JPH09506247A - ヘモフィリス属菌株トランスフェリン受容体遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘモフィリス属菌株のトランスフェリン受容体タンパク質またはトランスフェリン受容体タンパク質のフラグメントまたはその類似体をコードする精製・分離した核酸を提供する。核酸塩基配列は、Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２タンパク質を有する細菌による汚染物質のないペプチドを生産するのに使用でき、細菌の有するこれらのタンパク質は、免疫診断または治療目的のために有用である。さらに、この核酸は感染症の診断に有用である。組換えＴｂｐ１またはＴｂｐ２タンパク質およびこれらの精製法も提供する。トランスフェリン受容体タンパク質のエピトープを発現する生きたベクターはワクチンとして有用であり、本発明で提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモフィリス属菌株トランスフェリン受容体遺伝子 発明の分野 本発明は、トランスフェリン受容体をコードしている遺伝子のクローニング、 特に、Haemophilus influenzae（ヘモフィリス属インフルエンザ菌）のトランス フェリン受容体遺伝子のクローニングに関する。 関連出願のレファレンス 本出願は１９９３年１２月２９日出願の同時係属米国特許出願番号０８／１７ ５１１６の一部継続出願であり、この米国特許出願自体は１９９３年１１月８日 出願の同時係属米国特許番号０８／１４８，９６８の一部係属出願である。 発明の背景 被包性インフルエンザ菌ｂ型株は小児における細菌性髄膜炎やその他の侵入性 感染症の主な原因菌であある。 一方、非被包性または類型分類不能のインフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）は、中耳 炎、喉頭蓋炎、肺炎、気管気管支炎のような広範囲のヒトの疾病原因菌となって いる。インフルエンザ菌に対するワクチンとしてはｂ型インフルエンザ菌の夾膜 多糖をベース剤として、ジフテリア類毒素由来のタンパク質と抱合させたものな どが報告されている(Berkowitz et al.，1987)。 この出願の全体を通して、本発明と関係する最先端 技術を詳細に報告している種々のレファレンスを括弧に囲んで各所で紹介してい る。各レファレンスの完全な文献名はクレイムのすぐ前にある明細書の最後に示 してあるので参照してほしい。これらのレファレンスで開示されている内容につ いても、本発明の中で参考文献の内容として示している箇所もある。 破傷風類毒素(Classon et al.，1989，米国特許４，４９６，５３８)または髄 膜炎外層膜タンパク質(Black et al.，1991)は、インフルエンザ菌ｂ型が原因と なっている髄膜炎には免疫効果があるが、ＮＴＨｉ（類型分類不能のインフルエ ンザ菌）が原因となっている疾病には免疫効果がない(Bluestone，1982)。 中耳炎は、若年小児の最もありふれた病気であり、その６０％から７０％は２ 才以下までに感染する。慢性中耳炎は小児における聴覚障害、言語障害、知覚障 害の原因である。急性中耳炎の３０％、慢性中耳炎の６０％はインフルエンザ菌 が原因菌となっている。中耳炎の治療費は、抗生物質や扁挑摘出手術、アデノイ ド切除手術、鼓膜切開チューブ挿入手術などの外科治療費のために、米国だけで 年間１０−２０億ドルに達しているのである。さらに、中耳炎の原因菌の多くは 抗生物質に対して薬剤耐性を獲得しつつある。従って、中耳炎に予防効果のある ワクチンの開発が待たれるところである。類型分類不能のインフルエンザ菌は、 高 齢者や特に呼吸系感染を受け易い体質のヒトにおける肺炎の重要な原因菌である 。このように、インフルエンザ菌を防御することのできる免疫製剤の成分として のインフルエンザ菌由来の抗原タンパク質に対する需要がある。 鉄は多くの細菌の成長に不可欠の栄養素である。インフルエンザ菌、カタル球 菌、髄膜炎菌、淋菌のようなヒトにおける数種の病原菌および片利共生ナイヤリ ア属菌のような非病原菌は、ヒトのトランスフェリンをそれらの細菌の成長のた めの鉄源として利用する(Schryvers，1988; Schryvers and Lee，1989; Mickela een and Sparling，1981)。細菌のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は２個の タンパク分子鎖、Ｔｂｐ１、Ｔｂｐ２から構成されている。インフルエンザ菌株 の場合、この受容体のタンパク鎖Ｔｂｐ１の分子量は約１００，０００であるが 、一方、Ｔｂｐ２の分子量に、菌株の種類により変動と幅があり、その範囲は約 ６０，０００から９０，０００である(Schryvers and Gray-Owen，1992; Hollan d et al.，1992)。インフルエンザ菌のトランスフェリン受容体の発現は鉄調節 またはヘミン調節を受けると考えられているが、(Morton et al.，1993)、その 推定結合部位はｔｂｐ２の上流とされている。この塩基配列は遺伝子のプロモー タ剖位に見られ、鉄による負の調節を受ける。このこ とは髄膜炎菌のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）にもあてはまる(Legrain et al.，1993)。遺伝子のプロモータ部位の後にｔｂｐ２遺伝子とｔｂｐ１遺伝子が 続き、その配列は細菌のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）オペロンの形で見い 出される。抗体が、トランスフェリン受容体の鉄源への接近を阻害して、その結 果として細菌の細胞成長を阻止すると考えられている。 さらに、ＴｆＲに対する抗体の食菌作用、殺菌作用が防御の役目を果たす。こ のようなメカニズムにより、トランスフェリン受容体とそのフラグメントおよび それを構成しているタンパク鎖またはペプチドを、インフルエンザ菌が原因とな る病気のワクチンとして使えるのである。完全フロイントアジュバントを併用し て、髄膜炎菌トランスフェリン受容体タンパク質で免疫したネズミにおいては、 同種免疫において防御作用を示し、抗ＴｆＲ抗血清には抗原殺菌効果が認められ 、受動伝達検定でもその防御作用を発揮した(Danve at al.，1993)。胸膜肺炎菌 組換えＴｂｐ２で免疫したブタでは、同種移植例では防御作用を示したが、異種 移植では防御作用を示さなかった(Rossu-canpos at al.，1992)。これらの結果 は、ＴｆＲ由来のワクチンには病気に対する防御効果があることを示している。 診断、免疫感作、診断薬・免疫製剤の作製のために、トランスフェリン受容体 とそれとそれを構成している ペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列を提供すること、そのような塩基配 列を有するベクターを提供することが望まれるのである。 ポリオウイルスはピコルナウイルス科の一つの属であるエンテロウイルスであ る。このウイルスには明らかに識別可能な３種の血清型があり、同じ血清型でも 多種の菌株がある。この毒性株は麻痺性ポリオの原因菌である。ポリオ発症の可 能性を無くした弱毒株や不活性株はワクチンとして使用されている。このウイル スを感染させると長期の防御的粘膜性免疫を誘起する。不活性ポリオウイルスワ クチンを接種することでも粘膜性免疫を賦与できる。 ポリオウイルス自体の構造はよく知られており、菌株間および血清型間で極め て保存的タイプのものである。他の数種のピコルナウイルス（ピコナウイルス科 の中の属に分類されるウイルス）の構造もすでに判明しており、その構造はポリ オウイルスにと非常に類似している。ポリオウイルスのキャプシドに異種のエピ トープを発現させることは可能であり(Murdin et al.，1992)、この技術は別の ピコルナウイルスにも適用されている。発現したエピトープは、通常は短かい抗 原で構造が明確で連続形をしており、大概、ポリオウイルスの中和抗原部位Ｉ（ ＮＡｇＩ）または別のピコルナウイルスの同様の部位に存在する。この部位には ポ リオウイルス・キャプシド・タンパク質・ＶＰ１のループリンク・ベータ・スト ランドＢ，Ｃ（ＢＣループ）がある。ＶＰ１のＢＣループは表面が外側に張りだ したループで、９個のアミノ酸から成っており、これは他のアミノ酸での置換も 可能であり、少なくとも２５個のヘテロアミノ酸で伸張できる(Murdin et al.， 1991)。トランスフェリン受容体を発現するハイブリッド型またはキメラ型ポリ オウイルスは高力価の抗原であるので、ワクチンとして、あるいは、免疫製剤の 原料として有用である。 発明の要約 本発明の目的は、ヘモフィリス属インフルエンザ菌のトランスフェリン受容体 またはそのフラグメントまたはその類似体をコードしている不純物を含まない精 製分離した核酸分子を提供することである。本発明で提供する核酸分子は、イン フルエンザ菌の特異的検出、インフルエンザ菌の感染の診断に有用である。本発 明で提供する不純物を含まない精製分離した核酸分子（例えば、ＤＮＡ）は、Ｄ ＮＡ組換え技術を利用することによりトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を発現 させることが可能で、この方法により、低コストで不純粋物を含まない精製・分 離トランスフェリン受容体サブユニットを供給できる。トランスフェリン受容体 、そのサブユニット、そのフラグメントまたはその類似 体、これらをコードしている核酸分子およびそのような核酸分子をもっているベ クターは、インフルエンザ菌の感染の診断、インフルエンザ菌が原因で発症する 疾病に対する免疫製剤の作製に有用である。本発明の提供するトランスフェリン 受容体タンパク質を使用して産生されるモノクローナル抗体または単一特異性抗 血清は、インフルエンザ菌の感染の診断、インフルレンザ菌の特異的検出（in v itroとin vivo検定）、インフルエンザ菌が原因で発症した疾病の治療に有用で ある。 トランスフェリン受容体部位に対応するペプチドまたはその類似体は、インフ ルエンザ菌の感染の診断、インフルエンザ菌が原因で発症する疾病に対する免疫 製剤の作製に有用である。本発明で提供するこれらのペプチドの投与により産生 されるモノクローナル抗体または抗血清は、インフルエンザ菌の感染の診断、イ ンフルレンザ菌の特異的検出（in vitro・in vivo検定）およびインフルエンザ 菌が原因で発症する疾病の受動免疫治療としても有用である。 本発明の態様の一つは、インフルエンザ菌、特に、ＤＬ６３株、Ｅａｇａｎ株 、ＭｉｎｎＡ株のようなインフルエンザ菌ｂ型株、または、ＰＡＫ１２０８５、 ＳＢ３３、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０，ＳＢ３２のような類型分類不能のイ ンフルエンザ菌株のトラン スフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントや類似体をコードしている 不純物を含まない精製・分離した核酸分子を提供することである。 本発明の好適な実施例としては、本発明の核酸分子がインフルエンザ菌のＴｂ ｐ１タンパク質だけ、またはインフルエンザ菌のＴｂｐ２タンパク質だけをコー ドすることができることである。本発明のもうひとつの好適な実施例としては、 本発明の核酸分子は、トランスフェリン受容体タンパク質を産生する細菌の中で 保存されいる保存的アミノ酸配列順序を有するインフルエンザ菌のトランスフェ リン受容体のタンパク質のフラグメントをコードすることができることである。 そのような保存的アミノ酸配列順序は、表２、３で示されたようなインフルエン ザ菌ｂ株Ｅａｇａｎのペプチドおよびその他のインフルエンザ菌株のペプチドの アミノ酸配列順序に含まれているアミノ酸シーケンスを有することである。 本発明のもうひとつの態様は、精製した分離核酸分子を提供することであり、 その核酸分子は下記のグループ（ａ）（ｂ）（ｃ）から選択されたＤＮＡ塩基配 列をもつ。グループ（ａ）は、図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１（Ｓ ＥＱ．ＩＤ番号では、１，２，３，４，１０５，１０８，１１０，１１２，１１ ４）に示されたＤＮＡ塩基配列のうちのいずれか一つ、ま たは上記塩基配列のうちのいずれかの一つの相補的ＤＮＡ配列。グループ（ｂ） は、図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１（ＳＥＱ．ＩＤ番号では、５， ６，７，８，９，１０，１１，１２，１０６，１０７，１０９，１１１，１１３ ，１１５）で示されたアミノ酸配列順序のうちの一つをコードするＤＮＡ塩基配 列。グループ（ｃ）は、（ａ）（ｂ）で定義されたＤＮＡ塩基配列のうちのいず れかと厳格な条件下でハイブリッド形成されたＤＮＡ塩基配列。（ｃ）で定義さ れたＤＮＡ塩基配列が、（ａ）と（ｂ）で定義されたＤＮＡ塩基配列のいずれか 一つと配列上の少なくとも９０％の同一性を有することが望ましい。 本発明のもう一つの態様は、宿主の形質転換に使用されるベクターの提供であ り、これには上記の核酸を含む。このベクターは、ＡＴＣＣ（米国微生物寄託機 関）承認番号７５６０３のプラスミドＤＳ−７１２−１−３の特質を有するか、 または、ＡＴＣＣ・承認番号７５６０７のプラスミドＪＢ−１０４２−７−６の 特質を有する。 このプラスミドは、コードされたトランスフェリン受容体、そのフラグメント 、その類似体を、異種または同種宿主の中で、リピド化（脂質化）した状態また は脂質化してない状態で発現させるために使用される。従って、本発明の別の態 様は、上記の核酸を含む、宿 主の形質転換用の発現ベクターを提供すること、および核酸により宿主がトラン スフェリン受容体またはそのフラグメントや類似体を発現する方法を提示するこ とである。本発明の特別な実施例として、本発明にかかる核酸分子は、実質的に インフルエンザ菌株のすべてのトランスフェリン受容体タンパク質をコードする こともできるし、そのＴｂｐ１タンパク質だけ、または、そのＴｂｐ２タンパク 質だけをコードすることもできることである。その発現方法として、宿主からの トランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントや類似体の分泌のた めのリーダ塩基配列をコードする核酸部分を含ませることができる。さらに、こ の発現方法として、宿主からのトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフ ラグメントや類似体を、脂質化した状態で発現させるための脂質化シグナルをコ ードする核酸部分を含ませることができる。この発現プラスミドは、プラスミド ＪＢ−１４６８−２９、ＪＢ−１６００−１、ＪＢ−１４２４−２−８と同一の 特質を有する。宿主としては、例えば、大腸菌、バシラス、ヘモフィルス、真菌 、酵母、バキュロウイルスから選択され、セムリキ森林熱ウイルス発現システム が利用される。 発明の追加態様としては、上記の発現ベクターを有する形質転換された宿主が 提供される。ＪＢ−１４７ ６−２−１、ＪＢ−１４３７−４−１、ＪＢ−１６０７−１−１から、そのよう な宿主が選択される。本発明では、さらに形質転換した宿主が産生する組換えト ランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントや類似体を提供する。 下記に詳述する通り、本発明では、Ｔｂｐ１タンパク質受容体とＴｂｐ２タン パク質受容体を互いに別々の形で産生させることができる。即ち、ヘモフィルス 株由来のＴｂｐ１タンパク質をＴｂｐ２タンパク質の混ざらない、しかも、不純 物を含まない分離した状態で産生させ、他方、ヘモフィルス株由来のＴｂｐ２タ ンパク質をＴｂｐ１タンパク質の混ざらない、しかも、不純物を含まない分離し た状態で産生させることができる。ヘモフィリス属の菌株は、インフルエンザ菌 ｂ株またはインフルエンザ菌の類型分類不能株である。 本発明ではトランスフェリン受容体に対応する合成ペプチドも提供する。即ち 、６個以上１５０個以下のアミノ酸を有し、細菌株のトランスフェリン受容体タ ンパク質またはトランスフェリン受容体タンパク質類似体の一部分だけに対応す るアミノ酸配列順序を有する合成ペプチドも提供する。ここでの細菌株は、ヘモ フィリス属菌株、特に、インフルエンザ菌株のｂ型株またはインフルエンザ菌の 類型分類不能株である。 この発明で提供されるペプチドは、ヘモフィリス属 菌などの、細菌内で保存され、トランスフェリン受容体タンパク質を産生するア ミノ酸シーケンスを有する。このペプチドのアミノ酸配列はＬＥＧＧＦＹＧＰ（ ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４）またはＬＥＧＧＦＹＧ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：８５）で ある。このペプチドは、インフルエンザ菌ｂ型株のＥａｇａｎおよびその他のイ ンフルエンザ菌株のシーケンスを示した表２または３の中から選択されたアミノ 酸配列順序を有する。 本発明の別の態様では、少なくとも１個の上記核酸分子から選択される免疫有 効成分、少なくとも一個の上記組換えタンパク質、精製分離したＴｂｐ２タンパ ク質またはＴｂｐ１タンパク質、少なくとも一個の合成ペプチドから成る免疫原 成分、および、生きたベクターと薬学的見地から受け入れ可能なキャリアを提供 する。ここでの少なくとも一個の有効成分は宿主に投与された際には免疫応答を するものである。 この発明で提供される免疫原性製剤は、ワクチンの形でも作製され、それをin vivo投与をした場合に、トランスフェリン受容体を産生する細菌性病原菌が原 因で発症する疾病に防御機能を発揮する。このような目的のために、この免疫原 性製剤は、微粒子の形か、カプセルやリポソームを使用しても投与されるように 調製される。別な方法として、免疫システムの特定の細胞や粘膜表面にターゲッ トデリバリー（標的を定めた 与）できる分子と組み合わせても使用できる。さらに、この免疫原性成分は、多 数のトランスフェリン受容体を産生する細菌が原因となった疾病に対する防御を する多数の有効成分から成る場合もある。アジュバントこの免疫製剤と併用でき る。 本発明のもう一つの態様では、トランスフェリン受容体タンパク質を産生する ヘモフィリス株が原因で発症した病気またはその感染に対する防御を誘発する方 法を提供するもので、ヒトのような感染しやすい宿主に効果的な量の免疫原生成 分を投与する手段も含まれる。 さらに、本発明では、組換えタンパク質、不純物を含まない精製分離したＴｂ ｐ２タンパク質またはＴｂｐ１タンパク質、合成ペプチド、免疫原性成分に特異 的に反応する抗血清または抗体を提供する。 別な態様として、トランスフェリン受容体を宿主に伝達するための、上記の核 酸分子を有する生きたベクターも提供する。このベクターは、サルモネラ菌、Ｂ ＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイル スから選ぶ。特に、ポリオウイルスを使用する。その核酸分子はトランスフェリ ン受容体のフラグメントをコードしており、含まれるアミノ酸配列順序はＬＥＧ ＧＦＹＧＰ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４）またはＬＥＧＧＦＹＧ（ＳＥＱ．ＩＤ番 号：８５）である。本発明ではプラスミドベクターを提供し、それは、ｐＴ７Ｔ ＢＰ２Ａ、ｐＴ７ＴＢＰ２Ｃ、ｐＴ７ＴＢＰ２Ｄ（ＡＴＣＣ承認番号：７５９３ １，７５９３２，７５９３３，７５９３４）の特質を有する。 追加の態様として、トランスフェリン受容体タンパク質を産生しないヘモフィ リス属菌株も提供する。そのような菌株では、トランスフェリン受容体をコード する遺伝子があるけれども、挿入突然変異誘発などでトランスフェリン受容体産 生機能が働かないよになっている。弱毒化した菌株としてヘモフィリス菌株を提 供し、これは弱毒化されている菌株であるが、トランスフェリン受容体の伝達を するベクターが含まれている。 上記で説明したように、本発明の態様として、ヘモフィリス属菌、特にインフ ルエンザ菌株の新規Ｔｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質を提供するが 、これらは互いに混ざることはなく別のもので不純物を含まない分離した状態で 提供される。さらに別の態様として、そのようなタンパク質の産生方法を提供す る。不純物を含まない分離したヘモフィリス属株Ｔｂｐ１タンパク質またはＴｂ ｐ２タンパク質の生産方法を含み、その方法には次のステップ（ａ）から（ｉ） までを含む。即ち、ステップ（ａ）顆粒画分内でのＴｂｐ １タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質の組換え宿主発現（別々に発現）をさせ ること。ステップ（ｂ）宿主を増殖させて細胞塊を得ること。ステップ（ｃ）細 胞塊をつぶして細胞溶解物を得ること。ステップ（ｄ）細胞溶解物を分離して最 初の上澄み液と最初のペレットを得ること。この最初の上澄み液には大量の可溶 性宿主タンパク質が含まれる。ステップ（ｅ）最初のペレットから最初の上澄み 液を分離すること。