CN1141060A - 嗜血杆菌属转铁蛋白受体基因 - Google Patents
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Abstract
提供了编码嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质或该转铁蛋白受体蛋白质的片段或类似物的纯化和分离的核酸。该核酸序列可用于生产不含来自一般含Tbp1或Tbp2蛋白质之细菌的污染物以达到诊断或医学治疗的目的。而且,该核酸分子可用于感染的诊断。还提供了重组的Tbp1或Tbp2及其纯化方法。提供了表达用于免疫接种的转铁蛋白受体蛋白质的活载体。
Description
发明的领域
本发明涉及编码转铁蛋白受体之基因的分子克隆,特别是涉及来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)转铁蛋白受体基因的克隆。
相关申请的参考文献
本申请是申请日为1993年12月29日的共同未决的美国专利申请系列号08/175116的部分连续申请,而它本身又是申请日为1993年11月8日的共同未决的美国专利申请08/148,968的部分连续申请。
本发明的背景
有荚膜的流感嗜血杆菌b型株是幼龄儿童中细胞性脑膜炎和其它侵入性感染的主要原因。然而,无荚膜的或不可分型的流感嗜血杆菌(NTHi)引起大范围的人类疾病,包括中耳炎、会厌炎、肺炎和气管支气管炎。以结合到白喉毒素(Berkowitz et al.,1987。在本申请的全文中,圆括号内提及的各种参考文献更充分地描述了与本发明相关的技术状态。各次引证的全部文献目录资料见说明书最后,紧接权利要求之前。这些参考文献的说明书引用到本说明书中以供参考),破伤风类毒素(Classon et al.,1989和US专利4,496,538)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白质(Black et al.,1991)上的流感嗜血杆菌b型荚膜多糖为基础的疫苗在减轻流感嗜血杆菌b型诱导的脑膜炎中有效,但对NTHi诱导的疾病无效(Bluestone,1982)。
中耳炎是幼年儿童最常见的疾病,60-78%的儿童在不到2岁的经历中有1到3次耳朵感染。慢性中耳炎引起儿童听力、谈话和认识损伤。流感嗜血杆菌感染在急性中耳炎病例中占大约30%,在慢性中耳炎中占大约60%。仅在美国,每年治疗中耳炎使用的抗生素和手术过程(如扁桃体切除术,腺体切除术和鼓室口腔管插入)花费1到2亿美元。而且,许多中耳炎的病原体变得对抗生素治疗产生抗性。因此需要一种对中耳炎有效的预防疫苗。流感嗜血杆菌的不定型菌株也是在老年人和对呼吸道感染特别敏感的其他个体中引起肺炎的重要病原体。因此,需要作为免疫原性制品中有用成份的来自流感嗜血杆菌的抗原,以便提供保护抵抗流感嗜血杆菌的许多血清型。
铁是许多细菌生长所必需的营养成份。一些人类病原体,如流感嗜血杆菌、Branhamella catarrhalis、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)和不致病的共生奈瑟氏菌属菌株可利用人转铁蛋白作为铁来源(Schryvers,1988;Schryvers and Lee,1989;Mickelsen and Sparling,1981)。细菌转铁蛋白的受体(TfR)由2条链(Tbp1和Tbp2)组成。在流感嗜血杆菌菌株中,Tbp1的分子量是大约100,000,而Tbp2的分子量是可变的,根据菌株不同从60,000到90,000之间变动(Schryvers and Gray-Owen,1992;Holland eral.,1992)。据认为流感嗜血杆菌转铁蛋白受体的表达受铁和/或高铁血红素的的调控(Morton et al.,1993)且已鉴定推断的fur结合位点(Braun andHantke,1991)在tbp2上游。在受铁(包括脑膜炎奈瑟氏菌TfR)负调控的基因启动子区发现了这一序列(Legrain et al.,1993)。该启动子后面是tbp2和tbp1基因,这种排列方式也存在于其它细菌TfR操纵子中(Legrain et al.,1993;Witon et al.,1993)。封闭转铁蛋白受体接近其铁来源的抗体可能阻止细菌生长。另外,抗TfR的调理或杀菌抗体也可经过另一种可选择的机制提供保护作用。因此,转铁蛋白受体,其片段,其组成链或其衍生肽是防止流感嗜血杆菌疾病的候选疫苗。用含佛氏佐剂的脑膜炎奈瑟氏菌TfR蛋白质免疫小鼠可抵抗同源攻击感染,在被动转移试验中抗TfR抗血清是有杀菌和保护性(Danve etal.,1993)。用重组A.pleuropneumoniae Tbp2免疫的猪可抵抗同源攻击感染但不能抵抗异源攻击感染(Rossi-Campos et al.,1992)。这些资料表明了以TfR为基础的疫苗在抵抗疾病中的效率。令人满意的是提供该DNA分子的序列,它编码转铁蛋白受体,及与转铁蛋白的部分相应的肽,以及含有用于诊断的该序列的载体,免疫接种和产生诊断和免疫学试剂。
脊髓灰质炎病毒是细小核糖核酸病毒科一个属的一种肠道病毒。该病毒有3个不同的血清型,每种血清型含多个病毒株。烈性菌株是麻痹性脊髓灰质炎的病原体。减少了引起麻痹症潜力的减毒病毒株和灭活的烈性病毒株用作疫苗。病毒感染引起长期保护性粘膜免疫。用灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗接种也引起粘膜免疫应答。
脊髓灰质炎病毒的结构已知,在病毒株和血清型中它高度保守。也已测定了一些其它细小核糖核酸病毒(属于细小核糖核酸病毒科一些属的病毒)的结构并表明与脊髓灰质炎病毒的结构密切相关。在脊髓灰质炎病毒的衣壳上可表达外源抗原决定基(Murdin er al.,1992)且这一工作推广到其它细小核糖核酸病毒。表达抗原决定基一般是短而明确的连续抗原决定基,它们大多数在其它细小核糖核酸病毒的脊髓灰质炎病毒抑制抗原性位点I(NAgI)或相当位点上表达。这一位点包括连接脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白VP1β链B和C的环(BC环)。VP1的BC环是9个氨基酸的表面暴露环,它可被取代且可用至少25个异源氨基酸延伸(Murdin et al.,1991)。产生高效价且具有免疫原性的表达转铁蛋白受体抗原决定基的杂交或嵌合的脊髓灰质炎病毒可用作为疫苗和作为产生免疫学试剂的工具。
本发明的概述
本发明涉及编码嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体的纯化的和分离的核酸分子或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物。本文提供的核酸分子可用于特异性检测嗜血杆菌属及用于诊断嗜血杆菌属感染。本文提供的纯化的和分离的核酸分子(如DNA)也用于以重组DNA方式表达TfR基因,用于以经济的方式提供纯化的和分离的转铁蛋白受体亚基,片段或其类似物。转铁蛋白受体,其亚基或片段或其类似物以及编码它们的核酸分子和含有该核酸分子的载体可用于抵抗由嗜血杆菌属引起的疾病之免疫原性组合物中,用于嗜血杆菌感染的诊断以及作为产生免疫学试剂的工具。根据本发明的方面产生的抗转铁蛋白受体蛋白质的单克隆抗体或单价特异性抗血清(抗体)对于嗜血杆菌属感染的诊断,嗜血杆菌属的特异性检测(例如体外和体内试验)以及嗜血杆菌属引起的疾病的治疗有用。
与转铁蛋白受体部分相应的肽或其类似物在抗嗜血杆菌属引起的疾病的免疫原性组合物,嗜血杆菌属感染的诊断和作为产生免疫学试剂的工具中有用。根据本发明的方面产生的抗这些肽的单克隆抗体或抗血清对于嗜血杆菌属感染的诊断,嗜血杆菌属的特异性检测(例如,体外和体内试验)以及用于作为对嗜血杆菌属引起的疾病之治疗的被动免疫有用。
根据本发明的一个方面,提供了编码嗜血杆菌属菌株,更具体地说,一种流感嗜血杆菌菌株,特别是流感嗜血杆菌b型菌株(如流感嗜血杆菌b型菌株DL63,Eagan或MinnA)或流感嗜血杆菌不可分型菌株(如流感嗜血杆菌菌株PAK 12085,SB33,SB12,SB29,SB30或SB32)转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质的片段或类似物的纯化和分离的核酸分子。
在本发明的一个优选的实施例中,核酸分子可仅编码嗜血杆菌菌株Tbp1蛋白质或仅编码嗜血杆菌菌株Tbp2蛋白质。在本发明另一优选的实施例中,该核酸可编码具有在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌中保守的保守氨基酸序列的嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质的片段。这种保守的氨基酸序列可具有包含在下面表2和3中所示的流感嗜血杆菌b型菌株Eagan的肽以及流感嗜血杆菌其它菌株的相应肽中的氨基酸序列内的氨基酸序列。
在本发明的另一方面,提供了具有一种纯化和分离的核酸分子,该分子的DNA序列选自(a):图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ IDNOS1、2、3、4、105、108、110、112、114)所列的任一DNA序列或任一所说序列的互补DNA序列;(b):编码图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ ID NOS 5、6、7、8、9、10、11、12、106、107、109、111、113、115)所列的一个氨基酸序列的DNA序列或其互补DNA序列;(c)在严格条件下与(a)或(b)中限定的任一DNA序列杂交的DNA序列。(c)中限定的DNA序列优选与(a)和(b)中限定的DNA序列的任何一个具有至少大约90%的序列同一性。
另一方面,本发明包括适于转化宿主,包含本文提供的核酸分子的载体。该载体可以是具有ATCC保藏号75603的质粒DS-712-1-3或具有ATCC保藏号75607的质粒JB-1042-7-6之特征的一个载体。
质粒可适于在异源或同源宿主中以脂化或非脂化的形式表达所编码的的转铁蛋白受体,其片段或类似物。因此,本发明的另一方面提供了一种适于转化宿主的表达载体,它含有本文提供的核酸分子的表达载体以及与该核酸分子有效连接用于经宿主表达转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物的表达装置。在本发明该方面的具体实施例中,核酸分子可编码嗜血杆菌属菌株基本上完整的转铁蛋白受体蛋白质,仅编码其Tbp1蛋白质或仅编码Tbp2蛋白质。表达装置可包括编码用于从宿主分泌转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物之引导序列的核苷酸部分。该表达装置还可包括编码用于从宿主表达转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物的脂化形式之脂化信号的核酸部分。表达质粒可以具有质粒JB-1468-29,JB-1600-1或JB-1424-2-8所鉴定的特征。宿主可选自(例如)大肠杆菌(E.coli),芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜血杆菌属、真菌、酵母或杆状病毒,且可使用Semliki Forest病毒表达系统。
在本发明的另一方面,提供了一种含有本文提供的表达载体的转化的宿主。该宿主可选自JB-1476-2-1,JB-1437-4-1和JB-1607-1-1。本发明进一步包括可用转化的宿主生产的重组转铁蛋白受体蛋白质或其片段或类似物。
在下面更详细的描述中,产生了互相分离的Tbp1和Tbp2蛋白质受体。因此本发明的另一方面提供了一种不含嗜血杆菌属菌株Tbp2蛋白质的分离和纯化的嗜血杆菌属菌株Tbp1蛋白质和一种不含嗜血杆菌属菌株Tbp1蛋白质的分离和纯化的嗜血杆菌属菌株Tbp2蛋白质。嗜血杆菌属菌株可以是流感嗜血杆菌b型或流感嗜血杆菌不可分型菌株。
本发明进一步提供了与部分转铁蛋白受体相对应的合成肽。因此,在本发明的另一方面,提供了一种具有不少于6个氨基酸且不多于150个氨基酸,并含有仅与细菌菌株转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质类似物部分相应的氨基酸序列的合成肽。细菌菌株优选是嗜血杆菌属菌株,特别是流感嗜血杆菌菌株,具体地说是流感嗜血杆菌b型菌株或流感嗜血杆菌不可分型菌株。
本文提供的肽可以包含在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌,包括嗜血杆菌属菌株中保守的氨基酸序列。该肽可包括氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)或LEGGFYG(SEQ ID NO:85)。本文提供的肽可具有选自在下文表2或3中提供的流感嗜血杆菌b型Eagan菌株的氨基酸序列和流感嗜血杆菌其它菌株中相应的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面,提供了一种免疫原性组合物,它包含至少一种选自至少一种本文提供的核酸分子,至少一种本文提供的重组蛋白质,至少一种如本文提供的纯化和分离的Tbp1或Tbp2蛋白质,至少一种如本文提供的合成肽和至少一种如本文提供的活载体的活性成份以及其药用上可接受的载体(carriex)或其载体(vector)。当给宿主用药时,至少一种活性成份产生免疫反应。
本文提供的免疫原性组合物可配成疫苗,用于体内用药以防止产生转铁蛋白受体的细菌病原体引起的疾病。为达到这一目的,组合物可配成微粒、胶囊或脂质体制品。作为另一可选择方法,提供的组合物可与靶分子结合用于传递给免疫系统的特异性细胞或传递到粘膜表面。免疫原性组合物可包括许多活性成份以抵抗由许多种类的产转铁蛋白受体细菌产生的疾病。免疫原性组合物可进一步包含一种佐剂。
根据本发明的另一方面提供了用于诱导抵抗由嗜血杆菌属或产生转铁蛋白受体蛋白质的其它细菌引起的感染和疾病的方法,包括给敏感宿主(如人类)施用有效量的上面提到的免疫原性组合物的步骤。
根据本发明的另一方面,提供了一种对重组蛋白质,分离和纯化的Tbp1蛋白质或Tbp2蛋白质,合成肽或免疫原性组合物具特异性的抗血清或抗体。
另一方面,提供一种将转铁蛋白受体传递给宿主的活载体,包含一种含有上述核酸分子的载体。该载体可选自沙门氏菌属(Salmonella)、BCG、腺病毒、痘病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒。特别是该载体可以是脊髓灰质炎病毒,该核酸分子可编码具有LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)或LEGGFYG(SEQ ID NO:85)的氨基酸序列的转铁蛋白受体片段。本发明进一步包括具有pT7TBP2A,pT7TBP2B,pT7TBP2C或pT7TBP2D(ATCC保藏号75931,75932,75933,75934的鉴定特征的质粒载体。
本发明的另一方面提供了一种不产生转铁蛋白受体蛋白质的嗜血杆菌菌株。该菌株可包含编码失去功能(如经过插入诱变)的转铁蛋白受体的基因。该嗜血杆菌属菌株可以是已减毒的菌株,这种减毒菌株可包含用于传递转铁蛋白受体的载体。
如上所述,本发明的一个方面提供了嗜血杆菌属菌株,优选流感嗜血杆菌菌株的新Tbp1或Tbp2蛋白质,它们是分离和纯化的形式且彼此分离。本发明的另一方面提供了一种用于产生该蛋白质的方法。因此,在该另一方面中,本发明提供了生产嗜血杆菌属菌株的分离和纯化的Tbp1或Tbp2蛋白质的方法,包含的步骤有:(a)提供一种重组宿主,在包含体中表达Tbp1或Tbp2蛋白质,但不同时表达两者;(b)使宿主生长以提供细胞团;(c)破碎细胞团以提供细胞溶胞产物;(d)分级分离细胞溶胞产物以提供第一上清和第一沉淀,第一上清基本上包含可溶性宿主蛋白质的大部分;(e)从第一沉淀中分离第一上清;(f)选择性地提取第一沉淀以基本上从中去掉全部可溶性宿主蛋白质和宿主膜蛋白质,从而提供第二上清和含包含体的提取沉淀;(g)从提供沉淀中分离第二上清;(h)增溶提取沉淀以提供增溶的提取物;(i)分级分离增溶的提取物以提供含Tbp1或Tbp2蛋白质的组分。
可对细胞溶胞产物分级分离以提供第一上清,第一沉淀可用至少一种去污剂提取来处理。
以凝胶过滤分级分离溶解的提取物以提供含Tbp1或Tbp2蛋白质的组分,随后可对它进行透析以去掉至少该去污剂以提供Tbp1或Tbp2蛋白质的进一步纯化的溶液。
附图的简要描述
参考附图以下面的描述可进一步理解本发明,其中:
图1A显示了流感嗜血杆菌b型菌株DL63转铁蛋白受体操纵子的2个质粒克隆(pBHT1和pBHT2)的限制性图谱。
