FR2805544A1 - Adenylcyclase recombinante et procede de tri de molecules a activite proteolytique utilisant cette adenylcyclase - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une adénylcyclase recombinante, comprenant au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique. L'invention concerne également des procédés de tri de molécules à activité protéolytique utilisant cette adénylcyclase recombinante.

Description

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La présente invention concerne une adénylcyclase recombinante, comprenant au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique. L'invention concerne également les fragments d'ADN codant pour une telle adénylcyclase recombinante, ainsi que des procédés de détection, d'identification et/ou de quantification d'activité protéolytique ou de résistance à des inhibiteurs d'activité protéolytique de molécules utilisant les produits ci-dessus définis. Des trousses de diagnostics pour la mise en #uvre de ces procédés sont également objets de l'invention.

Chez les eucaryotes comme chez les procaryotes, les protéases sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Les cascades d'activation par protéolyse conduisant à la coagulation et à la digestion sont maintenant bien connues mais on découvre régulièrement de nouveaux phénomènes impliquant ces enzymes. Certains récepteurs membranaires ("Protease Activated Receptor" : sont activés spécifiquement par protéolyse (Coughlin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 91, 9200-2). Chez Bacillus subtilis, les protéases SpoIIGA et SpoIVFB assurent la conversion de pro-#E et pro-aK en #E et #K, facteurs de transcription essentiels à la sporulation (Hofmeister et al, 1995, Cell, 83,219-26 ; Lu et al, 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 87,9722-6). Les caspases, autre famille de protéases, sont impliquées dans l'apoptose (Villa et al, 1997, TIBS, 22,388-93 ; Steller, 1995, Science, 267,1445-9) et ont un rôle important dans le développement et l'homéostasie. Les protéases sont également impliquées dans certaines pathologies : la maladie d'Alzheimer serait due à un clivage anormal des ss-amyloides par une sérine-protéase (Selkoe, 1999, Nature, 399,23-31). Dans les tumeurs, des métalloprotéinases (MMPs), en dégradant la matrice extracellulaire, permettent aux cellules de métastaser (Nagase et al, 1999, J Biol. Chem., 274, 21491-4). Enfin, la protéase est un élément indispensable à la maturation de nombreux virus dont certains sont responsables d'infections mortelles (Schwartz et al, 1999, Clin. Diagn.

Lab. Immunol., 6, 295-305).

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L'identification de ces enzymes et leur étude sont donc nécessaires aussi bien pour préciser leurs rôles physiologiques que pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La complexité des méthodes classiques de caractérisation et de purification des protéases a entraîné le développement de systèmes génétiques d'étude chez Escherichia coli ou chez la levure. Ces systèmes ont pour but d'isoler et de caractériser des protéases site-spécifiques. Leur principe repose, soit sur l'inactivation d'un enzyme rapporteur dans lequel a été introduit le site de coupure spécifique de la protéase étudiée, soit sur la toxicité de cette protéase chez E. coli.

Sices et al (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,2828-33), ont décrit un système dans lequel le répresseur du phage est spécifiquement clivé, entraînant le passage de l'état lysogénique à l'état lytique. Des sites spécifiques de clivage ont également été insérés dans la p-galactosidase et la thymidylate synthase d'E. coli et dans l'activateur transcriptionnel GAL4 de la levure (Baum et al, 1990, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 87, 5573-7 ;Kupiec et al, 1996, J. Biol. Chem., 271, 18465-70 ; Dasmahapatra et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,4159-62). La protéolyse de ces protéines a ensuite été observée in vivo. Baum et al, (1990, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 87,10023-7) ont montré que la surexpression de la protéase du VIH est toxique dans la souche E. coli BL21 (DE3) et ont utilisé cette propriété pour isoler et étudier des mutants non toxiques de la protéase. Cette toxicité a également été utilisée pour cribler des inhibiteurs de protéase (Buttner et al, 1997, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 233,36-8). Toutefois, le manque de sensibilité de ces systèmes en a limité l'utilisation.

Ce manque de sensibilité tient au fait que, lorsque la protéase étudiée possède une faible activité protéolytique, la protéolyse de la protéine rapporteur cible est incomplète. Dans la plupart des cas, l'activité enzymatique résiduelle de la fraction de protéine cible non clivée suffit alors pour conférer le phénotype associé à la forme active de cette protéine. De ce fait, il est impossible de discriminer phénotypiquement les organismes exprimant une protéase capable de cliver et d'inactiver la protéine rapporteur cible de ceux n'exprimant pas cette protéase spécifique.

