WO2001064854A1 - Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique - Google Patents

Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique Download PDF

Info

Publication number
WO2001064854A1
WO2001064854A1 PCT/FR2001/000593 FR0100593W WO0164854A1 WO 2001064854 A1 WO2001064854 A1 WO 2001064854A1 FR 0100593 W FR0100593 W FR 0100593W WO 0164854 A1 WO0164854 A1 WO 0164854A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
adenylcyclase
proteolytic activity
protease
activity
molecule
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/000593
Other languages
English (en)
Inventor
Gouzel Karimova
Daniel Ladant
Agnès ULLMANN
Nathalie Dautin
Original Assignee
Institut Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur, Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Institut Pasteur
Priority to MXPA02008427A priority Critical patent/MXPA02008427A/es
Priority to IL15133101A priority patent/IL151331A0/xx
Priority to JP2001564337A priority patent/JP2003525606A/ja
Priority to AU37519/01A priority patent/AU3751901A/en
Priority to BR0108767-3A priority patent/BR0108767A/pt
Priority to CA002401315A priority patent/CA2401315A1/fr
Priority to EP01909931A priority patent/EP1265993A1/fr
Publication of WO2001064854A1 publication Critical patent/WO2001064854A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
    • C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
    • C12Y406/01001—Aodenylate cyclase (4.6.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adenylcyclase, comprising at least one polypeptide sequence including one or more cleavage sites of at least one molecule with site-specific proteolytic activity, said polypeptide sequence being inserted into the catalytic domain of an adenylcyclase while retaining its enzymatic activity.
  • the invention also relates to the DNA fragments coding for such a recombinant adenylcyclase, as well as to methods of detection, identification and / or quantification of proteolytic activity or of resistance to inhibitors of proteolytic activity of molecules using the products defined above. Diagnostic kits for implementing these methods are also objects of the invention.
  • proteases are involved in many biological processes.
  • the cascades of activation by proteolysis leading to coagulation and digestion are now well known but we regularly discover new phenomena involving these enzymes.
  • Certain membrane receptors (“Protease Activated Receptor”: PAR) are specifically activated by proteolysis (Coughlin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91, 9200-2).
  • proteases SpoIIGA and SpoIVFB ensure the conversion of pro- ⁇ E and pro- ⁇ ⁇ to ⁇ E and ⁇ ⁇ , transcription factors essential for sporulation (Hofmeister et al, 1995, Cell, 83, 219-26 ; Lu et al, 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 87, 9722-6).
  • Caspases another family of proteases, are involved in apoptosis (Villa et al, 1997, TIBS, 22, 388-93; Sachr, 1995, Science, 261, 1445-9) and have an important role in the development and homeostasis.
  • protease is an essential element for the maturation of many viruses, some of which are responsible for fatal infections (Schwartz et al, 1999, Clin. Diagn. Lab. Immunol, 6, 295-305).
  • HIV proteases the virus responsible for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • HIV protease inhibitors the HIV protease inhibitors, associated in the context of triple therapy with reverse transcriptase inhibitors.
  • protease is essential for the multiplication of the virus HIV is a retrovirus, its capsid contains an RNA which, once introduced into the target cell, is retrotranscribed by viral reverse transcriptase
  • the DNA obtained is integrated to the eukaryotic genome then the genes encoding the structural proteins and enzymes of the virus are transcribed and translated into polyproteins by the cellular machinery
  • the role of the viral protease is to cleave these precursors (gag and pol) into active proteins to obtain mature viruses and infectious
  • the protease is released from the polyproteins by autoproteolysis and then ensures the cleavage of the other proteins by cutting 8 sites specific (pi to p8 where p5 and p6 are the sites flanking the protease)
  • protease sequence During the reverse transcription step, mutations can appear in the protease sequence. They are generally silent or lethal, but can sometimes lead to resistance to protease inhibitors (Dulioust et al, 1999, J. Viroi, 73, 850-4) and cause an escape from treatment (Perrin et al, 1998, Science, 280, 1871-3) This resistance is generally coupled with a decrease in the proteolytic activity of the enzyme Because of the importance of proteases in general, and HIV protease in particular, it is therefore necessary to determine a method which makes it possible to detect the proteolytic activities of molecules, preferably proteins, these activities being preferably "site-specific"
  • site-specific is meant that the protease recognizes a specific amino acid sequence in a polypeptide and that it cleaves said polypeptide at a site which depends on the amino acid sequence and on the protease. This site can be located between two amino acids of said specific sequence, but can also be located upstream or downstream of said sequence
  • a recombinant virus test (RVA for Recombinant Virus Assay) is currently used, which consists of the introduction of the protease gene of the virus to be studied into a known test virus, and by studying said recombinant virus on cell lines.
  • RVA Recombinant Virus Assay
  • the present invention provides an original solution to the problem of developing tests for the detection of molecules with proteolytic activity, by developing a genetic system for detecting such activities based on the inactivation, by proteolysis, of an adenylcyclase ( or adenylate cyclase), preferably adenylcyclase from Bordetella pertussis.
  • Adenylcyclase is an enzyme involved in the synthesis of cyclic AMP (cAMP) from ATP.
  • CAMP is an ubiquitous intracellular mediator, which however does not appear to be required for cell survival or growth, at least in bacteria, under certain growth conditions. CAMP is therefore used, in the present invention, as a signaling molecule.
  • adenylcyclase or "adenylate cyclase” means any protein having the same biological activity as the adenylcyclases found in natural organisms, that is to say having the capacity to transform ATP in cAMP, or in other words in accordance with the proteins of the international definition EC 4.6.1.1, or else any enzyme having a similar biological activity, derived from an adenylate cyclase.
  • Those skilled in the art are indeed capable, by carrying out certain judicious mutations, of transforming an adenylate cyclase into guanylate cyclase, that is to say of changing the specificity of the substrate of the starting protein so that it produces cGMP from GTP (EC 4.6.1.2) (Beuve and Danchin, 1992, J. Mol. Biol, 225, 933-8) and vice versa (Beuve, 1999, Methods, 19, 545-50).
  • Such an enzyme, obtained from an adenylate cyclase is therefore included in the definition given above.
  • the system developed in the present invention is based on the proteolytic inactivation of the catalytic domain of said adenylcyclase (CYA). This domain can complement a bacterial, fungal (including yeast) or cell line strain deficient in endogenous adenylcyclase (cya " ) to give it a cya + phenotype.
  • Said cya + phenotype is detected, preferably by studying a second phenotype of said strain or line, more easily detectable, and the appearance of which is linked to the enzymatic activity of adenylcyclase.
  • an “easily detectable” phenotype can preferably be observed macroscopically. For example, it can be directly observed on a Petri dish with an appropriate medium.
  • Some examples of "easily detectable” phenotypes include antibiotic resistance (induced or repressed by cAMP), the catabolism of certain sugars, such as maltose or lactose, or cAMP-induced expression of readily detectable proteins (for example ⁇ -galactosidase, luciferase, green fluorescent protein (GFP)).
  • antibiotic resistance induced or repressed by cAMP
  • the catabolism of certain sugars such as maltose or lactose
  • cAMP-induced expression of readily detectable proteins for example ⁇ -galactosidase, luciferase, green fluorescent protein (GFP)
  • the present invention thus relates to a recombinant adenylcyclase characterized in that it comprises at least one polypeptide sequence including one or more cleavage sites of at least one molecule with site-specific proteolytic activity, said polypeptide sequence being inserted in the field catalytic of an adenylcyclase while retaining its enzymatic activity.
  • the inserted polypeptide sequence also comprises a polypeptide sequence corresponding to a molecule with proteolytic activity.
  • the protease must self-protect.
  • the protease of interest is provided in trans of the sequence containing the cleavage sites (first case), or it is provided in cis (second case).
  • the polypeptide sequence contains at least one specific cleavage site of a viral protease, preferably of the HIV protease, in particular p5 (SEQ ID NO 1) and / or p6 (SEQ ID NO 2) .
  • Another preferred embodiment of the invention relates to a recombinant adenylcyclase comprising a polypeptide sequence inserted into its catalytic domain, while retaining its enzymatic activity, said polypeptide sequence further containing a viral protease.
  • a viral protease Preferably, it is the HIV protease framed by the cleavage sequences p5 and p6
  • adenylcyclase in the catalytic site from which it is possible to insert a polypeptide sequence, while retaining its enzymatic activity can be used for the implementation of the invention.
  • a preferred adenylcyclase is the adenylcyclase of bacteria of the genus Bordetella, in particular B. pertussis, and more especially, the catalytic domain of the adenylcyclase of B. pertussis (SEQ ID NO 4).
  • this domain is composed of two fragments T25 and T18, both necessary for the activity of this adenylcyclase, and can tolerate large insertions (up to 200 residues) between these fragments without its enzymatic activity being affected; on the other hand, the two dissociated fragments have no activity.
  • These two fragments correspond to amino acids 1-224 (T25) and 225-400 (Tl 8).
  • a very particularly preferred embodiment of the invention consists of adenycyclase from B. pertussis, comprising a polypeptide sequence including one or more cleavage sites of at least one molecule with site-specific proteolytic activity inserted between residues 224 and 225
  • the invention cannot be reduced to this site, since it is possible to determine other permissive sites for the insertion of foreign sequences, without there being inactivation of protein.
  • the residues 137-138, 228-229, 235-236, 317-318, 384-385 (Ladant et al, 1992, J Biol Chem., 267, 2244-50). This list is not exhaustive and other sites may also be used for the implementation of the invention.
  • the present invention also relates to a polynucleotide (preferably a DNA fragment) characterized in that it codes for an adenylcyclase according to the present invention, and a vector containing such a DNA fragment or such a polynucleotide or allowing expression of an adenylcyclase according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a recombinant adenylcyclase according to the invention, as such or expressed by a DNA fragment, polynucleotide, or vector, in methods of detection, identification and / or for quantifying proteolytic activity or resistance to inhibitors of proteolytic activity. Such methods are also part of the invention.
  • a method for the detection of the proteolytic activity of a molecule comprises the steps consisting in: a. complement a bacterial, fungal or cell line strain deficient in endogenous adenylcyclase with a recombinant adenylcyclase according to the invention, said bacterial, fungal or cell line having a phenotype whose expression is linked to the enzymatic activity of adenylcyclase; b. putting said molecule to be tested in contact with said strain or complemented line; vs. cultivating said strain or line under conditions allowing the demonstration of the phenotype linked to the activity of adenylcyclase; d. controlling the expression of said phenotype.
  • E. coli cya bacterial strains
  • bacteria of the genus Salmonella strains of Saccharomyces yeast
  • GH1 cell lines Vanadium phosphate-se
  • a bacterial strain E E.
  • coli cya "will be used , in particular the strain DHT1 (F", gin V44 (AS), recAI, endAl, gyrA96 (NaV), MI, hsdR17, spoTl, rflDl, cya-854 , ilv-691 :: Tn / 0).
  • This strain or any mutant of this strain is also one of the objects of the invention.
  • mutant of the bacterial strain DHT1 is meant within the meaning of the invention a bacterial strain having a similarity index of at least 90%>, preferably 95%, 98%> or 99%> as determined by example by the RFLP or RAPD method, and having the same phenotype as the DHT1 strain, that is to say cya ' .
