WO2021229065A1 - Nouvelles compositions immunogenes et leur application pour la preparation de vaccins contre l'hepatite c et l'hepatite b - Google Patents

Nouvelles compositions immunogenes et leur application pour la preparation de vaccins contre l'hepatite c et l'hepatite b Download PDF

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WO2021229065A1
WO2021229065A1 PCT/EP2021/062853 EP2021062853W WO2021229065A1 WO 2021229065 A1 WO2021229065 A1 WO 2021229065A1 EP 2021062853 W EP2021062853 W EP 2021062853W WO 2021229065 A1 WO2021229065 A1 WO 2021229065A1
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WO
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shbv
protein
deleted
fusion protein
hcv
Prior art date
Application number
PCT/EP2021/062853
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Inventor
Elodie BEAUMONT
Elsa GOMEZ-ESCOBAR
Christophe Hourioux
Romuald Patient
Philippe Roingeard
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Universite De Tours
Centre Hospitalier Regional Universitaire De Tours
I.N.S.E.R.M. (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
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    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the subject of the invention is novel immunogenic compositions comprising a mixture of chimeric sub-viral envelope particles between the envelope proteins of the hepatitis B virus (HBV, for Hepatitis B virus) and of the hepatitis virus. C (HCV, for Hepatitis C virus).
  • HBV hepatitis B virus
  • C Hepatitis C virus
  • a subject of the invention is also the use of these novel immunogenic compositions, as a vaccine, for the prevention and / or the prophylactic and / or therapeutic treatment of hepatitis C, or for the prevention and / or the prophylactic treatment. and / or therapy for hepatitis B, or for the prevention and / or prophylactic and / or therapeutic treatment of hepatitis C and hepatitis B.
  • HCV hepatitis C virus
  • WHO World Health Organization
  • HCV hepatitis C virus
  • the object of the present invention is to provide new immunogenic compositions comprising a mixture of particles of subviral envelopes. chimeras between the envelope proteins of hepatitis B virus (HBV, for Hepatitis B virus) and hepatitis C virus (HCV, for Hepatitis C virus).
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • the object of the invention is also the use of these novel immunogenic compositions, as a vaccine, for the prevention and / or the prophylactic and / or therapeutic treatment of hepatitis C and / or of hepatitis B.
  • the invention has the advantage that it can easily be adapted to existing industrial production chains for hepatitis B vaccines currently on the market.
  • the invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • the use of a multivalent mixture of different genotypes of the HCV virus and / or a mixture of the E1 and / or E2 proteins of one or more genotypes makes it possible to induce an immune response. stable and efficient.
  • the immunogenic composition of the invention represents a major advance that can be used, according to various combination strategies, to induce broad neutralizing protection against different genotypes of the HCV virus (ie neutralizing antibody "broad spectrum ') or to provide protection against the prevalence of a particular genotype in a given region.
  • immunogenic composition a composition capable of being administered to humans or animals in order to induce an immune response.
  • Said immune response can be a humoral immune response, ie an immune response which results in the production of neutralizing antibodies by the B lymphocytes, or a cytotoxic cellular immune response, ie an immune response which results in activation of certain cells, in particular antigen presenting cells (for example dendritic cells), T lymphocytes, NK lymphocytes (for “Natural Killer” in English).
  • the immunogenic compositions of the invention are therefore similar to pharmaceutical compositions or to vaccines, which are suitable for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal administration. , transdermal, rectal, intraocular, intraauricular, pulmonary.
  • subviral envelope particles any filamentous or spherical particle resulting from the assembly of the wild-type S protein of the HBV virus. and / or the S protein deleted from its N-terminal transmembrane domain, said particle being devoid of the viral genome, and in particular synthesized and secreted in very large excess, and which can be analyzed by any protocol making it possible to demonstrate the absence nucleotide fragments specific for HBV or HCV viruses, such as in particular, by amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction) previously described, eg:
  • chimeric subviral envelope particle any subviral envelope particle comprising at least the wild-type S protein of the HBV virus and an immunogenic fusion protein mentioned above, and therefore resulting from the self-assembly of wild-type S protein and an aforementioned fusion protein.
  • mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles is meant that this mixture constitutes the active principle of the immunogenic composition of the invention. This comprises a mixture of at least two particles chosen from among six particles A, B, C, D, E and F. In other words, it can be a mixture of two, three, four, five or six. particles, so that the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles is chosen from:
  • this mixture or active principle can be administered via the immunogenic composition of the invention in unit administration form.
  • Said immunogenic composition of the invention in unit administration form can be, for example, a tablet, a capsule, a granule, a powder, an injectable solution or oral suspension, a transdermal patch (patch), a form of sublingual administration, buccal, intratracheal, intraocular, intranasal, intraauricular, by inhalation, a topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous form of administration, a form of rectal administration or an implant.
  • topical administration one can in particular consider creams, gels, ointments, lotions or eye drops.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle is added to the immunogenic composition of the invention.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant a non-toxic material which is compatible with a biological system such as a cell, a cell culture, a cell. animal or human tissue or organism. It is therefore a pharmaceutically appropriate vehicle of which a person skilled in the art will easily determine the nature and the amount to be used as a function of the usual parameters and of the constituents of the immunogenic composition of the invention, of its pharmaceutical form and of the method. administration desired.
  • they may be crystalloid solutes (eg sodium chloride, bicarbonate, glucose), cationic lipids, peptide compounds, surfactants (eg polysorbates).
  • the immunogenic composition of the invention must be sterile, stable under the conditions of manufacture and storage, and must imperatively be preserved from any contamination by microorganisms, such as than bacteria and fungi.
  • the invention relates to the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above, in wherein said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • At least one of said at least two particles exhibiting either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein (B) is meant that the mixture must contain either a particle characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein, i.e. a particle characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above, in which said mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles is chosen from:
  • A, B and F mixing said particles A, C and D; mixing said particles A, C and E; mixing said particles A, C and F; mixing said particles A, D and E; mixing said particles A, D and F; mixing said particles A, E and F; mixing said particles B, C and D; mixing said particles B, C and E; mixing said particles B, C and F; mixing said particles B, D and E; mixing said particles B, D and F; mixing said particles B, E and F; mixing said particles B, E and F;
  • the invention relates to the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above, in wherein said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • the invention relates to the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above.
  • said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • a first polypeptide consisting of: the amino acid sequence of the S protein of a virus isolate human hepatitis B, which protein S is deleted from its transmembrane domain located at its N-terminus; or of an amino acid sequence having a percentage identity of at least 91%, in particular of at least 93%, particularly of at least 95%, and more particularly of at least 97%, with said amino acid sequence of the protein S deleted at the N-terminus, with the proviso that said amino acid sequence retains the capacity to form non-infectious subviral envelope particles, immunogenic with respect to the virus of L 'Hepatitis B ; or the amino acid sequence of a natural variant derived from another isolate of the HBV virus or from a synthetic variant derived from said amino acid sequence of the S protein deleted at the N-terminus, provided that said amino acid sequence retains the ability to form non-infectious sub-viral envelope particles, immunogenic to hepatitis B virus, and # on the N-terminal side,
  • fusion proteins can also be defined as comprising at least:
  • SHBv deleted S protein of HBV deleted consisting essentially of three transmembrane domains located at the C-terminus, wherein said protein S deleted retaining assembly capacity in subviral envelope particles , and retaining the immunogenic properties against the HBV virus;
  • EI HCV 43 E2HCV 43 , E2Hcv 1a , E2Hcv 3a , EI HCV 13 OR EI HCV 33
  • said fusion proteins are capable of assembling into subviral envelope particles, in the presence of wild-type S protein (SHBV), and are capable of inducing immunization against HBV viruses and / or HCV, and in particular to induce a double immunization against the HBV and HCV viruses.
  • SHBV wild-type S protein
  • said immunogenic fusion proteins may be proteins having an amino acid sequence exhibiting a percentage identity of at least 83%, in particular of at least 85%, particularly of at least 90%. %, and more particularly at least 95%, with the amino acid sequence consisting of the S protein deleted from its N-terminal transmembrane domain (SHBv deleted ), from the transmembrane domain and from the ectodomain of an E1 protein or E2 of an isolate of the hepatitis C genotype 1a, 3a or 4a (EI HCV 43 E2HCV 43 E2Hcv 1a, 3a E2Hcv, EI HCV HCV EI 13 oR 33).
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles is chosen from:
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence of particles characterized by the presence:
  • the invention also relates to the immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence of particles characterized by the presence:
  • hepatitis B virus isolate any isolate member of the Hepadnaviridae family and belonging to the genus Orthohepadnavirus, or any isolate classified by the International Committee for the Taxonomy of Viruses (ICTV) as being related to the HBV virus (Schaefer S . Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol. 2007 Jan 7: 13 (1): 14-21).
  • mutant SHBV protein is meant the wild-type S protein of the surface antigen of an isolate of hepatitis B virus, that is to say:
  • the envelope protein of an isolate of the HBV virus comprising in particular 226 amino acids and comprising four transmembrane domains, and in particular the envelope protein of the HBV isolate of serotype adw;
  • the invention relates to the immunogenic composition as described below.
  • said native SHBV protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition as described above, in which said native SHBV protein has the sequence SEQ ID NO: 2, which is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • the latter can, for example, be obtained using the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which comprises the hph gene for resistance to hygromycin and in which the sequence encoding the wild-type S protein (SHBV ) at the level of the unique BamHI GGATCC enzyme restriction site (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector.
  • fusion protein or “fusion protein” is meant any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and the quasi- an entire E1 and / or E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus, the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • immunogenic (fusion) protein any protein, in particular any fusion protein according to the invention as well as any fragment of any fusion protein described here, endowed with antigenic properties and capable of inducing a reaction or a response. immune.
  • a protein is considered to be immunogenic towards HCV and / or HBV, if it induces respectively after immunization an anti-E1, anti-E2 and / or anti-S humoral response, detected for example according to a protocol described:
  • HCV virus Hamed MR, Tarr AW, McClure CP, Bail JK, Hickling TP, Irving WL. Association of antibodies to hepatitis C virus glycoproteins 1 and 2 (anti-E1E2) with HCV disease. J Viral Hepat . 2008 May, 15 (5): 339-45).
  • E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and the quasi- an entire E1 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 4a (EI HCV 43 ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and almost all of an E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 4a (E2Hcv 4a ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminus of the S protein of the HBV virus.
  • deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and almost all of an E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 1a (E2Hcv 1a ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • deleted E2Hcv 3a - SHBv fusion protein any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and almost all of an E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 3a (E2Hcv 3a ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • EI HCV 13 - SHBv fusion protein deleted is understood to mean any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and the quasi- an entire E1 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 1a (EI HCV 13 ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminus of the S protein of the HBV virus.
  • E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted is meant any protein comprising at least the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ), and the quasi- an entire E1 envelope protein of an isolate of the HCV virus genotype 3a (EI HCV 33 ), the transmembrane domain of which replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • a binding peptide links the first and the second polypeptides constituting said aforementioned fusion proteins, said binding peptide consisting of an amino acid, or of two amino acids, or of three amino acids, or of four amino acids, or five amino acids; with the proviso that said immunogenic fusion proteins retain the ability to assemble into subviral envelope particles, in the presence of the wild-type S protein, and that the immunogenic properties vis-à-vis the HCV virus, or the HBV virus , or, HCV and HBV viruses are retained.
  • protein S is deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end” or by “protein S deleted at the N-terminal” or by “SHBv deleted ”, is meant:
  • deleted SHBv is meant the protein of sequence SEQ ID NO: 4, which is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • an underlying aspect of the invention relates to one of the aforesaid fusion proteins (a., b., c. or d.) and / or their mixtures.
  • the subject of the invention is therefore a fusion protein chosen from: a. the E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted , in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 18, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 18 ; b. the deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein, in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 20; vs.
  • the deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 24; and D.
  • the E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 28, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 28 .
  • the subject of the invention is a fusion protein chosen from: a. the E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 18, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G4a E1-S of sequence SEQ ID NO: 32, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the E1 HCV 43 - SHBv protein deleted at the level of the unique BamHI GGATCC enzymatic restriction site (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector; b.
  • the E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 28, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G3a E1-S of sequence SEQ ID NO: 37, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the E1 HCV 33 - SHBv protein deleted at the level of the unique BamHI GGATCC enzymatic restriction site (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector.
  • the subject of the invention is a fusion protein chosen from: a. the E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 18; b. the E2HCV 43 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 20; vs. the E2HCV 33 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 24; and D. the E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted with sequence SEQ ID NO: 28.
  • the term “capacity to form sub-viral envelope particles” is understood to mean the ability of any protein, in particular the S protein of the HBV virus, particularly of the S protein deleted from its N-terminal transmembrane domain, and more particularly of the S protein. 'a fusion protein of the invention comprising the protein S deleted at the N-terminus, to assemble in the presence of the wild-type S protein or, where appropriate, to self-assemble, into sub-envelope particles filamentous or spherical virals; said ability to form subviral envelope particles can at least be demonstrated by observation according in particular to an electron microscopy analysis known to those skilled in the art (International application No. PCT / FR2009 / 051142 filed on June 16, 2009 , here examples 1 and 2).
  • assembly By “assembly”, “to assemble” is meant the capacity of a protein to form subviral envelope particles by associating with the wild-type S protein (SHBV). By “self-assembly” is meant the ability of a protein to form by itself subviral envelope particles.
  • SHBV wild-type S protein
  • HCV virus isolate any isolate member of the Flaviviridae family and belonging to the Hepacivirus genus and consisting of a polyprotein of more than 3000 amino acids of the HCV virus (Choo, Q. L, Kuo, G., Weiner, AJ, Overby, LR, Bradley, DW, and Houghton, M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244 (4902), 359- 362; Choo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) v88: 2451-2455; Han et al.
  • HCV virus genotype identification of the isolate by classification in one of the 7 major genotypes of the HCV virus (numbered 1 to 7, themselves subdivided into subtypes). This classification is based on the nucleotide conservation between the different strains. Isolates sharing 65-70% sequence identity belong to distinct genotypes, while isolates with 75-85% nucleotide conservation are classified into different subtypes within the same genotype (Simmonds, P ., P. Becher, MS Collett, EA Gould, FX Heinz, G. Meyers, T. Monath, A. Pletnev, CM Rice, K. Stiasny, HJ Thiel, A. Weiner, and J. Bukh. 2012. Family Flaviviridae. , pp. 1003-1020. In MQK Andrew, L. Elliot, JA Michael, and EB Carstens (ed.), Virus Taxonomy. Elsevier, San Diego).
  • envelope protein of an isolate of hepatitis C virus is meant virtually all of one of the two proteins E1 and E2, consisting of their ectodomain and their transmembrane domain and corresponding:
  • transmembrane domains of hepatitis C virus envelope proteins is meant:
  • the transmembrane domains of E1 and / or of E2, and constituting a part of the fusion protein are deleted of at least one of the last three amino acids, and in particular of the last three amino acids. , located in the C-terminal position, so that said transmembrane domains deleted from E1 and / or E2 exhibit a percentage identity with the transmembrane domains of wild-type E1 and / or E2, of at least 91%, in which concerns E1 and at least 90% for E2.
  • the E1 HCV 43 , E2HCV 43 , E2Hcv 1a , E2Hcv 3a , EI HCV 13 and E1 HCV 33 proteins are the reference proteins of sequence SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14 and 16, which are respectively encoded by the nucleic acid sequences SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13 and 15.
  • percentage identity is meant the percentage determined by direct comparison of two sequences of polypeptide molecules, by determining the number of identical amino acid residues between the two sequences, then by dividing it by the number of residues of. amino acids of the longer sequence of the two, and multiplying the result by 100.
  • at least 78% is also meant at least 80%, at least 82%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 88%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • this definition applies to all embodiments of the invention.
  • natural variant it is meant any variability, any polymorphism, any diversity, of a DNA sequence, of an allele, or of a protein sequence, between isolates of the same species or of different species. 'the same population.
  • the “percentage of natural variability” is determined by direct comparison of two polypeptide molecules, or polynucleotides, derived from a wild-type reference molecule and endowed with biological properties of interest, such as immunogenic properties and / or the ability to form compounds. subviral envelope particles.
  • the percentage of variability between two sequences is particularly versatile because it depends in particular on the virus considered, the genotype considered, the sequence fragment considered - the region of the ectodomain of the virus HCV, for example, being more variable than the region of the transmembrane domain -, etc.
  • the percentage of variability of the E1 and E2 proteins of HCV is 88% in nucleotides, and 90% in amino acids, between strains of the same genotype.
  • HBV virus being a DNA virus, it is much less variable than the HCV virus (Zhang M, Gaschen B, Blay W, Foley B, Haigwood N, Kuiken C, Korber B. Tracking global patterns of N- linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin. Glycobiology. 2004 Dec. 14 (12): 1229-46).
  • synthetic variant reference is made to any polypeptide molecule, or polynucleotide according to the invention, or any fragment of a polypeptide molecule, or polynucleotide described here, derived by recombination of a wild-type reference molecule, or by addition, deletion , substitution, for said wild-type reference molecule, with the proviso that it retains the biological properties of interest, such as immunogenic properties and / or the capacity to form subviral envelope particles.
  • the “percentage of synthetic variability” is determined by direct comparison of said molecule derived from said wild-type reference molecule, and by determining the exact number of amino acid residues, or nucleic acids, identical between the two sequences, with regard to their position and nature, then dividing them by the number of amino acid residues, or nucleic acids, of the longer sequence of the two, and multiplying the result by 100.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which:
  • said deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 18, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 18;
  • said deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 20;
  • said deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 22, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 22;
  • said deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 24;
  • said deleted EI HCV 13 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 26, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 26; and
  • said deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 28, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 28.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which:
  • said deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 18, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G4a E1-S of sequence SEQ ID NO: 32, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the E1 HCV 43 - SHBv protein deleted at the level of the unique enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the site of multi- cloning of the vector;
  • said deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 20, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G4a E2-S of sequence SEQ ID NO: 33, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the protein E2HCV 43 - SHBv deleted at the level of the unique enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector;
  • said deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 22, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G1a E2-S of sequence SEQ ID NO: 34, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the protein E2HCV 13 - SHBv deleted at the level of the unique enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of vector;
  • said deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 24, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G3a E2-S of sequence SEQ ID NO: 35, which comprises the pac gene of resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the protein E2Hcv 3a - SHBv deleted at the level of the single enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector;
  • said deleted EI HCV 13 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 26, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G1a E1-S of sequence SEQ ID NO: 36, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the EI HCV 13 - SHBv protein deleted at the level of the unique enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the site of multi- cloning of the vector; and
  • said deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein is of sequence SEQ ID NO: 28, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G3a E1-S of sequence SEQ ID NO: 37, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the E1 HCV 33 - SHBv protein deleted at the level of the unique enzymatic restriction site BamHI GGATCC (SEQ ID NO: 38) located in the site of multi- vector cloning.
  • the invention also relates to the immunogenic composition as described above, in which:
  • said deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 18, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 18;
  • said deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 20;
  • said deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 22, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 22;
  • said deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein is chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 24.
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition as described above, in which:
  • Said fusion protein # E2HCV 43 - S HB v deleted sequence is SEQ ID NO: 20;
  • Said fusion protein # E2HCV 13 - S HB v deleted sequence is SEQ ID NO: 22;
  • Said fusion protein # E2HCV 33 - S HB v deleted sequence is SEQ ID NO: 24.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of sub-viral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above, in wherein said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • a native SHBV protein chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 2 and a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 20;
  • a native S HBV protein chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 2 and of a deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein chosen from sequences having at least 80% d identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 24;
  • a native SHBV protein chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 2 and a E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 28, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 28. preferably, at least one of said at least two particles exhibiting either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein (B).
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized:
  • said aforementioned immunogenic fusion proteins in particular those of sequences SEQ ID NOs: 18 (EI HCV 43 ), 20 (E2Hcv 4a ), 22 (E2Hcv 1a ), 24 (E2hicv 3a ), 26 (EI HCV 13) ) and 28 (EI HCV 33 ), comprise at their N-terminal end a transfer initiation peptide (PIT) of an isolate of hepatitis C virus (eg of genotype 1a, 3a or 4a).
  • transfer initiation peptide of an E1 or E2 protein (respectively PIT1 and PIT2) or of a fusion protein according to the invention is meant:
  • any peptide fragment grafted at the N-terminal of said second polypeptide provided that said peptide fragment, when it constitutes part of the fusion protein, retains the ability to address, after translation, said fusion protein to the endoplasmic reticulum so that it is correctly glycosylated and that its three-dimensional conformation, and / or its antigenic qualities, are at best preserved with regard to proteins wild.
  • these transfer initiation peptides can be interchanged (eg PIT1 4a at the N-terminal of the E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted can be replaced by PIT1 1a , PIT1 3a , PIT2 1a , etc.; PIT2 4a in N -terminal of the deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein can be replaced by PIT1 1a , PIT1 3a , PIT2 1a , etc .; ETC.).
