FR2891544A1 - Substrat proteique pour la detection de l'activite calpaine 3 - Google Patents

Abstract

L'invention a trait à un substrat protéique comprenant une protéine calpaine 3 dépourvue d'activité autolytique et une étiquette de détection, ainsi qu'à une méthode de détection in vitro de l'activité calpaine 3 dans un échantillon biologique.

Description

SUBSTRAT PROTEIOUE POUR LA DETECTION DE L'ACTIVITE CALPAINE 3

L'invention concerne une méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique de type tissulaire. Elle se rapporte plus précisément aux substrats protéiques destinés à être utilisés dans ladite méthode. L'invention a également pour objet l'utilisation desdits substrats protéiques pour le diagnostic in vitro de la dystrophie des ceintures type 2A (LGMD 2A). Elle concerne par ailleurs une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert du gène de la calpaine 3 dans des cellules animales ou humaines in vitro, mais également chez l'animal in vivo. En outre, elle concerne une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. Enfin, la méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 selon la présente invention constitue un outil pour étudier la fonction de la calpaine 3.

Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres, dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles régulent vraisemblablement des fonctions cellulaires importantes. En particulier, l'implication des calpaïnes ubiquitaires dans l'apoptose [Squier, 1994], la différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires [Yamaguchi, 1994] [Schollmeyer, 1986] [Balcerzak, 1995] a été démontrée.

La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à cystéine calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant spécifiquement dans le muscle squelettique [Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une maladie génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A (LGMD 2A ou calpainopathie) [Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une faiblesse progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un aspect de nécrose régénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène correspondant, situé sur le chromosome 15 chez l'homme, code pour un transcrit de 3,5 kb, lui-même codant pour une protéine de 94 kDa. Il a été démontré que la calpaine 3 pouvait se lier à la titine, protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région IS2 et qu'elle subissait une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle est exprimée dans les cellules Cos? [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette région comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine peut être localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. Il a par ailleurs été montré que la calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3 semble aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante atrophique du muscle (cachexie, etc...).

Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des mutations dans le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à une inhibition de l'activité protéolytique de la calpaine 3 présente dans le muscle squelettique. Le diagnostic clinique de la LGMD 2A est très difficile puisque les patients présentent des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies. Le diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes méthodes.

La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le gène de la calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où le gène est relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes et qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.

Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide d'anticorps spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon, cela ne signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la mutation sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations sur un autre gène que celui de la calpaine.

En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est d'offrir un test permettant de détecter l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique.

Le document FR 2 826 656 décrit certes une méthode de détection de l'activité calpaine 3 dans un échantillon biologique, en utilisant comme substrat un peptide porteur d'un site de clivage de ladite enzyme couplé à une molécule rapporteuse fluorogénique ou colorogénique. Cependant, il s'avère que si les résultats sont satisfaisants sur des extraits cellulaires, la transposition de cette méthode à des extraits tissulaires révèle une spécificité insuffisante de ce test.

Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc de développer un nouveau substrat spécifique de la calpaine 3, qui puisse être utilisé pour détecter son activité dans des tissus biologiques.

Dès lors et tout d'abord, l'invention concerne un substrat protéique comprenant une protéine calpaine 3 dépourvue d'activité autolytique et une étiquette de détection. Un tel substrat est destiné à évaluer l'activité protéolytique d'une calpaine 3 exogène, éventuellement présente dans un échantillon biologique à tester.

Par calpaine 3, on désigne toute protéine produite par le gène calpaine 3, incluant celles résultant d'un événement alternatif du type promoteur alternatif ou épissage alternatif. Les calpaines 3 de toute origine sont évidemment concernées par l'invention, en particulier celles d'origine humaine et murine.

La protéine calpaine 3 présente dans le substrat protéique selon l'invention se caractérise par le fait qu'elle est dénuée d'activité autolytique, contrairement à la protéine native et active de 94 kDa qui possède la capacité de s'autocliver au niveau des sites de clivage présents dans son domaine IS1, générant essentiellement deux fragments de 30 et 55 kDa respectivement. De fait, ce clivage ne peut donc être assuré que par l'apport d'une calpaine 3 exogène (par exemple présente dans un échantillon biologique) et active.

