FR3053689A1 - Polypeptides substrats des proteases de la famille des astacines et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un polypeptide substrat d'au moins une protéase de la famille des astacines, comprenant un enchaînement des peptides suivants : - (1) un peptide espaceur 'ESP 1' d'une taille comprise entre 0 et 50 résidus d'acides aminés; - (2) un peptide 'FLUO' comprenant un site accepteur d'une molécule fluorescente ; - (3) un peptide espaceur 'ESP 2' d'une taille comprise entre 0 et 30 acides aminés ; - (4) un peptide 'CIBLE' comprenant un site de clivage spécifique d'une protéase de la famille des astacines, caractérisé en ce que le clivage dudit polypeptide par une protéase de la famille des astacines génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide 'FLUO' et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et ledit polypeptide étant d'au moins 1/4.
Description
Titulaire(s) : UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON I Etablissement public, CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Etablissement public.
Demande(s) d’extension
Mandataire(s) : REGIMBEAU.
FR 3 053 689 - A1 (54) POLYPEPTIDES SUBSTRATS DES PROTEASES DE LA FAMILLE DES ASTACINES ET LEURS UTILISATIONS.
©) La présente invention se rapporte à un polypeptide substrat d'au moins une protéase de la famille des astacines, comprenant un enchaînement des peptides suivants :
- (1) un peptide espaceur 'ESP T d'une taille comprise entre 0 et 50 résidus d'acides aminés;
- (2) un peptide 'FLUO' comprenant un site accepteur d'une molécule fluorescente;
- (3) un peptide espaceur 'ESP 2' d'une taille comprise entre 0 et 30 acides aminés ;
- (4) un peptide 'CIBLE' comprenant un site de clivage spécifique d'une protéase de la famille des astacines, caractérisé en ce que le clivage dudit polypeptide par une protéase de la famille des astacines génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide 'FLUO' et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et ledit polypeptide étant d'au moins 1/4.
TITRE DE L’INVENTION
Polypeptides substrats des protéases de la famille des astacines et leurs utilisations.
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se rapporte à un polypeptide substrat d’au moins une protéase de la famille des astacines.
Plus particulièrement, le polypeptide substrat comprend des peptides espaceur, un site accepteur d’une molécule fluorescente et un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines, ledit polypeptide étant adapté pour observer un signal de polarisation de fluorescence après clivage par ladite protéase.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les collagènes fibrillaires sont les principaux composants de la matrice extracellulaire (MEC) et l'équilibre entre leur synthèse et leur dégradation est un facteur important pour le maintien de l'intégrité structurale et fonctionnelle des tissus conjonctifs comme la peau, la cornée, les tendons, les cartilages, les os, le cœur, les reins, les poumons et le foie.
Les collagènes fibrillaires sont synthétisés sous la forme de précurseurs solubles, appelés pro-collagènes, lesquels doivent subir une maturation protéolytique pour s’assembler en fibrilles. Les protéases « Bone Morphogenetic Protein-1 (BMP-1)/Tolloidlike proteases » (BTPs), aidées par leurs activateurs spécifiques de la famille des « Procollagen Ç-Proteinase Enhancers » (PCPEs), sont les principales protéases responsables de la libération du domaine C-terminal (« C-propeptide ») des pro-collagènes, qui est l'étape limitante de la formation des fibrilles de collagènes, appelée encore fibrillogenèse des collagènes.
Les protéases de la famille des BTPs ont des substrats additionnels tels que des enzymes de réticulation et des facteurs de croissance, notamment impliqués dans la production et le dépôt de la matrice extracellulaire. Des travaux récents ont montré que d'autres protéases de la famille des astacines, telles que les méprines, peuvent également participer à la maturation de la matrice extracellulaire.
Le rôle majeur des protéases de la famille des astacines dans l'assemblage du collagène en fait des cibles attractives pour le traitement de diverses maladies liées au collagène, en particulier les fibroses, qui sont à l’origine de 45 % des décès, toutes causes confondues, dans le monde entier.
Les fibroses sont caractérisées par un dépôt excessif de collagène, résultant en une rigidification du tissu concerné qui entrave son fonctionnement normal et peut conduire à la mort des patients lorsque les organes vitaux sont touchés.
Par ailleurs, d'autres types de désordres, comme par exemple les plaies chroniques ou l’arthrose, se caractérisent par une matrice collagénique défectueuse, due à un déficit de synthèse ou un excès de dégradation.
De plus en plus de données de la littérature montrent aussi l’implication des activateurs de la famille des PCPEs dans le développement des fibroses. Les activateurs PCPEs stimulent jusqu’à 10 fois la maturation protéolytique des pro-collagènes fibrillaires par les protéases BTPs, sans affecter les autres activités de ces protéases. Ils exercent leur activité en se liant de façon forte et spécifique à l’extrémité C-terminale des procollagènes.
Comme les protéases BTPs, ils représentent des cibles thérapeutiques intéressantes pour traiter les pathologies associées à une dérégulation de la fibrillogenèse des collagènes. Il a par exemple été montré qu’en cas de de fibrose cardiaque ou de cicatrisation pathologique de la cornée, conduisant à la formation d’opacités d’origine fibrotique, la protéase BMP-1 et l’activateur PCPE-1 sont tous deux surexprimés.
De plus, une analyse d’expression génique a mis en évidence que les variations de l’expression du gène codant pour l’activateur PCPE-1 sont celles qui sont les mieux corrélées avec la fibrose du foie, parmi un panel de 67 gènes prédits pour y être associés. Enfin, des souris déficientes en l’activateur PCPE-2 dans lesquelles une fibrose cardiaque a été induite présentent une diminution significative de la quantité de collagène qui se dépose au niveau du cœur.
A ce jour, plusieurs tests d’activité quantitatifs permettent de mesurer l’activité des protéases BTPs, notamment dans des échantillons biologiques prélevés sur des patients. Cependant, chacun d’entre eux possèdent des contraintes qui limitent leurs applications.
Par exemple, on peut suivre le clivage du pro-collagène I radioactif sur gel ou par scintillation liquide, mais ce test « historique » fonctionne à des points temporels fixes, et pose des problèmes de sécurité et de disponibilité du substrat radioactif. Au vu des contraintes associées à l’utilisation de la radioactivité, il est de nos jours difficile d’imaginer un test de routine sur la base de ce substrat radioactif.
Plusieurs peptides fluorogéniques émettant de la fluorescence après leur clivage par la protéase BMP-1 et libération du groupement « quencher », sont également commercialisés. Ces substrats sont bien adaptés au suivi de l’activité des protéases BTPs. Cependant, leur clivage ne permet pas de suivre l’activité des activateurs de la famille des PCPEs, étant donné que ce ne sont pas des substrats de type pro-collagénique. Ce test n’est donc d’aucune utilité pour l’étude de l’influence des activateurs PCPEs sur l’activité des protéases BTPs. Par ailleurs, ces substrats ne sont pas spécifiques des astacines, puisqu’ils ont été développés pour d’autres protéases comme les caspases.
Enfin, il est également possible de quantifier l’activité de la protéase BMP-1 sur gel d’électrophorèse en utilisant un colorant fluorescent qui se fixe aux protéines, tel que le SYPRO® Ruby. Néanmoins, cette méthode analyse le résultat en points temporels fixes, et ne permet donc pas de suivre en continu l’activité enzymatique. De plus, une étape de coloration/décoloration des gels assez longue est nécessaire, et celle-ci peut présenter des résultats variables en termes de rapport signal sur bruit. Finalement, l’analyse des résultats par quantification sur gel est également source de biais, et surtout relativement fastidieuse en vue de la perspective de criblage d’inhibiteurs de l’activation par les activateurs de la famille des PCPEs.
Ainsi, il n’existe pas, à ce jour, de molécule capable d’inhiber la stimulation du clivage des pro-collagènes fibrillaires par les protéases de la famille des astacines, en présence des activateurs PCPEs. Une meilleure compréhension de cette activité enzymatique, et la mise au point d’inhibiteurs spécifiques, pourraient permettre de mieux évaluer l’importance du rôle biologique des activateurs PCPEs dans le processus fibrotique.
Il existe donc un besoin de disposer d’un test quantitatif capable de mesurer l’activité des protéases de la famille des astacines, notamment des protéases BTPs, et l’effet de leurs activateurs PCPEs. Idéalement, ce test quantitatif permet une mesure sensible et continue de l’activité des protéases BTPs et de leurs activateurs PCPEs dans des échantillons biologiques. Ce test se voudra simple d’utilisation et utilisable en routine.
RESUME DE L’INVENTION
Selon un premier aspect, l’invention se rapporte à un polypeptide substrat d’au moins une protéase de la famille des astacines, comprenant un enchaînement des peptides suivants :
- (1) un peptide espaceur ‘ESP 1’ d’une taille comprise entre 0 et 50 résidus d’acides aminés ;
- (2) un peptide ‘FLUO’ comprenant un site accepteur d’une molécule fluorescente ;
- (3) un peptide espaceur ‘ESP 2’ d’une taille comprise entre 0 et 30 acides aminés ;
- (4) un peptide ‘CIBFE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines, caractérisé en ce que le clivage dudit polypeptide par une protéase de la famille des astacines génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FFUO’ et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et ledit polypeptide étant d’au moins 1/4.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un conjugué fluorescent comprenant le polypeptide substrat tel que défini dans la présente description, couplé de manière covalente à une molécule fluorescente, sur le site accepteur d’une molécule fluorescente du peptide ‘FFUO’ compris dans ledit polypeptide substrat.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à une utilisation d’un polypeptide substrat selon la description ou d’un conjugué fluorescent selon la description pour la quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines contenue dans un échantillon.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un procédé de quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la description, dans des conditions compatibles avec l’observation d’une activité de ladite protéase ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte aussi à un procédé de quantification de la modulation de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, en présence d’un modulateur de ladite activité, comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la description, en présence d’un modulateur de ladite activité, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte aussi à une utilisation d’un polypeptide substrat ou d’un conjugué fluorescent, tels que définis dans la présente description, pour le criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un procédé de criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la description, en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte à un procédé de criblage d’un agoniste ou d’un antagoniste d’un modulateur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la présente description, en présence d’un modulateur de l’activité de ladite protéase et en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Un autre aspect de l’invention se rapporte à un kit comprenant :
- un conjugué fluorescent selon la description ;
- des réactifs permettant la mesure d’un signal de polarisation de fluorescence ; et optionnellement,
- un modulateur de l’activité d’une protéase de la famille des astacines ; et optionnellement,
- une protéase de ladite famille.
Selon un autre aspect, l’invention concerne aussi une utilisation d’un polypeptide substrat ou d’un conjugué fluorescent, tel que défini dans la présente description, pour le diagnostic d’une pathologie impliquant une modification de l’expression ou de l’activité d’une protéase de la famille des astacines ou une modification de l’expression ou de l’activité d’un modulateur des protéases de la famille des astacines.
LEGENDES DES FIGURES
FIGURE 1 : Schéma illustrant le plasmide pHLsec comprenant la construction CPIII-long-TGase. Les sites de restrictions ayant servis au clonage (Agel et Xhol) sont indiqués en italique. Le substrat CPIII long est notamment décrit dans Bourhis et al. (PNAS ; 2013, 110(16):6394-6399). « TGase » correspond au site accepteur de la molécule fluorescente (peptide ‘FLUO’) ; « TAG 6 His » correspond au peptide espaceur ‘ESP2’ ; « CPIII long » correspond au peptide ‘CIBFE’.
FIGURE 2 : Schéma illustrant le marquage enzymatique catalysé par la transglutaminase (schéma d’après Taki et al, Protein Eng. Des. Sel. ; 2004 ; 17(2) : 119126). Fa transglutaminase catalyse une réaction conduisant au pontage covalent entre la molécule fluorescente FITC-Cadavérine et le polypeptide substrat, au site accepteur de la molécule fluorescente du peptide ‘FLUO’. Fa séquence HQSYVDPW (SEQ ID NO : 21 ; appelée « TGase » par la suite) introduite au niveau de l’extrémité N-terminale du polypeptide substrat sert de peptide ‘FLUO’, car il consiste en un site de accepteur de la molécule fluorescente, substrat spécifique à la transglutaminase.
FIGURE 3 : Schéma illustrant le couplage d’une protéine (« R ») à la Sepharose. Le couplage est réalisé à partir du ε-ΝΕΕ des résidus lysyls de l’activateur PCPE-l-His par formation d’une liaison iso-urée avec la Sepharose (à pH basique). Schéma d’après le site web : http://www.emelcabio.com/contents/en-us/p21965_CNBractivated_Separopore_6B .html.
FIGURE 4 : Schéma illustrant l’excitation des molécules fluorescentes (masse arrondie grisée) par une lumière polarisée horizontalement (flèche avec sinusoïde). Les molécules sont plus ou moins excitées selon leur orientation vis-à-vis de la lumière : aucune absorption de lumière avec une orientation perpendiculaire (flèche vers le haut ou vers le bas), absorption maximale avec une orientation parallèle (flèche vers la droite ou la gauche).
FIGURE 5 : Schéma illustrant un polypeptide substrat d’une protéase de la famille des astacines, selon l’invention. (A) Le polypeptide substrat est constituée (1) de la séquence « TGase » (HQSYVDPW ; SEQ ID NO : 21 ; peptide ‘FLUO’), (2) de l’étiquette 6-histidines (HHHHHH ; SEQ ID NO : 7 ; espaceur ‘ESP2’), (3) des 3 derniers triplets de la triple hélice de collagène III (GPPGPPGAP ; SEQ ID NO : 28), du domaine C-télopeptide (GPCCGGVCAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG ; SEQ ID NO : 29) et du domaine C-propeptide (DEPMDFKINTDE...QEFGVDVGPVCFL ; SEQ ID NO: 30), formant tout trois le peptide ‘CIBLE’. Le site de clivage par la protéase BMP-1 est représenté par une flèche dirigée vers le bas, et les ponts disulfures interchaînes sont représentés par « S- S ». (B) Le fluorophore est représenté par le triangle (1), le site ‘FLUO’ comprenant un site accepteur d’une molécule fluorescente par le carré (2) et le peptide ‘CIBLE’ comprenant un site de clivage par la protéase BMP-1 par la structure en forme de trèfle (3). Après clivage par la protéase BMP-1 deux fragments peptidiques de tailles distinctes sont générés (1-2-3’) et (‘3).
FIGURE 6 : Purification par affinité sur résine cobalt du polypeptide substrat CPIII-long-TGase. (A) Chromatogramme de la purification. Deux étapes de lavages ont été réalisées entre 50 et 80 mL (en présence de 10 mM d’imidazole) puis entre 80 et 120 mL (20 mM d’imidazole). L’élution a été réalisée par un gradient de tampon d’élution. (B) Analyse de la purification par SD S-PAGE (gradient 4-20 % acrylamide) en conditions non réductrices (Elution ; pistes 5-8). SN (piste 1) est le surnageant de culture initial, NR (piste 2) est la fraction « non retenue » par la résine de cobalt, Ll (piste 3) et L2 (piste 4) sont les 2 étapes de lavages.
FIGURE 7 : Purification par filtration sur gel S200 16/600 du polypeptide substrat CPIII-long-TGase. (A) Diagramme illustrant le chromatogramme de la purification. (B) Analyse par SDS-PAGE (8 % d’acrylamide), en condition réductrices (avec DTT ; piste 2) ou non réductrices (sans DTT ; piste 1).
FIGURE 8 : Clivage du polypeptide substrat CPIII-long-TGase par la protéase BMP-1. 300 nM du polypeptide substrat CPIII-long-TGase ont été incubées in vitro durant lh à 37 °C en présence (pistes 4 et 5) ou non (pistes 1 à 3) de 300 nM de l’activateur PCPE-1 et de la protéase BMP-1 aux concentrations indiquées sur la figure (0 nM, piste 1 ; 5 nM, pistes 2 et 5 ; 13 nM, piste 3 ; et 1 nM, piste 4). Analyse des résultats par SDS-PAGE (8 % d’acrylamide) en conditions non réductrices, coloration au SYPRO Ruby et révélation par un scanner de fluorescence Typhoon FLA9500.
FIGURE 9 : Diagrammes illustrant la comparaison du clivage par la protéase BMP-1 du polypeptide CPIII-long (1), c’est-à-dire ne possédant pas le peptide ‘FLUO’ TGase, et du polypeptide substrat CPIII-long-TGase (2). 300 nM de substrat ont été incubés in vitro durant lh à 37 °C en présence de la protéase BMP-1 à la concentration de 1 nM (en présence de 300 nM de l’activateur PCPE-1 ; panel de droite) ou de 5 nM (en absence de l’activateur PCPE-1 ; panel de gauche). Les échantillons ont ensuite été analysés par SDS-PAGE puis colorés au SYPRO Ruby. Le taux de clivage est obtenu par analyse densitométrique du rapport des bandes « (CPIII) / (CPIII + CPIII-long-TGase) ». Les écarts type ont été mesurés sur des triplicats.
FIGURE 10 : Diagramme illustrant la mesure par DLS du diamètre moyen et de la polydispersité des molécules au sein de différents échantillons du polypeptide CPIIIlong. Courbe de DLS pour le polypeptide substrat CPIII-long-TGase. Les Résultats de DLS sur la moyenne de 3 réplicats pour chaque protéine testée sont reportés dans le Tableau 2.
FIGURE 11 : Courbes de dichroïsme circulaire obtenues entre 190 et 260 nm, pour le polypeptide substrat CPIII-long-TGase et le polypeptide CPIII-long. Les estimations de la proportion de chaque type de structures secondaires par le logiciel Dichroweb sont reportées dans le Tableau 3.