  • these transfer initiation peptides can be replaced by other PITs originating eg from an isolate of the HCV virus of genotype 2, 5, 6 or 7, or even replaced by peptides of viral, bacterial or eukaryotic origin with the proviso that all of these peptides, when they constitute part of the fusion protein, retain the ability to address, after translation, said fusion protein to the endoplasmic reticulum so that it is correctly glycosylated and that its three-dimensional conformation, and / or that its antigenic qualities are at best preserved with regard to wild proteins.
  • said E1 or E2 components N-terminal side of said fusion proteins of the invention are defined as being:
  • amino acid sequence exhibiting a percentage identity of at least 78% with said amino acid sequence of the transmembrane domain and of the ectodomain of an envelope protein of an isolate of the virus of the hepatitis C, with the proviso that said amino acid sequence retains the ability to form non-infectious subviral envelope particles, immunogenic with respect to the hepatitis C virus;
  • said envelope protein of an isolate of hepatitis C virus being chosen from the E1 protein of the HCV virus of genotype 4a, the E2 protein of the HCV virus of genotype 4a, the E2 protein of the HCV virus of genotype 1a, the E2 protein of the HCV virus of genotype 3a, the E1 protein of the HCV virus of genotype 1a and the E1 protein of the HCV virus of genotype 3a. It is also because of this flexibility at the N-terminal end that the fusion proteins of the invention are defined as being:
  • a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 28, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 28. so as to include preferentially, by means of the percentage identity, this flexibility at the level of the PIT peptide fragment at the N-terminal end of said fusion proteins.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said fusion proteins comprise at the N-terminal end of said second polypeptide E1 or E2 (eg E1 HCV 43 , E2HCV 43 , E2Hcv 1 a , E2HCV 33 , EI HCV 13 OR EI HCV 33 ), a third peptide consisting of the amino acid sequence of a transfer initiation peptide (PIT) of a virus isolate hepatitis C (eg genotype 1a, 3a or 4a).
  • E1 HCV 43 eg E1 HCV 43 , E2HCV 43 , E2Hcv 1 a , E2HCV 33 , EI HCV 13 OR EI HCV 33
  • PIT transfer initiation peptide
  • said third peptide is a peptide chosen from: PIT1 4a of sequence SEQ ID NO: 40, PIT2 4a of sequence SEQ ID NO: 42, PIT2 1a of sequence SEQ ID NO: 44, PIT2 3a of sequence SEQ ID NO: 46, PIT1 1a of sequence SEQ ID NO: 48, PIT1 3a of sequence SEQ ID NO: 50 and the sequences having at least 80% identity with the sequences SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 48 and 50 .
  • an immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from the particles characterized by the presence:
  • said native SHBV protein being the wild-type S protein of the surface antigen of a hepatitis B virus isolate ( HBV), and said fusion proteins PIT - E1 HCV 43 - SHBv deleted , PIT - E2HCV 43 - SHBv deleted , PIT - E2 H cv 1 a - S Bv deleted , PIT - E2 H cv 3a - S Bv deleted , PIT - E1 H cv 1 a - S B v deleted and PIT - E1 HCV 33 - SHBv deleted being immunogenic fusion proteins comprising from the N-terminus to the C-term inal at least the following three (poly) peptides:
  • transfer initiation peptide consisting of: a sequence chosen from: PIT1 4a of sequence SEQ ID NO: 40, PIT2 4a of sequence SEQ ID NO: 42, PIT2 1a of sequence SEQ ID NO: 44, PIT2 3a of sequence SEQ ID NO: 46, PIT1 1a of sequence SEQ ID NO: 48, PIT1 3a of sequence SEQ ID NO: 50 and the sequences having at least 80% identity with the sequences SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 48 and 50; or a PIT peptide fragment originating from an isolate of the HCV virus of genotype 2, 5, 6 or 7; or a peptide fragment of viral, bacterial or eukaryotic origin similar (equivalent) to a transfer initiation peptide provided that all of these peptides, when they constitute part of the fusion protein, retain the capacity in addressing, after translation, said fusion protein to the endoplasmic reticulum so that it is correctly
  • a second polypeptide consisting of: the amino acid sequence of the transmembrane domain and of the ectodomain of an envelope protein of an isolate of hepatitis C virus (HCV); or of an amino acid sequence having a percentage identity of at least 78%, in particular of at least 80%, particularly of at least 85%, and more particularly of at least 90%, with said amino acid sequence of the transmembrane domain and the ectodomain of an envelope protein of an isolate of hepatitis C virus, provided that said amino acid sequence retains the ability to form particles of non-infectious sub-viral envelope, immunogenic against hepatitis C virus; or of the amino acid sequence of a natural variant derived from an isolate of the HCV virus, or of a synthetic variant derived from said amino acid sequence of the transmembrane domain and of the ectodomain of a protein of envelope of an isolate of hepatitis C virus, provided that said amino acid sequence retains immunogenic properties against hepatitis C virus, said envelope protein of
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above, wherein said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition
  • the immunogenic composition comprising a mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle as described above, wherein said mixture is characterized by the presence of at least two particles chosen from particles characterized by the presence:
  • the subject of the invention is also the immunogenic composition as described above, said first peptide, called transfer initiation peptide (PIT), said fusion proteins being a peptide chosen from: PIT1 4a of sequence SEQ ID NO: 40, PIT2 4a of sequence SEQ ID NO: 42, PIT2 1a of sequence SEQ ID NO: 44, PIT2 3a of sequence SEQ ID NO: 46, PIT1 1a of sequence SEQ ID NO: 48, PIT1 3a of sequence SEQ ID NO: 50 and the sequences having at least 80% identity with the sequences SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 48 and 50.
  • PIT transfer initiation peptide
  • said fusion proteins are in particular:
  • Protein fusion PIT2 4a - E2HCV 43 - SHBv deleted chosen from the sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 20 and is preferably the sequence SEQ ID NO: 20;
  • Protein fusion PIT2 1a - E2HCV 13 - SHBv deleted chosen from the sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 22, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 22 and is preferably the sequence SEQ ID NO: 22;
  • Protein fusion PIT2 3a - E2HCV 33 - SHBv deleted chosen from the sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 24 and is preferably the sequence SEQ ID NO: 24;
  • fusion proteins have never been described in the prior art. These are: a. of the fusion protein PIT1 4a - E1 HCV 43 - SHBv deleted; b. of the fusion protein PIT2 4a - E2HCV 43 - SHBv deleted; vs. of the fusion protein PIT2 3a - E2HCV 33 - SHBv deleted; and D. of the PIT 1 3a - E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted
  • fusion protein chosen from: a. the PIT1 4a - E1 HCV 43 - S HB v fusion protein deleted , in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 18, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 18; b.
  • the PIT2 4a - E2HCV 43 - SHBv fusion protein deleted in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 20, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO : 20; vs. the PIT2 3a - E2HCV 33 - SHBv fusion protein deleted , in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 24, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO : 24; and D.
  • the fusion protein PIT1 3a - E1 HCV 33 - S HB v deleted in particular that chosen from sequences having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 28, preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 28.
  • the subject of the invention is a fusion protein chosen from: a. the PIT1 4a - E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted with sequence SEQ ID NO: 18, which can, for example, be obtained using the plasmid pHR'pac-G4a E1-S of sequence SEQ ID NO: 32, which comprises the pac gene for resistance to puromycin and in which has been cloned the sequence encoding the E1 HCV 43 protein - SHBv deleted at the level of the unique BamHI GGATCC enzymatic restriction site (SEQ ID NO: 38) located in the multi-cloning site of the vector; b.
  • the subject of the invention is a fusion protein chosen from: a. the PIT1 4a - E1 HCV 43 - SHBv fusion protein deleted with the sequence SEQ ID NO: 18; b. the PIT2 4a - E2HCV 43 - SHBv fusion protein deleted with the sequence SEQ ID NO: 20; vs. the PIT2 3a - E2HCV 33 - SHBv fusion protein deleted with the sequence SEQ ID NO: 24; and d. the PIT1 3a - E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted with the sequence SEQ ID NO: 28.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, said composition comprising from 5 pg to 50 pg, preferably from 10 pg to 20 pg, of said mixture of envelope particles under - viral, chimeric, immunogenic and non-infectious.
  • this whether it is a unit dose or not, can be comprised from 10 pg to 50 pg, from 15 g to 50 pg, from 20 pg to 50 pg, from 25 pg to 50 pg, from 30 pg to 50 pg, 35 pg to 50 pg, 40 pg to 50 pg, 45 pg to 50 pg, 5 pg to 10 pg, 5 pg to 15 pg, 5 pg to 20 pg, 5 pg to 25 pg, 5 pg to 30 pg, 5 pg to 35 pg, 5 pg to 40 pg, 5 pg to 45 pg, 10 pg to 20 pg, 20 pg to 30 pg, 30 pg to 40 pg, from 40 pg to 50 pg, this applying to all aspects or embodiments of the invention.
  • It can also be 5 pg, 10 pg, 15 pg, 20 pg, 25 pg, 30 pg, 35 pg, 40 pg, 45 pg or 50 pg, this being applicable to all aspects or embodiments of the invention.
  • the mixture can comprise either an equal proportion / amount of each subviral envelope particle, or a different proportion / amount of each subviral envelope particle, the sum of the proportions / amounts of which is from 5 ⁇ g to 50 pg.
  • equal amount / proportion it is meant that each subviral envelope particle is in the same amount / proportion, applying to all aspects or embodiments of the invention. For example, for a mixture of 30 ⁇ g, this may include:
  • each subviral envelope particle is in a separate amount / proportion from the others, applying to all aspects or embodiments of the invention. For example, for a mixture of 30 ⁇ g, this may include:
  • the mixture comprises at least three sub-viral envelope particles, for some, they can be mixed in an equal quantity / proportion and for the others, they can be mixed in a different quantity / proportion or in an equal quantity / proportion. but different from the aforesaid first quantity / equal proportion, this applying to all aspects or embodiments of the invention.
  • this may include:
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, said composition being formulated to be administered by one of the following routes: sublingual, buccal, intratracheal, intraocular, intra- nasal, pulmonary, intra-auricular, parenteral, rectal, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous.
  • said composition is formulated to be administered by one of the following routes: subcutaneous, intramuscular or intravenous.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, said composition further comprising an adjuvant.
  • adjuvant is meant a product added to another (here, the mixture of sub-viral envelope particles) to enhance or supplement its action. It is therefore a pharmacological or immunological agent which modifies the effect of other agents.
  • these can be added to a vaccine to stimulate the immune response to produce more antibodies and longer lasting immunity, thus minimizing the dose of antigen needed.
  • it can be chosen from:
  • adjuvants based on oil-in-water or water-in-oil emulsions e.g. squalene type, MF59;
  • adjuvants based on mineral salts e.g. aluminum hydroxide and phosphate, calcium phosphate
  • microbial-derived adjuvants ie.g. lipopolysaccharide type, CpG, flagellin, etc.
  • the latter relates to the cell lines which produce the chimeric, immunogenic and chimeric subviral envelope particles. non-infectious substances of the invention, which make it possible, among other things, to purify them and to prepare the mixture (ie the active principle) of the immunogenic composition of the invention described above.
  • yeasts such as those of the following families: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis and Kluveromyces lactis being preferred; and bacteria, such as E. coli and those of the following families: Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus and Streptomyces.
  • eukaryotic cells which are suitable for the purposes of the invention, there may be mentioned cells from animals such as mammals, reptiles, insects and the like.
  • Preferred eukaryotic cells are cells from Chinese hamster (CHO cells), monkey (COS and Vero cells), dwarf hamster kidney (BHK cells), pig kidney (PK 15 cells), and rabbit kidney ( RK13 cells, human osteosarcoma cell lines (143 B cells), human HeLa cell lines and human hepatoma cell lines (such as Hep G2 cells), as well as insect cell lines (e.g. of Spodoptera frugiperda).
  • the Chinese hamster ovary line named CHO is chosen (Michel ML, Pontisso P, Sobczak E, Malpièce Y, Streeck RE, Tiollais P. Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particles carrying a receptor for polymerized human serum albumin Proc Natl Acad Sci US A. 1984 Dec; 81 (24): 7708-12); or the yeast Saccharomyces cerevisae; or the newborn hamster kidney cell line (BHK), in particular the newborn hamster kidney cell line (BHK-21) (Goldman RD, Follett EA. Birefringent filamentous organelle in BHK-21 cells and its possible role in cell spreading and motility. Science. 1970 Jul 17; 169 (942): 286-8).
  • the above cell lines are manipulated, transduced, cultured, etc. by techniques known to those skilled in the art and thus make it possible to produce and purify each of the envelope particles under- virals of the invention described above.
  • the invention comprises a method of producing the aforementioned non-infectious, immunogenic chimeric sub-viral envelope particles from an aforementioned cell line, comprising the steps following: i. a step of transducing cells of the cell line with a lentiviral vector comprising a nucleic acid sequence encoding the wild-type S protein (SHBV) of an isolate of hepatitis B virus; ii.
  • SHBV wild-type S protein
  • the cell line eg. CHO
  • the cell line transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2
  • the cell line eg CHO
  • the cell line transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2
  • the cell line eg CHO
  • the cell line transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2
  • over-transduced with the plasmid pHR'pac-G1a E2-S of sequence SEQ ID NO: 34 which codes for the E2 H cv 1a - S B v fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 22, said cell line allowing to produce and purify the sub-viral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein;
  • the cell line (eg CHO) transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2; and over-transduced with the plasmid pHR'pac-G3a E2-S of sequence SEQ ID NO: 35, which codes for the deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein of sequence SEQ ID NO: 24, said cell line making it possible to produce and purify the sub-viral envelope particles characterized by the presence of a native protein SHBV and a deleted E2Hcv 3a - SHBv fusion protein;
  • the cell line eg CHO
  • the cell line eg. CHO
  • the cell line transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2
  • the cell line (eg CHO) transduced with the plasmid pHR'hph-S of sequence SEQ ID NO: 30, which codes for the wild-type S protein (SHBV) of sequence SEQ ID NO: 2; and over-transduced with the plasmid pHR'pac-G3a E1-S of sequence SEQ ID NO: 37, which codes for the E1 HCV 33 - SHBv fusion protein deleted of sequence SEQ ID NO: 28, said cell line making it possible to produce and to purify the sub-viral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein
  • a third aspect of the invention relates to a method for preparing the immunogenic composition of the invention.
  • the subject of the latter is a method for preparing the immunogenic composition as described above comprising at least the following steps: i. optionally, a step of producing at least two cell lines chosen from: a. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein; b. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein; vs.
  • a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein d. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2Hcv 3a - SHBv fusion protein; e. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted EI HCV 13 - SHBv fusion protein; and F. a cell line capable of secreting sub-viral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein,
  • a step of culturing said at least two cell lines of interest for the production of the aforementioned chimeric, immunogenic, immunogenic subviral envelope particles of interest (/.e. particles A, B, C, D, E or F); iii. a step of purifying the subviral envelope particles of interest from the culture medium collected (centrifugation, ultracentrifugation on gradients, collection of fractions positive for the chimeric subviral envelope particles, dialysis) to obtain a solution each of said subviral envelope particles of interest; and iv. optionally, a step of mixing said solutions of each of said subviral envelope particles of interest to obtain the immunogenic composition as described above.
  • the subject of the invention is the preparation method as defined above comprising at least the following steps: i. optionally, a step of producing at least two cell lines chosen from: a. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein; b. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein; vs. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein; d.
  • a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2Hcv 3a - SHBv fusion protein e. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 13 - SHBv fusion protein
  • F a cell line capable of secreting sub-viral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein
  • At least one of said at least two cell lines secreting a fusion protein is HCV E1 43 - SHBv deleted or a fusion protein E2HCV 43 - S HB v deleted; ii. a step of culturing said at least two cell lines of interest for the production of the aforementioned non-infectious, immunogenic, non-infectious sub-viral envelope particles of interest (/.e. particles A and / or B, and / or C , Crazy) ; iii.
  • a step of purifying the subviral envelope particles of interest from the culture medium collected centrrifugation, ultracentrifugation on gradients, collection of fractions positive for the chimeric subviral envelope particles, dialysis) to obtain a solution each of said subviral envelope particles of interest; and iv. optionally, a step of mixing said solutions of each of said subviral envelope particles of interest to obtain the immunogenic composition as described above.
  • the subject of the invention is the preparation method as defined above comprising at least the following steps: i. optionally, a step of producing at least two cell lines chosen from: To. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein; b. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein; vs. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein; and D. a cell line capable of secreting subviral envelope particles characterized by the presence of a native SHBV protein and of a deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein;
  • a fusion protein secreting a fusion protein is HCV E1 43 - SHBv deleted or a fusion protein E2HCV 43 - S HB v deleted ; ii. a step of culturing said at least two cell lines of interest for the production of the aforementioned chimeric, immunogenic, immunogenic subviral envelope particles of interest (ie particles A and / or B, and / or C and / or D); iii.
  • a step of purifying the subviral envelope particles of interest from the culture medium collected centrrifugation, ultracentrifugation on gradients, collection of fractions positive for the chimeric subviral envelope particles, dialysis) to obtain a solution each of said subviral envelope particles of interest; and iv. optionally, a step of mixing said solutions of each of said subviral envelope particles of interest to obtain the immunogenic composition as described above.
  • the subject of the invention is the preparation method as defined above comprising said step i.
  • the subject of the invention is the preparation method as defined above comprising said step iv.
  • the subject of the invention is the preparation method as defined above comprising said steps i and iv.
  • step iv it should be noted that the production of the mixture of said at least two subviral envelope particles of interest (ie at least two chosen from six, or at least two chosen from among six of which at least one is A or B, or at least two chosen from among four of which at least one is A or B) can be made:
  • step iv makes it possible, among other things, to allow the preparation of a so-called kit-of-parts composition.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from the particles characterized by the presence:
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition as described above comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from particles characterized by the presence:
  • a subject of the invention is also the immunogenic composition as described above comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from the particles characterized by the presence:
  • A deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein
  • B protein E2HCV 43 - deleted SHBv fusion
  • kit-of-parts is meant that said preparations each containing one of the particles A, B, C, D, E or F are physically separated via for example the use of ampoules, vials or bags. separate infusion sets. These preparations can then be used simultaneously, for example, the patient is placed under infusion and upstream of the injection needle at least two infusion bags (eg preparation A and preparation B) are connected thereto. They can also be used separately in time, for example, the patient is placed at time t under an infusion with an infusion bag containing, eg, preparation A and at time t '(a few days / weeks / months later), this same patient is placed under an infusion with another infusion bag containing this time, eg, preparation B.
  • the invention can provide up to six preparations (A, B, C, D, E and F), it is understood that it is possible via the kit-of-parts to combine a mode of simultaneous administration and a mode of sequential administration thereof. Indeed, the mixing of preparations A, B, C, D, E and F not being mandatory (see above), it is possible to store each of its preparations in separate bottles and to use them separately or in mixed. In doing so, it is possible to administer / inject each of these preparations to the patient separately (or as a mixture) via a syringe.
  • this patient is injected with preparation B at using a syringe from which a dose of preparation B has been withdrawn.
  • this patient is injected with preparation B at using a syringe from which a dose of preparation B has been withdrawn.
  • at time t are injected into the patient preparations A and B using two syringes in which have been respectively taken a dose of preparation A and a dose of preparation B, then at time t ', is injected to this patient the preparation C using a syringe from which has been taken a dose of the preparation C.
  • preparations A and B can be mixed beforehand if necessary and that according to the needs of the practitioner it is possible to combine the above in abundance (eg injection of A then B then C, injection of A and B then C, injection of A then of B and C, injection of C then of A and B, injection of B and C then injection of A etc. ; this is also valid with preparations D, E and F).
  • the above can be considered with another mode of administration, such as the use of an infusion bag.
  • the patient is placed at time t under an infusion with at least two infusion bags containing, eg, for one of them preparation A and for the other preparation.
  • this same patient is placed under an infusion with another infusion bag containing, this time, eg, preparation C.
  • the subject of the invention is an immunogenic composition
  • a mixture of nucleic acids in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a nucleic acid encoding a protein.
  • native SHBV and at least two nucleic acids chosen from:
  • the subject of the invention is an immunogenic composition
  • a mixture of nucleic acids in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a nucleic acid encoding a native protein SHBV and at least two nucleic acids chosen from:
  • nucleic acid encoding a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein, at least one of said at least two nucleic acids encoding either a deleted EI HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein (B).
  • the subject of the invention is an immunogenic composition
  • a mixture of nucleic acids in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a nucleic acid encoding a native protein SHBV and at least two nucleic acids chosen from:
  • a nucleic acid encoding a deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein at least one of said at least two nucleic acids encoding either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein ( B).