ステップ（ｆ）最初のペレットを選択的に抽出し可溶性宿主 タンパク質と可溶性宿主膜タンパク質を除去し、第二の上澄み液と顆粒分画を含 む抽出ペレットを得ること。ステップ（ｇ）抽出ペレットから第二の上澄み液を 分離すること。ステップ（ｈ）抽出ペレットを溶解し溶解抽出物を作製すること 。ステップ（ｉ）溶解抽出物を分離して、フラクションを含むＴｂｐ２タンパク 質またはＴｂｐ１タンパク質を取り出すこと。細胞溶解物を分別し、最初の上澄 み液を得る。最初のペレットでは少なくとも一回の海面活性剤抽出で効果が得ら れる。 溶解抽出物をゲル濾過してフラクションを含むＴｂｐ１タンパク質またはＴｂ ｐ２タンパク質を取り出し、これを分離して海面活性剤を除去し、さらに精製し たＴｂｐ２タンパク質またはＴｂｐ１タンパク質溶液を得る。 図面の簡単は説明 本発明は下記の説明と図面を参照することでさらに理解が深まる。 図１Ａはインフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株のトランスフェリン受容体オペロン の２個のプラスミドクローン（ｐＢＨＴ１、ｐＢＨＴ１）の制限酵素地図である 。 図１Ｂはインフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株のトランスフェリン受容体（Ｔｆ Ｒ）遺伝子を含むクローンＳ−４３６８−３−３とＪＢ−９０１−５−３の制限 酵素地図である。 図１Ｃはインフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株のトランスフェリン受容体遺伝子 を含むクローンＤＳ−７１２−１−３の制限酵素地図である。 図１Ｄは類型分類不能インフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５株のトランスフェリ ン受容体遺伝子を含むクローンＪＢ−１０配列４２−７−６の制限酵素地図であ る。 図２は、特定菌株のクローン化したＴｂｐ１とＴｂｐ２遺伝子の形成地図と制 限酵素地図であり、単一プロモータの転写調節の下でのオペロンの直列形成にお ける２個の遺伝子（ｔｂｐ１とｔｂｐ２）を有するＴｆＲオペロン遺伝子形成の 状態を示し、ヘモフィリス属菌由来のＴｆＲ遺伝子のライブラリを探知するため に使用されるｐＢＨＩＴ２の３．０ｋｂ・ＤＮＡフラ グメントである。 図３は、インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株由来のトランスフェリン受容体遺伝 子（ＳＥＱ．ＩＤ番号１）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列順 序（ＳＥＱ．ＩＤ番号５−Ｔｂｐ１とＳＥＱ．ＩＤ番号６−Ｔｂｐ２）である。 下線のあるアミノ酸配列はアミノ酸塩基決定法により確定されたＴｂｐ１のペプ チドと対応している。推定上のシグナル配列は二重線で示し、Ｔｂｐ１の残基１ から１７まで、Ｔｂｐ２の残基１から２５に対応している。 図４は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株由来のトランスフェリン受容体遺 伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号２）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列 順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号７−Ｔｂｐ１とＳＥＱ．ＩＤ番号８−Ｔｂｐ２）である 。推定の−３５配列，−１０配列とリボソーム結合都位塩基配列は上に線を付け てある。 図５は、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株由来のトランスフェリン受容体遺 伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号３）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列 順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号９−Ｔｂｐ１とＳＥＱ．ＩＤ番号１０−Ｔｂｐ２）であ る。推定の−３５配列，−１０配列とリボソーム結合部位塩基配列は上に線が付 けてある。 図６は、類型分類不能インフルエンザ菌ＰＡＫ・１２０８５株由来のトランス フェリン受容体遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号４）のヌクレトチドの塩基配列および 推定アミノ酸配列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号１１−Ｔｂｐ１とＳＥＱ．ＩＤ番号１ ２−Ｔｂｐ２）である。推定の−３５配列，−１０配列とリボソーム結合部位塩 基配列には上に線を付けてある。 図７は、類型分類不能インフルエンザ菌ＳＢ３３株由来のトランスフェリン受 容体遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号１０５）のヌクレトチドの塩基配列および推定ア ミノ酸配列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号１０６−Ｔｂｐ１とＳＥＱ．ＩＤ番号１０７ −Ｔｂｐ２）である。 図８は、類型分類不能インフルエンザ菌ＳＢ１２株由来のＴｂｐ２遺伝子（Ｓ ＥＱ．ＩＤ番号１０８）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列順序 （ＳＥＱ．ＩＤ番号１０９−Ｔｂｐ２）である。 図９は、類型分類不能インフルエンザ菌ＳＢ２９株由来のＴｂｐ２遺伝子（Ｓ ＥＱ．ＩＤ番号１１０）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列順序 （ＳＥＱ．ＩＤ番号１１１−Ｔｂｐ２）である。 図１０は、類型分類不能インフルエンザ菌ＳＢ３０株由来のＴｂｐ２遺伝子 （ＳＥＱ．ＩＤ番号１１２）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列 順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号１１３−Ｔｂｐ２）である。 図１１は、類型分類不能インフルエンザ菌ＳＢ３２株由来のＴｂｐ２遺伝子（ ＳＥＱ．ＩＤ番号１１４）のヌクレトチドの塩基配列および推定アミノ酸配列順 序（ＳＥＱ．ＩＤ番号１１５−Ｔｂｐ２）である。 図１２Ａはインフルエンザ菌Ｅａｇａｎ株（ＳＥＱ．ＩＤ番号１１６）、Ｍｉ ｎｎＡ（ＳＥＱ・ＩＤ番号１１７）、ＰＡＫ・１２０８５（ＳＥＱ・ＩＤ番号１ １８）、ＳＢ３３（ＳＥＱ・ＩＤ番号１１９）のプロモータ部位とｔｂｐ２遺伝 子の５’末端のヌクレオチド塩基配列である。ＰＣＲでｔｂｐ２遺伝子を増幅す るのに使用するコード化ストランドプライマーには下線を付けてある（ＳＥＱ・ ＩＤ番号１２０）。 図１２Ｂはインフルエンザ菌Ｅａｇａｎ（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２１）、Ｍｉｎ ｎＡ（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２２）、ＤＬ６３（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２３）、ＰＡ Ｋ・１２０８５（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２４）、ＳＢ１２（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２ ５）、ＳＢ２９（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２６）、ＳＢ３０（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２ ７）、ＳＢ３２（ＳＥＱ・ＩＤ番号１２８）の遺伝子間部位とｔｂｐ１遺伝子の ５’末端のヌクレオチド塩基配列である。ＰＣＲでｔｂｐ２遺伝子を増幅するの に使用する非コード化ストランドプライマーには下線を付けてある（ＳＥＱ・Ｉ Ｄ番号１２９）。 図１３は、類型分類不能のインフルエンザ菌ＳＢ１ ２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２、ＳＢ３３株由来のＰＣＲで増幅したｔｂｐ ２遺伝子のアガロースゲル分析の結果を示したものである。列１はＳＢ３３、列 ２はＳＢ１２、列１３はＳＢ２９、列４はＳＢ３０、列５はＳＢ３２である。 図１４は、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、ＰＡＫ・１２０８５、Ｓ Ｂ３３株（ＳＥＱ・ＩＤ番号７，５，１１，１０６）、髄膜炎菌Ｂ１６Ｂ６株と Ｍ９８２株（ＳＥＱ・ＩＤ番号９４、９５）、淋菌ＦＡ１９株（ＳＥＱ・ＩＤ番 号９６）由来のＴｂｐ１遺伝子のそれぞれのアミノ酸配列順序を比較したもので ある。 図１５は、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、ＰＡＫ・１２０８５、Ｓ Ｂ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２株（ＳＥＱ・ＩＤ番号８，６，１２，１ ０９，１１０，１１２，１１４）、髄膜炎菌Ｂ１６Ｂ６株とＭ９８２株（ＳＥＱ ・ＩＤ番号９７、９８）、淋菌ＦＡ１９株、アクチノバチルス属胸膜肺炎菌ＡＰ ２０５，ＡＰ３７（ＳＥＱ・ＩＤ番号９９、１００）由来のＴｂｐ２遺伝子のそ れぞれのアミノ酸配列順序を比較したものである。 図１６Ａは、インフルエンザ菌由来Ｔｂｐ１タンパク質の予想二次構造であり 、１６Ｂは、インフルエンザ菌Ｔｂｐ２タンパク質の予想二次構造である。 図１７は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ１遺伝子を大腸菌に発現 させるプラスミドＪＢ−１４６８−２９の構造である。 図１８は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２遺伝子を大腸菌に発現 させるプラスミドＪＢ−１４２４−２−８の構造である。 図１９は、プラスミドＪＢ−１４２４−２−８を作製するために使用したオリ ゴヌクレオチド対（ＳＥＱ・ＩＤ番号１３０、１３１）を示したものである。 図２０は、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２発現プラスミドを作製するためのオリゴヌクレ オチド対Ａ（ＳＥＱ・ＩＤ番号８６、８７）、Ｂ（ＳＥＱ・ＩＤ番号８８、８９ ），Ｃ（ＳＥＱ・ＩＤ番号９０、９１），Ｄ（ＳＥＱ・ＩＤ番号９２、９３）を 示したものである。 図２１は、インフルエンザ菌ＳＢ株Ｔｂｐ２遺伝子を大腸菌に発現させるプラ スミドＪＢ−１６００−１の構造である。 図２２はヘモフィリス属菌ｂ株Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ１タンパク質、Ｅａｇａｎ ・Ｔｂｐ２タンパク質、類型分類不能インフレエンザ菌ＳＢ１２株・Ｔｂｐ２タ ンパク質の大腸での発現から得られた産生物質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示して いる。列１、ｔ₀でのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／Ｅａｇａｎ−Ｔｂｐ１） ；列２、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４７６−２−１； 列３、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ 、３１ｋＤａの分子量マーカ；列４、ｔ₀でのＪＢ−１４３７−４−１（Ｔ７／ Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２）；列５、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４３７−４−１；列 ６、ｔ₀でのＪＢ−１６０７−１−１（Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２）；列７、 ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１６０７−１−１。 図２３は、大腸菌で発現される組換えＴｂｐ１とＴｂｐ２の不純物除去法であ る。 図２４は、図２３で不純物除去された組換えＴｂｐ１とＴｂｐ２の純度分析を 示す。列１には分子量マーカ（１０６，８０，４９．５，３２．５，２７．５， １８．５ｋＤａ）が含まれている。列２は大腸菌全細胞溶解物である。列３は溶 解顆粒分画。列４は精製Ｔｂｐ１とＴｂｐ２。 図２５は、ネズミにおけるｒＴｂｐ１（上側パネル）とｒＴｂｐ２（下側パネ ル）の免疫原性を示す。 図２６はウエスタンブロット法による抗Ｅａｇａｎ・ｒＴｂｐ１抗血清の種々 のインフルエンザ菌株との反応性を示す。列１、ＢＬ２１／ＤＥ３；列２、ＳＢ １２ −ＥＤＤＡ；列３、ＳＢ１２ ＋ＥＤＤＡ；列４、ＳＢ２９ −ＥＤＤＡ ；列５、ＳＢ２９ ＋ＥＤＤＡ；列６、ＳＢ３３ −ＥＤＤＡ；列７、ＳＢ３３ ＋ＥＤＤＡ、列８、Ｅａｇａｎ −ＥＤＤＡ；列９、 Ｅａｇａｎ ＋ＥＤＤＡ；列１０、カタル球菌 ４２２３ −ＥＤＤＡ、列１１ 、カタル球菌 ４２２３ ＋ＥＤＤＡ、列１２、髄膜炎菌 ６０８ −ＥＤＤＡ 、列１３、髄膜炎菌 ６０８ ＋ＥＤＤＡ、列１４、誘導ＪＢ−１４７６−２− １発現組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｐ１、列１５、分子量マーカ。特定−９５ｋＤＡ バンドは列３，４，５，７，８，９において抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し、これは 、インフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３３、Ｅａｇａｎと対応する。 −１１０ｋＤＡバンドは列１０，１１において抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し、これ は、カタル球菌４２２３株と対応する。−８０ｋＤＡバンドは列１２，１３にお いて抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し、これは、髄膜炎菌６０８株と対応する。 図２６はウエスタンブロット法による抗Ｅａｇａｎ・ｒＴｂｐ２抗血清の種々 のインフルエンザ菌株との反応性を示す。列１、分子量マーカ；列２、誘導ＪＢ −１４３７−４−１発現組換えＥａｇａｎ−Ｔｂｐ２、列３、ＳＢ１２ −ＥＤ ＤＡ；列４、ＳＢ１２ ＋ＥＤＤＡ；列５、ＳＢ２９ −ＥＤＤＡ；列６、ＳＢ ２９ ＋ＥＤＤＡ；列７、ＳＢ３０ −ＥＤＤＡ；列８、ＳＢ３０ ＋ＥＤＤＡ 、列９、ＳＢ３２ −ＥＤＤＡ；列１０、ＳＢ３３ −ＥＤＤＡ；列１１、ＳＢ ３３ ＋ＥＤＤＡ；列１２、ＰＡＫ −ＥＤＤＡ 列１３、ＰＡＫ ＋ＥＤＤＡ；Ｅａｇａｎ −ＥＤＤＡ；列１５、Ｅａｇａｎ ＋ＥＤＤＡ。特定６０−７０ｋＤＡバンドは列３，６，７，８，１３，１４にお いて抗Ｔｂｐ２抗血清と反応し、これは、インフルエンザ菌ＳＢ１２、ＳＢ２９ 、ＳＢ３０、ＰＡＫ、Ｅａｇａｎ株と対応する。 図２８は、トランスフェリン受容体を産生しないインフルエンザ菌株を作製す るのに使用したプラスミドｐＵＨＩＴ１ＫＦＨ、ｐＵＨＩＴ１ＫＦＰの構造を示 したものである。 図２８は、トランスフェリン受容体を産生する細菌内で保存されているトラン スフェリン受容体タンパク質由来のエピトープを発現するキメラポリオウイルス をコードしたプラスミドの構造である。 図３０は、ウサギの免疫により産生された抗血清と、トランスフェリン受容体 を産生する細菌内で保存されるトランスフェリン受容体タンパク質由来のエピト ープを発現するポリオウイルスのキメラとの反応性を示したウエスタンブロット 法の結果である。パネルＡは、大腸菌に発現されたインフルエンザ菌株ＳＢ１２ の不純物を除去した組換えＴｂｐ２、カタル菌４２２３株（列２）の不純物を除 去したＴｂｐ２、鉄制限カタル菌４２２３株（列３）の全細胞溶解物、鉄制限の 無い条件下で増殖した大腸菌ＪＭ１０９の全細胞溶解物 （列５）を示すクーマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルである。パネルＢは 、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａ（ウサギ４０、４１、４２）で免疫したウサギから２７日間 採取した血清プールを使用した同型ゲルのウエスタンブロット法試験の結果であ る。パネルＣは、ウサギの免疫を行う前に採取した血清プールを使用した場合の 試験結果で、反応は最小であった。 上図では、部位特異性制限エンドヌクレアーゼをを示すために下記のような略 字が使用されている。即ち、Ｒ、Ｅｃｏ ＲＩ； Ｐｓ、Ｐｓｔ Ｉ；Ｈ、Ｈｉ ｎｄ ＩＩＩ；Ｂｇ、Ｂｇ１ ＩＩ；Ｎｄｅ，Ｎｄｅ Ｉ；Ｅａｒ、Ｅａｒ Ｉ ；Ｓａｕ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ。 図２８では、剖位特異性制限エンドヌクレアーゼを示す下記のような略字が使 用されている。即ち、Ａ、Ａｃｃ Ｉ；Ｂ、Ｂａｍ ＨＩ；Ｅ、Ｅｃｏ ＲＩ； Ｏ、Ｘｈｏ Ｉ；Ｈ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｐｓ，Ｐｓｔ Ｉ；Ｖ、Ｅｃｏ ＲＶ ；Ｘ、Ｘｂａ Ｉ；Ｇ、Ｂｇｌ ＩＩ；Ｓ、Ｓａｌ Ｉ；Ｋ、Ｋｐｎ Ｉ；Ｓ＊ 、Ｓａｃ Ｉ。 発明の一般的説明 本発明の実施例で示したようなトランスフェリン受容体をコードしている核酸 部分から成り、ＤＮＡ分子の形態をした精製分離した核酸を提供しようとする場 合に、ヘモフィリス属菌株は便利に使用できる菌であ る。この菌株は臨床現場からでも、米国のＡＴＣＣのような細菌収集機関から入 手可能である。 本発明の態様に従って、トランスフェリン受容体タンパク質は、ヘモフィリス 属菌株から、Schryvers(1989)やOgunnviwo and Schryvers(1992)の方法、米国特 許第５，１４１，７４３の方法に従うことで分離が可能である。これらの内容は レファレンスで示している。この分離方法の詳細は米国特許第５，１４１，７４ ３に説明されているが、その要約は下記の通りである。このトランスフェリン受 容体の分離は、細胞膜フラクションをトランスフェリン結合作用を示している細 菌株から分離し、アフィニティ法でトランスフェリン受容体から不純物を除去す る方法で行う。この方法には、膜フラクションの中で事前にトランスフェリンを トランスフェリン受容体に結合させ、その後、この膜を溶解させトランスフェリ ンを固定化し、その固定化させたトランスフェリンからトランスフェリン受容体 を分離するという連続ステップを含む。上記の方法と別の修正法では、Ogunnviw oとSchryvers(1992)が示したように、トランスフェリンのトランスフェリン受容 体への事前の結合を行わないで、溶解緩衝液に高濃度の塩を使用して、固定化し たトランスフェリンから直接に分離する。 本出願で使用している 「トランスフェリン受容体」 とは「Ｔｂｐ１、Ｔｂｐ２タンパク質のファミリー」のことであり、これは、例 えば、ヘモフィリス属菌のような菌株内で天然に存在しており、アミノ酸配列順 序が異なる変種がある。このトランスフェリン受容体を有する細菌としては、ナ イセリア属菌、ブランハメラ属菌、パスツレラ属菌、アクチノバチラス属菌があ るが、これらに限定される訳ではない。これらの細菌に中には、全部ではないが 、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質の両方を有している細菌もある。この発明では 、トランスフェリン受容体をコードする、精製・分離したＤＮＡにはトランスフ ェリン受容体の類似体をコードするものも含む。この発明では、第一のタンパク 質が免疫機能において第二のタンパク質またはペプチドと関係があるか同じ機能 を有する場合には、その第一のタンパク質またはペプチドは第二のタンパク質の 機能的類似体であると定義する。機能的類似体とは、例えば、タンパク質のフラ グメント、置換体、付加変異体、欠失変異体である。 特別な実施例では、このトランスフェリン受容体はインフルエンザ菌ｂＤＬ６ ３株からも分離され、Schryvers(1989)やOgunnviwo and Schryvers(1992)の方法 、米国特許第５，１４１，７４３の方法で提示されたようなアフィニティ・クロ マトグラフィー法により不純物除去がなされる。ここで得られた精製分離された ト ランスフェリン受容体は、ウサギにおける抗ＴｆＲ抗血清を作製に使用された。 インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株から得られた染色体ＤＮＡは機械的にせん断し 、ＥｃｏＲＩリンカーを添加し、λＺＡＰ発現ライブラリを作製した。