FIGURE 12 : Optimisation de l’efficacité du marquage. Le marquage de 7,5 μΜ du polypeptide substrat CPIII-long-TGase a été réalisé en présence de 0,005 unité de transglutaminase et de 1 mM de la molécule fluorescente FITC-Cadavérine pour un volume réactionnel de 25 pL. Le temps (2 h ; pistes 1, 4, 7, 11, 14, 17 ; 6 h, pistes 2, 5, 8, 12, 15 et 18 ; 18 h, pistes 3, 6, 9, 13, 16 et 19) et la température d’incubation (4 °C, pistes 1 à 3 et 11 à 13 ; 20° C, pistes 4 à 6 et 14 à 16 ; 37 °C, pistes 7 à 9 et 17 à 19) varient selon les conditions indiquées sur la figure. T (pistes 10 et 20) représente le marquage témoin du polypeptide CPIII-long ne disposant pas de l’étiquette TGase (peptide ‘FLUO’). (A) Analyse de la fluorescence de la protéine par SDS-PAGE (13 % d’acrylamide) en conditions réductrices révélée par un scanner de fluorescence (pistes 1 à 10) et coloration du même gel au bleu de Coomassie (pistes 11 à 20). (B) Résultats de la quantification de l’intensité de fluorescence de 3 expériences indépendants, les valeurs brutes de fluorescence de chaque échantillon ont été normalisées par rapport à la valeur de fluorescence de l’échantillon n°2.
FIGURE 13 : Optimisation de la spécificité du marquage du polypeptide substrat par une molécule fluorescente. Le marquage de 7,5 μΜ du polypeptide substrat CPIII-long-TGase a été réalisé en présence de 0,005 unité de transglutaminase et de 1 mM de la molécule fluorescente FITC-Cadavérine pour un volume réactionnel de 25 pL. Le temps et la température d’incubation varient selon les conditions indiquées sur la figure. Après marquage fluorescent, les échantillons sont incubés en présence (+) ou en absence () de 125 nM de la protéase BMP-1. Le «témoin» est le polypeptide CPIII-long sans étiquette TGase (c’est-à-dire sans peptide ‘FLUO’). (A) Analyse de la fluorescence de la protéine par SDS-PAGE (13 % d’acrylamide) en conditions réductrices révélée par un scanner de fluorescence (images du haut), et coloration du même gel au bleu de Coomassie (images du bas). (B) Quantification du taux de marquage non spécifique, correspondant au rapport « fluorescence du CPIII / fluorescence du CPIII-long-TGase », sur 3 expériences indépendantes.
FIGURE 14 : Analyse par SDS-PAGE de la purification par filtration sur gel du conjugué CPIII-long-TGase-FITC. Les différentes fractions sont analysées en conditions non réductrices sur un gel 8 % révélé par un scanner de fluorescence.
ίο
FIGURE 15 : Purification du conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC sur colonne Sepharose-PCPE-1. L’échantillon issu du marquage fluorescent est chargé sur la colonne afin que le conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC se fixe par affinité à l’activateur PCPE-1. Des étapes de lavages sont réalisées avec le tampon d’équilibration (pistes 2 à 4 et 11 à 13). Le conjugué est élué au moyen d’un tampon Glycine 0,1 M pH 2,5 (pistes 5 à 9 et 14 à 18). Analyse par SDS-PAGE (8 % d’acrylamide ; pistes 1 à 9) en conditions non réductrices révélée par un scanner de fluorescence (NR : fraction non retenue, piste 1). Coloration du même gel au bleu de Coomassie (pistes 10 à 18).
FIGURE 16 : Vérification du clivage par la protéase BMP-1 du conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC. 500 nM du conjugué fluorescent CPIII-long-TGaseFITC ont été incubés in vitro durant 2h à 37 °C en présence (pistes 3, 4, 6 et 7) ou non (pistes 2 et 5) de 125 nM de la protéase BMP-1 et en présence (pistes 4 et 7) ou non (pistes 2, 3, 5 et 6) de 500 nM de l’activateur PCPE-1. Analyse par SDS-PAGE (12 % d’acrylamide ; pistes 1 à 4) en conditions réductrices et coloration au bleu de Coomassie. Même gel révélé par un scanner de fluorescence (pistes 5 à 7).
FIGURE 17 : Suivi de l’activité de la protéase BMP-1 sur le conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC (« CPIII-FITC ») par polarisation de fluorescence. A l’intérieur d’un polarimètre, 400 nM de conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC ont été incubés durant 3h à 37 °C en présence (courbes 3 et 4) ou non (courbes 1 et 2) de 7 nM de la protéase BMP-1 et en présence (courbes 1 et 4) ou non (courbes 2 et 3) de 400 nM de l’activateur PCPE-1. Les résultats bruts sont représentés par les courbes 1 à 4.
FIGURE 18 : Suivi de l’activité de la protéase BMP-1 sur le conjugué fluorescent CPIII-long-Dylight488 par polarisation de fluorescence. A l’intérieur d’un polarimètre, 100 nM de conjugué fluorescent CPIII-long-Dylight488 ont été incubés durant 2h à 37 °C en présence (courbes 2 et 3) ou non (courbe 1) de 10 nM de la protéase BMP-1 et en présence (courbe 3) ou non (courbes 1 et 2) de 100 nM de l’activateur PCPE-1.
FIGURE 19 : Diagrammes illustrant l’évaluation de la valeur de kcat/Km sur les cinétiques mesurées par polarisation de fluorescence. A l’intérieur d’un polarimètre, 400 nM de conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC (« CPIII-FITC ») ont été incubés durant 3h à 37 °C en présence ou non de 7 nM de la protéase BMP-1 et en présence ou non de 400 nM de PCPE-1. Les résultats obtenus ont été normalisés et transformés en concentrations de produit formé en fonction du temps d’incubation. Les courbes expérimentales (courbe 1 : protéase BMP-1 + activateur PCPE-1 ; courbe 2 : protéase BMP-1) sont obtenues par lissage sur 10 points voisins et tracées par intégration de l’équation de Michaelis-Menten (en noir) avec le logiciel Prism.
FIGURE 20 : Observation par polarisation de fluorescence de l’inhibition de l’activité de la protéase BMP-1 par l’inhibiteur « Sizzled ». A l’intérieur d’un polarimètre, 400 nM conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC (« CPIII-FITC ») ont été incubés durant 3h à 37 °C en présence (courbes 2 et 4) ou non (courbes 1 et 3) de 14 nM de la protéase BMP-1 et en présence (courbes 3 et 4) ou non (courbes 1 et 2) de 140 nM de l’inhibiteur « Sizzled ».
FIGURE 21 : Observation par polarisation de fluorescence de l’inhibition de l’activité de la protéase BMP-1 par l’inhibiteur « 33A». A l’intérieur d’un polarimètre, 400 nM conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC (« CPIII-FITC ») ont été incubées durant 3h à 37 °C en présence (courbes 2, 3 et 4) ou non (courbe 1) de 14 nM de la protéase BMP-1, de 20 nM de l’inhibiteur « 33A » (courbe 3) ou de 200 nM de l’inhibiteur «33A» (courbe 4). L’activité enzymatique a été suive par polarisation de fluorescence puis les résultats obtenus ont été normalisés et transformés en concentrations de produit formé en fonction du temps d’incubation : les courbes dans l’insert situé en haut à droite dans la figure sont obtenues par lissage sur 10 points voisins (les courbes 1, 2 et 3 ont la même signification que ci-dessus).
FIGURE 22 : Détermination de l’affinité de l’activateur PCPE-1 pour le conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC. A l’intérieur d’un polarimètre, 250 nM de conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC ont été incubés à 37 °C en présence d’une concentration croissante de l’activateur PCPE-1 (0 nM (courbe 5), 125 nM (courbe 4), 250 nM (courbe 3), 1000 nM (courbe 2) et 2000 nM (courbe 1)). (A) L’augmentation du signal entre chaque courbe est due à l’interaction croissante des 2 protéines. Le signal est suivi pendant 40 minutes afin de pouvoir moyenner les écarts entre chaque concentration testée. Quelques courbes lissées représentatives ont été tracées ici. (B) Les résultats obtenus ont été normalisés et transformés en concentrations de protéines liées afin de déterminer le KD grâce à la courbe de saturation de la liaison. Les écarts types ont été calculés sur des triplicats.
FIGURE 23 : Mesure de l’activité de la protéase BMP-1 contenue dans un échantillon complexe de protéines. A l’intérieur d’un polarimètre, 250 nM de conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC ont été incubés durant 3h à 37 °C en présence (courbes 2 à 5) ou non (courbe 1) de 10 μ g de protéines contenues dans différents surnageants de culture (cellules HT 1080 non transfectées (HT1080-NT) : courbes 2 et 3 ; cellules HT 1080 transfectées par une construction codant pour la protéase BMP-1 (HT1080-BMP-1) : courbes 4 et 5 ; en présence (courbes 2, 4) ou non (courbes 1, 3, 5) de 10 μΜ de l’inhibiteur « 33A ». (A) L’activité enzymatique a été suive par polarisation de fluorescence. (B) Les résultats obtenus ont été normalisés et transformés en concentration de produit formé en fonction du temps puis les courbes ont été lissées sur 10 points voisins via Prism. (C) Une analyse SDS-PAGE de contrôle a été effectuée sur les échantillons en point final (SN = surnageant).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les inventeurs ont mis au point un test quantitatif permettant de mesurer l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, comme par exemple une protéase BTP, ainsi que l’effet des modulateurs de ladite activité, comme par exemple les activateurs PCPEs. A titre illustratif, la protéase BMP-1 et l’activateur PCPE-1 ont été mis en œuvre, mais le test est applicable à d’autres protéases de ladite famille, et à d’autres activateurs.
Le polypeptide substrat modèle choisi comme exemple comprend un peptide ‘CIBLE’ consistant en un dérivé du pro-collagène III, trimérique, et dont le clivage par la protéase BMP-1 est augmenté par l’activateur PCPE-1. Ce peptide ‘CIBLE’ est appelé « CPIII-long », et ne contient plus que les domaines C-propeptidique, C-télopeptidique et les trois derniers triplets GXY de la triple hélice du procollagène III (Bourhis et al. ; PNAS ; 2013, 110(16) :6394-6399).
De manière remarquable, le test qui a été mis au point permet le suivi en continu de la cinétique de clivage d’un polypeptide substrat comprenant le peptide ‘CIBLE’ « CPIII-long » par polarisation de fluorescence.
• Polypeptides
Un premier aspect de l’invention concerne un polypeptide substrat d’au moins une protéase de la famille des astacines, comprenant un enchaînement des peptides suivants :
- (1) un peptide espaceur ‘ESP 1’ d’une taille comprise entre 0 et 50 résidus d’acides aminés ;
- (2) un peptide ‘FLUO’ comprenant un site accepteur d’une molécule fluorescente ;
- (3) un peptide espaceur ‘ESP 2’ d’une taille comprise entre 0 et 30 acides aminés ;
- (4) un peptide ‘CIBLE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines, caractérisé en ce que le clivage dudit polypeptide par une protéase de la famille des astacines génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FLUO’ et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et ledit polypeptide étant d’au moins 1/4.
Dans un mode de réalisation, le sens directionnel de l’enchaînement consécutif ou non consécutif des peptides ‘ESPl’, ‘FLUO’, ‘ESP2’ et ‘CIBLE’ est représenté par le sens conventionnel, c’est-à-dire le sens N-terminal vers C-terminal.
Dans un mode de réalisation particulier, le sens directionnel de l’enchaînement consécutif des peptides ‘ESPl’, ‘FLUO’, ‘ESP2’ et ‘CIBLE’ est représenté par le sens N-terminal vers C-terminal.
Dans un autre mode de réalisation, le sens directionnel de l’enchaînement consécutif ou non consécutif des peptides ‘ESPl’, ‘FLUO’, ‘ESP2’ et ‘CIBLE’ est représenté par le sens inverse du sens conventionnel, c’est-à-dire le sens C-terminal vers N-terminal.
Autrement dit, ces quatre peptides sont enchaînés selon toutes les combinaisons d’ordre possibles, sous réserve qu’après clivage, deux fragments peptidiques soient générés, un premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FLUO’ et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et le polypeptide substrat non clivé étant d’au moins 1/4.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « protéase de la famille des astacines » inclut la protéase ovastacine ; les protéases de la famille des BTPs (« BMP1/Tolloid-like proteases» ou protéases «tolloïdes»), incluant la protéase BMP-1 (Bone Morphogenetic Protein-1), la protéase mTLD (mammalian Tolloid), la protéase mTLL-1 (mammalian Tolloid-like 1), la protéase mTLL-2 (mammalian Tolloid-like 2) ; les protéases de la famille des méprines, incluant la méprine alpha et la méprine béta, ainsi que toutes les protéases de la famille des astacines telles qu’elles sont définies dans GomisRüth et al. (Biol. Chem. 2012 ; 393 :1027-1041).
Il est entendu que le polypeptide de l’invention est le substrat d’au moins une protéase de la famille des astacines, mais qu’il pourra également être le substrat d’au moins deux, trois, quatre ou plus de différentes protéases de cette famille.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéase de la famille des astacines est une protéase de la famille des protéases BTPs, en particulier la protéase BMP-1.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « un peptide espaceur ‘ESP Γ d’une taille comprise entre 0 et 50 résidus d’acides aminés » doit être compris comme englobant un peptide d’une taille de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49 et 50 résidus d’acides aminés.
Dans un mode de réalisation, le peptide espaceur ‘ESPl’ a une taille comprise entre 0 et 25 résidus d’acides aminés, de préférence une taille comprise entre 0 et 10 résidus d’acides aminés.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « un peptide espaceur ‘ESP 2’ d’une taille comprise entre 0 et 30 résidus d’acides aminés » doit être compris comme englobant un peptide d’une taille de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 et 30 résidus d’acides aminés.
Dans un mode de réalisation, le peptide espaceur ‘ESP2’ a une taille comprise entre 0 et 20 résidus d’acides aminés, de préférence une taille comprise entre 0 et 10 résidus d’acides aminés.
Par « espaceur», il est désigné des peptides espaceurs ‘ESPl’ et ‘ESP2’ qui permettent d’espacer et donc de limiter l’encombrement stérique entre, d’une part, le peptide ‘FLE1O’, et d’autre part, le peptide ‘CIBLE’. Ainsi, la liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et une molécule fluorescente, d’une part, et le clivage du peptide ‘CIBLE’ par la protéase, d’autre part, sont mis en œuvre sans interférences stériques.
Dans certains modes de réalisation, les espaceurs ‘ESPl’ et/ou ‘ESP2’ ont une taille égale à 0 acide aminé. Dans ces modes de réalisation, l’espaceur ‘ESPl’ est absent, ou bien l’espaceur ‘ESP2’ est absent, ou bien encore les espaceurs ‘ESPl’ et ‘ESP2’ sont tous les deux absents.
Dans certains modes de réalisation, l’espaceur ‘ESPl’, ou bien l’espaceur ‘ESP2’, ou bien les espaceurs ‘ESPl’ et ‘ESP2’ comprennent un enchaînement aléatoire d’acides aminés, étant entendu que cet enchaînement d’acides aminés est inerte par rapport aux propriétés des autres peptides compris dans le polypeptide substrat.
Dans le cadre de l’invention, il est entendu par « inerte » qu’aucun des peptides ‘ESPl’ et ‘ESP2’, lorsqu’il est présent dans le polypeptide substrat, n’affecte les propriétés de marquage par une molécule fluorescente, ni le clivage par une protéase de la famille des astacines.
En d’autres termes, il est entendu que ni l’espaceur ‘ESPl’, ni l’espaceur ‘ESP2’, n’est adapté pour comprendre un site accepteur d’une molécule fluorescente, ni adapté pour comprendre un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide espaceur ‘ESPl’ et/ou le peptide espaceur ‘ESP2’ comprennent une étiquette de marquage, laquelle facilite notamment les étapes de purification.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « étiquette de marquage » désigne notamment une séquence peptidique, reconnue de manière spécifique par un composé, tel qu’un anticorps ou un composé inorganique, par exemple le nickel.
De manière non limitative, une étiquette de marquage adaptée à l’invention désigne notamment une étiquette « Avi » (GLNDIFEAQKIEWHE ; SEQ ID NO : 1), une étiquette « calmoduline » (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL ; SEQ ID NO : 2), une étiquette « polyglutamate » (EEEEEE ; SEQ ID NO : 3), une étiquette « E » (GAPVPYPDPLEPR ; SEQ ID NO : 4), une étiquette FLAG (DYKDDDDK ; SEQ ID NO : 5), une étiquette « HA » (YPYDVPDYA ; SEQ ID NO : 6), une étiquette « His » (HHHHHH ; SEQ ID NO : 7), une étiquette « Myc » (EQKLISEEDL ; SEQ ID NO : 8), une étiquette « S » (KETAAAKFERQHMDS ; SEQ ID NO : 9), une étiquette « SBP » (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP ; SEQ ID NO : 10), une étiquette « Softag 1 » (SLAELLNAGLGGS ; SEQ ID NO : 11), une étiquette « Softag 3 » (TQDPSRVG ; SEQ ID NO : 12), une étiquette « Strep » (WSHPQFEK ; SEQ ID NO : 13), une étiquette « TC » (CCPGCC ; SEQ ID NO : 14), une étiquette « V5 » (GKPIPNPLLGLDST ; SEQ ID NO: 15), une étiquette « VSV » (YTDIEMNRLGK; SEQ ID NO: 16), une étiquette « Xpress » (DLYDDDDK ; SEQ ID NO: 17), une étiquette «Isopeptag» (TDKDMTITFTNKKDAE; SEQ ID NO: 18), une étiquette « Spy » (AHIVMVDAYKPTK; SEQ ID NO: 19), une étiquette « Snoop » (KLGDIEFIKVNK ; SEQ ID NO : 20).