  • the subject of the invention is an immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence:
  • the subject of the invention is an immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence:
  • nucleic acid encoding a native SHBV protein is meant a nucleic acid sequence encoding the wild-type S protein of the surface antigen of an isolate of hepatitis B virus as defined above. In particular, it is a nucleic acid chosen from the sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 1 (encoding the native protein SHBV of sequence SEQ ID NO: 2), preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 1. In particular, it is a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 1.
  • percentage of homology is meant the percentage determined by direct comparison of two sequences of polynucleotide molecules, by determining the number of identical nucleic acid residues between the two sequences, then by dividing it by the number of residues of. nucleic acids of the longer sequence of the two, and multiplying the result by 100.
  • at least 78% is also meant at least 80%, at least 82%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 88%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • this definition applies to all embodiments of the invention.
  • nucleic acid encoding a fusion protein is meant a nucleic acid sequence encoding a fusion protein (eg. E1 HCV 43 - SHBv deleted , E2HCV 43 - SHBv deleted , E2 H cv 1a - S B v deleted , E2 H cv 3a - S B v deleted , E1 H cv 1a - S B v deleted and E1 H cv 3a - S B v deleted ) as defined above.
  • a fusion protein eg. E1 HCV 43 - SHBv deleted , E2HCV 43 - SHBv deleted , E2 H cv 1a - S B v deleted , E2 H cv 3a - S B v deleted , E1 H cv 1a - S B v deleted and E1 H cv 3a - S B v deleted
  • the latter comprises at least two sequences, one on the 3 'side encoding the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end of an isolate of the HBV virus (SHBv deleted ) and the other 5 'side encoding almost all of an E1 or E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 4a, 1a or 3a (EI HCV 43 , E2HCV 43 , E2HCV 13 , E2hicv 3a , EI HCV 13 and EI HCV 33 ), whose transmembrane domain replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus.
  • substantially all is meant at least the transmembrane domain and the ectodomain of an E1 or E2 envelope protein of an isolate of hepatitis C virus (HCV).
  • HCV hepatitis C virus
  • nucleic acid sequence encoding the S protein deleted from its transmembrane domain located at its N-terminal end, of an isolate of the hepatitis B virus;
  • nucleic acid sequence having a homology of at least 91%, in particular of at least 93%, particularly of at least 95%, and more particularly of at least 97% with said sequence of acids nucleic acid of the N-terminally deleted protein S, with the proviso that the protein encoded by said nucleic acid sequence retains the capacity to form non-infectious subviral particles, immunogenic with respect to the hepatitis B virus ; or of the nucleic acid sequence of a natural variant derived from another isolate of the HBV virus, or of a synthetic variant, derived from a nucleic acid sequence of said S protein deleted at the N-terminus, under provided that the protein encoded by said nucleic acid sequence retains the ability to form non-infectious subviral particles, immunogenic against hepatitis
  • a second sequence of nucleic acids encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one envelope protein of an isolate of the hepatitis C virus or of a nucleic acid sequence having a homology of at least 78%, in particular of at least 80%, particularly of at least 85%, and more particularly of at least 90%, with said sequence of nucleic acids encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one coat protein of an isolate of hepatitis C virus, provided that the protein encoded by said nucleic acid sequence retains the immunogenic properties vis -to the hepatitis C virus; or the nucleic acid sequence of a natural variant derived from an isolate of the HCV virus, or from a synthetic variant, derived from said nucleic acid sequence encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least an envelope protein of an isolate of hepatitis C virus, provided that the protein encoded
  • the subject of the invention is therefore the immunogenic composition as described above comprising a mixture of nucleic acids in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a nucleic acid encoding a native SHBV protein and at least two nucleic acids chosen from:
  • a nucleic acid encoding a deleted E2HCV 33 - SHBv fusion protein at least one of said at least two nucleic acids encoding either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein ( B), said native SHBV protein being the wild-type S protein of the surface antigen of an isolate of hepatitis B virus (HBV), and said E1 HCV 43 - SHBv fusion proteins deleted , E2HCV 43 - SHBv deleted , E2HCV 13 - deleted SHBv and E2HCV 33 - deleted SHBv being immunogenic fusion proteins each encoded by a nucleic acid comprising at least the following two sequences:
  • a second sequence of nucleic acids encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one envelope protein of an isolate of the hepatitis C virus or of a nucleic acid sequence having a homology of at least 78%, in particular of at least 80%, particularly of at least 85%, and more particularly of at least 90%, with said sequence of nucleic acids encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one coat protein of an isolate of hepatitis C virus, provided that the protein encoded by said nucleic acid sequence retains the immunogenic properties vis -to the hepatitis C virus; or the nucleic acid sequence of a natural variant derived from an isolate of the HCV virus, or from a synthetic variant, derived from said nucleic acid sequence encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least an envelope protein of an isolate of hepatitis C virus, with the proviso that
  • said nucleic acid encoding a fusion protein also comprises a sequence encoding a transfer initiation peptide (PIT) as defined above. That is, it comprises at least three sequences, which, from the 5 'end to the 3' end, are:
  • # a sequence encoding a transfer initiation peptide eg. PIT1 1a , PIT1 3a , PIT1 4a , PIT2 1a , PIT2 3a or PIT2 4a );
  • EI HCV 43 a sequence encoding almost all of an E1 or E2 envelope protein of an isolate of the HCV virus of genotype 4a, 1a or 3a (EI HCV 43 , E2HCV 43 , E2Hcv 1a , E2Hcv 3a , EI HCV 13 and EI HCV 33 ), whose transmembrane domain replaces that deleted at the N-terminal of the S protein of the HBV virus;
  • nucleic acid encoding a fusion protein defined above, comprising at least the following three nucleic acid sequences:
  • a second nucleic acid sequence encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one envelope protein of an isolate of hepatitis C virus; or of a nucleic acid sequence having a homology of at least 78%, in particular of at least 80%, particularly of at least 85%, and more particularly of at least 90%, with said sequence of nucleic acids encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least one coat protein of an isolate of hepatitis C virus, provided that the protein encoded by said nucleic acid sequence retains the immunogenic properties vis -to the hepatitis C virus; or the nucleic acid sequence of a natural variant derived from an isolate of the HCV virus, or from a synthetic variant, derived from said nucleic acid sequence encoding the transmembrane domain and the ectodomain of at least an envelope protein of an isolate of hepatitis C virus, with the proviso that the protein
  • a third nucleic acid sequence encoding a transfer initiation peptide of an envelope protein from an isolate of hepatitis C virus (PIT); or a nucleic acid sequence of a natural variant derived from an isolate of the HCV virus, or from a synthetic variant, derived from said the nucleic acid sequence of the protein encoding a peptide transfer initiation (PIT), provided that the transfer initiation peptide encoded by said nucleic acid sequence retains the ability to address, after translation, said fusion protein to the endoplasmic reticulum so that it is correctly glycosylated and that its three-dimensional conformation presents as little alteration as possible, and / or that its antigenic qualities are best preserved with regard to wild proteins; or any nucleic acid sequence encoding a peptide capable of addressing, after translation, said fusion protein to the endoplasmic reticulum so that it is correctly glycosylated and that its three-dimensional conformation presents as few alterations
  • a sequence of nucleic acids encoding a binding peptide connects the first and the second nucleic acid constituting said aforementioned fusion proteins, said sequence of nucleic acids encoding a binding peptide consisting of 3 nucleic acids, or of 6 acids.
  • nucleic acids or 9 nucleic acids, or 12 nucleic acids, or 15 nucleic acids, or any nucleotide sequence encoding any binding peptide; with the proviso that said immunogenic fusion proteins encoded by said nucleic acid sequences and which comprise said binding peptide retain the ability to assemble into subviral envelope particles, in the presence of the wild-type S protein, and that the immunogenic properties vis-à-vis the HCV virus, or the HBV virus, or, the HCV and HBV viruses are retained.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said at least two acids nucleic acids encoding a fusion protein are chosen from:
  • E1 HCV 43 - SHBv fusion protein also called PIT1 4a - E1 HCV 43 - deleted SHBv
  • PIT1 4a - E1 HCV 43 - deleted SHBv chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 17, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 17;
  • E2HCV 43 - SHBv fusion protein also called PIT2 4a - E2HCV 43 - deleted SHBv
  • PIT2 4a - E2HCV 43 - deleted SHBv chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 19, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 19;
  • E2HCV 13 - SHBv fusion protein also called PIT2 1a - E2HCV 13 - deleted SHBv
  • PIT2 1a - E2HCV 13 - deleted SHBv chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 21, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 21;
  • E2HCV 33 - SHBv fusion protein also called PIT2 3a - E1 HCV 33 - deleted SHBv
  • PIT2 3a - E1 HCV 33 - deleted SHBv chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 23, of preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 23;
  • EI HCV 13 - SHBv fusion protein also called PIT1 1a - EI HCV 13 - deleted SHBv
  • PIT1 1a - EI HCV 13 - deleted SHBv chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 25, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 25;
  • nucleic acid encoding a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein (also called PIT1 3a - E1 HCV 33 - deleted SHBv) chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 27, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 27.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above, in which said at least two nucleic acids encoding a fusion protein are chosen from:
  • the invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising a mixture of nucleic acids in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence:
  • # of a nucleic acid encoding a native SHBV protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 1, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 1, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid encoding a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 19, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO : 19, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 19;
  • C a nucleic acid encoding a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 21, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO : 21, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 21; and D.
  • nucleic acid encoding a deleted E2 H cv 3a - S HB v fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 23, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 23, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 23, at least one of said at least two nucleic acids encoding either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or an E2HCV 43 fusion protein - SHBv deleted (B).
  • the subject of the invention is an immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence:
  • # of a nucleic acid encoding a native SHBV protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 1, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 1, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid encoding a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 17, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 17, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 17;
  • # of a nucleic acid encoding a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 19, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 19, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 19.
  • the subject of the invention is an immunogenic composition as described above, in which said mixture is characterized by the presence:
  • # of a nucleic acid encoding a native SHBV protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 1, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 1, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid encoding a deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein chosen from sequences having at least 80% homology with the sequence SEQ ID NO: 19, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 19, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 19;
  • nucleic acid encoding a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 21, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 21, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 21;
  • # of a nucleic acid encoding a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein chosen from sequences having a homology of at least 80% with the sequence SEQ ID NO: 23, preferably at least 90% with the sequence SEQ ID NO: 23, and is preferably of sequence SEQ ID NO: 23.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above comprising not only the mixture of said nucleic acids but also the vectors comprising at least said nucleic acids and the means necessary for the expression of proteins (ie native S protein and the fusion proteins as defined above) encoded by the latter, said means being operably linked thereto.
  • expression vectors which are suitable for the purposes of the invention, mention may be made, for example, of plasmids, lentiviral type viral vectors, Semliki, adenoviruses, poxviruses, vaccinia virus, baculovirus, bacterial vectors of the salmonella type, BCG.
  • a protein By “means necessary for the expression” of a protein (the term protein being used for any amino acid molecule, such as protein, fusion protein, protein fragment, peptide, polyprotein, polypeptide, etc.), we means any means which make it possible to obtain the protein, such as in particular a promoter, a transcription terminator, an origin of replication and preferably a selection marker.
  • the latter can be homologous means, that is to say included in the genome of the vector used, or else be heterologous. In the latter case, said means are cloned with the protein of interest to be expressed.
  • the means necessary for the expression of a protein are operably linked to the nucleic acid sequence encoding the (poly) peptide of interest.
  • the elements necessary for expression and those of the gene (nucleic acid) encoding the protein of interest are juxtaposed separately or contiguously and are related so that the gene can be correctly transcribed by machinery cellular.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above comprising a mixture of vectors in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a coding vector.
  • the invention also relates to the immunogenic composition as described above comprising a mixture of vectors in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a vector encoding a native SHBV protein of sequence SEQ ID NO: 30 (plasmid pHR '/ ip / iS) and at least two vectors chosen from:
  • E a vector encoding a deleted EI HCV 13 - SHBv fusion protein of sequence SEQ ID NO: 36 (plasmid pHR'pac-G1a E1-S);
  • the invention also relates to the immunogenic composition as described above comprising a mixture of vectors in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a vector encoding a native SHBV protein of sequence SEQ ID NO: 30 (plasmid pHR '/ ip / iS) and at least two vectors chosen from:
  • E a vector encoding a deleted EI HCV 13 - SHBv fusion protein of sequence SEQ ID NO: 36 (plasmid pHR'pac-G1a E1-S);
  • a vector encoding a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein of sequence SEQ ID NO: 37 (plasmid pHR'pac-G3a E1-S), at least one of said at least two vectors encoding either an E1 HCV fusion protein 43 - SHBv deleted (A) or an E2HCV 43 - SHBv fusion protein deleted (B).
  • the invention also relates to the immunogenic composition as described above comprising a mixture of vectors in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which said mixture is characterized by the presence of a vector encoding a native SHBV protein of sequence SEQ ID NO: 30 (plasmid pHR '/ ip / iS) and at least two vectors chosen from:
  • C. a vector encoding a deleted E2HCV 13 - SHBv fusion protein of sequence SEQ ID NO: 34 (plasmid pHR'pac-G1a E2-S); and D. a vector encoding a deleted E2 H cv 3a - S HB v fusion protein of sequence SEQ ID NO: 35 (plasmid pHR'pac-G3a E2-S), at least one of said at least two vectors encoding either a protein E1 HCV 43 - SHBv fusion deleted (A) or an E2HCV 43 - SHBv fusion protein deleted (B).
  • the latter relates to the use of the immunogenic composition as described above, in particular the use as a preventive, prophylactic and / or therapeutic vaccine for a virus infection.
  • HVC or HBV virus or HCV and HBV viruses the subject of the invention is the immunogenic composition as described above for its use in the prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or in the prevention of hepatitis C.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or in the prevention of hepatitis c and hepatitis B.
  • preventive vaccine or “preventive treatment” is meant the use of the immunogenic composition as described above before an individual (eg. Non-human or human primates, in particular humans) has come into contact. with hepatitis C virus (HCV) and / or hepatitis B virus (HBC) in order to prevent future infection.
  • HCV hepatitis C virus
  • HBC hepatitis B virus
  • prophylactic vaccine or “prophylactic treatment” is meant the use of the immunogenic composition as described above after an individual (eg non-human or human primates, in particular humans) has come into contact with hepatitis C virus (HCV) and / or hepatitis B virus (HBC), for example following an accident in a hospital (or research laboratory) with a contaminated sample, but before seroconversion and this, with the aim of preventing / avoiding seroconversion of the individual.
  • HCV hepatitis C virus
  • HBC hepatitis B virus
  • therapeutic vaccine or “therapeutic treatment” is meant the use of the immunogenic composition as described above after an individual (eg. non-human or human primates, in particular humans) has come into contact with the hepatitis C virus (HCV) and / or the virus of hepatitis B (HBC), and after seroconversion, with the aim of treating / curing the individual.
  • HCV hepatitis C virus
  • HBC virus of hepatitis B
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above for its use in the prophylactic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in the therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in the prophylactic and therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in the prevention of hepatitis C and / or hepatitis B
  • the invention relates to the composition for its use as described above, said composition comprising from 5 pg to 50 pg, preferably from 10 pg to 20 pg, of said mixture of particles of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelopes.
  • the subject of the invention is the composition for its use as described above, said composition being formulated to be administered (or said composition being administered) by one of the following routes: sublingual, buccal , intratracheal, intraocular, intranasal, pulmonary, intraauricular, parenteral, rectal, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous.
  • the invention relates to the composition for its use as described above, said composition being formulated to be administered (or said composition being administered) by one of the following routes: subcutaneous, intramuscular or intravenous .
  • the subject of the invention is the composition for its use as described above, said composition being administered once or several times spaced in time.
  • the immunogenic composition is administered at least twice to the patient who needs it, said administrations possibly being spaced apart by a few hours, a few days, a few months or even a few years depending on the vaccination schedule. recommended that one skilled in the art is able to determine.
  • at least twice is meant that the immunogenic composition can be administered to the patient who needs it twice, three times or even four times according to the recommended vaccination schedule that a person skilled in the art is able to determine.
  • patient who needs it is meant a mammal, such as humans (man, woman and / or child), which requires preventive care (vaccination) to avoid developing an infection with the HCV and / or HBV virus. or who needs treatment for recovery from HCV and / or HBV infection.
  • the aforesaid use can be described as a method of prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to a method for prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis C comprising the administration to a patient in need of the immunogenic composition as described above, said composition comprising from 5 ⁇ g to 50 ⁇ g, of preferably from 10 ⁇ g to 20 ⁇ g, of said mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles.
  • composition comprising from 5 ⁇ g to 50 ⁇ g, preferably 10 ⁇ g to 20 ⁇ g, of said mixture of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles.
  • the invention relates to the method of prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis C as defined above comprising the administration to a patient who needs it. of the immunogenic composition as described above, said composition being formulated to be administered (or said composition being administered) by one of the following routes: sublingual, buccal, intratracheal, intraocular, intranasal, pulmonary, intraauricular, parenteral, rectal, topical, transdermal, subcutaneous , intramuscular or intravenous.
  • a subject of the invention is also the method of prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis B as defined above comprising the administration to a patient in need of the immunogenic composition as described.
  • composition being formulated to be administered (or said composition being administered) by one of the following routes: sublingual, buccal, intratracheal, intraocular, intranasal, pulmonary intraauricular, parenteral, rectal, topical , transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous.
  • the invention relates to the method of prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis C as defined above comprising the administration to a patient who needs it. of the immunogenic composition as described above, said composition being administered once or several times spaced in time.
  • a subject of the invention is also the method of prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or prevention of hepatitis B as defined above comprising the administration to a patient in need of the immunogenic composition as described. above, said composition being administered once or more times spaced in time.
  • the subject of the invention is the method for the prophylactic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B as described above.
  • the invention relates to the method of therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B as described above.
  • the subject of the invention is the method of prophylactic and therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B as described above.
  • the subject of the invention is the method for preventing hepatitis C and / or hepatitis B as described above.
  • the latter relates to the use of the immunogenic composition as described above, in particular the use as a preventive, prophylactic and / or therapeutic vaccine for hepatitis C and / or hepatitis B, in which each of the constituents of the mixture of sub-viral envelope particles is administered simultaneously, separately or spread (gradually / sequentially) over time (kit-of-parts).
  • the invention relates to the use:
  • # at least two subviral envelope particles chosen from among four, at least one of which is A or B, whether in the form of combined preparations containing all of said subviral envelope particles of interest (ie the mixture), or in the form of separate preparations for the simultaneous, separate or sequential combined administration of certain preparations.
  • the subject of the invention is an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from particles characterized by the presence:
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. , in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from the particles characterized by the presence:
  • a native SHBV protein and of a deleted E1 HCV 33 - SHBv fusion protein said at least two preparations being different, at least one having either a deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein (A) or one deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein (B), and said preparations being either in the form of combined preparations or in the form of separate preparations, for its use in the prophylactic and / or therapeutic treatment, and / or in the prevention of hepatitis C and / or hepatitis B, in which said at least two preparations are administered simultaneously, sequentially or separately in time.
  • A deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein
  • B deleted E2HCV 43 - SHBv fusion protein
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above comprising at least two preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. , in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from the particles characterized by the presence:
  • A deleted E1 HCV 43 - SHBv fusion protein
  • B protein fusion E2HCV 43 - deleted SHBv
  • administered simultaneously is meant that the aforementioned at least two preparations are co-administered at the same time to the patient who needs them.
  • administered separately or sequentially in time is meant that the aforesaid at least two preparations are administered at at least two different times. This embodiment is in particular implemented when the aforesaid at least two preparations are in the form of separate preparations.
  • the subject of the invention is the composition for its use as described above, said composition comprising three preparations of subviral, chimeric, immunogenic and non-infectious envelope particles, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle, in which each preparation is characterized by the presence of a particle chosen from particles characterized by the presence:
  • the subject of the invention is the immunogenic composition for its use as described above, in which:
  • the invention relates to the composition for its use as described above, in which said preparations are in the form of separate preparations and each of said preparations comprises from 1 pg to 25 pg of a particle subviral envelope.
  • each of said preparations comprises from 1 pg to 25 pg of a particle subviral envelope.
  • the dose at which said subviral envelope particle is included in a preparation according to the invention may be between 1 pg.
  • this dose which can be considered as a unit dose, can be equal to 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 11 pg, 12 pg, 13 pg, 14 pg, 15 pg, 16 pg, 17 pg, 18 pg, 19 pg, 20 pg, 21 pg, 22 pg, 23 pg 24 pg or 25 pg.
  • the subject of the invention is the composition for its use as described above, in which said preparations are in the form of combined preparations, said combined preparations comprising from 5 ⁇ g to 50 ⁇ g, preferably from 10 ⁇ g to 20 ⁇ g, of the mixture of the subviral envelope particles.