图1B显示了含有来自流感嗜血杆菌b型菌株Eagan的TfR基因的克隆S-4368-3-3和JB-901-5-3的限制性图谱。
图1C显示了含有来自流感嗜血杆菌b型菌株MinnA的转铁蛋白受体基因的克隆DS-712-1-3的限制性图谱。
图1D显示了含有来自不可分型的流感嗜血杆菌菌株PAK 12085的转铁蛋白受体基因的克隆JB-1042-7-6的限制性图谱。
图2说明了鉴定的菌株克隆Tbp1和Tbp2基因的构建和限制性图谱以及在单个启动子的转录调控下由2个基因(tbp1和tbp2)串联形成操纵子的TfR操纵子之遗传构建,还描绘了用于探测嗜血杆菌属菌株TfR基因文库的pBHT2 3.0kb的DNA片段。
图3显示了来自流感嗜血杆菌b型DL63菌株的转铁蛋白受体基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:5-Tbp1和SEQ ID NO:6-Tbp2)。下面划线的氨基酸序列相应于以氨基酸测序鉴定的Tbp1肽。推断的信号序列以上面划双线表示并相应于Tbp1的残基1到17和Tbp2的1至25。
图4显示了来自流感嗜血杆菌b型菌株Eagan的转铁蛋白受体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:7-Tbp1和SEQ IDNO:8-Tbp2)。推断的-35,-10和核糖体结合位置序列上面划线。
图5显示了来自流感嗜血杆菌b型菌株MinnA的转铁蛋白受体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:9-Tbp1和SEQ IDNO:10-Tbp2)。上面划线处是推断的-35,-10和核糖体结合位点序列。
图6显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株PAK 12085的转铁蛋白受体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:11-Tbp1和SEQ ID NO:12-Tbp2)。上面划线处是推断的-35,-10和核糖体结合位点序列。
图7显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB33的转铁蛋白受体基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:105)和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:107-Tbp2)。
图8显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB12的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:108)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:109-Tbp2)。
图9显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB29的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:110)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:111-Tbp2)。
图10显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB30的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:112)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:113-Tbp2)。
图11显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB32的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:114)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:115-Tbp2)。
图12A显示了来自流感嗜血杆菌菌株Eagan(SEQ ID NO:116)、MinnA(SEQ ID NO:117)、PAK 12085(SEQ ID NO:118)和SB33(SEQ ID NO:119)tbp2基因的启动子区和5′端的核苷酸序列。下面划线处为用于经PCR扩增tbp2基因的编码链引物(SEQ ID NO:120)。
图12B显示了来自流感嗜血杆菌菌株Eagan(SEQ ID NO:121)、MinnA(SEQ ID NO:122)、DL63(SEQ ID NO:123)PAK 12085(SEQ ID NO:124)、SB12(SEQ ID NO:125)、SB29(SEQ ID NO:126)、SB30(SEQ ID NO:127)、SB32(SEQ ID NO:128)tbp1基因间隔区和5′端的核苷酸序列。下面划线处为用于经PCR扩增tbp2基因的非编码链引物(SEQ ID NO:129)。
图13显示了来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB12、SB29、SB30、SB32和SB33的PCR扩增的tbp2基因的琼脂糖凝胶分析。泳道1是SB33、泳道2是SB12、泳道3是SB29、泳道4是SB30、泳道5是SB32。
图14显示了来自流感嗜血杆菌菌株Eagan、DL63、PAK 12085和SB33(SEQID NOs:7、5、11和106),脑膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(SEQ IDNOS:94和95)和淋病奈瑟氏菌菌株FA19(SEQ ID NOs:96)的Tbp1氨基酸序列的比较。
图15显示了来自流感嗜血杆菌菌株Eagan、DL63、PAK 12085、SB12、SB29、SB30和SB32((SEQ ID NOS:8、6、12、109、110、112、114),脑膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(SEQ ID NOS:97和98)。淋病奈瑟氏菌菌株FA19和Actinobacillus Pleuropneumoniae菌株AP205和AP37(SEQ ID NOS:99和100)Tbp2氨基酸序列的比较。
图16A显示了流感嗜血杆菌Tbp1蛋白质预测的二级结构,图16B显示了流感嗜血杆菌Tbp2蛋白质预测的二级结构。
图17显示了从E.coli中表达流感嗜血杆菌b型Eagan Tbp1的质粒JB-1468-29的构建方式。
图18显示了从E.coli中表达流感嗜血杆菌b型Eagan Tbp2的质粒JB-1424-2-8的构建方式。
图19显示了用于构建质粒JB1428-2-8的寡核苷酸对(SEQ ID NOS:130和131)。
图20显示了用于构建Tbp1和Tbp2表达质粒的寡核苷酸对A(SEQ ID NOS:86和87)、B(SEQ ID NOs:88和89)、C(SEQ ID NOS:90和91)和D(SEQ ID NOs:92,93)的序列。
图21显示了在大肠杆菌中表达流感嗜血杆菌菌株SB12、Tbp2的质粒JB-1600-1的构建方式。
图22显示了从大肠杆菌中表达嗜血杆菌属b型Eagan Tbp1蛋白质,EaganTbp2蛋白质和不可分型流感嗜血杆菌SB12 Tbp2蛋白质得到的产物的SDS-PAG凝胶。泳道1,JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1)在t0;泳道2,JB-1476-2-1在t=4h的诱导;泳道3,200kDa,116kDa,97.4kDa,66kDa,45kDa和31kDa的分子标准品;泳道4,JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2)在t0;泳道5,JB-1437-4-1在t=4h诱导;泳道6,JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2)在t0;泳道7,JB-1607-1-1在t=4h诱导。
图23显示了从大肠杆菌中表达出的重组Tbp1和Tbp2的纯化方式。
图24显示了以图23的方法纯化的重组Tbp1和Tbp2的纯度的分析。泳道1含分子量大小标准品(106、80、49.5、32.5、27.5、18.5kDa),泳道2是大肠杆菌总细胞溶胞产物。泳道3是溶解的包含体。泳道4是纯化的Tbp1或Tbp2。
图25显示了小鼠rTbp1(上排)和rTbp2(下排)的免疫原性。图26显示了在Western印迹试验中抗Eagan rTbp1抗血清与各种流感嗜血杆菌菌株的反应性,泳道1,BL21/DE3;泳道2,SB12-EDDA;泳道3,SB12+EDDA;泳道4,SB29-EDDA;泳道5,SB29+EDDA;泳道6,SB33-EDDA;泳道7,SB33+EDDA泳道8,Eagan-EDDA;泳道9,Eagan+EDDA;泳道10,B.catarrhalis 4223-EDDA;泳道11,B.catarrhalis 4223+EDDA;泳道12,脑膜炎奈瑟氏菌608-EDDA;泳道13,脑膜炎奈瑟氏菌608+EDDA;泳道14,表达重组Eagan Tbp1的经诱导的JB-1476-2-1;泳道15,分子量标记物。在与流感嗜血杆菌菌株SB12、SB29、SB33和Eagan相对应的泳道3、4、5、7、8和9中,特异性的~95kDa带与抗Tbp1抗血清发生反应;在泳道10和11中~110kDa的带与B.catarrhalis菌株4223相对应;在泳道12和13中~80kD的带与脑膜炎奈瑟氏菌608相对应。
图27显示了在Western印迹试验中抗Eagan rTbp2抗血清与各种流感嗜血杆菌菌株的反应性。泳道1,分子量标准品;泳道2,诱导的JB-1437-4-1表达的重组Eagan Tbp2;泳道3,SB12-EDDA;泳道4,SB29+EDDA;泳道5,SB29-EDDA;泳道6,SB29+EDDA;泳道7,SB30-EDDA;泳道8,SB30+EDDA;泳道9,SB32-EDDA;泳道10,SB33-EDDA;泳道11,SB33+EDDA;泳道12,PAK-EDDA;泳道13,PAK+EDDA;泳道14,Eagan-EDDA;泳道15,Eagan+EDDA;在泳道3、6、7、8、13、14和15(即菌株SB12、SB29、SB30、PAK和Eagan)中60-70kDa的特异性带与抗Tbp2抗血清反应。
图28显示了用于生产不产生转铁蛋白受体的流感嗜血杆菌的质粒pUHIT1KFH和pUHIT1KFP的构建。
图29显示了编码表达来自转铁蛋白受体蛋白质的,在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌中保守之抗原决定基的嵌合的脊髓灰质炎病毒的质粒的构建。
图30是Western印迹,显示了用表达来自转铁蛋白受体的蛋白质的,在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌中保守之抗原决定基的脊髓灰质炎病毒嵌合体免疫接种兔产生的抗血清的反应性。A组显示了考马斯亮蓝染色的凝胶,显示在E.coli中表达的来自流感嗜血杆菌SB12的纯化的重组Tbp2(泳道1),来自Branhamellacatarrhalis菌株4223纯化的Tbp2(泳道2),限铁条件下生长的B.catarrhalis4223的总细胞溶胞产物(泳道3),在非限铁条件下生长的E.coli JM109总细胞溶胞产物(泳道5)。B组显示了使用在第27天从用PV1 TBP2A免疫的兔(兔40、41、42)中收集的血清合并液的复制凝胶Wetern的印迹结果。C组显示了从相同兔预先抽血的合并血清的结果,它显示了轻微的特异性免疫反应性。
在上面的一些附图中,下列缩写用于命名限制性核酸内切酶特异性的特定位点:R,Eco RI;Ps,Pst I;H,HindIII;Bg,Bgl;Nde,Nde I;Ear,Ear I;和Sau,Sau 3AI。
在图28中,下列缩写用于命名限制性核酸内切酶特异性的具体位点:A,Acc I;B,Bam HI;E,Eco RI;O,Xho I;H,Hind III;Ps,Pst I;V,Eco RV;X,Xba I;G,Bgl II;S,Sal I;K,Kpn I;和S*,Sac I。
发明总述
任何嗜血杆菌属菌株都可方便地用于提供纯化和分离的核酸,该核酸可以是DNA分子形式,包含至少一部分编码本发明实施例中所鉴定的转铁蛋白受体的核酸。这类菌株一般可从临床来源和细菌培养物保藏中心(如美国典型培养物保藏中心)获得。
根据本发明的一个方面,转铁蛋白受体蛋白质可从嗜血杆菌属菌株以Schryvers(1989),Ogunnaviwo schryvers(1992)和美国专利5 141 743(本文引用其主题内容以供参考)所述的方法分离。尽管在专利US 5 141 743中对合适的方法提供了详细的描述,但下面仍对该方法作简要的概述。转铁蛋白受体的分离经过从表达转铁蛋白结合活性的细菌菌株中分离膜部分并以包含将转铁蛋白预先结合到膜部分上的转铁蛋白受体上,溶解膜,固相化转铁蛋白并从固相转铁蛋白上分离转铁蛋白受体的一系列步骤的亲和法纯化转铁蛋白受体来实现。另一可选择方法,受体蛋白可经过对上述方法的修改来分离,其中不用预先结合步骤而在溶解缓冲液中含高浓度的盐以便能用固相转铁蛋白直接分离,如Ogunnariwo和Schryvers(1992)所述。
在本申请中,术语“转铁蛋白受体”用于定义Tbp1和/或Tbp2蛋白质族,它包括那些包括在各种菌株(例如嗜血杆菌属)中天然存在的氨基酸序列的氨基酸序列发生变异的蛋白质。转铁蛋白受体的其它细菌来源包括但不局限于奈瑟氏菌属,Branhamella,Pasteurella和Actinobacillus的种类。这些细菌中有些(如果并非全部)含有Tbp1和Tbp2两种蛋白质。包含编码本发明的转铁蛋白受体至少一部分的纯化和分离的DNA分子也包括那些编码转铁蛋白受体功能类似物的DNA分子。在本申请中,如果第一个蛋白质与第二个蛋白质或肽具有免疫学相关性和/或具有相同功能,那么在第一个蛋白质或肽是第二个蛋白质的功能类似物。例如,功能类似物可以是该蛋白质的片段或其取代,增加或缺失突变体。
在一个具体实施例中,转铁蛋白受体从流感嗜血杆菌b型菌株DL63中分离并以Schryver(1989),Ogunnariwo Schrtvers(1992)和美国专利5141743所述的亲和层析方法纯化。分离和纯化的转铁蛋白受体用于在兔中产生抗TfR抗血清。机械剪切流感嗜血杆菌b型菌株DL63染色体DNA,加入EcoRI连接头,构建λZAP表达文库。用抗TfR兔抗血清筛查文库并获得具有重叠限制性图谱的2个阳性克隆(pBHIT1和pBHIT2)(图1A和图2)。对克隆进行测序并鉴定了两个大型开架阅读框(图2)。流感嗜血杆菌DL63的转铁蛋白受体基因Tbp1和Tbp2(SEQID NO:1)的核苷酸序列和其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:5-Tbp1和SEQID NO:6-Tbp2)如图3所示。序列分析表明组成2个基因(Tbp1和Tbp2)TfR操纵子串联排列并以单个启动子转录(具体在图2和图3中显示)。Tbp2蛋白质分子量的变化取决于种类而Tbp1蛋白质具有更恒定的分子量,虽然在具有TfR基因的各种细菌中有一些可变性。Tbp1的分子量范围一般从94到106,000,而Tbp2的分子量变化相当大,从58到98,000。
对流感嗜血杆菌DL63的转铁蛋白受体进行了N末端和溴化氰片段氨基酸测序。Tbp2的N端被封闭,但经过Tbp1测序鉴定了其氨基酸序列并在图3的蛋白质序列中以下面划线表示。这些肽序列是Glu Thr Gln Ser Ile Lys Asp ThrLys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr(如图3所示,SEQ IDNO:101)和Leu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gln Gln AsnTrp Leu Thr His Gln Ile Ala Phe(如图3所示,SEQ ID NO:102)。