La recherche porte actuellement particulièrement sur le développement de tests permettant l'étude de protéases virales, et en particulier de la protéase du VIH, virus responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA).

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En effet, les molécules les plus actives dont on dispose à l'heure actuelle pour le traitement de l'infection à VIH sont les inhibiteurs de protéase du VIH, associés dans le cadre des trithérapies à des inhibiteurs de la transcriptase inverse.

L'efficacité de ces molécules repose sur le fait que la protéase est indispensable à la multiplication du virus : VIH est un rétrovirus, sa capside contient un ARN qui, une fois introduit dans la cellule cible, est rétrotranscrit par la transcriptase inverse virale. L'ADN obtenu est intégré au génome eucaryote puis les gènes codant les protéines de structure et les enzymes du virus sont transcrits et traduits en polyprotéines par la machinerie cellulaire. Le rôle de la protéase virale est de cliver ces précurseurs (gag et pol) en protéines actives pour obtenir des virus matures et infectieux. La protéase est libérée des polyprotéines par autoprotéolyse et assure ensuite le clivage des autres protéines par coupure de 8 sites spécifiques (pi à p8 où p5 et p6 sont les sites flanquants la protéase).

Lors de l'étape de transcription inverse, des mutations peuvent apparaître dans la séquence de la protéase. Elles sont en général silencieuses ou létales mais peuvent parfois conduire à une résistance aux inhibiteurs de protéase (Dulioust et al, 1999, J Virol., 73,850-4) et provoquer un échappement au traitement (Perrin et al, 1998, Science, 280,1871-3). Cette résistance est généralement couplée à une baisse d'activité protéolytique de l'enzyme.

Du fait de l'importance des protéases en général, et de la protéase du VIH en particulier, il est donc nécessaire de déterminer un procédé qui permette de détecter les activités protéolytiques de molécules, de préférence des protéines, ces activités étant de préférence site-spécifique .

Par site- spécifique , on entend que la protéase reconnaît une séquence spécifique d'acides aminés dans un polypeptide et qu'elle clive ledit polypeptide à un site qui dépend de la séquence d'acides aminés et de la protéase. Ce site peut être situé entre deux acides aminés de ladite séquence spécifique, mais peut également être situé en amont ou en aval de ladite séquence.

Il est essentiel d'apporter des améliorations aux systèmes actuels de détection des protéases. En particulier, il faut améliorer la sensibilité des systèmes afin de permettre la détection de l'activité protéolytique plus faible de certaines protéases mutées. Dans le cas du VIH, ce point est d'autant plus important que sa protéase possède une activité protéolytique déjà relativement faible.

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De plus, afin que les tests puissent être utilisés en clinique, il est important que ceux-ci soient faciles à mettre en #uvre, qu'ils soient peu onéreux et que les résultats puissent être obtenus dans un délai raisonnable (quelques jours). En effet, pour l'étude de la protéase du VIH, on utilise actuellement un test de virus recombinant (RVA pour Recombinant Virus Assay), qui consiste en l'introduction du gène de la protéase du virus à étudier dans un virus test connu, et en l'étude dudit virus recombinant sur des lignées cellulaires. Ce test présente l'inconvénient de ne caractériser que la population majoritaire des virus présents dans l'organisme du patient, et d'imposer une attente de quelques semaines pour obtenir les résultats.

La présente invention apporte une solution originale au problème de développement de tests pour la détection de molécules à activité protéolytique, par l'élaboration d'un système génétique de détection de telles activités fondé sur l'inactivation, par protéolyse, d'une adénylcyclase (ou adénylate cyclase), de préférence de l' adénylcyclase de Bordetella pertussis.

L'adénylcyclase est une enzyme impliquée dans la synthèse de l'AMP cyclique (AMPc) à partir de l'ATP. L'AMPc est un médiateur intracellulaire ubiquitaire, qui ne semble toutefois pas être requis pour la survie ou la croissance des cellules, au moins chez les bactéries, dans certaines conditions de croissance.