Dans le cadre de la présente invention, l’expression « site accepteur d’une molécule fluorescente » désigne une séquence peptidique capable de réaliser une liaison covalente avec une molécule fluorescente, de façon spécifique et orientée, notamment en présence d’une enzyme adaptée pour la réalisation d’une telle liaison covalente.
Dans le cadre de la présente description, les expressions « réalisation d’une liaison covalente avec une molécule fluorescente » et « marquage fluorescent » sont équivalentes et peuvent être utilisées de manière indifférente.
Dans le cadre de l’invention, les termes « molécule fluorescente » et « fluorophore » sont équivalents et peuvent être indifféremment utilisés.
Dans un mode de réalisation préféré, la liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et la molécule fluorescente est réalisée de manière enzymatique, en particulier au moyen d’une sortase, d’une ligase ou d’une transférase. Une telle méthode de marquage fluorescent par voie enzymatique permet avantageusement de lier la molécule fluorescente de manière spécifique et orientée sur un site accepteur localisé sur le polypeptide substrat, au contraire d’un marquage fluorescent par voie chimique.
A titre illustratif, une liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et la molécule fluorescente peut être réalisée selon les principes décrits par Lotze et al. (Mol BioSyst. 2016 May 24; 12(6): 1731-45) ou par Sunbul et Yin (Org Biomol Chem, 2009, 7, 33613371).
Dans un mode de réalisation, le peptide ‘FLUO’ consiste en un site accepteur d’une molécule fluorescente, de préférence un site accepteur comprenant une séquence d’acides aminés telle que listée dans Lotze et al. (Mol BioSyst. 2016 May 24; 12(6): 173145).
Dans un premier mode de réalisation, la liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et la molécule fluorescente est réalisée au moyen d’une sortase, en particulier la sortase A.
A titre illustratif, lorsque la sortase est la sortase A, le site accepteur d’une molécule fluorescente comprend la séquence d’acides aminés LPXTG (SEQ ID NO : 75), dans laquelle X représente n’importe quel acide aminé.
Dans un deuxième mode de réalisation, la liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et la molécule fluorescente est réalisée au moyen d’une ligase, en particulier, une biotine ligase, une acide lipoïque ligase ou une tubuline tyrosine ligase.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la ligase est la biotine ligase, le site accepteur d’une molécule fluorescente comprend la séquence d’acides aminés GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO : 76).
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la ligase est l’acide lipoïque ligase, le site accepteur d’une molécule fluorescente comprend une séquence d’acides aminés choisie dans un groupe comprenant DEVLVEIETDKAVLEVPGGEEE (SEQ ID NO : 77) et GFEIDKVWYDLDA (SEQ ID NO : 78).
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la ligase est la tubuline tyrosine ligase, le site accepteur d’une molécule fluorescente comprend la séquence d’acides aminés VDSVEGEGEEEGEE (SEQ ID NO : 79).
Dans un troisième mode de réalisation, la liaison covalente entre le peptide ‘FLUO’ et la molécule fluorescente est réalisée au moyen d’une transférase, en particulier, une phosphopantéthéinyl transférase ou une transglutaminase.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque la transférase est la phosphopantéthéinyl transférase, le site accepteur d’une molécule fluorescente comprend une séquence d’acides aminés choisie dans un groupe comprenant DSLEFIASKLA (SEQ ID NO : 80), GDSLSWLLRLLN (SEQ ID NO : 81) et GDSLDMLEWSLM (SEQ ID NO : 82).
Dans un mode de réalisation particulier, la transférase est une transglutaminase.
Dans un mode de réalisation particulier, la transglutaminase établit une liaison covalente entre une molécule fluorescente et le site accepteur adapté à ladite molécule fluorescente, ledit site accepteur comprenant une séquence d’acides aminés choisie dans un groupe comprenant les séquences suivantes : HQSYVDPW (SEQ ID NO : 21) ; PNPQLPF (SEQ ID NO : 22) ; PKPQQFM (SEQ ID NO : 23) ; GQQQLG (SEQ ID NO : 24).
A titre illustratif, le marquage fluorescent du polypeptide substrat, tel que défini par la description, au moyen d’une transglutaminase peut être réalisé comme décrit par Taki et al. (Protein Eng Des Sel. 2004 Feb; 17(2): 119-26).
Il est des compétences de l’homme du métier de choisir une molécule fluorescente adaptée au couplage avec le peptide ‘FLUO’ d’un polypeptide substrat, tel que défini dans la présente demande, notamment de choisir le site accepteur correspondant au site ‘donneur’ d’une molécule fluorescente, qui sera localisé sur le peptide ‘FLUO’ dudit substrat.
Dans un mode de réalisation le peptide ‘FLUO’ consiste en un site accepteur d’une molécule fluorescente, de préférence un site accepteur consistant en une séquence d’acides aminés choisie dans un groupe comprenant les séquences suivantes : HQSYVDPW (SEQ ID NO : 21) ; PNPQLPF (SEQ ID NO : 22) ; PKPQQFM (SEQ ID NO : 23) ; GQQQLG (SEQ ID NO : 24).
Dans un mode de réalisation particulier, la molécule fluorescente présente une fonction amine libre, c’est-à-dire est capable de réaliser une liaison covalente avec une fonction compatible située sur le site accepteur du peptide ‘FLUO’.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule fluorescente est avantageusement sélectionnée, de manière non limitative, dans un groupe comprenant la cadavérine FITC, la cadavérine lucifer yellow, la cadavérine TAMRA, la cadavérine TexasRed ou tout autre amine couplée à un fluorophore tel que le DAPI, la Coumarine, le Cascade Blue, le Pacific Blue, un Alexa Fluor®, la rhodamine, le Nile Red, un DyLight®, et le Sytox Green.
Dans un autre mode de réalisation, la molécule fluorescente peut être sélectionnée, de manière non limitative, parmi un dérivé d’oligoglycine, un dérivé de l’acide lipoïque, un dérivé de tyrosine, un dérivé de streptavidine, un dérivé de Coenzyme A, un dérivé de CDP-choline, une hydrazine ou un dérivé aminooxy, couplés à un fluorophore.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « peptide ‘CIBLE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines » désigne un peptide dont tout ou partie de la séquence en acides aminés est reconnue de manière spécifique par ladite protéase, ladite séquence pouvant être clivée par ladite protéase, ceci générant deux fragments peptidiques.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide ‘CIBLE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines est sélectionné, de manière non limitative, dans un groupe comprenant un pro-collagène I, un pro-collagène II, un procollagène III, un pro-collagène V, un pro-collagène VII, un pro-collagène XI, une décorine, une protéine biglycan, une ostéoglycine, une lysyl oxydase LOX, une lysyl oxydase LOXL, une laminine alpha-3, une laminine gamma-2, une « dentin matrix protein1 », une « dentin sialophospho-protein », une « latent TGF-beta-binding protein 1 », un récepteur III du TGF-beta, la protéine CD109, la protéine IGFBP-3, la perlecane, la prolactine, la « angiopoietin-like protein 2 », la chordine, la protéine GDF-8, la protéine GDF-11, la gliomédine, l’apolipoprotéine Al, et un de leurs fragments.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide ‘CIBFE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines est sélectionné dans un groupe comprenant un pro-collagène I, un pro-collagène II, un pro-collagène III, un procollagène V, un pro-collagène VII, un pro-collagène XI et un de leurs fragments.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide ‘CIBFE’ comprend la région C-terminale d’une molécule de pro-collagène.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le site de clivage spécifiquement reconnu par une protéase de la famille des astacines comprend une séquence de formule suivante :
X-X-(L/Q)-(A/G/S)-D-E-(A/P)-X (1), autrement dit une séquence de formule suivante :
X1X2X3X4DEX7X8 (SEQ ID NO : 25), dans laquelle :
- Xi, X2 et Xs représentent n’importe quel acide aminé ;
- X3 représente F (Feu) ou Q (Gin) ;
- X4 représente A (Ala), G (Gly) ou S (Ser) ; et
- X7 représente A (Ala) ou P (Pro).
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le site de clivage spécifiquement reconnu par une protéase de la famille des astacines comprend une séquence de formule suivante :
X-X-(A/L/V)-(A/D/E/N/S)-(D/T)-(G/P)-(E/G/L)-(E/M/P) (2) autrement dit une séquence de formule suivante :
X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO : 26), dans laquelle :
- Xi et X2 représentent n’importe quel acide aminé ;
- X3 représente A (Ala), F (Feu) ou V (Val) ;
- X4 représente A (Ala), D (Asp), E (Glu), N (Asn) ou S (Ser) ;
- X? représente D (Asp) ou T (Thr) ;
- Xô représente G (Gly) ou P (Pro) ;
- Χγ représente E (Glu), G (Gly) ou L (Leu) ; et
- Xs représente E (Glu), M (Met) ou P (Pro).
Dans un troisième mode de réalisation particulier, le site de clivage spécifiquement reconnu par une protéase de la famille des astacines comprend une séquence de formule suivante :
X-X-(L/V)-(A/D/E)-(D/E)-(A/P)-(A/L/V)-X (3), autrement dit une séquence de formule suivante :
X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO : 27), dans laquelle,
- Xi, X2 et Xs représentent n’importe quel acide aminé ;
- X3 représente L (Leu) ou V (Val) ;
- X4 représente A (Ala), D (Asp) ou E (Glu) ;
- X5 représente D (Asp) ou E (Glu) ;
- Xô représente A (Ala) ou P (Pro) ; et
- X7 représente A (Ala), L (Leu) ou V (Val).
Dans le cadre de l’invention, l’expression « n’importe quel acide aminé » se rapporte à un acide aminé quelconque choisi parmi A (Ala, alanine), C (Cys, cystéine), D (Asp, acide aspartique), E (Glu, acide glutamique), F (Phe, phénylalanine), G (Gly, glycine), H (His, histidine), I (Ile, isoleucine), K (Lys, lysine), L (Leu, leucine), M (Met, méthionine), N (Asn, asparagine), P (Pro, proline), Q (Gin, glutamine), R (Arg, arginine), S (Ser, Sérine), T (Thr, thréonine), V (Val, valine), W (Trp, tryptophane) et Y (Tyr, tyrosine).
En fonction de la protéase étudiée, dont l’activité est quantifiée, l’homme du métier choisira un polypeptide substrat contenant le site de clivage reconnu par ladite protéase étudiée.
A titre illustratif et non limitatif, le site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines comprend une séquence choisie parmi l’une des séquences suivantes : YYRADDAN (SEQ ID NO : 36), FYRADQPR (SEQ ID NO : 37), YMRADQAA (SEQ ID NO : 38), PYYGDEPM (SEQ ID NO : 39), QLLDDGNG (SEQ ID NO : 40), TPQSQDPN (SEQ ID NO : 41), EFTEDQAA (SEQ ID NO : 42), SFQQAQAQ (SEQ ID NO : 43), GMQADADD (SEQ ID NO : 44), AAQAQEPQ (SEQ ID NO : 45), LMQEDEAI (SEQ ID NO : 46), RPQNQQPH (SEQ ID NO : 47), FMMNDEEA (SEQ ID NO : 48), QLQKDEAI (SEQ ID NO : 49), FMLEDEAS (SEQ ID NO : 50), RMVGDDPY (SEQ ID NO : 51), VAVGDSTG (SEQ ID NO : 52), VRSSDTPP (SEQ ID NO : 53), SYAADTAG (SEQ ID NO : 54), CYSGDENP (SEQ ID NO : 55), EKQSDDPE (SEQ ID NO : 56), SMQGDDPN (SEQ ID NO : 57), RSYSDRGE (SEQ ID NO : 58), PMQADGPR (SEQ ID NO : 59), DVQRDDSS (SEQ ID NO : 60), DFQGDALQ (SEQ ID NO : 61), IPSLDQEK (SEQ ID NO : 62), YFIQDRFL (SEQ ID NO : 63), EEMGDEEV (SEQ ID NO : 64), RILLDPGA (SEQ ID NO : 65), GFPGDMDE (SEQ ID NO : 66), RFMEENEG (SEQ ID NO : 67), ESQSTDTQ (SEQ ID NO : 68), SGGNDAPG (SEQ ID NO : 69), LQMADEES (SEQ ID NO : 70), NSHNDDAL (SEQ ID NO : 71), EIQSDQNL (SEQ ID NO : 72), FWQQDEPP (SEQ ID NO : 73) et AIPNDDTL (SEQ ID NO : 74).
Dans le cadre de l’invention, le clivage spécifique d’un polypeptide substrat, tel que défini ici, génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FLUO’ et un deuxième fragment peptidique comprenant au moins une partie du peptide ‘CIBLE’.
Après couplage du polypeptide substrat avec une molécule fluorescente, et après clivage dudit polypeptide par au moins une protéase, sont ainsi présents dans le milieu réactionnel deux entités fluorescentes : le polypeptide substrat complet, non clivé, et le premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FLUO’. Le deuxième fragment peptidique généré par le clivage n’est pas fluorescent.
Dans le cadre de la mesure de l’activité d’une protéase de la famille des astacines par polarisation de fluorescence, il est important que le rapport de taille entre le premier fragment peptidique fluorescent et le polypeptide substrat non clivé soit d’au moins 1/4, afin de distinguer nettement les deux signaux fluorescents.
Il est entendu que la taille du polypeptide substrat est sensiblement identique à la taille du conjugué fluorescent, consistant en le polypeptide substrat couplé avec une molécule fluorescente, ceci en raison de la taille négligeable de la molécule fluorescente au regard de la taille du polypeptide substrat.
Le signal fluorescent émis par chacune des entités fluorescentes présentes dans le milieu réactionnel est mesuré par polarisation de fluorescence. La polarisation de fluorescence met en jeu l’anisotropie des molécules. Lne lumière polarisée à la longueur d’onde d’excitation des molécules fluorescentes est dirigée sur l’échantillon (aussi appelé milieu réactionnel) et induit l’excitation de celles-ci selon leur orientation. Lne molécule ayant une orientation parallèle à la lumière sera fortement excitée à l’inverse d’une molécule orientée perpendiculairement (voir pour illustration la Fig. 4).
Par la suite, il y a émission des photons préalablement absorbés par les molécules fluorescentes. Or, une molécule en solution est constamment mobile et l’orientation dans laquelle ceux-ci seront réémis a son importance. En effet, la durée entre l’excitation de la molécule et la réémission des photons est suffisante pour que la molécule se déplace et modifie son orientation. Cette diffusion est corrélée avec le rayon de Stockes des molécules. Ainsi, si la molécule fluorescente fait partie d’une petite molécule telle que le premier fragment peptidique, elle sera très mobile. Au contraire, si elle est intégrée à une grosse molécule, telle que le polypeptide substrat, elle sera ralentie.
Etant donné que la polarisation de fluorescence prend en compte la mobilité des entités fluorescentes en présence (exprimée en « mP »), si la molécule fluorescente est intégrée à une grosse molécule, elle sera ralentie et aura une mesure de polarisation de fluorescence élevée, tandis que si elle est liée à une plus petite molécule elle aura une mesure de polarisation de fluorescence plus faible.
Dès lors, il apparaît clairement que la quantification de l’activité de clivage d’une protéase, par le suivi en continu du clivage d’un conjugué fluorescent comprenant un polypeptide substrat, tel que défini par la description, sera facilitée si les deux entités fluorescentes dont la polarisation de fluorescence est mesurée, ont des tailles suffisamment différentes l’une de l’autre.
Il en ressort que la mesure de polarisation de fluorescence sera facilitée lorsque la différence de taille entre le polypeptide substrat non clivé, et le premier fragment peptidique obtenu après clivage dudit polypeptide substrat, est suffisamment importante.
En d’autres termes, au plus la taille du premier fragment peptidique obtenu après clivage dudit polypeptide substrat est petite par rapport à la taille dudit polypeptide substrat, meilleure sera l’amplitude du signal de polarisation de fluorescence.
Dans le cadre de l’invention, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et le polypeptide substrat non clivé, est d’au moins 1/4. Selon un aspect préféré, le rapport détaillé entre ces deux entités est d’au moins 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/12, 1/14, 1/16, 1/18, 1/20, 1/25, 1/30, 1/35, 1/40, 1/45, 1/50, 1/55, 1/60, 1/65, 1/70, 1/75, 1/80, 1/85, 1/90, 1/95, 1/100, 1/110, 1/120, 1/130, 1/140, 1/150, 1/160, 1/170, 1/180, 1/190, 1/200, 1/250, voir 1/500.
Dans un mode de réalisation particulier, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et le polypeptide substrat non clivé, est d’au moins 1/10, et plus préférentiellement d’au moins 1/100.
• Conjugués
Un autre aspect de l’invention concerne un conjugué fluorescent comprenant le polypeptide substrat, tel que défini dans la présente description, couplé de manière covalente à une molécule fluorescente, sur le site accepteur d’une molécule fluorescente du peptide ‘FLUO’ compris dans ledit polypeptide substrat.
Selon une mise en œuvre préférée, le conjugué fluorescent selon l’invention consiste en le polypeptide substrat couplé de manière covalente à une molécule fluorescente, au niveau d’un site accepteur compris dans le peptide FLUO.