在图3中以上面划双线表示Tbp1的信号序列和Tbp2推定的信号序列。Tbp1推定的信号序列是Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser IleIle Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala(SEQ ID NO:103)。 Tbp2推断的信号序列是Met Lys Ser Val Pro Leu Ile SerGly Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala(SEQ ID NO:104)。Tbp2N端区所得的氨基酸序列表明它是脂蛋白质。
制备流感嗜血杆菌b型菌株Eagan染色体DNA并产生文库。以用Sau 3AI部分消化的DNA构建第一文库,分离大小为~5-10kb的片段并克隆进以pUC为基础的质粒中。从克隆到λZAP的EcoRI限制性染色体DNA片段构建第二文库。用图2所示的pBHIT克隆的5′片段探测的两个文库,得到称为S-4368-3-3和JB-901-5-3的流感嗜血杆菌Eagan TfR基因的部分克隆。因此,根据本发明的另一方面,在图1B和2中显示了编码流感嗜血杆菌b型菌株Eagan Tbp1和Tbp2的质粒克隆S-4368-3-3和JB-901-5-3。流感嗜血杆菌b型菌株Eagan Tbp1和Tbp2基因的DNA序列(SEQ ID NO:2)和其推定的氨基酸序列(SEQ ID NOs:7和8)如图4所示,Tbp2序列是操纵子的第一个基因。在图4中,上面划线处为推定的-35,-10和核糖体结合位点序列。
制备流感嗜血杆菌b型菌株MinnA染色体DNA,用Sau 3AI部分消化DNA,分离10-20kb大小的片段并克隆进EMBL3的BamHI位点。用pBHIT克隆的5′片段(图2)探测文库并获得了编码TfR全长的克隆(DS-712-1-3)。根据本发明的另一方面,在图1 和2中显示了编码流感嗜血杆菌b型菌株MinnATbp1和Tbp2的质粒克隆DS-712-1-3。来自流感嗜血杆菌b菌株MinnA Tbp1和Tbp2的DNA序列(SEQ ID NO:3)和其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:9-Tbp1和SEQ ID NO:10-Tbp2)如图5所示,其中在操纵子中,Tbp2序列是第一个基因。在图5中,上面划线处为推定的-35,-10和核糖体结合位点序列。
从不可分型流感嗜血杆菌菌株PAK 12085制备染色体DNA,用Sau 3AI部分消化DNA,分离10-20kb大小的片段,并克隆进EMBL3的BamHI位点。用pBHIT克隆片段(图2)探测文库并获得了编码TfR的全长克隆(JB-1042-7-6)。克隆JB-1042-7-6的限制性图谱如图1D和2所示,来自流感嗜血杆菌PAK12085 Tbp1和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)和其推定的氨基酸序列如图6所示(SEQ ID NOs:11,12),Tbp2序列在前。在图6中,上面划线处为推定的-35,-10和核糖体结合位点序列。
从来自中耳炎的不可分型流感嗜血杆菌菌株SB33制备染色体DNA。用Sau 3AI部分消化DNA,分离10-20kb大小的片段,并克隆进EMBL3的BamHI位点。用pBHIT克隆片段(图2)探测文库,获得了编码TfR全长的克隆(JB-1031-2-9)。克隆JB-1031-2-9的限制性图谱如图2所示,来自流感嗜血杆菌SB33的Tbp1和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)和其推定的氨基酸序列如图7所示(SEQ ID NOs:11,12),Tbp2序列在前面。发现SB33 tbp2基因有单个碱基缺失,导致在残基126处读框移位且导致产生的蛋白质在成熟前在残基168位截短。
对来自中耳炎NTHi菌株SB12、SB29、SB30和SB32的tbp2基因进行了PCR扩增和基因测序。
来自不可分型流感嗜血杆菌菌株SB12(SEQ ID NO:105),SB29(SEQID NO:108),SB30(SEQ ID NO:110)和SB32(SEQ ID NO:112)的tbp2基因的核苷酸序列分别如图8、9、10和11所示。
发现所有扩增的tbp2基因编码全长的Tbp2蛋白质,表明菌株SB33的缺陷型tbp2基因不是典型的。
所有3个流感嗜血杆菌b菌株在tbp2和tbp1之间具有相同的长仅13bp的短间隔序列。但NTHi菌株PAK 12085和SB33具有27bp的较长间隔序列(图12)。
菌株SB12具有13bp的间隔序列,与在流感嗜血杆菌b菌株中所发现的相同,而菌株SB32、SB30和SB32含有较长的间隔序列,正如在其它NTHi菌株PAK 12085和SB33中所发现的(27-30bp)(图2B)。所有9个菌株在其tbp2和tbp1基因之间具有13bp序列保守的共同核心。
鉴定了靠近流感嗜血杆菌Tbp1氨基末端的五肽序列(图12),它与TonB盒相似。最近已克隆和测序了流感嗜血杆菌tonB基因(Jarosik et al.,1994)。
在图14中比较了流感嗜血杆菌菌株Eagan/MinnA、DL63、PAK 12085和SB33菌株Tbp1的氨基酸序列。Eagan和MinnA的Tbp1蛋白质相同,有912个氨基酸,DL63有914个残基,PAK 12085有914个残基,SB33有911个残基。流感嗜血杆菌Tbp1蛋白质具有高度保守性,有95-100%的序列相同。流感嗜血杆菌菌株Eagan/MinnA、DL63、PAK 12085、SB12、SB29、SB30和SB32的Tbp2氨基酸序列在图15中作了比较。Eagan和MinnA的Tbp2蛋白质相同且含有660个氨基酸,DL63的Tbp2含644个残基,PAK 12085的Tbp2含654个残基。在SB33 tbp2基因中有单个碱基的缺失,导致在残基126处读框移位,所产生的蛋白质在残基168处成熟前截短。经过直接对PCR扩增的染色体DNA测序证实了该碱基的丢失。除了Eagan和MinnA相同外,Tbp2蛋白质序列较少保守,只有66-70%同一性,但有一些保守的短片段序列,可以图15中作出鉴定。发现所有来自菌株SB12、SB29、SB30和SB32的PCR扩增的tbp2基因编码全长的tbp2蛋白质。在推导的Tbp2蛋白质中存在序列和大小不均一性,其中SB12有648个氨基酸,SB32有631个残基,SB30有630个残基,SB32有631个残基。
测定了推导的Eagan Tbp1和Tbp2二级结构(图16A和16B)。两种蛋白质都有几个跨膜区,Tbp1跨膜20次,Tbp2跨膜12次。在Tbp1氨基末端区域鉴定了3个暴露的保守抗原决定基(DNEVTGLGK-(SEQ ID NO:43,EQVLN/DIRDLTRYD-SEQ ID NO:139和140,GAINEIEYENVKAVEISK-SEQ ID NO:141),在C端区鉴定了1个(GI/VYNLF/LNYRYVTWE-SEQ ID NO:142和143)。在人病原体的Tbp2蛋白质内只能鉴定3个较小的保守区域:CS/LGGG(G)SFD-SEQ ID NOS:75,144和145(在N端),LE/SGGFY/FGP-SEQ IDNOS:74和146(位于内部),VVFGAR/K-SEQ ID NOS:83和84(位于C末端)。
嗜血杆菌属菌株之间的Tbp2氨基酸序列有变化这一发现使得可将嗜血杆菌属分成以相同Tbp2氨基酸序列定义的亚组。这一发现允许合理地选择最少数的Tbp1和/或Tbp2序列或合成肽以用于免疫组合物,他们递呈嗜血杆菌属菌株中该亚型共有的抗原决定基例如该免疫组合物可用于免疫由嗜血杆菌属和其它产生与嗜血杆菌属种Tbp1和Tbp2具有序列相似性的转铁蛋白受体的细菌引起的疾病。因此,最少数目的转铁蛋白受体,类似物、片段和/或肽可用于免疫许多和全部嗜血杆菌属菌株和其它产生转铁蛋白受体的细菌性病原体。
另外,比较了来自不同细菌病原体(流感嗜血杆菌b型、不可分型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌和Actinobacillus(Haemophilus)Pleuropneumoniae)的转铁蛋白受体的氨基酸序列,如图14和15所示。这一分析揭示了在所有这些细菌中保守的Tbp1和Tbp2区域。一些这类保守的序列包含在表2和3的肽中。具体地说,序列DNEVTGLGK(SEQ ID NO:43),EQVLNIRDLTRYDPGI(SEQ ID NO:44),EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD(SEQ ID NO:45),GAINEIEYENVKAVEISKG(SEQ ID NO:46),GALAGSV(SEQ ID NO:47)在Tbp1中保守(表1和图14)。在Tbp2中特别保守的序列包括LEGGFYGP(SEQ ID NO:74),CSGGGSFD(SEQ ID NO:75),YVYSGL(SEQ ID NO:76),CCSNLSYVKFG(SEQ ID NO:77),FLLGHRT(SEQ ID NO:78),EFNVOF(SEQ ID NO:79),NAFTGTA(SEQ ID NO:80),VNGAFYG(SEQ ID NO:81),ELGGYF(SEQ ID NO:82),VVFGAR(SEQ ID NO:83),和VVFGAK(SEQ ID NO:84)(表3和图15)。
在不同细菌病原体中转铁蛋白受体内保守序列的发现允许选择具有特定氨基酸序列的最小数目的抗原(包括以合成肽的形式)来免疫由具有转铁蛋白受体的病原体引起的疾病。这类细菌除了上面所列举的外,还包括奈瑟氏菌属的其它种类,如淋病奈瑟氏菌以及Branhamella包括Branhamella catarrhalis。在许多细菌性病原体中该保守的氨基酸序列允许产生TfR特异性抗体,包括单克隆抗体,来识别大多数(如果不是全部的话)转铁蛋白受体。生产抗与转铁蛋白受体保守部分相对应的肽的抗血清。该抗血清识别Branhamella catarrhalis中的转铁蛋白受体。这种抗血清对于检测和中和大部分(如果并非全部)产生TfR蛋白质的细菌有用。也用于对由该病原体引起的疾病进行被动免疫。使用该保守的氨基酸序列的诊断检验和试剂盒对于检测许多(如果并非全部)产生转铁蛋白受体的细菌有用。
含前述氨基酸序列的抗原决定基可经过使用含该序列的合成肽,或经过使用表达该序列的活载体或经过直接施用编码该氨基酸序列的核酸分子传递到免疫系统的细胞中。
流感嗜血杆菌b型菌株Eagan、MinnA,DL63和不可分型菌株PAK12085的Tbp1蛋白质内含保守氨基酸序列的一些肽如表2所示。抗一些这类肽的抗体在豚鼠中产生(表4)。含流感嗜血杆菌b型菌株Eagan,MinnA,DL63和不可分型菌株PAK12085的Tbp2蛋白质内保守氨基酸序列的肽如表3所示。抗一些这类肽的抗体在豚鼠中产生(表4)。
将Tbp1和Tbp2基因的编码序列克隆进合适的表达载体中生产重组蛋白质。使用T7表达系统从E.coli中表达重组Tbp1和Tbp2。将编码成熟Eagan Tbp1蛋白质的tbp1基因克隆到阅读框中T7启动子后面产生质粒JB-1468-29,如图17所示。当导入BL21/DE3细胞并用IPTG或乳糖诱导时,表达Eagan Tbp1蛋白质,如图22所示。
将编码成熟Tbp2蛋白质的tbp2基因克隆到框架中T7启动子后面产生质粒JB-1424-2-8,如图18所示。当导入到大肠杆菌细胞中并按如上所述诱导时,表达出显示于图22中的Tbp2蛋白质。
以PCR扩增来自菌株NTHi SB12的tbp2基因。所得的扩增DNA在成熟蛋白质前含有已证实的流感嗜血杆菌Tbp2信号序列。编码信号序列和成熟蛋白质的SB12tbp2基因克隆进pT7-7表达系统,如图21所示。当所得的质粒(JB-1600-1)导入E.coli BL21/DE3细胞并进行诱导时,表达SB12 Tbp2,如图22所示。
在E.coli中以包含体形体产生的重组蛋白质Tbp1和Tbp2以图23所示的程序纯化。纯化的蛋白质至少为大约70%纯,如图24所示。用纯化的重组Tbp1和Tbp2蛋白质在小鼠中进行免疫原性研究。两种蛋白质以3-10μg剂量在小鼠中引起较好的免疫应答(图25)。
产生的抗一种流感嗜血杆菌菌株的重组Tbp1或Tbp2的抗血清与其它菌株发生交叉反应,使其成为有使用潜力的诊断试剂(图26和27)。
图28所示的质粒pUHIT1KFH和pUHITKFP含有克隆进转铁蛋白受体操纵子内的可选择的抗生素抗性标记并构建成由于插入而失活的转铁蛋白受体操纵子。这些质粒用于转化嗜血杆菌属以产生实施例19所述的不产生转铁蛋白受体Tbp1和/或Tbp2的菌株。这种菌株在体外和体内检测和诊断实践中用作阴性对照(因为它们不产生TfR。这种菌株也期望是可用于体内生长而减毒的并用作活疫苗以抵抗嗜血杆菌属引起的疾病。
如上所述,转铁蛋白受体蛋白质抗原决定基可经过使用表达该氨基酸序列的活载体传递给免疫系统的细胞,该活载体可以是脊髓灰质炎病毒。在图29中解释了表达转铁蛋白受体蛋白质抗原决定基,包括Tbp2 LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)的保守的抗原决定基的杂交脊髓灰质炎病毒的构建。该病毒被产生的抗插入氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)(表5)的肽的抗体识别表明该病毒以抗原性可识别的形式表达该序列。PV1TBP2A和PV1TBP2B也受产生的抗流感嗜血杆菌菌株DL63 tbp2的兔抗血清的中和,表明至少这两种病毒以可被抗该蛋白质的抗体识别的形式表达该序列。所有的病毒受抗PV1血清的中和,表明脊髓灰质炎中和抗原性位点I的改变不明显地影响该病毒上的其它抗原性位点。而且经过用脊髓灰质炎病毒嵌合体PV1TBP2A或PV1TBP2B免疫产生的兔抗血清识别插入氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)的肽。这表明PV1TB2A和PV1TBP2B表达的序列具有免疫原性且诱导能识别合成肽内相同序列的抗体。
至于图30,A组显示了SDS PAGE凝胶,显示了在大肠杆菌中表达的流感嗜血杆菌菌株SB12纯化的重组tbp2(泳道1),从Branhamella catarrhalis菌株4223纯化的tbp2(泳道2),限铁B.catarrhalis菌株4223的细胞总溶胞产物(泳道3),限铁大肠杆菌JM109的总细胞溶胞产物(泳道4)和在非限铁条件下生产的大肠杆菌JM109总细胞溶胞产物(泳道5)。B组显示了复制凝胶的Western印迹结果,其中使用了用PV1TBP2A免疫的兔血清合并液。在泳道1和2中与纯化的转铁蛋白结合蛋白强烈反应,在泳道3中有相似大小的斑带。与任何大肠杆菌蛋白质没有明显的反应(泳道4和5)。C组显示了从相同兔预先抽血的合并血清的结果,显示出轻微的特异性反应。这些结果表明PV1TBP2A能诱导对流感嗜血杆菌和B.catarrhalis转铁蛋白结合蛋白质特异性的抗血清,该抗血清能区分B.catarrhalis与大肠杆菌,后者不表达等价蛋白质。
含有编码本文描述的实施例例举的嗜血杆菌属种转铁蛋白受体至少一部分的纯化和分离的DNA分子在下列方面具有优势:
-用于体内和体外特异性鉴定嗜血杆菌属菌株的核酸探针。
-由该DNA分子编码的产物可用于作为诊断试剂,作为用于产生嗜血杆菌属特异性的抗血清的抗原。该抗原用于免疫接种以抵抗由嗜血杆菌属种类引起的疾病以及用于(例如)检测嗜血杆菌属感染。
-以本文所述的实施例例举的与部分转铁蛋白受体相对应的肽在用作诊断试剂,用来产生嗜血杆菌属特异性的抗血清,用于免疫接种以抵抗由嗜血杆菌属种类引起的疾病和(例如)用于检测嗜血杆菌属感染的抗原时有优势。
由本发明的核酸分子编码的转铁蛋白受体,其片段和类似物,以及含有与在嗜血杆菌属各分离物和其它产生转铁蛋白受体的细胞中保守的转铁蛋白受体部分相对应的序列的肽,在诊断和免疫由任何产生转铁蛋白受体的细菌菌株引起的疾病中有用。特别是,含序列LEGGFYGP的肽在许多产生转铁蛋白受体的细菌病原体的转铁蛋白受体蛋白质中保守并适于诊断和免疫由产生转铁蛋白受体的细胞引起的疾病。这类细菌包括(但不限于)嗜血杆菌属,奈瑟氏菌属(包括脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌)和Branhamella(包括B.catarrhalis)种类。
本发明的各种实施例在对诸如嗜血杆菌属感染和产生转铁蛋白受体的其它细菌病原体感染的免疫、诊断和治疗以及免疫学试剂的生产领域中有许多用途。对这些用途进一步的非限制性讨论在下面进一步提供。1.疫苗制备和使用