  • One of the preferred modes for complementing the strain or line used is the introduction of a DNA fragment or of a polynucleotide according to the invention.
  • a DNA fragment or of a polynucleotide can be carried by a vector according to the invention, but can also be integrated stably in the chromosome.
  • the DNA fragment or polynucleotide is introduced episomally on a vector according to the invention.
  • the contacting of the proteolytic activity molecule is preferably done by introduction into the strain or the complemented line of a DNA fragment or polynucleotide coding for said molecule with proteolytic activity and therefore by the expression of said molecule in said strain.
  • the level of resistance to the inhibitor can also be measured by quantifying the expression of the phenotype observed.
  • a person skilled in the art will be able to measure the activity of ⁇ -galactosidase, of which expression is naturally controlled by cAMP. He will also be able to measure the activity of other proteins such as luciferase (in this case, we will use cya ' strains with a gene under the control of a dependent cAMP / CAP promoter), or measure the level of resistance to an antibiotic. given or else the fluorescence emitted in the case where GFP is used.
  • the cAMP produced can also be assayed, which gives an exact measurement of the activity of adenylcyclase in the host cell.
  • the methods according to the invention are preferably used to detect the proteolytic activity and / or the resistance to the NIH protease inhibitors.
  • the methods according to the invention can therefore prove to be extremely valuable tools for the study of HIV infections, in particular for laboratory research in order to define new molecules inhibiting the HIV protease, testing the effectiveness of the inhibitors. under development, or determine new mutants, the study of which may help to understand the resistance mechanisms of the virus.
  • the present invention also relates to the use of an adenylcyclase, a DNA fragment or a vector according to the invention, for the manufacture of diagnostic kits allowing the detection of the activity of molecules with activity proteolytic or their resistance to an inhibitor, these molecules being encoded by viruses present in the serum or cells of a patient.
  • the compounds according to the invention can also be used for the manufacture of a diagnostic kit allowing the quantification of the ratio (molecules with proteolytic activity resistant to an inhibitor / molecules with proteolytic activity not resistant to said inhibitor) in a patient, said molecules proteolytic activity being encoded by viruses present in the serum or cells of said patient.
  • Such diagnostic kits in particular contain a. a bacterial, fungal or cell line deficient in endogenous adenylcyclase, b. a DNA fragment, a purified polynucleotide or a vector according to the invention coding for a recombinant adenylcyclase, into the catalytic site of which are inserted one or more cleavage site (s) corresponding to the molecule with proteolytic activity.
  • kits may also optionally contain: c. specific primers making it possible to amplify the DNA coding for the proteolytic molecule of interest flanked or not by auto-proteolytic sequences, and / or d.
  • a vector configured so as to be able to insert into it the DNA coding for the proteolytic molecule of interest amplified using the primers of c, and / or e. a vector having the same base as the vector of d., coding for an active proteolytic molecule, in order to have a positive control, and / or f. culture media allowing the growth of the bacterial, fungal or cell line strain of a. and detecting the phenotype associated with cAMP production, and / or g. reagents to quantify the production of cAMP in the strain or line used, and / or h. reagents to quantify the expression of the reporter protein.
  • Such a diagnostic kit allows the study of a protease inserted in trans, since the latter is then provided on a vector other than that coding for adenylcylase according to the invention. It is therefore understood that the vector coding for adenylcyclase may have already been introduced into the deficient strain, either in episomal form, or in form allowing integration into the genome. The latter case may be particularly preferred, insofar as there is then a strain initially deficient in endogenous adenylcyclase (a) complemented stably by an adenylcyclase according to the invention (b). The use of antibiotics is then not necessary to maintain the selection and the implementation of the method according to the invention is not changed.
  • the present invention also covers diagnostic kits containing: a. a bacterial, fungal or cell line deficient in endogenous adenylcyclase, b. a DNA fragment, a purified polynucleotide or a vector coding for an adenylcyclase, configured to be able to insert the gene coding for the proteolytic molecule of interest possibly flanked by autoproteolytic sequences in the catalytic domain of adenylcyclase while retaining its enzymatic activity , vs. specific primers making it possible to amplify the DNA coding for the proteolytic molecule of interest, optionally flanked by auto-proteolytic sequences, in order to insert it into the DNA fragment of b.
  • kits may also optionally contain: d. a vector having the same base as the vector of b., coding for an adenylcyclase, in the catalytic site of which is inserted an active proteolytic molecule optionally flanked by proteolytic sequences, in order to have a positive control, and / or e. culture media allowing the growth of the bacterial, fungal or cell line strain of a. and detecting the phenotype associated with the production of cAMP, and / or f of the reagents in order to quantify the production of cAMP in the strain or line used, and / or g. reagents to quantify the expression of the reporter protein.
  • a diagnostic kit allows the study of the action of the protease in cis, which is particularly advantageous, in particular for the detection of resistance to inhibitors, as demonstrated in the examples.
  • these diagnostic kits allow the study of a viral protease, in particular the HIV protease.
  • specific primers are chosen to amplify the DNA coding for this protease and the flanking regions p5 and p6, in particular the primers of sequences SEQ ID NO 7 and SEQ ID NO 8.
  • the system is simple to use and rapid (PCR on the serum of patients, subcloning in the plasmid which, preferably is derived from pUC and transformation in bacteria which can be DHT1)
  • PCR on the serum of patients, subcloning in the plasmid which, preferably is derived from pUC and transformation in bacteria which can be DHT1
  • this test limits the manipulation to the proviral DNA fragment coding for the HIV II protease is therefore carried out without risk of contamination and does not require a P3 laboratory unlike the RVA test.
  • the invention allows very high detection sensitivity Indeed, adenylcyclase is a protein with a fairly short half-life In addition, the peptide containing residues 224 and 225 of the AC of B.
  • pertussis is easily accessible to external proteins, insofar as adenylcyclase is a relatively flexible protein
  • the preferred introduction of the proteolysis sites between residues 224 and 225 therefore leads to good exposure of these sites to the protease of interest This therefore makes it possible to gain in sensitivity We gain even more in sensitivity when we use the system in which the protease is inserted in ace and self-protolysis, since in this case, the proces the cleavage is intramolecular, and there is no competition with other proteins of the strain or complemented line, for example of E. coli
  • the invention also relates to a method for the identification of molecules with site-specific proteolytic activity in a library of molecules, characterized by the implementation of a process as described above on the various molecules of the library, adenylcyclase co-implementing the bacterial, fungal or cell line strain being characterized in that it comprises the specific target sequence of amino acids for which one seeks possible molecules with proteolytic activity
  • the invention relates to a method for identifying the target sequences of a molecule with proteolytic activity, characterized by implementation of a process as described above on a bank of bacterial, fungal or cell lines, each being complemented by an adenylcyclase according to the invention comprising a different amino acid sequence in order to determine whether this sequence consists of a site for cleaving said molecule with proteolytic activity
  • FIG 1 Schematic representation of the plasmids used in an embodiment of the invention plac promoter of the lactose operon, T25 and T18 sequences coding respectively the fragments T25 and T18 of the adenylcyclase of B. pertussis, p5 and p6 sequences coding the HIV protease cleavage sites, kan r kanamycin resistance gene, amp r ampicillin resistance gene Plasmids pKT25 and derivatives have an origin of replication of type P15A and are therefore compatible with plasmids pUCVIH and derivatives ( ColEl replication origin)
  • Figure 3 ⁇ -galactosidase activity of DHT1 bacteria transformed with pKACp5 and pUC19. pKACp5 and pUCVM or pKT25 and pUC! 9
  • the transformed bacteria are grown overnight at 30 ° C. in LB medium + kanamycin + ampicillin supplemented with protease inhibitors at the indicated concentrations
  • the assay is then carried out as described in Example 3
  • FIG. 4 Synthesis of cAMP in cells as a function of the concentration of protease inhibitors in the culture medium
  • the bacteria E.coh DHT1 were transformed with the plasmids indicated, then cultured overnight at 30 ° C. in LB medium + kanamycin + ampicillin added to protease inhibitors at the indicated concentrations
  • the assay of cAMP is carried out as described in Example 4
  • Figure 6 ⁇ -galactosidase activity of DHT1 bacteria transformed with pKACp5. pKACPr and pKT25 depending on the concentration of inhibitor in the culture medium The transformed bacteria are grown overnight at 30 ° C. in LB + kanamycin medium supplemented with inhibitors at the indicated concentrations The activity assay is then carried out as described in 'Example 3
  • FIG. 7 Synthesis of cAMP by DHT1 bacteria transformed with pKACp5, pKACPr and pKT25 as a function of the concentration of inhibitors in the medium
  • the transformed bacteria are cultured overnight at 30 ° C. in LB medium + kanamycin added with inhibitors at increasing concentrations
  • the assay is then carried out as described in Example 4
  • Example 1 Strains and media The genetic constructions are carried out in the Escherichia coli XLl-Blue strain ⁇ endAl, hsdR17, supE44, thil, ⁇ ⁇ , recAl, gyrA96, relAl, A (lac-proB) / F ", proAB, lacNZ ⁇ Ml ⁇ , TnlO (tet 1 ) (available in particular from Stratagene) and the activity of the proteins expressed by the plasmids is tested in the strain Escherichia coli DHT1 (F " , gin V44 (AS), recAl, endAl, gyrA96 (NaFJ, thil, hsdR17, spoTl, rflDl , cya-854, ilv-691 :: TnlO) This strain was deposited at the CNCM on January 4, 2000, under the order number 1-2375.
  • the bacteria are grown in Luria-Bertani (LB) liquid or agar medium (15g / l agar). Their capacity to ferment sugars is tested on McConkey agar medium containing 1% maltose (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY). Antibiotics are used at the following concentrations: Ampicillin: 100 ⁇ g / ml and Kanamycin: 50 ⁇ g / ml. The protease inhibitors, Indinavir (Crixivan, Merck) and Saquinavir (Invirase, Roche) are dissolved respectively in ethanol and in water (final concentration 20mM) then diluted in the culture media to the concentrations indicated.
  • LB Luria-Bertani
  • agar medium 15g / l agar.
  • Antibiotics are used at the following concentrations: Ampicillin: 100 ⁇ g / ml and Kanamycin: 50 ⁇ g /
  • plasmids were constructed according to the standard protocols described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a laboratory mamial, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • the plasmid DNAs were purified using the "Qiagen kit” (Qiagen GmbH Germany) and hydrolyzed by the appropriate restriction enzymes according to the indications of the suppliers (New England Biolabs or Fermentas).
  • the PCR Polymerase chain reaction
  • conditions are determined as a function of the composition of the primers in purine and pyrimidine bases (Saiki et a, 1988, Science, 239, 487-91).
  • the plasmid pUCVIH is a derivative of the plasmid pUC19 (Sambrook et al, 1989) and expresses the wild type protease of the HIV virus under the control of a lac promoter.
  • a PCR was carried out using as a template the proviral DNA of the HIV virus and as primers the oligonucleotides Al (SEQ ID NO 5) and A2 (SEQ ID NO 6).
  • the PCR product obtained was purified from agarose gel, digested with the enzymes BamHI and SalI and subcloned between the BamHI and SalI sites of pUC19.