En pratique, l'activité autolytique de la calpaine 3 est catalysée par le site actif de cette protéase (site catalytique), constitué de 3 acides aminés: une Cystéine (C) en position 129, une Histidine en position 332 et une Asparagine en position 358. La cystéine est une cible privilégiée pour la mutagénèse permettant d'abolir l'activité autolytique de la calpaine 3. Ainsi, une protéine calpaine 3 portant une mutation C129S s'est avérée particulièrement performante dans le cadre de l'invention.

On appelle "étiquette de détection" un élément du substrat protéique selon l'invention ayant la capacité d'être révélé dans un test simple. En effet et en pratique, il s'agit de pouvoir différencier la taille du substrat protéique et celle du substrat clivé, révélées par la détection de ladite étiquette après migration électrophorétique. Il est donc nécessaire que cette étiquette de détection permette de révéler spécifiquement le substrat protéique selon l'invention.

Dans le cadre de l'invention, on parle de substrat protéique dans la mesure où un tel substrat comporte nécessairement au moins la protéine calpaine 3. En revanche, la nature de l'étiquette de détection peut être variable.

De manière privilégiée, cette étiquette de détection est un fragment protéique constitué d'au moins plusieurs acides aminés. Ceci permet la production du substrat par génie génétique, à l'aide de cellules capables d'exprimer le gène recombinant codant ce substrat. Préférentiellement, ce fragment protéique présente des propriétés antigéniques, tel que l'épitope V5. Il peut ainsi être reconnu spécifiquement par des anticorps disponibles. Alternativement, le fragment protéique peut posséder des propriétés fluorogéniques, tels que les dérivés de la protéine GFP.

Il est toutefois envisageable d'utiliser comme étiquette de détection des molécules d'autre nature, telles que la biotine ou des molécules radioactives. Dans ce cas de figure, le substrat protéique selon l'invention ne peut être produit que par synthèse chimique.

Il est à noter de manière importante que cette étiquette de détection ne doit pas 30 interférer avec le clivage du substrat protéique selon l'invention par la calpaine 3 testée.

En outre, il est nécessaire que cette étiquette de détection soit présente et soit parfaitement "exogène" à la calpaine 3. En effet, s'il est en principe envisageable d'utiliser des anticorps reconnaissant la calpaine 3 pour réaliser la détection, ceci n'est pas souhaitable puisqu'un tel anticorps reconnaîtrait aussi bien le substrat protéique selon l'invention que la calpaine 3 jouant le rôle de protéase (apportée dans l'échantillon biologique). Ceci priverait le présent test de détection de sa dimension quantitative.

Dans la séquence du substrat protéique selon l'invention, l'étiquette de détection est préférentiellement située à l'extrémité C-terminale de la protéine calpaine 3 dépourvue d'activité autolytique. Cependant, il est possible d'introduire cette étiquette à l'extrémité N-terminale. Plusieurs étiquettes peuvent également être envisagées, soit en vue de détections complémentaires, soit de détection et de purification (par exemple à l'aide d'une étiquette histidine).

Dans un mode de réalisation privilégiée, un substrat protéique selon l'invention présente une séquence en acides aminés SEQ ID 2.

L'invention a également pour objet une séquence d'acides nucléiques codant un 20 substrat protéique qui comprend une protéine calpaine 3 dépourvue d'activité autolytique et une étiquette de détection.

L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'acides nucléiques et pourvu des éléments (en particulier de type promoteur) nécessaires à l'expression de cette séquence dans un système d'intérêt. Une telle construction est illustrée par la séquence SEQ ID 1.

L'invention se rapporte également à une cellule hôte porteur dudit vecteur. Ces cellules sont transformées lorsque le vecteur est de type plasmidique, et transfectées lorsqu'il est d'origine virale. De telles cellules peuvent constituer le matériel biologique de base pour la production, voire la purification, du substrat protéique selon l'invention.

Aussi bien le substrat protéique en tant que tel, les séquences d'acides nucléiques le codant, les vecteurs porteurs de ces séquences et/ou les cellules hôtes porteuses de ces vecteurs peuvent être conditionnés dans un kit de diagnostic, également objet de la présente invention.

Avantageusement, le système de détection permettant de révéler l'étiquette de détection dans le substrat protéique selon l'invention est également fourni dans ledit kit de diagnostic. Dans le cas où l'étiquette est un fragment antigénique, l'anticorps spécifique correspondant, par exemple anti-V5, est associé.

Selon un second aspect, l'invention concerne une méthode de détection in vitro de l'activité calpaine 3 dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes: - on met en contact ledit échantillon biologique avec un substrat protéique selon l'invention en présence de calcium, - on soumet le mélange à une migration électrophorétique, - on détecte la présence ou l'absence de clivage par la calpaine 3 grâce à la révélation de l'étiquette de détection.