可从本文公开的免疫原性转铁蛋白受体,其类似物和片段和/或肽制备适于用作疫苗的免疫原性组合物。该疫苗引起产生包括抗转铁蛋白受体抗体和调理或杀菌抗体之抗体的免疫应答。如果用嗜血杆菌属或其它产生转铁蛋白受体的细菌攻击感染接种的受试者,抗体结合到转铁蛋白受体上从而阻断了为存活所必须的细菌铁来源。而且调理或杀菌抗TfR抗体也可以选择另一种机制提供保护。
含肽类的疫苗是本领域公知的,例如见美国专利4601903;4599231;4599230和4596792;本文引用所有这些文献以供参考。包括疫苗的免疫原组合物可制备成注射剂,液体溶液或乳剂。转铁蛋白受体,其类似物和片段和/或肽可以和与该转铁蛋白受体、片段、类似物或肽相配伍的药用赋形剂混合。这类赋形剂可包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其组合。免疫原组合物和疫苗可进一步含有辅助物质。如加湿或乳化剂,pH缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂。免疫原性组合物和疫苗可经肠胃外途径,皮下或肌内注射用药。作为另一种选择方法,根据本发明形成的免疫原组合物可以以在粘膜表面引起免疫反应的方式配制或传递。因此,可经诸如鼻内或口服(消化道内)途径将免疫组合物施用到粘膜表面。为传递给免疫系统的特异性细胞或粘膜表面免疫原性组合物可以与靶分子结合来提供。一些这类靶分子包括菌株B12和细胞毒素片段(如WO 92/17167(BiotechAustralia Pty.Ltd)所述)和单克隆抗体(如美国专利5194254(Barber etal)所述)。作为另一种可选择方法,也可使用包括栓剂或口服配方的其它用药方式。对于栓剂,结合物和载体可包括(例如)polyalkalene glycols或甘油三酯。口服配方包括一般使用的赋形剂,例如药用级糖精,纤维素和碳酸镁。这些组合物的形式可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊,缓释制剂或粉末,且含有10-95%的转铁蛋白受体,片段,类似物和/或肽。
以与配方剂量相配伍的方式施用疫苗,其施用量应是治疗上有效的,保护性的和免疫原性的。施用量取决于所治疗的受试者,例如包括个体免疫系统合成抗体且如果需要的话产生细胞介导的免疫应答的能力。所需施用的活性成份的准确量取决于医生的判断。然而,对于本领域的技术人员而言,合适的剂量范围易于确定,可以是微克级的转铁蛋白受体,其类似物和片段和/或肽。初次用药和加强剂量用药的合适方式也可变化,但应包括初次用药后接着进行随后的用药。疫苗的剂量也可取决于用药途径并可根据宿主的大小而变化。
编码本发明转铁蛋白受体的核酸分子也可直接用于经直接施用DNA进行免疫,例如经过注射用于遗传免疫或经过构建活载体,例如沙门氏菌属、BCG、腺病毒、痘病毒、牛痘病毒或脊髓灰质炎病毒。用于将异源性抗原携带进免疫系统的一些活载体的讨论见诸如O′Hagan(1992)的讨论。用于将DNA直接注射进受试者以进行遗传免疫的方法在诸如Ulmer et al.,1993的文章中进行了描述。
肽类的体内应用首先需要对其进行化学修饰,因为肽类本身可能不具备足够长的血清和/或组织半寿期和/或足够的免疫原性。这种化学修饰的肽本文称为“肽类似物”。术语“肽类似物”引伸为肽的任何功能化学等价物,其特征为就本发明的实践而言其体内或体外稳定性和/或效力和免疫原性增加。本文所用的术语“肽类似物”也引伸为本文所述的肽的任何氨基酸衍生物。本文预期的肽类似物的生产程序包括但不限于对侧链的修饰,在肽合成期间插入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交联剂和其它将构象限制强加到肽或其类似物上的方法。
本发明预期的侧链修饰的例子包括氨基修饰,如经过与乙醛反应接着用NaBH4还原进行还原性烷基化;用甲基乙酰亚胺酰胺化;用乙酸酐乙酰化;用氰酸盐使氨基氨甲酰化;用2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯基化;用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐使氨基烷基化;用5′磷酸吡哆醛使赖氨酸吡哆酰化接着用NaBH4还原。
精氨酸残基上的胍基可经过用诸如2,3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛的试剂形成杂环缩合产物进行修饰。
羧基可经过形成邻酰基异脲接着衍生成诸如相应的酰胺进行碳二亚氨活化来修饰。
巯基的修饰方法有:例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化;过甲酸氧化成磺基丙氨酸;与其它硫醇化合物形成混合的二硫化物;与顺丁烯二酰亚胺,顺丁烯二酸酐或其它取代的顺丁烯二酰亚胺反应;使用4氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞-4硝基酚和其它汞制剂形成汞制剂衍生物;用氰酸盐在碱性pH下进行氨甲酰基化。
色氨酸残基可经过(例如)用N溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟-5-硝基苄基溴或磺酰卤使吲哚环烷基化进行修饰。酪氨酸残基可经过用四硝基甲烷硝化进行改变以形成3-硝基酪氨酸衍生物。
组氨酸残基咪唑环的修饰可经过碘乙酸衍生物烷基化或用焦碳酸二乙酯进行乙酯基化作用来实现。
在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基己酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
如果抗原与佐剂共同施用,可明显改进免疫原性,通常使用百分之0.05至1.0的磷酸盐溶液-缓冲盐水。佐剂增强抗原的免疫原性,但其本身并不具有免疫原性。佐剂可经过将抗原局部保留在靠近用药的位点以产生贮存效应利于缓慢,持久地释放抗原到免疫系统的细胞中来发挥作用。佐剂也可将免疫系统的细胞吸引到抗原贮存点并刺激这些细胞产生免疫应答。
很多年来免疫刺激试剂或佐剂用于改善宿方主对诸如疫苗的免疫应答。内部佐剂(如脂多糖)一般是用作疫苗的杀死的或减毒的细菌成份。外部佐剂是免疫调节剂,一般与抗原以非共价键结合并配成增强宿主的免疫应答。因此已鉴定了佐剂增强对经肠胃外途径传递的抗原的免疫应答。然而一些这类佐剂有毒性,可引起不期望的副作用,使得它们不适用于人类和许多动物。事实上,只有氢氧化铝和磷酸铝(一般笼统地称为铝)常规用作人类和兽医疫苗的佐剂。铝在增强对diptheria和破伤风类毒素抗体中的效力即将建立,且最近铝已用作HBsAg疫苗的佐剂。尽管铝在一些用途中的有用性已充分形成,但它也有局限性。例如,铝对流感免疫接种无效且不能持续诱导细胞介导的免疫应答。以铝作佐剂的抗原诱导的抗体在小鼠中主要是IgG1类,它对一些疫苗试剂提供的保护不是最佳的。
大范围的外部佐剂可诱导对抗原的有效免疫应答。这些包括与膜蛋白质抗原复合的皂苷(免疫刺激复合物),含矿物油的pluronic聚合体,杀死的分枝杆菌和矿物油Freund氏完全佐剂,细菌产物,如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂A和脂质体。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫(CMI),将免疫原在佐剂中乳化。许多佐剂有毒性,诱导肉芽瘤,急性和慢性炎症(Freund氏完全佐剂,FCA),细胞溶解(皂苷和pluronic聚合物)和热原性,关节炎和前眼色素层炎(LPS和MDP)。尽管FCA是一种优良的佐剂并在研究中广泛使用,但由于其毒性不允许将它用于人类或兽医疫苗。
理想的佐剂所需的特征包括:(1).无毒性;(2).刺激长期免疫应答的能力;(3).生产简便和在长期贮存中稳定;(4).如果需要,对以各种途径施用的抗原诱导CMI和HIR两者的能力;(5).与其它佐剂协同作用;(6).与抗原递呈细胞群体(APC)选择性相互作用的能力;(7).特异性地诱发合适的TH1或TH2细胞特异性免疫反应的能力;(8).选择地增强针对抗原的合适抗体类型水平(例如IgA)的能力。
于1989年8月8日授权给Lockhoff等的美国专利4855283(本文引用以供参考)教导了包括N糖基酰胺,N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯的糖脂类似物,其中每种都在糖残基上被氨基酸取代,将它们作为免疫调节剂或佐剂。因此,Lockhoff等1991报道了与天然存在的糖脂表现出相似结构的N-糖脂类似物,如葡糖鞘脂和葡糖甘油脂,在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中能诱导强烈免疫反应。以长链烷基胺和通过异头碳原子直接与糖类相连接的脂肪酸合成了一些糖脂以模仿天然存在的脂残基的功能。
授权给Moloney(本文称为受让人)的美国专利4258029(本文引用以供参考)教导了十八烷基酪氨酸盐酸(OTH)与破伤风类毒素和福尔马林灭活的I、II和III型脊髓灰质炎病毒疫苗混合时充当佐剂。另外,Nixon-George等1990报道了与重组肝炎B表面抗原混合的芳香族氨基酸的十八烷基酯增强宿主对肝炎B病毒的免疫反应。
合成肽的脂化也用于增强其免疫原性。因此,Wiesmuller 1989描述了将含有与口蹄疫病毒蛋白质同源之序列的肽偶联到佐剂三软脂酰基-5-甘油-半胱氨酰丝氨酰丝氨酸上作为革兰氏阴性菌脂蛋白N端部分的合成类似物。而且Deres等1989报道了用由来自流感病毒核蛋白经过连接到脂肽N-软脂酰基-S-[2,3-双(软脂酰基)-(2RS)-丙基-[R]-半胱氨酸(TPC)上修饰的合成肽组成的合成脂肽疫苗体内引发病毒特异性细胞毒T淋巴细胞。2.免疫试验
本发明的转铁蛋白受体,其类似物和片段和/或肽在包括酶联免疫吸附试验(ELISA),RIA和其它非酶联抗体结合试验或本领域已知的用于检测抗细菌性嗜血杆菌属TfR和/或肽的抗体的方法之免疫试验中用作为免疫原,抗原。在ELISA试验中,转铁蛋白受体,类似物,与TfR蛋白部分相应的片段和/或肽在选定的表面固相化,例如能结合蛋白质或肽的表面,如聚苯乙烯微滴定板的孔中。洗涤去掉未完全吸附的转铁蛋白受体,类似物,片段和/或肽后,将非特异性蛋白质如已知对试验样品是免疫原中性的牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白溶液结合到选定的表面上。这样使固相表面的非特异性吸附位点封闭,因而减少了由抗血清与表面的非特异性结合引起的本底。除了待检测的是特定细菌种类外,选定的肽优选来自表2或表3的保守区域以增强种间交叉检测。在检测特定种类的情况下,选择的肽是特定种类TfR所独有的。一般情况下,肽范围为12个残基以上优选14个到30个残基。然而一些情况下肽的混合物既可用作疫苗免疫原又可作为诊断试剂。事实上来自保守区和/或非保守区的肽混合物可用于提供种交叉保护和/或诊断。在这种情况下,肽免疫原混合物通常称为用作疫苗或诊断试剂的“鸡尾酒”制品。
然后将固定表面与样品如待测临床或生物学材料以有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式接触。这可包括用稀释剂如BSA,牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐水溶液(PBS)/Tween稀释样品。然后在诸如25°到37℃档的温度下将样品保温2到4小时。保温后,洗涤接触样品的表面以去掉非免疫复合物质。洗涤程序可包括用诸如BPS/Tween或硼酸缓冲液的溶液洗涤。
在试验样品和结合的转铁蛋白受体,类似物,片段和/或肽之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤后,可将免疫复合物与对第一抗体具有特异性的第二抗体接触来检测免疫复合物的形成甚至形成量。如果试验样品来自人类,第二抗体是对人免疫球蛋白具有特异性的抗体且一般是IgG。为了提供检测手段,第二抗体可具有相联活性,如酶促活性,例如当与合适的生色底物保温时产生颜色反应。使用(例如)可见光谱分光光度计测量颜色产生的程度可实现定量。3.作为杂交探针的序列的应用
含有转铁蛋白受体基因序列的本发明的核苷酸序列现有使得可从嗜血杆菌的任何种类和其它具有转铁蛋白基因的细菌中鉴定和克隆转铁蛋白受体基因。
包含本发明转铁蛋白受体基因的序列的核苷酸序列对于其与其它TfR基因互补序列选择性地形成双螺旋分子的能力是有用的。根据本申请,可使用各种杂交条件以获得不同程度选择性的针对其它TfR基因的探针。对于高度选择性,可使用相当严格的条件以形成双螺旋,如低盐和/或高温度条件,例如由0.02M到0.15M NaCl,温度在大约50℃到70℃之间提供的条件。对于有些应用,需要不太严格的杂交条件,如0.15M到0.9M盐,温度在大约20℃到55℃之间变化。也可经过加入增加量的甲酰胺使杂交双螺旋去稳定来产生更严格的杂交条件。因此,具体杂交条件应该易于操作,并且选择的方法一般取决于所需的结果。一般情况下,在50%甲酰胺存在下的常规杂交温度是:对于与靶片段有95到100%同源的探针为42℃,对于有90到95%同源的为37℃,对于有85到90%同源为32℃。
在临床诊断实践中,本发明TfR基因核酸序列可与合适的工具结合使用,如一种标记物,用于检测杂交的。本领域已知大范围的各种合适的指示剂工具,包括放射活性,酶促或其它配体,如抗生物素蛋白/生物素,它们可提供可检测的信号。在一些诊断实践中,可使用酶标记如脲酶,碱性磷酸酶或过氧化物酶来代替放射活性标记。对于酶标记,比色指示剂底物是已知的,可用它提供一种肉眼或分光光度术可见的装置来鉴定与含有TfR基因序列样品的特异性杂交。
本发明的TfR基因的核酸序列作为杂交探针,用于作不溶液杂交和运用固相程序的实施例在运用固相程序的实施例中,来自样品,如临床样品,包括渗出液,体液(例如,血清,羊膜液,中耳渗出液,痰,支气管肺泡灌洗液)或甚至组织的试验DNA(或RNA)吸附或否则附着在选定的基质或表面上。然后用选定的含有本发明TfR基因或其片段的核酸序列的探针在所需条件下对固定的单链核酸进行特异性杂交。选自的条件取决于以特定标准为基础的具体情况。所需的标准取决于(例如)G+C含量,靶核酸类型,核酸来源,杂交探针的大小等。洗涤杂交表面去掉非特异性结合的探针分子后,以标记工具检测或甚至定量特异性杂交。至于肽的选择,优选选择在嗜血杆菌属种类中保守的核酸序列部分,如编码图8、9、13和14及特别是在表2和表3中列出的保守肽序列的核酸序列。选定的探针可以是至少18bp且可以是在30bp到90bp长的范围中。4.转铁蛋白受体基因的表达
含有来自与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质粒载体用于在表达系统中表达转铁蛋白受体基因。该载体通常携带一个复制位点,以及能够在转化细胞中提供表型选择的序列。例如,可使用含有编码氨苄青霉素和四环素抗性的基因的pBR322转化大肠杆菌,从而提供鉴定转化细胞的简便方法。pBR322质粒或其它微生物质粒或噬菌体也可含有(或修饰成含有)可被宿主细胞用来表达其自身蛋白质的启动子。
另外,含有与宿主相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主相关的转化载体。例如,在λGEMTM-11中的噬菌体可用于制备能用来转化宿主如大肠杆菌LE392的重组噬菌体载体。
通常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang et al.,1978;Itakura et al.,1977;Goeddel et al.,1979;Goeddel et al.,1980)以及其它微生物启动子,如T7启动子系统(美国专利4952496)。关于启动子核酸序列的详情是已知的,技术人员能够将它们与基因有效地连接。所用的具体启动子的选择一般取决于所需的结果。适合于表达转铁蛋白受体基因,其片段或变异体的宿主包括大肠杆菌,芽孢杆菌属种类,嗜血杆菌属,真菌,酵母,也可使用杆状病毒表达系统。
根据本发明,优选以重组方法制备蛋白质,尤其是当从嗜血杆菌属种培养物中纯化的天然存在的TfR蛋白质可能包含微量有毒物质或其它污染物时。在异源系统中使用重组方法生产的TfR蛋白质可避免这一问题,因为以此方法TfR蛋白质可从宿主中以能够减少纯化物质中的污染物的方式分离。在这一方面用于表达的具体所需宿主包括不具有LPS,因而无内毒素的革兰氏阳性细菌。这类宿主包括芽孢杆菌属种类并且对于生产非热原性转铁蛋白受体,片段或其类似物特别有用。而且,重组方法生产允许Tbp1或Tbp2或其片段的生产互相分离,这与存在于嗜血杆菌属中的正常结合的蛋白质不同。生物学保藏:
本文描述和提及的含有编码来自流感嗜血杆菌菌株的转铁蛋白受体至少一部分的一些质粒根据布达佩斯条约在本申请申请日前保藏在位于美国马里兰州Rockyille的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。保藏的质粒样品在以本美国专利申请为基础的专利同意下对公众是可获得的。本文描述和要求的本发明的范围不受保藏的质粒的限制,因为保藏实践只试图作为对本发明的解释。任何编码与本申请所述相似或等价的抗原的等价或相似质粒在本发明范围内。保藏概述:
血杆菌菌株:
克隆 | ATCC登记号 | 保藏日期 |
DS-712-1-3JB-1042-7-6JB-1424-2-8JB-1600-1JB-1468-29pT7TBP2ApT7TBP2BpT7TBP2CpT7TBP2D | 756037560775937759357593675931759327593375934 | 1993年11月4日1993年11月4日1994年10月27日1994年10月27日1994年10月27日1994年10月27日1994年10月27日1994年10月27日1994年10月27日 |
Hib菌株Eagan可从Connaught Laboratories Limited,1755 SteelesAve.W.,Willowdale,Ontario,Canada M2R 3T4获得。
Hib菌株MinnA从Missouri 63110,St.Louis街道儿童医院,华盛顿医科大学微生物学和免疫学系Robert Munson博士的保藏品中获得。
Hib菌株DL63从University of Texas Southwestern Medical Center,5323 Harry Hines Boulevard,Dallas,Texas 75235-9048微生物学系Eric Hansen博士的保藏品中获得。
PAK 12085从RObert Munson博士的保藏品(出处同上)中获得。
SB12、29;30、32和33从Department of Pediatrics,Schoolof Medicine,Saint Louis University Medical Centre,St.Louis,Missouri 63104的Stephem Barenkamp博士的保藏品中获得。
实施例
上面的说明书对本发明进行了一般性描述。经过参考下面具体实施例可获得更完全的了解。这些实施例的描述仅用作解释的目的而不是对本发明范围的限制。形式的改变和等价替换视为出于具体情况的考虑或导致便利。尽管本文使用了特定的术语,但这些术语是描述性的而不是用于限制的目的。
在本说明书和这些实例中使用但未清楚描述的分子遗传学,蛋白质生物化学,免疫学和发酵技术方法在科技文献中进行了充分的报道且完全在本领域技术人员的能力范围内。实施例1
本实施例描述了流感嗜血杆菌菌株DL63,Eagan,MinnA,PAK 12085和SB33。
在Mueller-Hiuton琼脂或在Harkness等1992年所述的脑心浸出培养基上生长流感嗜血杆菌菌株。A.以流感嗜血杆菌b型DL63提取染色体DNA
染色体DNA制备如下。在Beckman J14离心机中以8000rpm离心15分钟沉淀250ml培养物。用200ml 50mM Tris-HCl pH 8.0洗涤沉淀,如前离心,重悬于12.5ml 50mM Tris-HCl,50mM EDTA pH8.0中,在-20℃冷冻。然后向冷冻的细胞沉淀中加入1.25ml含10mg/ml溶菌酶溶液的0.25M Tris-HCl,pH 8.0。融化沉淀并在冰上保温45分钟。接着加入2.5ml含1mg/ml蛋白酶K的0.5%SDS,0.4M EDTA,50mM Tris-HCl pH 7.5的溶液。混合物在50℃保温1小时并偶尔搅拌。用15ml Tris-缓冲酚提取溶胞产物一次,然后加入1.5ml 3M乙酸钠和30ml乙醇以沉淀DNA。使DNA缠绕到玻璃棒上,经摇动过夜溶于12.5ml含0.2mg/ml RNAse A的50mM Tris-HCl,1mm EDTA,pH 7.5中。用等体积的氯仿提取样品一次,沉淀并如上所述缠绕。DNA溶于2ml 50mMTirs-HCl,1mm EDTA,pH 7.5中并贮存于4℃。B.从流感嗜血杆菌b型Eagan中提取染色体DNA
经离心沉淀50ml培养物,沉淀重悬于25ml TE(10mM Tris,1mMEDTA,pH 7.5)中,2×5ml等份试样用于染色体制备。向每份等份试样中加入0.6ml 10%的十二烷基肌氨酸钠和0.15ml 20mg/ml的蛋白酶K,样品在37℃培养1小时。用Tris-饱和酚提取溶胞产物一次并用抉氯仿∶异戊醇(24∶1)提取3次。合并水相得到7ml终体积。然后加入0.7ml 3M乙酸钠(pH 5.2)和4.3ml异丙醇,以沉淀且缠绕DNA并用70%乙醇漂洗,干燥并重悬于1m1水中。C.从流感嗜血杆菌Eagan,MinnA,PAK 12085和SB33中提取染色体DNA
以5000rpm在4℃离心15-20分钟从50ml培养物中沉淀细胞。细胞沉淀重悬于10ml TE(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.5)中并加入链霉蛋白酶和SDS至终浓度分别为500μg/ml和1%。样品在37℃保温4小时至得到清亮的溶胞产物。溶胞产物用Tris饱和酚提取一次,用Tris饱和酚/氯仿(1∶1)提取一次,用氯仿提取一次。最终水相在2×500ml 1M NaCl中4℃透析24小时,更换一次缓冲液。并在2×500ml TE中4℃透析24小时,更换一次缓冲液。最终透析物分成等份试样备用。实施例2
本实施例描述染色体文库的制备A.流感嗜血杆菌DL63-N2AP文库
在带25号针头的1ml注射器中机械剪切溶于TE中的100μg流感嗜血杆菌DL63染色体DNA。经过加入45μl 10×S1核酸酶缓冲液(2M NaCl,500mM NaOAc,pH 4.5,10mM ZnSO4,5%甘油),1.7μl 100U/μl的S1核酸酶,加水至终体积405μl并在37℃保温15分钟使剪切的DNA钝端化。样品用酚/氯仿提取一次,用氯仿提取一次并加入1ml乙醇沉淀DNA。样品在冰上保温10分钟或在-20℃过夜,在微量离心机中离心30分钟收获DNA。用70%乙醇洗涤并干燥。使用标准程序将DNA序列的EcoRI位点甲基化。向该甲基化DNA中加入5μl100mM MgCl2 8μl dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)和4μl5U/μl Klenow。混合物在12℃保温30分钟。加入450μl STE(0.1MNaCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),混合物用酚/氯仿提取一次,用氯仿提取一次,再加入1ml乙醇沉淀DNA。样品在冰上保温10分钟或-20℃过夜。在微量离心机中离心30分钟收获DNA,用70%乙醇洗涤并干燥。
将DNA重悬于7μl TE中,并向溶液中加入14μl磷酸化EcoRI接头(200μg/μl),3μl 10×连接缓冲液,3μl 10mM ATP和3μl T4DNA连接酶(4U/μl)。样品在4℃保温过夜,然后在68℃保温10分钟以灭活连接酶。向混合物中加入218μl H2O,45μl 10×通用缓冲液和7μl30U/μl的EcoRI。37℃保温1.5小时后,加入1.5μl 0.5M EDTA,混合物放于冰上。
在蔗糖梯度中分离不同大小的DNA,合并含6-10kb DNA的组分。合并的DNA用乙醇沉淀并重悬于5μl TE缓冲液中。在5μl的终体积中用1μg ZAPII载体在4℃与200ng插入DNA连接2-3天。使用Gigapack II Gold(Stratagene)包装连接混合物并涂布在NZY平板上的大肠杆菌SURE细胞上。滴定文库,扩增后在0.3%氯仿中贮存于4℃。B.流感嗜血杆菌Eagan-pUC文库
用实施例1C的方法从流感嗜血杆菌Eagan制备的染色体DNA用Sau 3A I消化2、5和10分钟,样品在制备的琼脂糖凝胶上电泳。切下含有3-10kb长DNA片段的凝胶片并以标准冻融程序提取DNA。pUC 8∶2(在多克隆位点上具有增加的Bgl II和Xba I限制性酶位点的pUC)的质粒DNA用BamH I和Bgl II消化并用小牛碱性磷酸酶(CAP)脱磷酸化。将流感嗜血杆菌Eagan DNA片段连接进pUC中,混合物用于转化大肠杆菌JM109细胞。C.流感嗜血杆菌Eagan-λZAP文库
按实施例1B制备的流感嗜血杆菌Eagan染色体DNA用EcoRI消化并在制备的琼脂糖凝胶上进行大小分离。切下与7-23kb DNA片段相对应的凝胶片,在含3ml TAE(40mM Tris-乙酸,1mM EDTA)的透析管中以14V电洗脱DNA过夜。DNA沉淀两次并重悬于水中,随后用EcoRI消化的λ2AP II DNA连接过夜。使用Grgapack II包装试剂盒(Stratagene)包装连接混合物并涂布在大肠杆菌XL1-Blue细胞上。滴定文库,扩增后在0.3%氯仿中贮存于4℃。D.EMBL3文库
按实施例1C制备流感嗜血杆菌MinnA染色体DNA(10μg),用Sau3A I(40单位)消化2、4和6分钟,然后在含10-30%蔗糖梯度的TNE缓冲液(20mM Tris-HCl,5mM NaCl,1mM EDTA,pH8)中进行大小分离。合并含大于5kb DNA片段的组分并沉淀。在第二次实验中,染色体DNA(2.6μg)用Sau3A I(4单位)消化1、2和3分钟并采用制备性琼脂糖凝胶电泳方法进行大小分离。切下含10-20kb DNA片段的凝胶切片并用标准冻/融技术提取DNA。合并2次实验大小分离的DNA用于与EMBL3的/BamH I臂(Promega)连接。使用Gigapack II包装试剂盒包装连接混合物并涂布到大肠杆菌LE392细胞上。滴定文库,然后扩增并在0.3%氯仿中4℃贮存。
按实施例1C制备的流感嗜血杆菌PAK 12085或SB33的染色体DNA用Sau 3AI(0.5单位/10μg DNA)在37℃消化15分钟并以琼脂糖凝胶电泳进行大小分离。切下与15-23kb DNA片段相对应的凝胶片并在含3ml TAE的透析管中以14V电洗脱DNA过夜。沉淀DNA 2次,并重悬于水中,接着用EMBL3 BamH I臂(Promega)连接过夜。使用λ体外包装试剂盒(Amersham)根据厂家说明书包装连接混合物并涂布到大肠杆菌NM539细胞上。滴定文库,然后扩增并在0.3%氯仿存在下贮存于4℃。实施例3
本实施例描述文库的筛选A.流感嗜血杆菌DL63-λZAP表达文库:
Tbp1和Tbp2蛋白质在固相人转铁蛋白(hTf)上进行亲和纯化。简单地说,根据厂家方案制备一个20ml hTf-Sepharose柱用于将蛋白质配体耦联到CNBr活化的Sepharose(Sigma)上。用3倍柱体积的50mM Tris-HCl,1M NaCl,6M盐酸胍pH 8.0洗涤所得的基质以去掉非共价结合的hTf。然后用50mN Tris-HCl,pH 8.0平衡柱子并使用1ml在含柠檬酸钠和重碳酸钠各100mM pH 8.6的缓冲液中的10mg/ml FeCl3使结合的hTf装载铁,接着用2倍柱体积的50mMTris-HCl,1M NaCl,pH 8.0洗涤。按以前所述(Schryvers et al.,1989)以生长于缺铁培养基的流感嗜血杆菌菌株DL63制备总细菌膜(300mg总蛋白)。在50mM Tris-HCl,1M NaCl,pH 8.0中将膜稀释成2mg/ml并经过加EDTA至15mM及十二烷基肌氨酸钠NL97至1.5%使之溶解。以40,000xg离心1小时后,将上清液上样到hTf柱上并用10倍柱体积的50mM Tris-HCl,1M NaCl,10mMEDTA,0.5%十二烷基肌氨酸钠pH 8.0洗涤柱。使用含2M GnHCl的相同缓冲液洗脱受体蛋白质,洗脱组分在25mM碳酸氢铵缓冲液中充分透析(更换5次缓冲液),冻干并贮存于-20℃。分离的蛋白质用以标准技术在新西兰白兔中产生转铁蛋白受体特异性抗血清。简单地说,兔经皮下途径免疫3次,间隔为2周,使用完全佛氏佐剂进行第一次注射并用不完全佛氏佐剂进行随后的注射。
将DL63 λZAP文库涂布到大肠杆菌SURE细胞上并将噬菌斑转移到预先浸泡在10mM IPTG中的硝酸纤维素膜上以从pBluescript Lac2启动子上诱导表达。在用多克隆抗TfR抗血清和辣根过氧化物酶连接的羊抗兔IgG探测前使用含0.5%脱脂乳的50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.5封闭滤膜。经过3轮筛选对噬菌斑纯化并经体内切除程序(Short et al.,1988)回收重组pBluescript质粒(pBHIT1和pBHIT2;图1A和2)。B.Eagan,MiinA和PAK 12085非表达文库
(i)流感嗜血杆菌Eagan-pUC文库的筛选
使用标准技术将菌落转移到硝酸纤维素膜上,用图2描述的转铁蛋白受体基因的5′pBHIT2探针探测滤膜。该探针用洋地黄毒苷(dig,BoehringerMannheim)按厂家说明书进行了标记。将几个推断的克隆点印迹到硝酸纤维素上并使用相同的5′pBHIT2探针进行第二轮筛选。以限制性酶切图谱分析第二轮推断的克隆并选择克隆S-4368-3-3(图18,图2)用于序列分析。
(ii)流感嗜血杆菌Eagan-λZAP文库的筛选
使用LB平板和0.7%琼脂覆盖层将噬菌体文库用标准技术涂布到XLI Blue细胞(stratagene)上。使用标准方法将噬菌斑转移到硝酸纤维素上,滤膜在真空中80℃烘焙2小时以固定DNA。用洋地黄毒苷标记转铁蛋白受体基因(图2)的5′pBHIT2探针,滤膜在42℃预杂交4小时,然后在42℃用标记的探针杂交过夜。在68℃洗涤滤膜,放射自显影后,选择一些噬菌斑用于第二轮筛选。根据λZAP系统(Promega)提供的方案体内切割第二轮推定的噬菌斑的噬菌粒DNA。获得了四个具有相同~2.5kb Eco RI插入片段的克隆,其中在图B,图2中的JB-901-5-3是一个例子。也扩增了推断的噬菌斑并以500ml培养物中纯化噬菌体DNA。经过用Xba I消化切开插入的DNA并克隆进用Xba I消化和脱磷酸化的pUC8∶2(在其多克隆位点含有另一Bgl II和Xba I位点的pUC8)中。克隆B-911-3-2(图17)含流感嗜血杆菌Eagan TfR操纵子的3′一半序列。
(iii)筛选EMBL 3文库
使用含0.7%上层琼脂糖的NZCYM作覆盖物将流感嗜血杆菌MinnA文库涂布到NZCYM平板上的LE392细胞上。按标准程序将噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上,加工滤膜并用以洋地黄毒苷标记的5′pBHIT2探针(图2)探测。将推断的噬菌斑涂布培养并用相同程序进行第二和第三轮筛选。使用标准技术从500ml培养物中制备噬菌体DNA,以Sal I消化切割插入的DNA并克隆进pUC以产生克隆DS-712-1-3(图1C和2)。
使用含0.7%琼脂糖的NZCYM作覆盖物将流感嗜血杆菌PAK 12085文库涂布到NZCYM平板上的LE392细胞上。将噬菌斑转移到硝酸纤维素上,加工该滤膜并用洋地黄毒苷标记的5′pBHIT2探针(图2)探测。将推断的噬菌斑涂布培养并使用相同程序进行第二轮筛选。以标准技术从500ml培养物中制备噬菌体DNA,经过用Sal I消化切下的DNA插入序列并克隆进pUC以产生克隆JB-1042-7-6(图10和2)。
使用含0.7%琼脂糖的NZCYM作为覆盖物将流感嗜血杆菌SB33文库涂布到NZCYM平板上的LE392细胞上。将噬菌斑转移到硝酸纤维素上,加工该滤膜并用洋地黄毒苷标记的5′pBHT2探针(图2)探测。将推断的噬菌斑涂布培养并使用相同的程序进行第二轮筛选。以标准技术从500ml培养物中制备噬菌体DNA。经过用Sal I消化切下的DNA插入序列并克隆进pUC以产生克隆JB-1031-2-9(图2)。实施例4
本实施例描述TfR操纵子Tbp1和Tbp2基因的测序。
使用标准技术从克隆pBHIT1,pBHIT2,S-4368-3-3,JB-901-5-3,DS-712-1-3,JB-1042-7-6,JB-1031-2-9制备质粒DNA。在ABI型380B DNA合成仪上合成17-25个碱基长的寡核苷酸测序引物,经使用从Applied Biosystems Inc.获得并根据厂家建议使用的OPC柱色谱纯化。使用ABI型370A DNA序列仪和染料终止子化学根据厂家方法测序该样品。菌株DL63的TfR操纵子的序列如图3所示,菌株Eagan的相应序列如图4所示,图5是菌株MinnA的相应序列,图6是PAK 12085的相应序列,图7是SB33的相应序列。实施例5
本实施例描述了不可分型流感嗜血杆菌菌株SB12,SB29,SB30和SB32 tbp2基因的PCR扩增。