  • the subject of the invention is the composition for its use as described above, in which said preparations are formulated to be administered (or are administered) by one of the following routes: sublingual, buccal , intratracheal, intraocular, intranasal, pulmonary, intraauricular, parenteral, rectal, topical, transdermal, sub- cutaneous, intramuscular or intravenous.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above for its use in the prophylactic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in the therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the invention relates to the immunogenic composition as described above for its use in the prophylactic and therapeutic treatment of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • the subject of the invention is the immunogenic composition as described above for its use in the prevention of hepatitis C and / or hepatitis B.
  • FIG 1 shows the immunization protocol that was put in place with the different vaccination strategies.
  • Groups of twelve rabbits were immunized three times subcutaneously with chimeric subviral envelope particles of HBV-HCV with adjuvant AddaVax TM, exhibiting an E2 envelope glycoprotein of genotype 1a ( 15 pg) or with different mixtures consisting of equal amounts of chimeric particles exhibiting HCV genotype 1a, 3a and 4a envelope glycoproteins E1 or E2, on days 0, 14 and 28.
  • Groups of six rabbits were immunized with AddaVax TM adjuvant alone or with Engerix TM, a commercially available HBV vaccine (15 ⁇ g), which were used as negative and positive controls, respectively. Serum samples were taken from rabbits at different time points (days 0, 14, 28, 42 and 56), for the characterization of the antibody responses and the evaluation of the neutralization potential of the antibodies induced by the vaccination.
  • Figure 2 shows the analysis of the humoral responses induced by the different vaccination strategies.
  • results are expressed as difference in optical density (anti-E1- or anti-E2-p-Gal) and anti-HBsAg titer (mIU / mL), respectively.
  • FIG. 3 represents the neutralization potential of the antibodies induced by the different vaccination strategies.
  • the cross-neutralization properties against HCVcc of the anti-HCV antibodies induced by the different vaccination strategies were evaluated on the six samples of rabbit serum exhibiting the strongest humoral responses to vaccination in each group.
  • Quintuple dilutions of rabbit serum samples taken on days 0 and 56 were first incubated with cc HCVs sporting envelope glycoproteins derived from HCV isolates of genotype 1a, 1b, 2a, 3a and 4a for 1 hour. at 37 ° C, and the serum / HCVcc mixtures were then used to infect Huh7.5 cells for 6 hours. Infection levels were determined after 48 hours of incubation at 37 ° C, in an infectious foci staining test (FFU).
  • FFU infectious foci staining test
  • HBV (adw subtype) - HCV (genotype 1a) chimeric envelope particles carrying on the surface the E1 (E1 1a S particles) or E2 (E2 1a S particles) proteins of the HCV virus were produced and purified as described above. (International application No. PCT / FR2009 / 051142 filed June 16, 2009). Using the same strategy, it was designed, produced and purified new vaccine particles carrying the E1 or E2 glycoproteins of the HCV virus of genotype 3a or 4a called E1 3a S, E2 3a S, E1 4a S and E2 4a S.
  • chimeric envelope particles E1 4a S, E2 4a S, E2 1a S, E2 3a S, E1 3a S and E1 1a S respectively correspond to the envelope particles chimeric characterized by the presence of:
  • Anti-HBsAg and anti-E1 / E2 tests were carried out and analyzed as described in detail previously (International application No. PCT / FR2009 / 051142 filed on June 16, 2009). Briefly, the anti-HBsAg antibodies were quantified with the ARCHITECT TM system (Abbott TM Laboratories).
  • Anti-E1 and anti-E2 responses were assessed using internal ELISAs based on the use of solid phases consisting of appropriate lysates (or mixtures of lysates) of baby hamster kidney cells (BHK-21 ) expressing the same HCV E1 or E2 proteins from genotype 1a, 3a and 4a than those exposed on the surface of the vaccine particles, which were compared to control cells expressing b-galactosidase (b-gal). For each serum sample tested, the value of the optical density (OD) obtained for the wells with capture by the b-gal protein was subtracted from that obtained for the wells with capture by the E1 or E2 proteins.
  • OD optical density
  • HCV viruses in cell culture exhibiting HCV envelope glycoproteins derived from isolates of genotype 1a (JFH1 / H77), 1b (JFH1 / J4), 2a (JFH1), 3a (JFH1 / S52) and 4a (JFH1 / ED43) were used to evaluate and compare the neutralizing potential of anti-HCV envelope protein antibodies present in serum samples from rabbits before and after vaccination. Infection levels were determined using a focus of infection (FFU) stain test. The differences observed in the ability to induce neutralizing antibodies between vaccination strategies for a given genotype were statistically analyzed with nonparametric Mann-Whitney tests. A p value ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • HBV / HCV vaccine based on subviral envelope particles presenting HCV virus envelope glycoproteins of the same or different genotypes can be used, according to various combination strategies, to induce broad neutralizing protection against different genotypes of the HCV virus (ie at least against genotypes 1a, 1b, 2a, 3a and 4a of the HCV virus) or to provide protection against the prevalence of a particular genotype in a given region.
  • the mixture of different subviral envelope particles based on envelope proteins can be used to optimize the prophylactic vaccine.
  • bivalent HBV-HCV especially in the event of potential exposure to different genotypes of the HCV virus, especially since this vaccine is simple to produce. Indeed, it can be treated by industrial procedures adapted from those established for the vaccine against the HBV virus, and it can thus help to control the global epidemic of hepatitis C.

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Abstract

L'invention a pour objet de nouvelles compositions immunogènes comprenant un mélange de particules d'enveloppes sous-virales chimères entre les protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite B (HBV, pour Hepatitis B virus) et du virus de l'hépatite C (HCV, pour Hepatitis C virus). L'invention a également pour objet l'utilisation de ces nouvelles compositions immunogènes, en tant que vaccin, pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l'hépatite C, ou pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l'hépatite B, ou pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l'hépatite C et de l'hépatite B.

Description

DESCRIPTION
TITRE : NOUVELLES COMPOSITIONS IMMUNOGENES ET LEUR APPLICATION POUR LA PREPARATION DE VACCINS CONTRE L’HEPATITE C ET L’HEPATITE
B
DOMAINE DE L’INVENTION
L’invention a pour objet de nouvelles compositions immunogènes comprenant un mélange de particules d’enveloppes sous-virales chimères entre les protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B (HBV, pour Hepatitis B virus) et du virus de l’hépatite C (HCV, pour Hepatitis C virus). L’invention a également pour objet l’utilisation de ces nouvelles compositions immunogènes, en tant que vaccin, pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l’hépatite C, ou pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l’hépatite B, ou pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l’hépatite C et de l’hépatite B.
CONTEXTE DE L’INVENTION
Le virus de l’hépatite C (HCV), identifié en 1989, puis cloné et séquencé, représente encore à l’heure actuelle un réel problème de santé publique du fait de sa large répartition à travers le monde et de l’évolution fréquente de la maladie vers la chronicité, laquelle peut évoluer vers la cirrhose voire le carcinome hépatocellulaire.
En 2000, L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estimait qu’environ 3% de la population mondiale, soit environ 170 millions de personnes, étaient infectées par le virus HCV. Depuis, l’OMS a estimé que l’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) pourrait être éradiquée d’ici 2030 si l’épidémie du virus HCV dans le monde diminue (c’est-à-dire si le nombre de patients guéris par des AAD dépasse constamment et sensiblement le nombre de nouvelles infections) d’au moins 7% par an. Seulement, des études récentes ont montré que la régression annuelle nette mondiale, estimée à seulement 0,4%, est loin d’atteindre cet objectif (Hill AM, Nath S, Simmons B. The road to élimination of hepatitis C: analysis of cures versus new infections in 91 countries. J Virus Erad 2017;3:117-123.).
Pour l’atteindre, il faudrait améliorer la sécurité du sang et le contrôle des infections, ainsi que développer ou créer des services pour les utilisateurs de drogues par voie intraveineuse, et procéder à un dépistage et un traitement à grande échelle, dont le coût estimé par l’OMS est d’au moins 12 milliards de dollars américains (Wiktor S. How feasible is the global élimination of HCV infection? Lancet 2019;393: 1265- 1267.). En outre, bien que les médicaments antiviraux soient très efficaces pour contrôler l’infection, ils ne peuvent empêcher la réinfection par le virus HCV, une situation qui devient de plus en plus courante chez les toxicomanes dans les pays industrialisés (Midgard H, Weir A, Palmateer N, et al. HCV epidemiology in high-risk groups and the risk of reinfection. J Hepatol 2016;65:S33-S45).
De tels efforts sont de nos jours impossibles et malgré l’existence de vaccins candidats dans l’art antérieur, le développement d’un vaccin prophylactique efficace anti-HCV pour lutter contre l’épidémie du virus HCV reste un objectif majeur. En effet, dans la population mondiale, plusieurs génotypes du virus HCV circulent (e.g. 1a, 1b, 3a, etc.) et à ce jour, aucun vaccin s’est révélé capable d’induire une réponse immunitaire efficace contre tous.
Par exemple, il peut être cité la mise au point d’un vaccin basé sur des glycoprotéines d’enveloppe E1 ou E2 du virus HCV fusionnées à la protéine d’enveloppe S (HBsAg) du virus de l’hépatite B (HBV) hétérologue (Demande internationale No. PCT/FR2009/051142 déposée le 16 juin 2009). Seulement celui-ci ne permet pas une réponse immunitaire et la production d’anticorps avec un haut potentiel de neutralisation croisée contre différents génotypes du virus HCV.
BREF APERÇU DE L’INVENTION
En réponse à ce besoin sanitaire pressant et pour pallier aux inconvénients de l’art antérieur, la présente invention a pour but de fournir de nouvelles compositions immunogènes comprenant un mélange de particules d’enveloppes sous-virales chimères entre les protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite B (HBV, pour Hepatitis B virus) et du virus de l’hépatite C (HCV, pour Hepatitis C virus). L’invention a également pour but l’utilisation de ces nouvelles compositions immunogènes, en tant que vaccin, pour la prévention et/ou le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B. A cet égard, l’invention a comme avantage qu’elle peut aisément s’adapter aux chaînes existantes de production industrielles des vaccins contre l’hépatite B actuellement commercialisés.
DESCRIPTION DETAILLEE
Dans son aspect le plus général, l’Invention a pour objet une composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, laquelle, comme l’ont démontré les inventeurs, permet de répondre à l’ensemble des problématiques soulevées précédemment (i.e. lutter efficacement contre l’épidémie, diminué les coûts relatifs à la gestion de celle-ci, etc.).
En effet et ce, de manière inattendue et surprenante, l’emploi d’un mélange multivalent de différents génotypes du virus HCV et/ou un mélange des protéines E1 et/ou E2 d’un ou plusieurs génotypes permet d’induire une réponse immunitaire stable et efficace. Se faisant, la composition immunogène de l’invention (vaccin bivalent HBV/HCV) représente une avancée majeure pouvant être utilisée, selon diverses stratégies de combinaison, pour induire une large protection neutralisante contre différents génotypes du virus HCV (i.e. anticorps neutralisant « à large spectre ») ou pour fournir une protection contre la prévalence d’un génotype particulier dans une région donnée.
Par « composition immunogène », on entend une composition susceptible d’être administrée à l’Homme ou à l’animal afin d’induire une réponse immunitaire. Ladite réponse immunitaire peut être une réponse immunitaire humorale, i.e. une réponse immunitaire qui se traduit par une production d’anticorps neutralisants par les lymphocytes B, ou une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique, i.e. une réponse immunitaire qui se traduit par une activation de certaines cellules, notamment les cellules présentatrices d’antigènes (par exemple les cellules dendritiques), les lymphocytes T, les lymphocytes NK (pour « Natural Killer» en anglais). Les compositions immunogènes de l’invention s’apparentent donc à des compositions pharmaceutiques ou à des vaccins, lesquels sont appropriés pour l’administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intra-trachéale, intra-nasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, pulmonaire.
Par « particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses », abrégée « particules d’enveloppe sous-virales », on entend toute particule filamenteuse ou sphérique, résultant de l’assemblage de la protéine S sauvage du virus HBV et/ou de la protéine S délétée de son domaine transmembranaire N-terminal, ladite particule étant dépourvue du génome viral, et notamment synthétisée et sécrétée en très large excès, et qui peut être analysée par tout protocole permettant de mettre en évidence l’absence de fragments nucléotidiques spécifiques des virus HBV ou HCV, tel que notamment, par l’amplification par PCR ( Polymerase Chain Reaction) antérieurement décrite, e.g. :
# en ce qui concerne le virus HCV, par Halfon P, Bourlière M, Ouzan D, Séné D, Saadoun D, Khiri H, Pénaranda G, Martineau A, Oulès V, Cacoub P.Occult HCV infection revisited with ultra-sensitive real-time PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2008 Apr 30 ; et
# en ce qui concerne le virus HBV, par Thibault V, Pichoud C, Mullen C, Rhoads J, Smith JB, Bitbol A, Thamm S, Zoulim F. Characterization ofa new sensitive PCR assay for quantification of viral DNA isolated from patients with hepatitis B virus infections. J. Clin. Microbiol. 2007 Dec. 45(12):3948-53, et dont le résultat est négatif.
Par « particule d’enveloppe sous-virale chimère », on entend toute particule d’enveloppe sous-virale comprenant au moins la protéine S sauvage du virus HBV et une protéine de fusion immunogène susmentionnée, et donc résultant de l’auto- assemblage de la protéine S sauvage et d’une protéine de fusion susmentionnée.
Par « mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses », on entend que ce mélange constitue le principe actif de la composition immunogène de l’Invention. Celui-ci comprend un mélange d’au moins deux particules choisies parmi six particules A, B, C, D, E et F. Autrement dit, il peut s’agir d’un mélange de deux, trois, quatre, cinq ou six particules, si bien que l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses est choisi parmi :
# le mélange desdites particules A et B ; le mélange desdites particules A et C ;
A et D ; le mélange desdites particules A et E ; le mélange desdites particules
A et F ; le mélange desdites particules B et C ; le mélange desdites particules
B et D ; le mélange desdites particules B et E ; le mélange desdites particules
B et F ; le mélange desdites particules C et D ; le mélange desdites particules
C et E ; le mélange desdites particules C et F ; le mélange desdites particules
D et E ; le mélange desdites particules D et F ; le mélange desdites particules
E et F ;
# le mélange desdites particules A, B et C ; le mélange desdites particules A, B et D ; le mélange desdites particules A, B et E ; le mélange desdites particules A, B et F ; le mélange desdites particules A, C et D ; le mélange desdites particules A, C et E ; le mélange desdites particules A, C et F ; le mélange desdites particules A, D et E ; le mélange desdites particules A, D et F ; le mélange desdites particules A, E et F ; le mélange desdites particules B, C et D ; le mélange desdites particules B, C et E ; le mélange desdites particules B, C et F ; le mélange desdites particules B, D et E ; le mélange desdites particules B, D et F ; le mélange desdites particules B, E et F ; le mélange desdites particules C, D et E ; le mélange desdites particules C, D et F ; le mélange desdites particules C, E et F ; le mélange desdites particules D, E et F ;
# le mélange desdites particules A, B, C et D ; le mélange desdites particules A, B, C et E ; le mélange desdites particules A, B, C et F ; le mélange desdites particules A, B, D et E ; le mélange desdites particules A, B, D et F ; le mélange desdites particules A, B, E et F ; le mélange desdites particules A, C, D et E ; le mélange desdites particules A, C, D et F ; le mélange desdites particules A, C, E et F ; le mélange desdites particules A, D, E et F ; le mélange desdites particules B, C, D et E ; le mélange desdites particules B, C, D et F ; le mélange desdites particules B, C, E et F ; le mélange desdites particules B, D, E et F ; le mélange desdites particules C, D, E et F ;
# le mélange desdites particules A, B, C, D et E ; le mélange desdites particules A, B, C, D et F ; le mélange desdites particules A, B, C, E et F ; le mélange desdites particules A, B, D, E et F ; le mélange desdites particules A, B, D, E et F ; le mélange desdites particules A, C, D, E et F ; le mélange desdites particules B, C, D, E et F ; et
# le mélange desdites particules A, B, C, D, E et F.
Avantageusement, ce mélange ou principe actif peut être administré via la composition immunogène de l’invention sous forme unitaire d’administration. Ladite composition immunogène de l’invention sous forme unitaire d’administration peut être par exemple un comprimé, une gélule, un granule, une poudre, une solution injectable ou suspension orale, un timbre transdermique (patch), une forme d’administration sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, intra-auriculaire, par inhalation, une forme d’administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, une forme d’administration rectale ou un implant. Pour l’administration topique, on peut notamment envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Pour aboutir à ces diverses formes galéniques, un véhicule pharmaceutiquement acceptable est ajouté à la composition immunogène de l’invention. Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu’une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme animal ou humain. Il s’agit donc d’un véhicule pharmaceutiquement approprié dont l’Homme du métier déterminera facilement la nature et la quantité à utiliser en fonction de paramètres usuels et des constituants de la composition immunogène de l’invention, de sa forme pharmaceutique et du mode d’administration souhaité. Par exemple, il peut s’agir de solutés cristalloïdes (e.g. chlorure de sodium, bicarbonate, glucose), de lipides cationiques, de composés peptidiques, de surfactants (e.g. polysorbates). Dans tous les cas et ce, quel que soit la formulation choisie, la composition immunogène de l’invention doit être stérile, stable dans les conditions de fabrication et de stockage, et doit impérativement être préservée de toute contamination par des micro-organismes, tels que les bactéries et les champignons.
Selon un autre mode de réalisation, l’Invention a pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Par « l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B) », on entend que le mélange doit contenir soit une particule caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, soit une particule caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée Autrement dit, et selon cet autre mode de réalisation, on comprend que l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses est choisi parmi :
# le mélange desdites particules A et B ; le mélange desdites particules A et C ;
A et D ; le mélange desdites particules A et E ; le mélange desdites particules
A et F ; le mélange desdites particules B et C ; le mélange desdites particules
B et D ; le mélange desdites particules B et E ; le mélange desdites particules
B et F ;
# le mélange desdites particules A, B et C ; le mélange desdites particules A, B et D ; le mélange desdites particules A, B et E ; le mélange desdites particules
A, B et F ; le mélange desdites particules A, C et D ; le mélange desdites particules A, C et E ; le mélange desdites particules A, C et F ; le mélange desdites particules A, D et E ; le mélange desdites particules A, D et F ; le mélange desdites particules A, E et F ; le mélange desdites particules B, C et D ; le mélange desdites particules B, C et E ; le mélange desdites particules B, C et F ; le mélange desdites particules B, D et E ; le mélange desdites particules B, D et F ; le mélange desdites particules B, E et F ;
# le mélange desdites particules A, B, C et D ; le mélange desdites particules A,
B, C et E ; le mélange desdites particules A, B, C et F ; le mélange desdites particules A, B, D et E ; le mélange desdites particules A, B, D et F ; le mélange desdites particules A, B, E et F ; le mélange desdites particules A, C, D et E ; le mélange desdites particules A, C, D et F ; le mélange desdites particules A, C, E et F ; le mélange desdites particules A, D, E et F ; le mélange desdites particules B, C, D et E ; le mélange desdites particules B, C, D et F ; le mélange desdites particules B, C, E et F ; le mélange desdites particules B, D, E et F ;
# le mélange desdites particules A, B, C, D et E ; le mélange desdites particules A, B, C, D et F ; le mélange desdites particules A, B, C, E et F ; le mélange desdites particules A, B, D, E et F ; le mélange desdites particules A, B, D, E et F ; le mélange desdites particules A, C, D, E et F ; le mélange desdites particules B, C, D, E et F ; et
# le mélange desdites particules A, B, C, D, E et F. Selon un autre mode de réalisation, l’Invention a pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
En particulier et selon cet autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), ladite protéine native SHBV étant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B (HBV), et lesdites protéines fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV13 - SHBvdélétée et E2HCV33 - SHBvdélétée étant des protéines de fusion immunogènes comprenant au moins les deux polypeptides suivants :
# du côté C-terminal, un premier polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés de la protéine S d’un isolat du virus humain de l’hépatite B, laquelle protéine S est délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B, et # du côté N-terminal, un second polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C (HCV) ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a.
Au sens de l’invention, lesdites protéines de fusion peuvent également être définies comme comprenant au moins :
# d’une part la protéine S de HBV délétée (SHBvdélétée), essentiellement constitué de ses trois domaines transmembranaires situés à l’extrémité C-terminale, ladite protéine S délétée conservant la capacité d’assemblage en particules d’enveloppe sous-virales, et conservant les propriétés immunogènes contre le virus HBV ; et
# d’autre part la quasi-intégralité de la séquence d’une des protéines E1 et E2 (EI HCV43, E2HCV43, E2Hcv1a, E2Hcv3a, EI HCV13 OU EI HCV33), conservant également les propriétés immunogènes contre le virus HCV, de sorte que lesdites protéines de fusion soient capables de s’assembler en particules d’enveloppe sous-virales, en présence de la protéine S sauvage (SHBV), et soient susceptibles d’induire une immunisation contre les virus HBV et/ou HCV, et notamment d’induire une double immunisation contre les virus HBV et HCV.