このライ ブラリーを抗ＴｆＲ抗血清でスクリーニングし、２個のポジティブ・クローン（ ｐＢＨＩＴ１、ｐＢＨＩＴ２）を得た。これは制限酵素地図とオーバラッピング した（図１Ａ、図２）。これらのクローンの配列決定により、２個の大きなオー プン・リーディングフレーム（開いた読み枠）が同定された（図２）。図３は、 インフルエンザ菌ＤＬ６３株由来のトランスフェリン受容体遺伝子・ｔｂｐ１、 ｔｂｐ２（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１）と推定アミノ酸配列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号 ：５−Ｔｂｐ１、ＳＥＱ．ＩＤ番号：６−Ｔｂｐ２）を示したものである。塩基 配列の分析より、２個の遺伝子（ｔｂｐ１、ｔｂｐ２）から成るＴｆＲオペロン は、縦列配列であり、一個のプロモータから転写されることが判明した（図２、 ３）。ＴｆＲ遺伝子を有する細菌では、Ｔｂｐ２タンパク質の分子量は菌種によ り変動する傾向があり、Ｔｂｐ１タンパク質の分子量は一定となる傾向がある。 ｔｂｐ１の分子量は、通常の場合に９４から１０６、０００であり、ｔｂｐ２の 分子量は５８から９８、０００でかなり変動がある。 インフルエンザ菌ＤＬ６３株由来のトランスフェリン受容体のＮ−末端と臭化 シアンフラグメントのアミノ酸配列決定を行った。Ｔｂｐ２のＮー末端はブロッ クされていたが、アミノ酸配列はＴｂｐ１の配列決定により同定できた。これは 図３のタンパク質配列の部分に下線をつけて示している。これらのペプチドの配 列：Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙ ｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈ ｒ（図３、ＳＥＤ．ＩＤ番号：１０１）およびＬｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ（図３、ＳＥＤ． ＩＤ番号：１０２）。図３では、ｔｂｐ１のシグナル配列とＴｂｐ２の推定シグ ナル配列に二重線を付けてある。Ｔｂｐ１のシグナル配列：、Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＰｒｏＴｙｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １ｌｅ Ｉ ｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｖ ａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１０３）。Ｔｂｐ２の推定シグナル 配列：Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇ ｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ（Ｓ ＥＱ．ＩＤ番号：１０４）。Ｔｂｐ２のＮ−末端の推定アミノ酸配列からそれが リポタンパク質であることを示している。 インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株由来の染色体ＤＮＡを用意してライブラリ を作製した。最初のライブラリはＳａｕ３Ａ・Ｉで部分的に切断して、５ー１０ ｋｂサイズのフラグメントにしたＤＮＡで作製して、それをクローン化してｐＵ Ｃベースのプラスミドとした。第二のライブラリはＥＣＯ・ＲＩ制限染色体ＤＮ Ａフラグメントから作製しクローン化してλＺＡＰとした。両方のライブラリを 図２で示したようにｐＢＨＩＴクローンの５’ーフラグメントでプローブをした 。その結果、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株由来のＴｆＲ遺伝子のクローン が得られた。これをＳ−４３６８−３−３、ＪＢ−９０１−５−３と呼ぶ。図１ Ｂ、図２は、本発明のもうひとつの態様を示してもので、インフルエンザ菌ｂ型 Ｅａｇａｎ株由来のＴｂｐ１、Ｔｂｐ２をコードするプラスミド（Ｓ−４３６８ −３−３、ＪＢ−９０１−５−３）のクローンである。インフルエンザ菌ｂ株Ｅ ａｇａｎ由来のｔｂｐ１、ｔｂｐ２遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号：２）のＤＮＡ塩 基配列を図４に示した。ここでは、Ｔｂｐ２配列がオペロンの第一番目の遺伝子 であることを示している。図４では、推定−３５，−１０配列、染色体結合部位 配列 には線を引いてある。 インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株由来の染色体ＤＮＡを用意し、Ｓａｕ３Ａ ・Ｉで部分的に切断して、１０ー２０ｋｂサイズのフラグメントにしたＤＮＡを 作製して、それをクローン化してＥＭＢＬ３のＢＡａｍＨＩ部位に挿入した。ｐ ＢＨＩＴクローン（図２）の５’ーフラグメントでライブラリをプローブをした 。その結果、ＴｆＲ（ＤＳ−７１２−１−３）をコードする完全な長さのクロー ンが得られた。図１Ｃと図２には、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株由来のｔ ｂｐ１、ｔｂｐ２遺伝子をコードするプラスミドクローン（ＤＳ７１２−１−３ ）が示されている。図５には、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株由来のｔｂｐ １、ｔｂｐ２遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号：３）のＤＮＡ塩基配列とその推定アミ ノ酸配列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号：９ーＴｂｐ１、ＳＥＱ．ＩＤ番号：１０ーＴ ｂｐ２）が示されている。ここでは、Ｔｂｐ２配列がオペロンの最初の位置であ る。図５では、推定−３５，−１０配列、染色体結合部位配列には線を引いてあ る。類型分類不能のインフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５由来の染色体ＤＮＡを用 意した。Ｓａｕ３Ａ・Ｉで部分的に切断して、ー１０ー２０ｋｂサイズのフラグ メントにしたＤＮＡを作製して、それをクローン化してＥＭＢＬ３のＢＡａｍＨ Ｉ部位に挿入した。ｐＢＨＩＴ クローン（図２）のフラグメントでライブラリをプローブをした。その結果、Ｔ ｆＲ（ＪＢ−１０４２−７−６）をコードする完全な長さのクローンが得られた 。クローン・ＪＢ−１０４２−７−６の制限地図が図Ｄ１、図２に示されている 。図６には、インフルエンザ菌ＰＡＫ・１２０８５株由来のｔｂｐ１、ｔｂｐ２ 遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４）のヌクレオチド塩基配列とその推定アミノ酸配 列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１１，１２）を示されている。ここでは、Ｔｂｐ２ 配列がオペロンの最初に位置する。図６では、推定−３５，−１０配列、染色体 結合部位配列には線を引いてある。 類型分類不能のインフルエンザ菌ＳＢ３３由来の染色体ＤＮＡを用意した。Ｓ ａｕ３Ａ・Ｉで部分的に切断して、ー１０ー２０ｋｂサイズのフラグメントにし たＤＮＡを作製して、それをクローン化してＥＭＢＬ３のＢＡａｍＨＩ部位に挿 入した。ｐＢＨＩＴクローン（図２）のフラグメントでライブラリをプローブを した。その結果、ＴｆＲ（ＪＢ−１０３１−２−９）をコードする完全な長さの クローンが得られた。クローン・ＪＢ−１０４２−７−６の制限地図が図Ｄ１、 図２に示されている。図７には、インフルエンザ菌ＳＢ３３由来のｔｂｐ１、ｔ ｂｐ２遺伝子（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４）のヌクレオチド塩基配列とその推定アミ ノ酸配列順序（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１１，１２）を示されている。ここでは、Ｔ ｂｐ２配列がオペロンの最初に位置する。ＳＢ３３由来ｔｂｐ２遺伝子には塩基 一個が欠けており、そのために残基１２６で位相のズレが発生して、残基１６８ でタンパク質の早期切断が起こった。 中耳炎菌由来ＮＴＨｉ株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２から作製し たｔｂｐ２遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、遺伝子の配列決定を行った。 類型分類不能のインフルエンザ菌ＳＢ１２（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１０５）、Ｓ Ｂ１２（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１０５）、ＳＢ２９（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１０８） 、ＳＢ３０（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１１２）由来のｔｂｐ２遺伝子のヌクレオチド 塩基配列が、図８，９，１０，１１にそれぞれ示されている。 増幅された全ｔｂｐ２遺伝子がＴｂｐタンパク質の全長をコードしていること が判明し、これはＳＢ３３株由来の欠陥ｔｂｐ２遺伝子が非定型のものであるこ とを示している。 ３個のインフレンザ菌ｂ型株では、すべて同一の短い遺伝子間配列、つまり、 ｔｂｐ２とｔｂｐ１との間がわずか１３ｂｐであるが、ＮＴＨｉ株ＰＡＫ１２０ ８５およびＳＢ３３ではこれが２７ｂｐとより長いものなっていた（図１２）。 ＳＢ１２株でもその遺伝子間配列は１３ｂｐであり、これはインフレンザ菌ｂ 型株の場合と同じであり、他方、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２では２７ー３０ ｂｐと長くなっており、ＮＴＨｉ株ＰＡＫ１２０８５やＳＢ３３（図２Ｂ）と同 じであった。９個の株すべて共通のコアを有し、ｔｂｐ２とｔｂｐ１遺伝子間に １３ｂｐが保存されていた。 インフルエンザ菌株Ｔｂｐ１のアミノ末端近くのペンタペプチド配列は同定さ れ（図１２）、ＴｏｎＢボックスと類似している。インフルエンザ菌株のＴｏｎ Ｂ遺伝子が最近クローン化され、その配列決定もなされている(Jarosik et al. ，1994)。 図１４では、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ／ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１ ２０８５、ＳＢ３３株由来のＴｂｐ１のアミノ酸配列順序が比較されている。Ｅ ａｇａｎとＭｉｎｎＡのＴｂｐ１は同一の長さで９１２個のアミノ酸を有し、他 方、ＤＬ６３は９１４残基、ＰＡＫ１２０８５は９１４残基、ＳＢ３３は９１１ 残基である。インフルエンザ菌株由来Ｔｂｐ１タンパク質では９５ー１００％の 配列同一性で保存されている。 図１５では、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ／ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１ ２０８５、ＳＢ３３、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３２株由来のＴｂｐ２のアミノ 酸配列順序が比較されている。ＥａｇａｎとＭｉｎｎＡのＴｂｐ２は同一で、６ ６０のアミノ酸を有する。ＤＬ６３は６４４残基、ＰＡＫ１２０８５は６５４残 基である。ＳＢ３３由来ｔｂｐ２遺伝子には塩基一個が欠けており、そのために 残基１２６で位相のズレが発生して、残基１６８でタンパク質の早期切断が起こ った。この塩基の欠落は、ＰＣＲで増幅された染色体ＤＮＡを直接に配列決定す ることで確認された。 インフルエンザ菌ＥａｇａｎとＭｉｎｎＡ株の場合には配列同一性が等しいので 例外として、Ｔｂｐ２タンパク質配列の同一性はわずかに６６％ー７０％であり 、保存配列が短いフラグメントもいくらかあり、これは図１５で同定できる。Ｓ Ｂ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２株由来の、ＰＣＲで増幅されたｔｂｐ２ 遺伝子はＴｂｐタンパク質を完全な長さでコードしていることが判明した。推定 Ｔｂｐ２タンパク質にはその配列とサイズに異種性があり、ＳＢ１２由来では６ ４８個のアミノ酸を有し、ＳＢ２９由来では６３１の残基、ＳＢ３０由来では６ ３０の残基、ＳＢ３２由来では６３１の残基であった。 Ｅａｇａｎ株由来のＴｂｐ１、Ｔｂｐ２タンパク質の推定の二次構造の決定を 行った（図１６Ａ，１６Ｂ）。両タンパク質ともに数個のトランスメンブラン・ ドメインを有し、Ｔｂｐ１では２０回メンブレンを横断し、 Ｔｂｐ２では１２回クロスする。Ｔｂｐ１のアミノ末端部位に３個の外側を向い た保存エピトープが同定され（ＤＮＥＶＴＧＬＧＫ−ＳＥＱ．ＩＤ番号：４３、 ＥＱＶＬＮ／ＤＩＲＤＬＴＲＹＤ−ＳＥＱ．ＩＤ番号：１４２）、Ｃー末端には 一個のエピトープが同定された（ＧＩ／ＶＹＮＬＦ／ＬＮＹＲＹＶＴＷＥーＳＥ Ｑ．ＩＤ番号：１４２、１４３）。ヒトの病原菌のＴｂｐ２タンパク質には３個 の小さい保存部位が同定され、そのＮー末端には、ＣＳ／ＬＧＧＧ（Ｇ）ＳＦＤ ーＳＥＱ．ＩＤ番号：７５、１４４、１４５、その内部にはＬＥ／ＳＧＧＦＹ／ ＦＧＰ−ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４、１４６が、そのＣー末端にはＶＶＦＧＡＲ／ Ｋ−ＳＥＱ．ＩＤ番号：８３，８４が同定された。 ヘモフィリス属の菌株により、Ｔｂｐ２タンパク質のアミノ酸配列順序に差異 があることが判明したので、ヘモフィリス属菌は、同じＴｂｐ２アミノ酸配列順 序を持つサブグループに分類できることを意味する。つまり、この発見により、 ヘモフィリス属菌株のサブタイプごとのエピトープを表現する最小数のＴｂｐ１ とＴｂｐ２またはその合成ペプチドの配列決定の合理的な選択が可能となる。例 えば、ヘモフィリス属菌やヘモフィリス属の菌株由来のＴｂｐ１、Ｔｂｐ２タン パク質と似た配列を持つトランスフェリン受容体を産生する細菌が原因で発症し た疾病の免疫に必要な免疫原 性成分を合成しようとする時に利用できるのである。このように、トランスフェ リン受容体、その類似体、そのフラグメント、そのペプチドを、必要最小限のレ ベルで、トランスフェリン受容体を産生するヘモフィリス属菌やその他の菌が原 因で発症する疾病の免疫に使えるのである。 図１４、１５には、種々の細菌性病原菌（インフルエンザ菌ｂ株、類型分類不 能インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌、アクチノバチラス属胸膜肺炎菌）由来の トランスフェリン受容体のアミノ酸配列順序の比較が示してある。この配列分析 により、トランスフェリン受容体はＴｂｐ１、Ｔｂｐ２タンパク質であり、これ はこれらの細菌のすべてに保存されていることが判明した。このような保存され たタンパク質のアミノ酸配列のいくつかは、表２、３で示したようなペプチドに も含まれる。特に、Ｔｂｐ１タンパク質（表１、図１４）で保存されているアミ ノ酸配列は、ＤＮＥＶＴＧＬＧＫ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４３）、ＥＱＶＬＮＩＲ ＤＬＴＲＹＤＰＧＩ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４４）、ＥＱＶＬＮＩＲＤＬＴＲＹＤ ＰＧＩＳＶＶＥＱＧＲＧＡＳＳＧＹＳＩＲＧＭＤ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４５）、 ＧＡＩＮＥＩＥＹＥＮＶＫＡＶＥＩＳＫＧ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４６）、ＧＡＬ ＡＧＳＶ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：４６）である。Ｔｂｐ２タンパク質（表２、図１ ５）で保存されているアミノ酸配列は、ＬＥＧＧＦＹＧＤ（ＳＥＱ．ＩＤ番号： ７４）、ＣＳＧＧＧＳＦＤ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７５）、ＹＶＹＳＧＬ（ＳＥＱ ．ＩＤ番号：７６）、ＣＣＳＮＬＳＹＶＫＦＧ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７７）、Ｆ ＬＬＧＨＲＴ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７８）、ＥＦＮＶＯＦ（ＳＥＱ．ＩＤ番号： ７９）、ＮＡＦＴＧＴＡ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：８０）、ＶＮＧＡＦＹＧ（ＳＥＱ ．ＩＤ番号：８１）、ＥＬＧＧＹＦ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：８２）、ＶＶＦＧＡＲ （ＳＥＱ．ＩＤ番号：８３）、ＶＶＦＧＡＫ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：８４）。 ある範囲の細菌性病原菌由来のトランスフェリン受容体として保存されたアミ ノ酸配列順序が解明されたことで、抗体（合成のペプチドも含む）の選択ができ ることになる。この抗体でトランスフェリン受容体を有する病原菌が原因となっ ている疾病に対する免疫賦与することが可能となる。このような細菌として、淋 菌のようなナイセリア属の菌、カタル球菌のようなブランハメラ属の菌がある。 このような多数の細菌性病原菌のトランスフェリン受容体のアミノ酸配列が判明 したことで、トランスフェリン受容体に特異的に結合する抗体（モノクローナル 抗体）の生産が可能である。トランスフェリン受容体に相当するペプチドに反応 する抗血清も生産できる。この抗血清はカタル球菌のト ランスフェリン受容体を認識する。このような抗血清はトランスフェリン受容体 抗原の検出や中和抗体として、あるいは、トランスフェリン受容体を産生する病 原菌に対する受動免疫の賦与に使用できる。トランスフェリン受容体を産生する 病原菌に対する診断機器の生産にも使用できる。 トランスフェリン受容体タンパク質のアミノ酸配列を有するエピトープを、こ の配列を持つ合成のペプチドを使用することで、あるいは、その配列を発現する 生きたベクターを使用することで、または、このアミノ酸配列をコードする核酸 分子を直接に投与することで、免疫系の細胞に運搬できる。 インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３株、類型分類不能イ ンフルエンザ菌ＰＡＫ・１２０８５株由来のＴｂｐ１タンパク質のアミノ酸配列 順序を有するペプチドを表２に示した。これらのペプチドに対する抗体をモルモ ットで産生させた（表４）。インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、Ｄ Ｌ６３、類型分類不能インフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５由来のＴｂｐ２タン パク質のアミノ酸配列順序を有するペプチドを表２に示した。これらのペプチド に対する抗体をモルモットで産生させた（表４）。ｔｂｐ１、ｔｂｐ２遺伝子を コードしたＤＮＡをベクターに組み込んで組換えＤＮＡを作り、Ｔ７発現システ ム を利用して大腸菌の中でクローンを作製できる。図１７に示すように、成熟Ｅａ ｇａｎ由来Ｔｂｐ１タンパク質をコードするｔｂｐ１遺伝子をプラスミドＪＢ− １４６８−２９を産生するＴ７プロモータの背後のフレームでクローン化させた 。ＢＬ２１／ＤＥ３細胞に導入してＩＰＴＧまたはラクトースで誘導すると、図 ２２で示すように、Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ１タンパク質が発現した。 図１８に示すように、成熟Ｅａｇａｎ由来Ｔｂｐ２タンパク質をコードするｔ ｂｐ２遺伝子をプラスミドＪＢ−１４２４−２−８を産生するＴ７プロモータの 背後のフレームでクローン化させた。大腸菌に導入してＩＰＴＧまたはラクトー スで誘導すると、図２２で示すように、Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２タンパク質が発現 した。 ＮＴＨｉ・ＳＢ１２由来のｔｂｐ２遺伝子をＰＣＲで増幅させた。この増殖し たＤＮＡには真正インフルエンザ菌ｔｂｐ２シグナル配列が含まれている。シグ ナル配列と成熟タンパク質をコードするＳＢ１２・ｔｂｐ２遺伝子を、図２１で 示すように、ＰＴ７−７発現システムでクローン化した。このプラスミド（ＪＢ −１６００−１）を大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３に導入して誘導すると、図２２に示 すように、ＳＢ１２・Ｔｂｐ２が発現した。 大腸菌内で顆粒分画として産生された組換えタンパク質Ｔｂｐ１とＴｂｐ２か ら図２３で示すような方法で不純物を除去した。