按上面所述制备不可分型流感嗜血杆菌菌株SB12,SB29,SB30和SB32的染色体DNA。TfR基因排列成具tbp2的后面接着tbp1的操纵子(见图12A和12B)。合成针对tbp2 5′端和tbp1编码序列5′端逆向互补的寡核苷酸。引物是:与Tbp2先导序列MKSVPLISGS(SEQ ID NO:147)相应的GGATCCATATGAAATCTGTACCTCTTATCTCTGGT(SEQ ID NO:120)和与Tbp1先导序列MTKK(SEQ ID NO:138)及部分间隔序列(图12A和12B)逆向互补的TCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTCCAT(SEQ ID NO:137)。在含有10mMTris/HCl pH 8.3,50mM氯化钾和1.5mM氯化镁的缓冲液中进行PCR扩增。每100μl反应混合物含5ng染色体DNA,1μg每种引物,5单位扩增taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)和0.4mM dNTPs(Perkin Elmer Cetus)。循环条件是94℃1.0分钟,45℃2.0分钟和72℃1.5分钟循环25次。对每种样品扩增特异性的2kb片段(图13)。SB33 DNA用作阳性对照(泳道1)。用于扩增Tbp2基因的染色体DNA是:泳道1,SB33;泳道2,SB12;泳道3,SB29;泳道4,SB30;泳道5,SB32。将片段克隆进TA克隆载体(Invitrogen)内并测定其核苷酸序列。菌株SB12(SEQ ID NO:108),SB29(SEQ ID NO:110),SB30(SEQ ID NO:112)和SB32(SEQ ID NO:114)的Tb2核酸序列分别如图8、9、10和11显示。实施例6
本实施例描述了转铁蛋白氨基酸序列的比较和经二级结构分析对转铁蛋白受体蛋白有效暴露的抗原决定基的鉴定。
在图14中,显示了流感嗜血杆菌b型Eagan,DL63,不可分型流感嗜血杆菌菌株PAK 12085和SB33,脑膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(Legrain et al.,1993)和淋病奈瑟氏菌FA19(Cornelissen et al.,1992)Tbp1氨基酸序列的比较。这一分析揭示了在所有这些细菌中保守的Tbp1区域。
在图15中,显示了流感嗜血杆菌b型菌株Eagan,DL63,不可分型流感嗜血杆菌PAK 12085,SB12,SB29,SB30和SB32,脑膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982,淋病奈瑟氏菌FA19和Actinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniae(Gerlachet al.,1992)205和37的Tbp2氨基酸序列的比较。这一分析揭示了在所有这些细菌中保守的Tbp2区域。
使用Chou和Fasman公式(1978)进行蛋白质二级结构分析,使用Hopp公式(1986)进行亲水性/疏水性分区。该值来自七肽窗口平均值,且在每个片段的中点分区。图16A显示了流感嗜血杆菌b型Eagan Tbp1预期的二级结构,图16B显示了流感嗜血杆菌b型Eagan Tbp2预期的二级结构。使用上面所述的程序得到了图16A和16B描绘的预测的二级结构。然而,本发明还不能证实二级结构就是这些图中所描绘的。
经过序列比较鉴定了一些不同细菌中Tbp1和Tbp2蛋白质保守的抗原决定基,分别在图14和15中所示。一些这类保守的抗原决定基包括:
TBP1 DNEVTGLGK SEQ ID NO:43
TBP1 EQVLNIRLTRYDPGI SEQ ID NO:44
TBP1 GAINEIEYENVKAVEISKG SEQ ID NO:45
TBP1 GALAGSV SEQ ID NO:46
TBP2 LEGGFYGP SEQ ID NO:74
TBP2 CSGGGSFD SEQ ID NO:75
TBP2 YVYSGL SEQ ID NO:76
TBP2 CCSNLSYVKFG SEQ ID NO:77
TBP2 FLLGHRT SEQ ID NO:78
TBP2 EFNVDF SEQ ID NO:79
TBP2 NAFTGTA SEQ ID NO:80
TBP2 VNGAFYG SEQ ID NO:81
TBP2 LEGGYF SEQ ID NO:82
TBP2 VVFGAR SEQ ID NO:83
而且结合预测的二级结构,在Tbp1中鉴定了4个保守的暴露的抗原决定基,在Tbp2中鉴定了两个。它们是:Tbp1 DNEVTGLGK SEQ ID NO:43
Tbp1 EQVLN/DIRDLTRYD SEQ ID NOS:139和140
Tbp1 GAINEIEYENVKAVEISK SEQ ID NO:141
Tbp1 GI/VYNLF/LNYRYVTWE SEQ ID NOS:142和143
Tbp2 CS/LGGG(G)SFD SEQ ID NOS:75,144和145
Tbp2 LE/SGGFY/FGP SEQ ID NOS:74和146
含有上述保守氨基酸序列的蛋白质,多肽或然在诊断实践中作为检测装置,作为检测或防止由产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌引起的疾病中的免疫原特别有用。对于免疫接种,可将特别说明的氨基酸序列以蛋白质或肽或活传递载体的形式递呈给免疫系统,例如可使用沙门氏菌,BCG,腺病毒,痘病毒,牛痘病毒或脊髓灰质炎病毒。实施例7
本实施例描述了从大肠杆菌表达Eagan Tbp1的质粒JB-1 468-29的构建。
质粒S-4368-3-3(图1B和2)和JB-911-3-2(图17)分别含Eagan tbp1基因的5′和3′部分。图17描述了质粒JB-1468-29的构建方法。用于JB-1468-29构建的寡核苷酸序列如图20所示(SEQ ID NOS:86和87)。经电穿孔将质粒JB-1468-29导入大肠杆菌菌株BL21/DE3以产生菌株JB-1476-2-1。
JB-1476-2-1在YT培养基中生长并按标准方案用IPTG诱导。为了制备用于免疫原性和其它研究的Tbp1,菌株JB-1476-2-1在含3%葡萄糖的NZCYM培养基中生长过夜。将1∶40的接种物加入新鲜的不含葡萄糖的NZCYM培养基中,将培养物生长到A578=0.3。加入乳糖至1%并将培养物诱导4小时。JB-1476-2-1总细胞溶胞产物SDS-PAGE分析如图22所示。泳道1,t0时的B-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1);泳道2,诱导t=4h JB-1476-2-1时的;泳道3,分子量标记:200kD,116kDa,97.4kDa,66kDa,45kDa和31kDa;泳道4,t0时的JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2);泳道5,诱导t=4h JB-1437-4-1时的;泳道6,t0时的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2);泳道7,诱导t=4h时的JB-1607-1-1。实施例8
本实施例描述了从大肠杆菌中表达Eagan Tbp2的质粒JB-1424-2-8的构建。
在图18中,显示了含有流感嗜血杆菌b型Eagan完整tbp2基因的质粒S-4368-3-3。图18描述了质粒JB-1424-2-8,图19显示了所用的寡核苷酸。经电穿孔将质粒JB-1424-2-8导入大肠杆菌菌株BL21/DE3以产生大肠杆菌菌株JB-1437-4-1。用IPTG或乳糖诱导时,大肠杆菌JB-1437-4-1表达Tbp2,如图2 2所示。泳道1,t0时的JB-1476-2-1(T7/EaganTbp1);泳道2,JB-1476-2-1(诱导t=4 h);泳道3;分子量标记200kD,116kDa,97.4kDa,66kDa,45kDa和31kDa;泳道4,t0时的JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2);泳道5,JB-1437-4-1(诱导t=4h);泳道6,t0时的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2);泳道7,诱导t=4h时的JB-1607-1-1。实施例9
本实施例描述了编码位于Tbp2序列前的脂蛋白前导序列的质粒的构建。
用于构建含有在Tbp2前的来自E.coli lpp(SEQ ID NO:88和89),rlpB(SEQ ID NO:90和91)和pal(SEQ ID NO:92和93)的脂蛋白的前导序列之质粒的寡核苷酸如图20所示。构建的质粒和产生的相应的菌株如下面表1所示。实施例10
本实施例描述了从大肠杆菌表达SB12 Tbp2的质粒JB-1600-1的构建。
质粒DS-1047-1-2(图21)含有PCR扩增的SB12 tbp2基因。以Nde I到EcoRI的限制性片段切下tbp2基因并插入到pT7-7表达载体中以产生质粒JB-1600-1。电穿孔进BL21/DE3细胞产生表达SB12 Tbp2的大肠杆菌菌株JB-1607-1-1。用IPTG或乳糖诱导时,表达SB12 Tbp2,如图22所示。泳道1,t0时的JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1);泳道2,JB-1476-2-1(诱导t=4 h);泳道3;分子量标记200kD,116kDa,97.4kDa,66kDa,45kDa和31kDa;泳道4,t0时的JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2);泳道5,诱导t=4h时的JB-1437-4-1;泳道6,t0时的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2);泳道7,t=4h诱导时的JB-1607-1-1。实施例11
本实施例描述了Tbp1和Tbp2的提取和纯化。
Tbp1和Tbp2的纯化方法如图23所示。两种重组蛋白质都以大肠杆菌中包含体的形式被表达且纯化方式相同。按实施例7制备Tbp1和实施例8制备Tbp2所述方法制备的从500ml 50ml 50mM Tris-HCl,pH 8.0中并经声处理破碎(3×10分钟,70%工作循环)。提取物在20,000xg下离心30分钟,弃去含>95%可溶性大肠杆菌蛋白质的所得上清液。
在50ml含0.5%Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris pH 8.0中进一步提取所得的沉淀(图23,PPT1)。以20,000xg离心30分钟后,弃去含残余可溶性蛋白质和主要膜蛋白的上清液。上述提取后获得的沉淀(图23,PPT2)含有包含体。将Tbp1和Tbp2蛋白质溶于含0.1%SDS和5mM DTT的50mMTris,pH 8.0中。离心后,再用含0.1%SDS和5mM DTT的50mM Tris,pH 8.0平衡的Superdex 200凝胶过滤柱上进一步纯化所得的上清液。以SDS PAGE分析馏分,将含纯化的Tbp1或Tbp2的组分用50mM Tris pH 8.0在4℃下透析过夜,然后以20,000xg离心30分钟。在这些条件下该蛋白质仍是可溶性,纯化的Tbp1和Tbp2贮存于-20℃。
纯化方法的SDS-PAGE分析如图24所示。泳道1,预先染色的分子量蛋白标记(106,80,49.5,32.5,27.5,18.5kDa);泳道2,大肠杆菌总细胞溶胞产物;泳道3,可溶性包含体;泳道4,纯化的Tbp1或Tbp2。实施例12
本实施例描述了重组Tbp1和Tbp2在小鼠中的免疫原性研究。
5只Bal b/c小鼠组在第1、29和43天经皮下(s.c.)注射含AlPO4(1.5mg/剂量)的按实施例11所述制备的纯化rTbp1或rTbp2(1μg至10μg)。在第14、28、42和56天取血样用于经EIA进行抗rTbp1和抗-rTbp2抗体滴度分析。免疫原性研究的结果如图25所示。实施例13
本实施例描述了用于测定小鼠血清中抗rTbp1和抗-rTbp2抗体的EIAs建立。
基本上按Panezutti et al.,(1993)所述测定抗rTbp1和抗-rTbp2抗体滴度。微滴定孔用按实施例11所述制备的0.5μg rTbp1或rTbp2在室温下包被16h。然后用含0.1%(w/v)BSA的PBS进行封闭。系列稀释血清并加入到孔中,然后在室温下保温1小时。与辣根过氧化物酶连接的羊抗小鼠IgG(Fc特异性)抗体亲和纯化的F(ab′)2片段用作第二抗体。使用四甲基联苯胺(TMB/H2O2)进行显色反应并在Flow Multiskan MCC微板阅读器上在450nm(使用540nm作为参照波长)下测吸光率。抗血清的反应滴度定义为持续地显示出比预先免疫血清样品增加2倍的吸光率的稀释度的倒数。实施例14
本实施例描述了用重组Eagan Tbp1免疫接种产生的抗Tbp1抗血清与流感嗜血杆菌各种菌株的交叉反应性。
以SDS PAGE凝胶分离生长于含NAD和血红素(Harkness et al.,1992)±EDDA的BHI培养基中的流感嗜血杆菌菌株总细胞溶胞产物,转移到硝酸纤维素膜上,并用针对纯化的重组Eagan Tbp1产生的豚鼠抗tbp1抗血清(图26)进行探测。泳道1,BL21/DE3;泳道2,SB12-EDDA;泳道3,SB12+EDDA;泳道4,SB29-EDDA;泳道5,SB29+EDDA;泳道6,SB33-EDDD;泳道7,SB33+EDDA;泳道8,Eagan-EDDA;泳道9,Eagan+EDDA;泳道10,B.catarrhalis4223-EDDA;泳道11,B.catarrhalis 4223+EDDA;泳道12,脑膜炎奈瑟氏菌608-EDDA;泳道13,脑膜炎奈瑟氏菌608+EDDA;泳道14,诱导JB-1476-2-1表达的重组Eagan Tbp1;泳道15,分子量标记。与抗Tbp1抗血清反应的特异性~95kDa带,在相应于流感嗜血杆菌菌株SB12、SB29、SB33和Eagan的泳道3、4、5、7、8和9中,泳道10和11中~110kDa带,相应于B.catarrhalis菌株4223,泳道12和13中~80kDa带,相应于脑膜炎奈瑟氏菌608。实施例15
本实施例描述了用重组Eagan Tbp2免疫产生的抗Tbp2抗血清与流感嗜血杆菌各种菌株的交叉反应性。
在SDS PAGE凝胶上分离生长于含NAD和血红素(Harkness et al.,1992)±EDDA的BHI培养基的流感嗜血杆菌菌株总细胞溶胞产物,转移到硝酸纤维素膜上,并用针对纯化的重组Eagan Tbp2产生的豚鼠抗Tbp2抗血清进行探测(图27)。泳道1,分子标记;泳道2,诱导JB-1437-4-1表达的重组Eagan Tbp2;泳道3,SB12-EDDA;泳道4,SB12+EDDA;泳道5,SB29-EDDA;泳道6,SB29+EDDA;泳道7,SB30-EDDD;泳道8,SB30+EDDA;泳道9,SB32-EDDA;泳道10,SB33-EDDA;泳道11,SB33+EDDD;泳道12,PAK-EDDA;泳道13,PAK+EDDA;泳道14,Eagan-EDDA;泳道15,Eagan+EDDA;与抗Tbp2抗血清反应的大约60~70kDa的特异性带在与嗜血杆菌属菌株SB12、SB29、SB30、PAK和Eagan相对应的泳道3、6、7、8、13、14和15上。实施例16
本实施例描述了与Tbp2和Tbp1中保守区相对应的合成肽的合成。
在图14和15中分别比较了Tbp1和Tbp2的推测的氨基酸序列。这种比较鉴定了在表2和3中所示的上述转铁蛋白受体内氨基酸序列保守区,合成了含转铁蛋白受体部分的肽。经过在含有编码所说肽的核酸之重组载体在合适宿主中表达或以标准肽合成法可实现这种合成。
简单地说,使用ABI 430A肽合成仪和使用厂家推荐的条件的最优化t-Boc化学合成肽,使用氢氟酸(HF)从树脂上裂解肽。使用以2ml/分的流速在40分钟内在0.1%三氟乙酸(TFA)中形成的15至55%乙腈梯度在Vydac C4半制备柱(1×30cm)上以反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化肽。以分析型HPLC判断在生化和免疫学研究中所用的全部合成肽是>95%的纯度。在Waters Pico-Tag系统中进行氨基酸成份分析,结果与理论组成较好地吻合。实施例17
本实施例描述了在试验动物中合成肽的免疫原性。