  • the plasmid pUCVIH was the subject of a deposit at the CNCM on January 4, 2000, under the order number 1-2376.
  • the plasmids pUCB1, pUCB3, pUCV1 and pUCV2 are derivatives of pUC19 which each express a mutant protease of HIV.
  • the DNA encoding these proteases was amplified from the patient's serum and used as a template to carry out a PCR with the primers Al and A2.
  • the construction of the plasmids was then carried out by subcloning into pUC19 the PCR fragments purified and digested with BamHI and SalI.
  • the plasmid pKT25 is a derivative of the plasmid pSU (Bartolomé et al, 1991, Gene, 102, 75-8) (compatible with the plasmids pUC and its derivatives) expressing only the inactive T25 fragment of adenylcyclase under the control of a promoter lake.
  • the plasmid pKAC expresses the entire catalytic domain of adenylcyclase. It was constructed by subcloning into pKT25, the Aat ⁇ l-EcoRl fragment from pCmAHLl (Karimova et al, 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 5752-
  • the plasmid pKACPr is a derivative of pSU and expresses, under the control of a lac promoter, the recombinant protein ACp (HIV protease and its two flanking sequences p5 and p6, inserted between amino acids 224 and 225 of the catalytic domain of adenylcyclase ) ( Figure 1). It was constructed by carrying out a PCR with the primers A3 (SEQ ID NO 7) and A4 (SEQ ID NO 8) on the proviral DNA of the HIV virus. The purified and digested PCR product was then subcloned between the Nhel and Kpnl sites of pACM224 ⁇ 815A (Karimova et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12532-7). The plasmid obtained, pACP, was then digested with Aatll and EcoRl and the digestion product was subcloned in pKT25.
  • variants of pKACPr in which the wild type HIV protease is replaced by a modified protease (pKACB1, pKACB3, pKACV1 and pKACV2) have been constructed.
  • the DNA encoding the mutant proteases was amplified with primers A3 and A4, and the PCR products purified and digested with Nhel and Kpnl were subcloned between the Nhel and Kpnl sites of pKACPr
  • the plasmid pKACp5 was constructed by hybridizing the two complementary oligonucleotides A5 (SEQ ID NO 9) and A6 (SEQ ID NO 10) and by subcloning them between the Nhel and KpnI sites of pKACPr This sequence codes for the polypeptide p5 which is a HIV protease cleavage sites Plasmids pKACPr and PKACp5 were each deposited at the
  • the bacteria are cultivated in LB medium overnight at 30 ° C.
  • the suspension is diluted 5 times in medium 63B1 (Miller, 1972, cf. supra), the optical density (OD) at 600 nm of this dilution is measured and then added , at 3ml of this suspension, a drop of toluene and a drop of 1% sodium deoxycholate>
  • the tubes are vortexed for 10 seconds and placed for 30 minutes at 37 ° C with shaking This treatment weakens the bacterial membranes so that the small molecules (ONPG and ONP) diffuse freely
  • the toluenized suspension is diluted in 1 ml of PM2 buffer (70mM Na 2 HPO 4 l2 ⁇ f>, 30mM NaHPO 4 H ⁇ O, ImM MgSO 4 , 0.2mM MnSO 4 , pH
  • the OD at 420 nm is read against a control sample (1 ml of PM2 having undergone the same treatment as the other samples)
  • One unit of ⁇ -galactosidase corresponds to 1 nanomole of ONPG hydrolyzed per minute at 28 ° C and at pH 7 The number of units per ml is then converted into
  • the cAMP produced by the bacteria is measured by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-cAMP rabbit serum and anti-rabbit goat antibodies coupled with alkaline phosphatase.
  • the alkaline phosphatase substrate used is 5'-paranitrophenyl phosphate sodium, added at a concentration of 0.5 mg / ml in PA buffer; 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-Hcl, pH 9.5.
  • the system is based on the possibility of inserting a polypeptide sequence into the catalytic domain of an adenylcyclase, without affecting its enzymatic activity.
  • Adenylcyclase from B. pertussis can be cleaved by trypsin into two fragments: T25 (amino acids 1-224) and T18 (amino acids 225-400) which, separately, have no catalytic activity (Ladant, 1988, J. Biol. Chem., 263, 2612-8).
  • insertions between amino acids 224 and 225 do not alter its ability to produce cAMP.
  • a recombinant protein according to the invention ACp5, into which is inserted, between amino acids 224 and 225 of adenylcyclase, the p5 cleavage site of the HIV protease was generated.
  • the plasmid expressing this protein (pKACp5, Example 2) was cotransformed into an E.co cya strain, with a compatible plasmid carrying or not carrying the wild HIV protease (pUCVTH or pUC19). The phenotype of the transformants was then observed on McConkey maltose medium containing or not containing protease inhibitors.
  • ACp5 is capable of restoring the Cya + phenotype (red colonies on McConkey maltose medium) when it is expressed in an E. coli cya strain; the insertion of the polypeptide p5 between amino acids 224 and 225 therefore does not alter the adenylcyclase activity;
  • pKAC is a plasmid which expresses the wild adenylcyclase, i.e. without the sequence p5).
  • Cya + of these bacteria shows that the HIV protease is only able to cleave adenylcyclase if it contains a specific site such as p5.
  • the ⁇ -galactosidase activity of the cultures in liquid medium of these cells as a function of the concentration of inhibitors in the medium was measured (FIG. 3 ).
  • the ⁇ -galactosidase activity is high and constant regardless of the amount of inhibitors in the medium.
  • the bacteria cotransformed with pKT25 and pUC19 have, for their part, a ⁇ -galactosidase activity corresponding to the basic level of the strain which expresses the only T25 fragment (pKT25).
  • the increase in ⁇ -galactosidase activity is a function of the amount of inhibitors in the medium, which translates into progressive inhibition of the protease in the cells.
  • the amount of cAMP produced by DHT1 transformed with pKACPr and pUCVIH increases with the concentration of inhibitors in the medium ( Figure 4) whereas for the positive control and the negative control (respectively pKACp5 + pUC19 and pKT25 + pUC19), the level of cAMP is constant.
  • Table 1 Genotypic and phenotypic characteristics of HIV protease mutants.
  • the mutations are described with respect to the amino acid sequence (1-99) of the protease of the reference virus (V: Val; I: Ile; M: Met; T: Thr; L: Leu and P: Pro).
  • the resistance level of the mutants corresponds to the relative increase (compared to the wild-type protease) of the concentration of inhibitors necessary to inhibit 50%> of viral replication.
  • the DNA encoding the modified proteases was cloned into the vector pUC19 (Example 2) and the plasmids obtained were cotransformed with pKACp5 in the strain DHT1.
  • the phenotype of the transformed bacteria is observed on McConkey maltose medium containing or not containing protease inhibitors. Under these conditions, the proteases B1 and VI behave like the wild protease (white colonies in the absence of inhibitors and red with) which is expected because according to their genotypic and phenotypic characteristics (Table 1), they do not exhibit resistance to protease inhibitors.
  • the phenotype of the bacteria in the presence of Indinavir, the phenotype is the same as for the wild-type protease (Cya + from 50 ⁇ M of Indinavir). In the presence of Saquinavir, a higher concentration (20 ⁇ M instead of 10 ⁇ M) is required for the bacteria to become Cya + . The mutant V2 therefore exhibits resistance to Saquinavir (which confirms the data in Table 1). Finally, in the case of the B3 mutant, the phenotype of the bacteria is always
  • Cya + including when there are no inhibitors in the environment. This can be explained by the fact that this mutant has a weaker proteolytic activity than the wild-type protease and that, even if it cleaves a fraction of the adenylcyclase molecules, there remains enough to activate the regulatory cascade leading to the Cya phenotype. + .
  • the system is therefore sensitive enough to detect the activity of the wild protease and the mutants B1, VI and V2, but not sufficient to detect less active mutants such as B3.
  • This lack of sensitivity of the system may be due to the fact that the cleavage is the consequence of a bimolecular process: in fact the protease, once synthesized, must first dimerize and secondly interact with its substrate. During this time, the non-cleaved adenylcyclase molecules synthesize cAMP which activates the catabolic operons.
  • Example 6 Inactivation in cis of adenylcyclase ⁇ & B. pertussis. Autoproteolysis of the HIV protease inserted into adenylcyclase 6. a. Principle
  • This system exploits the particular properties of the HIV protease on the one hand and of the adenylcyclase of B. pertussis on the other hand. Enzymes and proteins structure of HIV are synthesized as polyproteins. The maturation of these polyproteins is carried out by the protease which can cleave sequences upstream and then downstream of its own sequence (p5 and p6 sites). In addition, adenylcyclase tolerates large insertions (up to 200 residues) between the T25 and Tl 8 fragments without this affecting its enzymatic activity.
  • a chimeric protein (ACPr) was therefore constructed (Example 2), into which is inserted, between amino acids 224 and 225 of adenylcyclase, the HIV protease (99 residues) and its two cut sequences p5 and p6 ( 8 amino acids each).
  • the wild protease autoproteolysis by releasing T25 and T18 which, separated, are inactive.
  • the protease is inactive or in the presence of inhibitors, its autocleavage does not take place, and the adenylcyclase retains its activity of synthesis of cAMP and can complement the E.coh cya which then have a Cya phenotype. + ( Figure 5).
  • the bacteria transformed by the plasmid pKACPr are Cya " in the absence of inhibitor and Cya + in the presence of Saquinavir or Indinavir.
  • proteases B1, B3, VI and V2 are inserted between amino acids 224 and 225 of the adenylcyclase and the chimeric proteins obtained are expressed in the strain DHT1 (plasmids pKACB1, pKACB3, pKACV1 and pKACV2).
  • B1 and VI behave like the wild protease (Cya phenotype "in the absence of inhibitor and Cya + with).
  • the mutant B3 confers, in the absence of inhibitors, a Cya phenotype" on bacteria.
  • the bacteria transformed with pKACB3 have a Cya phenotype "up to a concentration of 100 ⁇ M (against 50 ⁇ M for those transformed with pKACPr) which shows that this protease carries a mutation which makes it resistant to Indinavir
  • the DHT1 bacteria transformed with pKACB3 have a Cya "phenotype at 10 ⁇ M while those transformed with pKACPr (wild protease) are red on this medium.
  • the mutant protease B3 is therefore also resistant to Saquinavir.
  • the system makes it possible to demonstrate the decrease in its sensitivity to Saquinavir and to Indinavir: the bacteria transformed with pKACV2 are Cya "on medium containing 100 ⁇ M Indinavir or
  • the "cis” system is therefore much more sensitive than that into which the protease is supplied on an independent plasmid; in fact, it detects very weak proteolytic activities like that of the protease B3 and makes it possible to distinguish limited increases in resistance (4X).
  • Example 7 Detection of a Minority Population of HIV Proteases Resistant to Inhibitors
  • This example shows that the invention makes it possible, from a phenotypic test, to detect in a predominantly sensitive population, a minority of HIV viruses expressing proteases resistant to inhibitors.
  • This process which can be routinely applied to the serum of patients, makes it possible to detect the emergence of resistance at the early stage of the treatment and possibly to adapt the treatment accordingly.
  • mixtures containing pKACV2 and pKACPr were produced in variable quantities (1/1, 1/10 and 1/100), then each of these mixtures was transformed into the strain DHT1.
  • the phenotype of the transformants is observed on McConkey maltose medium containing 20 ⁇ M of Saquinavir because this concentration makes it possible to easily discriminate the sensitive wild protease from the protease resistant to Saquinavir (V2).
  • DHTl bacteria transformed with pKACPr or pKACV2 are white in the absence of inhibitors.
  • Plasmids purified from red colonies have the same digestion profile as pKACPr (two fragments of 3852 bp and 710 bp) while plasmids from white colonies have the same digestion profile as pKACV2
  • the red colonies therefore correspond well to bacteria transformed by pKACPr, while the white colonies harbor pKACV2.
  • the process described in the present invention therefore makes it possible to distinguish phenotypically from proteases resistant to a given inhibitor in a population which predominantly contains proteases sensitive to this inhibitor.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une adénylcyclase recombinante, comprenant au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique. L'invention concerne également des procédés de tri de molécules à activité protéolytique utilisant cette adénylcyclase recombinante.