On entend par échantillon biologique tout extrait de matière biologique susceptible d'abriter une activité calpaine 3. Il peut s'agir d'extraits cellulaires, par exemple pour vérifier une efficacité de transduction, ou de manière plus intéressante pour le diagnostic, des extraits tissulaires, préférentiellement musculaires tels que des biopsies.

Comme déjà mentionné, le substrat protéique à mettre en oeuvre dans cette méthode peut être obtenu par la culture, et éventuellement le traitement, de cellules hôtes abritant des séquences d'acides nucléiques codant un tel substrat.

Il est à noter qu'en raison de la conservation des sites de clivage de la calpaine 3 entre les différentes espèces, il est par exemple possible de mettre en oeuvre le test de détection entre un substrat protéique comprenant une calpaine 3 d'origine humaine et un échantillon biologique murin, ou inversement.

Il était connu que l'activité protéolytique de la calpaine 3 est favorisée par la présence de calcium (Ca2+). Il a été toutefois montré que dans le cadre de l'invention, la présence du Cal+, préférentiellement à hauteur d'environ 5mM, permettait d'avoir une sensibilité du test d'activité satisfaisante. De ce fait, du calcium est donc ajouté dans le mélange d'incubation.

En outre et conformément aux connaissances acquises sur l'activité protéolytique de la calpaine 3, la première étape de mise en contact enzyme/substrat est préférentiellement réalisée à 37 C pendant 1 à 2 heures.

Dans une seconde étape, le mélange d'incubation est soumis à une migration électrophorétique, selon des protocoles bien connus de l'homme du métier, de manière à séparer physiquement le substrat protéique non clivé de ses produits de clivage. Une méthode classique de séparation est celle réalisé en fonction du poids moléculaire, dans un gel de polyacrylamide.

Dans une troisième étape, l'étiquette de détection est révélée permettant de conclure quant à l'activité calpaine 3 présente dans l'échantillon biologique testée. Dans un mode de réalisation privilégié, lorsque l'étiquette est un fragment antigénique, la révélation consiste à un transfert de type Western, à l'aide d'anticorps appropriés.

Ainsi, dans le cas où le substrat protéique selon l'invention présente la séquence SEQ ID 2, le produit non clivé a une taille d'environ 100 kDa (94 kDa + étiquette en C-terminale d'environ 5 kDa), alors que le produit clivé a une taille d'environ 60 kDa (55 kDa + étiquette en C-terminale d'environ 5 kDa). Ce test apporte une réponse qualitative mais également quantitative. En effet, dans le cas d'une quantité insuffisante de calpaine 3 par rapport au substrat protéique selon l'invention, les deux espèces vont être détectées.

La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.

Dans cet optique diagnostic, la méthode serait donc mise en oeuvre sur des biopsies humaines. Pour une validation scientifique, il sera nécessaire d'apporter la preuve qu'une éventuelle absence d'activité calpaine 3 n'est pas liée à une détérioration de l'échantillon biologique testé. Le Demandeur propose donc de tester parallèlement l'activité des calpaines ubiquitaires, censée ne pas être affectée dans cette pathologie. S'inspirant de la présente invention, un substrat adapté pour réaliser ce test serait une protéine de fusion comprenant un site de clivage de la fodrine (substrat naturel des calpaines ubiquitaires) associé à YFP et CFP, toutes deux détectables en Western Blot à l'aide d'anticorps antiGFP.

L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents.

Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste: - à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le substrat protéique de l'invention, - et à détecter la présence ou l'absence de clivage, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.

Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste: - à préparer un échantillon biologique incorporant le substrat protéique de l'invention, puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à tester, et à détecter la présence ou l'absence de clivage, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.

Si le taux de clivage est augmenté en présence de la substance testée, alors il s'agit d'une substance activatrice de la calpaine 3. Au contraire, si le taux de clivage est diminué en présence de la substance testée, alors il s'agit d'une substance inhibitrice de la calpaine 3.

L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert 5 de gène de la calpaine 3 comprenant les étapes suivantes: on transfecte des cellules animales ou humaines avec le gène de la calpaine 3, - on met en oeuvre la méthode de détection in vitro précédemment décrite sur un extrait cellulaire ou tissulaire.

Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les techniques de transfection précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas d'avantage détaillés.