図２７で示すように、純度は少 なくとも７０％以上であった。この精製組換えＴｂｐ１とＴｂｐ２をネズミに投 与してその免疫原性を調査した。両方とも、３ー１０μｇの投与で良好な免疫応 答が得られた（図２５）。 インフルエンザ菌株由来の組換えタンパク質Ｔｂｐ１とＴｂｐ２に対して産生 された抗血清を他の菌株と交差反応させた。その結果、これらの抗血清は診断薬 の生産に有用であることが判明した（図２６。２７）。 図２８で示したプラスミドｐＵＨＩＴ１ＫＦＨとｐＵＨＩＴＫＦＰには、トラ ンスフェリン受容体オペロン内でクローン化された選択可能な抗生物質抵抗性マ ーカが含まれ、挿入時にトランスフェリン受容体オペロンを不活性化させるよう に作製された。実施例１９で説明している通り、これらのプラスミドは、ヘモフ ィリス属菌を形質転換させて、トランスフェリン受容体・Ｔｂｐ１、Ｔｂｐ２を 産生させないようにするために使用した。このような菌株はin vitroとin vivo での検出や診断では負の調節として有用である。このような菌株はin vivo増殖 で弱毒化されることが予想され、これはヘモフィリス属菌が原因となる病気の生 ワクチンとして使えるのである。 上記で説明した通り、トランスフェリン受容体タンパク質のエピトープを、そ のタンパク質のアミノ酸配列を発現できる生きたベクターを使うことで、免疫シ ステム細胞に送ることができる。この生きたベクターとしてポリオウイルスがあ る。図２９はハイブリッド・ポリオウイルスの構造を示したものである。このポ リオウイルスはトランスフェリン受容体タンパク質のエピトープを発現する。こ のエピトープには、Ｔｂｐ２・ＬＥＧＧＦＹＧＰ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４）の 保存エピトープも含まれる。このようなウイルスが、アミノ酸配列・ＬＥＧＧＦ ＹＧＰ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４）のペプチドに対して産生された抗体により認 識された（表５）。このことは、抗体が免疫認識できるアミノ酸配列をウイルス が発現したことを示している。ポリオウイルス・ＰＶ１ＴＢＰ２ＡとＰＶ１ＴＢ Ｐ２Ｂが、インフルエンザ菌株ＤＬ６３・ｔｂｐ２投与で産生されたウサギ抗体 で中和された。このことは、これらのウイルスが、タンパク質に対して産生した 抗体が免疫応答するアミノ酸配列を発現したことを示している。抗ーＰＶ１血清 によりすべてのウイルスが中和された。このことは、ポリオ中和抗原部位Ｉでの 変化が、ウイルスの他の抗原部位に影響を与えなかったことを示している。 ポリオウイルスのキメラであるＰＶ１ＴＢＰ２Ａと ＰＶ１ＴＢＰ２Ｂによる免疫で生産されたウサギ抗血清はアミノ酸配列ＬＥＧＧ ＦＹＧＰ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：７４）を有するペプチドを認識した。このことは 、ＰＶ１ＴＢＰ２ＡとＰＶ１ＴＢＰ２Ｂにより発現したアミノ酸配列が免疫原性 があり、そのような配列を認識できる抗体を引きだしたことを示していると同時 に、そのような配列は合成のペプチドのものでもよいことを示している。 図３０のパネルＡは、ＳＤＳ・ＰＡＧＥゲルである。このゲルは、大腸菌で発 現されたインフルエンザ菌ＳＢ１２由来の不純物のない組換えｔｂｐ２（列１） 、カタル球菌４２２３由来のｔｂｐ２（列２）、鉄制限下で増殖させたカタル菌 株４２２３（列３）の全細胞溶解物、鉄制限下で増殖させた大腸菌ＪＭ１０９（ 列３）、鉄制限の無い条件で増殖させた大腸菌ＪＭ１０９（列５）の全細胞溶解 物である。パネルＢは、同型ゲルのウエスタンブロット法試験を、ＰＶ１ＴＢＰ ２Ａで免疫化したウサギの血清プールを利用して行った時に結果を示す。列１、 ２において、精製したトランスフェリンー結合タンパク質および列３の類似のサ イズのバンドとの強い反応が見られた。大腸菌タンパク質との重要な反応は無か った（列４、５）。パネルＣは、同じウサギから免疫化する前に採取した血清プ ールで試験した結果で、特異な反応はなかった。これら の結果から分かることは、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａには、インフルエンザ菌、カタル球 菌由来のトランスフェリン結合タンパク質に特異的に反応する抗血清を誘発する 能力があり、この抗血清は、タンパク質の発現量が同じでないカタル球菌と大腸 菌の区別ができるということである。 ヘモフィリス属菌のトランスフェリン受容体をコードする部分から成る不純物 のない分離ＤＮＡ分子には下記のような長所がある。 −この核酸はヘモフィリス属菌株をin vitroでもin vivoでも特異的に同定、探 知する。 −ＤＮＡ分子でコードされた産生タンパク質は診断薬、ヘモフィリス属菌に特異 的に結合する抗体を生産させるための抗原として、ヘモフィリス属菌が原因であ る疾病の予防接種および診断用として有用。 −本発明で特定したトランスフェリン受容体に対応するペプチドは、診断薬、ヘ モフィリス属菌特異的に結合する抗体生産用の抗原、ヘモフィリス属菌が原因と なる病気のワクチン、ヘモフィリス属菌の感染を検出薬として優れている。 この発明では、核酸分子にコードされているこのトランスフェリン受容体タン パク質、そのフラグメント、その類似体、このトランスフェリン受容体アミノ酸 配列を有するペプチドを提供し、これらはヘモフィリス 属菌の種々の単離株やその他のトランスフェリン受容体を産生する細菌に保存さ れたもので、トランスフェリン受容体を産生する細菌であればどんな細菌に対し ても、その感染の診断と免疫賦与に有用である。特に、トランスフェリン受容体 を産生する多くの細菌性病原菌において、そのトランスフェリン受容体タンパク 質内に保存されているアミノ酸配列・ＬＥＧＧＦＹＧＰを有するペプチドは、ト ランスフェリン受容体を産生する菌が原因となっている病気の診断と免疫賦与に 適している。このような細菌として、ヘモフィリス属細菌、ナイセリア属細菌（ 髄膜炎菌、淋菌を含む）、ブランハメラ属細菌（カタル球菌を含む）があるが、 これらに限定されるものでない。 この発明の実施例としては種々のケースが可能であり、例えば、予防接種、ヘ モフィリス属菌感染診断、その他の菌内にトランスフェリン受容体を産生する細 菌性病原菌感染症の診断と治療の分野や免疫製剤の生産分野などで多くの応用が 可能であることは、この分野の専門家には明白である。以下にさらに詳しく応用 方法について説明する。１．ワクチン製剤とその使用法 ワクチンとして使える免疫原成分は、免疫原性のあるトランスフェリン受容体 、その類似体、そのフラグメント、そのペプチドを原料として製剤される。ワク チンは免疫応答を引き出し、この免疫賦与により抗トランスフェリン受容体抗体 のような食菌作用と殺菌作用のある抗体が産生されることになる。ワクチン投与 を受けた対象の体内にヘモフィリス属菌やその他のトランスフェリン受容体を産 生する細菌が侵入した時には、ここで産生された抗体が、侵入した菌が産生する トランスフェリン受容体と結合して、その細菌が生存に不可欠である鉄源に接近 するのを防ぐ。さらに、食菌・殺菌作用のある抗ＴｆＲ抗体が別の機序で防御作 用をすることになる。 ペプチドを含むワクチンについては一般に技術上周知のこととされており、米 国特許第４，６０１，９０３；４，５９９，２３１；４，５９９，２３０；４， ５９６，７９２でも例示されている。これらについては、レファレンスとして本 出願にも示している。ワクチンなどの免疫原性成分は、液状の溶液やエマルジョ ンとして剤型の注射剤として製剤できる。トランスフェリン受容体タンパク質、 そのフラグメント、その類似体は、製薬的見地から受け入れ可能で、しかも、ト ランスフェリン受容体、そのフラグメント、類似体、そのペプチドと適合可能な 賦形剤と混ぜて使用することができる。そのような賦形剤としては 水、生理食 塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、および、これらの組み合わ せたものがある。免疫原性 成分やワクチンは、そのワクチン効果を強化する目的で、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ 緩衝液、アジュバントを補助物質として使用する。 免疫原性成分やワクチンは、非経口で、あるいは、皮下注射や筋肉内注射によ り投与される。さらに、本発明に従って製剤された免疫原性成分は、その免疫応 答を誘起させる方法として粘膜表面に投与できるようにも調剤が可能である。こ こでの免疫原性成分を経鼻または胃内ルートから粘膜表面に投与することも可能 である。ここでの免疫原性成分を、免疫が働くある特定の細胞または粘膜表面に 到達するように調製したターゲット分子と併用して使用することもできる。その ようなターゲット分子として、ＷＯ第９２／１７１６７(Biotech Australia)で 紹介されているような細胞毒素Ｂ１２またはそのフラグメントや、米国特許第５ ，１９４，２５４(Barber at al)で紹介されているモノクローナル抗体がある。 その他、坐薬や経口薬のような剤型でもかまわない。坐薬の場合には、結合剤や キャリアも同時に使用されるが、例えば、ポリアルカリン・グリコールまたはト リグリヤリドなどがある。経口薬として使用する場合の、通常使用される賦形剤 には、薬学的に許容される程度のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムが ある。投与剤形として、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤 粉末剤 もあ り、その成分の１０ー９０％がトランスフェリン受容体、そのフラグメント、類 似体、ペプチドであるように調剤したものである。このワクチンでは、製剤設計 をして、その量は治療的にも効果があり、防御作用、免疫原性が発揮されるレベ ルで投与する。投与量は治療対象個人の免疫能次第であり、ここで免疫能とは、 例えば、抗体を合成できる免疫能、必要であれば細胞性免疫応答のできる免疫能 がある。投与が必要な有効成分の正確な量は医者が判断する。しかし、この分野 の専門家なら適切な用量範囲は容易に決定できることであり、トランスフェリン 受容体、その類似体、そのフラグメント、そのペプチドの量ではマイクログラム のオーダーである。最初の投与量、その二次免疫抗原量についても、一回目の量 とその後の投与量についてはどの量が適切であるかは一定しておらず、変動があ る。ワクチン用量は投与経路や宿主の大きさによりばらつきがある。 本発明にかかるトランスフェリン受容体タンパク質をコードしている核酸を免 疫のために直接に使用することも可能で、その場合には、注射やサルモネラ菌、 ＢＣＧ、アデノウイルス、ポリオウイルス、バクシニア、ポックスウイルスなど を生きたベクタとして使用する方法によりＤＮＡを直接に導入する。異種抗原を 免疫システム内に搬送する生きたベクタについてはす でに報告がある(O'Hagan，1992)。遺伝的免疫のために、ＤＮＡを試験対象へ直 接的に注入する方法についても報告がある(Ulmer at al.，1993)。 ここでのペプチドをin vivoで使う場合には、ペプチドそれら自体は血清や組 織に十分な長い半減期や十分な免疫原性を有していないので、まず最初に化学修 飾が必要である。ここでは、そのような化学修飾をしたペプチドのことを「ペプ チド類似体」と呼ぶことにする。ここでの「ペプチド類似体」という語の意味は 拡大されて使用され、安定性がさらに増加し、効果が改善され、in vivoおよびi n vitroでの免疫原性のある機能的・化学的に同等なペプチドのことを意味する 場合もある。さらに、この語の意味が拡大されて、本発明にかかるペプチドのア ミノ酸誘導体を意味することもある。このペプチド類似体の作製には、側鎖の修 飾、天然に存在しないアミノ酸とその誘導体をペプチド合で導入すること、クロ スリンカーの使用、ペプチドとその類似体にコンフォメーション上の制約を与え るようなその他の方法・手順が採用される。但し、これらに限定されるものでは ない。 本発明で示された側鎖の修飾の例として、アルデヒドとの反応、その後のＮａ ＢＨ４との反応による還元的アルキル化、メチルアヤトアミドによるアミド化、 無水酢酸によるアヤチル化、シアンによるアミノ基のカ ルバモイル化、２、４、６トリニトロベンゼン・スルホン酸によるアミノ基のト リニトロベンジル化、無水コハク酸と無水テトラヒドロフサルによるアミノ基の アルキル化、ピリドキシサール５’ーリン酸とその後のＮａＢＨ４での還元によ るピリドキシル化のようなアミノ基の修飾がある。 アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３ーブタンジオン、フェニルグルオキ サール、グリオキサールのような試薬で複素環濃縮生成物の作製により修飾が可 能である。 カルボキシル基は、ｏ−アシルイソ尿素形成とその後のアミドへの誘導化を通 してカーボデイミドを活性化させることで修飾が可能である。 スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアヤトアミドによるカルボキシ メチル化、過ギ酸のシステイン酸への酸化、その他のチオール化合物とジスルヒ ド混合物の生成、マレイミドとの反応、無水マレイン酸置換、４ークロロメルク リ安息香酸、４ークロロメルクリフェニールスルホン酸、塩酸フェニールメルク リ、２ークロロメルクリー４ーニトロフェノール、その他のメルクリアルを使用 してメルクリアル誘導体の形成、アルカリｐＨ下でのシアンによりカーバミル化 のような方法で修飾が可能である。 トリプトファン残基はＮーブロモシクシンイミドに よる酸化または２ーヒドロキシー５ーニトロベンジル臭化物かスルホニルハロゲ ン化物によるインドール環のアルキル化により修飾が可能である。トリプシン残 基はテトラニトロメタンでニトロ化（その結果、３ーニトロトリプシン誘導体が 生成される）により変化させることができる。 ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ヨード酢酸によるアルキル化またはジエ チルピロカルカルボネートによるＮーカルベトキシル化により修飾できる。 ペプチド合成で導入した天然に存在しないアミノ酸とその誘導体の例として、 ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキ−５−フェニールペ ンタノン酸、６−アミノヘキサノン酸、ｔーブチルグリシン、ノルバリン、フェ ニールグリシン、オルニチン、サルコシン、４ーアミノー３ーヒドロキー６ーメ チルヘプタノン酸、２ーチェニルアラニン、アミノ酸のＤー異性体などがあるが 、これに限定されるものでない。抗原をアジュバントと併用した場合には、抗原 の免疫原性が著明に改善される。通常、アジュバントは０．０５−１．０％のリ ン酸緩衝溶液として使用する。アジュバントには抗原の免疫原性を強化する作用 があるが、それ自体には必ずしも免疫原性はない。アジュバントは、投与した抗 原を、その投与部位近くの局所に保持しておく働きがある。これは貯蔵効果と 言われるもので、抗原を免疫システム内にゆっくり徐放する役目がある。アジュ バントは免疫システムの細胞を抗原が貯蔵されている場所に引きつけ、抗体を産 生する細胞の免疫応答を誘起させる。 免疫誘発剤またはアジュバントは、長年に亘り、宿主の免疫応答を改善するも のとして使用されてきた。例えば、ワクチンなどの投与で併用されてきた。リポ 多糖のような内因型アジュバントは、ワクチンとして使用された死滅細菌または 弱毒細菌の菌体部分でもある。外因型アジュバントは、イミュノモジュレータ（ 免疫増強剤）であり、抗原に非共有結合をし宿主の免疫応答を強化するように調 製されている。このように、アジュバントは非経口的に投与された抗原に対する 宿主側の免疫応答を増強させるものとして認識されてきた。アジュバントには有 毒なものもあり、副作用を引き起こすために、ヒトや動物には使用できないもの もある。 ヒトと動物用ワクチンの投与で併用されるアジュバントとしては、水酸化アル ミニウムまたはリン酸アルミニウムが日常的に使用されてきた。以下、これをア ラム(alum)と呼ぶ。抗体の免疫応答の増強に関して、ジフテリアと破傷風毒素抗 原に対してはアラムが有効であることはすでに確立された事実である。最近では 、ＨＢｓＡｇワクチンにアラムが併用されている。ある 抗原に対してアラムの有用性は確立されたことであるが、全部の抗原に有効であ るわけでなく、制限もある。例えば、アラムはインフルエンザの予防接種では効 果はなく、一緒にに投与しても細胞性免疫を不連続的にしか誘起しない。アラム を抗原と一緒に投与することで誘起される主な抗体は、マウスではＩｇＧ１イソ タイプであり、これはある種のワクチンに対しては、その防御作用が最大にはな らない。外因的アジュバントには広い範囲のものがあり、抗原に対しての強い免 疫応答を増強する。これらはの例として、膜タンパク質抗原（免疫刺激複合物質 ）と複合したサポニン、死滅したミコバクテリアと鉱物油との重合体、完全フロ イント・アジュバント、ムラミルジペプチドやリポ多糖のような菌体成分、脂質 Ａ、リポソームなどがある。 体液性免疫と細胞性免疫の両方を効果的に誘起させるため、エマルション化し たアジュバントに免疫原を入れて使用する場合もある。病気を誘発する有毒なア ジュバントも多く、肉芽腫、急性または慢性炎症（完全フロイントアジュバント ）、細胞崩壊（サポニン）、発熱、関節炎、前部ブトウ膜炎などの発症が報告さ れている。完全フロイントアジュバントは優れたアジュバントであり、研究用に も広く使用されているが、その毒性のためにヒトと動物用には許可されていない 。 理想的なアジュバントの特性としては下記の点をあ げることができる。 （１）毒性がないこと。 （２）長期間に亘り持続する免疫応答刺激ができること。 （３）その生産が簡単で、長期保存でも安定していること。 （４）種々のルートから投与された抗原に対して、細胞性免疫と体液性免疫の両 方を引き出せること。 （５）他のアジュバントとの共同作用があること。 （６）抗原表現細胞の集団と選択的に相互に作用できること。 （７）特に、ＴＭ１、ＴＭ２細胞特異的免疫応答を引き出せること。 （８）抗原に対する抗体イソタイプレベル（例：ＩｇＡ）を選択的に増加させる ことができること。 米国特許第４，８５５，２８３（Lockhoff et al.，August 8,1989）（レファ レンスとして添付）は、Ｎーグリコシラミド、Ｎーグリコシルウレア、Ｎーグル コシルカルバメートのような糖脂質において、それぞれの糖残基をアミノ酸で置 換したものがイミュノモジュレータ（免疫増強剤）またはアジュバントとして使 えることを示している。この中で、Ｌｏｃｋｈｏｆｆらは、スフィンゴ糖脂質や グリセロ糖脂質のように、天然に存在する糖脂質と構造が類似している糖脂質類 似 体は、アジュバントとして、単純ヘルペスウイルスワクチンと仮性狂犬病ウイル スワクチンと併用した場合に、強い免疫応答を引き出すことができることを報告 している。長鎖のアルキルアミンと脂肪酸から合成される脂質はアノマー炭素原 子を通して糖と直接にリンクしており、天然に存在する脂質残基の機能を真似る 役割をしている。 米国特許第４，２５８，０２９(Moloney)では、塩酸オクタデシルチロシンは 、破傷風菌毒素とホルマリン活性化タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩポリオウイルスワク チンとが複合した時にはアジュバントとして機能することを示している。Ｎｉｘ ｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅらは(1990)、組換えＢ型肺炎表面抗原と複合化した芳香アミ ノ酸のオクタデシルエステルには、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主の免疫応答を 増強する作用があることを報告している。合成ペプチドを脂質化することで免疫 原性を増強させることを示した。 Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒ(1989)は、アジュバントであるトリパルミチルーｓーグ リセリルーシステニルヤリルヤリン（グラム陰性菌由来のリポタンパク質のＮー 末端部の合成類似体）と結合した口蹄疫ウイルスタンパク質と相同の配列を有す るペプチドについて報告している。さらに、Ｄｅｒｅｓらは(1989らは、ウイル ス特異性細胞毒Ｔリンパ球の合成リポペプチドワクチン （インフルエンザウイルス核タンパク修飾合成ペプチド）とのin vivoプライミ ングについて報告している。このワクチンは、リポペプチドであるＮーパルミチ ル−ｓー[２、３ービス（パルミチルキシ）ー（２ＲＳ）ープロピル−（Ｒ）シ ステインとのリンケージにより調製されたものである。２．イミノアッセイ 本発明のトランスフェリン受容体、その類似体、フラグメント、そのペプチド はＥＬＩＳＡ（エリザ）を含むイミノアッセイでの抗原・免疫原としてに有用で ある。 ヘモフィリス属菌トランスフェリン受容体に対する抗体検出にはＲＩＡ（ラジ オイムノアッヤイ）とその他の非エリザ法が使用されることは、この分野では知 られたことである。