在第0天用在佛氏完全佐剂中乳化的,按实施例16所述制备的100μg肽经肌内免疫豚鼠,接着使用在佛氏不完全佐剂中乳化的相同量的肽在第+14和+28天进行加强注射。在第42+天获取血清样品,经酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度。简单地说,用溶于50μg包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mMNaHCO3,pH 9.6)中的500ng任一特定肽在室温下包被微滴定板的孔(Nunc,Immunoplate,Nunc,Denmark)16小时。然后用含0.1%(w/v)BSA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)在室温下封闭该板30分钟。系列稀释抗血清,加入各孔中并在室温下保温1小时。去掉抗血清后,用含0.1%(w/v)Tween-20和0.1%(w/v)BSA的PBS洗涤该板5次。用洗涤缓冲液稀释(1/8,000)与辣根过氧化物酶(Jackson Immuno Research Labs Inc.PA)连接的羊抗豚鼠IgG抗体F(ab′)2,加到微滴定板上。室温下保温1小时后,用洗涤缓冲液洗涤平板5次。使用溶于H2O2(ADI,Toronto)中的底物四甲基苯胺(TMB)使该平板显色,用1N H2SO4终止反应,使用Titretek Multiskan II(Flow Labs.,Virginia)在450nm下测定光密度。在这些ELISA中包括2个32氨基酸残基的无关肽作为阴性对照。试验以一式三份进行,每份抗血清的反应滴度定义为持续显示出比阴性对照增加2倍光吸收值的稀释度。在豚鼠中产生的抗血清对用于免疫的肽具有单一特异性。免疫后获得的血清滴度如表4所示。
本发明的肽包含在表2和3中所示的任一单拷贝或含多拷贝的其类似物肽。肽可包含选自表2和3所示的多个不同肽或其类似物且包括合适的载体分子。优选的保守区的肽可用于形成抗体,因为免疫的或其它类型的结合试验可用于检测嗜血杆菌属的一些种类。因此,表2和3列出了转铁蛋白受体的一些其它保守区用于鉴定在诊断,免疫和医学治疗中有用的其它肽。实施例18
本实施例描述了针对与转铁蛋白受体保守区相对应的肽产生的抗血清识别Branhamella catarrhalis转铁蛋白受体的能力。
用与转铁蛋白受体保守部分相对应的肽免疫接种豚鼠,获得的抗血清在实施例17中描述。Branhamella catarrhalis总细胞提取物用特异性识别该细菌转铁蛋白受体的肽特异性抗血清免疫印迹。用Tbp2 N末端肽和Tbp2-25肽免疫豚鼠所得的抗肽抗血清特异性地识别Branhamella catarrhalis Tbp2蛋白质和在大肠杆菌中以质粒克隆pBHIT2表达的重组Tbp2。克隆pBHIT2表达以氨基酸80开始的Tbp2的截短变体(即NKKFYSG SEQ ID NO:105)。因此,pBHIT2的Tbp2蛋白质仅能被针对第二抗原决定基LEGGFYGP(TBP2-25)产生的抗体识别。这一分析表明:与转铁蛋白受体保守区相对应的肽在对大多数(如果并非全部)产生转铁蛋白受体的细菌检测中有用以及作为包括用于产生抗转铁蛋白受体的免疫反应和抵抗由该细菌引起的疾病的疫苗在内的免疫原性组合物中的成份有用。
采用ELISA检验这些兔的血清对插入序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)的肽或流感嗜血杆菌菌株DL63 Tbp2的抗性。ELISA板用肽或蛋白质包被,然后用5%脱脂乳封闭。将在含0.05%tween-20,1%干乳的磷酸缓冲盐中系列2倍稀释的血清在板上37℃保温2小时。接着将平板在含0.05%tween-20的磷酸缓冲盐水中洗涤5次。用辣根过氧化物酶(HRPO)连接的猴抗兔IgG在室温下探测洗涤过的平板30分钟。然后用含0.05%tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤5次。向全部孔中加入HRPO底物后室温下黑暗中放置30分钟,然后经加入50μl1M硫酸终止显色。经过在450nm下测吸光率来测定颜色。实施例19
本实施例描述了不产生转铁蛋白受体的流感嗜血杆菌菌株的产生。
将pBHIT1中插入的2.55 EcoRI片段亚克隆进pUC4K的EcoRI位点,导致从该载体中去掉了Tn903卡那霉素抗性(Kan)表达盒(pUHIT1;图28)。这一亚克隆步骤有利于随后将含Kan基因盒的Hinc II或Pst I pUC4K片段插入到pUHIT1的Hind III或Pst I位点,因为在用于产生pUHIT1KFH和pUHIT1KFP的构建体中两者都是单一位点(图28)。用EcoRI消化去掉间断的基因序列后,使用以前描述的M-IV培养基(Bracak et al.,1991)经转化方法将构建体导入流感嗜血杆菌野生型基因组中,在含20μg/ml卡那霉素的BHINH琼脂上选择转化子。实施例20
本实施例描述了表达转铁蛋白受体抗原决定基的脊髓灰质炎病毒的构建。
将脊髓灰质炎病毒1型Mahoney菌株(PV1-M)基因组碱基1175至2956的cDNA克隆用限制性酶Sau I和Hind III剪切。这些酶切下含碱基2754至2786的片段,该片段编码PV1-M氨基酸1094至1102,如图29所示。在本申请中,我们使用四位数字编码脊髓灰质炎病毒氨基酸;例如1095是衣壳蛋白VP1的氨基酸95。经过用编码流感嗜血杆菌Tbp2氨基酸的合成寡核苷酸取代切除的片段来构建编码脊髓灰质炎病毒和转铁蛋白受体氨基酸序列的新杂交体cDNA克隆。用限制性酶NheI和SnaB I剪切新杂交体cDNA克隆,它切下包括人脊髓灰质炎病毒碱基2471至2956的转铁蛋白受体DNA序列的杂交片段。用Nhe I和SnaBI剪切PV1-M完整基因组的cDNA克隆(例如pT7XLD或pT7CMCB)以切下脊髓灰质炎病毒碱基2471至2956的片段。然后用包含转铁蛋白受体DNA序列的杂交片段代替切下的片段以产生基因组PV1-M碱基2754至2786被编码包括转铁蛋白受体氨基酸的杂交BC环的碱基取代的杂交cDNA克隆,如图29所示。
质粒pT7XLD和来自pT7XLD的克隆(如pT7CMCB)在PV1-M cDNA5′端含有酶T7 RNA聚合酶的启动子序列。使用T7 RNA聚合酶按Van der Werf et al.,所述制备包括编码转铁蛋白受体氨基酸任意碱基的PV1-McDNA之RNA转录体。用这些RNA转录体转染Vero细胞产生4个活的杂交病毒,命名为PV1TBP2A、PV1TBP2B、PV1TBP2C和PV1TBP2D用pT7CMCB转录体转染产生来自转染的野生型脊髓灰质炎病毒,命名为PV1XLD(图29)。
PV1TBP2A、PV1TBP2B、PV1TBP2C和PV1TBP2D的抗原性特征如表5所示。它们都被针对插入了序列LEGGFYGP(SEQ ID NQ:74)的肽产生的豚鼠抗血清中和,这表明这些病毒以抗原性可识别的形式表达这一序列。为了生产抗血清,用在磷酸铝(3mg/ml)中配制的含200μg肽的500μl体积以IM免疫雌性豚鼠。动物在第1、14、28和42天免疫并在第0、28、42和56天抽血。血清来自第56天抽的血。PV1TBP2A和PV1TBP2B也被针对流感嗜血杆菌DL63 Tbp2产生的兔抗血清中和,表明至少这两种病毒以被针对该蛋白质产生的抗体可识别的形式表达该序列。所有病毒都被抗PV1血清中和,表明脊髓灰质炎病毒中和抗原性位点I的改变不明显影响病毒上的其它抗原性位点。实施例21
本实施例描述了用于诱导抗Tbp2的高滴度的抗血清的脊髓灰质炎病毒杂交体的使用。
用CsCl纯化的PV1TBP2A接种兔(兔(#40、41、42)。注意尽管所用的病毒是活的,但脊髓灰质炎病毒在兔中不复制且观察到的任一反应都是针对灭活抗原的有效反应。在第1天,用溶于弗氏完全佐剂中的1μg病毒在背部经皮下接种兔,在第14天,用含1μg病毒的弗氏不完全佐剂在背部皮下接种来加强免疫兔。在第0天(预抽血)和第27天对兔抽血。每次接种的病毒剂量是2.5×107pfu,这一值从A260值测定,大约为3.0×1011病毒粒子。它相当于0.5pmol病毒或30pmol LEGGFTG(SEQ ID NO:74)抗原决定基,因为每个病毒粒子表达60拷贝的该抗原决定基。
说明书小结
小结本说明书,本发明提供了含有转铁蛋白受体基因的分离和纯化的DNA分子,这些转铁蛋白受体基因的序列和其所得的氨基酸序列。本发明还提供了与转铁蛋白受体部分相应的肽。该基因,DNA序列,重组蛋白质和肽在诊断、免疫和诊断及免疫学试剂的生产中有用。可制备以表达的重组Tbp1和/或Tbp2,其部分或来自假定序列的肽为基础的疫苗用于防止由产生转铁蛋白受体的病原菌引起的疾病。在本发明的范围内可进行修改。
表1
先导 | 第一个残基 | 质粒 | 菌株 |
E.coli lpp | Cys | JB-1360-1R-10 | JB-1407-1-1 |
E.coli lpp | Ser | JB-1366-1R-7 | JB-1407-3-1 |
E.coli pal | Cys | JB-1360-3-10 | JB-1407-2-1 |
E.coli pal | Ser | JB-1366-3R-5 | JB-1407-4-4 |
E.coli rlpB | Cys | JB-1399-1 | JB-1437-1-1 |
E.coli rlpB | Ser | JB-1378-7 | JB-1407-5-1 |
表2
预测的抗原性Tbp1肽肽 残基1 序列 SEQ ID NO:TBP1-N 1-36 AETQSIKDTKEAISSEVDTQSTEDSELETISVTAEK 13TBP1-2 31-66 SVTAEKVRDRKDNEVTGLGKIIKTSESISREQVLNI 14TBP1-3 59-94 SREQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGM 15TBP1-4 88-123 GYSIRGMDRNRVALLVDGLPQTQSYVVQSPLVARSG 16TBP1-5 117-152 PLVARSGYGTGAINEIEYENVKAVEISKGGSSSEYG 17TBP1-6 147-182 SSSEYGNGALAGSVTFQSKSAADILEGDKSWGIQTK 18TBP1-7 179-214 GIQTKNAYSSKNKGFTHSLAVAGKQGGFEGVAIYTH 19TBP1-8 208-243 GVAIYTHRNSIETQUHKDALKGVQSYDRFIATTEDQ 20TBP1-9 236-271 IATTEDQSAYFVMQDECIDGYDKCKTSPKRPATLST 21TBP1-10 266-301 PATLSTQRETVSVSDYTGANRIKPNPMKYESQSWFL 22TBP1-11 293-328 YESQSWFLRGGYHFSEQHYIGGIFEFTQQKFDIRDM 23TBP1-12 322-357 KFDIRDMTFPAYLRPTEDKDLQSPPFYPKQDYGAYQ 24TBP1-13 352-387 DYGAYQHIGDGRGVKYASGLYFDEHHRKQRVGIEYI 25TBP1-14 383-418 GIEYIYENKNKAGIIDKAVLSANQQNIILDSYMRHT 26TBP1-15 412-447 DSYMRHTHCSLYPNPSKNCRPTLDKPYSYYHSDRNV 27TBP1-16 443-478 SDRNVYKEKENMLQLNLEKKIQQNWLTHQIAFNLGF 28TBP1-17 469-504 THQIAFNLGFDDFTSALQHKDYLTRRVIATASSISE 29TBP1-M 498-534 TASSISEKRGEARRNGLQSSPYLYPTPKAELVGGDLC 30TBP1-19 528-563 LVGGDLCNYQGKSSNYSDCKVRLIKGKNYYFAARNN 31TBP1-20 558-593 FAARNNMALGKYVDLGLGMRYDVSRTKANESTISVG 32TRP1-21 588-623 STISVGKFKNFSWNTGIVIKPTEWLDLSYRLSTGFR 33TBP1-22 618-653 LSTGFRNPSFAEMYGWRYGGKDTDVYIGKFKPETSR 34TBP1-23 648-683 KPETSRNQEFGLALKGDFGNIEISHFSNAYRNLIAF 35TBP1-24 677-712 YRNLIAFAEELSKNGTTGKGNYGYHNAQNAKLVGVN 36TBP1-25 706-741 AKLVGVNITAQLDFNGLWKRIPYGWYATFAYNRVKV 37TBP1-26 735-770 AYNRVKVKIQKINAGLASVSSYLFDAIQPSRYIIGL 38TBP1-27 764-799 SRYIIGLDYDHPSNTWGIKTMFTQSKAKSQNELLGK 39
表2(续)TBP1-28 794-829 NELLGKRALGNNSRNVKSTRKLTRAWHILDVSGYYM 40TBP1-29 825-854 SGYYMVNRSILFRLGVYNLLNYRYVTWEAV 41TBP1-30 843-865 LLNYRYVTWEAVRQTAQGAEFDI 42TBP1-31 42-50 DNEVTGLGK 43TBP1-32 61-76 EQVLNIRDLTRYDPGI 44TBP1-33 61-95 EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD 45TBP1-34 128-146 GAINEIEYENVKAVEISKG 46TBP1-35 155-161 GALAGSV 47TBP1-1 1-14 AETQSIKDTKEAISC2 481.流感嗜血杆菌b型菌株Engan Tbp1序列的残基数(如图8所示)2.加入半胱氨酸有助于偶联到载体蛋白质(例如KLH)上
表3
预测保守的抗原性Tbp2肽肽 残基1 序列 SEQ ID
NO:TBP2-1 18-31 CSGGGSFDVDNVSN 49TBP2-2 231-261 LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK 50TBP2-3 358-380 TVGKKTYQVEACCSNLSYVKFGM 51TBP2-4 527-549 ATVKGAFYGPKASELGGYFTYNG 52TBP2-5 1-36 MKLAALNLFDRNKPSLLNEDSYMIFSSRSTIEEDV 53TBP2-6 29-64 STIEEDVKNDNQNGEHPIDSIVDPRAPNSNENRHG 54TBP2-7 57-92 SNENRHGQKYVYSGLYYIQSWSLRDLPNKKFYSGY 55TBP2-8 85-120 KKFYSGYYGYAYYFGNTTASALPVGGVATYKGTWS 56TBP2-9 113-148 TYKGTWSFITAAENG KNYELLRNSGGGQAYSRRSA 57TBP2-10 141-176 AYSRRSATPEDIDLDRKTGLTSEFTVNFGTKKLTG 58TBP2-11 169-204 GTKKLTGGLYYNLRETDANKS QNRTHKLYDLFADV 59TBP2-12 197-232 YDLEADVHSNRFRGKVKPTKKESSEEHPFTSEGTL 60TBP2-13 225-260 FTSEGTLEGGFYGPEGQELGGKFLAHDKKVLGVFS 61TBP2-14 253-288 KVLGVFSAKEQQETSENKKLPKETLIDGKLTTFKT 62TBP2-15 281-316 KLTTFKTTNATANATTDATTSTTASTKTDTTTNAT 63TBP2-16 309-344 DTTTNATANTENFTTKDIPSLGEADYLLIDNYPVP 64TBP2-17 337-372 IDNYPVPLFPESGDFISSKHHTVGKKTYQVEACCS 65TBP2-M 360-406 CSNLSYVKFGMYYEAPPKEEEKEKEKDKDKEKEKQA 66TBP2-19 393-428 KEKDKDKEKEKQATTSIKTYYQFLLGLRTPSSEIP 67TBP2-20 421-456 TPSSEIPKEGSAKYHGNWFGYISDGETSYSASGDK 68TBP2-21 449-484 YSASGDKERSKNAVAEFNVNFAEKTLTGELKRHDT 69TBP2-22 477-512 ELKRHDTQNPVFKINATFQSGKNDFTGTATAKDLA 70TBP2-23 505-540 ATAKDLAIDGKNTQGTSKVNFFATVNGAFYGPHAT 71TBP2-24 533-559 FYGPHATELGCVTTYNGNNPTDKNSS 72TBP2-C 553-581 CPTDKNSSSNSEKARAAVVFGAKKQQVETFK 73TBP2-25 231-238 LEGGFYGP 74TBP2-26 18-25 CSGGGSFD 75