Un homme du métier est en mesure de déterminer les paramètres nécessaires pour obtenir un tel couplage ayant un bon rendement et une bonne spécificité. Les paramètres sont par exemple la composition du milieu réactionnel, la nature du système tampon utilisé, les conditions de température, les conditions de pH et la durée du couplage.
Dans certains modes de réalisation, le couplage covalent entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat peut être réalisé dans un milieu réactionnel tamponné, à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de manière préférentielle à un pH compris entre 7,0 et 8,0, de manière encore plus préférée à un pH compris entre 7,3 et 7,8.
Dans certains modes de réalisation, le couplage covalent entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat peut être réalisé dans un milieu réactionnel maintenu à une température comprise entre 1 °C et 45 °C, de préférence à une température comprise entre 3 °C et 37 °C, encore plus préférentiellement à une température comprise entre 3 °C et 25 °C.
Dans certains modes de réalisation, le couplage covalent entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat peut être réalisé dans un milieu réactionnel maintenu à une température inférieure à 20 °C, de préférence à une température inférieure à 10 °C.
Dans certains modes de réalisation, le couplage covalent entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat peut être réalisé pendant une durée comprise entre 15 min et 48h, de préférence une durée comprise entre 30 min et 24h, de préférence une durée comprise entre lh et 20h, de préférence une durée comprise entre lh et lOh.
Dans un mode de réalisation particulier, le couplage covalent entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat peut être réalisé à une température inférieure à 10 °C, pendant une durée inférieure à lOh. Ces paramètres permettent de limiter le couplage non-spécifique entre la molécule fluorescente et le polypeptide substrat, c’est-àdire le couplage de la molécule fluorescente à un site différent du site accepteur d’une molécule fluorescente localisé dans le peptide ‘FLUO’.
• Utilisations
Dans un mode de réalisation particulier, les utilisations sont mises en œuvre in vitro ou ex vivo.
Dans un mode de réalisation particulier, les utilisations sont mises en œuvre in vitro.
L’invention concerne aussi une utilisation d’un polypeptide substrat ou d’un conjugué fluorescent, tel que défini dans la présente description, pour la quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, contenue dans un échantillon.
Un tel échantillon contenant une protéase sera défini ci-dessous. Il s’agira par exemple d’un échantillon biologique, issu d’un être humain ou d’un animal.
Dans un mode de réalisation particulier, la quantification de l’activité de ladite protéase est réalisée par une mesure de la fluorescence, et de manière préférée, par mesure d’une polarisation de fluorescence.
La mesure d’une polarisation de fluorescence est directement proportionnelle à l’activité de ladite protéase au sein de l’échantillon.
La mesure de polarisation de fluorescence peut être réalisée selon le principe décrit par Bolger et Checovich (Biotechniques. 1994 Sep; 17(3):585-9).
Dans un mode de réalisation particulier, la polarisation de fluorescence peut être mesurée dans un fluorimètre commercial du type Mithras LB 940 (BERTHOLD TECHNOLOGIES®), en suivant les recommandations du constructeur.
Dans certains modes de réalisation, la polarisation de fluorescence peut être mesurée dans un milieu réactionnel tamponné, à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de manière préférentielle à un pH compris entre 7,0 et 8,0.
Dans certains modes de réalisation, la polarisation de fluorescence peut être mesurée dans un milieu réactionnel maintenu à une température comprise entre 20 °C et 45 °C, de préférence entre 30 °C et 40 °C, encore plus préférentiellement entre 35 °C et 39 °C.
Selon un autre aspect, l’invention concerne une utilisation d’un polypeptide substrat ou d’un conjugué fluorescent, tel que défini dans la présente description, pour le criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « activateur de l’activité d’une protéase de la famille des astacines » doit être comprise par un homme du métier par tout composé chimique et/ou biologique possédant la propriété d’augmenter de manière significative la quantité de produit obtenu pendant un temps donné, par la réaction entre ladite protéase et un substrat de celle-ci.
Dans le cadre de l’invention, l’expression « inhibiteur de l’activité d’une protéase de la famille des astacines » doit être comprise par un homme du métier par tout composé chimique et/ou biologique possédant la propriété de diminuer de manière significative la quantité de produit obtenu pendant un temps donné, par la réaction entre ladite protéase et un substrat de celle-ci.
Selon un autre aspect, l’invention concerne aussi une utilisation d’un polypeptide substrat ou d’un conjugué fluorescent, tel que définis dans la présente description, pour le diagnostic d’une pathologie impliquant une modification de l’expression ou de l’activité d’une protéase de la famille des astacines ou une modification de l’expression ou de l’activité d’un modulateur des protéases de la famille des astacines.
Il est entendu que ce diagnostic sera réalisé par des étapes in vitro ou ex vivo.
Dans un mode de réalisation particulier, ces pathologies impliquant une modification de l’expression ou de l’activité d’une protéase de la famille des astacines, ou une modification de l’expression ou de l’activité d’un modulateur des protéases de la famille des astacines, sont sélectionnées dans un groupe comprenant les fibroses, en particulier les fibroses cardiaques, hépatiques, rénales, pulmonaires, rétropéritonéales, musculaires, ligamentaires et tendineuses, les fibroses induites par les radiations et les agents de contraste utilisés en imagerie, la maladie de Dupuytren, les adhésions postchirurgicales, les cicatrices hypertrophiques, les chéloïdes, la sclérodermie et la desmoplasie ; les maladies de l’œil, en particulier les opacités cornéennes, le glaucome et la dégénérescence maculaire liée à l’âge ; les maladies inflammatoires de l’intestin et du système urinaire, en particulier la maladie de Crohn ; les maladies squelettiques, en particulier l’arthrose, l’arthrite, l’ostéoporose, l’ostéogenèse imparfaite, les chondrodysplasies ; les maladies du muscle squelettique, telles que les dystrophies musculaires, en particulier la myopathie de Duchenne, la dystrophie musculaire de Becker ; les syndromes d’Ehlers-Danlos ; les cancers, en particulier les carcinomes ; le diabète, l’athérosclérose, la maladie d’Alzheimer et les prolapsus d’organes pelviens.
Procédés
Les procédés décrits ci-dessous peuvent être mis en œuvre in vitro ou ex vivo.
Dans un mode de réalisation particulier, les procédés sont mis en œuvre in vitro.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent tel que défini dans la présente description, dans des conditions compatibles avec l’observation d’une activité de ladite protéase ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend également une étape supplémentaire :
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Dans certains modes de réalisation, la valeur de référence est avantageusement représentée par une mesure de signal de polarisation de fluorescence obtenue au moyen d’une ou plusieurs courbes de calibrations, elle(s) même(s) obtenue(s) avec une/des quantité(s) déterminée(s) de ladite protéase. Les protéases de la famille des astacines étant relativement ubiquitaires chez les eucaryotes, il s’ensuit que n’importe quel échantillon provenant d’un organisme eucaryote peut a priori être utilisé pour mesurer une activité de ladite protéase.
Dans un mode réalisation, un organisme eucaryote peut être choisi parmi les vertébrés inférieurs et les invertébrés, en particulier les nématodes, les crustacés, les mollusques, les cnidaires, les poissons, les insectes, les oiseaux et les amphibiens.
Dans un mode réalisation, un organisme eucaryote peut être un vertébré supérieur non humain choisi, de manière non limitative, parmi un animal domestique, en particulier un chat, un chien, un cochon domestique, un lapin, un hamster, une souris, un rat ; un primate, en particulier un chimpanzé ; un animal d’importance économique, en particulier un bovin, un cheval, une chèvre, un mouton, un cochon, une souris, un rat et un lama. Dans un mode réalisation, un organisme eucaryote peut être un individu humain.
Par ailleurs, une protéase de la famille des astacines peut être produite de manière recombinante en suivant les protocoles bien connus de l’homme du métier.
Dans un mode de réalisation, un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines est un échantillon biologique, notamment issu d’un être humain ou d’un animal. Il s’agira en particulier d’un échantillon liquide complexe, comprenant de nombreux constituants.
Un tel échantillon biologique est choisi notamment dans le groupe comprenant un échantillon de sang, un échantillon de lymphe, un échantillon d’urine, un liquide de lavage, une biopsie, une cellule d’un organisme eucaryote, un tissu d’un organisme eucaryote, un organe d’un organisme eucaryote, un organisme eucaryote entier, un broyât ou lysat de tissu, d’organe ou d’organisme eucaryote entier, un échantillon de matrice extracellulaire, tout ou partie d’une culture cellulaire exprimant de manière endogène ou recombinante ladite protéase.
Dans le cadre de la présente invention, l’expression «tout ou partie d’une culture cellulaire exprimant de manière endogène ou recombinante ladite protéase » inclut un lysat cellulaire, un échantillon de matrice extracellulaire et un surnageant de culture.
Dans certains modes de réalisation, une cellule exprimant une protéase de la famille des astacines peut être choisie, de manière non limitative, parmi un groupe comprenant une cellule de type fibroblaste, une cellule musculaire, une cellule épithéliale et une cellule nerveuse.
Dans le cadre de la présente invention, un tissu comprenant une protéase de la famille des astacines peut être choisi, de manière non limitative, parmi un groupe comprenant un tissu musculaire, un tissu épithélial, un tissu conjonctif et un tissu nerveux.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines est choisi, de manière non limitative, dans un groupe comprenant un échantillon de sang, un échantillon de peau, un échantillon de tendon, un échantillon de cornée, un échantillon d’os, un échantillon d’épithélium, un échantillon de tissu riche en collagène.
Dans le cadre de la présente invention, les conditions compatibles avec l’observation d’une activité de ladite protéase sont facilement déterminées par l’homme du métier, et incluent les paramètres tels que la température, le pH, la composition du milieu réactionnel et la durée de la mise en contact de ladite protéase avec un substrat susceptible d’être clivé par ladite protéase.
Comme indiqué plus haut, le conjugué fluorescent, après clivage par la protéase, donne naissance à un premier fragment peptidique fluorescent et un deuxième fragment peptidique non fluorescent. Il s’ensuit que la mesure de l’activité de la protéase est possible par la mesure d’une polarisation de fluorescence, reflétant l’activité de clivage de ladite protéase.
Dans un mode de réalisation particulier, le signal de polarisation de fluorescence est mesuré en continu au cours du temps.
Dans un mode de réalisation, le signal de polarisation de fluorescence est mesuré pendant une durée comprise entre 1 min et 200 min, de préférence pendant une durée comprise entre 5 et 180 min.
Dans certains modes de réalisation, le signal de polarisation de fluorescence est mesuré pendant une durée relativement courte, c’est-à-dire une durée comprise entre 1 min et 30 min.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de quantification de la modulation de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, en présence d’un modulateur de ladite activité, comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la présente description, en présence d’un modulateur de ladite activité, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « modulateur » tout composé chimique et/ou biologique, naturel ou synthétique, apte à augmenter ou diminuer l’activité de ladite protéase.
Dans un mode de réalisation, le modulateur est un activateur de l’activité de la protéase.
Dans un autre mode de réalisation, le modulateur est un inhibiteur de l’activité de la protéase.
Dans certains modes de réalisation, le modulateur peut interagir avec le site actif de sorte à favoriser ou à interférer avec la reconnaissance du substrat par la protéase.
Dans certains modes de réalisation, le modulateur peut interagir avec un site distinct du site actif de la protéase, de sorte à créer des contraintes structurales qui ont pour résultat de favoriser ou d’interférer avec la reconnaissance du substrat par la protéase.
Dans certains modes de réalisation, le modulateur peut interagir avec le substrat de sorte à favoriser ou à interférer avec la reconnaissance du substrat par la protéase.
Dans certains modes de réalisation, un modulateur de l’activité de ladite protéase est un activateur, en particulier un activateur choisi parmi un activateur de la famille des PCPE, incluant la protéine PCPE-1 (Procollagen Ç-Proteinase Enhancer-1) et la protéine PCPE-2 (Procollagen Ç-Proteinase Enhancer-2) ; la périostine ; la protéine Tsg (Twisted gastrulation) ; la protéine ONT-1 (Olfactomedin Noelin Tiarin factor-1) ; et la fibronectine.
Dans un mode de réalisation particulier, le modulateur de l’activité de ladite protéase est un activateur, de préférence un activateur de la famille des PCPEs.
Dans certains modes de réalisation, un modulateur de l’activité de ladite protéase est un inhibiteur, en particulier un inhibiteur choisi parmi la protéine sizzled ; une protéine de la famille des sFRPs (secreted frizzled-related jjroteins) ; la protéine BMP-4 ; et l’inhibiteur « 33 A ».
Les propriétés de l’inhibiteur « sizzled » sont notamment décrites par Bijakowski et al. (J Biol Chem. 2012 Sep 28;287(40):33581-93).
Dans le cadre de la présente invention, l’inhibiteur « 33 A » est un composé de formule suivante :
ô
dont les propriétés inhibitrices sont notamment décrites par Turtle et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012; 22: 7397-7401).
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « valeur de référence » la mesure de l’activité de la protéase d’intérêt en l’absence de toute modulation de son activité, dans des conditions appropriées pour observer le clivage du substrat par la protéase.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la mesure du signal de polarisation de fluorescence mesurée à l’étape c) et la mesure de la valeur de référence sont effectuées dans des conditions similaires ou identiques, ce qui inclut des temps de réaction similaires ou identiques.
Dans un mode de réalisation, une valeur de référence peut être mesurée dans un milieu réactionnel comprenant un conjugué fluorescent, tel que défini par la présente description et la protéase d’intérêt, dans des conditions de température, de pH et pour une durée adaptées.
Dans certains modes de réalisation, la valeur de référence est une valeur unique mesurée en l’absence du modulateur, dans des conditions identiques ou équivalentes.
Dans certains modes de réalisation, la valeur de référence est une moyenne de valeurs mesurées en l’absence du modulateur, dans des conditions identiques ou équivalentes.
La valeur de référence peut également se présenter sous la forme d’une courbe de référence, représentant l’activité d’une protéase particulière au cours du temps, en l’absence de tout modulateur d’activité.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend en outre l’étape suivante :
- e) observer une variation entre la mesure du signal de polarisation de fluorescence mesurée à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que ladite variation est indicatrice des propriétés de modulation dudit modulateur de l’activité de ladite protéase.
Dans le cadre de la présente invention, il est compris que les mesures des signaux de polarisation de fluorescence mesurées à l’étape c) et les mesures de références sont des valeurs brutes qui peuvent être directement comparées pour déterminer une variation.
Dans un mode de réalisation, toute variation de la mesure du signal de polarisation de fluorescence mesurée à l’étape c) d’au moins 10 % en plus ou moins par rapport à la valeur de référence est considérée comme significative.
Dans un mode de réalisation, une variation d’au moins 10 %, en plus ou moins par rapport à la valeur de référence, inclut une variation d’au moins 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 %, en plus ou moins par rapport à la valeur de référence.
Dans certains modes de réalisation, la mesure du signal de polarisation de fluorescence permet de déduire la quantité de produit formé, c’est-à-dire la quantité du premier fragment peptidique fluorescent formé au cours du temps, ce qui permet consécutivement de déterminer les paramètres enzymatiques classiques de la protéase, tels que par exemple la constante catalytique kcat et la constante de Michaelis Km.
En pratique, lorsque la mesure de l’activité est réalisée au moyen d’une mesure de la polarisation de fluorescence, la valeur de référence peut tenir compte du bruit de fond, c’est-à-dire de la fluorescence observée en présence du conjugué fluorescent seul, tel que défini par la présente description.
Le bruit de fond peut être mesuré en P Plane (dans l’orientation perpendiculaire au rayon incident) et en S Plane (dans l’orientation parallèle au rayon incident) dans le milieu réactionnel comprenant l’ensemble des molécules à l’exception du conjugué fluorescent. Ainsi, une valeur exprimée en mP peut être calculée, selon la formule cidessous :
Plane - P Plane mp - 5 Plane + P Plane
Les résultats sont exprimés en terme de « [produit formé] au cours du temps ». A titre illustratif, on calcule dans un premier temps la valeur AmP maximal résultant de la protéolyse de 100 % du substrat, par différence entre la valeur mPl mesurée lorsque le substrat est entièrement clivé et la valeur mP2 mesurée dans des conditions sans protéase.
A partir de cette valeur AmP, il est possible de calculer un pourcentage de substrat clivé à un temps t selon la formule « (AmP à un temps t / AmP maximal) * 100 ». Ce pourcentage de substrat clivé peut aisément être exprimé en concentration de substrat clivé si on connaît la concentration initiale de substrat. Par différence, on obtient finalement la concentration de produit formé pour chaque point d’acquisition et on peut donc tracer la courbe « concentration de produit formé [P] = f(temps) ». A partir de ces données, l’intégration de l’équation de Michaelis-Menten permet de déterminer une valeur de kcat/Km.
]F] [5ti] ( 1 — nxp(— k » £)) avec Ii fccat*[£]
Km dans laquelle :
[P] représente la concentration de produit formé, [So] représente la concentration initiale de substrat,
- t représente le temps, kcat représente la constante catalytique, [E] représente la concentration en enzyme, et
- Km représente la constante de Michaelis
Dans certains modes de réalisation, une valeur kcat/Km telle qu’obtenue à partir des mesures de polarisation de fluorescence mesurées à l’étape c) peut être comparée avec une valeur kcat/Km obtenue à partir des mesures de fluorescences mesurées dans des conditions de référence.
Dans certains modes de réalisation, une variation significative de la valeur kcat/Km calculée à partir des mesures effectuées à l’étape c) par rapport à la valeur kcat/Km de référence est d’au moins d’un facteur 1,2, ce qui inclut un facteur 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 par rapport à la valeur kcat/Km de référence.