L'AMPc est donc utilisé, dans la présente invention, comme molécule signalisatrice.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par adénylcyclase ou adénylate cyclase toute protéine possédant la même activité biologique que les adénylcyclases trouvées dans les organismes naturels, c'est-à-dire ayant la capacité de transformer l'ATP en AMPc, ou en d'autres termes conforme aux protéines de la définition internationale EC 4.6.1.1, ou bien toute enzyme possédant une activité biologique similaire, dérivée d'une adénylate cyclase. L'homme du métier est en effet capable, en effectuant certaines mutations judicieuses, de transformer une adénylate cyclase en guanylate cyclase, c'est à dire de changer la spécificité du substrat de la protéine de départ afin qu'elle produise du GMPc à partir de GTP (EC 4. 6.1.2) (Beuve et Danchin, 1992, J. Mol. Biol., 225,933-8) et inversement (Beuve, 1999, Methods, 19, 545-50). Une telle enzyme, obtenue à partir d'une adénylate cyclase est donc comprise dans la définition donnée ci-dessus.

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Le système développé dans la présente invention est fondé sur l'inactivation protéolytique du domaine catalytique de ladite adénylcyclase (CYA). Ce domaine peut complémenter une souche bactérienne, fongique (y compris de levure) ou lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène (cya-) pour lui redonner un phénotype cya+.

On détecte ledit phénotype cya+, de préférence en étudiant un second phénotype de ladite souche ou lignée, plus aisément détectable, et dont l'apparition est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase.

Ainsi, lorsqu'une molécule à activité protéolytique est présente, active, et reconnaît le site de clivage inséré dans l'adénylcyclase, cette dernière est coupée, et la souche complémentée redevient cya'.

Par aisément détectable , on entend qu'il n'est pas besoin de mettre en oeuvre des moyens excessifs ou d'utiliser un appareillage excessif pour la détection du phénotype. En effet, il est possible de détecter directement le phénotype cya+, mais cela nécessite la détection de la formation d'AMPc, ce qui peut être fait par ELISA mais demande un certain appareillage et ne peut être effectué rapidement.

Ainsi, un phénotype aisément détectable peut être observé de préférence de manière macroscopique. Par exemple, il peut être directement observable sur boîte de Pétri avec un milieu approprié.

Certains exemples de phénotypes aisément détectables comprennent la résistance aux antibiotiques (induite ou réprimée par l'AMPc), le catabolisme de certains sucres, tels le maltose ou le lactose, ou l'expression induite par l'AMPc de protéines aisément détectables (par exemple la (3-galactosidase, la luciférase, la protéine verte fluorescente (GFP)). L'homme du métier est capable de choisir et de définir d'autres systèmes possédant les mêmes propriétés.

La présente invention a ainsi pour objet une adénylcyclase recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique.

Dans un autre mode de mise en #uvre de l'invention, la séquence polypeptidique insérée comprend en outre une séquence polypeptidique

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correspondant à une molécule à activité protéolytique. Dans ce cas, la protéase doit s'autoprotéolyser.

Ainsi, selon le mode de mise en #uvre de l' invention, la protéase d' intérêt est apportée en trans de la séquence contenant les sites de clivage (premier cas), ou elle est apportée en cis (second cas).

D'une manière préférée, la séquence polypeptidique contient au moins un site de clivage spécifique d'une protéase virale, de préférence de la protéase du VIH, en particulier p5 (SEQ ID NO 1) et/ou p6 (SEQ ID NO 2).

Un autre mode de réalisation préféré de l'invention concerne une adénylcyclase recombinante comprenant une séquence polypeptidique insérée dans son domaine catalytique, tout en conservant son activité enzymatique, ladite séquence polypeptidique contenant en outre une protéase virale. De manière préférée, il s'agit de la protéase du VIH encadrée des séquences de clivage p5 et p6 (SEQ ID NO 3).

Toute adénylcyclase dans le site catalytique de laquelle il est possible d'insérer une séquence polypeptidique, tout en conservant son activité enzymatique, peut être utilisée pour la mise en #uvre de l'invention. Toutefois, une adénylcyclase préférée est l'adénylcyclase des bactéries du genre Bordetella, en particulier B. pertussis, et plus spécialement, le domaine catalytique de l'adénylcyclase de B. pertussis (SEQ ID NO 4).