ＲＩＡ法では、トランスフェリン受容体、その類似体、フラ グメント、そのペプチドを選択表面で固定する。この表面は、ポリスチレン・マ イクロティタ・プレートの壁面のようにタンパク質やペプチドを結合できるもの である。不完全に吸着されたトランスフェリン受容体、その類似体、フラグメン ト、そのペプチドを除去するために、この表面を洗浄した後、免疫的には中立で あるウシ・ガンマ・グロブリン（ＢＳＡ）またはカゼインの溶液のような非特異 的タンパク質をその選択表面に付着させる。こうする ことにより、固定表面の非特異的吸着部位のブロッキングができ、その結果、表 面への抗血清の非特異的結合が原因となる背景要因を減少させることになる。こ のペプチドは、ある特定の細菌種を検出する必要がない場合には、交差株検出を 強化するために、表２または表３で示した保存部位から選択するのが望ましい。 この場合には、特定の種のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的であるポ リペプチドが選択されることになる。通常の場合には、このペプチドは１２残基 の範囲内にあるが、１２以上、つまり、１４から３０残基が好ましい。しかし、 通常の場合には、このペプチドを混合したものがワクチンの免疫原や診断用とし て使用されている。保存された部位からのペプチドまたは非保存部位からのペプ チドの混合物を使用する場合もあり、この場合には、交差種の検出または診断を できる。この例ではペプチド抗原の混合物を「カクテル」と呼んでおり、ワクチ ンや診断薬として使用されている。 この後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）が形成されるように、テス トの対象となっている臨床現場から得たサンプルまたは生物材料のようなサンプ ルに接触させる。この過程で、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＣＧ）やリン 酸緩衝溶液／トウイーンのような希釈剤でサンプルを希釈する。その後、サンプ ルを温度を２５から３７℃にして２−４時間培養する。この培養の後、非免疫複 合材料を除去するために、そのサンプルに接触した表面を洗浄する。洗浄ではＰ ＢＳ／トウイーンやホウ酸緩衝液を使用する。テストサンプルとトランスフェリ ン受容体、類似体、フラグメント、ペプチドとが結合した特殊な免疫複合体が形 成されると、次に洗浄して、最初の抗体に対して特異性をもっている第二の抗体 と反応させることで免疫複合体を定量する。このテストサンプルがヒト由来のも のであれば、その第二の抗体はヒト免疫グロブリン（一般にＩｇＧ）に特異性を 有する抗体である。検出のためにその第二の抗体として酵素活性のような 関連 活性を持った抗体を使用する。ここでは色素産生物質と培養することで色が発生 する。スペクトル分光光度計を使用して、この色の発生の程度を測定することで 定量が可能となる。３．ハイブリッド形成プローブとして塩基配列を使用 本発明にかかる、トランスフェリン受容体遺伝子の塩基配列から構成される塩 基配列は、ヘモフィリス属菌やその他のトランスフェリン受容体遺伝子を有する すべての菌種由来のトランスフェリン受容体遺伝子の同定およびクローニングに 利用できる。本発明のトランスフェリン受容体遺伝子から構成されるこの核酸塩 基配列を使用すれば、別のトランスフェリン受容体遺 伝子と相補的構造をもつハイブリッド二重鎖を選択的に生成させることができる 。ハイブリダイゼーション条件を変化させることで、相補トランスフェリン受容 体遺伝子を得るためのプローブ選択性の幅を変化させることができる。つまり、 相同二重鎖を形成させるための比較的厳格な条件では塩濃度を低くして高い温度 を使用する。例えば、０．０２から０．１５Ｍ・ＮａＣＬの存在下で，温度を５ ０から７０℃にするような条件である。得たいハイブリッドにより、緩いハイブ リダイゼーション条件が要求される場合もあり、例えば、塩濃度を０．１５Ｍか ら０．９Ｍにして、温度も２０から５５℃にするようなケースである。ホルムア ミドを添加することで、ハイブリダイゼーション条件をより厳しくできるが、こ の場合には、形成されたハイブリッド二重鎖が不安定になる。このように、得た い結果により、特別なハイブリダイゼーション条件を容易に選択し操作できるの である。一般には、５０％のホルムアミドの存在下での都合のよいハイブリダイ ゼーション温度は、ターゲットフラグメントの９５％から１００％の相同性を得 たい場合には、４２℃の温度で、９０から９５％の相同性を得たい場合には３７ ℃、８５から９０％では３２℃である。 臨床診断に応用した場合にはトランスフェリン受容体遺伝子の核酸塩基配列を 適当な識別方法と組み合わ せることで使用する。例えば、ハイブリッド形成の確認のためのラベルを使用す るのである。広い範囲の標識方法がこの技術分野では知られており、放射線、酵 素や、アビジン／ビオチンのような検出信号を発生するその他のリガンドがある 。診断用として、ウレアーゼ、リン酸アルカリン、ペルオキシダーゼ、のような 酵素標識が放射線標識の代わりとして使用されている。酵素標識の一例として、 色素表示物質も使用されており、これは分光光度計を使うことで人間の目で識別 できる方法として、トランスフェリン受容体遺伝子配列を含んだサンプルでの特 別なハイブリッド形成確認用として使用されている。 トランスフェリン受容体遺伝子核酸配列は、固相手順を使用した実施例では、 ハイブリッド形成プローブとして使用できる。このような場合では、浸出液、体 液（血清、羊水、中耳浸出液、痰、気管支肺胞洗浄液）または組織などの臨床現 場から得たサンプルのテストＤＮＡが選択マトリックスまたは表面に吸収または 吸着されるようになっている。固定された一本鎖核酸からトランスフェリン受容 体遺伝子核酸配列から構成されている選択プローブを通して特別なハイブリッド 形成が望む条件で達成されることになる。選択条件は多様であり、Ｇ＋Ｃ内容、 核酸のソース、ハイブリッド形成プローブのサイズなどの特別な基準次第である 。 非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイゼーションさせ た表面を洗浄の後、特定のラベルを使用して特定のハイブリッドを検出して定量 する。ペプチドの選択の場合と同様に、ヘモフィリス属菌に保存されている核酸 配列部分の選択では、図８，９，１３，１４、特に、表２，３で示したよう保存 ペプチド配列をコードした核酸配列を選択するのが望ましい。選択するプローブ の大きさは１８ｂｋ、３０ｂｋから９０ｂｐの範囲の長さのものが好ましい。 ４．トランスフェリン受容体遺伝子の発現 レプリコンと制御配列を含み宿主細胞と適合性のある菌種由来のプラスミドベ クタはトランスフェリン受容体遺伝子の発現にも使用できる。ベクタは、通常、 複製部位とマーキング部位を細胞内に運搬するが、これら部位により、形質転換 された細胞内の表現型選択ができる。例えば、大腸菌は、アンピシリンとテトラ サイクリンに耐性がある遺伝子をもつｐＢＲ３２２を使用して形質転換でき、形 質転換された細胞の同定は容易にある。ｐＢＲ３２２プラスミド、その他の細菌 プラスミドまたはファージにもプロモータがあり、これを有するように修飾も可 能である。宿主細胞はこのプロモータを利用してその独自のタンタク質を発現さ せる。 さらに、宿主と適合性のあるレプリコンと調節配列 をもつファージベクタは宿主の形質転換ベクタとしても利用できる。例えば、ラ ムダＧＥＭー１１のようなファージは、組換えファージベクタを作製するのに使 用でき、このベクタは大腸菌ＬＥ３９２のような宿主細胞の形質転換で使える。 組換えＤＮＡ法で通常使用されているプロモータとしては、ベーターラクトマー ゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース・プロモータ・システム(Chang et al.，197 8; Itakura et al.,1977; Goeddel at al.，1979; Goeddel at ａl.，1980)、Ｔ ７プロモータ・システム（米国特許第４，９５２，４９６）のような細菌プロモ ータがある。プロモータの塩基配列の詳細についてはすでに知られており、この 知識を利用して、専門家はプロモータを遺伝子と機能的に結合させて使用してい る。どのようなプロモータを選択するかは、作製しようとる対象次第である。ト ランスフェリン受容体遺伝子の発現に適している宿主としては、大腸菌、バシラ ス菌、ヘモフィリス属菌、真菌、酵母、バキュロウイルスなどがある。 ヘモフィリス属菌の培養から分離させた天然に存在しているＴｆＲタンパク質 には、微量の有毒物質やその他の汚濁物質が含まれるので、この発明にかかるＴ ｆＲタンパク質作製には組換えＤＮＡ法を使用することが望ましい。この方法で 不純物を最小限に抑えることが可能である。特に好ましい宿主はグラム陰性細菌 で、この菌はＬＰＳを持たないのでエンドトキシンが含まれてない。特に、非発 熱トランスフェリン受容体タンパク質を生産する場合にはバシラス菌を宿主とし て使用する。組換えＤＮＡ法を使うことで、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質やそ の類似体を別々に分離した形で取り出せる。これら２個のタンパク質は、ヘモフ ィリス属菌では通常結合した状態で存在している。生物寄託 インフルエンザ菌由来のトランスフェリン受容体をコードするプラスミドのう ちのある種のものは、ブタベスト条約に従って、本出願の提出に先だって、アメ リカのＡＣＣ（米国メリーランド州ロックビル）に寄託してある。寄託したプラ スミドのサンプルは、この特許が承認された後は公開され入手が可能である。こ の発明の範囲はここで寄託されたプラスミドに限定されない。寄託したプラスミ ドは本発明の例示のひとつに過ぎない。この申請で示した抗原に類似した抗原を コードする類似したプラスミドもこの発明の範囲内に入る。寄託の概要 ヘモフィリス属菌株 Ｈｉｂ株Ｅａｇａｎは，Connaugh Laboratories(1755 Steeles Ave．W.，Will owdale，Ontario，Canada M2R 3T4)社から入手できる。 Ｈｉｂ株ＭｉｎｎＡはワシントン医学大学、微生物・免疫学部の小児病院(St ．Louis，Missouri 63110)のDr．Robert Munson氏のコレクションから入手でき る。 Ｈｉｂ株ＤＬ６３はテキサスサウスウエスタン医学大学（5323 Harry Hines B oulevard、Dallas，Texas 75235-9048）微生物学部のDr．Eric Hansen氏のコレ クションから入手できる。 ＰＡＫ１２０８５はDr．Robert Munson氏のコレクションから入手した（上記 ）。 ＳＢ１２、２９，３０，３２，３３はセントルイス大学医学部(St/Louis，Mis souri 63104)、医療センター小児科のDr.Stephen Barenkamp氏のコレクションか ら入手した。 実施例 上記の開示内容は本発明を一般的に記載したものである。下記の実施例を参照 することでより深い理解が得られる。ここで記載する実施例は単に例示目的で示 すもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。環境事情 により、形態の変化や入れ替えが適当であると判断される場合にはその事情に従 って変更、差し替えを行う。特別な用語を使用している場合もあるが、それは単 に記述目的のためであり、それに限定されるものではない。分子遺伝学、タンパ ク生化学、免疫学、酵素学の用語が使用されているが、この開示ではそれらの内 容を明確には説明していないが、それらはこの分野の専門家には理解できるもの であり、実施例で使用されたこれらの分野の用語は科学分野では十分に報告され ているものである。実施例１ この実施例は、インフルエンザ菌株ＤＬ６３、Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＰＡ Ｋ１２０８５、ＳＢ３３か らの染色体ＤＮＡの作製法を示したものである。 Harkness et al(1992)の方法に従って、インフルエンザ菌をミューラヒントン 寒天またはブレインハート流体培養基で増殖させた。Ａ．インフルエンザ菌株ＤＬ６３からの染色体ＤＮＡの抽出 染色体ＤＮＡは下記のような方法で調製すた。ベックマン・Ｊ１４モデル・ロ ータで１５分間遠心分離した培地から２５０ｍｌの細胞をペレットに取った。そ のペレットを５０ｍＭトリスＨＣＬ（ｐＨ８．０）の２００ｍｌで洗浄し、５０ ｍＭトリスＨＣＬ、５０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の１２．５ｍｌに再懸濁 させた。その後、２０℃で凍結させた。其の後、１０ｍｇ／ｍｌリゾチームの０ ．２５Ｍ・トリスーＨＣＬｌ溶液の１．２５ｍｌを凍結した細胞ペレットに添加 した。ペレットを解凍して４５分間氷上で培養させた。次に、１ｍｇ／ｍｌプロ テナーゼＫの０．５％ＳＤＣ、０．４Ｍ・ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ ｐＨ７．５）溶液の２．５ｍｌを添加して、その混合液をときどき撹拌しながら 、５０℃で１時間培養した。その溶解液をトリスー緩衝フェノールの１５ｍｌで 一回抽出させ、それに３Ｍ酢酸ナトリウム１．５ｍｌとエタノール３０ｍｌを加 えてＤＮＡを沈澱させた。ガラスロッドでＤＮＡを巻取り、０．２ｍｇ／ｍｌＲ ＮＡ ｓｅを含んだ５０ｍＭトリス−ＨＣＬ、１ｍＭ・ＥＤＴＡの１２．５ｍｌの中に １昼夜振りながら溶かた。同様に、サンプルを同量のクロロフォルムで抽出して 、沈澱させて、巻き上げた。そのＤＮＡを５０ｍ・Ｍトリス−ＨＣＬ、１ｍＭ・ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の２ｍｌの中に溶かして４℃で保管した。Ｂ．インフルエンザ菌ｂ株Ｅａｇａｎからの染色体ＤＮＡの抽出 遠心分離した培地から５０ｍｌの細胞をペレットに取って、ＴＥ（５０ｍＭト リスＨＣＬ、５０ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の２５ｍｌに再懸濁させた。染 色体ＤＮＡ調製に２Ｘ５ｍｌアリクオットを使用した。各アリクオットに１０％ サルコシルと２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを加えて、３７℃で１時間培養した 。その溶解産物をトリス飽和フェノールで一回抽出して、その後クロロフォルム とアイソミルアルコールの混合液（２４：１）で三回抽出した。その液相部分を 最終的に７ｍｌになるようにプールした。その後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５ ．２）の０７ｍｌとイソプロパノール４．３ｍｌを添加してＤＮＡを沈澱させた 。このＤＮＡを巻き上げて、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた後、１ｍｌ の水に溶かした。Ｃ．インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ３３ からの染色体ＤＮＡの抽出 ５０００ｒｍｐ、１５ー２０分、４℃で遠心分離した培地から５０ｍｌの細胞 をペレットに取った。このペレットで取った細胞をＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣＬ 、１ｍＭ・ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の１０ｍｌに再懸濁させ、プロナーゼとＳＤ Ｓを添加して最終の濃度がそれぞれ５００μｇ／ｍｌと１％になるように調製し た。そのサンプルを透明な溶解物が得られるまで３７℃で４時間培養した。その 溶解産物をトリス飽和フェノールで一回抽出して、その後溶解産物をトリス飽和 フェノール／クロロフォルムの混合物（１：１）で一回抽出し、さらに、クロロ フォルムで一回抽出した。最終の液相部分を２４時間、１Ｍ・ＮａＣＬの２ｘ５ ００ｍｌで４℃で、バッファを一回取り替えて、濾過し、さらに、ＴＥの２ｘ５ ００ｍｌで４℃で２４時間濾過しバッファを一回取り替えた。最終濾過液をアリ クオットとして使用した。実施例２ この実施例は、染色体ライブライの作製法を示したものである。Ａ．インフルエンザ菌ＤＬ６３−λライブラリ インフルエンザ菌ＤＬ６３染色体ＤＮＡの１００μｇを機械的に２５ゲージ針 を使用して１ｍｌにせん断した。そのせん断されたＤＮＡが平滑末端を有するよ うにするために、１０ＸＳ１・ヌクレアーゼバッファ の４５μｌ、Ｕ／μｌ濃度のＳ１・ヌクレアーゼ(２Ｍ Nacl，500mM NaOAc，pH4 .5，10mM ZnSO4，5%グリセロール）の１．７μｌを加えて最終的に４０５μｌに なるようにして、３７℃で１５分間培養した。そのサンプルをフェノール／クロ ロフォルムで一回抽出して、さらにクロロフォルムで一回抽出して、エタノール １ｍｌを加えてＤＮＡを沈澱させた。サンプルを氷上で１０分、またはー２０℃ で１昼夜培養して、３０分間遠心分離してＤＮＡを取り出した。取り出したＤＮ Ａを７０％エタノールで洗浄して乾燥させた。ＤＮＡ配列の中のＥｃｏ・ＲＩ部 位を標準手順によりメチール化させた。このメチール化したＤＮＡに１００ｍＭ ＭＧＣＬ２の５μｌ、ｄＮＴＰ・ミックス（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰの２．５ｍＭ）の８μｌ、Ｕ／μｌ・クレノーの５μｌを添加した。そ の混合液を１２℃で３０分間培養した。ＳＴＥ(0.1M NaCl，10mM Tris-HCL，1mE DTA，pH 8.0)の４５０μｌを加え、その混合液をフェノール／クロロフォルムで 一回抽出して、次にクロロフォルムだけで一回抽出して、エタノールの１ｍｌを 加えてＤＮＡを沈澱させた。サンプルを氷上で１０分、−２０℃で１昼夜培養し た。３０分遠心分離にかけて、ＤＮＡを取り出し、７０％のエタノールで洗浄し て乾燥させた。 ７μｌのＴＥでＤＮＡを再懸濁させ、その溶液に１ ４μｌのホスホリル化・ＥｃｏＲＩ・リンカー(200 ng/ul)、３μｌの１０ｘ連 鎖反応バッファ、３μｌの１０ｍＭ・ＡＴＰ、３μｌの４Ｔ・ＤＮＡ・リガーゼ (4U/ｕl)を加えた。サンプルを４℃で１昼夜培養し、６８℃で１０分間それぞれ 培養してリガーゼを不活性化させた。この混合液に２１８μｌのＨ２Ｏ)、４５ μｌの１０ｘユニバーサル・バッファ、７μｌのＥｃｏ・ＲＩ(U/ul))を加えた 。３７℃で１．５時間培養した後、１．５μｌの０，５Ｍ ＥＤＴＡを加え、そ の混合液を氷の上に置いた。 ＤＮＡをスルロース・グラジエント上で小さいフラクションとして、６−１０ ｋｂの大きさのＤＮＡをもつ各フラクションをプールした。プールしたＤＮＡを エタノールで沈澱させて、５μｌのＴＥバッファで再懸濁させた。挿入ＤＮＡの ２００ｎｇを１μｇのＺＡＰＩＩベクタ（最終では５μｌ）で２ー３日間連鎖反 応させた。連鎖反応を起こした混合物質をギガパック・ＩＩ・ゴールド（STRATA GENE社）でパックして、ＮＺＹプレート上の大腸菌ＳＵＲＥ細胞に置いた。この ライブラリを滴定して増幅させ、０．３％クロロフォルム内で４℃で保存した。Ｂ．インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−ｐＵＣライブラリ 実施例１Ｃの方法により、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ株から作製した染色体 ＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａ・Ｉ と２、５、１０分間それぞれ酵素分解させ、予め用意したアガロースゲルで電気 泳動させた。大きさが３ー１０ｋｂのＤＮＡフラグメントをもつゲルスライスを 切断して、標準解凍手順に従ってＤＮＡを分離した。ＰＵＣ８：２（多重クロー ニング都位に追加ＢｇｌＩとＸｂａ制限酵素部位をもつｐＵＣ８）由来のプラス ミドＤＮＡをＢａｍＨ・ＩとＢｇｌ・ＩＩで酵素分解させて、ウシ・リン酸アル カリンでジホスホリル化させた。インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ・ＤＮＡのフラグ メントをｐＵＣと結合させて、大腸菌ＪＭ１０９細胞の形質転換に使用した。Ｃ．インフルエンザ菌Ｅａｇａｎーλライブラリ 実施例１Ｂの方法で、インフルエンザ菌Ｅａｇａｎから作製した染色体ＤＮＡ をＥｃｏ・ＲＩで酵素反応させて、予め用意したアガロースゲル上で小部分に分 けた。７−２３ｋｂの大きさを持つＤＮＡフラグメントを含むゲルスライスを切 断して、３ｍｌのＴＡＥ(４０ｍＭ・トリス酢酸、１ｍＭ・ＥＤＴＡ)の入った隔 膜チューブ内で１昼夜ＤＮＡを電気溶解させた。そのＤＮＡを２回沈澱させ、水 に溶解させた後、Ｅｃｏ・ＲＩと酵素反応したλＺＡＰ・ＩＩ・ＤＮＡと１昼夜 連鎖反応させた。連鎖反応を起こした混合物質をギガパック・ＩＩ・ゴールド（ STRATAGENE社）でパックして、大腸菌・ＸＬ１ーブルー細胞に置いた。このライ ブラ リを滴定して増幅させ、０．３％クロロフォルム内で４℃で保存した。Ｄ．ＥＭＢＬ・ライブラリ 実施例１Ｃの方法により、インフルエンザ菌ＭｉｎｎＡ株から染色体ＤＮＡを 作製し、Ｓａｕ３Ａ・Ｉ（４０単位）と２、４、６分間酵素分解させ、ＴＮＥバ ッファ(10mM Tris-HCL，1mEDTA，pH 8.0)内で、１０ー３０％スルロース・グラ ジエント上で小さいフラクションとした。