Dans certains modes de réalisation, une variation d’au moins un facteur 1,2 de la valeur kcat/Km calculée à partir des mesures effectuées à l’étape c) au-delà de la valeur kcat/Km de référence est indicatrice des propriétés activatrice du modulateur.
Dans certains modes de réalisation, une variation d’au moins un facteur 1,2 de la valeur kcat/Km calculée à partir des mesures effectuées à l’étape c) en deçà de la valeur kcat/Km de référence est indicatrice des propriétés inhibitrices du modulateur.
A titre illustratif, il ressort de la Figure 19, que l’activité de la protéase BMP-1 est augmentée d’un facteur 4,5 en présence de l’activateur PCPE-1.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent tel que défini dans la présente description, en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de criblage comprenant en outre l’étape suivante :
- e) observer une variation entre le signal de polarisation de fluorescence mesuré à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que ladite variation est indicatrice d’une propriété de type activatrice ou inhibitrice du composé test.
A titre illustratif, l’insert dans la Figure 21 montre que des quantités croissantes en inhibiteur « 33A » inhibent la formation du premier fragment peptidique fluorescent (« produit formé »), ce qui illustre la faisabilité du procédé de criblage d’un inhibiteur de l’activité d’une protéase de la famille des astacines, comme par exemple la protéase BMP-1.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de criblage d’un agoniste ou d’un antagoniste d’un modulateur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent tel que défini dans la présente description, en présence d’un modulateur de l’activité de ladite protéase et en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de criblage comprend en outre l’étape suivante :
- e) observer une variation entre le signal de polarisation de fluorescence mesuré à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que cette variation est indicatrice d’une propriété de type agoniste ou antagoniste du composé test vis-à-vis du modulateur de l’activité de ladite protéase.
Un autre aspect de l’invention se rapporte aussi à un procédé de diagnostic in vitro ou ex vivo d’une pathologie impliquant une activité astacine plus élevée ou moins élevée que la normale dans un liquide biologique ou un échantillon tissulaire, comprenant les étapes successives suivantes :
- a) fournir un échantillon biologique comprenant une protéase de la famille des astacines, obtenu à partir dudit individu ;
- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent tel que défini dans la présente description, dans des conditions compatibles avec l’observation de l’activité de ladite protéase ;
- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;
- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
Dans certains modes de réalisation, le procédé pourra remplacer ou compléter le procédé de mesure du « turnover » du collagène (synthèse et dégradation) dans un échantillon biologique, habituellement mis en œuvre, et assister ainsi le praticien pour le diagnostic de certaines pathologies telles que les fibroses, en particulier les fibroses cardiaques, hépatiques, rénales, pulmonaires, rétro-péritonéales, musculaires, ligamentaires et tendineuses, les fibroses induites par les radiations et les agents de contraste utilisés en imagerie, la maladie de Dupuytren, les adhésions post-chirurgicales, les cicatrices hypertrophiques, les chéloïdes, la sclérodermie et la desmoplasie, les opacités cornéennes; les maladies squelettiques, en particulier l’arthrose, l’arthrite, l’ostéoporose, l’ostéogenèse imparfaite, les chondrodysplasies.
L’échantillon biologique considéré est en particulier un échantillon liquide complexe.
Dans certains modes de réalisation, l’échantillon biologique comprenant une protéase de la famille des astacines est choisi, de manière non limitative, dans un groupe comprenant un échantillon de sang, un échantillon de lymphe, un échantillon d’urine, un échantillon de placenta, un échantillon de peau, un échantillon de tendon, un échantillon de ligament, un échantillon de cornée, un échantillon d’os, un échantillon de cartilage, un échantillon d’intestin, un échantillon de cœur, un échantillon de rein, un échantillon de poumon, un échantillon de foie, un échantillon d’ovaire.
Dans certains modes de réalisation, les échantillons solides, comme par exemple les échantillons de peau, de tendon, de ligament, de cornée, d’os, de cartilage, d’intestin, de cœur, de rein, de poumon, de foie et d’ovaire, peuvent provenir d’une biopsie.
Dans un mode de réalisation particulier, la valeur de référence est une valeur unique ou une moyenne de valeurs d’activité de ladite protéase, mesurée chez un ou plusieurs individus sains ou sur un échantillon de tissu sain provenant du même patient.
La valeur de référence peut également se présenter sous la forme d’une courbe de calibration, représentant l’activité d’une protéase particulière mesurée en faisant varier un paramètre, en particulier la concentration de la protéase.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de diagnostic comprend en outre l’étape suivante :
- e) observer une variation entre le signal de polarisation de fluorescence mesuré à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que cette variation est indicatrice d’une fibrose chez ledit individu.
Dans le cadre de l’invention, une fibrose inclut une fibrose cardiaque, hépatique, rénale, pulmonaire, rétro-péritonéale, musculaire, ligamentaire et tendineuse, une fibrose induite par les radiations et les agents de contraste utilisés en imagerie, la maladie de Dupuytren, une adhésion post-chirurgicale, une cicatrice hypertrophique, une chéloïde, la sclérodermie, la desmoplasie, ou une opacité coméenne.
Le procédé de diagnostic se base sur le fait qu’une variation de l’activité de la protéase de la famille des astacines par rapport à une valeur de référence de ladite activité dans des conditions physiologiques normales, c’est-à-dire sans fibrose, peut être un indicateur de la présence potentielle d’une fibrose.
• Kits
Un autre aspect de l’invention concerne un kit comprenant :
- un conjugué fluorescent tel que défini dans la présente description ;
- des réactifs permettant la mesure d’un signal de polarisation de fluorescence ; et optionnellement,
- un modulateur de l’activité d’une protéase de la famille des astacines, et optionnellement,
- une protéase de ladite famille.
Dans certains modes de réalisation, les réactifs permettant la mesure d’un signal de polarisation de fluorescence comprennent au moins une solution tampon, au moins une plaque adaptée à la mesure de la fluorescence.
Dans certains modes de réalisation, le modulateur de l’activité de ladite protéase est un activateur, en particulier un activateur choisi parmi un activateur de la famille des PCPE, comme la protéine PCPE-1 (Procollagen C-Proteinase Enhancer-1) et la protéine PCPE-2 (Procollagen C-Proteinase Enhancer-2) ; la périostine ; la protéine Tsg (Twisted gastrulation) ; la protéine ONT-1 (Olfactomedin Noelin Tiarin factor-1) ; et la fibronectine.
Dans certains modes de réalisation, le modulateur de l’activité de ladite protéase est un inhibiteur, en particulier un inhibiteur choisi parmi la protéine sizzled ; une protéine de la famille des sFRPs (secreted frizzled-related proteins) ; la protéine BMP-4 ; et l’inhibiteur « 33 A ».
Comme il ressortira des exemples ci-dessous, il a été développé un test quantitatif fonctionnel permettant de détecter l’activité de la protéase BMP-1 de manière simple, sensible et efficace. Ce test permet de suivre à la fois l’activité de la protéase BMP-1 mais aussi sa régulation par les activateurs de la famille des PCPEs ou encore par des inhibiteurs.
Ce test repose sur la mise en œuvre d’un nouveau polypeptide substrat de la protéase BMP-1, lequel permettra une meilleure caractérisation de l’effet de certains régulateurs encore peu étudiés tels que l’activateur PCPE-2 ou l’héparine et les protéoglycanes à héparane sulfate.
D’autres applications sont également envisageables au niveau de l’analyse des interactions avec le conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC ainsi qu’au niveau de la détection in cellulo et ex vivo de la protéase BMP-1. A moyen terme, ce test sera également mis en œuvre pour le criblage de potentiels inhibiteurs des astacines ou antagonistes des activateurs de la famille des PCPEs, dans le but de mettre au point de nouveaux outils thérapeutiques.
EXEMPLES
1/Matériels & Méthodes
1.1/ Culture Cellulaire
1.1.1/ Culture des cellules mammifères
Lors de la décongélation, les cellules sont rapidement incubées à 37 °C durant 5 minutes, resuspendues en présence de milieu de culture DMEM High Glucose (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), puis centrifugées (5 min à 200xg) afin d’éliminer le milieu de congélation. Par la suite, les cellules sont cultivées dans le milieu DMEM supplémenté par 10 % de SVF (Sérum de Veau Fœtal normal ou Gold, PAA) et incubées à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
Lorsque les cellules arrivent à confluence, le milieu nutritif est retiré, les cellules sont rincées avec du PB S (Phosphate Buffered Saline) puis décollées par incubation durant 5 min à 37 °C en présence de 1 mL d’une solution de Trypsine 0,5 mg.mL1 et EDTA 0,2 mg.mL1. La trypsine est inhibée par du DMEM contenant 10 % SVF puis les cellules sont centrifugées (5 min à 200xg), resuspendues dans du milieu frais (DMEM, 10 % SVF) puis réensemencées à plus faible confluence.
1.1.2/ Expression des protéines dans les cellules HEK-293T Le protocole décrit ci-dessous concerne les protéines surexprimées dans les cellules HEK293T. Les constructions codant pour les polypeptides « CPIII-long » (SEQ ID NO : 33) et « CPIII-court » (SEQ ID NO : 35) sont décrites dans Bourhis et al. (PNAS, 2013, 110(16), 6394-6399) et ont été introduites dans le plasmide pHLsec (Aricescu et al, Acta Cryst. ; 2006 ; D62 : 1243-1250 ; Fig. 1). Ces plasmides ont ensuite été amplifiés dans la bactérie E. Coli XL1 Blue et purifiés avec le kit EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN®) en suivant les instructions du fournisseur. De l’eau stérile sans endotoxine est utilisée pour la resolubilisation puis la pureté des plasmides est mesurée au moyen du rapport « absorbance à 260 nm / absorbance à 280 nm ». L‘absence de mutation dans la séquence polypeptidique a été vérifiée par séquençage. La transfection transitoire des cellules HEK293T par ces vecteurs permet l’expression des polypeptides correspondants.
Pour ceci, les cellules sont cultivées dans du DMEM 10 % SVF supplémenté de G418 (250 pg.mL1) et incubées à 37 °C en présence de 5 % de CO2. Elles sont ensuite amplifiées dans un flacon de culture de 225 cm2 en absence d’antibiotique. A confluence, les cellules sont trypsinées afin d’être ensemencées dans un CellSTACK® double étage (CORNING®) pour un volume final de 200 mL (1272 cm2) ou dans un HYPERflask™ (CORNING®) pour un volume final de 550 mL (1720 cm2). Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, elles sont lavées avec du PBS puis le milieu est remplacé par du DMEM supplémenté cette fois avec 2 % de SVF et 1 % d’aminoacides non essentiels. Une pré-incubation de 10 minutes à température ambiante de 1 mg d’ADN plasmidique et de 2 mL d’agent de transfection PEI (Polyethylenimine) en solution dans 18 mL de DMEM permet aux complexes ADN-lipides de se former. Compte-tenu de la surface moins importante dans un double CellSTACK, 0,75 mg d’ADN plasmidique et 1,5 mL de PEI y sont utilisés.
Après ajout des mélanges de transfection aux cellules, celles-ci sont incubées à 37 °C en présence de 5 % de CO2. La récolte du surnageant de culture au bout de 72 heures permet de récupérer les polypeptides sécrétés. Le milieu de culture des cellules est alors remplacé afin d’effectuer une seconde récolte après 72h. A chaque récolte, le surnageant de culture est centffugé à basse vitesse (1 OOOxg à 4 °C pendant 10 min) puis à plus forte vitesse (10 OOOxg à 4 °C pendant 15 minutes) afin d’éliminer les débris cellulaires. Des inhibiteurs de protéases, N-Ethylmaleimide (2 mM) et Pefabloc (0,25 mM) sont ensuite ajoutés dans le milieu qui est conservé à -80 °C afin d’être purifié ultérieurement.
1.2/ Purification des polypeptides
1.2,1/Purification des polypeptides dérivés de « CPIII-His »
Les différents polypeptides dérivés de « CPIII-His » (« CPIII-long », « CPIIIlong-TGase» et « CPIII-court-TGase») possèdent tous une étiquette 6-histidines à leur extrémité N-terminale qui est mise à profit lors d’une première étape de chromatographie d’affinité pour les ions nickel ou cobalt. Par la suite, une seconde étape de purification par filtration sur gel est réalisée.
a) Dialyse du surnageant :
Les surnageants de culture contenant le polypeptide d’intérêt surexprimé sont décongelés puis clarifiés par centrifugation (10 OOOxg à 4 °C pendant 15 minutes). Par la suite, le surnageant est dialysé contre du tampon A (Tris 50 mM, NaCl 0,3 mM, CaCh 5 mM, pH 8,0).
b) Purification sur colonne Cobalt-NTA Agarose ou Nickel-NTA Agarose :
Pour 500 mL de surnageant de culture, 10 mL de résine NT A-Agarose contenant du cobalt ou du nickel sont utilisés. L’équilibration est réalisée avec 10 volumes colonne de tampon A. Le polypeptide d’intérêt est ensuite fixé à la résine en faisant passer le surnageant au travers de la colonne à un débit de 2 mL.min1. Les étapes suivantes sont réalisées à l’aide d’un système FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) à un débit de 2 mL.min1. Le lavage est composé de 3 étapes qui nécessitent dans l’ordre, 5 volumes de tampon A, 3 volumes de tampon A contenant 10 mM d’imidazole et 4 volumes de tampon A contenant 20 mM d’imidazole. Finalement, l’élution est réalisée avec un gradient d’imidazole allant de 0 à 250 mM sur 10 volumes colonne. Les fractions contenant la protéine d’intérêt sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
c) Purification par filtration sur gel S200 16/600 :
Toutes les étapes sont réalisées à l’aide d’un appareil FPLC à un débit de 0,75 mL.min1. La colonne est équilibrée avec 2 volumes de tampon B (Hepes 20 mM, NaCl 0,3 mM, CaCh 5 mM, pH 7,4). Après injection de l’échantillon polypeptidique, la séparation des molécules est effectuée au sein d’1 volume colonne de tampon B. Finalement, les fractions contenant le polypeptide d’intérêt sont rassemblées puis concentrées par ultrafiltration.
1.2,2/ Purification de la protéine PCPE-1
La protéine PCPE-1 contient un tag 8His et est purifiée selon le protocole décrit dans Blanc et al. (J. Biol. Chem. 2007 ; 282(23):16924-33) puis sur une colonne HiTrap™ Heparin HP selon le protocole ci-dessous.
La colonne est équilibrée dans le tampon C (Hepes 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4). La fixation de la protéine PCPE-l-His se fait par passage de l’échantillon au travers de la colonne puis le lavage est réalisé avec 10 volumes de tampon C. L’élution nécessite un gradient de 0,15 M à 1 M de NaCl sur 10 volumes colonnes. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et conservées à -80 °C.
1.2.3/ Purification de la protéase BMP-1
La forme de BMP-1 utilisée est BMP-1-Flag (Blanc et al. ,J. Biol. Chem. 2007 ; 282(23):16924-33), purifiée comme décrit dans Hung et al. (J. Proteomics 2016 ; 138:136-45).
1.3/ Analyses structurales
1.3.1/Diffusion dynamique de la lumière (DLS)
L’appareil utilisé est un Zetasizer (Malvern Instruments). L’échantillon protéique est centrifugé (15 min à 15 OOOxg, 4 °C) afin de retirer un maximum d’agrégats pouvant nuire à son homogénéité. Un cône est rincé à plusieurs reprises afin d’éliminer la poussière lors du transfert de 100 pL d’échantillon dans une mini-cuve de spectrophotomètre. Les mesures sont réalisées à 25 °C en respectant préalablement une pré-incubation de 2 minutes. Le matériel est réglé sur « protéine » et le solvant sur « eau ».
Pour une meilleure fiabilité des résultats, une moyenne est calculée sur 15 « run » par mesure et 3 jeux de mesure par échantillon.
1.3,2/ Dichroïsme circulaire (CD)
L’appareil utilisé est un Chirascan Circular Dichroism Spectrometer (Applied Photophysics). En premier lieu, une dialyse des polypeptides est effectuée afin d’échanger le tampon de conservation contre un tampon permettant de minimiser les interférences : Tris 20 mM, NaCI 0,15 M, CaCE 5 mM, pH 7,4. Un volume minimal de 100 pL et une concentration d’environ 500 mg.mL1 sont nécessaires. Les échantillons polypeptidiques sont ensuite dosés précisément par mesure de l’absorbance à 280 nm avant d’être introduits dans une cuve en quartz de 0,02 cm d’épaisseur. Les mesures sont réalisées à 25 °C sur une gamme de longueur d’onde allant de 190 à 260 nm avec un pas de 1 nm. Pour une meilleure fiabilité des résultats, 12 secondes d’acquisition sont paramétrées pour chaque point et une moyenne est effectuée sur 2 jeux d’acquisition par échantillon. Entre chaque échantillon, un lavage de la cuve est réalisé avec 100 pL de tampon Hellmanex II puis un nettoyage abondant à l’eau pure.