En pratique, cet aspect revêt une grande importance puisque aujourd'hui, le seul espoir thérapeutique pour le traitement des calpainopathies repose sur la thérapie génique, à savoir l'introduction du gène de la calpaine 3 intact (via des vecteurs AAV) dans les organismes malades. Cette méthode permet donc de tester quelle a été l'efficacité de transfert de ce gène in vivo et de déterminer l'activité calpaine 3 nécessaire pour retrouver un statut musculaire normal.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative.

Figure 1: cartographie du plasmide pcDNA3.1D/CAPN3-hC129S-V5-His-TOPO codant un substrat protéique selon l'invention.

Figure 2: A/ schéma du substrat protéique selon l'invention; B/ séquence protéique de la partie ajoutée à l'extrémité C-terminale de la calpaine 3 humaine mutée en 30 C129S.

Figure 3: Détection de la calpaine 3 par transfert de type Western (Western Blot) : A/ à l'aide de l'anticorps B3 (reconnaît la calpaine 3 humaine et murine dans la partie C-terminale après le site de coupure) : piste 1: Témoin positif = cellules 911 transfectées par la forme non 5 autolysable hC129S; - piste 2: cellules transfectées avec la calpaine 3; piste 3: broyat musculaire.

B/ à l'aide de l'anticorps 2C4 (reconnaît la calpaine 3 humaine dans la partie N-terminale avant le site de coupure): - piste 1: surnageant de l'extrait cellulaire (NIH3T3) non transfecté ; - piste 2: surnageant de l'extrait cellulaire (NIH3T3) dilué au 1/10; - piste 3: surnageant de l'extrait cellulaire (NIH3T3) dilué au 1/2; - piste 4: surnageant de l'extrait cellulaire (NIH3T3) pur.

Figure 4: Test d'activité sur broyats de muscles normaux ou déficients en calpaine 3, traités ou non avec l'AAV-05_12-C3 (SEQ ID 3) : - piste 1: hC129S + broyat de muscle de souris +/+ injectée avec l'AAV-05_12-C3; piste 2: hC129S + broyat de muscle de souris +/+ injectée avec 20 l'AAV05_12-C3 + Cat+ ; - piste 3: hC129S + broyat de muscle de souris -/injectée avec l'AAV-05_12-C3; - piste 4: hC129S + broyat de muscle de souris -/- injectée avec l'AAV-05_12-C3+Ca2+; - piste 5: hC129S + broyat de muscle de souris -/- non injectée; - piste 6: hC129S + broyat de muscle de souris -/- non injectée + Cat+.

Figure 5: Détection de l'activité calpaine 3 à partir d'extraits protéiques de muscle tibialis antérieur de souris -/- transfectées avec différentes quantités de génome viral 30 d'une préparation AAV-desmincalpain 3 (SEQ ID 4).

Figure 6: Détection de l'activité de la calpaine 3 à partir d'extraits protéiques de biopsies humaines.

I/ Construction codant la protéine de fusion: L'ADNc codant la calpaine 3 humaine a été muté au niveau du nucléotide en position 388: la guanine a été remplacée par une cytosine. Ainsi la protéine produite est mutée de façon à ce que la cystéine en position 129 soit remplacée par une sérine. Cet ADNc de la calpaine 3 mutée en C129S a été isolé et cloné dans le vecteur directionnel pcDNA3.1D/V5-His-TOPO par des méthodes classiques de biologie moléculaire. Le vecteur ainsi obtenu, appelé pcDNA3.1D/CAPN3hC129S-V5-His-TOPO, est représenté à la figure 1 et a pour séquence la séquence SEQ ID 1.

Ce vecteur permet l'expression d'une protéine de fusion comportant deux étiquettes - V5 (séquence de 14 acides aminés) et polyhistidine (succession de 6 acides aminés histidine) -, situées en C-terminal de la protéine calpaine 3 humaine mutée en C129S. La protéine de fusion correspondante est schématisée à la figure 2 et présente une séquence SEQ ID 2.

2/ Transfection des cellules NIH3T3: Des cellules NIHT3 ont été transfectées selon le protocole décrit ci-dessous par le 20 vecteur pcDNA3.1D/CAPN3-hC129S-V5- His-Topo (SEQ ID 1) : Des fibroblastes embryonnaires de souris sont ensemencés 36 heures avant la transfection, en boîtes de culture cellulaire de 10 cm, de façon à obtenir une confluence de 50-60 % lors de la transfection.