En outre, il est entendu que lesdites protéines de fusion immunogènes peuvent être des protéines ayant une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 83%, notamment d’au moins 85%, particulièrement d’au moins 90%, et plus particulièrement d’au moins 95%, avec la séquence d’acides aminés constituée de la protéine S délétée de son domaine transmembranaire N-terminal (SHBvdélétée), du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine E1 ou E2 d’un isolat du virus de l’hépatite C de génotype 1a, 3a ou 4a (EI HCV43, E2HCV43, E2Hcv1 a, E2Hcv3a, EI HCV13 OU EI HCV33).
Selon cet autre mode de réalisation, on comprend également que l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses est choisi parmi :
# le mélange desdites particules A et B ; le mélange desdites particules A et C ; A et D ; le mélange desdites particules B et C ; le mélange desdites particules B et D ;
# le mélange desdites particules A, B et C ; le mélange desdites particules A, B et D ; le mélange desdites particules A, C et D ; le mélange desdites particules B, C et D ; et
# le mélange desdites particules A, B, C et D.
En particulier, l’Invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence des particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée; et
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée
En particulier, l’Invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence des particules caractérisées par la présence :
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée
Par « isolat du virus de l’hépatite B », tout isolat membre de la famille des Hepadnaviridae et appartenant au genre Orthohepadnavirus, ou tout isolat classifié par International Committee for the Taxonomy of Viruses (ICTV) comme étant apparenté au virus HBV (Schaefer S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus génotypes. World J Gastroenterol. 2007 Jan 7: 13(1 ): 14-21 ).
Par « protéine native SHBV », on entend la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B, c’est-à-dire :
# la protéine d’enveloppe d’un isolat du virus HBV comprenant notamment 226 acides aminés et comportant quatre domaines transmembranaires, et notamment la protéine d’enveloppe de l’isolat HBV de sérotype adw ; ou
# le variant naturel issu d’un isolat du virus HBV ; ou
# le variant synthétique de la protéine susmentionnée.
En particulier, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci- dessus, dans laquelle ladite protéine native SHBV est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. L’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ladite protéine native SHBV est de séquence SEQ ID NO : 2, laquelle est codée par la séquence d’acide nucléiques SEQ ID NO : 1. Cette dernière peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel comporte le gène hph de résistance à l’hygromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine S sauvage (SHBV) au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi-clonage du vecteur.
Par « protéine de fusion » ou « protéine fusion », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi- intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 et/ou E2 d’un isolat du virus HCV, dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV.
Par « protéine (de fusion) immunogène », on entend toute protéine, notamment toute protéine de fusion selon l’invention ainsi que tout fragment de toute protéine de fusion décrit ici, dotée de propriétés antigéniques et capable d’induire une réaction ou une réponse immunitaire. En particulier, une protéine est considérée comme immunogène envers HCV et/ou HBV, si elle induit respectivement après immunisation une réponse humorale anti-E1, anti-E2 et/ou anti-S, détectée par exemple selon un protocole décrit :
# en ce qui concerne le virus HBV (Huzly D, Schenk T, Jilg W, Neumann- Haefelin D. Com pari son of ni ne commercially avai labié assays for quantification of a ntibody response to hepatitis B virus surface antigen. J Clin Microbiol. 2008 Apr, 46(4): 1298-306) ; ou
# en ce qui concerne le virus HCV (Hamed MR, Tarr AW, McClure CP, Bail JK, Hickling TP, Irving WL. Association of antibodies to hepatitis C virus glycoproteins 1 and 2 (anti-E1E2) with HCV disease. J Viral Hepat. 2008 May, 15(5):339-45).
Par « protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 d’un isolat du virus HCV de génotype 4a (EI HCV43), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV. Par « protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi- intégralité d’une protéine d’enveloppe E2 d’un isolat du virus HCV de génotype 4a (E2Hcv4a), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N- terminal de la protéine S du virus HBV. Par « protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E2 d’un isolat du virus HCV de génotype 1a (E2Hcv1a), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV. Par « protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E2 d’un isolat du virus HCV de génotype 3a (E2Hcv3a), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV. Par « protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi- intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 d’un isolat du virus HCV de génotype 1a (EI HCV13), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N- terminal de la protéine S du virus HBV. Par « protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée », on entend toute protéine comprenant au moins la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée), et la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 d’un isolat du virus HCV de génotype 3a (EI HCV33), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV.
Avantageusement, un peptide de liaison relie le premier et le second polypeptides constituant lesdites protéines de fusion susmentionnées, ledit peptide de liaison étant constitué d’un acide aminé, ou de deux acides aminés, ou de trois acides aminés, ou de quatre acides aminés, ou de cinq acides aminés ; sous réserve que lesdites protéines de fusion immunogènes conservent la capacité à s’assembler en particules d’enveloppe sous-virales, en présence de la protéine S sauvage, et que les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus HCV, ou du virus HBV, ou, des virus HCV et HBV soient conservées.
Par « protéine S est délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale » ou par « protéine S délétée en N-terminal » ou par « SHBvdélétée », on entend :
# la protéine S susdéfinie, délétée de la région comprise de l’acide aminé en position 1 à celui en position 19, ou en position 1 à celui en position 20, ou en position 1 à celui en position 21, et préférentiellement en position 1 à celui en position 22 de la protéine S d’un isolat du virus HBV ; ou
# la protéine S susmentionnée présentant un pourcentage d’identité d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite région de la protéine S délétée ; ou
# le « variant naturel » issu d’un isolat du virus HBV ; ou
# le « variant synthétique » de la protéine S délétée susmentionnée.
En particulier, par « SHBvdélétée », on entend la protéine de séquence SEQ ID NO : 4, laquelle est codée par la séquence d’acides nucléiques SEQ ID NO : 3.
Parmi les susdites protéines fusion, certaines d’entre elles n’ont jamais été décrites dans l’art antérieur. Il s’agit : a. de la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. de la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. de la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; et d. de la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée
Ce faisant, on comprend qu’un aspect sous-jacent de l’invention a pour objet l’une des susdites protéines fusion (a., b., c. ou d.) et/ou leurs mélanges. L’invention a donc pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ; b. la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ; c. la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ; et d. la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E1-S de séquence SEQ ID NO : 32, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi-clonage du vecteur ; b. la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E2-S de séquence SEQ ID NO : 33, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi-clonage du vecteur ; c. la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E2-S de séquence SEQ ID NO : 35, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2Hcv3a - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi-clonage du vecteur ; et d. la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E1-S de séquence SEQ ID NO : 37, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV33 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi-clonage du vecteur.
En particulier, l’invention a pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18 ; b. la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20 ; c. la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24 ; et d. la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28.
Par « capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales », on entend l’aptitude de toute protéine, notamment la protéine S du virus HBV, particulièrement de la protéine S délétée de son domaine transmembranaire N-terminal, et plus particulièrement d’une protéine de fusion de l’invention comprenant la protéine S délétée en N-terminal, à s’assembler en présence de la protéine S sauvage ou, le cas échéant, à s’auto-assembler, en particules d’enveloppe sous-virales filamenteuses ou sphériques ; ladite capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales pouvant au moins être mise en évidence par observation selon notamment une analyse en microscopie électronique connu de l’Homme du métier (Demande internationale No. PCT/FR2009/051142 déposée le 16 juin 2009, ci exemples 1 et 2).
Par « assemblage », « s’assembler », on entend la capacité d’une protéine à former des particules d’enveloppe sous-virales en s’associant à la protéine S sauvage (SHBV). Par « auto-assemblage », on entend la capacité d’une protéine à former par elle-même des particules d’enveloppe sous-virales.
Par « isolat du virus HCV », on entend tout isolat membre de la famille des Flaviviridae et appartenant au genre Hepacivirus et constitué d’une polyprotéine de plus de 3000 acides aminés du virus HCV (Choo, Q. L, Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W., and Houghton, M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244(4902), 359-362 ; Choo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) v88:2451-2455 ; Han et al. Characterization of the terminal régions of hepatitis C viral RNA: identification of conserved sequences in the 5’ untranslated région and poly(A) tails at the 3’ end. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715), ou tout isolat classifié par l’International Committee for the Taxonomy of Vi ruses (ICTV) comme étant apparenté au HCV.
Par « génotype du virus HCV », on entend une identification de l’isolat par un classement dans l’un des 7 génotypes majeurs du virus HCV (numérotés de 1 à 7, eux même subdivisés en sous-types). Cette classification est basée sur la conservation nucléotidique entre les différentes souches. Les isolats partageant 65 à 70% d’identité de séquence appartiennent à des génotypes distincts, alors que des isolats possédant une conservation nucléotidique de 75 à 85% sont classés dans des sous-types différents au sein d’un même génotype (Simmonds, P., P. Becher, M. S. Collett, E. A. Gould, F. X. Heinz, G. Meyers, T. Monath, A. Pletnev, C. M. Rice, K. Stiasny, H. J. Thiel, A. Weiner, and J. Bukh. 2012. Family Flaviviridae, p. 1003-1020. In M. Q. K. Andrew, L. Elliot, J. A. Michael, and E. B. Carstens (ed.), Virus Taxonomy. Elsevier, San Diego).
Par « protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C », on entend, la quasi- intégralité de l’une des deux protéines E1 et E2, constituées de leur ectodomaine et de leur domaine transmembranaire et correspondant :
# aux fragments peptidiques de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-1a du virus HCV (SEQ ID NO : 51), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 383, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 380, en ce qui concerne la protéine E1, et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 746, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 743, en ce qui concerne la protéine E2 ; ou
# aux fragments peptidiques de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-3a du virus HCV (SEQ ID NO : 52), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 383, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 380, en ce qui concerne la protéine E1, et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 746, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 743, en ce qui concerne la protéine E2 ; ou
# aux fragments peptidiques de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-4a du virus HCV (SEQ ID NO : 53), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 383, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 380, en ce qui concerne la protéine E1, et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 746, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 743, en ce qui concerne la protéine E2 ; ou
# aux fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 75%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E1 susmentionnées ; ou
# aux fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E2 susmentionnées ; ou
# à des variants naturels ou à des variants synthétiques de la polyprotéine desdits isolats du virus HCV de génotype 1a, 3a ou 4a. Par « ectodomaine des protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite C », on entend :
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-1a du virus HCV (SEQ ID NO : 51), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E1, et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E2 ; ou
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-3a du virus HCV (SEQ ID NO : 52), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E 1 , et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E2 ; ou
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-4a du virus HCV (SEQ ID NO : 53), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, ou notamment de l’acide aminé en position 192 à celui en position 352, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E 1 , et de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, ou notamment de l’acide aminé en position 384 à celui en position 717, en ce qui concerne l’ectodomaine de la protéine E2 ; ou
# les fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 75%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E1 susmentionnées ; ou # les fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E2 susmentionnées ; ou
# à des variants naturels ou à des variants synthétiques de la polyprotéine d’un isolat du virus HCV de génotype 1a, 3a ou 4a.
Par « domaines transmembranaires des protéines d’enveloppe du virus de l’hépatite C », on entend :
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-1a du virus HCV (SEQ ID NO : 51), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 353 à celui en position 383, et avantageusement de l’acide aminé en position 353 à celui en position 380, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E1 , et de l’acide aminé en position 718 à celui en position 746 et avantageusement de l’acide aminé en position 718 à celui en position 743, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E2 ; ou
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-3a du virus HCV (SEQ ID NO : 52), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 353 à celui en position 383, et avantageusement de l’acide aminé en position 353 à celui en position 380, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E1 , et de l’acide aminé en position 718 à celui en position 746 et avantageusement de l’acide aminé en position 718 à celui en position 743, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E2 ; ou
# les parties de fragments peptidiques de E1 ou E2, issues de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-4a du virus HCV (SEQ ID NO : 53), localisés dans les régions comprises : de l’acide aminé en position 353 à celui en position 383, et avantageusement de l’acide aminé en position 353 à celui en position 380, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E1 , et de l’acide aminé en position 718 à celui en position 746 et avantageusement de l’acide aminé en position 718 à celui en position 743, en ce qui concerne le domaine transmembranaire de la protéine E2 ; ou
# les fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 75%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E1 susmentionnées ; ou
# les fragments présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec lesdites régions E2 susmentionnées ; ou
# les variants naturels ou variants synthétiques de la polyprotéine d’un isolat du virus HCV de génotype 1a, 3a ou 4a.
Avantageusement, il convient de noter que les domaines transmembranaires de E1 et/ou de E2, et constituant une partie de la protéine de fusion, sont délétés d’au moins l’un des trois derniers acides aminés, et notamment des trois derniers acides aminés, situés en position C-terminale, de sorte que lesdits domaines transmembranaires délétés de E1 et/ou de E2 présentent un pourcentage d’identité avec les domaines transmembranaires de E1 et/ou E2 sauvages, d’au moins 91%, en ce qui concerne E1 et d’au moins 90% en ce qui concerne E2. Ladite délétion d’au moins l’un des trois acides aminés, et notamment des trois derniers acides aminés, en position C-terminale présente l’avantage d’inactiver le site de clivage des peptidases qui est nécessaire à la maturation de la polyprotéine du HCV, mais qui est indésirable dans le cadre des constructions chimériques de la présente invention. De plus, il convient de noter qu’aux fins de l’invention, les protéines E1 HCV43, E2HCV43, E2Hcv1a, E2Hcv3a, EI HCV13 et E1 HCV33 de référence sont respectivement les protéines de séquence SEQ ID NOs : 6, 8, 10, 12, 14 et 16, lesquelles sont respectivement codées par les séquences d’acides nucléiques SEQ ID NOs : 5, 7, 9, 11, 13 et 15.
Par « pourcentage d’identité », on entend le pourcentage déterminé par comparaison directe de deux séquences de molécules polypeptidiques, en déterminant le nombre de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences, puis en le divisant par le nombre de résidus d’acides aminées de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100. Par « au moins 78% », on entend également au moins 80%, au moins 82%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 88%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%. A cet égard, il convient de noter que cette définition s’applique à tous les modes de réalisation de l’invention.
Par « variant naturel », il est fait référence à toute variabilité, tout polymorphisme, toute diversité, d’une séquence d’ADN, d’un allèle, ou d’une séquence de protéine, entre isolats d’une même espèce ou d’une même population. On détermine le « pourcentage de variabilité naturelle » par comparaison directe de deux molécules polypeptidiques, ou polynucléotidiques, dérivées d’une molécule de référence sauvage et dotées de propriétés biologiques d’intérêt, telles que des propriétés immunogènes et/ou la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales. Il se quantifie en déterminant le nombre exact de résidus d’acides aminés, ou d’acides nucléiques, identiques entre les deux séquences, puis en les divisant par le nombre de résidus d’acides aminés, ou d’acides nucléiques, de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100. Ledit pourcentage de variabilité entre deux séquences est particulièrement versatile car il dépend notamment du virus considéré, du génotype considéré, du fragment de séquence considéré - la région de l’ectodomaine du virus HCV étant par exemple plus variable que la région du domaine transmembranaire -, etc. Ainsi, le pourcentage de variabilité des protéines E1 et E2 du HCV, est de 88% en nucléotide, et de 90% en acides aminés, entre souches d’un même génotype. Mais elle tombe à 55% en nucléotides, et à 59% en acides aminés, entre souches de différents génotypes. De plus, le virus HBV étant un virus à ADN, il est beaucoup moins variable que le virus HCV (Zhang M, Gaschen B, Blay W, Foley B, Haigwood N, Kuiken C, Korber B. Tracking global patterns of N- linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin. Glycobiology. 2004 Dec. 14(12): 1229- 46).
Par « variant synthétique », il est fait référence à toute molécule polypeptidique, ou polynucléotidique selon l’invention, ou tout fragment de molécule polypeptidique, ou polynucléotidique décrit ici, dérivée par recombinaison d’une molécule sauvage de référence, soit par addition, délétion, substitution, à ladite molécule sauvage de référence, sous réserve qu’elle conserve les propriétés biologiques d’intérêt, telles que des propriétés immunogènes et/ou la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales. On détermine le « pourcentage de variabilité synthétique » par comparaison directe de ladite molécule dérivée de ladite molécule sauvage de référence, et en déterminant le nombre exact de résidus d’acides aminés, ou d’acides nucléiques, identiques entre les deux séquences, au regard de leur position et de leur nature, puis en les divisant par le nombre de résidus d’acides aminés, ou d’acides nucléiques, de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle :
# ladite protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ;
# ladite protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ;
# ladite protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 ;
# ladite protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ; # ladite protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26 ; et
# ladite protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28.
En particulier, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci- dessus, dans laquelle :
# ladite protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 18, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E1-S de séquence SEQ ID NO : 32, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ;
# ladite protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 20, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E2-S de séquence SEQ ID NO : 33, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ;
# ladite protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 22, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G1a E2-S de séquence SEQ ID NO : 34, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2HCV13 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ;
# ladite protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 24, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E2-S de séquence SEQ ID NO : 35, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2Hcv3a - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ;
# ladite protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 26, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G1a E1-S de séquence SEQ ID NO : 36, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine EI HCV13 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ; et
# ladite protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 28, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E1-S de séquence SEQ ID NO : 37, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV33 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur.
En particulier, l’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle :
# ladite protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ;
# ladite protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ;
# ladite protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 ; et
# ladite protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24. En particulier, l’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle :
# ladite protéine fusion E1HCV 43 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 18 ;
# ladite protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 20 ;
# ladite protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 22 ; et
# ladite protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée est de séquence SEQ ID NO : 24.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ; ou
B. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ; ou
C. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 ; ou
D. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ; ou
E. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26 ; ou
F. d’une protéine native SHBV choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28. de préférence, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
En particulier, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci- dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé :
# par la présence des particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18 ; et
B. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20, ou par la présence :
# des particules caractérisées par la présence :
B. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20 ;
C. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 22 ; et D. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24.
De manière intéressante, lesdites protéines de fusion immunogènes susmentionnées, en particulier celles de séquences SEQ ID NOs : 18 (EI HCV43), 20 (E2Hcv4a), 22 (E2Hcv1a), 24 (E2hicv3a), 26 (EI HCV13) et 28 (EI HCV33), comprennent à leur extrémité N-terminale un peptide d’initiation de transfert (PIT) d’un isolat du virus de l’hépatite C ( e.g . de génotype 1a, 3a ou 4a). Par « peptide d’initiation de transfert » d’une protéine E1 ou E2 (respectivement PIT1 et PIT2) ou d’une protéine de fusion selon l’invention, on entend :
# le fragment peptidique de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-1a (SEQ ID NO : 51), localisé dans la région comprise : de l’acide aminé en position 166 à celui en position 191 en ce qui concerne la protéine E1 (PIT11a de séquence SEQ ID NO : 48) ; et de l’acide aminé en position 366 à celui en position 383 en ce qui concerne la protéine E2 (PIT21a de séquence SEQ ID NO : 44) ; ou
# le fragment peptidique de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-3a (SEQ ID NO : 52), localisé dans la région comprise : de l’acide aminé en position 166 à celui en position 191 en ce qui concerne la protéine E1 (PIT 13a de séquence SEQ ID NO : 50) ; et de l’acide aminé en position 366 à celui en position 383 en ce qui concerne la protéine E2 (PIT23a de séquence SEQ ID NO : 46) ; ou
# le fragment peptidique de la polyprotéine du virus HCV, et notamment de l’isolat HCV-4a (SEQ ID NO : 53), localisé dans la région comprise : de l’acide aminé en position 166 à celui en position 191 en ce qui concerne la protéine E1 (PIT 14a de séquence SEQ ID NO : 40) ; et de l’acide aminé en position 366 à celui en position 383 en ce qui concerne la protéine E2 (PIT24a de séquence SEQ ID NO : 42) ; ou
# le variant naturel issu d’un isolat du virus HCV, ou le variant synthétique dudit fragment peptidique susmentionné ; ou
# tout fragment peptidique greffé en N-terminal dudit second polypeptide, sous réserve que ledit fragment peptidique, quand il constitue une partie de la protéine de fusion, conserve la capacité à adresser, après traduction, ladite protéine de fusion au réticulum endoplasmique de sorte qu’elle soit correctement glycosylée et que sa conformation tridimensionnelle, et/ou que ses qualités antigéniques, soient au mieux préservées au regard des protéines sauvages.