En effet, ce domaine est composé de deux fragments T25 et T18, tous deux nécessaires à l'activité de cette adénylcyclase, et peut tolérer des insertions importantes (jusqu'à 200 résidus) entre ces fragments sans que son activité enzymatique en soit affectée ; par contre, les deux fragments dissociés n'ont pas d'activité. Ces deux fragments correspondent aux acides aminés 1-224 (T25) et 225- 400 (T18).

Ainsi un mode de réalisation tout particulièrement préféré de l'invention consiste en l'adénycyclase de B. pertussis, comprenant une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique insérée entre les résidus 224 et 225. Toutefois, il est clair que l'invention ne saurait être réduite à ce site, dans la mesure où l'on peut déterminer d'autres sites permissifs pour l'insertion de séquences étrangères, sans qu'il n'y ait inactivation de la protéine. On peut citer à titre d'exemple les

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résidus 137-138,228-229, 235-236,317-318, 384-385 (Ladant et al., 1992, J Biol Chem., 267,2244-50). Cette liste n'est pas exhaustive et d'autres sites peuvent également être utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention.

Dans la présente demande, il est entendu que les termes résidu et acide aminé ont la même signification.

La présente invention concerne également un polynucléotide (de préférence un fragment d'ADN) caractérisé en ce qu'il code pour une adénylcyclase selon la présente invention, et un vecteur contenant un tel fragment d'ADN ou un tel polynucléotide ou permettant l'expression d'une adénylcyclase selon l'invention.

La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une adénylcyclase recombinante selon l'invention, en tant que telle ou exprimée par un fragment d'ADN, polynucléotide, ou vecteur, dans des procédés de détection, d'identification et/ou de quantification de l'activité protéolytique ou de la résistance à des inhibiteurs d'activité protéolytique. De tels procédés font également partie de l' invention.

Ainsi, un procédé selon l'invention pour la détection de l'activité protéolytique d'une molécule est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. complémenter une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène par une adénylcyclase recombinante selon l'invention, ladite souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire possédant un phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase ; b. mettre ladite molécule à tester au contact de ladite souche ou lignée complémentée ; c. cultiver ladite souche ou lignée dans des conditions permettant la mise en évidence du phénotype lié à l'activité de l'adénylcyclase ; d. contrôler l'expression dudit phénotype.

Il existe de nombreuses souches bactériennes, fongiques ou lignées cellulaires déficientes en adénylcyclase endogène. On peut citer en particulier les souches bactériennes E. coli cya-, les bactéries du genre Salmonella, des souches de

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levure Saccharomyces (Matsumoto et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2355-9), ou les lignées cellulaires GHl (Martin et al, 1981, J Cell. Physiol., 109, 289-97) ou dérivées d'un lymphome (Bourne et al, 1975, Science, 187,750-2). De manière préférée, on utilisera une souche bactérienne E. coli cya-, en particulier la souche DHT1 (F-, gln V44(AS), recAl, endAl, gyrA96 (Nalr), thil, hsdRI7, spoTl, rfbDl, cya-854, ilv-691 : : TnlO). Cette souche ou tout mutant de cette souche est également un des objets de l'invention.

Par mutant de la souche bactérienne DHT1, on entend au sens de l'invention une souche bactérienne possédant un indice de similarité d'au moins 90%, de préférence 95%, 98% ou 99% tel que déterminé par exemple par la méthode RFLP ou RAPD, et présentant le même phénotype que la souche DHT1, c'est-à-dire cya-.

Un des modes préférés pour complémenter la souche ou lignée utilisée est l'introduction d'un fragment d'ADN ou d'un polynucléotide selon l'invention. Un tel fragment ou polynucléotide peut être porté par un vecteur selon l'invention, mais peut également être intégré de façon stable dans le chromosome. L'homme du métier choisira une technique ou une autre en fonction des résultats à atteindre. De manière préférée, on introduit le fragment d'ADN ou polynucléotide de façon épisomale sur un vecteur selon l'invention.

La mise en contact de la molécule à activité protéolytique se fait de préférence par introduction dans la souche ou la lignée complémentée d'un fragment d'ADN ou polynucléotide codant pour ladite molécule à activité protéolytique et donc par l'expression de ladite molécule dans ladite souche.

On a déjà cité les phénotypes aisément détectables liés à l'activité de l'adénylcyclase. Chez E. coli, on choisit de préférence la capacité à fermenter des sucres tels que le maltose ou le lactose.