Milieu minimum de culture: DMEM (Milieu de Eagle Modifié par Dulbecco) (Gibco BRL) + Gentamycine (concentration finale: 10 g / mL) (Gibco BRL) Milieu de culture complet: milieu minimum de culture + 10% de SVF (Hyclone) Agent transfectant: Transfection Reagent Fugene 6 (Roche) Préparation des complexes: Dans un premier tube en polystyrène, 6 tg de plasmide sont introduits et dans un second tube, 400 L de milieu minimum auxquels sont ajoutés goutte à goutte 30 L de Fugène 6. Après 10 minutes d'incubation, le mélange DMEM + Fugène 6 est ajouté aux 6 tg de plasmide et incubé 30 à 45 min à température ambiante.

Procédure de transfection: Le milieu des cellules est remplacé par 10mL de milieu de culture complet. Le complexe fugène-plasmide est déposé goutte-à-goutte sur les cellules. Le milieu est 5 réparti délicatement sur les cellules et les boîtes sont mises à 37 C pendant 36 heures.

Lyse des cellules et extraction protéique Tampon de lyse conservé à 4 C: Tris HC1 pH 7,5 20mM NaCl 150mM EGTA 2mM Triton 0,1% Les cellules sont grattées dans 404L de tampon de lyse sur la glace. Le lysat est centrifugé 10min à 4 C à 10.000g et le surnageant est récupéré.

3/ Production et détection de la protéine fusion: Afin de vérifier la production de la protéine fusion, les protéines contenues dans 150L de surnageant brut, dilué au 1/2 et au 1/10, sont dénaturées en Bleu NuPAGE LDS Sample Buffer 4X (Invitrogen) complémenté en DTT 3M par chauffage 10 minutes à 70 C. Les protéines sont ensuite déposées sur gel de polyacrylamide 4-12% Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen) afin d'être séparées par électrophorèse. Afin d'évaluer les poids moléculaires des protéines, on dépose également le marqueur Precision Plus Protein Standards (Biorad).

Tampon de migration: - Compartiment extérieur: MOPS Running Buffer 1X Côté gel: MOPS Running Buffer 1X + Antioxidant NuPAGE Après la migration (à 80V pendant 15 minutes puis 150 V), les protéines sont transférées dans le système Biorad sur une membrane de PolyVinyliDene Fluoride (PVDF) (Immobilon - P Transfer Membrane - MILLIPORE) pendant 1 heure à 100V.

Tampon de transfert: Glycine 200mM (Sigma) Tris 24mM (Sigma) SDS 0.1% (SDS Easy sol 20% - Qbiogene) Ethanol 20% (Normapur) Afin d'évaluer l'efficacité de ce transfert, une coloration des protéines au rouge Ponceau 0,2% en acide acétique 1% est réalisée.

Les sites aspécifiques sont saturés en incubant la membrane pendant 45 min à RT (température ambiante) dans 50mL de lait 5% en TTBS (Tris-HC1 pH8 50mM, NaCl 138mM, 2.7mM KC1, Tween - 20 0.1%) (Sigma) additionné de 0. 5% de BSA. Puis la membrane est hybridée sous agitation douce pendant 2 heures à RT avec une dilution au 1/150 en TTBS-lait 1% de l'anticorps monoclonal de souris B3 (anticorps spécifique de la calpaine 3) ou 2C4 (NCL- CALP 2C4 Novocastra). Après 4 lavages de 5 minutes dans du TTBS sous agitation forte, la membrane est incubée avec un anticorps secondaire anti IgG de souris couplé à la horseradish peroxydase (HRP) dilué au 1/10.000 dans du TTBS lait 1% pendant 45 minutes à RT. Cet anticorps secondaire va reconnaître le premier anticorps.

Après 4 lavages de 5 minutes en TTBS, la révélation est réalisée par ajout sur la membrane du substrat de la peroxydase: le luminol (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate PIERCE). La réaction enzymatique provoque l'émission de chemiluminescence qui permet d'impressionner un film autoradiographique (Hyperfilm Amersham Biosciences) qui est alors révélé et fixé.