Description

ADENYLCYCLASE RECOMBINANTE ET SON UTILISATION POUR LE TRI DE MOLECULES A ACTIVITE
PROTEOLYTIQUE
La présente invention concerne une adenylcyclase recombinante, 5 comprenant au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adenylcyclase tout en conservant son activité enzymatique. L'invention concerne également les fragments d'ADN codant pour une telle adenylcyclase recombinante, 0 ainsi que des procédés de détection, d'identification et/ou de quantification d'activité protéolytique ou de résistance à des inhibiteurs d'activité protéolytique de molécules utilisant les produits ci-dessus définis. Des trousses de diagnostics pour la mise en œuvre de ces procédés sont également objets de l'invention.
Chez les eucaryotes comme chez les procaryotes, les protéases sont 5 impliquées dans de nombreux processus biologiques. Les cascades d'activation par protéolyse conduisant à la coagulation et à la digestion sont maintenant bien connues mais on découvre régulièrement de nouveaux phénomènes impliquant ces enzymes. Certains récepteurs membranaires ("Protease Activated Receptor": PAR), sont activés spécifiquement par protéolyse (Coughlin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91, 9200-2). Chez Bacillus subtilis, les protéases SpoIIGA et SpoIVFB assurent la conversion de pro-σE et pro-σκ en σE et σκ, facteurs de transcription essentiels à la sporulation (Hofmeister et al, 1995, Cell, 83, 219-26 ; Lu et al, 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 87, 9722-6). Les caspases, autre famille de protéases, sont impliquées dans l'apoptose (Villa et al, 1997, TIBS, 22, 388-93 ; Steller, 1995, Science, 261, 1445-9) et ont un rôle important dans le développement et l'homéostasie. Les protéases sont également impliquées dans certaines pathologies : la maladie d'Alzheimer serait due à un clivage anormal des β-amyloides par une sérine-protéase (Selkoe, 1999, Nature, 399, 23-31). Dans les tumeurs, des métalloprotéinases (MMPs), en dégradant la matrice extracellulaire, permettent aux cellules de métastaser (Nagase et al, 1999, J. Biol. Che ., 274, 21491-4). Enfin, la protease est un élément indispensable à la maturation de nombreux virus dont certains sont responsables d'infections mortelles (Schwartz et al, 1999, Clin. Diagn. Lab. Immunol, 6, 295-305). L'identification de ces enzymes et leur étude sont donc nécessaires aussi bien pour préciser leurs rôles physiologiques que pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques La complexité des méthodes classiques de caractéπsation et de purification des protéases a entraîné le développement de systèmes génétiques d'étude chez Escheric a coli ou chez la levure Ces systèmes ont pour but d'isoler et de caractériser des protéases site-spécifiques Leur principe repose, soit sur l'inactivation d'un enzyme rapporteur dans lequel a été introduit le site de coupure spécifique de la protease étudiée, soit sur la toxicité de cette protease chez E. coli
Sices et al (1998, Proc. Natl. Acad. Sa. USA, 95, 2828-33), ont décrit un système dans lequel le répresseur du phage λ est spécifiquement clivé, entraînant le passage de l'état lysogénique à l'état lytique Des sites spécifiques de clivage ont également été insérés dans la β-galactosidase et la thymidylate synthase d'E. coli et dans l'activateur transcriptionnel GAL4 de la levure (Baum et al, 1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87, 5573-7 , Kupiec et al, 1996, J. Biol. Chem., 271, 18465-70 , Dasmahapatra et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sa. USA, 89, 4159-62) La protéolyse de ces protéines a ensuite été observée in vivo Baum et al, (1990, Proc Natl. Acad. Sa. USA, 87, 10023-7) ont montré que la surexpression de la protease du VIH est toxique dans la souche E. coli BL21 (DΕ3) et ont utilisé cette propriété pour isoler et étudier des mutants non toxiques de la protease Cette toxicité a également été utilisée pour cribler des inhibiteurs de protease (Buttner et al, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 233, 36-8) Toutefois, le manque de sensibilité de ces systèmes en a limité l'utilisation
Ce manque de sensibilité tient au fait que, lorsque la protease étudiée possède une faible activité protéolytique, la protéolyse de la protéine rapporteur cible est incomplète Dans la plupart des cas, l'activité enzymatique résiduelle de la fraction de protéine cible non clivée suffit alors pour conférer le phénotype associé à la forme active de cette protéine De ce fait, il est impossible de discriminer phénotypiquement les organismes exprimant une protease capable de cliver et d'inactiver la protéine rapporteur cible de ceux n'exprimant pas cette protease spécifique
La recherche porte actuellement particulièrement sur le développement de tests permettant l'étude de protéases virales, et en particulier de la protease du VIH, virus responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) En effet, les molécules les plus actives dont on dispose à l'heure actuelle pour le traitement de l'infection à VIH sont les inhibiteurs de protease du VIH, associés dans le cadre des trithérapies à des inhibiteurs de la transcriptase inverse L'efficacité de ces molécules repose sur le fait que la protease est indispensable à la multiplication du virus le VIH est un rétrovirus, sa capside contient un ARN qui, une fois introduit dans la cellule cible, est rétrotranscrit par la transcriptase inverse virale L'ADN obtenu est intégré au génome eucaryote puis les gènes codant les protéines de structure et les enzymes du virus sont transcrits et traduits en polyprotéines par la machinerie cellulaire Le rôle de la protease virale est de cliver ces précurseurs (gag et pol) en protéines actives pour obtenir des virus matures et infectieux La protease est libérée des polyprotéines par autoprotéolyse et assure ensuite le clivage des autres protéines par coupure de 8 sites spécifiques (pi à p8 où p5 et p6 sont les sites flanquants la protease)
Lors de l'étape de transcription inverse, des mutations peuvent apparaître dans la séquence de la protease Elles sont en général silencieuses ou létales mais peuvent parfois conduire à une résistance aux inhibiteurs de protease (Dulioust et al, 1999, J. Viroi, 73, 850-4) et provoquer un échappement au traitement (Perrin et al, 1998, Science, 280, 1871-3) Cette résistance est généralement couplée à une baisse d'activité protéolytique de l'enzyme Du fait de l'importance des protéases en général, et de la protease du VIH en particulier, il est donc nécessaire de déterminer un procédé qui permette de détecter les activités protéolytiques de molécules, de préférence des protéines, ces activités étant de préférence « site-spécifique »
Par « site- spécifique », on entend que la protease reconnaît une séquence spécifique d'acides aminés dans un polypeptide et qu'elle clive ledit polypeptide à un site qui dépend de la séquence d'acides aminés et de la protease Ce site peut être situé entre deux acides aminés de ladite séquence spécifique, mais peut également être situé en amont ou en aval de ladite séquence
Il est essentiel d'apporter des améliorations aux systèmes actuels de détection des protéases En particulier, il faut améliorer la sensibilité des systèmes afin de permettre la détection de l'activité protéolytique plus faible de certaines protéases mutées Dans le cas du VIH, ce point est d'autant plus important que sa protease possède une activité protéolytique déjà relativement faible De plus, afin que les tests puissent être utilisés en clinique, il est important que ceux-ci soient faciles à mettre en œuvre, qu'ils soient peu onéreux et que les résultats puissent être obtenus dans un délai raisonnable (quelques jours). En effet, pour l'étude de la protease du VIH, on utilise actuellement un test de virus recombinant (RVA pour Recombinant Virus Assay), qui consiste en l'introduction du gène de la protease du virus à étudier dans un virus test connu, et en l'étude dudit virus recombinant sur des lignées cellulaires. Ce test présente l'inconvénient de ne caractériser que la population majoritaire des virus présents dans l'organisme du patient, et d'imposer une attente de quelques semaines pour obtenir les résultats. La présente invention apporte une solution originale au problème de développement de tests pour la détection de molécules à activité protéolytique, par l'élaboration d'un système génétique de détection de telles activités fondé sur l'inactivation, par protéolyse, d'une adenylcyclase (ou adénylate cyclase), de préférence de l'adénylcyclase de Bordetella pertussis. L'adénylcyclase est une enzyme impliquée dans la synthèse de l'AMP cyclique (AMPc) à partir de l'ATP. L'AMPc est un médiateur intracellulaire ubiquitaire, qui ne semble toutefois pas être requis pour la survie ou la croissance des cellules, au moins chez les bactéries, dans certaines conditions de croissance. L'AMPc est donc utilisé, dans la présente invention, comme molécule signalisatrice.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « adenylcyclase » ou « adénylate cyclase » toute protéine possédant la même activité biologique que les adénylcyclases trouvées dans les organismes naturels, c'est-à-dire ayant la capacité de transformer l'ATP en AMPc, ou en d'autres termes conforme aux protéines de la définition internationale EC 4.6.1.1, ou bien toute enzyme possédant une activité biologique similaire, dérivée d'une adénylate cyclase. L'homme du métier est en effet capable, en effectuant certaines mutations judicieuses, de transformer une adénylate cyclase en guanylate cyclase, c'est à dire de changer la spécificité du substrat de la protéine de départ afin qu'elle produise du GMPc à partir de GTP (EC 4.6.1.2) (Beuve et Danchin, 1992, J. Mol. Biol, 225, 933-8) et inversement (Beuve, 1999, Methods, 19, 545-50). Une telle enzyme, obtenue à partir d'une adénylate cyclase est donc comprise dans la définition donnée ci-dessus. Le système développé dans la présente invention est fondé sur l'inactivation protéolytique du domaine catalytique de ladite adenylcyclase (CYA). Ce domaine peut complémenter une souche bactérienne, fongique (y compris de levure) ou lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène (cya") pour lui redonner un phénotype cya+.
On détecte ledit phénotype cya+, de préférence en étudiant un second phénotype de ladite souche ou lignée, plus aisément détectable, et dont l'apparition est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase.
Ainsi, lorsqu'une molécule à activité protéolytique est présente, active, et reconnaît le site de clivage inséré dans l'adénylcyclase, cette dernière est coupée, et la souche complémentée redevient cya".
Par « aisément détectable », on entend qu'il n'est pas besoin de mettre en œuvre des moyens excessifs ou d'utiliser un appareillage excessif pour la détection du phénotype. En effet, il est possible de détecter directement le phénotype cya+, mais cela nécessite la détection de la formation d'AMPc, ce qui peut être fait par
ELISA mais demande un certain appareillage et ne peut être effectué rapidement.
Ainsi, un phénotype « aisément détectable » peut être observé de préférence de manière macroscopique. Par exemple, il peut être directement observable sur boîte de Pétri avec un milieu approprié. Certains exemples de phénotypes « aisément détectables » comprennent la résistance aux antibiotiques (induite ou réprimée par l'AMPc), le catabolisme de certains sucres, tels le maltose ou le lactose, ou l'expression induite par l'AMPc de protéines aisément détectables (par exemple la β-galactosidase, la luciférase, la protéine verte fluorescente (GFP)). L'homme du métier est capable de choisir et de définir d'autres systèmes possédant les mêmes propriétés.
La présente invention a ainsi pour objet une adenylcyclase recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adenylcyclase tout en conservant son activité enzymatique.
Dans un autre mode de mise en œuvre de l'invention, la séquence polypeptidique insérée comprend en outre une séquence polypeptidique correspondant à une molécule à activité protéolytique. Dans ce cas, la protease doit s'autoprotéolyser.
Ainsi, selon le mode de mise en œuvre de l'invention, la protease d'intérêt est apportée en trans de la séquence contenant les sites de clivage (premier cas), ou elle est apportée en cis (second cas).
D'une manière préférée, la séquence polypeptidique contient au moins un site de clivage spécifique d'une protease virale, de préférence de la protease du VIH, en particulier p5 (SEQ ID NO 1) et/ou p6 (SEQ ID NO 2).
Un autre mode de réalisation préféré de l'invention concerne une adenylcyclase recombinante comprenant une séquence polypeptidique insérée dans son domaine catalytique, tout en conservant son activité enzymatique, ladite séquence polypeptidique contenant en outre une protease virale. De manière préférée, il s'agit de la protease du VIH encadrée des séquences de clivage p5 et p6
(SEQ ID NO 3). Toute adenylcyclase dans le site catalytique de laquelle il est possible d'insérer une séquence polypeptidique, tout en conservant son activité enzymatique, peut être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention. Toutefois, une adenylcyclase préférée est l'adénylcyclase des bactéries du genre Bordetella, en particulier B. pertussis, et plus spécialement, le domaine catalytique de l'adénylcyclase de B. pertussis (SEQ ID NO 4).
En effet, ce domaine est composé de deux fragments T25 et T18, tous deux nécessaires à l'activité de cette adenylcyclase, et peut tolérer des insertions importantes (jusqu'à 200 résidus) entre ces fragments sans que son activité enzymatique en soit affectée ; par contre, les deux fragments dissociés n'ont pas d'activité. Ces deux fragments correspondent aux acides aminés 1-224 (T25) et 225- 400 (Tl 8).