Afin de déterminer la capacité de résistance de la molécule à activité protéolytique à un inhibiteur d'activité protéolytique, on mettra en #uvre le procédé ci-dessus décrit, en mettant en outre ladite molécule au contact dudit inhibiteur dans l'étape b.

On peut également mesurer le niveau de résistance à l'inhibiteur en quantifiant l'expression du phénotype observé. Ainsi, et en fonction du phénotype étudié, l'homme du métier saura doser l'activité de la p-galactosidase dont

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l'expression est naturellement contrôlée par l'AMPc. Il saura aussi doser l'activité d'autres protéines telles que la luciférase (dans ce cas, on utilisera des souches cyaavec un gène sous contrôle d'un promoteur AMPc/CAP dépendant), ou mesurer le niveau de résistance à un antibiotique donné ou bien la fluorescence émise dans le cas où la GFP est utilisée. On peut également doser l'AMPc produit, ce qui donne une mesure exacte de l'activité de l'adénylcyclase dans la cellule hôte.

On met de préférence en #uvre les procédés selon l'invention pour détecter l'activité protéolytique et/ou la résistance aux inhibiteurs de la protéase du VIH.

Les procédés selon l'invention peuvent donc s'avérer des outils extrêmement précieux pour l'étude des infections au VIH, en particulier pour la recherche de laboratoire afin de définir de nouvelles molécules inhibitrices de la protéase du VIH, tester l'efficacité des inhibiteurs en cours de développement, ou déterminer de nouveaux mutants dont l'étude pourra aider à la compréhension des mécanismes de résistance du virus.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une adénylcyclase, d'un fragment d'ADN ou d'un vecteur selon l'invention, pour la fabrication de trousses de diagnostic permettant la détection de l'activité de molécules à activité protéolytique ou leur résistance à un inhibiteur, ces molécules étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules d'un patient.

On peut également utiliser les composés selon l'invention pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la quantification du rapport (molécules à activité protéolytique résistantes à un inhibiteur / molécules à activité protéolytique non résistantes audit inhibiteur) chez un patient, lesdites molécules à activité protéolytique étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules dudit patient.

De telles trousses de diagnostic, contiennent en particulier a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur selon l'invention codant pour une adénylcyclase recombinante, dans le site catalytique de laquelle sont insérés un ou plusieurs site (s) de clivage correspondant à la molécule à activité protéolytique.

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Ces trousses peuvent en outre éventuellement contenir : c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt flanquée ou non de séquences auto-protéolytiques, et/ou d. un vecteur configuré de manière à pouvoir y insérer l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt amplifié en utilisant les amorces de c., et/ou e. un vecteur possédant la même base que le vecteur de d., codant pour une molécule protéolytique active, afin de disposer d'un contrôle positif, et/ou f. des milieux de culture permettant la croissance de la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire de a. et la détection du phénotype associé à la production d'AMPc, et/ou g. des réactifs pour quantifier la production d'AMPc dans la souche ou lignée utilisée, et/ou h. des réactifs pour quantifier l'expression de la protéine rapporteur.

Une telle trousse de diagnostic permet l'étude d'une protéase insérée en trans, puisque celle-ci est alors apportée sur un autre vecteur que celui codant pour l'adénylcylase selon l'invention. Il est donc alors entendu que le vecteur codant pour l'adénylcyclase peut avoir déjà été introduit dans la souche déficiente, soit sous forme épisomiale, soit sous forme permettant l'intégration dans le génome. Ce dernier cas peut-être particulièrement préféré, dans la mesure où l'on dispose alors d'une souche initialement déficiente en adénylcyclase endogène (a) complémentée de manière stable par une adénylcyclase selon l'invention (b). L'emploi d'antibiotiques n'est alors pas nécessaire pour maintenir la sélection et la mise en #uvre du procédé selon l'invention n'est pas changée.

Dans un autre cas de figure, le vecteur et la souche sont présentés de façon séparée, et l'utilisateur doit transformer la souche afin de restaurer une activité adénylcyclase.

La présente invention couvre également les trousses de diagnostics contenant : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène,

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b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adénylcyclase, configuré pour pouvoir insérer le gène codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences autoprotéolytiques dans le domaine catalytique de l'adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique, c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences auto-protéolytiques, afin de l'insérer dans le fragment d'ADN de b.