Les résultats obtenus par Western blot pour différents échantillons sont illustrés aux figures 3A et 3B. La figure 3A confirme que la protéine mutée hC129S est bien détectée sous sa forme entière (piste 1) et donc qu'elle n'est pas autolysée, contrairement à la calpaine 3 normale qui est complètement lysée quand elle est exprimée en cellules non musculaires (piste 2). Dans le muscle, la calpaine 3 est partiellement lysée (piste 3). La figure 3B confirme que la protéine fusion est bien exprimée dans les cellules NIH3T3. Elle est détectée aux environs de 100 kDa (taille théorique de 99 kDa). Par ailleurs, l'anticorps 2C4 dirigé contre l'exon 1 reconnaît la forme entière de la calpaine 3 située à 94 kDa, mais également sa partie N-terminale qui est clivée lorsque la calpaine 3 est active. Cette partie N-terminale a un poids moléculaire de 30kDa. Elle n'est pas détectée ici, ce qui confirme que la calpaine qui a été produite dans les cellules n'est pas capable de s'activer. De plus, on peut constater que le niveau d'expression de la protéine est élevé car on s'aperçoit que même en diluant l'extrait cellulaire, on obtient des bandes intenses.

4/ Test in vitro de la calpaine 3: La protéine fusion hC129S, produite comme décrit ci-dessus, sert de substrat dans une réaction enzymatique impliquant la calpaine 3, soit injectée dans des muscles de 5 souris, soit présente dans des biopsies humaines.

A - Injection de la calpaine 3 dans des modèles animaux L'ADNc de la calpaine 3 est placé sous le contrôle d'un promoteur muscle spécifique synthétique C5_12 ou du promoteur de la desmine. Les vecteurs AAV résultant ont des séquences SEQ ID 3 (pAAV_SynKozhCAPN3FSRmut) et SEQ ID 4 (pAAV_DESKozhCANP3FSRmut_SV40Pa), respectivement. L'AAV contenant l'ADNc de la calpaine 3 est injecté par voie intra musculaire ou intra artérielle dans des muscles de souris modèles déficientes en calpaine 3 ou normales. Il est à noter que la calpaine 3 injectée a une mutation silencieuse FSR de façon à ce que l'ARNm correspondant à la calpaine 3 apportée puisse être distingué de l'ARNm de la calpaine 3 endogène chez les souris WT et ainsi être quantifié en RT-PCR quantitative.

B - Prélèvement et broyage des muscles Les muscles striés squelettiques de souris déficientes en calpaine 3 (-/-) ou normales (+1+), injectées ou non avec de 1'AAV contenant l'ADNc de la calpaine 3 sont prélevés et aussitôt broyés avec un ultra-turrax T8 (IKA Labortechnik). S'ils ne sont pas broyés dès le prélèvement, les muscles sont congelés en isopentane refroidi dans l'azote liquide et conservés à -80 C avant d'être broyés.

Les muscles utilisés sont plus (Soléaire, EDL) ou moins (TA, plantaire)touchés par la maladie. Ces muscles n'ayant pas la même taille et le même poids, les volumes de tampon de broyage varient en conséquence: le TA est broyé dans 1mL de tampon de lyse, le plantaire dans 400 L, le soléaire et 1'EDL dans 200 L. Le tampon de broyage est le même que celui utilisé pour la lyse cellulaire ci-dessus, additionné de cocktail d'inhibiteurs de protéases. Les broyats sont conservés à 4 C.

Dans le cas de biopsies humaines, 20 mg de muscle ont été broyés dans 1 mL de tampon NaCl 150 mM, Tris pH 7,5, 20 mM triton 0.1%, EGTA 2 mM, PIC 1 tablette/l0mL, E64 10 microl/10 mL.

C Test enzymatique Un volume arbitraire de 3 L de la protéine hC129S produite dans les conditions décrites ci-dessus est incubé 1 heure à 37 C en présence de 25 L de broyat musculaire pur ou dilué avec ou sans CaC12 5mM dans un volume final de 50 L (qsp avec du tampon de lyse).

Le protocole de transfert de type western (WB) est le même que décrit précédemment, excepté que l'anticorps spécifique utilisé est l'anticorps monoclonal de souris anti-V5 dilué au 1/5000 dans du TTBS -lait 3% et incubé 2heures à RT et l'anticorps secondaire est l'anti IgG de souris couplé à la HRP dilué au 1/10.000 dans du TTBS lait 3%. L'anticorps anti V5 permet de révéler l'étiquette V5 de la hC129S. Cette étiquette étant en position C-terminal sur la protéine et le clivage par la calpaine 3 libérant un fragment N terminal de 30 kDa et un fragment C- terminal de 55 kDa, il est attendu, en cas d'activité de la protéine apportée, un fragment de 55 kDa+S kDa correspondant à l'étiquette V5 et Histidine, plus quelques acides aminés contenus dans la carte du plasmide et permettant aux étiquettes d'être en phase avec la protéine (Fig. 2).