Ainsi un mode de réalisation tout particulièrement préféré de l'invention consiste en Padénycyclase de B. pertussis, comprenant une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique insérée entre les résidus 224 et 225. Toutefois, il est clair que l'invention ne saurait être réduite à ce site, dans la mesure où l'on peut déterminer d'autres sites permissifs pour l'insertion de séquences étrangères, sans qu'il n'y ait inactivation de la protéine. On peut citer à titre d'exemple les résidus 137-138, 228-229, 235-236, 317-318, 384-385 (Ladant et al, 1992, J Biol Chem., 267, 2244-50). Cette liste n'est pas exhaustive et d'autres sites peuvent également être utilisés pour la mise en œuvre de l'invention.
Dans la présente demande, il est entendu que les termes « résidu » et « acide aminé » ont la même signification.
La présente invention concerne également un polynucléotide (de préférence un fragment d'ADN) caractérisé en ce qu'il code pour une adenylcyclase selon la présente invention, et un vecteur contenant un tel fragment d'ADN ou un tel polynucléotide ou permettant l'expression d'une adenylcyclase selon l'invention. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une adenylcyclase recombinante selon l'invention, en tant que telle ou exprimée par un fragment d'ADN, polynucléotide, ou vecteur, dans des procédés de détection, d'identification et/ou de quantification de l'activité protéolytique ou de la résistance à des inhibiteurs d'activité protéolytique. De tels procédés font également partie de l'invention.
Ainsi, un procédé selon l'invention pour la détection de l'activité protéolytique d'une molécule est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. complémenter une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène par une adenylcyclase recombinante selon l'invention, ladite souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire possédant un phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase ; b. mettre ladite molécule à tester au contact de ladite souche ou lignée complémentée ; c. cultiver ladite souche ou lignée dans des conditions permettant la mise en évidence du phénotype lié à l'activité de l'adénylcyclase ; d. contrôler l'expression dudit phénotype.
Il existe de nombreuses souches bactériennes, fongiques ou lignées cellulaires déficientes en adenylcyclase endogène. On peut citer en particulier les souches bactériennes E. coli cya", les bactéries du genre Salmonella, des souches de levure Saccharomyces (Matsumoto et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2355-9), ou les lignées cellulaires GH1 (Martin et al, 1981, J. Cell Physiol, 109, 289-97) ou dérivées d'un lymphome (Bourne et al, 1975, Science, 187, 750-2). De manière préférée, on utilisera une souche bactérienne E. coli cya", en particulier la souche DHT1 (F", gin V44(AS), recAI, endAl, gyrA96 (NaV), MI, hsdR17, spoTl, rflDl, cya-854, ilv-691 :: Tn/0). Cette souche ou tout mutant de cette souche est également un des objets de l'invention.
Par « mutant » de la souche bactérienne DHT1, on entend au sens de l'invention une souche bactérienne possédant un indice de similarité d'au moins 90%>, de préférence 95%, 98%> ou 99%> tel que déterminé par exemple par la méthode RFLP ou RAPD, et présentant le même phénotype que la souche DHT1, c'est-à-dire cya'.
Un des modes préférés pour complémenter la souche ou lignée utilisée est l'introduction d'un fragment d'ADN ou d'un polynucléotide selon l'invention. Un tel fragment ou polynucléotide peut être porté par un vecteur selon l'invention, mais peut également être intégré de façon stable dans le chromosome. L'homme du métier choisira une technique ou une autre en fonction des résultats à atteindre. De manière préférée, on introduit le fragment d'ADN ou polynucléotide de façon épisomale sur un vecteur selon l'invention. La mise en contact de la molécule à activité protéolytique se fait de préférence par introduction dans la souche ou la lignée complémentée d'un fragment d'ADN ou polynucléotide codant pour ladite molécule à activité protéolytique et donc par l'expression de ladite molécule dans ladite souche.
On a déjà cité les phénotypes aisément détectables liés à l'activité de l'adénylcyclase. Chez E. coli, on choisit de préférence la capacité à fermenter des sucres tels que le maltose ou le lactose.
Afin de déterminer la capacité de résistance de la molécule à activité protéolytique à un inhibiteur d'activité protéolytique, on mettra en œuvre le procédé ci-dessus décrit, en mettant en outre ladite molécule au contact dudit inhibiteur dans l'étape b.
On peut également mesurer le niveau de résistance à l'inhibiteur en quantifiant l'expression du phénotype observé. Ainsi, et en fonction du phénotype étudié, l'homme du métier saura doser l'activité de la β-galactosidase dont l'expression est naturellement contrôlée par l'AMPc. Il saura aussi doser l'activité d'autres protéines telles que la luciférase (dans ce cas, on utilisera des souches cya' avec un gène sous contrôle d'un promoteur AMPc/CAP dépendant), ou mesurer le niveau de résistance à un antibiotique donné ou bien la fluorescence émise dans le cas où la GFP est utilisée. On peut également doser l'AMPc produit, ce qui donne une mesure exacte de l'activité de l'adénylcyclase dans la cellule hôte.
On met de préférence en œuvre les procédés selon l'invention pour détecter l'activité protéolytique et/ou la résistance aux inhibiteurs de la protease du NIH.
Les procédés selon l'invention peuvent donc s'avérer des outils extrêmement précieux pour l'étude des infections au VIH, en particulier pour la recherche de laboratoire afin de définir de nouvelles molécules inhibitrices de la protease du VIH, tester l'efficacité des inhibiteurs en cours de développement, ou déterminer de nouveaux mutants dont l'étude pourra aider à la compréhension des mécanismes de résistance du virus. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une adenylcyclase, d'un fragment d'ADN ou d'un vecteur selon l'invention, pour la fabrication de trousses de diagnostic permettant la détection de l'activité de molécules à activité protéolytique ou leur résistance à un inhibiteur, ces molécules étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules d'un patient. On peut également utiliser les composés selon l'invention pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la quantification du rapport (molécules à activité protéolytique résistantes à un inhibiteur / molécules à activité protéolytique non résistantes audit inhibiteur) chez un patient, lesdites molécules à activité protéolytique étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules dudit patient.
De telles trousses de diagnostic, contiennent en particulier a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur selon l'invention codant pour une adenylcyclase recombinante, dans le site catalytique de laquelle sont insérés un ou plusieurs site(s) de clivage correspondant à la molécule à activité protéolytique. Ces trousses peuvent en outre éventuellement contenir : c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt flanquée ou non de séquences auto-protéolytiques, et/ou d. un vecteur configuré de manière à pouvoir y insérer l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt amplifié en utilisant les amorces de c, et/ou e. un vecteur possédant la même base que le vecteur de d., codant pour une molécule protéolytique active, afin de disposer d'un contrôle positif, et/ou f. des milieux de culture permettant la croissance de la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire de a. et la détection du phénotype associé à la production d'AMPc, et/ou g. des réactifs pour quantifier la production d'AMPc dans la souche ou lignée utilisée, et/ou h. des réactifs pour quantifier l'expression de la protéine rapporteur.
Une telle trousse de diagnostic permet l'étude d'une protease insérée en trans, puisque celle-ci est alors apportée sur un autre vecteur que celui codant pour l'adénylcylase selon l'invention. Il est donc alors entendu que le vecteur codant pour l'adénylcyclase peut avoir déjà été introduit dans la souche déficiente, soit sous forme épisomiale, soit sous forme permettant l'intégration dans le génome. Ce dernier cas peut-être particulièrement préféré, dans la mesure où l'on dispose alors d'une souche initialement déficiente en adenylcyclase endogène (a) complémentée de manière stable par une adenylcyclase selon l'invention (b). L'emploi d'antibiotiques n'est alors pas nécessaire pour maintenir la sélection et la mise en œuvre du procédé selon l'invention n'est pas changée.
Dans un autre cas de figure, le vecteur et la souche sont présentés de façon séparée, et l'utilisateur doit transformer la souche afin de restaurer une activité adenylcyclase. La présente invention couvre également les trousses de diagnostics contenant : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adenylcyclase, configuré pour pouvoir insérer le gène codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences autoprotéolytiques dans le domaine catalytique de l'adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique, c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences auto-protéolytiques, afin de l'insérer dans le fragment d'ADN de b.
Ces trousses peuvent en outre éventuellement contenir : d. un vecteur possédant la même base que le vecteur de b., codant pour une adenylcyclase, dans le site catalytique de laquelle est insérée une molécule protéolytique active éventuellement flanquée de séquences protéolytiques, afin de disposer d'un contrôle positif, et/ou e. des milieux de culture permettant la croissance de la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire de a. et la détection du phénotype associé à la production d'AMPc, et/ou f des réactifs afin de quantifier la production d'AMPc dans la souche ou lignée utilisée, et/ou g. des réactifs pour quantifier l'expression de la protéine rapporteur. Une telle trousse de diagnostic permet l'étude de l'action de la protease en cis, ce qui est particulièrement avantageux, en particulier pour la détection de résistance à des inhibiteurs, comme démontré dans les exemples.
De préférence, ces trousses de diagnostic permettent l'étude d'une protease virale, en particulier la protease du VIH. Dans ce cas, on choisit des amorces spécifiques pour amplifier l'ADN codant pour cette protease et les régions flanquantes p5 et p6, en particulier les amorces de séquences SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO 8.
Ces outils de diagnostic permettent d'identifier de manière précoce, à partir du sérum de malades atteints du SIDA, des mutants résistants aux inhibiteurs de protéases. Ainsi, il est attendu que le choix d'un traitement adapté à un patient en fonction des populations virales qu'il héberge permettra de limiter les échecs thérapeutiques
En effet, le système est simple à utiliser et rapide (PCR sur le sérum de malades, sous-clonage dans le plasmide qui, de préférence est dérivé de pUC et transformation dans les bactéries qui peuvent être DHT1) On peut ainsi espérer obtenir un résultat en quelques jours seulement contre 2-3 semaines pour le RVA
En outre, ce test limite la manipulation au fragment d'ADN proviral codant pour la protease du VIH II est donc effectué sans risque de contamination et ne nécessite pas de laboratoire P3 contrairement au test RVA Par ailleurs, et comme les exemples le démontrent, l'invention permet d'obtenir une très grande sensibilité de détection En effet, l'adénylcyclase est une protéine possédant une demi-vie assez courte De plus, le peptide contenant les résidus 224 et 225 de l'AC de B. pertussis est facilement accessible à des protéines extérieures, dans la mesure où l'adénylcyclase est une protéine relativement flexible L'introduction préférée des sites de protéolyse entre les résidus 224 et 225 mène donc à une bonne exposition de ces sites à la protease d'intérêt Ceci permet donc de gagner en sensibilité On gagne encore plus en sensibilité lorsque l'on utilise le système dans lequel la protease est insérée en as et s'autoprotéolyse, puisque dans ce cas, le processus de clivage est intramoléculaire, et qu'il n'y a pas de compétition avec d'autres protéines de la souche ou lignée complémentée, par exemple d'E. coli
Ce système génétique peut également être utilisé pour effectuer des criblages à grande échelle afin de rechercher des protéases responsables du clivage d'une séquence spécifique ou bien les séquences cibles d'une protease donnée Ainsi, l'invention concerne aussi un procédé pour l'identification de molécules à activité protéolytique site-spécifique dans une banque de molécules, caractérisé par la mise en œuvre d'un procédé tel que décrit précédemment sur les différentes molécules de la banque, l'adénylcyclase co plémentant la souche bactérienne, fongique ou la lignée cellulaire étant caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence cible spécifique d'acides aminés pour laquelle on recherche les éventuelles molécules à activité protéolytique
De même, l'invention concerne un procédé pour l'identification des séquences cibles d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé par la mise en œuvre d'un procédé tel que décrit précédemment sur une banque de souches bactériennes, fongiques ou des lignées cellulaires, chacune étant complémentée par une adenylcyclase selon l'invention comprenant une séquence différente d'acides aminés afin de déterminer si cette séquence consiste en un site de clivage de ladite molécule à activité protéolytique