Ces trousses peuvent en outre éventuellement contenir : d. un vecteur possédant la même base que le vecteur de b., codant pour une adénylcyclase, dans le site catalytique de laquelle est insérée une molécule protéolytique active éventuellement flanquée de séquences protéolytiques, afin de disposer d'un contrôle positif, et/ou e. des milieux de culture permettant la croissance de la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire de a. et la détection du phénotype associé à la production d'AMPc, et/ou f. des réactifs afin de quantifier la production d'AMPc dans la souche ou lignée utilisée, et/ou g. des réactifs pour quantifier l'expression de la protéine rapporteur.

Une telle trousse de diagnostic permet l'étude de l'action de la protéase en cis, ce qui est particulièrement avantageux, en particulier pour la détection de résistance à des inhibiteurs, comme démontré dans les exemples.

De préférence, ces trousses de diagnostic permettent l'étude d'une protéase virale, en particulier la protéase du VIH. Dans ce cas, on choisit - des amorces spécifiques pour amplifier l'ADN codant pour cette protéase et les régions flanquantes p5 et p6, en particulier les amorces de séquences SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO 8.

Ces outils de diagnostic permettent d'identifier de manière précoce, à partir du sérum de malades atteints du SIDA, des mutants résistants aux inhibiteurs de protéases. Ainsi, il est attendu que le choix d'un traitement adapté à un patient en

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fonction des populations virales qu'il héberge permettra de limiter les échecs thérapeutiques.

En effet, le système est simple à utiliser et rapide (PCR sur le sérum de malades, sous-clonage dans le plasmide qui, de préférence est dérivé de pUC et transformation dans les bactéries qui peuvent être DHT1). On peut ainsi espérer obtenir un résultat en quelques jours seulement contre 2-3 semaines pour le RVA.

En outre, ce test limite la manipulation au fragment d'ADN proviral codant pour la protéase du VIH. Il est donc effectué sans risque de contamination et ne nécessite pas de laboratoire P3 contrairement au test RVA.

Par ailleurs, et comme les exemples le démontrent, l'invention permet d'obtenir une très grande sensibilité de détection. En effet, l'adénylcyclase est une protéine possédant une demi-vie assez courte. De plus, le peptide contenant les résidus 224 et 225 de l'AC de B. pertussis est facilement accessible à des protéines extérieures, dans la mesure où l'adénylcyclase est une protéine relativement flexible. L'introduction préférée des sites de protéolyse entre les résidus 224 et 225 mène donc à une bonne exposition de ces sites à la protéase d'intérêt. Ceci permet donc de gagner en sensibilité. On gagne encore plus en sensibilité lorsque l'on utilise le système dans lequel la protéase est insérée en cis et s'autoprotéolyse, puisque dans ce cas, le processus de clivage est intramoléculaire, et qu'il n'y a pas de compétition avec d'autres protéines de la souche ou lignée complémentée, par exemple d'E. coli.

Ce système génétique peut également être utilisé pour effectuer des criblages à grande échelle afin de rechercher des protéases responsables du clivage d'une séquence spécifique ou bien les séquences cibles d'une protéase donnée.

Ainsi, l'invention concerne aussi un procédé pour l'identification de molécules à activité protéolytique site-spécifique dans une banque de molécules, caractérisé par la mise en #uvre d'un procédé tel que décrit précédemment sur les différentes molécules de la banque, l'adénylcyclase complémentant la souche bactérienne, fongique ou la lignée cellulaire étant caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence cible spécifique d'acides aminés pour laquelle on recherche les éventuelles molécules à activité protéolytique.

De même, l'invention concerne un procédé pour l'identification des séquences cibles d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé par la mise en

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#uvre d'un procédé tel que décrit précédemment sur une banque de souches bactériennes, fongiques ou des lignées cellulaires, chacune étant complémentée par une adénylcyclase selon l'invention comprenant une séquence différente d'acides aminés afin de déterminer si cette séquence consiste en un site de clivage de ladite molécule à activité protéolytique.

Les exemples qui suivent permettent d'illustrer l'invention en développant certains modes de réalisation préférés.

En particulier, ces exemples permettent d'illustrer les différents avantages de l'invention, notamment la grande sensibilité des procédés selon l'invention, et les avantages de chaque système selon l'invention (introduction de la molécule à activité protéolytique en cis ou en trans).