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 4.

Un premier test sur le broyat d'un TA de souris normale est réalisé afin d'évincer, au 25 cas où aucune activité ne serait visible, l'hypothèse d'un transfert de gène inefficace (pistes 1 et 2).

Pour s'assurer que la dégradation du substrat n'est pas le fait du chauffage à 37 C mais qu'elle résulte bien de l'activité des protéines contenues dans le broyat, un témoin sans broyat est réalisé (non montré).

On constate comme déjà décrit que l'activité de la calpaine 3 injectée dans les muscles est augmentée par la présence de Calcium (puits 1/2, 3/4, 5/6).

Chez une souris déficiente en calpaine 3 et non injectée, aucune dégradation de la hC129S n'est détectée, que ce soit en présence ou non de calcium (pistes 5 et 6) : il n'y a effectivement pas de calpaine 3. Ce témoin permet de prouver que c'est bien la calpaine 3 présente dans le muscle qui clive le substrat puisque seule l'injection d'AAV codant la calpaine 3 différencie les souris -/- injectées et non injectées. La spécificité du test proposé pour la détection de l'activité de la calpaine 3 est donc validée.

Par ailleurs, une activité de la calpaine 3 dans les muscles de souris déficientes en calpaine 3 ayant reçu une injection d'AAV codant cette protéine est bien détectée (piste 4), témoignant de l'efficacité du transfert mais cette activité est à un niveau plus faible que chez une souris normale injectée (piste 2), pour laquelle l'activité observée correspond à la somme de l'activité de la calpaine 3 apportée et de la calpaine 3 endogène.

Il est donc apparu intéressant de déterminer la quantité de génome viral nécessaire pour obtenir une activité calpaine 3 équivalente à celle observée chez une souris normale.

Pour cela, des muscles de tibialis antérieur de souris transfectées avec différentes quantités de la construction pAAV_DESKozhCANP3FSRmut_SV40Pa (SEQ ID 4) ont été prélevés, broyés et analysés comme décrit ci-dessus, 35 jours après injection de la préparation en intramusculaire. Les résultats sont présentés à la figure 5.

La figure 6 illustre la possibilité d'utiliser ce test enzymatique pour détecter l'activité calpaine 3 présente dans des biopsies humaines, en particulier pour le diagnostic 25 LGMD2A.

BIBLIOGRAPHIE

Sorimachi, H., Ishiura, S., Suzuki, K. (1997). "Structure and physiological function of calpains." Biochemistry Journal 328: 721-732.

Squier, M. K. T., Miller, A.K.C., Malkinson, A.M., Cohen, J.J. (1994). "Calpain activation in apoptosis." J. Cell. Physiol. 159: 229-237.

Kwak, K. B., Chung, S.S., Kim, O.M., Kang, M.S., Ha, D.B., Chung, C.H. (1993).

"Increase in the level of m-calpain correlates with the elevated cleavage of filamin during myogenic differentiation of embryonic muscle cell." Biochim. Biophys. Acta 1175: 243-249.

Yamaguchi, R., Maki, M., Hatanaka, M., Sabe, H. (1994). "Unphosphorylated and tyrosine-phosphorylated forms of a focal adhesion protein, paxillin, are substrates for calpain II in vitro: Implications for the possible involvement of calpain II in mitosis-specific degradation of paxillin." FEBS lett. 356: 114-116.

Schollmeyer, J. E. (1986). "Role of Ca2+ and Ca2±activated protease in myoblast 20 fusion." Exp. Cell. Res. 162: 411-422.

Balcerzak, D., Poussard, S., Brutis, J.J., Elamrani, N., Soriano, M., Cottin, P., Ducastaing, A. (1995). "An antisense oligodeoxyribonucleotide to m-calpain inhibits myoblast fusion." J. Cell. Scien. 108: 2077-2082.

Sorimachi, H., Imajoh-Ohmi, S., Emori, Y., Kawasaki, H., Ohno, S., Minami, Y., Suzuki, K. (1989). "Molecular cloning of a novel mammalian calciumdependent protease distinct from both m- and mu- type. Specific expression of the mRNA in skeletal muscle." J. Biol. Chem. 264: 20106- 20111.