Avantageusement, ces peptides d’initiation de transfert peuvent être interchangés (e.g. PIT14a en N-terminal de la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée peut être remplacé par PIT11a, PIT13a, PIT21a, etc. ; PIT24a en N-terminal de la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée peut être remplacé par PIT11a, PIT13a, PIT21a, etc. ; ETC.). Avantageusement, ces peptides d’initiation de transfert peuvent être remplacés par d’autres PIT provenant e.g. d’isolat du virus HCV de génotype 2, 5, 6 ou 7, voire remplacés par des peptides d’origine virale, bactérienne ou eucaryote sous réserve que l’ensemble de ces peptides, quand il constitue une partie de la protéine de fusion, conserve la capacité à adresser, après traduction, ladite protéine de fusion au réticulum endoplasmique de sorte qu’elle soit correctement glycosylée et que sa conformation tridimensionnelle, et/ou que ses qualités antigèniques, soient au mieux préservées au regard des protéines sauvages.
A cet égard, c’est en partie en raison de cette flexibilité à l’extrémité N-terminale des composantes E1 ou E2 côté N-terminal des protéines fusion de l’Invention que dans son aspect le plus général, lesdites composantes E1 ou E2 côté N-terminal desdites protéines fusion de l’invention sont définies comme étant :
# la séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C (HCV), laquelle n’inclut pas le peptide d’initiation de transfert (PIT) ; ou
# la séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78% avec ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou
# la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a, la protéine E1 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E1 du virus HCV de génotype 3a. C’est également en raison de cette flexibilité à l’extrémité N- term inale que les protéines fusion de l’Invention sont définies comme étant :
# une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ;
# une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ;
# une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 ;
# une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ;
# une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26 ; et
# une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28. de sorte à inclure préférentiellement, par le biais des pourcentage d’identité, cette flexibilité au niveau du fragment peptidique PIT à l’extrémité N-terminale desdites protéines fusion. En effet et par exemple, si au sein de la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée est utilisé non pas le peptide PIT14a (SEQ ID NO : 40) mais le peptide PIT24a (SEQ ID NO : 42), la séquence résultante de 412 acides aminés a 93,81% ((394/420) x 100) d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 de 420 acides aminés, le nombre de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences étant de 394. Etc.
Selon un autre mode de réalisation, on comprend donc que l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdites protéines fusion comprennent à l’extrémité N-terminale dudit second polypeptide E1 ou E2 (e.g. E1 HCV43, E2HCV43, E2Hcv1 a, E2HCV33, EI HCV13 OU EI HCV33), un troisième peptide constitué de la séquence d’acide aminés d’un peptide d’initiation de transfert (PIT) d’un isolat du virus de l’hépatite C {e.g. de génotype 1a, 3a ou 4a). En particulier, ledit troisième peptide est un peptide choisi parmi : PIT14a de séquence SEQ ID NO : 40, PIT24a de séquence SEQ ID NO : 42, PIT21a de séquence SEQ ID NO : 44, PIT23a de séquence SEQ ID NO : 46, PIT11a de séquence SEQ ID NO : 48, PIT13a de séquence SEQ ID NO : 50 et les séquences ayant au moins 80% d’identité avec les séquences SEQ ID NOs : 40, 42, 44, 46, 48 et 50.
Alternativement, on comprend également qu’un autre aspect général de l’invention concerne une composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV33 - SHBvdélétée, ladite protéine native SHBV étant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B (HBV), et lesdites protéines fusion PIT - E1 HCV43 - SHBvdélétée, PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée, PIT - E2Hcv1 a - S Bvdélétée, PIT - E2Hcv3a - S Bvdélétée, PIT - E1 Hcv1 a - S Bvdélétée et PIT - E1 HCV33 - SHBvdélétée étant des protéines de fusion immunogènes comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-term inale au moins les trois (poly)peptides suivants :
# un premier peptide, dit peptide d’initiation de transfert (PIT), constitué : d’une séquence choisie parmi : PIT14a de séquence SEQ ID NO : 40, PIT24a de séquence SEQ ID NO : 42, PIT21a de séquence SEQ ID NO : 44, PIT23a de séquence SEQ ID NO : 46, PIT11a de séquence SEQ ID NO : 48, PIT13a de séquence SEQ ID NO : 50 et les séquences ayant au moins 80% d’identité avec les séquences SEQ ID NOs : 40, 42, 44, 46, 48 et 50 ; ou d’un fragment peptidique PIT provenant d’isolat du virus HCV de génotype 2, 5, 6 ou 7 ; ou d’un fragment peptidique d’origine virale, bactérienne ou eucaryote semblable (équivalent) à un peptide d’initiation de transfert sous réserve que l’ensemble de ces peptides, quand il constitue une partie de la protéine de fusion, conserve la capacité à adresser, après traduction, ladite protéine de fusion au réticulum endoplasmique de sorte qu’elle soit correctement glycosylée et que sa conformation tridimensionnelle, et/ou que ses qualités antigèniques, soient au mieux préservées au regard des protéines sauvages,
# un deuxième polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C (HCV) ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a, la protéine E1 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E1 du virus HCV de génotype 3a, et # un troisième polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés de la protéine S d’un isolat du virus humain de l’hépatite B, laquelle protéine S est délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B.
Selon cet autre mode de réalisation, l’invention a également pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion PIT - E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon cet autre mode de réalisation, l’invention a également pour objet la composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2HCV13 - SHBvdélétée ; OU
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion PIT - E2Hcv3a - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion PIT - EI HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion PIT - E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon cet autre mode de réalisation, l’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ledit premier peptide, dit peptide d’initiation de transfert (PIT), desdites protéines fusion étant un peptide choisi parmi : PIT14a de séquence SEQ ID NO : 40, PIT24a de séquence SEQ ID NO : 42, PIT21a de séquence SEQ ID NO : 44, PIT23a de séquence SEQ ID NO : 46, PIT11a de séquence SEQ ID NO : 48, PIT13a de séquence SEQ ID NO : 50 et les séquences ayant au moins 80% d’identité avec les séquences SEQ ID NOs : 40, 42, 44, 46, 48 et 50.
Selon ces autres modes de réalisation, il convient de noter que lesdites protéines fusion sont en particulier :
# la protéine fusion PIT14a - E1HCV 43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 18 ;
# la protéine fusion PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 20 ;
# la protéine fusion PIT21a - E2HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 22 ;
# la protéine fusion PIT23a - E2HCV33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 24 ;
# la protéine fusion PIT11a - EI HCV13 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 26 et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 26 ; et
# la protéine fusion PIT13a - E1HCV 33 - SHBvdélétée choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28 et est de préférence la séquence SEQ ID NO : 28.
Comme mentionné ci-dessus, certaines des protéines fusion n’ont jamais été décrites dans l’art antérieur. Il s’agit : a. de la protéine fusion PIT14a - E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. de la protéine fusion PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. de la protéine fusion PIT23a - E2HCV33 - SHBvdélétée ; et d. de la protéine fusion PIT 13a - E1 HCV33 - SHBvdélétée
Ce faisant, on comprend qu’un autre aspect sous-jacent de l’invention a pour objet l’une des susdites protéine fusion (a., b., c. ou d.) et/ou leurs mélanges. L’invention a donc pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion PIT14a - E1HCV 43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ; b. la protéine fusion PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ; c. la protéine fusion PIT23a - E2HCV33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ; et d. la protéine fusion PIT13a - E1HCV 33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion PIT14a - E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E1-S de séquence SEQ ID NO : 32, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ; b. la protéine fusion PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G4a E2-S de séquence SEQ ID NO : 33, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2HCV43 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ; c. la protéine fusion PIT23a - E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E2-S de séquence SEQ ID NO : 35, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E2HCV33 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur ; et d. la protéine fusion PIT13a - E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28, laquelle peut, par exemple, être obtenue à l’aide du plasmide pHR’pac-G3a E1-S de séquence SEQ ID NO : 37, lequel comporte le gène pac de résistance à la puromycine et dans lequel a été clonée la séquence codant la protéine E1 HCV33 - SHBvdélétée au niveau du site de restriction enzymatique unique BamHI GGATCC (SEQ ID NO : 38) localisé dans le site de multi- clonage du vecteur.
En particulier, l’invention a pour objet une protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion PIT14a - E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18 ; b. la protéine fusion PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20 ; c. la protéine fusion PIT23a - E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24 ; et d. la protéine fusion PIT13a - E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, dudit mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses.
Par « de 5 pg à 50 pg dudit mélange de particules d’enveloppe sous-virales », on entend que la somme des différentes doses de particules d’enveloppe sous-virales constituant le mélange est comprise de 5 pg à 50 pg. Cette dose de 5 pg à 50 pg peut être définie comme la dose unitaire. En particulier, celle-ci, qu’elle soit une dose unitaire ou non, peut être comprise de 10 pg à 50 pg, de 15 g à 50 pg, de 20 pg à 50 pg, de 25 pg à 50 pg, de 30 pg à 50 pg, de 35 pg à 50 pg, de 40 pg à 50 pg, de 45 pg à 50 pg, de 5 pg à 10 pg, de 5 pg à 15 pg, de 5 pg à 20 pg, de 5 pg à 25 pg, de 5 pg à 30 pg, de 5 pg à 35 pg, de 5 pg à 40 pg, de 5 pg à 45 pg, de 10 pg à 20 pg, de 20 pg à 30 pg, de 30 pg à 40 pg, de 40 pg à 50 pg, ceci s’appliquant à tous les aspects ou modes de réalisation de l’invention. Elle peut également être de 5 pg, de 10 pg, de 15 pg, de 20 pg, de 25 pg, de 30 pg, de 35 pg, de 40 pg, de 45 pg ou de 50 pg, ceci s’appliquant à tous les aspects ou modes de réalisation de l’invention.
Avantageusement, le mélange peut comprendre soit une proportion/quantité égale de chaque particule d’enveloppe sous-virale, soit une proportion/quantité différente de chaque particule d’enveloppe sous-virale dont la somme des proportions/quantités est comprise de 5 pg à 50 pg. Par « quantité/proportion égale », on entend que chaque particule d’enveloppe sous-virale est à la même quantité/proportion, ceci s’appliquant à tous les aspects ou modes de réalisation de l’invention. Par exemple, pour un mélange de 30 pg, celui-ci peut comprendre :
# 15 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale et 15 pg d’une seconde particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# 10 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 10 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale et 10 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# 7,5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 7,5 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale, 7,5 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale et 7,5 pg d’une quatrième particule d’enveloppe sous- virale ; ou
# etc.
Par « quantité/proportion différente », on entend que chaque particule d’enveloppe sous-virale est à une quantité/proportion distincte des autres, ceci s’appliquant à tous les aspects ou modes de réalisation de l’invention. Par exemple, pour un mélange de 30 pg, celui-ci peut comprendre :
# 20 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale et 5 pg d’une seconde particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# 5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 10 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale et 15 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# 7,5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 17,5 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale, 1 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale et 4 pg d’une quatrième particule d’enveloppe sous- virale ; ou
# etc.
Avantageusement, et lorsque le mélange comprend au moins trois particules d’enveloppe sous-virales, pour certaines, elles peuvent être mélangées en quantité/proportion égale et pour les autres, elles peuvent être mélangées en quantité/proportion différente ou en quantité/proportion égale mais différente de la première susdite quantité/proportion égale, ceci s’appliquant à tous les aspects ou modes de réalisation de l’invention. Par exemple, pour un mélange de 30 pg, celui-ci peut comprendre :
# 5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 5 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale et 20 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# 7,5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 7,5 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale, 10 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale et 5 pg d’une quatrième particule d’enveloppe sous- virale ; ou
# 5 pg d’une première particule d’enveloppe sous-virale, 5 pg d’une deuxième particule d’enveloppe sous-virale, 10 pg d’une troisième particule d’enveloppe sous-virale et 10 pg d’une quatrième particule d’enveloppe sous-virale ; ou
# etc.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant formulée pour être administrée par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, pulmonaire, intra-auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. En particulier, ladite composition est formulée pour être administrée par l’une des voies suivantes : sous- cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant en outre un adjuvant. Par « adjuvant », on entend un produit ajouté à un autre (ici, le mélange de particules d’enveloppe sous-virales) pour renforcer ou compléter son action. Il s’agit donc d’un agent pharmacologique ou immunologique qui modifie l’effet d’autres agents. En particulier, ces derniers peuvent être ajoutés à un vaccin pour stimuler la réponse immunitaire afin de produire plus d’anticorps et une immunité plus durable, minimisant ainsi la dose d’antigène nécessaire. Au sens de l’invention, celui-ci peut être choisi parmi :
# les adjuvants à base d’émulsions huile dans eau ou eau dans huile (e.g. type squalène, MF59) ;
# les adjuvants basés sur les sels minéraux (e.g. hydoxyde et phosphate d’aluminium, phosphate de calcium) ;
# les adjuvants dérivés microbiens (ie.g. type lipopolysaccharides, CpG, flagelline, etc.) ;
# les adjuvants à base de saponine ; et
# les adjuvants agonistes des récepteurs de l’immunité innée (i.e. les Pattern récognition receptors - PRR).
Selon un deuxième aspect de l’invention, celle-ci a pour objet les lignées cellulaires qui produisent les particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes et non infectieuses de l’invention, lesquelles permettent entre autre de les purifier et de préparer le mélange (i.e. le principe actif) de la composition immunogène de l’invention précédemment décrite.
A titre d’exemple de microorganismes qui conviennent aux fins de l’invention, on peut citer les levures, telles que celles des familles suivantes : Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis et Kluveromyces lactis étant préférées ; et les bactéries, telles que E. coli et celles des familles suivantes : Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus et Streptomyces.
A titre d’exemple de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l’invention, on peut citer les cellules provenant d’animaux tels que les mammifères, les reptiles, les insectes et équivalent. Les cellules eucaryotes préférées sont les cellules provenant du hamster chinois (cellules CHO), du singe (cellules COS et Vero), du rein de hamster nain (cellules BHK), du rein de cochon (cellules PK 15) et du rein de lapin (cellules RK13, les lignées cellulaires humaines de l’ostéosarcome (cellules 143 B), les lignées cellulaires humaines HeLa et les lignées cellulaires humaines de l’hépatome (du type cellules Hep G2), ainsi que les lignées cellulaires d’insecte (par exemple de Spodoptera frugiperda).
Avantageusement il est choisi la lignée d’ovaire de hamster chinois nommée CHO (Michel ML, Pontisso P, Sobczak E, Malpièce Y, Streeck RE, Tiollais P. Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particles carrying a receptor for polymerized human sérum albumin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec;81(24):7708-12) ; ou la levure Saccharomyces cerevisae ; ou la lignée cellulaire de rein de hamster nouveau-né (BHK), en particulier la lignée cellulaire de rein de hamster nouveau-né (BHK-21) (Goldman RD, Follett EA. Biréfringent filamentous organelle in BHK-21 cells and its possible rôle in cell spreading and motility. Science. 1970 Jul 17; 169(942):286-8).
Aux fins de l’invention, les susdites lignées cellulaires sont manipulées, transduites, mises en culture, etc. par des techniques connues de l’Homme du métier et permettent ainsi de produire et de purifier chacune des particules d’enveloppe sous- virales de l’invention décrites précédemment. De manière générale et pour chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales, l’invention comprend une méthode de production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses susmentionnées, à partir d’une lignée cellulaire susmentionnée, comprenant les étapes suivantes : i. une étape de transduction des cellules de la lignée cellulaire avec un vecteur lentiviral comprenant une séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine S sauvage (SHBV) d’un isolat du virus de l’hépatite B ; ii. une étape de culture desdites cellules afin de générer une lignée cellulaire capable de produire les particules d’enveloppe sous-virales d’enveloppe sauvage du virus de l’hépatite B ; iii. une étape de sélection d’un clone présentant une sécrétion optimale de particules d’enveloppe sous-virales d’enveloppe sauvage du virus de l’hépatite B ; iv. une étape de sur-transduction dudit clone avec un second vecteur codant pour l’une desdites protéines fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2Hcv1 a - S Bvdélétée ou E2Hcv3a - S Bvdélétée ; v. une étape de culture desdites cellules afin de générer une lignée cellulaire capable de produire les particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses susmentionnées (i.e. les particules A, B, C, D, E ou F) ; vi. une étape de sélection desdites cellules capables de secréter de manière optimale les particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses susmentionnées (i.e. les particules A, B, C, D, E ou F) ; vii. une étape de culture dudit clone pour la production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses susmentionnées (i.e. les particules A, B, C, D, E ou F) ; et viii. une étape de purification des particules d’enveloppe sous-virales à partir du milieu de culture collecté (centrifugation, utltracentrifugation sur gradients, collecte des fractions positives pour les particules d’enveloppe sous-virales chimères, dialyse).
En particulier et in fine, la mise en oeuvre de cette méthode permet à l’Flomme du métier de disposer, par exemple, de :
A. la lignée cellulaire ( e.g . CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G4a E1-S de séquence SEQ ID NO : 32, lequel code pour la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. la lignée cellulaire {e.g. CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G4a E2-S de séquence SEQ ID NO : 33, lequel code pour la protéine fusion E2Hcv4a - S Bvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. la lignée cellulaire {e.g. CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G1a E2-S de séquence SEQ ID NO : 34, lequel code pour la protéine fusion E2Hcv1a - S Bvdélétée de séquence SEQ ID NO : 22, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ;
D. la lignée cellulaire {e.g. CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G3a E2-S de séquence SEQ ID NO : 35, lequel code pour la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée ;
E. la lignée cellulaire ( e.g . CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G1a E1-S de séquence SEQ ID NO : 36, lequel code pour la protéine fusion E1Hcv4a - S Bvdélétée de séquence SEQ ID NO : 26, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; et
F. la lignée cellulaire {e.g. CHO) transduite avec le plasmide pHR’hph-S de séquence SEQ ID NO : 30, lequel code pour la protéine S sauvage (SHBV) de séquence SEQ ID NO : 2 ; et sur-transduite avec le plasmide pHR’pac-G3a E1-S de séquence SEQ ID NO : 37, lequel code pour la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28, ladite lignée cellulaire permettant de produire et de purifier les particules d’enveloppe sous-virales caractérisée par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée
A cet égard, on comprend également qu’un troisième aspect de l’invention concerne une méthode de préparation de la composition immunogène de l’invention. En particulier, celle-ci a pour objet une méthode de préparation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant au moins les étapes suivantes : i. optionnellement, une étape de production d’au moins deux lignées cellulaires choisies parmi : a. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; d. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée ; e. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée ; et f. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée,
(par exemple, à l’aide de la méthode décrite ci-dessus) ; ii. une étape de culture desdites au moins deux lignées cellulaires d’intérêt pour la production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses d’intérêt susmentionnées (/.e. les particules A, B, C, D, E ou F) ; iii. une étape de purification des particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt à partir du milieu de culture collecté (centrifugation, utltracentrifugation sur gradients, collecte des fractions positives pour les particules d’enveloppe sous-virales chimères, dialyse) pour obtenir une solution de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt ; et iv. optionnellement, une étape de mélange desdites solutions de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt pour obtenir la composition immunogène telle que décrites ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la méthode de préparation telle que définie ci-dessus comprenant au moins les étapes suivantes : i. optionnellement, une étape de production d’au moins deux lignées cellulaires choisies parmi : a. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; d. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée ; e. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; et f. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée,
(par exemple, à l’aide de la méthode décrite ci-dessus) ; l’une au moins desdites au moins deux lignées cellulaires sécrétant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ii. une étape de culture desdites au moins deux lignées cellulaires d’intérêt pour la production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses d’intérêt susmentionnées (/.e. les particules A et/ou B, et/ou C, D, E ou F) ; iii. une étape de purification des particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt à partir du milieu de culture collecté (centrifugation, utltracentrifugation sur gradients, collecte des fractions positives pour les particules d’enveloppe sous-virales chimères, dialyse) pour obtenir une solution de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt ; et iv. optionnellement, une étape de mélange desdites solutions de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt pour obtenir la composition immunogène telle que décrites ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la méthode de préparation telle que définie ci-dessus comprenant au moins les étapes suivantes : i. optionnellement, une étape de production d’au moins deux lignées cellulaires choisies parmi : a. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et d. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ;
(par exemple, à l’aide de la méthode décrite ci-dessus) : l’une au moins desdites au moins deux lignées cellulaires sécrétant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ii. une étape de culture desdites au moins deux lignées cellulaires d’intérêt pour la production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses d’intérêt susmentionnées (i.e. les particules A et/ou B, et/ou C et/ou D) ; iii. une étape de purification des particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt à partir du milieu de culture collecté (centrifugation, utltracentrifugation sur gradients, collecte des fractions positives pour les particules d’enveloppe sous-virales chimères, dialyse) pour obtenir une solution de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt ; et iv. optionnellement, une étape de mélange desdites solutions de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt pour obtenir la composition immunogène telle que décrites ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la méthode de préparation telle que définie ci-dessus comprenant ladite étape i. Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la méthode de préparation telle que définie ci-dessus comprenant ladite étape iv. Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la méthode de préparation telle que définie ci-dessus comprenant lesdites étapes i et iv. En particulier, et lorsque l’étape iv est présente, il convient de noter que la réalisation du mélange desdites au moins deux particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt (i.e. au moins deux choisies parmi six, ou au moins deux choisies parmi six dont l’une au moins est A ou B, ou au moins deux choisies parmi quatre dont l’une au moins est A ou B) peut être fait :
# soit en mélangeant en quantité/proportion égale les particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt (i.e. mélange de particules en quantités (pg) équivalentes) ;
# soit en mélangeant en quantité/proportion différente les particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt.
Avantageusement, il convient également de noter que le caractère optionnel de l’étape iv permet, entre autre, de permettre la préparation d’une composition dite kit- of-parts. De cette manière, on comprend que l’invention a également pour objet une composition immunogène comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées.