A partir de ces exemples, l'homme du métier sera capable d'améliorer certains paramètres. En particulier, toutes les valeurs données dans les exemples ne le sont qu'à titre indicatif et ne doivent en aucun cas être considérées comme limitant l'invention.

DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique des plasmides utilisés dans un mode de réalisation de l'invention. plac: promoteur de l'opéron lactose ; et T18: séquences codant respectivement les fragments T25 et T18 de l'adénylcyclase de B.pertussis ; p5 et p6 : codant les sites de clivage de la protéase VIH; kanr: gène de résistance à la kanamycine; ampr: gène de résistance à l'ampicilline.

Les plasmides pKT25 et dérivés ont une origine de réplication de type P15A et sont donc compatibles avec les plasmides pUCVIH et dérivés (origine de réplication: ColEl).

Figure 2 : Inactivation de l'adénylcyclase en trans par la protéase du virus VIH. T25et T18 correspondent respectivement aux acides aminés 1-224 et 225-400 de AC. p5 est un des sites spécifiques de coupure de la protéase du VIH (en amont de la séquence de la protéase). En A, la protéine recombinante ACp5, exprimée chez E.coli a une activité basale, calmoduline-indépendante, qui conduit à la synthèse d'AMPc et à l'activation des opérons lactose et maltose. En B, la protéase du VIH, coexprimée avec ACp5, clive la protéine, ce qui libère les fragments

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inactifs T25 et T18: il n'y a pas de synthèse d'AMPc. En C, la protéase inhibée spécifique ne peut inactiver ACp5 qui peut donc synthétiser de l'AMPc.

Figure 3 : Activité ss-galactosidase des bactéries DHT1 transformées avec pKACp5 et pUC 19, pKACp5 et pUCVIH ou bien pKT25 et pUC19. Les bactéries transformées sont cultivées 1 nuit à 30 C en milieu LB + kanamycine + ampicilline additionné des inhibiteurs de protéase aux concentrations indiquées. Le dosage est ensuite effectué comme décrit dans l'Exemple 3.

Figure 4 : Synthèse d'AMPc dans les cellules en fonction de la concentration des inhibiteurs de protéase dans le milieu de culture. Les bactéries Ecoli DHT1 ont été transformées avec les plasmides indiqués, puis cultivées 1 nuit à 30 C en milieu LB + kanamycine + ampicilline additionné des inhibiteurs de protéase aux concentrations indiquées. Le dosage de l'AMPc est réalisé comme décrit dans l'Exemple 4.

Figure 5 : Autoprotéolyse de la protéase du VIH insérée dans l'adénylcyclase. T25 et T18 représentent respectivement les acides aminés 1-224 et 225-400 de l'adénylcyclase de B.pertussis, p5 et p6 sont les sites spécifiques de clivage de la protéase du VIH. En A, la protéase s'autoclive ce qui génère les deux fragments inactifs T25 et T18; les bactéries restent Cya-. En B, les inhibiteurs de protéase inactivent la protéase qui ne peut plus s'autocliver; l'adénylcyclase synthétise alors de l'AMPc et restaure un phénotype Cya+.

Figure 6 : Activité ss-galactosidase des bactéries DHT1 transformées avec pKACp5, pKACPr et pKT25 en fonction de la concentration en inhibiteur dans le milieu de culture. Les bactéries transformées sont cultivées une nuit à 30 C en milieu LB + kanamycine additionné d'inhibiteurs aux concentrations indiquées. Le dosage d'activité est ensuite réalisé comme décrit dans l'Exemple 3.

Figure 7 : Synthèse d'AMPc par les bactéries DHT1 transformées avec pKACp5, pKACPr et pKT25 en fonction de la concentration en inhibiteurs dans le milieu. Les bactéries transformées sont cultivées une nuit à 30 C en milieu LB + kanamycine additionné d'inhibiteurs aux concentrations croissantes. Le dosage est ensuite réalisé comme décrit dans l'Exemple 4.