Richard, I., Broux, O., Allamand, V., Fougerousse, F., Chiannilkulchai, N. , Bourg, N., Brenguier, L., Devaud, C., Pasturaud, P., Roudaut, C., Hillaire, D., Passos-Bueno, M.- R., Zatz, M., Tischfield, J. A., Fardeau, M., Jackson, C.E., Cohen, D., Beckmann, J. S. (1995). "Mutations in the proteolytic enzyme, calpain 3, cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A." Cell 81: 27-40.

Fardeau, M., Hillaire, D., Mignard, C., Feingold, N., Mignard, D., de Ubeda, B., Collin, H., Tomé, F. M. S., Richard, I., Beckmann, J.S. (1996). "Juvenile limb-girdle muscular dystrophy: clinical, histopathological, and genetic data from a small community living in the Reunion Island." Brain 119: 295-308.

Sorimachi, H., Toyama-Sorimachi, N., Saido, T. C., Kawasaki, H., Sugita, H., Miyasaka, M., Arahata, K., Ishiura, S., Suzuki, K. (1993). "Musclespecific calpain, p94, is degraded by autolysis immediately after translation, resulting in disappearance from muscle." J. Biol. Chem. 268: 10593-10605.

Sorimachi, H., Kimbara, K., Kimura, S., Takahashi, M., Ishiura, S., Sasagawa, N., Sorimachi, N., Shimada, H., Tagawa, K., Maruyama, K., Suzuki, K. (1995). "Muscle-specific calpain, p94, responsible for limbgirdle muscular dystrophy type 2A, associates with connectin through IS2, a p94-specific sequence." J. Biol. Chem. 270: 31158-31162.

Claims (22)

REVENDICATIONS

1/ Substrat protéique comprenant une protéine calpaine 3 dépourvue d'activité autolytique et une étiquette de détection.

2/ Substrat protéique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine calpaïne 3 est mutée au niveau de son site catalytique.

3/ Substrat protéique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la protéine calpaïne 3 porte une mutation C129S.

4/ Substrat protéique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étiquette de détection est constituée d'un fragment antigénique apte à être reconnu spécifiquement par un anticorps, préférentiellement l'épitope V5.

5/ Substrat protéique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étiquette de détection est située à l'extrémité C-terminale de la protéine calpaïne 3.

6/ Substrat protéique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID 2.

7/ Substrat protéique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine calpaïne 3 est d'origine murine ou humaine.

8/ Séquence d'acides nucléiques codant un substrat protéique selon l'une des revendications 1 à 7.

9/ Vecteur comprenant une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 8 et des éléments permettant l'expression de ladite séquence dans une cellule hôte.

10/ Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il présente une séquence SEQ ID 1.

11/ Cellule hôte transformée ou transfectée à l'aide d'un vecteur selon la revendication 9 ou 10.

12/ Kit de diagnostic comprenant le substrat protéique selon l'une des revendications 1 à 7 et/ou une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 8 et/ou un vecteur selon la revendication 9 ou 10 et/ou des cellules hôtes selon la revendication 11.

13/ Kit de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un système de détection permettant de révéler l'étiquette de détection.

14/ Kit de diagnostic selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps reconnaissant spécifiquement le fragment antigénique du substrat protéique selon la revendication 4, préférentiellement l'anti-V5.

15/ Méthode de détection in vitro de l'activité calpaine 3 dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes: on met en contact ledit échantillon biologique avec un substrat protéique selon l'une des revendications 1 à 7 en présence de calcium, - on soumet le mélange à une migration électrophorétique, - on détecte la présence ou l'absence de clivage par la calpaine 3 grâce à la révélation de l'étiquette de détection.

16/ Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un extrait tissulaire, préférentiellement musculaire.

17/ Méthode selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que le substrat protéique est obtenu par culture de cellules hôtes selon la revendication 11.

18/ Méthode selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que la mise en contact est réalisée à une température d'environ 37 C, pendant 1 à 2 heures.

19/ Méthode selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce que la détection du clivage par la calpaine 3 est réalisée par un transfert de type Western.

20/ Utilisation de la méthode selon l'une des revendications 15 à 19 pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A.

21/ Méthode de criblage de substances activatrices ou inhibitrices de la calpaine 3 consistant à mettre en oeuvre la méthode selon l'une des revendications 15 à 19, en absence et en présence de la substance à tester, respectivement.

22/ Méthode d'analyse de l'efficacité de transfert du gène de la calpaine 3 selon laquelle on met en oeuvre la méthode selon l'une des revendications 15 à 19 sur des cellules ou des tissus isolés à partir d'un organisme transfecté à l'aide du gène de la calpaine 3.