ＤＮＡフラグメントの大きさが５ｋｂ 以上のフラクションをプールして、沈澱させた。第二番目の実験として、この染 色体ＤＮＡ（２．６μｇ）をＳａｕ３Ａ・Ｉ（４単位）で１、２、３分間それぞ れ酵素分解させ、予め用意したアガロースゲル電気泳動で小さいフラクションと した。大きさが１０−２０ｋｂのＤＮＡフラグメントをもつゲルスライスを切断 して、標準解凍手順に従ってＤＮＡを分離した。この２つの実験から得たフラク ションをプールして、ＥＭＢＬ３（プロメガ）のアームであるＢａｍＨ・Ｉと連 鎖反応させた。連鎖反応を起こした混合物質をギガパック・ＩＩ・ゴールド（ST RATAGENE社）でパックして、大腸菌・ＬＥ３９２細胞に置いた。このライブラリ を滴定して増幅させ、０．３％クロロフォルム内で４℃で保存した。 実施例１Ｃの方法により、インフルエンザ菌ＰＡＫ １２０８５またはＳＢ３３から作製した染色体ＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａ・Ｉと３７ ℃で１５分間酵素分解させ、アガロースゲルで電気泳動させ、小さいフラクショ ンとした。１５−２３ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを含むゲルスライスを 切断して、３ｍｌのＴＡＥの入った隔膜チューブ内で１昼夜ＤＮＡを１４Ｖで電 気溶解させた。そのＤＮＡを２回沈澱させ、水に溶解させた後、ＥＭＢＬ３・Ｂ ａｍＨ・Ｉ・アーム（プロメガ）と１昼夜連鎖反応させた。連鎖反応を起こした 混合物質を、製造者の指示に従って、ラムダ・インビトロ・パッキング・キット （Amersham社）でパックして、大腸菌・ＮＭ５３９細胞に置いた。このライブラ リを滴定して増幅させ、０．３％クロロフォルム内で４℃で保存した。実施例 ３ この実施例はライブラリのスクリーニングを示したものである。Ａ．インフルエンザ菌ＤＬ６３−λＺＡＰ発現ライブラリ Ｔｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質は固相ヒト・トランスフェリン（ｈＴｆ）から 不純物を除去したものである。 タンパク質リガンドをＣＮＢｒー活性化セファロース（シグマ）のためのプロト コールに従って、２０ｍｌ のｈＴｆーセファロース・カラムを用意した。結果として生じたマトリックスを 、５０ｍＭトリスーＨＣＬの３カラム容量、１Ｍ・ＮａＣｌ、６Ｍ・グアニジン ーＨＣＬ、ｐＨ８．０で洗浄して非共有的に結合しているｈＴｆを除去した。そ れから、そのカラムを５０ｍＭ・トリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０を用いて平衡させ 、結合ｈＴｆに、クエン酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムをそれぞれ１００ｍＭ 含んだ緩衝液の中で、１０ｍｇ／ｍｌ・ＦｅＣｌの１ｍｌを使用して鉄を負荷さ せた。その後、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の２カラ ム容量で平衡させた。全部の細菌膜（３００ｍｇ総タンパク質）を、鉄が不足し た培地で増殖したインフルエンザ菌ＤＬ６３から作製した（Schryvers at al.， 1989参照）。膜をトリス−ＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、ｐＨ８．０内で、２ｍｇ／ ｍｌに希釈し、ＥＤＴＡを加えて溶解させた。４０、０００ｒｍｐで１時間遠心 分離して、その上澄み液をｈＴｆカラムに加え、そのカラムを５０ｍＭトリス− ＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．５％サルコシ ル、ｐＨ８．０で洗浄した。２Ｍ・ＧｎＨＣｌを用いて、同じ緩衝液の中で受容 体タンパク質を溶解させ、その溶解フラクションを２５ｍＭ・重炭酸アンモニア バッファ（５バッファ取り替え）で濾過し、親液化させ−２０℃で保存した。分 離 したタンパク質を、ニュージランド・白ウサギでトランスフェリン特異性抗血清 を標準法で産生させるのに使用した。即ち、抗原の最初の注入では完全フロイン トアジュバントを併用して、二回目の注入では不完全フロイントアジュバントを 併用する方法で、ウサギを皮下投与で２週間の間隔をおいて３回免疫させた。 ＤＬ６３−λＺＡＰを 大腸菌ＳＵＲＥ細胞の上に置いて、そのプラークを、 予め１０ｍＭ／ＩＰＴＧに浸しておいたニトロセルロース膜に移すと、pBluescr ipt lacZ プロモータから抗体を発現した。ポリクローナル・抗ＴｆＲ・抗血清 とウマ・ラディッシュ・抱合ヤギ・抗ウサギＩｇＧによるプローブの前に、５０ ｍＭトリス−ＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、内で０．５％スキムミルク を用いて、フィルターをブロックした。３周のスクリーニングを行って、インビ ボ切断法により、組換え・pBluescript・プラスミド（ｐＢＨＩＴＩ、ｐＢＨＩ Ｔ２；図１Ａ、図２）を見つけだした。Ｂ．Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＰＡＫ１２０８５非発現ライブラリ （ｉ）インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−ｐＵＣライブラリのスクリーニング コロニーのニトロセルロース・フィルタへのリフトは標準法で行い、フィルタ ーは、図２で示したような トラランスフェリン受容体遺伝子の５’ｐＢＨＩＴ２プローブで処理をした。プ ローブを、製造者のスペックに従って、ジゴゴキシゲニン(Boehringer Mannheim 社)で標識した。数個のクローンをニトロセルロース上にドットの形でブロット して、同じ５’ｐＢＨＩＴ２を利用して、第二周のスクリーニングに移った。第 二周のスクリーニングの結果を制限酵素地図を用いて分析し、配列分析用にクロ ーンＳー４３６８−３−３（図１Ｂ、図２）を選択した。 （ｉｉ）インフルエンザ菌ＥａｇａｎーλＺＡＰライブラリのスクリーニング ファージライブラリを標準法に従って、ＬＢプレートと０．７％アガロース層 を用いて、ＸＬ１細胞にプレートした（付着させた）。プラークは標準プロトコ ールに従ってニトロセルロース・フィルタにリフトさせ（載せ）、このフィルタ を８０℃で２時間真空下でベーキングして、ＤＮＡを固着させた。トラランスフ ェリン受容体遺伝子の５’ｐＢＨＩＴ２プローブをジゴキシゲニンで標識し、フ ィルタを４２℃で４時間事前にハイブリッド形成させ、その後、４２℃で標識し たプローブで１昼夜ハイブリダイゼーションを行った。フィルタを６８℃で洗浄 してオートラジオグラフィを行った後、第二周のスクリーニング用のプラークを 選択した。ファージＤＮＡのインビボ切断は、λＺＡＰ システム(Promega社)と一緒に供給されたプロトコールに従って行った。−２． ５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ・インザートが付着した４個のクローンが得られたが、その うちのＪＢ−９０１−５−３は、図Ｂ、図２に例として示している。プラークを 増幅して、ファージＤＮＡを培地５００ｍｌから分離精製した。インザートＤＮ Ａは酵素Ｘｂａ・Ｉで切断し、ｐＵＣ８：２（複数コローニング部位での追加Ｂ ｇｌＩＩとＸｂａ−Ｉサイトを含むｐＵＣ８）に挿入した。このｐＵＣ８：２は 、すでに酵素Ｘｂａ・Ｉで消化されてジホスホリル化していた。クローンには、 インフルエンザ菌ＴｆＲオペロンの３’ーハーフが含まれていた。 （ｉｉｉ）ＥＭＢＬ ３・ライブラリのスクリーニング インフルエンザ菌ＭｉｎｎＡライブラリは０．７％トップ・アガロースのＮＺ ＣＹＭ溶液を用いて、ＮＺＣＹＭプレート上でＬＥ３９２細胞にプレートした。 標準法により、プラークをニトロセルロースフィルタにリフトし、このフィルタ を５’ｐＢＨＩＴ２プローブ（図２）で処理してジゴキシゲニンで標識した。プ ラークをプレートして、同じ方法で第二、第三周のスクリーニングに移行した。 ５００ｍｌの培地から、標準法で、ファージＤＮＡを調製し、インザートＤＮＡ は酵素Ｓａｌで切断して、ｐＵＣに挿入すると、クロ ーンＤＳ−７１２−１−３（図１Ｃ、図２）が産生された。 インフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５ライブラリを、０．７％アガロースを用い て、ＮＺＣＹＭプレート上のＬＥ３９２細胞にプレートした（付着させた）。プ ラークをニトロセルースフィルタにリフトし、そのフィルタを５’ｐＢＨＩＴ２ で標識されたプローブで処理をした。プラークをプレートして、同じ方法で第二 周のスクリーニングに移行した。５００ｍｌの培地から、標準法で、ファージＤ ＮＡを調製し、インザートＤＮＡは酵素Ｓａｌで切断して、ｐＵＣに挿入すると 、クローンＪＢ−１０４２−７−６（図１Ｄ、図２）が産生された。 インフルエンザ菌ＳＢ３３ライブラリを、０．７％アガロースを用いて、ＮＺ ＣＹＭプレート上のＬＥ３９２細胞にプレートした（付着させた）。プラークを ニトロセルースフィルタにリフトし、そのフィルタを５’ｐＢＨＩＴ２で標識さ れたプローブで処理をした（図２）。プラークをプレートして、同じ方法で第二 周のスクリーニングに移行した。５００ｍｌの培地から、標準法で、ファージＤ ＮＡを調製し、インザートＤＮＡは酵素Ｓａｌで切断して、ｐＵＣに挿入すると 、クローンＪＢ−１０３１−２−９（図２）が産生された。実施例 ４ この実施例は、ＴｆＲオペロンのＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質のスクリーニ ングを示したものである。 標準法を用いて、クローンｐＢＨＩＴ１、ｐＢＨ１Ｔ２、Ｓ−４３６８−３ −３，ＪＢ−９０１−５−３，ＤＳ−７１２−１−３，ＪＢ−１０４２−７−６ ，ＪＢ１０３１−２−９からプラスミドＤＮＡを調製した。シーケンス・プライ マーの塩基長さが１７ー２５であるオリゴヌレオチドを、ＡＢＩ・モデル３８０ Ｂ・ＤＮＡ合成器を使用して合成して、Applied Biosystem社のＯＰＣカートリ ッジによるクロマトグラフィで精製を行い、製造者の奨める方法で利用した。Ａ ＢＩ・モデル３８０Ｂ・ＤＮＡ合成器とダイ・ターミネータ化学法を、製造者の プロトコールに従って使用してサンプルのシーケンシング（塩基配列決定）を行 った。インフルエンザ菌株ＤＬ６３のＴｆＲオペロンのシーケンスを図３に、Ｅ ａｇａｎ株のＴｆＲオペロンのシーケンスを図４に、ＭｉｎｎＡ株のＴｆＲオペ ロンのシーケンスを図５に、ＰＡＫ１２０８５株のＴｆＲオペロンのシーケンス を図６に、ＳＢ３３株のＴｆＲオペロンのシーケンスを図７に示した。実施例 ５ この実施例は、類型分類不能のインフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ ３０，ＳＢ３２のｔｂｐ２ 遺伝子のＰＣＲ増幅を示したものである。 類型分類不能のインフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０，ＳＢ３２ の染色体ＤＮＡは上記で示した方法で作製した。ＴｆＲ遺伝子はオペロンとして 構成されており、最初にｔｂｐ２があり、つぎにｔｂｐ１が続く（図１２Ａ，１ ２Ｂ）。オリゴヌクレオチドはｔｂｐ２の５’末端で合成され、ｔｂｐ１コード ・シーケンスの５’末端の逆相補体である。プライマーは、ＧＧＡＴＣＣＡＴＡ ＴＧＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＴ（ＳＥＱ．ＩＤ番号： １２０）で、これはｔｂｐ２のリーダシーケンスからのＭＫＳＶＰＬＩＳＧＳ（ ＳＥＱ．ＩＤ番号：１４７）に対応している。さらに、ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴ ＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＣＣＡＴ（ＳＥＱ．ＩＤ番号：１３７ ）であり、これは、ｔｂｐ１のリーダシーケンスＭＴＫＫ（ＳＥＱ．ＩＤ番号： １３８）の逆相補体であり、遺伝子間シーケンスの一部である。ＰＣＲ増幅は、 １０ｍＭ・トリス／ＨＣＬ・ｐＨ８．３、５０ｍＭ・塩化カリウム、１．５ｍＭ 塩化マグネシウムを含むバファー内で行われる。１００μｌ反応混合液には、染 色体ＤＮＡの５ｎｇ、各プライマの１μｇ、ＤＮＡポリメラーゼの５ユニット、 ０．４ｍＭｄＮＴＰｓが含まれていた。サイクル条件は２５サイクルで、１．０ 分で９４℃、２．０分で４ ５℃、１．５分で７２℃であった。各サンプルに対して特定２ｋｂフラグメント が増幅された（図１３）。正の調節としてＳＢ３３・ＤＮＡが使用された（列１ ）。ｔｂｐ２遺伝子の増幅に使用された染色体ＤＮＡは列１、ＳＢ３３；列２、 ＳＢ１２；列３、ＳＢ２９；列４、ＳＢ３０；列５、ＳＢ３２であった。フラグ メントをＴＡコローニング・ベクタに挿入して、これらのヌクレオチド塩基配列 を決定した。図８にはＳＢ１２由来のＴｂｐ２の塩基配列（ＳＥＱＩＤ番号：１ ０８）、図９にはＳＢ２９由来のＴｂｐ２の塩基配列（ＳＥＱＩＤ番号：１１０ ）、図１０にはＳＢ３０由来のＴｂｐ２の塩基配列（ＳＥＱＩＤ番号：１１２） 、図１１にはＳＢ３２由来のＴｂｐ２の塩基配列（ＳＥＱＩＤ番号：１１４）を 示した。実施例 ６ この実施例は、トランスフェリン受容体タンパク質ののアミノ酸配列順序の比 較および二次構造分析によるトランスフェリン受容体タンパク質のエピトープを 同定したものである。 図１４は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株、ＤＬ６３株、類型分類不能イ ンフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５株、ＳＢ３３株、髄膜炎菌Ｂ１６ＢとＭ９８２ 株(Legrain et al.，1993)、淋菌ＦＡ１９株(Cornelissen et al.，1992)由来の Ｔｂｐ１のアミノ酸配列の 比較である。この分析は、Ｔｂｐ１の部位がすべての細菌に保存されていること を示した。 図１５は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株、ＤＬ６３株、類型分類不能イ ンフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５株、ＳＢ１２株、ＳＢ２９，ＳＢ３０、ＳＢ３ ２株、髄膜炎菌Ｂ１６ＢとＭ９８２株)、淋菌ＦＡ１９株、ヘモフィリス属胸膜 肺炎菌(Gerlach et al.，1992)由来のＴｂｐ２のアミノ酸配列の比較である。こ の分析は、Ｔｂｐ２の部位がすべての細菌に保存されていることを示した。 タンパク質の二次構造分析をＣｈｏｕ・Ｆａｍａｎアルゴリズム(1978)を使用 して行った。Ｈｏｐｐアルゴリズム(1986)を利用して、親水性、疎水性プロット も行った。ヘパペプチド・ウインドウの平均値から値を引き出し、それを各フラ グメントの中間点にプロットした。図１６Ａは、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａ ｎ株Ｔｂｐ１の推定の二次構造である 図１６Ｂは、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａ ｇａｎ株Ｔｂｐ２の推定の二次構造である。この図１６Ａ、Ｂで推定した二次構 造は下記のような手順で推定をした。本発明者としては、この図で示したような 二次構造が正確であるかどうかにはまだ確信を持てないでいる。 種々の別種の細菌由来のＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質の保存エピトープは図 １４と図１５で示したシー ケンスにより同定した。 保存エピトープの例をあげれば下記の通りである。 推定二次構造を組み合わせることで、Ｔｂｐ１では４個の保存エピトープが同 定され、Ｔｂｐ２では２個の保存エピトープが同定された。以下の通りである。 保存されたアミノ酸配列順序を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドは 、診断分野で検出、つまり、トランスフェリン受容体タンパク質を産生する細菌 が原因となっている病気を探知、防御するための免疫原として利用できる。免疫 賦与のため、特定のアミノ酸配列順序が免疫システムに与えられるタンパク質ま たはペプチドの形で細胞に供給され、それを運搬するベクタとして、サルモネラ 菌、ＢＣＧ、アデオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオ ウイルスなどが使用される。実施例 ７ この実施例は、大腸菌にＥａｇａｎ・Ｔｂｐ１を発現させるプラスミド・ＪＢ −１４６８−２９の構築概要を示したものである。 プラスミドＳ−４３６８−３−３（図１Ｂ、ず２）とＪ−９１１−３−２（図 １７）にはＥａｇａｎ・ｔｂｐ１遺伝子の５’ー、３’ー部分をそれぞれ含む。 図１７は、プラスミド・ＪＢ−１４６８−２９の構築概要を示したものである。 プラスミ ド・ＪＢ−１４６８−２９の構築に使用されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を 図２０に示した（ＳＥＱ ＩＤ番号：８６，８７）。プラスミド・ＪＢ−１４６ ８−２９を電気穿孔法により大腸菌株ＢＬ２１・ＤＥ３に導入してＪＢ−１４７ ６−２−１を産生させた。ＪＢ−１４７６−２−１をＹＴ培地で増殖させて、次 のプロトコールに従って、ＩＰＴＧで誘導した。免疫原性の分析とそのほかの研 究に使うＴｂｐ１の作製のために、ＪＢ−１４７６−２−１を１昼夜３％グルコ ースを含むＮＺＣＹＭ培地で増殖させた。１：４０接種物をグルコースを含まな い新鮮なＮＺＣＹＭ培地に加え、培地をＡ578=0.3になるように調整した。ラク トースをその含有量が１％になるように添加して４時間誘導した。図２２には、 ＪＢ−１４７６−２−１の全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したもので ある。列１、ｔ0でのＪＢ−１４７６−２−１；列２、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ− １４７６−２−１、列３、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ．６６ ｋＤａ，４５ｋＤａの分子量マーカー；列４、ｔ0でのＪＢ−１４７６−４−１ （Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２）、列５、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１６０７−１ −１、列６、ｔ0でのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／ＳＢ１２・Ｔｂｐ２）、 列７、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１６０７−１−１。実施例 ８ この実施例は、大腸菌にＥａｇａｎ・Ｔｂｐ２を発現させるプラスミド・ＪＢ −１４２４−２ー８の構築概要を示したものである。 図１８は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株由来のｔｂｏ２遺伝子を有する プラスミドＳ−４３６８−３−３である。図１８は、プラスミドＪＢ−１４２４ −２−８であり、図１９は、使用したオリゴヌクレオチドである。プラスミド・ ＪＢ−１４２４−２−８を電気穿孔法により大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入し てＪＢ−１４３７−４−１を産生させた。図２２で示したように、ＬＰＴＧまた はラクトースで誘導すると、大腸菌ＪＢ−１４３７−４−１はＴｂｐ２タンパク 質を産生した。列１、ｔ0でのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔ ｂｐ１）；列２、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４７６−２−１、列３、２００ｋＤ ａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ．６６ｋＤａ，４５ｋＤａ、３１ｋＤａの分 子量マーカー；列４、ｔ0でのＪＢ−１４３７−４−１（Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔ ｂｐ２）、列５、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４３７−４−１、列６、ｔ0でのＪ Ｂ−１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２・Ｔｂｐ２）、列７、ｔ＝４ｈ誘導での ＪＢ−１６０７−１−１。実施例 ９ この実施例は、Ｔｈｐ２配列の前にあるリポタンパク・リーダ・シーケンスを コードするプラスミドの構造を示したものである。 