表3(续)TBP2-27 130-134 YVYSGL 76TBP2-28 345-355 CCSNLSYVKFG 77TBP2-29 401-407 FLLGHRT 78TBP2-30 450-456 EFNVDF 79TBP2-31 485-491 NAFTGTA 80TBP2-32 516-522 VNGAFYG 81TBP2-33 527-532 ELGGYF 82TBP2-34 562-566 VVFGAR 83TBP2-35 562-568 VVFGAK 84TBP2-36 231-238 LEGGFYG 851.流感嗜血杆菌B型Engan菌株Tbp2序列的残基数(如图9所示)
表4
豚鼠抗体与Tbp1和Tbp2肽的应答肽 SEQ ID 序 列 滴度TBP1-N 13 AETQSIKDTKEAISSEVDTQSTEDSELETISVTAEK 500TBP1-M 30 TASSISEKGEARRNGLQSSPYLYPTPKAELVGGDLC 1562500TBP1-1 48 AETQSIKDTKEAISC <100TBP2-1 49 CSGGGSFDVDNVSN 2500TBP2-2 50 LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK 12500TBP2-3 51 TVGKKTYQVEACCSNLSYVKFGM 62500TBP2-4 52 ATVKGAFYGPKASELGGYFTYNG <100TBP2-M 66 CSNLSYVKFGMYYEAPPKEEEKEKEKDKDKEKEKQA 62500TBP2-C 73 CPTDKNSSSNSEKARAAVVFGAKKQQVETTK 312500
表5
抗Tbp2和抗肽的血清对脊髓灰质炎
病毒/Tbp2杂交病毒的中和活性
a.Rb@PV1是针对PV1×LD产生的兔免疫血清合并液。用3份连续的3μg剂量的重组流感嗜
血清a | 对病毒的中和滴度b | ||||
PV1TBP2A | PV1TBP2B | PV1TBP2C | PV1TBP2D | PV1XLD | |
Rb@pV1 | >40,9600 | 25,844 | 20,480 | 16,763 | >40,960 |
Rb 516 D0 | <4 | <4 | <4 | <4 | <4 |
Rb 516 D42 | 40 | 20 | <4 | <4 | <4 |
Gp561,562 D0合并液 | <4 | <4 | <4 | <4 | <4 |
Gp 561 D56 | >2048 | >2048 | >2048 | 1164 | <4 |
Gp 562 D56 | >2048 | >2048 | 25 | 10 | <4 |
GP558,559,560D56合并液 | <4 | <4 | <4 | <4 | <4 |
血杆菌DL63转铁蛋白接合蛋白2在第1、14和28天免疫兔516。在第0天(D0)和42天
(D42)收集血清。用4个连接剂量的200μg肽在第1、14、28和42天免疫豚鼠。在第0
天(D0)和56天(D56)收集血清。豚鼠561和562接受了含序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:
74)的肽。豚鼠558、559和556接受了含无关序列的对照肽。b.滴度是在对100TCID50病毒的病毒中和试验中产生50%终点的血清稀释度的反函数。
表6用PV1TBP2A或PV1TBP2B免疫的兔的肽特异性IgG滴度
a.滴度是产生A450至少为背景值2倍的最大稀释度的倒数
兔(抗原) | 肽特异性IgG滴度a | |
预抽血 | 第27天 | |
40(PV1TBP2A) | <20 | 640 |
41(PV1TBP2A) | <20 | 640 |
42(PV1TBP2A) | <20 | 2560 |
43(PV1TBP2B) | <20 | 160 |
44(PV1TBP2B) | <20 | 1280 |
45(PV1TBP2B) | <20 | 1280 |
10(PV1 Mahoney) | <20b | |
11(pV1 Mahoney) | <20 |
背景值是不含兔血清的试验孔中A450的平均值b.兔10和11的滴度指用PV1 Mahoney免疫3次后在第42天提
取的血清。按兔40到45免疫兔10和11,除了增加的加强
剂量在第28天用药。
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Claims (66)
1.一种编码嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物的纯化的和分离的核酸分子。
2.根据权利要求1的核酸分子,其中嗜血杆菌属菌株是流感嗜血杆菌菌株。
3.根据权利要求2的核酸分子,其中流感嗜血杆菌菌株是流感嗜血杆菌b型菌株。
4.根据权利要求3的核酸分子,其中流感嗜血杆b型菌菌株选自DL63,MinnA和Eagan。
5.根据权利要求2的核酸分子,其中流感嗜血杆菌菌株是不可分型流感嗜血杆菌菌株。
6.根据权利要求5的核酸分子,其中不可分型流感嗜血杆菌菌株选自PAK12085,SB12,SB29,SB30,SB32和SB33。
7.根据权利要求1的核酸分子,仅编码嗜血杆菌菌株Tbp1蛋白质。
8.根据权利要求1的核酸分子,仅编码嗜血杆菌菌株Tbp2蛋白质。
9.根据权利要求1的核酸分子,编码具有在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌中保守的保守氨基酸序列的嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质的片段。
10.根据权利要求9的核酸分子,其中的保守氨基酸序列具有包含在表2和3中所示的流感嗜血杆菌b型菌株Eagan肽和其它流感嗜血杆菌菌株相应肽的氨基酸序列内的氨基酸序列。
11.根据权利要求10的核酸分子,其中的保守氨基酸序列包括氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)或LEGGFYG(SEQ ID NO:85)。
12.一种纯化和分离的核酸分子,具有选自下列DNA序列:
(a)在图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ ID NOS:1、2、3、4、105、108、110、112、114)中列出的任一DNA序列或所说的任一序列的互补DNA序列;
(b)一种编码图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ ID NOS:5、6、7、8、9、10、11、12、106、107、109、111、113、115)中列出的任一氨基酸序列的DNA序列或其互补DNA序列;以及
(c)在严格条件下与(a)或(b)定义的任一DNA序列杂交的DNA序列。
13.根据权利要求12的核酸分子,其中(c)定义的DNA序列与(a)或(b)定义的任一DNA序列有至少大约90%的序列同一性。
14.一种适于转化宿主的载体,它含有权利要求1或12的核酸分子。
15.根据权利要求14的载体,它具有ATCC保藏号75603的质粒DS-712-1-3或ATCC保藏号75607的质粒JB-1042-7-6的鉴定特征。
16.适于转化宿主的表达载体,它含有权利要求1或12的核酸分子和与核酸分子有效耦联的表达装置(expression means)用于经宿主表达嗜血杆菌属菌株的转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体片段或类似物。
17.权利要求16的表达载体,其中的核酸分子编码基本上所有嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质。
18.权利要求16的表达载体,其中的核酸分子仅编码嗜血杆菌属菌株Tbp1或Tbp2蛋白质。
19.权利要求16的表达载体,其中的表达装置包括编码从宿主分泌的转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物之前导序列的核酸部分。
20.权利要求16的表达载体,其中的表达装置包括编码用于从宿主表达脂化形式的转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物的脂化信号。
21.权利要求16的表达载体,具有ATCC保藏号75937的质粒JB-1424-2-8,ATCC保藏号75935的质粒JB-1600-1或ATCC保藏号75936的质粒JB-1468-29的鉴定特征。
22.含有权利要求16要求的表达载体的转化细胞。
23.权利要求22的宿主,选自JB-1476-2-1,JB-1437-4-1和JB-1607-1-1。
24.可用权利要求22的转化宿主生产的重组转铁蛋白受体蛋白质或其片段或其类似物。
25.不含嗜血杆菌属菌株Tbp2蛋白质的分离和纯化的嗜血杆菌属菌株Tbp1蛋白质。
26.不含嗜血杆菌属菌株Tbp1蛋白质的分离和纯化的嗜血杆菌属菌株Tbp2蛋白质。
27.权利要求25或26的Tbp1或Tbp2蛋白质,其中所说的嗜血杆菌属菌株是流感嗜血杆菌。
28.权利要求27的Tbp1或Tbp2蛋白质,其中所说的嗜血杆菌属菌株是流感嗜血杆菌b型或不可分型流感嗜血杆菌。
29.一种合成肽,具有不少于6个氨基酸和不超过150个氨基酸,且含有相应于细菌菌株转铁蛋白受体蛋白质仅一部分或转铁蛋白受体蛋白质类似物仅一部分的氨基酸序列。
30.权利要求29的肽,其中的细菌菌株是嗜血杆菌属菌株。
31.权利要求30的肽,其中的嗜血杆菌属菌株是流感嗜血杆菌菌株。
32.权利要求31的肽,其中的流感嗜血杆菌菌株是流感嗜血杆菌b型菌株。
33.权利要求32的肽,其中的流感嗜血杆菌b型菌株选自DL63,MinnA和Eagan且所说的转铁蛋白受体蛋白质具有选自图3、4和5(SEQ ID NOS:5、6、7、8、9、10)提供的氨基酸序列。
34.权利要求31的肽,其中的流感嗜血杆菌菌株是不可分型流感嗜血杆菌菌株。
35.权利要求34的肽,其中不可分型流感嗜血杆菌菌株选自PAK 12085,SB12,SB29,SB30,SB32和SB33且所说的转铁蛋白受体蛋白质具有在图6、7、8、9、10和11(SEQ ID NOS:106、107、109、111、113、115)提供的氨基酸序列。
36.权利要求29的肽,包含在产生转铁蛋白受体蛋白质的细菌中保守的氨基酸序列。
37.权利要求36的肽,包含在嗜血杆菌属菌株中保守的氨基酸序列。
38.权利要求36的肽,包含氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)或LEGGFYG(SEQ ID NO:85)。
39.权利要求29的肽,具有选自在表2或表3中提供的流感嗜血杆菌菌株b型Eagan菌株的氨基酸序列和流感嗜血杆菌其它菌株相应氨基酸序列。
40.一种免疫原性组合物,包含选自下列的至少一种活性成份:
(A)纯化和分离的核酸分子,它编码嗜血杆菌属菌株转铁蛋白受体蛋白质或转铁蛋白受体蛋白质片段或类似物;
(B)纯化和分离的核酸分子,具有选自下列的DNA序列:
(a)在图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ ID NOS:1、2、3、4、105、108、110、112、114)中列出的任一DNA序列或任一所说序列的互补DNA序列;
(b)一种编码图3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ IDNOS:5、6、7、8、9、10、11、12、106、107、109、111、113、115)中列出的氨基酸序列之一的DNA序列或其互补DNA序列;以及
(c)在严格条件下与(a)或(b)定义的任一DNA序列杂交的DNA序列;
(C)重组转铁蛋白受体蛋白质或其片段或其类似物,可用含有表达载体的转化宿主生产,该表达载体含有(A)或(B)定义的核酸分子和与核酸分子有效耦联的表达装置,用于经宿主表达重组转铁蛋白受体蛋白质或其片段或其类似物;
(D)不含嗜血杆菌属菌株Tbp2蛋白质的嗜血杆菌属菌株分离和纯化的Tbp1蛋白质;
(E)不含嗜血杆菌属菌株Tbp1蛋白质的嗜血杆菌属菌株分离和纯化的Tbp2蛋白质;
(F)一种合成肽,具有不少于6个氨基酸且不超过150个氨基酸,且含有相应于细菌菌株转铁蛋白受体蛋白质的仅一部分或转铁蛋白受体蛋白质类似物的仅一部分的氨基酸序列;
(G)用于将转铁蛋白受体传递给宿主的活载体,包含含有(A)或(B)的核酸分子的载体;
以及一种药用载体,所说的至少一种活性成份在给宿主用药时产生免疫反应。
41.权利要求40的免疫原性组合物,配制成用于体内用药以抵抗由产生转铁蛋白受体的病原菌引起的疾病的疫苗。
42.权利要求40的免疫原性组合物,配制成颗粒、胶囊或脂质体制品。
43.权利要求40的免疫原性组合物,与用于传递给免疫系统特定细胞或粘膜表面的靶分子结合。
44.权利要求40的免疫原性组合物,包含对由产生转铁蛋白受体的多种细菌引起的疾病提供保护的多种活性成份。
45.权利要求40的免疫原性组合物,进一步包含一种佐剂。
46.一种诱导抵抗由产生转铁蛋白受体的病原菌引起的疾病的方法,包含给敏感宿主施用有效量的权利要求40的免疫原性组合物。
47.权利要求46的方法,其中的病原菌是嗜血杆菌属细菌。
48.权利要求46的方法,其中的敏感宿主是人类。
49.权利要求46的方法,其中所说的免疫原性组合物是权利要求44的组合物。
50.一种对权利要求24要求的重组蛋白质,权利要求25或26的分离和纯化的蛋白质,权利要求29所要求的合成肽具有特异性的抗血清或抗体,或权利要求40所要求的免疫原性组合物。
51.用于将转铁蛋白受体传递给宿主的活载体,包含含有权利要求1或12的核酸分子的载体。
52.权利要求51的活载体,其中的载体选自沙门氏菌属、BCG,腺病毒、痘病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒。
53.权利要求51的活载体,其中的载体是脊髓灰质炎病毒且核酸分子编码具有氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO:74)或LEGGFYG(SEQ ID NO:85)的转铁蛋白受体片段。
54.一种质粒载体,具有ATCC保藏号75931的pT7TBP2A、ATCC保藏号75932的pT7TBP2B、ATCC保藏号75933的pT7TBP2C、ATCC保藏号75934的pT7TBP2D的鉴定特征。
55.一种不产生转铁蛋白受体蛋白质的嗜血杆菌属菌株。
56.权利要求55的菌株,其中所说的菌株包含编码失去功能的转铁蛋白受体的基因。
57.权利要求56的菌株,其中的基因经插入突变失去功能。
58.权利要求55的菌株,它是一种减毒的嗜血杆菌属菌株。
59.权利要求51的活载体,其中的载体是权利要求58的减毒菌株。
60.一种生产分离和纯化的嗜血杆菌属菌株Tbp1或Tbp2蛋白质的方法,包含下列步骤:
(a)提供一种以包含体表达Tbp1或Tbp2蛋白质但不同时表达二者的重组宿主;
(b)生长所说的宿主以提供细胞团;
(c)破碎细胞团以提供细胞溶胞产物;
(d)分级分离细胞溶胞产物以提供第一上清和第一沉淀,第一上清基本上包含大部分可溶性宿主蛋白质。
(e)从所说的第一沉淀分离所说的第一上清;
(f)选择性地提取第一沉淀以基本上去掉全部可溶性宿主蛋白质和宿主膜蛋白质以提供第二上清和含包含体的提取沉淀;
(g)从所说的提取沉淀中分离所说的第二上清;
(h)增溶提取沉淀以提供增溶性提取物;以及
(i)分级分离增溶性提取物以提供含Tbp1或Tbp2蛋白质的级分。
61.权利要求60的方法,其中的细胞溶胞产物经离心而分级分离。
62.权利要求61的方法,其中选择性提取第一沉淀的步骤包含至少一种去污剂提取。
63.权利要求62的方法,其中经凝胶过滤分级分离增溶性提取物以提供含所说的Tbp1或Tbp2蛋白质的级分。
64.权利要求63的方法,包括随后透析含Tbp1或Tbp2蛋白质的级分以去掉至少所说的去污剂以提供进一步纯化的Tbp1或Tbp2蛋白质溶液。
65.权利要求60的方法,其中所说的嗜血杆菌属菌株是流感嗜血杆菌菌株。
66.权利要求22的宿主,其中所说的宿主是以所说的表达载体遗传修饰的嗜血杆菌属菌株。
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