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer l'invention en développant certains modes de réalisation préférés
En particulier, ces exemples permettent d'illustrer les différents avantages de l'invention, notamment la grande sensibilité des procédés selon l'invention, et les avantages de chaque système selon l'invention (introduction de la molécule à activité protéolytique en as ou en trans)
A partir de ces exemples, l'homme du métier sera capable d'améliorer certains paramètres En particulier, toutes les valeurs données dans les exemples ne le sont qu'à titre indicatif et ne doivent en aucun cas être considérées comme limitant l'invention
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 Représentation schématique des plasmides utilisés dans un mode de réalisation de l'invention plac promoteur de l'opéron lactose, T25 et T18 séquences codant respectivement les fragments T25 et T18 de l'adénylcyclase de B.pertussis , p5 et p6 séquences codant les sites de clivage de la protease VIH, kanr gène de résistance à la kanamycine, ampr gène de résistance à l'ampicilline Les plasmides pKT25 et dérivés ont une origine de réplication de type P15A et sont donc compatibles avec les plasmides pUCVIH et dérivés (origine de réplication ColEl)
Figure 2 Inactivation de l'adénylcyclase en trans par la protease du virus VIH T25 et T18 correspondent respectivement aux acides aminés 1-224 et 225-400 de AC p5 est un des sites spécifiques de coupure de la protease du VIH (en amont de la séquence de la protease) En A, la protéine recombinante ACp5, exprimée chez E.coh a une activité basale, calmoduline-indépendante, qui conduit a la synthèse d'AMPc et à l'activation des opérons lactose et maltose En B, la protease du VIH, coexprimée avec ACp5, clive la protéine, ce qui libère les fragments inactifs T25 et T18 il n'y a pas de synthèse d'AMPc En C, la protease inhibée spécifique ne peut inactiver ACp5 qui peut donc synthétiser de l'AMPc
Figure 3 Activité β-galactosidase des bactéries DHT1 transformées avec pKACp5 et pUC19. pKACp5 et pUCVM ou bien pKT25 et pUC!9 Les bactéries transformées sont cultivées 1 nuit à 30°C en milieu LB + kanamycine + ampicilline additionné des inhibiteurs de protease aux concentrations indiquées Le dosage est ensuite effectué comme décrit dans l'Exemple 3
Figure 4 Synthèse d'AMPc dans les cellules en fonction de la concentration des inhibiteurs de protease dans le milieu de culture Les bactéries E.coh DHT1 ont été transformées avec les plasmides indiqués, puis cultivées 1 nuit à 30°C en milieu LB + kanamycine + ampicilline additionné des inhibiteurs de protease aux concentrations indiquées Le dosage de l'AMPc est réalisé comme décrit dans l'Exemple 4
Figure 5 Autoprotéolyse de la protease du VIH insérée dans l'adénylcyclase T25 et T18 représentent respectivement les acides aminés 1-224 et 225-400 de l'adénylcyclase de B.pertussis, p5 et p6 sont les sites spécifiques de clivage de la protease du \TH En A, la protease s'autoclive ce qui génère les deux fragments inactifs T25 et T18, les bactéries restent Cya" En B, les inhibiteurs de protease inactivent la protease qui ne peut plus s'autocliver, l'adénylcyclase synthétise alors de l'AMPc et restaure un phénotype Cya+
Figure 6 Activité β-galactosidase des bactéries DHT1 transformées avec pKACp5. pKACPr et pKT25 en fonction de la concentration en inhibiteur dans le milieu de culture Les bactéries transformées sont cultivées une nuit à 30°C en milieu LB + kanamycine additionné d'inhibiteurs aux concentrations indiquées Le dosage d'activité est ensuite réalisé comme décrit dans l'Exemple 3
Figure 7 Synthèse d'AMPc par les bactéries DHT1 transformées avec pKACp5, pKACPr et pKT25 en fonction de la concentration en inhibiteurs dans le milieu Les bactéries transformées sont cultivées une nuit à 30°C en milieu LB + kanamycine additionné d'inhibiteurs aux concentrations croissantes Le dosage est ensuite réalisé comme décrit dans l'Exemple 4
EXEMPLES
Exemple 1 Souches et milieux Les constructions génétiques sont réalisées dans la souche Escherichia coli XLl-Blue {endAl, hsdR17, supE44, thil, λ~, recAl, gyrA96, relAl, A(lac-proB) / F", proAB, lacNZΔMlδ, TnlO (tet1 ) (disponible en particulier chez Stratagène) et l'activité des protéines exprimées par les plasmides est testée dans la souche Escherichia coli DHT1 (F", gin V44(AS), recAl, endAl, gyrA96 (NaFJ, thil, hsdR17, spoTl, rflDl, cya-854, ilv-691 :: TnlO). Cette souche a été déposée à la CNCM le 4 Janvier 2000, sous le numéro d'ordre 1-2375.
Les bactéries sont cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) liquide ou gélose (15g/l agar). Leur capacité à fermenter les sucres est testée sur milieu gélose McConkey contenant 1% de maltose (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY). Les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes: Ampicilline: lOOμg/ml et Kanamycine: 50μg/ml. Les inhibiteurs de protéases, Indinavir (Crixivan, Merck) et Saquinavir (Invirase, Roche) sont dissous respectivement dans de l'éthanol et dans de l'eau (concentration finale 20mM) puis dilués dans les milieux de culture aux concentrations indiquées.
Exemple 2. Constructions plasmidiques
Tous les plasmides ont été construits selon les protocoles standards décrits par Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : a laboratory mamial, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY). Les ADN plasmidiques ont été purifiés en utilisant le "Qiagen kit" (Qiagen GmbH Allemagne) et hydrolyses par les enzymes de restriction appropriées selon les indications des fournisseurs (New England Biolabs ou Fermentas). Les conditions de PCR ("Polymérase chain reaction") sont déterminées en fonction de la composition des amorces en bases puriques et pyrimidiques (Saiki et a , 1988, Science, 239, 487-91).
Le plasmide pUCVIH est un dérivé du plasmide pUC19 (Sambrook et al, 1989) et exprime la protease sauvage du virus VIH sous contrôle d'un promoteur lac. Pour le construire, une PCR a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADN proviral du virus VIH et comme amorces les oligonucléotides Al (SEQ ID NO 5) et A2 (SEQ ID NO 6). Le produit de PCR obtenu a été purifié à partir de gel d'agarose, digéré par les enzymes BamHl et Sali et sous-cloné entre les sites BamHl et Sali de pUC19.
Le plasmide pUCVIH a fait l'objet d'un dépôt à la CNCM le 4 Janvier 2000, sous le numéro d'ordre 1-2376. Les plasmides pUCBl, pUCB3, pUCVl et pUCV2 sont des dérivés de pUC19 qui expriment chacun une protease mutante du VIH. L'ADN codant ces protéases a été amplifié à partir du sérum de malades et utilisé comme matrice pour réaliser une PCR avec les amorces Al et A2. La construction des plasmides a ensuite été réalisée en sous-clonant dans pUC19 les fragments de PCR purifiés et digérés par BamHl et Sali.
Le plasmide pKT25 est un dérivé du plasmide pSU (Bartolomé et al, 1991 , Gène, 102, 75-8) (compatible avec les plasmides pUC et ses dérivés) exprimant uniquement le fragment T25 inactif de l'adénylcyclase sous contrôle d'un promoteur lac. Le plasmide pKAC exprime le domaine catalytique entier de l'adénylcyclase. Il a été construit en sous-clonant dans pKT25, le fragment Aatïl- EcoRl de pCmAHLl (Karimova et al, 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 5752-
6).
Le plasmide pKACPr est un dérivé de pSU et exprime, sous contrôle d'un promoteur lac, la protéine recombinante ACp (protease HIV et ses deux séquences flanquantes p5 et p6, insérées entre les acides aminés 224 et 225 du domaine catalytique de l'adénylcyclase) (Figure 1). Il a été construit en réalisant une PCR avec les amorces A3 (SEQ ID NO 7) et A4 (SEQ ID NO 8) sur l'ADN proviral du virus VIH. Le produit de PCR purifié et digéré a ensuite été sous-cloné entre les sites Nhel et Kpnl de pACM224ρ815A (Karimova et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12532-7). Le plasmide obtenu, pACP, a ensuite été digéré par Aatll et EcoRl et le produit de digestion a été sous-cloné dans pKT25.
Des variants de pKACPr, dans lesquels la protease sauvage du VIH est remplacée par une protease modifiée (pKACBl, pKACB3, pKACVl et pKACV2) ont été construits. Pour cela, l'ADN codant pour les protéases mutantes a été amplifié avec les amorces A3 et A4, et les produits de PCR purifiés et digérés par Nhel et Kpnl ont été sous-clonés entre les sites Nhel et Kpnl de pKACPr Le plasmide pKACp5 a été construit en hybridant les deux oligonucléotides complémentaires A5 (SEQ ID NO 9) et A6 (SEQ ID NO 10) et en les sous-clonant entre les sites Nhel et Kpnl de pKACPr Cette séquence code le polypeptide p5 qui est un des sites de clivage de la protease du VIH Les plasmides pKACPr et PKACp5 ont chacun fait l'objet d'un dépôt à la
CNCM le 4 Janvier 2000 sous les numéros d'ordre respectifs 1-2377 et 1-2378
Exemple 3 Dosage de l'activité β-galactosidase
On dose l'activité β-galactosidase par mesure de l'hydrolyse de l'orthonitrophényl-β-D-galactoside (ONPG) incolore, l'orthonitrophénol libéré étant coloré en milieu basique et absorbant à 420nm (ONP εmM=5 à 420nm et à pH 1 1)
Les bactéries sont cultivées en milieu LB une nuit à 30°C Le lendemain, la suspension est diluée 5 fois en milieu 63B1 (Miller, 1972, cf supra), la densité optique (DO) à 600nm de cette dilution est mesurée puis on ajoute, à 3ml de cette suspension, une goutte de toluène et une goutte de déoxycholate de sodium à 1%> Les tubes sont vortexés 10 secondes et placés 30 minutes à 37 °C sous agitation Ce traitement fragilise les membranes bactériennes de façon à ce que les petites molécules (ONPG et ONP) diffusent librement
Pour le dosage, la suspension toluénisée est diluée dans 1ml de tampon PM2 (70mM Na2HPO4 l2Αf>, 30mM NaHPO4 H^O, ImM MgSO4, 0,2mM MnSO4, pH
7 et lOOmM β-mercaptoéthanol ajouté extemporanément) Les tubes sont placés à 28°C et à t=0, la réaction est amorcée par addition de 0,25 ml d'une solution d'ONPG (13mM dissoutes dans du tampon PM2 sans β-mercaptoéthanol) Quand la coloration est suffisante (0,250 < DO420 1,6), la réaction est arrêtée par addition de 0,5ml de Na2CO3 1M (qui donne au milieu un pH de 11 et inactive l'enzyme)
La DO à 420nm est lue contre un échantillon témoin (1ml de PM2 ayant subi le même traitement que les autres échantillons)
Une unité de β-galactosidase correspond à 1 nanomole d'ONPG hydrolysée par minute à 28°C et à pH 7 Le nombre d'unités par ml est ensuite converti en
9 unités par mg de poids sec bactérien, grâce à la DO à 600nm, sachant que 10 cellules correspondent à 0,3 mg de poids sec bactérien Exemple 4. Dosage de l'AMP cyclique
L'AMPc produit par les bactéries est mesuré par dosage immunoenzymatique ELISA ("Enzyme Linked Immunosorbant Assay") indirect, en utilisant un sérum de lapin anti-AMPc, et des anticorps de chèvre anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline. Le substrat de la phosphatase alcaline utilisé est le 5'- paranitrophényl phosphate dissodique, ajouté à une concentration de 0,5mg/ml dans le tampon PA; lOOmM NaCl, 5mM MgCl 2, lOmM Tris-Hcl, pH 9,5.
Après environ lh à 37°C, la lecture est faite à λ = 405nm, et les concentrations d'AMPc sont calculées en comparant les DO obtenues pour les échantillons avec celles de la gamme étalon. Les concentrations (en pmol/ml) sont ensuite converties en picomoles par mg de poids sec bactérien (comme pour le dosage de l'activité β-galactosidase).
Exemple 5. Inactivation en trans de l'adénylcyclase de B. pertussis par la protease du VIH
5. a. Principe du système
Le système est basé sur la possibilité d'insérer une séquence polypeptidique dans le domaine catalytique d'une adenylcyclase, sans affecter son activité enzymatique. L'adénylcyclase de B. pertussis peut être clivée par la trypsine en deux fragments: T25 (acides aminés 1-224) et T18 (acides aminés 225-400) qui, séparément n'ont pas d'activité catalytique (Ladant, 1988, J. Biol. Chem., 263, 2612- 8). En revanche, des insertions entre les acides aminés 224 et 225 n'altèrent pas sa capacité à produire de l'AMPc. L'introduction du site spécifique de clivage d'une protease donnée entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase n'altère donc pas son activité. Par contre, si cette protéine recombinante est coexprimée avec la protease correspondante, elle est clivée spécifiquement pour libérer les deux domaines T25 et T18 inactifs. La synthèse d'AMPc n'a donc plus lieu (Figure 2). Pour tester l'activité fonctionnelle de l'adénylcyclase de B.pertussis, une souche E.co déficiente en adenylcyclase endogène {cya) est utilisée. En effet, chez E.co , l'AMPc se liant à l'activateur transcriptionnel CAP ("catabolite activator protein") forme un complexe qui active de nombreux gènes parmi lesquels les opérons maltose et lactose.
Ainsi, lorsque le domaine catalytique de l'adénylcyclase est exprimé dans cette souche, la production d'AMPc permet la complémentation du caractère cya et les bactéries sont alors capables de fermenter le lactose et le maltose. T25 et T18 exprimés dans cette même souche en tant qu'entités séparées ne peuvent pas produire d'AMPc et les bactéries conservent leur caractère cya.
La capacité des bactéries à fermenter les sucres peut être mise en évidence sur des milieux indicateurs (LB-X-Gal ou McConkey additionné de maltose) ou sur milieux sélectifs (milieu minimum contenant du lactose ou du maltose comme unique source de carbone).
1.b. Mise au point du système in vivo