En particulier, l’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées.
En particulier, l’invention a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées.
Par « kit-of-parts », on entend que lesdites préparations contenant chacune l’une des particules A, B, C, D, E ou F sont physiquement séparées via par exemple l’utilisation d’ampoules, de flacons ou de poches de perfusion distinctes. Ces préparations peuvent alors être utilisées simultanément, par exemple, le patient est placé sous perfusion et en amont de l’aiguille d’injection au moins deux poches de perfusion {e.g. préparation A et préparation B) y sont reliées. Elles peuvent également être utilisées séparément dans le temps, par exemple, le patient est placé au temps t sous perfusion avec une poche de perfusion contenant, e.g., la préparation A et au temps t’ (quelques jours/semaines/mois après), ce même patient est placé sous perfusion avec une autre poche de perfusion contenant cette fois, e.g., la préparation B. Par ailleurs et dans la mesure où l’invention peut fournir jusqu’à six préparations (A, B, C, D, E et F), on comprend qu’il est possible via le kit-of-parts de combiner un mode d’administration simultanée et un mode d’administration séquentielle de celles- ci. En effet, le mélange des préparations A, B, C, D, E et F n’étant pas obligatoire ( cf . supra) il est possible de stocker chacune de ses préparations dans des flacons distincts et de les utiliser de manière distincte ou en mélange. Ce faisant, il est possible d’administrer/d’injecter au patient chacune de ces préparations de manière distincte (ou en mélange) via une seringue. Par exemple, au temps t est injectée au patient la préparation A à l’aide d’une seringue dans laquelle a été prélevée une dose de la préparation A, puis à l’instant t’, est injectée à ce patient la préparation B à l’aide d’une seringue dans laquelle a été prélevée une dose de la préparation B. De la même manière et par exemple, au temps t sont injectées au patient les préparations A et B à l’aide de deux seringues dans lesquelles ont été respectivement prélevées une dose de la préparation A et une dose de la préparation B, puis à l’instant t’, est injectée à ce patient la préparation C à l’aide d’une seringue dans laquelle a été prélevée une dose de la préparation C. A cet égard, il convient de noter que les préparations A et B peuvent être préalablement mélangées si nécessaire et que selon les besoins du praticien il est possible de combiner à foison ce qui précède (e.g. injection de A puis B puis C, injection de A et B puis C, injection de A puis de B et C, injection de C puis de A et B, injection de B et C puis injection de A etc. ; ceci étant également valable avec les préparations D, E et F).
Bien évidemment, ce qui précède peut être envisagé avec un autre mode d’administration, comme l’utilisation de poche de perfusion. Par exemple, le patient est placé au temps t sous perfusion avec au moins deux poches de perfusion contenant, e.g., pour l’une d’entre elles la préparation A et pour l’autre la préparation B, et au temps t’ (quelques jours/semaines/mois après), ce même patient est placé sous perfusion avec une autre poche de perfusion contenant cette fois, e.g., la préparation C. L’inverse est également vrai, i.e. le patient est placé au temps t sous perfusion avec une première poche de perfusion contenant, e.g., la préparation A, et au temps t’ (quelques jours/semaines/mois après), ce même patient est placé sous perfusion avec au moins deux autres poches de perfusion contenant cette fois, e.g., pour l’une d’entre elles la préparation A et pour l’autre la préparation B. Tout ceci pouvant se combiner à foison selon les besoin du praticien.
Selon un quatrième aspect de l’invention, l’invention a pour objet une composition immunogène comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV et d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E 1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ;
D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ;
E. un acide nucléique codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée ; et
F. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV et d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ;
D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ;
E. un acide nucléique codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée ; et
F. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, l’un au moins desdits au moins deux acides nucléiques codant soit une protéine fusion EI HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV et d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’un au moins desdits au moins deux acides nucléiques codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence :
# d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; et
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence :
# d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée
Par « acide nucléique codant une protéine native SHBV », on entend une séquence nucléique codant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B telle que définie ci-dessus. En particulier, il s’agit d’un acide nucléique choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1 (codant la protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2), de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 1. En particulier, il s’agit d’un acide nucléique de séquence SEQ ID NO : 1.
Par « pourcentage d’homologie », on entend le pourcentage déterminé par comparaison directe de deux séquences de molécules polynucléotidiques, en déterminant le nombre de résidus d’acides nucléiques identiques entre les deux séquences, puis en le divisant par le nombre de résidus d’acides nucléiques de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100. Par « au moins 78% », on entend également au moins 80%, au moins 82%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 88%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99%. A cet égard, il convient de noter que cette définition s’applique à tous les modes de réalisation de l’invention.
Par « acide nucléique codant une protéine fusion », on entend une séquence nucléique codant une protéine fusion ( e.g . E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2Hcv1a - S Bvdélétée, E2Hcv3a - S Bvdélétée, E1Hcv1a - S Bvdélétée et E1Hcv3a - S Bvdélétée) telle que définie ci-dessus. C’est-à-dire que celui-ci comprend au moins deux séquences, l’une côté 3’ codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée) et l’autre côté 5’ codant pour la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 ou E2 d’un isolat du virus HCV de génotype 4a, 1a ou 3a (EI HCV43, E2HCV43, E2HCV13, E2hicv3a, EI HCV13 et EI HCV33), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV. Par « quasi- intégralité », on entend au moins le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe E1 ou E2 d’un isolat du virus de l’hépatite C (HCV). Avantageusement, on entend également un acide nucléique codant pour une protéine de fusion définie ci-dessus, comprenant au moins les deux séquences d’acides nucléiques suivantes :
# du côté 3’, une première séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N- terminale, d’un isolat du virus de l’hépatite B ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides nucléiques de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV, ou d’un variant synthétique, dérivée d’une séquence d’acides nucléiques de ladite protéine S délétée en N- terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous- virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B, et,
# du côté 5’ de la première séquence, une seconde séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique, dérivée de ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi les séquences codant la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a, la protéine E1 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E1 du virus HCV de génotype 3a.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a donc pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV et d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E 1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’un au moins desdits au moins deux acides nucléiques codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), ladite protéine native SHBV étant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B (HBV), et lesdites protéines fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV13 - SHBvdélétée et E2HCV33 - SHBvdélétée étant des protéines de fusion immunogènes chacune codée par un acide nucléique comprenant au moins les deux séquences suivantes :
# du côté 3’, une première séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N- terminale, d’un isolat du virus de l’hépatite B ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides nucléiques de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV, ou d’un variant synthétique, dérivée d’une séquence d’acides nucléiques de ladite protéine S délétée en N- terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous- virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B, et,
# du côté 5’ de la première séquence, une seconde séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique, dérivée de ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi les séquences codant la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a. Avantageusement, ledit acide nucléique codant une protéine fusion comprend également une séquence codant un peptide d’initiation de transfert (PIT) tel que définie ci-dessus. C’est-à-dire que celui-ci comprend au moins trois séquences, lesquelles, de l’extrémité 5’ à l’extrémité 3’, sont :
# une séquence codant un peptide d’initiation de transfert ( e.g . PIT11a, PIT13a, PIT14a, PIT21a, PIT23a ou PIT24a) ;
# une séquence codant pour la quasi-intégralité d’une protéine d’enveloppe E1 ou E2 d’un isolat du virus HCV de génotype 4a, 1a ou 3a (EI HCV43, E2HCV43, E2Hcv1a, E2Hcv3a, EI HCV13 et EI HCV33), dont le domaine transmembranaire se substitue à celui délété en N-terminal de la protéine S du virus HBV ; et
# une séquence codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale d’un isolat du virus HBV (SHBvdélétée).
Avantageusement, on entend également un acide nucléique codant pour une protéine de fusion définie ci-dessus, comprenant au moins les trois séquences d’acides nucléiques suivantes :
# du côté 3’, une première séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N- terminale, d’un isolat du virus de l’hépatite B ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides nucléiques de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV, ou d’un variant synthétique, dérivée d’une séquence d’acides nucléiques de ladite protéine S délétée en N- terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous- virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B,
# du côté 5’ de la première séquence, une seconde séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique, dérivée de ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi les séquences codant la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a, la protéine E1 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E1 du virus HCV de génotype 3a, et
# du côté 5’ de la seconde séquence, une troisième séquence d’acides nucléiques codant pour un peptide d’initiation de transfert d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C (PIT) ; ou une séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique, dérivée de ladite la séquence d’acides nucléiques de la protéine codant pour un peptide d’initiation de transfert (PIT), sous réserve que le peptide d’initiation de transfert codé par ladite la séquence d’acides nucléiques, conserve la capacité à adresser, après traduction, ladite protéine de fusion au réticulum endoplasmique de sorte qu’elle soit correctement glycosylée et que sa conformation tridimensionnelle présente le moins d’altération possible, et/ou que ses qualités antigéniques soient au mieux préservées au regard des protéines sauvages ; ou toute séquence d’acides nucléiques codant pour un peptide capable d’adresser, après traduction, ladite protéine de fusion au réticulum endoplasmique de sorte qu’elle soit correctement glycosylée et que sa conformation tridimensionnelle présente le moins d’altérations possibles, et/ou que ses qualités antigèniques soient au mieux préservées au regard des protéines sauvages, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi les séquences codant la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a, la protéine E1 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E1 du virus HCV de génotype 3a.
Avantageusement, une séquence d’acides nucléiques codant un peptide de liaison relie le premier et le second acide nucléique constituant lesdites protéines de fusion susmentionnées, ladite séquence d’acides nucléiques codant un peptide de liaison étant constitué de 3 acides nucléiques, ou de 6 acides nucléiques, ou de 9 acides nucléiques, ou de 12 acides nucléiques, ou de 15 acides nucléiques, ou de toute séquence nucléotidique codant pour tout peptide de liaison ; sous réserve que lesdites protéines de fusion immunogènes codées par lesdites séquences d’acides nucléiques et qui comprennent ledit peptide de liaison conservent la capacité à s’assembler en particules d’enveloppe sous-virales, en présence de la protéine S sauvage, et que les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus HCV, ou du virus HBV, ou, des virus HCV et HBV soient conservées.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdits au moins deux acides nucléiques codant pour une protéine fusion sont choisis parmi :
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (également appelée PIT14a — E1 HCV43 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 17, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 17 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (également appelée PIT24a - E2HCV43 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 19, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 19 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée (également appelée PIT21a - E2HCV13 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 21, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 21 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée (également appelée PIT23a - E1 HCV33 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 23 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée (également appelée PIT11a - EI HCV13 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 25, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 25 ; et
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée (également appelée PIT13a - E1 HCV33 - SHBvdélétée) choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 27, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 27.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdits au moins deux acides nucléiques codant pour une protéine fusion sont choisis parmi :
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 17 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 19 ; # l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 21 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 23 ;
# l’acide nucléique codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 25 ; et
# l’acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 27.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence :
# d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 1 ; et
# d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 17, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 17, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 17 ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 19, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 19, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 19 ;
C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 21, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 21, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 21 ; et D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 23, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 23, l’un au moins desdits au moins deux acides nucléiques codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence :
# d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 1 ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 17, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 17, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 17 ; et
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 19, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 19, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 19.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet une composition immunogène telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence :
# d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 1, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 1 ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 19, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 19, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 19 ;
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 21, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 21 , et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 21 ; et
# d’un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée choisi parmi les séquences ayant une homologie d’au moins 80% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence d’au moins 90% avec la séquence SEQ ID NO : 23, et est de préférence de séquence SEQ ID NO : 23.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant non seulement le mélange desdits acides nucléiques mais également les vecteurs comprenant au moins lesdits acides nucléiques et les moyens nécessaires à l’expression des protéines (i.e. protéine S native et les protéines fusion telles que définies ci-dessus) codées par ces derniers, lesdits moyens y étant liés de façon opérationnelle. A titre de vecteurs d’expression qui conviennent aux fins de l’invention, on peut citer par exemple les plasmides, les vecteurs viraux type lentiviraux, Semliki, adenovirus, poxvirus, virus de la vaccine, baculovirus, les vecteurs bactériens du type salmonelle, BCG. Par « moyens nécessaires à l’expression » d’une protéine (le terme protéine étant utilisé pour toute molécule d’acides aminés, telle que protéine, protéine de fusion, fragment de protéine, peptide, polyprotéine, polypeptide, etc.), on entend tous moyens qui permettent d’obtenir la protéine, tel que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. Ces derniers peuvent être des moyens homologues, c’est-à-dire inclus dans le génome du vecteur utilisé, ou bien être hétérologues. Dans ce dernier cas, lesdits moyens sont clonés avec la protéine d’intérêt à exprimer. En outre, les moyens nécessaires à l’expression d’une protéine sont liés de façon opérationnelle à la séquence d’acides nucléiques codant pour le (poly)peptide d’intérêt. C’est-à-dire que les éléments nécessaires à l’expression et ceux du gène (de l’acide nucléique) codant la protéine d’intérêt sont juxtaposés de manière séparée ou contiguë et sont en relation de sorte que le gène puisse être correctement transcrit par la machinerie cellulaire. Par exemple, il peut exister des bases supplémentaires entre le promoteur et le gène d’intérêt tant que leur relation fonctionnelle est préservée.
En particulier et selon cet autre mode de réalisation, l’invention concerne la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant un mélange de vecteurs en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un vecteur codant une protéine native SHBV et d’au moins deux vecteurs choisis parmi :
A. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ;
D. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ;
E. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; et
F. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée
En particulier et selon cet autre mode de réalisation, l’invention concerne également la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant un mélange de vecteurs en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un vecteur codant une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 30 (plasmide pHR’/ip/i-S) et d’au moins deux vecteurs choisis parmi :
A. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 32 (plasmide pHR’pac-G4a E1-S) ;
B. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 33 (plasmide pHR’pac-G4a E2-S) ;
C. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 34 (plasmide pHR’pac-G1a E2-S) ;
D. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 35 (plasmide pHR’pac-G3a E2-S) ;
E. un vecteur codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 36 (plasmide pHR’pac-G1a E1-S) ; et
F. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 37 (plasmide pHR’pac-G3a E1-S). En particulier et selon cet autre mode de réalisation, l’invention concerne également la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant un mélange de vecteurs en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un vecteur codant une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 30 (plasmide pHR’/ip/i-S) et d’au moins deux vecteurs choisis parmi :
A. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 32 (plasmide pHR’pac-G4a E1-S) ;
B. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 33 (plasmide pHR’pac-G4a E2-S) ;
C. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 34 (plasmide pHR’pac-G1a E2-S) ;
D. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 35 (plasmide pHR’pac-G3a E2-S) ;
E. un vecteur codant une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 36 (plasmide pHR’pac-G1a E1-S) ; et
F. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 37 (plasmide pHR’pac-G3a E1-S), l’un au moins desdits au moins deux vecteurs codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
En particulier et selon cet autre mode de réalisation, l’invention concerne également la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant un mélange de vecteurs en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un vecteur codant une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 30 (plasmide pHR’/ip/i-S) et d’au moins deux vecteurs choisis parmi :
A. un vecteur codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 32 (plasmide pHR’pac-G4a E1-S) ;
B. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 33 (plasmide pHR’pac-G4a E2-S) ;
C. un vecteur codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 34 (plasmide pHR’pac-G1a E2-S) ; et D. un vecteur codant une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 35 (plasmide pHR’pac-G3a E2-S), l’un au moins desdits au moins deux vecteurs codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B).
Selon un cinquième aspect de l’invention, celle-ci a pour objet l’utilisation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, notamment l’utilisation en tant que vaccin préventif, prophylactique et/ou thérapeutique d’une infection au virus HVC ou au virus HBV ou aux virus HCV et HBV. A ce titre, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C. Elle a également pour objet la composition immunogène telle que décrite ci- dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite B. En particulier, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite c et de l’hépatite B.
Par « vaccin préventif » ou « traitement préventif », on entend l’utilisation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus avant qu’un individu ( e.g . primates non humains ou humains, en particulier l’Homme) soit entré en contact avec le virus de l’hépatite C (HCV) et/ou le virus de l’hépatite B (HBC) et ce, dans le but de prévenir une infection future.
Par « vaccin prophylactique » ou « traitement prophylactique », on entend l’utilisation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus après qu’un individu (e.g. primates non humains ou humains, en particulier l’Homme) soit entré en contact avec le virus de l’hépatite C (HCV) et/ou le virus de l’hépatite B (HBC), par exemple à la suite d’un accident en milieu hospitalier (ou laboratoire de recherche) avec un échantillon contaminé, mais avant séroconversion et ce, dans le but d’empêcher / d’éviter une séroconversion de l’individu.
Par « vaccin thérapeutique » ou « traitement thérapeutique », on entend l’utilisation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus après qu’un individu ( e.g . primates non humains ou humains, en particulier l’Homme) soit entré en contact avec le virus de l’hépatite C (HCV) et/ou le virus de l’hépatite B (HBC), et après séroconversion, dans le but de soigner/guérir l’individu.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique de l’hépatite C et/ou l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique et thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, dudit mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant formulée pour être administrée (ou ladite composition étant administrée) par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, pulmonaire, intra- auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. En particulier, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant formulée pour être administrée (ou ladite composition étant administrée) par l’une des voies suivantes : sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant administrée une fois ou plusieurs fois espacées dans le temps. Par « plusieurs fois espacées dans le temps », on entend que la composition immunogène est administrée au moins deux fois au patient qui en a besoin, lesdites administrations pouvant être espacées de quelques heures, quelques jours, quelques mois voire quelques années selon le schéma vaccinal recommandé que l’Homme du métier est à même de déterminer. Par « au moins deux fois », on entend que la composition immunogène peut être administrée au patient qui en a besoin deux fois, trois fois voire quatre fois selon le schéma vaccinal recommandé que l’Homme du métier est à même de déterminer. Par « patient qui en a besoin », on entend un mammifère, tel que l’Homme (homme, femme et/ou enfant), lequel nécessite des soins préventif (vaccination) pour éviter de développer une infection au virus HCV et/ou HBV ou qui nécessite des soins en vue de sa guérison après une infection au virus HCV et/ou HBV.
Alternativement, la susdite utilisation peut être décrite comme une méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B. A ce titre, l’invention a pour objet une méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite C comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, dudit mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses. Elle peut également être décrite comme une méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite B comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, dudit mélange de particules d’enveloppe sous- virales, chimères, immunogènes et non infectieuses.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite C telle que définie ci-dessus comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant formulée pour être administrée (ou ladite composition étant administrée) par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, pulmonaire, intra-auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous- cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. L’invention a également pour objet la méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite B telle que définie ci-dessus comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant formulée pour être administrée (ou ladite composition étant administrée) par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra- nasale, pulmonaire intra-auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite C telle que définie ci-dessus comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant administrée une fois ou plusieurs fois espacées dans le temps. L’invention a également pour objet la méthode de traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou de prévention de l’hépatite B telle que définie ci-dessus comprenant l’administration à un patient qui en besoin de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, ladite composition étant administrée une fois ou plusieurs fois espacées dans le temps.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode traitement prophylactique de l’hépatite C et/ou l’hépatite B telle que décrite ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode traitement thérapeutique de l’hépatite C et/ou l’hépatite B telle que décrite ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode traitement prophylactique et thérapeutique de l’hépatite C et/ou l’hépatite B telle que décrite ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation alternatif, l’invention a pour objet la méthode de prévention de l’hépatite C et/ou l’hépatite B telle que décrite ci-dessus. Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci a pour objet l’utilisation de la composition immunogène telle que décrite ci-dessus, notamment l’utilisation en tant que vaccin préventif, prophylactique et/ou thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle chacun des constituants du mélange de particules d’enveloppe sous-virales est administré simultanément, séparément ou étalé (graduellement/séquentiellement) dans le temps ( kit-of-parts ). Selon cet aspect, l’invention concerne l’utilisation :
# d’au moins deux particules d’enveloppe sous-virales choisies parmi six ; ou
# d’au moins deux particules d’enveloppe sous-virales choisies parmi six dont l’une au moins est A ou B ; ou
# d’au moins deux particules d’enveloppe sous-virales choisies parmi quatre dont l’une au moins est A ou B, que ce soit sous forme de préparations combinées contenant l’ensemble desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt (i.e. le mélange), ou sous forme de préparations séparées pour l’administration combinée simultanée, séparée ou séquentielle de certaines préparations.
