorganisme ou cellule hôte selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est cotransformé par deux vecteurs d'expression, l'un codant pour le peptide tel que défini dans les revendications 1 ou 2 et l'autre codant pour les peptides A à D tels que définis dans la revendication 3.

19. Anticorps dirigés contre le peptide tel que défini dans l'une des 30 revendications 1 à 2 ou contre l'un des épitopes tels que définis dans l'une quelconque des revendications 5 à 10.

20. Utilisation d'un peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, d'une composition peptidique telle que définie dans l'une des revendications 3 à 4, d'au moins un épitope tel que défini dans les revendications 5 à 10, d'une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une des revendications 11 à 12 ou d'un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 13 à 15 pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement d'une infection provoquée par le virus de l'hépatite C chez un animal, de préférence l'homme.

21. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, contenant à titre de substance active au moins un peptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 2, ou une composition peptidique telle que définie dans l'une des revendications 3 à 4, ou au moins un épitope tel que défini dans les revendications 5 à 10, ou au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une des revendications 11 à 12, placée sous le contrôle d'éléments nécessaires à une expression constitutive et/ou inductible du ou des peptides d'intérêt codée par ladite séquence, ou un vecteur tel que défini dans l'une des revendications 13 à 15, ou bien au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 19, en association avec un excipient pharmaceutiquement approprié.

22. Utilisation d'un peptide tel que défini dans les revendications 1 à 2, d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 11 ou d'un anticorps tel que défini dans la revendication 19 pour le diagnostic in vitro du virus de l'hépatite C dans un échantillon ou un prélèvement biologique.

23. Procédé de détection et/ou de quantification du virus de l'hépatite C dans un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par ledit virus, tel que plasma, sérum ou tissu, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - mettre en contact ledit échantillon biologique avec les anticorps selon la 30 revendication 19 dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre le virus et l'anticorps, et - détecter et/ou quantifier la formation dudit complexe par tout moyen approprié.