Afin de tester ce système, une protéine recombinante selon l'invention ACp5, dans laquelle est insérée, entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase, le site de clivage p5 de la protease du VIH, a été générée. Le plasmide exprimant cette protéine (pKACp5, Exemple 2) a été cotransformé dans une souche E.co cya, avec un plasmide compatible portant ou non la protease du VIH sauvage (pUCVTH ou pUC19). Le phénotype des transformants a ensuite été observé sur milieu McConkey maltose contenant ou non des inhibiteurs de la protease.
Les résultats de ces tests phénotypiques indiquent:
(i) que ACp5 est capable de restaurer le phénotype Cya+ (colonies rouges sur milieu McConkey maltose) lorsqu'elle est exprimée dans une souche E.coli cya ; l'insertion du polypeptide p5 entre les acides aminés 224 et 225 n'altère donc pas l'activité adenylcyclase ;
(ii) que les bactéries DHT1 cotransformées avec pKACp5 et pUCVIH présentent un phénotype Cya" (colonies blanches sur milieu McConkey maltose) en absence d'inhibiteurs de protease ; la protease du virus VIH est donc bien active chez E. coli in vivo, elle clive ACp5, qui est alors inactivée et ne peut plus synthétiser d'AMPc. Le clivage de ACp5 par la protease du VIH a également été montré in vitro ; (iii) que ces mêmes transformants, en présence d'inhibiteurs de la protease, ont un phénotype Cya+ ; ACp5 n'est donc plus clivée, ce qui montre bien que la protease est inhibée par ces produits ;
(iv) enfin, pour vérifier que la protease du VIH clive ACp5 au niveau de la séquence p5 et pas ailleurs dans la protéine, les bactéries DHTl ont été cotransformées avec pUCVIH et pKAC (voir exemple 2, pKAC est un plasmide qui exprime l'adénylcyclase sauvage, c'est-à-dire sans la séquence p5). Le phénotype
Cya+ de ces bactéries montre que la protease du VIH n'est capable de cliver l'adénylcyclase que si celle-ci contient un site spécifique tel que p5.
Afin de mettre en évidence l'effet de la concentration en inhibiteurs sur l'activité adenylcyclase, l'activité β-galactosidase des cultures en milieu liquide de ces cellules en fonction de la concentration d'inhibiteurs dans le milieu a été dosée (Figure 3). Dans le cas des bactéries DHTl transformées avec pKACp5 et pUC19, l'activité β-galactosidase est élevée et constante quelle que soit la quantité d'inhibiteurs dans le milieu. Les bactéries cotransformées avec pKT25 et pUC19 ont, quant à elles, une activité β-galactosidase correspondant au niveau de base de la souche qui exprime le seul fragment T25 (pKT25). Pour les E.coli DHTl transformées avec pKACp5 et pUCVIH, l'augmentation de l'activité β-galactosidase est fonction de la quantité d'inhibiteurs dans le milieu ce qui traduit l'inhibition progressive de la protease dans les cellules.
De la même façon, la quantité d'AMPc produit par les DHTl transformées avec pKACPr et pUCVIH augmente avec la concentration en inhibiteurs dans le milieu (Figure 4) alors que pour le témoin positif et le témoin négatif (respectivement pKACp5 + pUC19 et pKT25 + pUC19), le niveau d'AMPc est constant.
Ces résultats montrent que ce système génétique est assez sensible pour permettre de visualiser l'activité de la protease du VIH sauvage et pour mettre en évidence l'inhibition de cette activité par des composés spécifiques. 5.C Détection de protéases du VIH résistantes à l'Indinavir et au Saquinavir dans le système in vivo
Afin de déterminer si le procédé selon l'invention est suffisamment sensible pour détecter des activités plus faibles, des mutants résistants aux inhibiteurs de la protease ont été étudiés.
Quatre isolats cliniques (deux virus résistants aux inhibiteurs de protease (B3 et V2), et deux virus mutants ne présentant pas de résistance aux inhibiteurs de protease (Bl et VI)) ont été analysés. Les caractéristiques génotypiques et phénotypiques de ces quatre mutants sont présentées dans le tableau 1.
Figure imgf000023_0001
Tableau 1: Caractéristiques génotypiques et phénotypiques des mutants de la protease du VIH.
Les mutations sont décrites par rapport à la séquence en acides aminés (1- 99) de la protease du virus de référence (V: Val; I: Ile; M: Met; T: Thr; L: Leu et P: Pro). Le niveau de résistance des mutants correspond à l'augmentation relative (par rapport à la protease sauvage) de la concentration en inhibiteurs nécessaire pour inhiber 50%> de la réplication virale. Ces données ont été obtenues dans des tests in vitro ("Recombinant Virus Assay").
L'ADN codant pour les protéases modifiées a été clone dans le vecteur pUC19 (Exemple 2) et les plasmides obtenus ont été cotransfor és avec pKACp5 dans la souche DHTl. Le phénotype des bactéries transformées est observé sur milieu McConkey maltose contenant ou non des inhibiteurs de protease. Dans ces conditions, les protéases Bl et VI se comportent comme la protease sauvage (colonies blanches en absence d'inhibiteurs et rouges avec) ce qui est attendu car d'après leurs caractéristiques génotypiques et phénotypiques (tableau 1), elles ne présentent pas de résistance aux inhibiteurs de protease. Dans le cas du mutant V2, en présence d'Indinavir, le phénotype est le même que pour la protease sauvage (Cya+ à partir de 50μM d'Indinavir). En présence de Saquinavir, il faut une concentration plus forte (20μM au lieu de lOμM) pour que les bactéries deviennent Cya+. Le mutant V2 présente donc une résistance au Saquinavir (ce qui confirme les données du tableau 1). Enfin, dans le cas du mutant B3, le phénotype des bactéries est toujours
Cya+, y compris lorsqu'il n'y a pas d'inhibiteurs dans le milieu. Ceci peut s'expliquer par le fait que ce mutant a une activité protéolytique plus faible que la protease sauvage et que, même si elle clive une fraction des molécules d'adénylcyclase, il en reste suffisamment pour activer la cascade de régulation aboutissant au phénotype Cya+.
Le système est donc assez sensible pour détecter l'activité de la protease sauvage et des mutants Bl, VI et V2, mais pas suffisamment pour détecter des mutants moins actifs tels que B3. Ce manque de sensibilité du système peut être dû au fait que le clivage est la conséquence d'un processus bimoléculaire : en effet la protease, une fois synthétisée, doit dans un premier temps se dimériser et dans un deuxième temps interagir avec son substrat. Pendant ce laps de temps les molécules d'adénylcyclase non clivées synthétisent de l'AMPc qui active les opérons cataboliques.
Afin d'améliorer la sensibilité du système, une autre approche, dans laquelle la réaction est plus directe, a été menée : la protease entière a été insérée dans l'adénylcyclase, de façon à étudier l'autoprotéolyse de cette molécule chimérique.
Exemple 6. Inactivation en cis de l'adénylcyclase ά& B. pertussis. Autoprotéolyse de la protease du VIH insérée dans l'adénylcyclase 6. a. Principe
Ce système exploite les propriétés particulières de la protease du VIH d'une part et de l'adénylcyclase de B. pertussis d'autre part. Les enzymes et les protéines de structure du VIH sont synthétisées sous forme de polyprotéines. La maturation de ces polyprotéines est réalisée par la protease qui peut cliver des séquences en amont puis en aval de sa propre séquence (sites p5 et p6). Par ailleurs, l'adénylcyclase tolère des insertions importantes (jusqu'à 200 résidus) entre les fragments T25 et Tl 8 sans que cela n'affecte son activité enzymatique.
Une protéine chimérique (ACPr) a donc été construite (exemple 2), dans laquelle est insérée, entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase, la protease du VIH (99 résidus) et ses deux séquences de coupure p5 et p6 (8 acides aminés chacune). Dans ce cas, la protease sauvage s'autoprotéolyse en libérant T25 et T18 qui, séparés, sont inactifs. A l'opposé, si la protease est inactive ou en présence d'inhibiteurs, son autoclivage ne se fait pas, et l'adénylcyclase conserve son activité de synthèse d'AMPc et peut complémenter les E.coh cya qui ont alors un phénotype Cya+ (Figure 5).
6.b. Étude de la protease sauvage dans le système in vivo
Le phénotype des bactéries DHTl transformées avec pKACPr ou bien pKT25 (témoin négatif) ou bien pKACp5 ou pKAC (contrôles positifs) a été observé.
Les bactéries transformées avec pKACp5 ou pKAC conservent leur phénotype Cya+ (colonies rouges sur McConkey maltose) quelles que soient les conditions, car la protease est absente. A l'opposé, les bactéries exprimant T25 seul
(DHTl + pKT25), sont toujours Cya" (colonies blanches) car ce fragment est inactif.
Enfin, les bactéries transformées par le plasmide pKACPr sont Cya" en absence d'inhibiteur et Cya+ en présence de Saquinavir ou d'Indinavir. Ces résultats montrent que la protease est toujours active lorsqu'elle est insérée dans l'adénylcyclase et qu'elle peut être inhibée par les inhibiteurs de protease.
Ces résultats qualitatifs sont confirmés par les données quantitatives obtenues par dosage de l'AMPc et de l'activité β-galactosidase dans des cultures liquides de ces cellules (Figures 6 et 7).
Ces données indiquent que, dans le cas de la protease sauvage, ce système en "cis" est au moins aussi sensible que celui en "trans" : il permet de mettre en évidence l 'autoprotéolyse spécifique de la protéine chimérique AC/protéase-VIH et son inhibition par les inhibiteurs de protease.
La sensibilité de ce procédé a ensuite été étudiée, afin de déterminer s'il permet la détection de protéases dont l'activité est réduite, comme c'est le cas des mutants résistants aux inhibiteurs, en particulier le variant B3.
6.c. Détection de protéases du VIH résistantes aux inhibiteurs dans le système en "cis "
Pour cette étude, les protéases Bl, B3, VI et V2 sont insérées entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase et les protéines chimériques obtenues sont exprimées dans la souche DHTl (plasmides pKACBl, pKACB3, pKACVl et pKACV2).
Comme attendu, Bl et VI se comportent comme la protease sauvage (phénotype Cya" en absence d'inhibiteur et Cya+ avec). Le mutant B3 (pKACB3) confère, en absence d'inhibiteurs, un phénotype Cya" aux bactéries. En présence d'Indinavir, les bactéries transformées avec pKACB3 ont un phénotype Cya" jusqu'à une concentration de lOOμM, (contre 50μM pour celles transformées avec pKACPr) ce qui montre que cette protease porte une mutation qui la rend résistante à l'Indinavir. En présence de Saquinavir, les bactéries DHTl transformées avec pKACB3 ont un phénotype Cya" à lOμM alors que celles transformées avec pKACPr (protease sauvage) sont rouges sur ce milieu. La protease mutante B3 est donc également résistante au Saquinavir.
Dans le cas de la protease mutante V2, le système permet de mettre en évidence la diminution de sa sensibilité au Saquinavir et à l'Indinavir : les bactéries transformées avec pKACV2 sont Cya" sur milieu contenant lOOμM Indinavir ou
20μM de Saquinavir alors que sur ces mêmes milieux, les bactéries transformées avec pKACPr donnent des colonies rouges.
Le système en "cis " est donc beaucoup plus sensible que celui dans lequel la protease est apportée sur un plasmide indépendant ; en effet, il détecte des activités protéolytiques très faibles comme celle de la protease B3 et permet de distinguer des augmentations limitées de résistance (4X). Exemple 7. Détection d'une population minoritaire de protéases du VIH résistantes aux inhibiteurs
Cet exemple montre que l'invention permet, à partir d'un test phénotypique, de détecter dans une population majoritairement sensible, une minorité de virus VIH exprimant des protéases résistantes aux inhibiteurs. Ce procédé, qui peut être appliqué en routine sur le sérum de malades, permet de détecter l'émergence de résistance au stade précoce du traitement et éventuellement d'adapter le traitement en conséquence.
Pour cela, on a réalisé des mélanges contenant pKACV2 et pKACPr en quantités variables (1/1, 1/10 et 1/100), puis chacun de ces mélanges a été transformé dans la souche DHTl. Le phénotype des transformants est observé sur milieu McConkey maltose contenant 20μM de Saquinavir car cette concentration permet de discriminer aisément la protease sauvage sensible de la protease résistante au Saquinavir (V2). Les bactéries DHTl transformées avec pKACPr ou pKACV2 sont blanches en absence d'inhibiteurs. Quand ces mêmes DHTl sont transformées avec un mélange des deux plasmides, on observe qu'en présence de 20μM de Saquinavir, les colonies sur les boîtes sont hétérogènes : on distingue des colonies blanches et des colonies rouges. De plus, le rapport entre le nombre de colonies rouges et le nombre de colonies blanches sur ces boîtes correspond aux quantités relatives de pKACPr et pKACV2 transformés dans la souche DHTl. Afin de vérifier que les colonies blanches hébergent pKACV2 et les rouges pKACPr, les plasmides sont purifiés à partir de 4 colonies rouges et de 4 colonies blanches, puis digérés par EcoRl et Kpnl.
Les plasmides purifiés à partir des colonies rouges ont le même profil de digestion que pKACPr (deux fragments de 3852 pb et 710 pb) tandis que les plasmides issus des colonies blanches ont le même profil de digestion que pKACV2
(ils ne sont digérés que par Kpnl car ils n'ont pas de sites EcoRl, celui-ci ayant été éliminé à dessein pour faciliter la distinction entre les deux plasmides).
Les colonies rouges correspondent donc bien à des bactéries transformées par pKACPr, alors que les colonies blanches hébergent pKACV2. Le procédé décrit dans la présente invention permet donc de distinguer phénotypiquement des protéases résistantes à un inhibiteur donné dans une population qui contient majoritairement des protéases sensibles à cet inhibiteur.
Dépôt de matériel biologique Les organismes suivants ont été déposés le 04 Janvier 2000 à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.
- Souche DHTl Numéro d'ordre 1-2375
- Souche XLl/pUCVTH Numéro d'ordre 1-2376 - Souche XLl/pKACPr Numéro d'ordre 1-2377
- Souche XLl/pKACp5 Numéro d'ordre 1-2378