1.4/ Marquage fluorescent des polypeptides
1.4.1/ Marquage fluorescent par voie chimique
Dans un premier temps, une colonne PD-10 (GE Healthcare) est utilisée afin de remplacer le tampon de conservation du polypeptide « CPIII-long » par de l’Acide Borique 50 mM, pH 8,5. La concentration du polypeptide par ultrafiltration est nécessaire afin que les conditions de marquages soit optimales : l’objectif est d’avoir une concentration polypeptidique entre 1,5 et 2 mg/mL dans un volume final d’environ 200 pL. Le marquage se fait ensuite, à l’abri de la lumière, par incubation d’1 heure à température ambiante du polypeptide en présence de 50 pg de fluorophore DyLight488 (THERMO SCIENTIFIC®). Le passage sur « Dye Removal Column » (THERMO SCIENTIFIC®) permet d’éliminer l’excès de fluorophore selon le protocole fourni avec les colonnes. Finalement, le tampon est à nouveau modifié à l’aide de Zeba™ Spin (PIERCE®) afin de revenir au tampon de conservation initial, Hepes 20 mM, NaCI 0,15 M, CaCE 5 mM.
G) Concentration en CPU 1 - long | DO 280 nm - (DO 493 nm * CF)) e CP1I1 — long (280 nm)
A la suite du marquage fluorescent, la formule (1) permet de déterminer la concentration protéique dans l’échantillon. Le facteur de correction (CF) est une valeur donnée par le fournisseur qui est de 0,147 pour le DyLight488. Le nombre de molécules de DyLight fixées par molécule de polypeptide se calcule à l’aide de la formule (2).
D0 493nm (2) Nombre de niole de fluorophore par mole de protéines = ' 2 F F F ε Fluorophore. (493 nui)» [CPIII-long |
Un tel marquage fluorescent ne permet pas d’obtenir le coupage orienté sur un site accepteur, qui plus est placé de manière adéquate sur le polypeptide substrat.
Un marquage fluorescent par voie enzymatique a donc été préféré.
1.4,2/ Marquage fluorescent par voie enzymatique
Les transférases, enzymes catalysant le transfert d’un groupe fonctionnel sur une autre molécule, ont été utilisées pour introduire un fluorophore sur un polypeptide substrat d’intérêt. Ce type de marquage est de plus en plus utilisé car il permet d’orienter le marquage vers une séquence spécifique. Ce marquage, dit orienté, peut permettre de choisir la localisation du fluorophore sur le polypeptide d’intérêt par introduction d’un site d’action préférentiel, nommé ici site accepteur de la molécule fluorescente, sur lequel la transférase va catalyser le transfert covalent du fluorophore. D’un point de vue fonctionnel, l’introduction de celui-ci sur une position éloignée des sites importants du polypeptide substrat permet de préserver l’activité dudit polypeptide marqué plus facilement que lors d’un marquage chimique.
La transglutaminase a été choisie pour réaliser un marquage enzymatique.
C’est une protéine ou plutôt un groupe de protéines présentes in vivo dans de nombreux organismes, et dont le rôle principal est de catalyser une modification post-traductionnelle par formation de liaisons isopeptidiques.
Les transglutaminases catalysent une réaction de transamination dépendante du calcium entre le groupement carboxamide d’un résidu glutaminyl d’une protéine et une amine primaire. In vivo, cette amine primaire est souvent le groupement amine en position ε d’un résidu lysyl. Cependant, les transglutaminases présentent une grande tolérance visà-vis de la structure de la molécule contenant l’amine primaire, et, dans le cadre d’un marquage enzymatique, le groupement amine est localisé sur le fluorophore à introduire.
Plusieurs études de criblage s’intéressant à la spécificité des transglutaminase s au niveau du résidu glutaminyl ont montré que des séquences particulières d’acides aminés permettent une activité préférentielle de l’enzyme. L’une de ces séquences est composée des 8 acides aminés HQSYVDPW (SEQ ID NO : 21), elle est spécifique à la transglutaminase de cochon d’inde. L’introduction de cette séquence au sein d’un polypeptide permet ainsi d’orienter le marquage sur un site particulier dudit polypeptide (Fig. 2) plutôt que de voir apparaître des pontages covalents intra- ou intermoléculaires ou encore non spécifiques.
a) Dosage d’activité de la transglutaminase
Le dosage d’activité de la transglutaminase est réalisé selon le protocole fourni par Sigma (Tableau 1). La transglutaminase catalyse le pontage covalent d’une hydroxylamine au niveau du résidu Glutamyl d’un peptide CBZ-Gln-Gly en présence de tampon Tris pH 6,0, de glutathion réduit et de CaCb. En parallèle, un standard d’Acide L-Glutamique γ-Monohydroxamate doit être préparé car il possède un coefficient d’extinction molaire très variable selon les lots.
Tableau 1 : Paramètres mis en œuvre dans le dosage de l’activité de la transglutaminase.
| Test | Blanc du Test | Standard | Blanc du Standard | |
| Cocktail de réaction (mL) | 0,20 | 0,20 | - | - |
| Transglutaminase (mL) | 0,03 | - | - | - |
| Incubation 10 minutes à 37 °C | - | - | - | - |
| H2O (mL) | - | - | - | 0,10 |
| Acide L-Glutamique y- Monohydroxamate 10 niM (mL) | 0,10 | |||
| Acide Trichloracétique 12 % (mL) | 0,50 | 0,50 | 0,50 | 0,50 |
| Transglutaminase (mL) | - | 0,03 | - | - |
| FeCb 5 % (mL) | 0,50 | 0,50 | 0,50 | 0,50 |
L’activité de la transglutaminase est arrêtée par ajout d’acide trichloracétique puis la solution est colorée par le fer. Finalement, la mesure pour chaque échantillon de la DO à 525 nm permet de déduire l’activité de la transglutaminase selon la formule cidessous.
DO Test - DO Blanc do Test [Standard] Μ V total Test
Activi’e IrdusKlijtrf’-i.f’dse (urnSu) = -- X DO Standard - ΠΟ B anc du Standa'd temps- de reaction r« T i 10 mM X H.J.Ï ,'li
DO Test - DO Blanc du Test L 1.1 m L .
- il --—
DO Standard - DO BOnc du Standard 10 minutes
b) Marquage fluorescent par la transglutaminase
Le marquage fluorescent par voie enzymatique du polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » est réalisé pendant 6h à 4 °C en présence de tampon Hepes 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCh 10 mM, MgCh 10 mM pH 7,4. Le protocole optimisé nécessite 7,5 μΜ du polypeptide substrat, 1 mM de la molécule fluorescente FITC-Cadavérine (INTERCHIM®) et 0,01 unité de transglutaminase pour 50 pL de volume.
c) Purification des conjugués fluorescents obtenus après marquage fluorescent par la transglutaminase d’un polypeptide substrat
L’échantillon de conjugués fluorescents est dialysé contre du tampon A (Hepes 20 mM, NaCl 0,3 mM, CaCh 5 mM, pH 7,4). Par la suite, une filtration sur gel S200 16/600 est réalisée dans du tampon A à un débit de 0,75 mL.min1. La dernière étape consiste à passer l’échantillon sur une colonne Sepharose-PCPE-l-His dont le protocole de fabrication est décrit ci-dessous. L’équilibration est réalisée dans du tampon A. Trois étapes de lavages sont ensuite réalisées avec un volume de tampon A équivalent à celui de l’échantillon. L’élution, au moyen d’un tampon glycine 0,1 M pH 2,5, est constituée d’une première fraction d’un volume équivalent à celui de l’échantillon puis de 3 autres fractions d’un volume moitié moindre. Le pH de ces fractions d’élution est immédiatement ajusté afin d’atteindre un pH 8,0 par ajout de 50 pL de tampon Tris 1,5 M pH 8,0 pour 1 mL de fraction d’élution. Ces fractions sont finalement concentrées par ultrafiltration puis dialysées contre le tampon A.
d) Préparation de la résine Sepharose-PCPE-l-His
Afin de fixer l’activateur PCPE-1 sur une colonne, on utilise une résine de Sepharose™ préalablement activée à l’aide de bromure de cyanogène (CNBr-Sepharose, GE HEALTHCARE®). Pour ce faire, un pH basique est nécessaire afin que le groupement ε-ΝΗ2 des résidus lysyl soit déprotoné (Fig. 3). Dans un premier temps, une colonne PD-10 est utilisée afin de remplacer le tampon de conservation de l’activateur PCPE-l-His par du tampon NaHCÜ3 0,1 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3 avant que la protéine ne soit concentrée par ultrafiltration afin d’en obtenir 1,5 mL à 3 mg.mL1.
Le couplage est réalisé à l’aide de 0,3 g de Sepharose activée. Lne désactivation partielle de celle-ci est nécessaire afin que les protéines fixées ne soient pas trop proches les unes des autres : la phase est incubée 10 minutes avec 2 mL de NaHCÜ3 0,1 M, NaCI 0,5 MpH 8,3.
Après élimination du surnageant par centrifugation (5 minutes à 1 500xg, 4 °C), le couplage est réalisé par mise en contact de l’activateur PCPE-l-His avec cette phase durant 16 heures sous agitation douce à 4 °C. Par la suite, la phase est rincée à deux reprises avec 15 mL de tampon NaHCÜ3 0,1 M, NaCI 0,5 M pH 8,3. Le tampon est éliminé par centrifugation (5 minutes à 1 500xg, 4 °C) puis les groupements réactifs restants sont bloqués par ajout de 12 mL de tampon Tris 0,1 M, NaCI 0,5 M, pH 8,0. La phase est de nouveau rincée par 4 cycles de 10 mL d’AcONa 0,1 M, NaCI 0,5 M pH 4 suivis de 10 mL de NaHCÜ3 0,1 M, NaCI 0,5 M pH 8,3. La phase Sepharose-PCPE-l-His, d’un volume final de 2 mL, est alors prête à l’emploi pour purifier le conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC », à savoir le polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » marqué par le fluorophore.
1.5/ Suivi cinétique de l’activité de la protéase BMP-1 par polarisation de fluorescence
1.5,1/ Paramétrage du fluorimètre
L’appareil utilisé est un fluorimètre (Mithras LB 940, BERTHOLD TECHNOLOGIES®) permettant des mesures de polarisation et programmé dans le mode «Fluorescence Polarization Repeated ». L’énergie de la lampe est paramétrée à 65000 unités arbitraires (équivalents à 75 watts) afin d’obtenir une sensibilité de détection optimale. La lecture de l’échantillon se fait dans une plaque noire de 96 puits de qualité « non binding surface » (GREINER®). Une lumière excite les fluorophores de type FITC à une longueur d’onde de 485 nm puis la fluorescence réémise à une longueur d’onde de 535 nm est mesurée durant 0.5 seconde selon les deux orientations P Plane et S Plane. L’intervalle de temps entre 2 acquisitions sur un même puits est généralement de 30 secondes mais il peut être modulé selon le nombre total d’échantillons.
1.5,2/ Mesure des signaux de polarisation de fluorescence
Les différents substrats fluorescents utilisés sont introduits dans un volume final de 100 pL de tampon. Pour le substrat FITC-Caséine, il s’agit de tampon Tris 10 mM, NaCl 0,15 M, CaCh 5 mM, Brij 0,02 %, pH 7,8 et pour les conjugués fluorescents CPIIITGase-FITC, de tampon Hepes 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCh 5 mM, octyl-P,Dglucopyranoside 0,02 %, pH 7,4. Une pré-incubation de la plaque durant 10 minutes à 37 °C est systématiquement réalisée avant l’introduction de la protéase BMP-1 afin d’homogénéiser la température de l’échantillon. A la suite, la protéase est rapidement ajoutée dans chacun des puits avant de démarrer l’acquisition.
1.5,3/ Traitement des résultats
En premier lieu, pour tout type d’expérience il est nécessaire de prendre en compte le bruit de fond mesuré en P Plane et en S Plane par l’ensemble des molécules à l’exception du substrat fluorescent (tampon, protéase...). Ainsi, à partir de ces corrections, la véritable valeur du mP peut être calculée, selon la formule ci-dessous, et les courbes « mP = f(temps) » peuvent être tracées. Cette correction permet notamment d’ajuster les différents départs de chaque courbe.
Plane - P Plane mP = '
Plane + P Plane
a) Mesure d’une activité protéasique
L’unité « mP » étant difficile à appréhender, on peut exprimer les résultats en termes de « [produit formé] au cours du temps ». Pour ce faire, il faut dans un premier temps déterminer le AmP maximal correspondant à la différence entre le mP lu lorsque le conjugué fluorescent est entièrement clivé et le mP lu dans le témoin sans protéase. A partir de cette valeur, il est possible de calculer un pourcentage de conjugué fluorescent clivé à un temps t selon la formule « (AmP à un temps t / AmP maximal) * 100 » ou une concentration de conjugué fluorescent clivé (à partir de la concentration initiale de conjugué fluorescent). Par différence, on obtient finalement la concentration de produit formé pour chaque point d’acquisition et on peut donc tracer la courbe « concentration de produit formé [P] = f(temps) ». A partir de ces données, l’intégration de l’équation de Michaelis-Menten permet de déterminer une valeur de kcat/Km.
|P] « [5oj ( 1 — exp( — k < )) .w'r k
Km
b) Mesure d’une constante d’affinité
Le conjugué fluorescent CPIII-long-TGase-FITC est incubé en présence d’une gamme de concentrations croissantes de partenaire jusqu’à saturation du signal. Ce «plateau» signifie que 100 % des molécules de conjugué fluorescent CPIII-FITC ont interagi avec le partenaire. Par proportionnalité avec la valeur maximale d’amplitude du signal, on peut ensuite calculer les concentrations de protéines liées dans chaque essai et, par déduction, obtenir les concentrations de protéines libres. Les signaux étant parfois fluctuants, il est préférable de calculer une moyenne de l’amplitude du signal sur 40 minutes pour chaque concentration testée.
2/ Résultats
2,1/ Construction du CPIII-long-TGase et du CPIII-court-TGase
Une construction a été mise au point à partir du vecteur préexistant pHLsecCPIII-long (expression en cellules de mammifères 293T ; Fig. 1). L’étiquette TGase a été positionnée du côté N-terminal du CPIII-long pour que le fluorophore soit localisé sur le plus petit fragment à la suite du clivage par la protéase BMP-1. En effet, le fragment N-terminal libéré par la protéase BMP-1 a une taille d’environ 6 kDa tandis que le fragment C-terminal, homo-trimérique, a une taille de 3 x 27 kDa (Fig. 5A). De plus, les ponts disulfures interchaînes responsables de l’homo-trimérisation du CPIII sont situés au niveau du fragment C-terminal, ce qui accroît cette différence de taille. Ainsi, la mobilité du fluorophore sera nettement plus importante après clivage par BMP-1 (Fig. 5B).
Ce polypeptide substrat sera appelé « CPIII-long-TGase » par la suite. Une deuxième construction nommée CPIII-court-TGase a été obtenue de la même façon et possède seulement 4 résidus du côté N-terminal en plus de la séquence TGase et du tag 6His.
2,2/ Production et purification du CPIII-long-TGase et du CPIII-court-TGase
La production des polypeptides substrat a été testée dans des cellules embryonnaires de rein humain HEK-293T transfectées de façon transitoire par un plasmide codant pour les polypeptides substrats.
2,2,1/Purification des polypeptides substrats
La première étape de purification met à profit l’étiquette 6-histidines du polypeptide par une chromatographie d’affinité pour le cobalt.
Au cours de cette chromatographie (Fig. 6A), on observe l’élimination de contaminants protéiques lors des étapes de lavage puis Félution du polypeptide d’intérêt lors du gradient (à une concentration approximative de 150 mM d’imidazole). L’analyse des fractions d’élution par SDS-PAGE (Fig. 6B) et par western blot a confirmé qu’il s’agissait bien du polypeptide substrat. Par ailleurs, on peut observer que la totalité du polypeptide d’intérêt présent dans le surnageant de culture (SN) a bien été fixée par la résine cobalt puisque la bande correspondante n’est plus visible dans la fraction « non retenue » (NR).
La seconde étape de purification est une chromatographie par filtration sur gel qui permet de séparer les polypeptides selon leurs poids moléculaire. Le chromatogramme montre une élution du polypeptide substrat sous la forme d’un pic relativement homogène à la taille attendue (Fig. 7).
2,3/ Caractérisation biochimique et structurale
Avant de réaliser le marquage fluorescent du polypeptide substrat « CPIIIlong-TGase » purifié, il a été vérifié qu’il est bien clivé par la protéase BMP-1 et que ce clivage est activé par l’activateur PCPE-1. En effet, l’ajout du peptide ‘FLUO’ (séquence « TGase ») en amont du peptide ‘CIBLE’ (substrat modèle « CPIII-long ») a pu entraîner des modifications structurales conduisant à une perte de reconnaissance par les autres partenaires du complexe protéolytique.
2,3,1/ Vérification du clivage par la protéase BMP-1 et de l’activation par 1 ’ activateur PCPE-1
Le clivage par la protéase BMP-1 des polypeptides substrats pro-collagéniques conduit à l’apparition de plusieurs bandes de tailles inférieures du fait de leur nature trimérique. En effet, il existe plusieurs produits intermédiaires selon que le clivage affecte une, deux ou trois chaînes. On appelle polypeptide « CPIII » (C-propeptide III) le fragment C-terminal libéré à la suite du clivage par la protéase.
L’analyse SDS-PAGE (Fig. 8) montre un clivage du polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » en présence de la protéase BMP-1. De plus, ce clivage est dépendant de la quantité de protéase BMP-1 puisqu’une concentration croissante en protéase induit un taux de clivage plus important du polypeptide substrat. En présence de l’activateur PCPE1, on observe un taux de clivage plus important à concentration de protéase BMP-1 identique (conditions avec 5 nM de BMP-1). De ce fait, le polypeptide substrat « CPIIIlong-TGase » est bien substrat de la protéase BMP-1 et l’activateur PCPE-1 est, quant à lui, capable de réguler positivement cette réaction de protéolyse.