図２０は、大腸菌ｌｐｐ（ＳＥＱ ＩＤ番号：８８，８９）、大腸菌ｒｌｐＢ （ＳＥＱ ＩＤ番号：９０，９１）、大腸菌ｐａｌ（ＳＥＱ ＩＤ番号：９２， ９３）由来のリポタンパク・リーダ・シーケンスを有するプラスミド作製に使用 したオリゴヌクレオチドである。表１には作製したプラスミドおよびそれと対応 する菌株を示した。実施例 １０ この実施例は、大腸菌にＳＢ１２・Ｔｂｐ２を発現させるプラスミド・ＪＢ− １６００−１の構造を示したものである。 プラスミド・ＪＢ−１０４７−１−２（図２１）には、ＰＣＲ増殖ＳＢ１２・ ｔｂｐ２遺伝子が含まれている。ｔｂｐ２遺伝子をＥｃｏＲ・Ｉで切断して、ｐ Ｔ７ー７発現ベクタに挿入して、プラスミド・ＪＢ−１６００−１を産生させた 。このプラスミドを電気穿孔法により大腸菌細胞ＢＬ２１／ＤＥ３に挿入すると 、大腸菌株由来プラスミドを産生し、これがＳＢ１２・Ｔｂｐ２を発現する。Ｉ ＰＴＧまたはラクトースで誘導するとすぐに図２２で示したようなＳＢ１２・Ｔ ｂｐ２を発現した。列１、ｔ0でのＪＢ−１４７６−２− １（Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ１）；列２、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４７６− ２−１、列３、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ．６６ｋＤａ，４ ５ｋＤａ、３１ｋＤａの分子量マーカー；列４、ｔ0でのＪＢ−１４３７−４− １（Ｔ７／Ｅａｇａｎ・Ｔｂｐ２）、列５、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１４３７− ４−１、列６、ｔ0でのＪＢ−１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２・Ｔｂｐ２） 、列７、ｔ＝４ｈ誘導でのＪＢ−１６０７−１−１。実施例 １１ この実施例は、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２の抽出と精製を図示したものである。 図２３は、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２の精製概要を示したものである。この組換え法 によるＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質は両方とも大腸菌の中では、顆粒分画とし て発現されるが、その精製は同じ方法で行う。５００ｍＭ培地から取った細胞（ Ｔｂｐ１については実施例７、Ｔｂｐ２について実施例８）を５０ｍＭトリスー ＨＣＬ、ｐＨ８．０の５０ｍｌ内で再懸濁させ、音波処理（３Ｘ１０ｍｉｎ、７ ０％衝撃周波）によりつぶした。その抽出物を２０、０００ｒｍｐｘｇ、３０分 間遠心分離器にかけ、その上澄み液（可溶性大腸菌タンパク質の９５％）を捨て た。残りのペレットをさらに０．５％トリトン・ｘ−１００と１０ｍＭ・ＥＤＴ Ａを含む５０ｍＭ・トリスーＨＣＬ、ｐＨ８．０の５０ｍｌで抽出した。その抽 出物を２０、０００ｒｍｐｘｇ、３０分間遠心分離器にかけ、その上澄み液（残 りの可溶性タンパク質と膜タンパク質が大部分）を捨てた。この抽出の後のペレ ット(図２３、ＰＰＴ２)には顆粒分画が含まれていた。ここで得られたＴｂｐ１ とＴｂｐ２タンパク質を、０．１％ＳＤＳと５ｍＭ／ＤＴＴを含む５０ｍＭ・ト リスーＨＣＬ、ｐＨ８．０に溶解させた。遠心分離後の上澄み液を０．１％ＳＤ Ｓと５ｍＭ／ＤＴＴを含む５０ｍＭ・トリスーＨＣＬ、ｐＨ８．０で平衡させた スーパデックス２００ゲル濾過カラムでさらに抽出した。そのフラクションをＳ ＤＳ・ＰＡＧＥで分析して、精製したＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質を含むもの を５０ｍＭ・トリスーＨＣＬ、ｐＨ８．０を使い４℃で１昼夜濾過し、２０，０ ００ｘｇで３０分間遠心分離した。この段階でのタンパク質は可溶性であり、− ２０℃で保存した。 図２４は、精製過程でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである。列１、予 め染色させた分子量タンパク質マーカ（１０６，８０，４９．５，３２．５，２ ７．５，１８．５ｋＤａ）；列２、大腸菌全細胞溶解物；列３、溶解顆粒分画； 列４、精製Ｔｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質。実施例 １２ この実施例は、マウスにおける組換えＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質免疫原性 研究である。 ５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群に、実施例１１で用意した精製ｒＴｂｐ１とｒ Ｔｂｐ２タンパク質をＡｌＰＯ４（一回投与量．５ｍｇ）存在下で、１、２９、 ４３日目に皮下投与（１μｇから１０ｐｇ）した。１４，２８，４２，５６日目 に採血をして、産生した抗ｒＴｂｐ１と抗ｒＴｂｐ２抗体の力価をＥＩＡ法によ り分析した。図２５はこの免疫原性研究からの結果である。実施例 １３ この実施例は、マウス抗血清における抗ｒＴｂｐ１と抗ｒＴｂｐ２の定量のた めのＥＩＡ開発の例示である。 基本的には、Panezutti et al.，(1993)の方法を用いて、抗ｒＴｂｐ１と抗ｒ Ｔｂｐ２抗体の力価を測定した。マイクロティタを０．５μｇのｒＴｂｐ１また は抗ｒＴｂｐ２（実施例１１）でコーティングして、１６時間室温で放置し、０ ．１％(W/V)のＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。抗血清を順番に希釈して、 室温で１時間培養した。第二抗体として、ホースラッデシュ・ペルオキシダーゼ と抱合したヤギーマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体・親和性精製Ｆ（ａｂ’）2 ・フラグメントを用いた。テトラメチルベンジヂン（ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2）を用いて 反応を進展させて、フロー・マ ルチスカン・ＭＣＣマイクロプレート・リーダで波長４５０ｎｍでの吸光度を測 定した。抗血清の反応力価は希釈度（これは常に免疫する前の血清で得られた吸 光度の２倍の増加を示す）の逆数で示した。実施例 １４ この実施例は、組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｐ１やその他のインフルエンザ株由来 のＴｂｐタンパク抗原による免疫での抗Ｔｂｐ１抗血清の交差反応性を示してい る。 ＮＡＤとヘム(Harknes at al.，1992)±ＥＤＤＡで補充したＢＨＩ培地で増殖 させたインフルエンザ菌株の全細胞溶解物を、ＳＤＳ・ＰＡＧＥゲルで作製して 、それをニトロセルロース膜に移し、精製組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｂ１・モルモ ット・抗Ｔｂｐ１で産生させた抗血清でプローブした（図２６）。列１、ＢＬ２ １／ＤＥ３；列２、ＳＢ１２ −ＥＤＤＡ：列３、ＳＢ１２ ＋ＥＤＤＡ；列４ 、ＳＢ２９ −ＥＤＤＡ；列５、ＳＢ２９＋ＥＤＤＡ；列６、ＳＢ３３ −ＥＤ ＤＡ；列７、ＳＢ３３ ＋ＥＤＤＡ；列８、Ｅａｇａｎ −ＥＤＤＡ；列９、Ｅ ａｇａｎ ＋ＥＤＤＡ；列１０、カタル球菌４２２３、−ＥＤＤＡ；列１１、カ タル球菌４２２３、＋ＥＤＤＡ；列１２、髄膜炎菌６０８ −ＥＤＤＡ；列１３ 、髄膜炎菌６０８ ＋ＥＤＤＡ；列１４、組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｐ１発現・誘 導 ＪＢ−１４７６−２−１；列５、分子量マーカ。インフルエンザ菌ＳＢ１２株、 ＳＢ２９株、ＳＢ３３株、Ｅａｇａｎ株に対応する、大きさが９５ｋＤａである 特定バンドは、列３、４、５，７，８，９において、抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し た。カタル球菌４２２３株と対応する、大きさが１１０ｋＤａである特定バンド は、列１０，１１において抗Ｔｂｐ１抗血清と反応した。；髄膜炎菌６０８株に 対応する、８０ｋＤａバンドは列１２，１３において抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し た。実施例 １５ この実施例は、組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｐ２やその他のインフルエンザ株由来 のＴｂｐタンパク抗原による免疫での抗Ｔｂｐ１抗血清の交差反応性を示してい る。 ＮＡＤとヘム(Harknes at al.，1992)±ＥＤＤＡで補充したＢＨＩ培地で増殖 させたインフルエンザ菌株の全細胞溶解物を、ＳＤＳ・ＰＡＧＥゲルで分離して 、それをニトロセルロース膜に移し、精製・組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｂ２・モル モット・抗Ｔｂｐ２で産生させた抗血清でプローブした（図２６）。列１、分子 量マーカ；列２、組換えＥａｇａｎ・Ｔｂｐ１発現・誘導ＪＢ−１４３７−４− １；列３、ＳＢ１２ −ＥＤＤＡ；列４、ＳＢ１２ ＋ＥＤＤＡ；列５、ＳＢ２ ９ −ＥＤＤＡ；列６、ＳＢ２９ ＋ＥＤＤＡ；列７、ＳＢ３０ −ＥＤＤＡ；列 ８、ＳＢ３０ ＋ＥＤＤＡ；列９、ＳＢ３２ −ＥＤＤＡ；列１０、ＳＢ３３ −ＥＤＤＡ；列１１、ＳＢ３３ ＋ＥＤＤＡ；列１２、ＰＡＫ −ＥＤＤＡ；列 １３、ＰＡＫ ＋ＥＤＤＡ；列１４、Ｅａｇａｎ −ＥＤＤＡ；列１５、Ｅａｇ ａｎ ＋ＥＤＤＡ。インフルエンザ菌ＳＢ１２株、ＳＢ２９株、ＳＢ３０株、Ｐ ＡＫ株、Ｅａｇａｎ株に対応する、大きさが６０−７０ｋＤａである特定バンド は、列３、６、７，８，１３，１４，１５において、抗Ｔｂｐ２抗血清と反応し た。実施例 １６ この実施例は、Ｔｂｐ２とＴｂｐ１の保存部位に対応する合成ペプチドの合成 を示したものである。 図１４と図１５にそれぞれ示されているＴｂｐ２とＴｂｐ１の推定アミノ酸配 列順序を比較した。この比較により、アミノ酸配列順序を保存しているトランス フェリン受容体内での部位を特定でき、表２，３で示したように、これに基いて 、トランスフェリン受容体部分を含むペプチドを合成した。すべての合成は、上 記ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクタを適当な宿主内で発現させる方 法、あるいは、標準ペプチド合成の方法で実施された。ペプチドをＡＢＩ４３０ Ａペプチド合成器を用い、最適ｔーＢｏｃ化学を利用 して、メーカが奨める条件で合成した。合成されたペプチドを、フッ化水素酸（ ＨＦ）を使用して、樹脂から分離した。このペプチドを、高性能液体逆相クロマ トグラフィで精製した。１５％から５５％アセトニトリルグラディエントの０． １％トリフルオリル酢酸（ＴＦＡ）溶液を、２ｍｌ／分の流量で、Ｖｙｄａｃ・ Ｃ４・セミプリパラテイブ・カラム（１ｘ３０ｃｍ）に流す方法で行った。生物 学的、免疫学的研究に使用した全部ペプチドの純度は９５％以上（分析ＨＰＬＣ 測定）であった。アミノ酸成分の分析はウオータ・ピコータグ・システムで行い 、結果は理論値とよく適合した。実施例 １７ この実施例は、試験動物における合成ペプチドの免疫原性を示したものである 。 モルモットを筋肉内投与により、実施例１１で作製した１００μｇのペプチド を使用して免疫した。ここでは完全フロイントアジュバントをエマルションの形 で併用した。１４日目と２８日目に同じペプチドと同じアジュバントを併用して 免疫賦与した。免疫賦与から４２日目に血清を採取してＥＬＩＳＡで測定した。 マイクロティタ・プレートに、ある特定のペプチドを５０μｌのコーティング緩 衝液（１５ｍＭ・Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６）に溶かして、これを コ ーティングして、室温で１６時間放置した。このプレートをＢＳＡのリン酸緩衝 溶液で３０分間室温でブロックした。抗血清を連続希釈して、それをマイクロテ ィタ・プレートに塗り、室温で１時間培養した。抗血清を取り除いた後 そのプ レートを０．１％（W/V)テウイーン２０と０．１(W/V)％ＢＳＡを含んだＰＢＳ で５回洗浄した。ホースラッデシュ・ペルオキシダーゼと抱合したヤギ抗モルモ ットＩｇＧ抗体から作製したＦ（ａｂ’）2を洗浄バッファで希釈して、希釈し た液をマイクロティタプレートに塗った。室温で１時間培養した後、プレートを 洗浄バッファで５回洗浄した。プレートを基質テトラメチルベンジデインのＨ2 Ｏ2溶液の中に入れて反応させ、１Ｎ・Ｈ2ＳＯ4でその反応を停止させた後、そ の吸光度をチトレクト・マルティスカンＩＩ（Flow Labs社）を用いて、波長４ ５０ｎｍで測定した。３２のアミノ酸残基を持った別の２個のペプチドをこのＥ ＬＩＳＡ分析では、負の調節のために導入した。３通りの分析を行い、各抗体の 力価を測定した。力価は、負の調節から得たものの吸光度の２倍の増加を示す希 釈度を基礎に示した。モルモットから得た抗体は免疫賦与で使用したペプチドに 対して単一特異的であった。表４は免疫賦与で得られた抗血清の力価を示したも のである。本発明にかかるペプチドは表２，３で示されたもの中のいずれかのコ ピーであ るか、または、その類似体の複数コピーを含むペプチドである。表２，３で示さ れたペプチド、または、その類似体から選択された別の複数のペプチドの場合も あり、適当な運搬分子を含む。細菌の保存部位から作製されたペプチドを抗体の 産生に使用することが望ましい。その理由は、ヘモフィリス属の数種の菌種の検 出にアミノ結合アセイを利用できるからである。そのために、表２，３には、ト ランスフェリン受容体の保存部位のいくつかを示して、それを利用したペプチド で、診断、免疫感作、医学治療が可能になる。実施例 １８ この実施例は、トランスフェリン受容体の保存部位に対応するペプチドを免疫 賦与することで得た抗血清のブランハメラ属カタル球菌のトランスフェリン受容 体認識能力を示したものである。 モルモットをトランスフェリン受容体の保存部位に対応するペプチド、および 、実施例１７で得られたペプチドで免疫した。ブランハメラ属カタル球菌の全細 胞抽出物をこの菌由来のトランスフェリン受容体を認識できる ペプチド特異性 抗血清でイミュノブロットした。Ｔｂｐ２・Ｎー末端ペプチドおよびペプチドＴ ＢＰ２ー２５で免疫したモルモットから得た抗ペプチド抗血清は、カタル球菌由 来のＴｂｐ２およびプラスミド・クローン・ｐＢＨＩＴ２により大腸菌で発現さ れた組換えＴｂｐ２を特異的に認識した。プラスミド・クローン・ｐＢＨＩＴ２ はアミノ酸配列８０でスタートするＴｂｐ２タンパク質の切断部位を発現した（ 例えば、ＮＫＫＦＹＳＧ、ＳＥＱ ＩＤ番号：１０５）。従って、ｐＢＨＩＴ２ により作製されたＴｂｐ２タンパク質は、第二エピトープＬＥＧＧＦＹＧＰ（Ｔ ＢＰ２ー２５）に対して産生された抗体でないと認識されない。この分析から、 トランスフェリン受容体間の保存シーケンスに対応するペプチドを、トランスフ ェリン受容体を産生する細菌の検出に使用でき、ワクチンのような免疫原製剤に すれば、トランスフェリン受容体に免疫応答する薬剤として使えるし、そのよう な細菌が原因となる病気の治療にも有用である。 ウサギから得た血清をＥＬＩＳＡ法により、アミノ酸配列がＬＥＧＧＦＹＧＰ （ＳＥＱＩＤ番号：７４）であるペプチドに対して、あるいは、インフルエンザ 菌ＤＬ６３株由来のＴｂｐに対して、抗体反応を示すかどうかを試験した。ＥＬ ＩＳＡ法用のプレートにペプチドまたはタンパク質をコーテングして、５％スキ ムミルクでブロックした。血清をリン酸緩衝食塩水、０．０５％テウイーンー２ ０、１％乾燥ミルクで２倍に連続希釈をして、プレート上で２時間培養した後、 そのプレートを０．０５％０．０５％テウイーンー２０を含むリン酸緩衝食塩水 で５回洗浄した。洗浄した プレートを、猿・抗ウサギＩｇＧと抱合したホースラヂッシュ・ペルオキシダー ゼで、室温で３０分プローブした。其の後、０．０５％０．０５％テウイーンー ２０を含むリン酸緩衝食塩水で５回洗浄した。プレートに暗室で、室温で３０分 、ＨＲＰＯ基質を加えて発光させ、其の後、５０μｌの１Ｍ・硫酸を添加して、 その発光を停止させた。波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。実施例 １９ この実施例は、トランスフェリン受容体を産生しないインフルエンザ菌株の作 製を示している。 ｐＢＨＩＴ２から得たインサートの２．５５・Ｅｃｏ・ＲＩフラグメントをｐ ＵＣ４ＫのＥｃｏ・ＲＩに挿入してサブクローンを作製すると、このベクタ（ｐ ＵＨＩＴ１、図２８）からＴｎ９０３カナマイシン抵抗カセットを除去される。 このサブクローン・ステップを行うことにより、カナマイシン抵抗カセットを含 むＨｉｎｃＩＩかＰｓｔＩ・ｐＵＣ４Ｋフラグメントのいずれかを、ｐＵＨＩＴ １のＨｉｎｄＩＩＩ部位またはＰｓｔＩ部位に挿入しやすくなる。この両部位は 、ｐＵＨＩＴ１ＫＦＨとｐＵＨＩＴ１ＫＦＰの構築の特異な部位である（図２８ ）。酵素Ｅｃｏ・ＲＩで妨害遺伝子シーケンスを除去した後、この物質を、すで に述べた方法(Barcak et al.，1991)により、Ｍ−ＩＶ培 地の使用による形質転換法により、インフルエンザ菌野生型ゲノムに導入する。 形質転換された物質を２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＢＨＩＮＨ寒天に移す 。実施例 ２０ この実施例は、トランスフェリン受容体のエピトープを発現するポリオウイル スの作製を示している。 ポリオウイルス・タイプＩ・マホニ株（ＰＶ１−Ｍ）ゲノムの塩基１１７５か ら２９５６を有するｃＤＮＡを、制限酵素・Ｓａｕ・ＩとＨｉｎｄ・ＩＩＩで切 断した。これらの酵素は、塩基２７５４から２７８６を有するフラグメントを切 断するが、図２９で示すように、このフラグメントはＰＶ１−Ｍ・アミノ酸１０ ９４から１１０２をコードするものである。本申請では、ポリオウイルスのアミ ノ酸を表現するのに４桁のコードを使用した。例えば、１０９５は、キャプシド ・タンパク質ＶＰ１のアミノ酸９５を示す。ポリオウイルスとトランスフェリン 受容体アミノ酸配列をコードする新しいハイブリッド・ｃＤＮＡ・クローンは、 切断されたフラグメントを、インフルエンザ菌由来Ｔｂｐ２タンパク質のアミノ 酸をコードする合成オリゴヌクレオチドで置換することで作製される。新しいハ イブリッド・ｃＤＮＡ・クローンは、制限酵素Ｎｈｅ・ＩとＳｎａＢで切断され るが、これらの酵素は、ポリオウイルス塩基２４７１から２９５６から、トラン スフ ェリン受容体ＤＮＡ配列を含むハイブリッドフラグメントを切断する。ＶＰ１− Ｍの全ゲノムのｃＤＮＡ・クローン（例えば、ｐＴ７ＸＬＤまたはｐＴ７ＣＭＣ Ｂ）は、酵素・Ｎｈｅ・ＩとＳｎａＢで切断され、ポリオウイルス塩基２４７１ から２９５６からハイブリッドフラグメントを切り離す。図２９で示したように 、この切り離された部分は、塩基２７５４から２７８６を持つＶＰ１−Ｍのトラ ンスフェリン受容体ＤＮＡ配列を含むハイブリッドフラグメントで代替されるが 、このハイブリッドフラグメントは、トランスフェリン受容体アミノ酸配列を含 むハイブリッドＢＣループをコードしている。 プラスミドｐＴ７ＸＬＤやｐＴ７ＣＭＣＢのようなｐＴ７ＸＬＤのクローンに は、ＶＰ１−Ｍ・ｃＤＮＡの５’末端に、酵素Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモ ータ配列が含まれている。トランスフェリン受容体アミノ酸をコードする塩基を 含むＶＰ１−Ｍ・ｃＤＮＡのＲＮＡ転写は、van der Werf et al.，が述べてい るように、Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼでなされる。ＲＮＡ転写物を有するＶｅｒ ｏ細胞のトランスフェクションを行うことで、４個の生きたハイブリッドウイル ス（ＰＶＩＴＢＰ２Ａ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｂ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｃ、ＰＶ１ＴＢ２Ｄ ）を産出した。ｐＴ７ＣＭＣＢの転写物のトランスフェクションを行うことで、 ト ランスフェクション誘導野生型ポリオウイルス（ＰＶ１ＸＬＤ）を産出した（図 ２９）。 表５は、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｂ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｃ、ＰＶ１Ｔ Ｂ２Ｄの抗原特性である。これらすべてが、アミノ酸配列・ＬＥＧＧＦＹＧＰ（ ＳＥＱＩＤ番号：７４）をもつペプチドで免疫して得られたモルモット抗血清に は中和性を示した。このことは、ウイルスが抗原認識できる形でその配列を発現 したことを示す。抗血清を得るために、雌モルモットを、リン酸アルミニウム（ ３ｍｇ・ｍｌ）で調整された２００μｇのペプチドを含む５００μｌのＩＭで免 疫した。１，１４，２０，４２日目に免疫をして、１，２８，４２，５６目にそ れぞれ採血した。