Claims

Revendications
1. Adenylcyclase recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adenylcyclase tout en conservant son activité enzymatique.
2. Adenylcyclase selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée comprend en outre une séquence polypeptidique correspondant à une molécule à activité protéolytique.
3. Adenylcyclase selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée contient au moins un site de clivage spécifique de la protease du VIH.
4. Adenylcyclase selon la revendication 3, caractérisée en ce que le site de clivage spécifique de la protease du VIH est le site p5, comprenant l'enchaînement d'acides aminés correspondant à SEQ ID NO 1.
5. Adenylcyclase selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée contient la protease du VIH encadrée des séquences de clivage p5 et p6 correspondant à la séquence SEQ ID NO 3. 6. Adenylcyclase selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'adénylcyclase est l'adénylcyclase de Bordetella pertussis. 1. Adenylcyclase selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique est insérée entre les acides aminés 224 et 225 de la séquence
SEQ ID NO 4. 8. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour une adenylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon la revendication
8, ou qu'il est capable d'exprimer une adenylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10, Vecteur selon la revendication 9, capable d'exprimer une adenylcyclase selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pKACp5 déposé le 4
Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2378,
11. Vecteur selon la revendication 9, capable d'exprimer une adenylcyclase selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pKACPr déposé le 4 Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2377.
12. Procédé pour la détection de l'activité protéolytique d'une molécule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. complémenter une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène par une adenylcyclase recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ladite souche- bactérienne, fongique ou lignée cellulaire possédant un phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase ; b. mettre ladite molécule à tester au contact de ladite souche ou lignée complémentée ; c. cultiver ladite souche ou lignée dans des conditions permettant la mise en évidence du phénotype lié à l'activité de l'adénylcyclase ; d. contrôler l'expression dudit phénotype.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène est complémentée par introduction d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que la souche bactérienne déficiente en adenylcyclase endogène est Escherichia coli.
15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à fermenter le lactose ou le maltose.
16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à résister à un antibiotique. 17. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à exprimer une protéine aisément détectable, en particulier la luciférase, ou la GFP.
18. Procédé pour la détection de la résistance à un inhibiteur d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, et qu'il comprend en outre la mise de ladite molécule au contact dudit inhibiteur dans l'étape b. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le niveau de ladite résistance est en outre mesuré par quantification de l'expression du phénotype étudié. 20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que ladite molécule à activité protéolytique est la protease du VIH. 21. Trousse de diagnostic pour la détection de molécules à activité protéolytique, caractérisée en ce qu'elle contient : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adenylcyclase recombinante, dans le site catalytique de laquelle sont insérés un ou plusieurs site(s) de clivage correspondant à la molécule à activité protéolytique. 22. Trousse de diagnostic pour la détection de molécules à activité protéolytique, caractérisée en ce qu'elle contient : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adenylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adenylcyclase, configuré pour pouvoir insérer le gène codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences autoprotéolytiques dans le domaine catalytique de l'adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique, c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences auto-protéolytiques, afin de l'insérer dans le fragment d'ADN de b. 23. Utilisation d'une adenylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11 pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la détection de l'activité de molécules à activité protéolytique ou leur résistance à un inhibiteur, ces molécules étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules d'un patient. 24, Utilisation d'une adenylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 1 1 pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la quantification du rapport (molécules à activité protéolytique résistantes à un inhibiteur / molécules à activité protéolytique non résistantes audit inhibiteur) chez un patient, lesdites molécules à activité protéolytique étant présentes dans le sérum ou les cellules dudit patient. 25. Utilisation selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisée en ce que la molécule à activité protéolytique est la protease du VIH.
26. Procédé pour l'identification de molécules à activité protéolytique site- spécifique dans une banque de molécules, caractérisé par la mise en œuvre un procédé selon l'une des revendications 12 à 17 sur les différentes molécules de la banque, l'adénylcyclase complémentant la souche bactérienne comprenant la séquence cible spécifique d'acides aminés pour laquelle on recherche les éventuelles molécules à activité protéolytique.
27. Procédé pour l'identification des séquences cibles d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé par la mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 17 sur une banque de souches bactériennes, fongiques ou des lignées cellulaires, chacune étant complémentée par une adenylcyclase selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant une séquence différente d'acides aminés afin de déterminer si cette séquence consiste en un site de clivage de ladite molécule à activité protéolytique. 28. Souche bactérienne tf Escherichia coli déficiente en adenylcyclase endogène, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche DHTl déposée le 4 Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2375 ou d'un mutant de cette souche. 29. Vecteur codant pour la protease du VIH caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pUCVIH déposé le 4 Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2376,
PCT/FR2001/000593 2000-02-28 2001-02-28 Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique WO2001064854A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MXPA02008427A MXPA02008427A (es) 2000-02-28 2001-02-28 Adenilciclasa recombinante y uso de la misma para analizar moleculas con actividad proteolitica.
IL15133101A IL151331A0 (en) 2000-02-28 2001-02-28 Recombinant adenylcyclase and use thereof for screening molecules with proteolytic activity
JP2001564337A JP2003525606A (ja) 2000-02-28 2001-02-28 組換えアデニルシクラーゼおよびタンパク質分解活性を有する分子のスクリーニングのためのそれらの使用
AU37519/01A AU3751901A (en) 2000-02-28 2001-02-28 Recombinant adenylcyclase and use thereof for screening molecules with proteolytic activity
BR0108767-3A BR0108767A (pt) 2000-02-28 2001-02-28 Adenilciclase recombinante, polinucleotìdeo, vetor, processos para a detecção de atividade proteolìtica de uma molécula e da resistência a um inibidor, de uma molécula com atividade proteolìtica e de identificação de moléculas com atividade proteolìtica sìtio-especìfica, kit de diagnóstico, utilização de uma adenilciclase, e, cepa bacteriana
CA002401315A CA2401315A1 (fr) 2000-02-28 2001-02-28 Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique
EP01909931A EP1265993A1 (fr) 2000-02-28 2001-02-28 Adenylcyclase recombinante et sa utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0002448A FR2805544B1 (fr) 2000-02-28 2000-02-28 Adenylcyclase recombinante et procede de tri de molecules a activite proteolytique utilisant cette adenylcyclase
FR00/02448 2000-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001064854A1 true WO2001064854A1 (fr) 2001-09-07

Family

ID=8847447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2001/000593 WO2001064854A1 (fr) 2000-02-28 2001-02-28 Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20030175735A1 (fr)
EP (1) EP1265993A1 (fr)
JP (1) JP2003525606A (fr)
CN (1) CN1419600A (fr)
AU (1) AU3751901A (fr)
BR (1) BR0108767A (fr)
CA (1) CA2401315A1 (fr)
FR (1) FR2805544B1 (fr)
IL (1) IL151331A0 (fr)
MX (1) MXPA02008427A (fr)
WO (1) WO2001064854A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005097818A2 (fr) * 2004-03-15 2005-10-20 Keck Graduate Institute Systeme de dosage permettant de cribler des inhibiteurs de protease
WO2020039033A1 (fr) * 2018-08-23 2020-02-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Protéines et compositions immunogènes

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105602924A (zh) * 2009-03-23 2016-05-25 巴斯德研究院 适合将免疫原性分子递送到细胞中的突变CyaA多肽及多肽衍生物
US9995716B2 (en) 2012-10-12 2018-06-12 General Electric Technology Gmbh Method for determining boiler tube cold side cracking and article for accomplishing the same

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0421109A2 (fr) * 1989-09-11 1991-04-10 American Cyanamid Company Procédés de dépistage des inhibiteurs de protéase
WO1992013972A1 (fr) * 1991-02-11 1992-08-20 Thomas Jefferson University Bacteries produites par genie genetique afin d'identifier et de produire des agents medicalement importants
WO1993021324A1 (fr) * 1992-04-21 1993-10-28 Institut Pasteur Mutants de recombinaison permettant d'induire des reponses immunitaires specifiques
WO1999028746A1 (fr) * 1997-12-04 1999-06-10 Institut Pasteur Systeme bacterien comportant des hybrides multiples et ses mises en application
WO1999038961A1 (fr) * 1998-01-30 1999-08-05 Sepracor Inc. Proteines de fusion regulatrices de genes et leurs procedes d'utilisation pour determiner la resistance d'une proteine a un medicament dirige contre elle

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0421109A2 (fr) * 1989-09-11 1991-04-10 American Cyanamid Company Procédés de dépistage des inhibiteurs de protéase
WO1992013972A1 (fr) * 1991-02-11 1992-08-20 Thomas Jefferson University Bacteries produites par genie genetique afin d'identifier et de produire des agents medicalement importants
WO1993021324A1 (fr) * 1992-04-21 1993-10-28 Institut Pasteur Mutants de recombinaison permettant d'induire des reponses immunitaires specifiques
WO1999028746A1 (fr) * 1997-12-04 1999-06-10 Institut Pasteur Systeme bacterien comportant des hybrides multiples et ses mises en application
WO1999038961A1 (fr) * 1998-01-30 1999-08-05 Sepracor Inc. Proteines de fusion regulatrices de genes et leurs procedes d'utilisation pour determiner la resistance d'une proteine a un medicament dirige contre elle

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAUTIN N ET AL: "Sensitive genetic screen for protease activity based on a cyclic AMP signaling cascade in Escherichia coli.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 182, no. 24, December 2000 (2000-12-01), pages 7060 - 7066, XP002168697 *
LADANT D ET AL: "INSERTIONAL MUTAGENESIS OF BORDETELLA-PERTUSSIS ADENYLATE CYCLASE", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 267, no. 4, 1992, pages 2244 - 2250, XP000960634, ISSN: 0021-9258 *
MELNICK L ET AL: "AN ESCHERICHIA COLI EXPRESSION ASSAY AND SCREEN FOR HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS PROTEASE VARIANTS WITH DECREASED SUSCEPTIBILITY TO INDINAVIR", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,US,AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, vol. 42, no. 12, December 1998 (1998-12-01), pages 3256 - 3265, XP000901687, ISSN: 0066-4804 *
MUNIER HELENE ET AL: "Structural flexibility of the calmodulin-binding locus in Bordetella pertussis adenylate cyclase: Reconstitution of catalytically active species from fragments or inactive forms of the enzyme.", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 217, no. 2, 1994, pages 581 - 586, XP000964836, ISSN: 0014-2956 *
MURRAY MICHAEL G ET AL: "Inactivation of a yeast transactivator by the fused HIV-1 proteinase: A simple assay for inhibitors of the viral enzyme activity.", GENE (AMSTERDAM), vol. 134, no. 1, 1993, pages 123 - 128, XP002926686, ISSN: 0378-1119 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005097818A2 (fr) * 2004-03-15 2005-10-20 Keck Graduate Institute Systeme de dosage permettant de cribler des inhibiteurs de protease
WO2005097818A3 (fr) * 2004-03-15 2006-06-08 Keck Graduate Inst Systeme de dosage permettant de cribler des inhibiteurs de protease
WO2020039033A1 (fr) * 2018-08-23 2020-02-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Protéines et compositions immunogènes

Also Published As

Publication number Publication date
EP1265993A1 (fr) 2002-12-18
FR2805544B1 (fr) 2004-07-16
FR2805544A1 (fr) 2001-08-31
US20030175735A1 (en) 2003-09-18
BR0108767A (pt) 2002-12-03
IL151331A0 (en) 2003-04-10
CN1419600A (zh) 2003-05-21
CA2401315A1 (fr) 2001-09-07
JP2003525606A (ja) 2003-09-02
MXPA02008427A (es) 2002-12-13
AU3751901A (en) 2001-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuchma et al. BifA, a cyclic-Di-GMP phosphodiesterase, inversely regulates biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14
Sheahan et al. Autoprocessing of the Vibrio cholerae RTX toxin by the cysteine protease domain
JP3456703B2 (ja) リポーター遺伝子に融合した細菌のストレスプロモーターを用いる毒性を測定するための方法および診断用キット
Patru et al. A role for the class A penicillin-binding protein PonA2 in the survival of Mycobacterium smegmatis under conditions of nonreplication
Moraes et al. Two-component system VicRK regulates functions associated with establishment of Streptococcus sanguinis in biofilms
Bebenek et al. Interacting fidelity defects in the replicative DNA polymerase of bacteriophage RB69
JPH07506003A (ja) Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおける抗生物質耐性の迅速検出法
WO1988003167A1 (fr) Retrovirus recombinant defectif
Wang et al. Characterization of FtsH essentiality in Streptococcus mutans via genetic suppression
US20120135497A1 (en) Differentially fluorescent yeast biosensors for the detection and biodegradation of chemical agents
EP1332210A1 (fr) Utilisation d&#39;adn polymerase mutagene pour la creation de mutations aleatoires
WO2001064854A1 (fr) Adenylcyclase recombinante et son utilisation pour le tri de molecules a activite proteolytique
CA1222212A (fr) Procede de detection du pouvoir mutagene de substances susceptibles d&#39;induire la deterioration d&#39;adn cellulaires mettant en jeu la productiond&#39; une reponse sos
Deghorain et al. Selectivity for D-lactate incorporation into the peptidoglycan precursors of Lactobacillus plantarum: role of Aad, a VanX-like D-alanyl-D-alanine dipeptidase
CA2563394A1 (fr) Methode d&#39;etude de la variabilite genique et fonctionnelle du vih et kit pour sa mise en oeuvre
Vandeputte et al. Hypersusceptibility to azole antifungals in a clinical isolate of Candida glabrata with reduced aerobic growth
FR2891544A1 (fr) Substrat proteique pour la detection de l&#39;activite calpaine 3
FR3107902A1 (fr) Bacteries gram-positives de l’espece lactococcus lactis ou streptococcus thermophilus ayant une tres faible proteolyse de surface, leurs methodes d’obtention et leurs utilisations
EP0301954A2 (fr) Procédé de clonage et d&#39;expression de gènes codant pour des protéines constituant des édifices fonctionnels organisés
FR2624523A1 (fr) Acide desoxyribonucleique portant l&#39;information genetique de la l-(alpha)-glycerophosphate oxydase et son application
FR2729973A1 (fr) Procede de criblage de composes anti-viraux
Georgaki et al. Polymorphic positions 349 and 725 of the autoimmunity-protective allotype 10 of ER aminopeptidase 1 are key in determining its unique enzymatic properties
Ramos PHENOTYPIC ANALYSIS ON THE GAP GYP8 REGULATION OF RAB GTPASE YPT1 IN AUTOPHAGY PATHWAY IN S. CEREVISIAE
Rousseau From Tuberculosis Diagnostics to Therapy: Development of a Tail Fiber Protein-Derived Microfluidic Diagnostic Device and Utilization of Synergistic Properties of Antimycobacterial Drugs
JP2014143942A (ja) ジアホラーゼ組成物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 151331

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IN/PCT/2002/01140/MU

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2401315

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001909931

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 02075736

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2001 564337

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: PA/a/2002/008427

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 018070353

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10204987

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001909931

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001909931

Country of ref document: EP