Dans le but de quantifier l’activité in vitro de la protéase BMP-1 sur les polypeptides « CPIII-long-TGase » et de « CPIII-long »., une incubation in vitro des 2 partenaires est réalisée puis les échantillons sont analysés par SDS-PAGE en conditions dénaturantes. Le gel est ensuite coloré au SYPRO Ruby et le taux de clivage pour chaque échantillon est quantifié par mesure d’un rapport densitométrique entre la bande correspondante à la forme « CPIII » et l’ensemble des bandes du polypeptide (formes entière et clivée). Les résultats (Fig. 9) montrent un taux de clivage du polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » par BMP-1 similaire à celui du témoin, à la fois en absence et en présence de PCPE-1.
2,3,2/ Analyse du rayon hydrodynamique par DLS
Une expérience de DLS (Dynamic Light Scattering) est réalisée afin de confirmer que l’ajout de la séquence TGase n’induit pas de modification du rayon hydrodynamique des différentes protéines. Par ailleurs, cette expérience permet également d’avoir une information sur la « polydispersité » qui représente l’homogénéité de masse de l’ensemble des molécules au sein d’un échantillon.
Les résultats permettent de déterminer un diamètre moyen de 8,24 nm pour le polypeptide témoin « CPIII-long » et un diamètre moyen de 8,91 nm pour le polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » (Fig. 10 et Tableau 2). Ces diamètres étant relativement proches, on peut considérer que les polypeptides sont dans un état multimérique identique.
Par ailleurs, les mesures de polydispersité donnent des résultats relativement similaires (0.296 pour CPIII-long et 0.416 pour CPIII-long-TGase) mais indiquent une hétérogénéité légèrement plus importante des solutions de CPIII-long-TGase.
Tableau 2 : Résultats des mesures de DLS sur la moyenne de 3 réplicats pour chaque polypeptide testé.
| Diamètre | Polydispersité | |
| CPIII-long | 8,24 nm | 0,296 |
| CPIII-long-TGase | 8,91 nm | 0,416 |
2,4/ Marquage fluorescent par la transglutaminase
De nombreux paramètres peuvent être ajustés afin d’optimiser l’efficacité et la spécificité du marquage fluorescent par la transglutaminase : quantité d’enzyme et de substrat, température et temps d’incubation.
Dans la littérature, les conditions généralement utilisées pour ce type de marquage fluorescent peuvent très largement varier selon les auteurs. Cependant, certains paramètres réactionnels apparaissent plus fréquemment tels qu’une température ne dépassant pas les 25 °C ou l’utilisation d’une faible concentration d’enzyme avoisinant les 0,01 unité pour 50 pL de volume réactionnel. Ces paramètres ont servi de base pour l’optimisation du marquage fluorescent du polypeptide substrat par la transglutaminase.
2,4,1/ Optimisation de l’efficacité du marquage fluorescent
Une meilleure efficacité du marquage fluorescent permet de rendre le conjugué comprenant le polypeptide substrat plus fluorescent et ainsi d’augmenter la sensibilité de détection. Une quantité moindre de polypeptide pourra être consommée pour des résultats plus précis. Plusieurs conditions de température et de temps de réaction ont été testées afin d’optimiser l’efficacité du marquage fluorescent en présence de la transglutaminase et du fluorophore FITC-Cadavérine. A la suite du marquage, les différents échantillons sont analysés par SDS-PAGE puis leur fluorescence est révélée et quantifiée à l’aide d’un scanner de fluorescence.
Les résultats de cette analyse révèlent une intensité de fluorescence plus importante pour les échantillons dont le marquage a été réalisé à faible température et à temps d’incubation plus court (Fig. 12A (pistes 1 à 10) et 12B). La révélation du même gel par coloration au bleu de Coomassie (Fig. 12A (pistes 11 à 20)) montre que ces résultats ne sont pas biaisés par des différences de quantités de polypeptides analysés sur gel. Initialement, on pouvait s’attendre à l’inverse puisque la plupart des enzymes ont un effet catalytique plus important avec un temps d’incubation plus long et une température de 37 °C. Cependant, ce test ne mesure vraisemblablement pas le taux de catalyse mais plutôt la fluorescence résiduelle après marquage : il est possible qu’avec un temps d’incubation prolongé, un phénomène de photo-blanchiment ait lieu. Ainsi, en prenant en compte uniquement ce paramètre de « sensibilité », les conditions de marquage les plus favorables sont une température de 4 °C et un temps d’incubation inférieur à 6h.
2,4,2/ Optimisation de la spécificité du marquage fluorescent
Afin de suivre de manière optimale le clivage protéolytique du polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » par polarisation de fluorescence, il est souhaitable d’obtenir un marquage spécifique au niveau de son extrémité N-terminale. Différentes conditions de température et de temps de réaction du marquage fluorescent sont donc testées afin d’étudier sa spécificité.
Pour ce faire, le marquage est réalisé de la même manière que précédemment. A la suite de celui-ci, les différents échantillons sont incubés en absence ou en présence d’un excès de protéase BMP-1 avant d’être analysés par SDS-PAGE (Fig. 13A). De ce fait, le taux de marquage non spécifique est mesuré selon le rapport:
lirrrilcA fuiin-sren.x: rêsicLd e du Œli hiliii·, k de îlifon·-,! pii i Mil' l.i i-uf k·! ..n ,;fil i 1m. „·μ |:,ϋ’ BML 1
Cette analyse révèle que le marquage devient de moins en moins spécifique lors d’une incubation prolongée et quand la température augmente entre 4 °C et 37 °C (Fig. 13B). Ainsi, plus la transglutaminase est active, plus sa propension à catalyser le marquage sur des zones non spécifiques est importante. Ln marquage à 4 °C durant moins de 6h semble préférable afin d’obtenir une spécificité de marquage correcte. Les résultats en termes de spécificité du marquage vont donc dans le même sens que ceux obtenus en termes d’efficacité.
2,4,3/ Purification du conjugué obtenu après marquage fluorescent du polypeptide substrat
A la suite du marquage fluorescent, il est nécessaire d’éliminer l’ensemble des réactifs utilisés au cours de celui-ci. Dans un premier temps, une purification par filtration sur gel est réalisée afin d’éliminer l’excès de fluorophore. Au cours de celle-ci, on remarque l’apparition, suite au marquage fluorescent, d’une quantité non négligeable de formes agrégées du conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC ». Bien que ces agrégats soient entièrement séparés par cette filtration sur gel, l’analyse par SDS-PAGE (Fig. 14) révèle aussi que des traces de fluorophore libre ainsi que la transglutaminase sont toujours présentes dans les fractions comprenant le conjugué fluorescent « CPIII-longTGase-FITC ». Une étape de purification supplémentaire est donc nécessaire.
Dans un premier temps, la présence de l’étiquette 6-histidines sur le conjugué fluorescent a été mise à profit pour éliminer les contaminants par passage sur une colonne Ni-NTA-sepharose. Malheureusement, les premiers essais ont montré que le polypeptide « CPIII-long-TGase » ne se fixe plus sur la résine après marquage fluorescent au FITC. Fe fluorophore étant positionné directement en amont de l’étiquette 6-histidines, un encombrement stérique en est vraisemblablement la cause.
Un nouvel outil de purification a donc été développé. En effet, les polypeptides de type « CPIII » ont une très bonne affinité pour l’activateur PCPE-1 et il est donc envisageable de les purifier en exploitant cette affinité. Ainsi, 3.4 mg de PCPE-l-His ont été produits en cellules HEK-293-EBNA et purifiés, puis greffés avec un rendement de 94 % sur une résine de Sepharose. Cette colonne « PCPE-1 » a été utilisée pour purifier le conjugué fluorescent.
L’analyse par SDS-PAGE (Fig. 15) de la purification montre que l’excès de fluorophore ainsi que la transglutaminase se trouvent dans les fractions « non-retenues » et « lavages ». Le conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC » a, quant à lui, bien été fixé par interaction avec l’activateur PCPE-1 puis élué à pH acide. De ce fait, la colonne Sepharose-PCPE-1 a permis de séparer les contaminants du conjugué fluorescent d’intérêt avec un rendement supérieur à 90 %.
L’ensemble des étapes de marquage enzymatique et de purification ont permis d’obtenir 700 pg de conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC » à partir de 3 mg de polypeptide substrat« CPIII-long-TGase » non marqué. Le rendement de 25 % est plutôt faible mais s’explique essentiellement par l’agrégation partielle de l’échantillon au cours du marquage.
2,4,4/ Test de clivage après obtention du conjugué fluorescent
A la suite du marquage fluorescent ainsi que des nombreuses étapes de purification consécutives, un nouveau test de clivage par la protéase BMP-1 du conjugué fluorescent comprenant le polypeptide substrat « CPIII-long-TGase » est nécessaire. L’analyse par SDS-PAGE (Fig. 16 ; pistes 1 à 4) confirme que la protéase BMP-1 clive le conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC » pour former un premier fragment Nterminal (Nter) et un deuxième fragment peptidique comprenant une grande partie du peptide ‘CIBLE’ « CPIII ». De plus, ce clivage est activé en présence de l’activateur PCPE-1.
L’analyse de la fluorescence (Fig. 16; pistes 5 à 7) montre également que la partie CPIII, obtenue à la suite du clivage par la protéase BMP-1, a une fluorescence négligeable par rapport à celle de la molécule entière. Ce résultat confirme que la très grande majorité des fluorophores sont localisés au niveau de l’extrémité N-terminale. La spécificité du marquage pour le peptide ‘FLUO’ consistant en la séquence TGase (site accepteur d’une molécule fluorescente) situé en Nter est donc bien optimisée dans les conditions utilisées.
2,5/ Polarisation de fluorescence
La polarisation de fluorescence a ensuite été utilisée afin d’observer et de quantifier le clivage du conjugué fluorescent « CPIII-long-TGase-FITC » par la protéase BMP-1.
2,5,1/ Validation du suivi cinétique par polarisation de fluorescence
En polarisation de fluorescence, une plus grande mobilité de la molécule fluorescente entraîne une dépolarisation partielle qui se traduit par une baisse de la valeur du signal exprimé en mP. C’est ce que l’on peut observer au travers des courbes décroissantes lors du suivi cinétique de l’activité de la protéase BMP-1 (Fig. 17).
On observe également une décroissance linéaire des courbes témoins (courbes 1 et 2) alors qu’il n’y a pas de clivage au sein des échantillons correspondants. Ce phénomène est imputable à un photo-blanchiment entraînant une dépolarisation partielle des molécules fluorescentes au cours du temps. Néanmoins, le clivage par la protéase BMP-1 reste facilement observable car une décroissance plus importante du signal est observée pour les courbes en présence de la protéase BMP-1 (courbes 3 et 4).
Par ailleurs, la présence de l’activateur PCPE-1 entraîne un déplacement vers le haut du signal de la courbe témoin 1 par rapport à la courbe témoin 2. Ce décalage est constant au cours du temps et indique une moindre mobilité du conjugué fluorescent CPIIIFITC en présence de l’activateur PCPE-1. L’affinité entre ces 2 protéines étant très forte (Kd ~ entre 5 et 10 nM), l’augmentation de signal est due à la formation d’un complexe stable entre l’activateur PCPE-1 et le conjugué fluorescent CPIII-FITC.
Lorsque le clivage par la protéase BMP-1 est total, les courbes en absence et en présence de l’activateur PCPE-1 convergent vers des valeurs identiques. En effet, le site d’interaction de l’activateur PCPE-1 est localisé au niveau de la partie C-terminale non fluorescente du conjugué fluorescent CPIII-FITC. De ce fait, l’activateur PCPE-1 n’impacte plus la mobilité de la molécule fluorescente après clivage par la protéase BMP-1.
A titre de comparaison, un essai similaire de polarisation de fluorescence a été réalisé sur un CPIII-long rendu fluorescent à l’aide d’un marquage chimique au Dylight488. Ce type de marquage n’est pas spécifique contrairement au marquage enzymatique. Les molécules fluorescentes sont fixées de façon aléatoire sur les amines libres réparties sur l’ensemble de la molécule et non uniquement sur son extrémité Nterminale. De ce fait, le clivage par la protéase BMP-1 n’entraine pas une grande différence de mobilité des molécules fluorescentes et les différences de signaux sont trop faibles pour être exploitées (Fig. 18).
Cette première analyse du suivi cinétique de l’activé de la protéase BMP-1 par polarisation de fluorescence a donc permis de valider la démarche et de montrer l’intérêt du marquage enzymatique. Par ailleurs, ces premiers résultats montrent que de nouvelles applications sont également envisageables telle que la détermination de la constante d’affinité de l’activateur PCPE-1 pour le polypeptide CPIII-long ou l’étude de mutations de l’activateur PCPE-1.
2,5,2/ Mesure des constantes cinétiques
Les mesures d’activité réalisées par polarisation de fluorescence permettent d’estimer les constantes cinétiques et de comparer l’activité de la protéase BMP-1 en présence et en absence de l’activateur PCPE-1. Pour ce faire, les unités de polarisation « mP en fonction du temps » sont normalisées à l’aide des contrôles et transformées en unités d’activité plus communes correspondant aux concentrations de produit formé en fonction du temps.
Lne intégration de l’équation de Michaelis-Menten (Fig. 19) avec le logiciel Prism permet d’estimer la valeur de kcat/Km à partir de ces courbes. De cette manière, on détermine un kcat/Km de 0,00350 ± 0,00005 min'fnM1 en absence de l’activateur PCPE-1 et de 0,01573 ± 0,00026 min'fnM1 en présence de l’activateur PCPE-1. La présence de l’activateur PCPE-1 induit donc une activation d’un facteur 4,5 de la réaction de protéolyse.
2,5,3/ Inhibition de l’activité de la protéase BMP-1
Les applications envisagées du polypeptide substrat incluent le criblage d’inhibiteurs de l’action des protéases astacines et le criblage d’antagonistes des modulateurs des astacines. Pour cela, il est nécessaire de pouvoir suivre convenablement une inhibition de l’activité de protéolyse. L’effet de différents inhibiteurs de la protéase BMP-1, de nature protéique (Sizzled) ou synthétique (33A), a donc été analysé par polarisation de fluorescence
Le suivi de l’activité de la protéase BMP-1 en présence de l’inhibiteur Sizzled (Fig. 20) révèle un léger déplacement vers le haut du signal de base, à l’image de ce qui a précédemment été observé en présence de l’activateur PCPE-1. Ce résultat indique une interaction directe entre l’inhibiteur Sizzled et le polypeptide CPIII-long.
Par ailleurs, les courbes en présence de l’inhibiteur Sizzled (courbes 3 et 4) se superposent de bout en bout qu’il y ait ou non du BMP-1. De ce fait, il n’y a aucune activité de la protéase BMP-1 visible en présence de l’inhibiteur Sizzled. Ce résultat est confirmé par une analyse SDS-PAGE. L’activité inhibitrice de l’inhibiteur Sizzled est donc parfaitement observable par polarisation de fluorescence.
Le suivi de l’activité de la protéase BMP-1 en présence de l’inhibiteur 33A (Fig. 21) ne révèle aucun déplacement du signal de base. En revanche, en présence de 20 nM de l’inhibiteur 33A, on peut observer une inhibition de l’activité de la protéase
BMP-1. A plus forte concentration de l’inhibiteur 33A (200 nM), cette activité est totalement inhibée puisque la courbe 4 se superpose à la courbe 1 du témoin d’absence de clivage.
2,5,4/ Analyse de mutants de PCPE-1 et détermination de constantes d’affinité
Le fait de pouvoir détecter une interaction avec le conjugué fluorescent CPIIIlong-TGase-FITC permet de comparer les conséquences de mutations portées par différents interactants de la molécule. Un décalage de signal moins important induit par 2 mutants de l’activateur PCPE-1 (D109A et D68A), par rapport à celui causé par l’activateur PCPE-1 non muté, a ainsi été observé. La taille des formes mutées et non mutées de l’activateur PCPE-1 étant sensiblement identique, cette différence résulte uniquement d’une fixation moins importante qui est révélatrice d’une affinité moindre des PCPE-1 mutés pour le conjugué fluorescent « CPIII-FITC ». Ces résultats confirment ceux obtenus par résonance plasmonique de surface.
Ces études d’interactions peuvent également permettre de déterminer la constante d’affinité d’une interaction. Pour ce faire, une gamme de concentrations croissantes de l’activateur PCPE-1 est mélangée au conjugué fluorescent CPIII-longTGase-FITC jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’augmentation du signal (Fig. 22A). Ce « plateau » signifie que le maximum d’interaction a été atteint et permet de définir la valeur maximale d’amplitude du signal. Par proportionnalité avec cette valeur, on peut ensuite calculer les concentrations de conjugués fluorescents liés dans chaque essai et, par déduction, obtenir les concentrations de conjugués fluorescents libres. La représentation graphique de saturation de la liaison permet finalement d’estimer la valeur de la constante d’affinité (Fig. 22B). Ainsi, un Kd de 35 nM est déterminé pour l’interaction entre l’activateur PCPE-1 et le conjugué fluorescent CPIII-FITC par polarisation de fluorescence.
2,5,5/ Mesure de l’activité de BMP-1 dans un mélange complexe
La polarisation de fluorescence peut également être utilisée pour détecter la présence de la protéase BMP-1 active au sein d’un échantillon complexe de protéines. L’activité de la protéase BMP-1 présente dans des surnageants de culture issus de cellules HT 1080 transfectées par un vecteur codant pour la protéase BMP-1 (HT1080-BMP-1) ou non transfectées (HT1080-NT) a pu être ainsi mesurée. Les résultats (Fig. 23A et 23B) montrent logiquement une activité plus importante au sein du surnageant HT1080-BMP-1.