５６日目から抗血清が得られた。ＰＶ１ＴＢＰ２Ａ、ＰＶ１Ｔ ＢＰ２Ｂは、インフルエンザ菌ＤＬ６３由来Ｔｂｐ２に対して産生したウサギ抗 血清に対しても中和を示した。このことは、少なくとも、これらの２種類のウイ ルスは、タンパク質に対して免疫して得られた抗体を認識できる形の配列を発現 したことを示している。抗ＰＶ１血清に対しては、全部のウイルスが中和性を示 した。このことは、ポリオ中和抗原部位Ｉの変化がウイルスの別の抗原部位に大 きな影響を与えなかったことを示している。実施例 ２１ この実施例は、Ｔｂｐ２に対しての高い力価を有する抗血清を誘発するための ポリオウイルス・ハイブリッドの使用について例示している。 ウサギにＣｓＣｌで精製したＰＶ１ＴＢＰ２Ａを接種した（ウサギ＃４０、４ １、４２）。生きたウイルスを使用したが、ウサギにポリオウイルスが増殖され ることはなく、観察された免疫応答は不活性化抗原に対して有効になされたこと を注意する必要がある。第１日目に、１μｇのウイルスを完全フロイントアジュ バントと一緒に背中の筋肉内に接種し、１４日目に前回と同じ場所に同じアジュ バントを使用して追加接種を行った。接種前と接種後２７日目に採血した。接種 したウイルスの量は２．５ｘ１０2ｐｆｕで、約３．０ｘ１０11ビリオンに相当 するＡ260値で決定した。これは、ウイルスの０．５ｐｍｏｌに相当し、ＬＥＧ ＧＦＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：７４）エピトープの３０ｐｍｏｌに相当する。１ ビリオンはエピトープの６０コピーに相当するからである。 発明の要約 本発明は、トランスフェリン受容体遺伝子を含む精製分離されたＤＮＡ分子、 これらのトランスフェリン受容体遺伝子の塩基配列、および、これらの塩基配列 から誘導されたアミノ酸配列順序を提供するものである。本発明はさらにトラン スフェリン受容体部分に対 応するペプチドを提供する。ここで提供する遺伝子、ＤＮＡシーケンス、組換え タンパク質とペプチドは、診断、免疫感作、診断薬・免疫製剤の生産に有用であ る。発現した組換えＴｂｐ１、Ｔｂｐ１、提供されたシーケンス情報を基に誘導 したペプチドは、トランスフェリン受容体を産生する細菌病原菌が原因となる疾 病の予防用にも使用できる。この発明の範囲内で修飾・改良が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/102 39/102 9051−4Ｃ 48/00 ＡＢＤ 48/00 ＡＢＤ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 7804−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ｇ０１Ｎ 33/569 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，Ｆ Ｉ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ハークネス、ロビン カナダ国 エム２ケー １ビー８ オンタ リオ州 ウイロウダール シェパード ア ヴェニュー イースト 640 アパートメ ント 1706 (72)発明者 シュライヴァース、アンソニー カナダ国 ティー３エー ３ヴイ８ アル バータ州 カルガリ エドフォース ロー ド エヌ．ダブリュ．39 (72)発明者 チョン、ペレ カナダ国 エル４シー ０ビー６ オンタ リオ州 リッチモンド ヒル エストリル ストリート 32 (72)発明者 グレイ−オウエン、スコット カナダ国 ティー３ビー ５エイチ４ ア ルバータ州 カルガリ シルヴァーグロー ヴ ドライヴ エヌ．ダブリュ．2210― 142 (72)発明者 ヤン、ヤン−ピン カナダ国 エム２アール ３エヌ７ オン タリオ州 ウイロウダール トレスダール アヴェニュー 120 アパートメント 1709 (72)発明者 マーディン、アンドリュー カナダ国 エル３エックス １ヴイ２ オ ンタリオ州 ニューマーケット ロウデズ サークル 146 (72)発明者 クライン、マイケル カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウダール ムンロ ブール ヴァード 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Haemophilus（ヘモフィリス属）菌株のトランスフェリン受容体、そのフラ グメント、その類似体をコードしている精製・分離した核酸。 ２．ヘモフィリス属の菌株がヘモフィリス属インフルエンザ菌の菌株である請求 項１に記載の核酸分子。 ３．ヘモフィリス属インフルエンザ菌の菌株がヘモフィリス属インフルエンザ菌 のｂ型株である請求項２に記載の核酸分子。 ４．ヘモフィリス属インフルエンザ菌のｂ型株はＤＬ６３株、ＭｉｎｎＡ株、Ｅ ａｇａｎ株から選択される請求項３に記載の核酸分子。 ５．ヘモフィリス属インフルエンザ菌が類型分類不能インフルエンザ菌である請 求項２に記載の核酸分子。 ６．類型分類不能インフルエンザ菌は、ＰＡＫ１２０８５株、ＳＢ１２株、ＳＢ ２９株、ＳＢ３０株、ＳＢ３２株、ＳＢ３３株から選択される請求項５に記載の 核酸分子。 ７．ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ１タンパク質だけをコードする請求項１に記載 の核酸分子。 ８．ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ２タンパク質だけをコードする請求項１に記載 の核酸分子。 ９．トランスフェリン受容体タンパク質を産生する細 菌内で保存されているアミノ酸シーケンスを有するヘモフィリス属菌株のトラン スフェリン受容体タンパク質のフラグメントをコードする請求項１に記載の核酸 分子。 １０．保存されたアミノ酸シーケンスは、表２，表３で示したヘモフィリス属イ ンフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株のペプチドおよびその他のヘモフィリス属イン フルエンザ菌株の対応ペプチドのアミノ酸に含まれるシーケンスを有する請求項 ９に記載の核酸分子。 １１．保存アミノ酸のシーケンスがＬＥＧＧＦＹＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ番号：７４ ）またはＬＥＧＧＦＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：８５）である請求項１０に記載の 核酸分子。 １２．ＤＮＡシーケンスが下記のグループから選択される精製・分離した核酸分 子。 （ａ）図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１（ＳＥＱ ＩＤ番号：１，２ ，３，４，１０５，１０８，１１０，１１２，１１４）に示したＤＮＡシーケン スのうちのいずれかひとつ、または上記ＤＮＡシーケンスのうちのいずれかひと つの相補的ＤＮＡシーケンス。 （ｂ）図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１（ＳＥＱ ＩＤ番号：５，６ ，７，８，９，１０，１１，１２，１０６，１０７，１０９，１１１，１１３， １１５）で示したアミノ酸シーケンスのいずれかひとつをコードするＤＮＡシー ケンス、または、上記の相補的ＤＮＡシーケンス。 （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）で特定されたＤＮＡシーケンスのいずれかひとつ を厳格な条件下でハイブリダイゼーションして得られたＤＮＡシーケンス。 １３．（ｃ）で特定されたＤＮＡシーケンスは、（ａ）または（ｂ）で特定され たＤＮＡシーケッスのうちのいずれかひとつとの間に少なくとも９０％の同一性 がある請求項１２に記載の核酸分子。 １４．請求項１または請求項２の核酸分子で構成される宿主（宿主）の形質転換 用のベクター。 １５．ＡＴＣＣ保管番号が７５６０３であるプラスミドＤＳ−７１２−１−３の 同定特質またはＡＴＣＣ保管番号が７５６０７であるプラスミドＪＢ−１０４２ −７−６を有する請求項１４に記載のベクター。 １６．請求項１または請求項１２に記載の核酸分子から構成される宿主の形質転 換用に用いられる発現ベクたー、および、上記のヘモフィリス属菌株のトランス フェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体を宿主が発 現できるための核酸を用いた有効な発現手段。 １７．核酸が実質的にすべてのヘモフィリス属菌株のトランスフェリン受容体を コードする請求項１６に記 載の発現ベクター。 １８．核酸がヘモフィリス属菌株のＴｂｐ１タンパク質だけ、または、Ｔｂｐ２ タンパクだけをコードする請求項１６に記載の発現ベクター。 １９．発現手段として、宿主からトランスフェリン受容体、そのフラグメント、 その類似体を分泌させるためのリーダ・シーケンスをコードする核酸部位を用い る請求項１６に記載の発現ベクター。 ２０．発現手段として、宿主からトランスフェリン受容体、そのフラグメント、 その類似体を発現させるためのリピド化（脂質化）のシグナルをコードする核酸 部位を用いる請求項１６に記載の発現ベクター。 ２１．ＡＴＣＣ保管番号が７５９３７であるプラスミドＪＢ−１４２４−２−８ 同定特質またはＡＴＣＣ保管番号が７５９３５であるプラスミドＪＢ−１６００ −１の同定特質、または、ＡＴＣＣ保管番号が７５９３６であるプラスミドＪＢ −１４６８−２９の同定特質を有する請求項１６に記載の発現ベクター。 ２２．請求項１６で記載された発現ベクターを有する形質転換した宿主。 ２３．ＪＢ−１４７６−２−１、ＪＢ−１４３７−４−１、ＪＢ−１６０７−１ −１で構成されるグループから選択された請求項２２に記載された宿主。 ２４．請求項２２に記載された形質転換した宿主によ り産生される組換えトランスフェリン受容体、そのフラグメント、その類似体。 ２５．ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ２タンパク質からは別個に独立したヘモフィ リス属菌株のＴｂｐ１タンパク質で分離精製したもの。 ２６．ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ１タンパク質からは別個に独立したヘモフィ リス属菌株のＴｂｐ２タンパク質で分離精製したもの。 ２７．上記ヘモフィリス属菌株がインフルエンザ菌である請求項２５に記載のＴ ｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質。 ２８．上記ヘモフィリス属菌株がインフルエンザ菌ｂ型または類型分類不能イン フルエンザ菌である請求項２７に記載のＴｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タン パク質。 ２９．少なくとも６個以上１５０個以下のアミノ酸を有し、細菌株のトランスフ ェリン受容体のある部分のみ、または、トランスフェリン受容体の類似体のある 部分のみに対応するアミノ酸シーケンスを含む合成ペプチド。 ３０．細菌株がヘモフィリス属菌株である請求項２９に記載のペプチド。 ３１．ヘモフィリス属の菌株がヘモフィリス属インフルエンザ菌の菌株である請 求項３０に記載のペプチド。 ３２．ヘモフィリス属の菌株がヘモフィリス属インフルエンザ菌ｂ型株である請 求項３１に記載のペプチド。 ３３．ヘモフィリス属インフルエンザ菌ｂ型株がＤＬ６３株、ＭｉｎｎＡ株、Ｅ ａｇａｎ株で構成されるグループの中から選択され、上記トランスフェリン受容 体タンパク質が、図３，４，５（ＳＥＱ ＩＤ番号：５，６，７，８，９，１０ ）で示されたシーケンスの中から選択されたアミノ酸シーケンスを有する請求項 ３１に記載のペプチド。 ３４．ヘモフィリス属インフルエンザ菌が類型分類不能インフルエンザ菌である 請求項３１に記載のペプチド。 ３５．類型分類不能インフルエンザ菌がＰＡＫ１２０８５株、ＳＢ１２株、ＳＢ ２９株、ＳＢ３０株、ＳＢ３２株、ＳＢ３３株で構成されるグループの中から選 択され、上記トランスフェリン受容体タンパク質が、図６，７，８，９，１０， １１（ＳＥＱ ＩＤ番号：１０６，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５） で示されたシーケンスの中から選択されたアミノ酸シーケンスを有する請求項３ ４に記載のペプチド。 ３６．トランスフェリン受容体タンパク質を産生する細菌に保存されているアミ ノ酸シーケンスから成る請求項２９のペプチド。 ３７．ヘモフィリス菌に保存されているアミノ酸シー ケンスから成る請求項３６のペプチド。 ３８．ペプチドのアミノ酸シーケンスがＬＥＧＧＦＹＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ番号： ７４）またはＬＥＧＧＦＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：８５）である請求項３６に記 載の核酸分子。 ３９．表２，３で示したヘモフィリス属インフルエンザ菌ｂ型株Ｅａｇａｎ株の アミノ酸シーケンスおよびヘモフィリス属インフルエンザ菌の別の菌株のアミノ 酸シーケンスから選択したアミノ酸シーケンスを有する請求項２９のペプチド。 ４０．下記のグループから選択したものの少なくとも１つが有効成分である免疫 原性成分。 （Ａ）ヘモフィリス属菌株のトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラ グメント、またはその類似体をコードする精製・分離した核酸分子。 （Ｂ）下記のグループから選択したＤＮＡシーケンスを有する精製・分離した核 酸分子。 （ａ）図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１（ＳＥＱ ＩＤ番号：１，２ ，３，４，１０５，１０８，１１０，１１２，１１４）に示したＤＮＡシーケン スのうちのいずれかひとつ、または上記ＤＮＡシーケンスのうちのいずれかひと つの相補的ＤＮＡシーケンス。 （ｂ）図３，４，５，６，７，８，９，１０，１１ （ＳＥＱ ＩＤ番号：５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１０６，１０７ ，１０９，１１１，１１３，１１５）で示したアミノ酸シーケンスのいずれかひ とつをコードするＤＮＡシーケンス、または、上記の相補的ＤＮＡシーケンス。 （ｃ）上記（ａ）または（ｂ）で特定されたＤＮＡシーケンスのいずれかひとつ を厳格な条件下でハイブリダイゼーションして得られたＤＮＡシーケンス。 （Ｃ）組換えトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメント、その 類似体は、（Ａ）または（Ｂ）で示された核酸分子から成る発現ベクターを有す る形質転換された宿主により産生されるもので、トランスフェリン受容体タンパ ク質またはそのフラグメントまたはその類似体を宿主が発現できるための核酸。 （Ｄ）ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ２タンパク質からは別個に独立したヘモフィ リス属菌株のＴｂｐ１タンパク質で分離精製したもの。 （Ｅ）ヘモフィリス属菌株のＴｂｐ１タンパク質からは別個に独立したヘモフィ リス属菌株のＴｂｐ２タンパク質で分離精製したもの。 （Ｆ）少なくとも６個以上１５０個以下のアミノ酸を有し、細菌株のトランスフ ェリン受容体のある部分のみ、または、トランスフェリン受容体の類似体のある 部分のみに対応するアミノ酸シーケンスを含む合成ペ プチド。 （Ｇ）トランスフェリン受容体を宿主に運搬する生きたベクターで、（Ａ）また は（Ｂ）の核酸分子を含むベクターから構成されたもの、および、薬学的見地か ら受け入れ可能なキャリア、宿主に投与された時に免疫応答をする少なくともひ とつの有効成分。 ４１．トランスフェリン受容体を産生する細菌性病原菌が原因となる疾病に対す る防御としてin vivo投与するワクチンとして作製された請求項４０の免疫原性 成分。 ４２．剤型は、微粒子、カプセル、リポソームで使用できる製剤として作製され た請求項４０の免疫原性成分。 ４３．免疫機能が働く特定の細胞または粘膜表面に薬剤を運搬することができる ターゲット分子と併用して使用できる請求項４０の免疫原性成分。 ４４．トランスフェリン受容体を産生する複数の細菌性病原菌株が原因となる疾 病に対する防御ができる複数の有効成分から成る請求項４０の免疫原性成分。 ４５．アジュバントを併用できる請求項４０に記載の免疫原性成分。 ４６．トランスフェリン受容体を産生する細菌性病原菌が原因となる疾病に対し て防御を誘発する方法、および、そのような疾病にかかりやすい宿主に効果的な 量の請求項４０の免疫原性成分を投与する方法。 ４７．細菌性病原菌がヘモフィリス属細菌である請求項４６に記載の方法。 ４８．そのような病気にかかりやすい対象がヒトである請求項４６に記載の方法 。 ４９．上記免疫原性成分が請求項４４に記載された免疫原性成分である請求項４ ６に記載の方法。 ５０．請求項２４に記載の組換えタンパク質、請求項２５、２６の精製分離タン パク質、請求項２９に記載の合成ペプチド、請求項４０に記載の免疫原性成分に 対して特異的に反応する抗血清または抗体。 ５１．トランスフェリン受容体を宿主に運搬する生きたベクターで、請求項１ま たは請求項１２に記載された核酸分子を含むベクターから構成されたもの。 ５２．ベクターがサルモネラ菌、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、 ワクシニア、ポリオウイルスから選択される請求項５１に記載の生きたベクター 。 ５３．ベクターがポリオウイルスであり、その核酸が、アミノ酸シーケンスがＬ ＥＧＧＦＹＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ番号：７４）または、ＬＥＧＧＦＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：８５）であるトランスフェリン受容体のフラグメントをコードしてい る請求項５１に記載の生きたベクター。 ５４．ＡＴＣＣ保管番号が７５９３１であるｐＴ７Ｔ ＢＰ２Ａ、同定特質またはＡＴＣＣ保管番号が７５９３２であるｐＴ７ＴＢＰ２ Ｂ、ＡＴＣＣ保管番号が７５９３３であるｐＴ７ＴＢＰ２Ｃ、ＡＴＣＣ保管番号 が７５９３４であるｐＴ７ＴＢＰ２Ｄの同定特質を有するプラスミドベクター。 ５５．トランスフェリン受容体タンパク質を産生しないヘモフィリス属菌株。 ５６．上記菌株が不活性化したトランスフェリン受容体をコードする遺伝子から 成る請求項５５に記載の菌株。 ５７．遺伝子が挿入突然変異により失活している請求項５６に記載の菌株。 ５８．菌株が弱毒化したヘモフィリス属菌株である請求項５５に記載の菌株。 ５９．ベクターが請求項５８に記載の弱毒化した菌株である請求項５１に記載の 生きたベクター。 ６０．精製分離したヘモフィリス属菌株のＴｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タ ンパク質を生産する下記のステップで構成される方法。 （ａ）Ｔｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質（但し、両方ではない）を 、顆粒分画の形で、発現させる組換え宿主を供給すること。 （ｂ）細胞塊を供給するための上記宿主の増殖させること。 （ｃ）細胞溶解物を供給するための上記細胞塊をつぶすこと。 （ｄ）かなりの部分が可溶性の宿主タンパク質から成る最初の上澄み液と最初の ペレットを供給するために細胞溶解物を細分化すること。 （ｅ）上記最初のペレットから上記最初の上澄み液を分離すること。 （ｆ）可溶性宿主タンパク質と宿主膜タンパク質を除去するために、選択的に最 初のペレットを抽出し、第二の上澄み液を供給すること。抽出したペレットには 顆粒分画を含む。 （ｇ）上記抽出ペレットから上記第二の上澄み液を分離すること。 （ｈ）溶解した抽出物を供給するために抽出されたペレットを溶解すること。 （ｉ）フラクションを含むＴｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質を供給 するために、その溶解させた抽出物を細分化させること。 ６１．細胞溶解物が遠心分離により細分化される請求項６０に記載の方法． ６２．第一ペレットを選択的に抽出する方法には少なくとも１種類の界面活性剤 抽出法を含む請求項６１に記載の方法． ６３．溶解させた抽出物をゲル濾過により細分化して、 フラクションを含むＴｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク質を供給する請 求項６１に記載の方法． ６４．連続的にフラクションを含むＴｂｐ１タンパク質またはＴｂｐ２タンパク 質を濾過して、少なくとも上記の界面活性剤を除去して、Ｔｂｐ１タンパク質ま たはＴｂｐ２タンパク質の精製溶液を供給する請求項６３に記載の方法． ６５．上記のヘモフィリス属菌がヘモフィリス属インフルエンザ菌株である請求 項６０に記載の方法． ６６．上記宿主は上記発現ベクターにより遺伝子的に修飾したヘモフィリス属菌 株である請求項２２に記載の宿主．