Autrement dit, l’invention a pour objet une composition immunogène comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées, pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle lesdites au moins deux préparations sont administrés simultanément, séparément ou séquentiellement dans le temps.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée ; ou
E. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV13 - SHBvdélétée ; ou
F. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées, pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle lesdites au moins deux préparations sont administrées simultanément, séquentiellement ou séparément dans le temps.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées, pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle lesdites au moins deux préparations sont administrées simultanément, séparément ou séquentiellement dans le temps.
Par « administrés simultanément », on entend que les susdites au moins deux préparations sont co-administrées en même temps au patient qui en a besoin. Avantageusement, ce mode de réalisation permet que les susdites au moins deux préparations soient sous forme de préparations combinées (= composition immunogène comprenant un mélange telle que précédemment décrite). Par « administrées séparément ou séquentiellement dans le temps », on entend que les susdites au moins deux préparations sont administrées à au moins deux moments différents. Ce mode de réalisation est en particulier mis en oeuvre lorsque les susdites au moins deux préparations sont sous forme de préparations séparées.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, ladite composition comprenant trois préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, lesdites trois préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant sous forme de préparations séparées, pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle lesdites trois préparations sont administrées séparément ou séquentiellement dans le temps. En particulier, l’invention a pour objet la composition immunogène pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, dans laquelle :
# la première préparation est administrée au jour 0 ;
# la deuxième préparation est administrée au jour 14 ; et
# la troisième préparation est administrée au jour 28.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdites préparations sont sous forme de préparations séparées et chacune desdites préparations comprend de 1 pg à 25 pg d’une particule d’enveloppe sous-virale. Par « de 1 pg à 25 pg d’une particule d’enveloppe sous-virale », on entend que la dose à laquelle est comprise ladite particule d’enveloppe sous-virale dans une préparation selon l’invention peut être comprise de 1 pg à 5 pg, de 1 pg à 10 pg, de 1 pg à 15 pg, de 1 pg à 20 pg, de 1 pg à 25 pg, de 5 pg à 25 pg, de 10 pg à 25 pg, de 15 pg à 25 pg, de 20 pg à 25 pg, de 5 pg à 15 pg ou de 10 pg à 20 pg. On entend également que cette dose, laquelle peut être considérée comme une dose unitaire, peut être égale à 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 11 pg, 12 pg, 13 pg, 14 pg, 15 pg, 16 pg, 17 pg, 18 pg, 19 pg, 20 pg, 21 pg, 22 pg, 23 pg 24 pg ou 25 pg.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdites préparations sont sous forme de préparations combinées, lesdites préparations combinées comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, du mélange des particules d’enveloppe sous-virales.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, dans laquelle lesdites préparations sont formulées pour être administrées (ou sont administrées) par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, pulmonaire, intra-auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous- cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique de l’hépatite C et/ou l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement prophylactique et thérapeutique de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition immunogène telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B.
A tout égard, il convient de noter que les différents aspects de l’invention, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux à foison pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention et ses modes de réalisation.
LISTE DES FIGURES
Les figures suivantes illustrent l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
La Figure 1 représente le protocole d’immunisation qui a été mis en place avec les différentes stratégies de vaccination.
Des groupes de douze lapins ont été immunisés trois fois par voie sous-cutanée avec des particules d’enveloppe sous-virales chimériques d’enveloppe du HBV-HCV avec l’adjuvant AddaVax™, présentant une glycoprotéine d’enveloppe E2 de génotype 1a (15 pg) ou avec différents mélanges constitués de quantités égales de particules chimériques présentant des glycoprotéines d’enveloppe E1 ou E2 de génotype 1a, 3a et 4a du virus HCV, aux jours 0, 14 et 28. Des groupes de six lapins ont été immunisés avec l’adjuvant AddaVax™ seul ou avec l’Engerix™, un vaccin contre le virus HBV disponible dans le commerce (15 pg), lesquels ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, respectivement. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur des lapins à différents moments (jours 0, 14, 28, 42 et 56), pour la caractérisation des réponses anticorps et l’évaluation du potentiel de neutralisation des anticorps induits par la vaccination.
La Figure 2 représente l’analyse des réponses humorales induites par les différentes stratégies de vaccination.
Les réponses spécifiques anti-E1/anti-E2 et anti-HBsAg ont été évaluées dans des sérums de lapin à l’aide de tests ELISA internes et d’un test immunologique de routine (Abbott™ Laboratories), respectivement. Les résultats sont exprimés sous forme de différence de densité optique (anti-E1- ou anti-E2-p-Gal) et de titre anti- HBsAg (mUI/mL), respectivement.
La Figure 3 représente le potentiel de neutralisation des anticorps induits par les différentes stratégies de vaccination.
Les propriétés de neutralisation croisée contre les HCVcc des anticorps anti-HCV induits par les différentes stratégies de vaccination ont été évaluées sur les six échantillons de sérum de lapin présentant les plus fortes réponses humorales à la vaccination dans chaque groupe. Des dilutions quintuples d’échantillons de sérum de lapin prélevés aux jours 0 et 56 ont d’abord été incubées avec des HCVcc arborant des glycoprotéines d’enveloppe dérivées d’isolats HCV de génotype 1a, 1b, 2a, 3a et 4a pendant 1 heure à 37°C, et les mixtures sérum/HCVcc ont ensuite été utilisées pour infecter des cellules Huh7.5 pendant 6 heures. Les niveaux d’infection ont été déterminés après 48 heures d’incubation à 37°C, dans un test de coloration des foyers infectieux (FFU). Les FFU ont été comptés au microscope, et le pourcentage de neutralisation en présence du sérum post-immun (jour 56) a été comparé à celui en présence du sérum pré-immun (jour 0) du même lapin. Le test a été effectué en trois exemplaires, et les résultats sont exprimés sous forme de valeurs moyennes. Des analyses statistiques ont été effectuées avec des tests non paramétriques de Mann-Whitney. * p<0,05 ; ** p<0,005 ; *** p<0,005 ; ns = non significatif.
EXEMPLE
L’exemple suivant illustre l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
EXEMPLE 1 - LE MÉLANGÉ DE PARTICULES DE DIFFERENTS GÉNOTYPES DU VIRUS HCV
AUGMENTE LA CAPACITE DU VACCIN HBV-HCV A INDUIRE LA PRODUCTION MASSIVE D’ANTICORPS NEUTRALISANTS CROSS- REACTIFS
MATERIELS ET METHODES
Production des particules vaccinales
Des particules d’enveloppe chimériques HBV (sous-type adw) - HCV (génotype 1a) portant en surface les protéines E1 (particules E11aS) ou E2 (particules E21aS) du virus HCV ont été produites et purifiées comme décrit précédemment (Demande internationale No. PCT/FR2009/051142 déposée le 16 juin 2009). En utilisant la même stratégie, il a été conçu, produit et purifié de nouvelles particules de vaccin portant les glycoprotéines E1 ou E2 du virus HCV de génotype 3a ou 4a nommées E13aS, E23aS, E14aS et E24aS.
En lien avec la description ci-dessus, il convient de noter que les particules d’enveloppe chimériques E14aS, E24aS, E21aS, E23aS, E13aS et E11aS correspondent respectivement aux particules d’enveloppe chimériques caractérisée par la présence :
A. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18 ;
B. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20
C. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 22 ;
D. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24 ; E. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion EI HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 26 ; et
F. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 28.
Immunisation de lapins New Zealand
Quatre groupes de 12 lapins ont été vaccinés par voie sous-cutanée aux jours 0, 14 et 28, avec 15 pg d’immunogènes adjuvantés par l’AddaVax™ (Invivogen™), quantifiés par ELISA HBsAg, comme suit : (i) uniquement des particules E21aS ; (ii) des quantités égales de particules E21aS, E23aS et E24aS (5 pg de chaque particule) ; (iii) des quantités égales de particules E11aS, E21aS, E13aS, E23aS, E14aS et E24aS (2,5 pg de chaque particule) ; (iv) ou des quantités égales de particules E14aS et E24aS (7,5 pg de chaque particule). Des groupes de six lapins immunisés avec l’adjuvant AddaVax™ seul ou avec Engerix™ (produit GSK™), un vaccin contre le virus HBV disponible dans le commerce, ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, respectivement. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur des lapins à différents moments (jours 0, 14, 28, 42 et 56) pour la caractérisation des réponses humorales. Les vaccinations ont été réalisées par Agro-Bio (La Ferté-Saint-Aubin, France), une société accréditée par les autorités françaises pour la réalisation de protocoles sur les animaux de laboratoire conformément à la directive européenne 2010/63/UE. Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique d’Agro-Bio C2A-99 (Ministère de la recherche, accord B45-146-01 ).
Analyse des réponses humorales anti-FIBsAg et Anti-E1/E2
Des tests anti-HBsAg et anti-E1/E2 ont été effectués et analysés comme décrit en détail précédemment (Demande internationale No. PCT/FR2009/051142 déposée le 16 juin 2009). Brièvement, les anticorps anti-HBsAg ont été quantifiés avec le système ARCHITECT™ (Abbott™ Laboratories). Les réponses anti-E1 et anti-E2 ont été évaluées à l’aide d’ELISA internes basés sur l’utilisation de phases solides constituées de lysats (ou de mélanges de lysats) appropriés de cellules de rein de bébé hamster (BHK-21 ) exprimant les mêmes protéines E1 ou E2 de HCV de génotype 1a, 3a et 4a que celles exposées à la surface des particules de vaccin, qui ont été comparées à des cellules témoins exprimant la b-galactosidase (b-gal). Pour chaque échantillon de sérum testé, la valeur de la densité optique (DO) obtenue pour les puits avec capture par la protéine b-gal a été soustraite de celle obtenue pour les puits avec capture par les protéines E1 ou E2.
Test de neutralisation du virus HVC en culture cellulaire
Des virus HCV en culture cellulaire (HCVcc) exposant des glycoprotéines d’enveloppe du HCV dérivées d’isolats de génotype 1a (JFH1/H77), 1b (JFH1/J4), 2a (JFH1), 3a (JFH1/S52) et 4a (JFH1/ED43) ont été utilisés pour évaluer et comparer le potentiel de neutralisation des anticorps anti-protéines d’enveloppe du virus HCV présents dans les échantillons de sérum de lapins avant et après la vaccination. Les niveaux d’infection ont été déterminés à l’aide d’un test de coloration des foyers infectieux (FFU). Les différences observées dans la capacité d’induction des anticorps neutralisants entre les stratégies de vaccination pour un génotype donné ont été analysées statistiquement avec des tests non paramétriques de Mann- Whitney. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
RESULTATS
Toutes les particules du vaccin HBV-HCV (qu’elles soient utilisées seules ou dans des cocktails, Figure 1) ont induit des réponses anticorps spécifiques contre les protéines d’enveloppe des virus HCV et HBV (Figure 2). Après l’évaluation des niveaux d’anticorps anti-HBsAg, anti-E1 et anti-E2 chez les animaux immunisés (Figure 2), il a été étudié les propriétés neutralisantes des six sérums de lapin induisant les plus fortes réponses humorales à la vaccination dans chaque groupe (les lapins présentant les niveaux les plus élevés d’anticorps anti-HBsAg étaient également ceux présentant les niveaux les plus élevés d’anticorps anti-E1 et anti- E2). Les tests de neutralisation du virus HCV ont été effectués avec des virus HCV exposant des glycoprotéines dérivées de différentes souches hétérologues de génotype 1a, 1b, 2a 3a et 4a (Figure 3). Ces expériences ont démontré que l’immunisation avec un cocktail de particules E2S portant les glycoprotéines d’enveloppe E2 de virus HCV de génotype 1a, 3a et 4a augmentait significativement l’induction d’anticorps aux propriétés neutralisantes larges (valeurs p = 0,026 et 0,005 pour la neutralisation des génotypes 3 et 4 du virus HCV, respectivement, par rapport à celles des animaux immunisés avec un cocktail de particules E21aS + E23aS + E24aS et des animaux immunisés avec des particules E21aS uniquement) (Figure 3). Cela a été confirmé par des essais de neutralisation supplémentaires utilisant des dilutions en série de sérums de lapin, montrant que ces larges propriétés neutralisantes des anticorps induits ont également été observées pour des dilutions sériques élevées ( non montrés). Par ailleurs, et c’est important, l’utilisation d’un cocktail de particules E21aS + E23aS + E24aS n’a pas réduit de manière significative la capacité du vaccin à induire des anticorps neutralisants contre les génotypes 1a et 1 b du virus HCV, par rapport au vaccin prototype E21aS. Néanmoins, un cocktail de seulement deux types de particules, portant séparément les glycoprotéines E1 et E2 du génotype 4a du virus HCV, a été identifié comme le meilleur candidat vaccin pour la protection contre ce génotype particulier. Il a clairement donné la meilleure protection dans les comparaisons entre les animaux immunisés avec le cocktail de particules E14aS + E24aS et les animaux immunisés avec le vaccin prototype E21aS (valeur p = 0,005, Figure 3). Cependant, même si la valeur médiane de neutralisation obtenue chez les animaux immunisés avec le cocktail de particules E14aS + E24aS était supérieure à celle des animaux immunisés avec le cocktail de particules E21aS + E23aS + E24aS (81 ,5% contre 70,5%, Figure 3), la différence n’était pas significative, probablement en raison du petit nombre d’animaux.
Ces données ont finalement démontré qu’un vaccin bivalent HBV/HCV à base de particules d’enveloppe sous-virales présentant des glycoprotéines d’enveloppe du virus HCV du même ou de différents génotypes peut être utilisé, selon diverses stratégies de combinaison, pour induire une large protection neutralisante contre différents génotypes du virus HCV (i.e. au moins contre les génotypes 1a, 1 b, 2a, 3a et 4a du virus HCV) ou pour fournir une protection contre la prévalence d’un génotype particulier dans une région donnée.
En conclusion, le mélange de différentes particules d’enveloppe sous-virales à base de protéines d’enveloppe peut être utilisé pour optimiser le vaccin prophylactique bivalent HBV-HCV, notamment en cas d’exposition potentielle à différents génotypes du virus HCV, surtout que ce vaccin est simple à produire. En effet, il peut être traité par des procédures industrielles adaptées de celles établies pour le vaccin contre le virus HBV, et il peut ainsi contribuer à contrôler l’épidémie mondiale d’hépatite C.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition immunogène comprenant un mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’au moins deux particules choisies parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux particules présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), ladite protéine native SHBV étant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B (HBV), et lesdites protéines fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV13 - SHBvdélétée et E2HCV33 - SHBvdélétée étant des protéines de fusion immunogènes comprenant au moins les deux polypeptides suivants :
# du côté C-terminal, un premier polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés de la protéine S d’un isolat du virus humain de l’hépatite B, laquelle protéine S est délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N-terminale ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B, et # du côté N-terminal, un second polypeptide constitué : de la séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C (HCV) ; ou d’une séquence d’acides aminés présentant un pourcentage d’identité d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve la capacité à former des particules d’enveloppe sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides aminés d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique dérivée de ladite séquence d’acides aminés du domaine transmembranaire et de l’ectodomaine d’une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que ladite séquence d’acides aminés conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a.
2. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence des particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée; et B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée
3. Composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence des particules caractérisées par la présence :
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ;
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée
4. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle ladite protéine native SHBV est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 2.
5. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle :
# ladite protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ;
# ladite protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ;
# ladite protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 22 ; et
# ladite protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée est choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24.
6. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit mélange est caractérisé :
# par la présence des particules caractérisées par la présence :
C. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 18 ; et
D. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20, ou par la présence :
# des particules caractérisées par la présence :
B. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 20 ;
C. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 22 ; et
D. d’une protéine native SHBV de séquence SEQ ID NO : 2 et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée de séquence SEQ ID NO : 24.
7. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, ladite composition comprenant de 5 pg à 50 pg, de préférence de 10 pg à 20 pg, dudit mélange de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses.
8. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, ladite composition étant formulée pour être administrée par l’une des voies suivantes : sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intra-nasale, pulmonaire, intra-auriculaire, parentérale, rectale, topique, transdermique, sous- cutanée, intramusculaire ou intraveineuse.
9. Méthode de préparation de la composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 comprenant au moins les étapes suivantes : i. optionnellement, une étape de production d’au moins deux lignées cellulaires choisies parmi : a. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; b. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; c. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et d. une lignée cellulaire capable de sécréter des particules d’enveloppe sous-virales caractérisées par la présence d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, l’une au moins desdites au moins deux lignées cellulaires sécrétant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ii. une étape de culture desdites au moins deux lignées cellulaires d’intérêt pour la production des particules d’enveloppe sous-virales chimères, immunogènes non infectieuses d’intérêt ; iii. une étape de purification des particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt à partir du milieu de culture collecté pour obtenir une solution de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt ; et iv. optionnellement, une étape de mélange desdites solutions de chacune desdites particules d’enveloppe sous-virales d’intérêt pour obtenir la composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Composition immunogène comprenant un mélange d’acides nucléiques en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle ledit mélange est caractérisé par la présence d’un acide nucléique codant une protéine native SHBV et d’au moins deux acides nucléiques choisis parmi :
A. un acide nucléique codant une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ;
B. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; C. un acide nucléique codant une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; et
D. un acide nucléique codant une protéine fusion E2Hcv3a - SHBvdélétée, l’un au moins desdits au moins deux acides nucléiques codant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), ladite protéine native SHBV étant la protéine S sauvage de l’antigène de surface d’un isolat du virus de l’hépatite B (HBV), et lesdites protéines fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV43 - SHBvdélétée, E2HCV13 - SHBvdélétée et E2HCV33 - SHBvdélétée étant des protéines de fusion immunogènes chacune codée par un acide nucléique comprenant au moins les deux séquences suivantes :
# du côté 3’, une première séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine S délétée de son domaine transmembranaire situé à son extrémité N- terminale, d’un isolat du virus de l’hépatite B ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 91%, notamment d’au moins 93%, particulièrement d’au moins 95%, et plus particulièrement d’au moins 97%, avec ladite séquence d’acides nucléiques de la protéine S délétée en N-terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous-virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un autre isolat du virus HBV, ou d’un variant synthétique, dérivée d’une séquence d’acides nucléiques de ladite protéine S délétée en N- terminal, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve la capacité à former des particules sous- virales non infectieuses, immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite B, et,
# du côté 5’ de la première séquence, une seconde séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C ; ou d’une séquence d’acides nucléiques présentant une homologie d’au moins 78%, notamment d’au moins 80%, particulièrement d’au moins 85%, et plus particulièrement d’au moins 90%, avec ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C ; ou de la séquence d’acides nucléiques d’un variant naturel issue d’un isolat du virus HCV, ou d’un variant synthétique, dérivée de ladite séquence d’acides nucléiques codant pour le domaine transmembranaire et l’ectodomaine d’au moins une protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C, sous réserve que la protéine codée par ladite séquence d’acides nucléiques conserve les propriétés immunogènes vis-à-vis du virus de l’hépatite C, ladite protéine d’enveloppe d’un isolat du virus de l’hépatite C étant choisie parmi les séquences codant la protéine E1 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 4a, la protéine E2 du virus HCV de génotype 1a et la protéine E2 du virus HCV de génotype 3a.
11. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 et 10 pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C.
12. Composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 et 10 pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite B.
13. Composition immunogène comprenant au moins deux préparations de particules d’enveloppe sous-virales, chimères, immunogènes et non infectieuses, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, dans laquelle chaque préparation est caractérisée par la présence d’une particule choisie parmi les particules caractérisées par la présence :
A. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée ; ou
B. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée ; ou
C. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV13 - SHBvdélétée ; ou
D. d’une protéine native SHBV et d’une protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, lesdites au moins deux préparations étant différentes, l’une au moins présentant soit une protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée (A) soit une protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée (B), et lesdites préparations étant soit sous forme de préparations combinées soit sous forme de préparations séparées, pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique, et/ou dans la prévention de l’hépatite C et/ou de l’hépatite B, dans laquelle lesdites au moins deux préparations sont administrées simultanément, séparément ou séquentiellement dans le temps.
14. Protéine fusion choisie parmi : a. la protéine fusion E1 HCV43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 18 ; b. la protéine fusion E2HCV43 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 20 ; c. la protéine fusion E2HCV33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 24 ; et d. la protéine fusion E1 HCV33 - SHBvdélétée, notamment celle choisie parmi les séquences ayant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28, de préférence au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 28.
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