Néanmoins, une activité basale est tout de même mesurée dans le surnageant HT1080-NT. Cette activité est dépendante de la protéase BMP-1 puisqu’elle disparait suite à l’ajout d’inhibiteurs spécifiques de ladite protéase, tels que l’inhibiteur 33A. Notons que l’activité du BMP-1 endogène des cellules HT1080-NT n’avait jamais pu être détectée auparavant.
L’analyse SDS-PAGE (Fig. 23C) confirme les résultats de la polarisation de fluorescence.
SEQUENCES UTILISEES DANS LE CADRE DE L’INVENTION
SEQ ID NO : 1 - étiquette « Avi »
GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO : 2 - étiquette « calmoduline »
I<RRWI<I<NF IA VS AANRFKKIS S SG AL
SEQ ID NO : 3 - étiquette « polyglutamate »
EEEEEE
SEQ ID NO : 4 - étiquette « E »
GAPVPYPDPLEPR
SEQ ID NO : 5 - étiquette « FLAG »
DYKDDDDK
SEQ ID NO : 6 - étiquette « HA »
YPYDVPDYA
SEQ ID NO : 7 - étiquette « His »
HHHHHH
SEQ ID NO : 8 - étiquette « Myc »
EQKLISEEDL
SEQ ID NO : 9 - étiquette « S »
KETAAAKFERQHMDS
SEQ ID NO : 10 - étiquette « SBP »
MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP
SEQ ID NO : 11 - étiquette « Softag 1 »
SLAELLNAGLGGS
SEQ ID NO : 12 - étiquette « Softag 3 »
TQDPSRVG
SEQ ID NO : 13 - étiquette « Strep »
WSHPQFEK
SEQ ID NO : 14 - étiquette « TC »
CCPGCC
SEQ ID NO : 15 - étiquette « V5 »
GKPIPNPLLGLDST
SEQ ID NO : 16 - étiquette « VSV »
YTDIEMNRLGK
SEQ ID NO : 17 - étiquette « Xpress »
DLYDDDDK
SEQ ID NO : 18 - étiquette « Isopeptag »
TDKDMTITFTNKKDAE
SEQ ID NO : 19 - étiquette « Spy »
AHIVMVDAYKPTK
SEQ ID NO : 20 - étiquette « Snoop »
KLGDIEFIKVNK
SEQ ID NO : 21 - site reconnu par la transglutaminase
HQSYVDPW
SEQ ID NO : 22 - site reconnu par la transglutaminase
PNPQLPF
SEQ ID NO : 23 - site reconnu par la transglutaminase
PKPQQFM
SEQ ID NO : 24 - site reconnu par la transglutaminase
GQQQLG
SEQ ID NO : 25 - site consensus de clivage par des protéases de la famille des astacines
X1X2X3X4DEX7X8
SEQ ID NO : 26 - site consensus de clivage par des protéases de la famille des astacines
XlX2X3X4X5X6X7X8
SEQ ID NO : 27 - site consensus de clivage par des protéases de la famille des astacines
XlX2X3X4X5X6X7X8
SEQ ID NO : 28 - 3 derniers triplets de la triple hélice de collagène III
GPPGPPGAP
SEQ ID NO : 29 - domaine C-télopeptide
GPCCGGVCAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG
SEQ ID NO : 30 - domaine C-terminal d’une molécule de pro-collagène
DEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEY
WVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGES
MDGGFQFSYGNPELPEDVLDVQLAFLRLLSSRASQQITYHCKNSIAYMDQASGNV
KKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPI
VDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL
SEQ ID NO : 31 - Séquence protéique de la construction CPIII-long-TGase (avec séquence signal issue de pHLSec)
MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETGHQSYVDPWHHHHHHSAGPPGPPGA
PGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESL
ISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCIS
ANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVQLAFL
RLLSSRASQQITYHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTV
LEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL
SEQ ID NO : 32 - Séquence protéique mature de la construction CPIII-long-TGase (sans séquence signal issue de pHLSec)
ETGHQSYVDPWHHHHHHSAGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPY
YGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGE
YWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFG
ESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVQLAFLRLLSSRASQQITYHCKNSIAYMDQASG
NVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVR
LPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL
SEQ ID NO : 33 - Séquence nucléotidique de la construction CPIII-long-TGase clonée dans le plasmide pHLsec aux sites Agel et Xhol
GAATTCAAGCTTGCCACCATGGGGATCCTTCCCAGCCCTGGGATGCCTGCGCT
GCTCTCCCTCGTGAGCCTTCTCTCCGTGCTGCTGATGGGTTGCGTAGCTGAAAC
CGGTCACCAATCTTATGTGGATCCTTGGCACCACCACCATCACCACTCCGCGG
GCCCTCCTGGACCTCCTGGTGCCCCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTGTTGGAGCCG
CTGCCATTGCTGGGATTGGAGGTGAAAAAGCTGGCGGTTTTGCCCCGTATTAT
GGAGATGAACCAATGGATTTCAAAATCAACACCGATGAGATTATGACTTCACT
CAAGTCTGTTAATGGACAAATAGAAAGCCTCATTAGTCCTGATGGTTCTCGTA
AAAACCCCGCTAGAAACTGCAGAGACCTGAAATTCTGCCATCCTGAACTCAAG
AGTGGAGAATACTGGGTTGACCCTAACCAAGGATGCAAATTGGATGCTATCAA
GGTATTCTGTAATATGGAAACTGGGGAAACATGCATAAGTGCCAATCCTTTGA
ATGTTCCACGGAAACACTGGTGGACAGATTCTAGTGCTGAGAAGAAACACGTT
TGGTTTGGAGAGTCCATGGATGGTGGTTTTCAGTTTAGCTACGGCAATCCTGAA
CTTCCTGAAGATGTCCTTGATGTGCAGCTGGCATTCCTTCGACTTCTCTCCAGC
CGAGCTTCCCAGCAAATCACATATCACTGCAAAAATAGCATTGCATACATGGA
TCAGGCCAGTGGAAATGTAAAGAAGGCCCTGAAGCTGATGGGGTCAAATGAA
GGTGAATTCAAGGCTGAAGGAAATAGCAAATTCACCTACACAGTTCTGGAGGA
TGGTTGCACGAAACACACTGGGGAATGGAGCAAAACAGTCTTTGAATATCGAA
CACGCAAGGCTGTGAGACTACCTATTGTAGATATTGCACCCTATGACATTGGT
GGTCCTGATCAAGAATTTGGTGTGGACGTTGGCCCTGTTTGCTTTTTATAACTC
GAG
SEQ ID NO : 34 - Séquence protéique mature de la construction CPIII-court-TGase (sans séquence signal issue de pHLSec)
ETGHQSYVDPWHHHHHHGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPA RNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKH WWTDS S AEKKHVWFGESMDGGFQF S YGNPELPEDVLD VQLAFLRLLS SRASQQIT YHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGE WSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL
SEQ ID NO : 35 - Séquence nucléotidique de la construction CPIII-court-TGase clonée dans le plasmide pHLsec aux sites Agel et Xhol
GAATTCAAGCTTGCCACCATGGGGATCCTTCCCAGCCCTGGGATGCCTGCGCT
GCTCTCCCTCGTGAGCCTTCTCTCCGTGCTGCTGATGGGTTGCGTAGCTGAAAC
CGGTCACCAATCTTATGTGGATCCTTGGCACCACCACCATCACCACGGAGATG
AACCAATGGATTTCAAAATCAACACCGATGAGATTATGACTTCACTCAAGTCT
GTTAATGGACAAATAGAAAGCCTCATTAGTCCTGATGGTTCTCGTAAAAACCC
CGCTAGAAACTGCAGAGACCTGAAATTCTGCCATCCTGAACTCAAGAGTGGAG
AATACTGGGTTGACCCTAACCAAGGATGCAAATTGGATGCTATCAAGGTATTC
TGTAATATGGAAACTGGGGAAACATGCATAAGTGCCAATCCTTTGAATGTTCC
ACGGAAACACTGGTGGACAGATTCTAGTGCTGAGAAGAAACACGTTTGGTTTG
GAGAGTCCATGGATGGTGGTTTTCAGTTTAGCTACGGCAATCCTGAACTTCCTG
AAGATGTCCTTGATGTGCAGCTGGCATTCCTTCGACTTCTCTCCAGCCGAGCTT
CCCAGCAAATCACATATCACTGCAAAAATAGCATTGCATACATGGATCAGGCC
AGTGGAAATGTAAAGAAGGCCCTGAAGCTGATGGGGTCAAATGAAGGTGAAT
TCAAGGCTGAAGGAAATAGCAAATTCACCTACACAGTTCTGGAGGATGGTTGC
ACGAAACACACTGGGGAATGGAGCAAAACAGTCTTTGAATATCGAACACGCA
AGGCTGTGAGACTACCTATTGTAGATATTGCACCCTATGACATTGGTGGTCCTG
ATCAAGAATTTGGTGTGGACGTTGGCCCTGTTTGCTTTTTATAACTCGAG
Les séquences suivantes (SEQ ID NO : 36 à SEQ ID NO : 74) représentent les séquences des sites de clivage par des protéases de la famille des astacines :
SEQ ID NO : 36
YYRADDAN
SEQ ID NO : 37
FYRADQPR
SEQ ID NO : 38
YMRADQAA
SEQ ID NO : 39
PYYGDEPM
SEQ ID NO : 40
QLLDDGNG
SEQ ID NO : 41
TPQSQDPN
SEQ ID NO : 42
EFTEDQAA
SEQ ID NO : 43
SFQQAQAQ
SEQ ID NO : 44
GMQADADD
SEQ ID NO : 45
AAQAQEPQ
SEQ ID NO : 46
LMQEDEAI
SEQ ID NO : 47
RPQNQQPH
SEQ ID NO : 48
FMMNDEEA SEQ ID NO : 49
QLQKDEAI SEQ ID NO : 50
FMLEDEAS SEQ ID NO : 51
RMVGDDPY SEQ ID NO : 52
VAVGDSTG SEQ ID NO : 53
VRSSDTPP SEQ ID NO : 54
SYAADTAG SEQ ID NO : 55
CYSGDENP SEQ ID NO : 56
EKQSDDPE SEQ ID NO : 57
SMQGDDPN SEQ ID NO : 58
RSYSDRGE SEQ ID NO : 59
PMQADGPR SEQ ID NO : 60
DVQRDDSS SEQ ID NO : 61
DFQGDALQ SEQ ID NO : 62
IPSLDQEK SEQ ID NO : 63
YFIQDRFL
SEQ ID NO : 64
EEMGDEEV SEQ ID NO : 65
RILLDPGA SEQ ID NO : 66
GFPGDMDE SEQ ID NO : 67
RFMEENEG SEQ ID NO : 68
ESQSTDTQ SEQ ID NO : 69
SGGNDAPG SEQ ID NO : 70
LQMADEES SEQ ID NO : 71
NSHNDDAL SEQ ID NO : 72
EIQSDQNL SEQ ID NO : 73
FWQQDEPP SEQ ID NO : 74
AIPNDDTL
Les séquences suivantes (SEQ ID NO : 75 à SEQ ID NO : 82) représentent les séquences des sites accepteurs d’une molécule fluorescente.
SEQ ID NO: 75 - site reconnu par la sortase A
LPXTG
SEQ ID NO : 76 - site reconnu par la biotine ligase
GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID NO : 77 - site reconnu par l’acide lipoïque ligase
DEVLVEIETDKAVLEVPGGEEE
SEQ ID NO : 78 - site reconnu par l’acide lipoïque ligase
GFEIDKVWYDLDA
SEQ ID NO : 79 - site reconnu par la tubuline tyrosine ligase
VDSVEGEGEEEGEE
SEQ ID NO : 80 - site reconnu par la phosphopantéthéinyl transférase
DSLEFIASKLA
SEQ ID NO : 81 - site reconnu par la phosphopantéthéinyl transférase
GDSLSWLLRLLN
SEQ ID NO : 82 - site reconnu par la phosphopantéthéinyl transférase
GDSLDMLEWSLM
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims (17)
- REVENDICATIONS1. Polypeptide substrat d’au moins une protéase de la famille des astacines, comprenant un enchaînement des peptides suivants :(1) un peptide espaceur ‘ESP 1’ d’une taille comprise entre 0 et 50 résidus d’acides aminés ;
- (2) un peptide ‘FLUO’ comprenant un site accepteur d’une molécule fluorescente ;
- (3) un peptide espaceur ‘ESP 2’ d’une taille comprise entre 0 et 30 acides aminés ;
- (4) un peptide ‘CIBLE’ comprenant un site de clivage spécifique d’une protéase de la famille des astacines, caractérisé en ce que le clivage dudit polypeptide par une protéase de la famille des astacines génère deux fragments peptidiques, un premier fragment peptidique comprenant le peptide ‘FLUO’ et un deuxième fragment peptidique, le rapport de taille entre le premier fragment peptidique et ledit polypeptide étant d’au moins 1/4.2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéase de la famille des astacines est une protéase de la famille des BTPs, en particulier la protéase BMP-1.3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que le peptide ‘CIBLE’ comprend la région C-terminale d’une molécule de pro-collagène.4. Conjugué fluorescent comprenant le polypeptide substrat selon l’une des revendications 1 à 3, couplé de manière covalente à une molécule fluorescente, sur le site accepteur d’une molécule fluorescente du peptide ‘FLUO’ compris dans ledit polypeptide substrat.
- 5. Utilisation d’un polypeptide substrat selon l’une des revendications 1 à 3 ou d’un conjugué fluorescent selon la revendication 4 pour la quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines contenue dans un échantillon.
- 6. Procédé de quantification de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la revendication 4, dans des conditions compatibles avec l’observation d’une activité de ladite protéase ;- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence.
- 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le signal de polarisation de fluorescence est mesuré en continu.
- 8. Procédé de quantification de la modulation de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, en présence d’un modulateur de ladite activité, comprenant les étapes successives suivantes :- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la revendication 4, en présence d’un modulateur de ladite activité, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
- 9. Procédé selon la revendication 8 comprenant en outre l’étape suivante :- e) observer une variation entre la mesure du signal de polarisation de fluorescence mesurée à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que ladite variation est indicatrice des propriétés de modulation dudit modulateur de l’activité de ladite protéase.
- 10. Procédé selon l’une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que le modulateur de l’activité de ladite protéase est un activateur, de préférence un activateur de la famille des PCPEs.
- 11. Utilisation d’un polypeptide substrat selon l’une des revendications 1 à 3 ou d’un conjugué fluorescent selon la revendication 4 pour le criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines.
- 12. Procédé de criblage d’un activateur ou d’un inhibiteur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la revendication 4, en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
- 13. Procédé de criblage selon la revendication 12, comprenant en outre l’étape suivante :- e) observer une variation entre le signal de polarisation de fluorescence mesuré à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que ladite variation est indicatrice d’une propriété de type activatrice ou inhibitrice du composé test.
- 14. Procédé de criblage d’un agoniste ou d’un antagoniste d’un modulateur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines comprenant les étapes successives suivantes :- a) fournir un échantillon comprenant une protéase de la famille des astacines ;- b) mettre en contact l’échantillon avec un conjugué fluorescent selon la revendication 4, en présence d’un modulateur de l’activité de ladite protéase et en présence d’un composé test, dans des conditions compatibles avec l’observation de ladite activité ;- c) mesurer un signal de polarisation de fluorescence dans le mélange obtenu à l’étape b) ;- d) comparer le signal mesuré à l’étape c) avec une valeur de référence.
- 15. Procédé de criblage selon la revendication 14, comprenant en outre l’étape suivante :- e) observer une variation entre le signal de polarisation de fluorescence mesuré à l’étape c) et la valeur de référence, étant entendu que cette variation est indicatrice d’une5 propriété de type agoniste ou antagoniste du composé test vis-à-vis du modulateur de l’activité de ladite protéase.
- 16. Kit comprenant :un conjugué fluorescent selon la revendication 4 ;des réactifs permettant la mesure d’un signal de polarisation de 10 fluorescence ; et optionnellement, un modulateur de l’activité d’au moins une protéase de la famille des astacines, et optionnellement,- une protéase de ladite famille.
- 17. Utilisation d’un polypeptide substrat selon l’une des revendications 1 à 3 ou 15 d’un conjugué fluorescent selon la revendication 4 pour le diagnostic d’une pathologie impliquant une modification de l’expression ou de l’activité d’une protéase de la famille des astacines ou une modification de l’expression ou de l’activité d’un modulateur des protéases de la famille des astacines.1/16ÇiiV enhancerAmpChicken beta actin promotei pHLsec CPIII-long-TGase5SO5 bpRabMt beta globin polyA >fl (2758)Kozak sequence . Sécrétion signal sequence V\ Λρ.Ί (13.55) • TGaseTAG 6 MIS CPI» long
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-
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| EP2107112A1 (fr) * | 2004-09-22 | 2009-10-07 | Allergan, Inc. | Analyses de polarisation de fluorescence pour déterminer l'activité de la toxine clostridienne |
Non-Patent Citations (1)
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| TAMARA JEFFERSON ET AL: "The substrate degradome of meprin metalloproteases reveals an unexpected proteolytic link between meprin [beta] and ADA", CMLS CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, BIRKHÄUSER-VERLAG, BA, vol. 70, no. 2, 1 September 2012 (2012-09-01), pages 309 - 333, XP035157522, ISSN: 1420-9071, DOI: 10.1007/S00018-012-1106-2 * |
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