EXEMPLES Exemple 1. Souches et milieux

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Les constructions génétiques sont réalisées dans la souche Escherichia coli XLl-Blue (endAl, hsdR17, supE44, thil, #-, recAl, gyrA96, relAI, #(lac-proB) / F-, proAB, lacIqZ#M15, TnlO (tetr)) (disponible en particulier chez Stratagène) et l'activité des protéines exprimées par les plasmides est testée dans la souche Escherichia coli DHT1 (F-, gln V44(AS), recAl, endAl, gyrA96 (Nalr), thil, hsdR17, spoTl, rfbDl, cya-854, ilv-691 : : TnlO). Cette souche a été déposée à la CNCM le 4 Janvier 2000, sous le numéro d'ordre 1-2375.

Les bactéries sont cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) liquide ou gélosé (15g/1 agar). Leur capacité à fermenter les sucres est testée sur milieu gélosé McConkey contenant 1% de maltose (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY). Les antibiotiques sont utilisés aux concentrations suivantes : Ampicilline:100 g/ml et Kanamycine: 50u.g/ml. Les inhibiteurs de protéases, Indinavir (Crixivan, Merck) et Saquinavir (Invirase, Roche) sont dissous respectivement dans de l'éthanol et dans de l'eau (concentration finale 20mM) puis dilués dans les milieux de culture aux concentrations indiquées.

Exemple 2. Constructions plasmidiques
Tous les plasmides ont été construits selon les protocoles standards décrits par Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY). Les ADN plasmidiques ont été purifiés en utilisant le "Qiagen kit" (Qiagen GmbH Allemagne) et hydrolysés par les enzymes de restriction appropriées selon les indications des fournisseurs (New England Biolabs ou Fermentas). Les conditions de PCR ("Polymérase chain reaction") sont déterminées en fonction de la composition des amorces en bases puriques et pyrimidiques (Saiki et al., 1988, Science, 239,487-91).

Le plasmide pUCVIH est un dérivé du plasmide pUC19 (Sambrook et al.,
1989) et exprime la protéase sauvage du virus VIH sous contrôle d'un promoteur lac. Pour le construire, une PCR a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADN proviral du virus VIH et comme amorces les oligonucléotides Al (SEQ ID NO 5) et A2 (SEQ ID NO 6).

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Le produit de PCR obtenu a été purifié à partir de gel d'agarose, digéré par les enzymes BamHI et Sali et sous-cloné entre les sites BamHI et Sali de pUC 19.

Le plasmide pUCVIH a fait l'objet d'un dépôt à la CNCM le 4 Janvier 2000, sous le numéro d'ordre 1-2376.

Les plasmides pUCBl, pUCB3, pUCVl et pUCV2 sont des dérivés de pUC19 qui expriment chacun une protéase mutante du VIH. L'ADN codant ces protéases a été amplifié à partir du sérum de malades et utilisé comme matrice pour réaliser une PCR avec les amorces Al et A2. La construction des plasmides a ensuite été réalisée en sous-clonant dans pUC 19 les fragments de PCR purifiés et digérés par BamHI et Sali.

Le plasmide pKT25 est un dérivé du plasmide pSU (Bartolomé et al, 1991, Gene, 102, 75-8) (compatible avec les plasmides pUC et ses dérivés) exprimant uniquement le fragment T25 inactif de l'adénylcyclase sous contrôle d'un promoteur lac.

Le plasmide pKAC exprime le domaine catalytique entier de l'adénylcyclase. Il a été construit en sous-clonant dans pKT25, le fragment AatII- EcoRI de pCmAHLl (Karimova et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752- 6).

Le plasmide pKACPr est un dérivé de pSU et exprime, sous contrôle d'un promoteur lac, la protéine recombinante ACp (protéase HIV et ses deux séquences flanquantes p5 et p6, insérées entre les acides aminés 224 et 225 du domaine catalytique de l'adénylcyclase) (Figure 1). Il a été construit en réalisant une PCR avec les amorces A3 (SEQ ID NO 7) et A4 (SEQ ID NO 8) sur l'ADN proviral du virus VIH. Le produit de PCR purifié et digéré a ensuite été sous-cloné entre les sites NheI et KpnI de pACM224p815A (Karimova et al, 1998, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 95,12532-7). Le plasmide obtenu, pACP, a ensuite été digéré par AatII et EcoRI et le produit de digestion a été sous-cloné dans pKT25.

Des variants de pKACPr, dans lesquels la protéase sauvage du VIH est remplacée par une protéase modifiée (pKACBl, pKACB3, pKACVl et pKACV2) ont été construits. Pour cela, l'ADN codant pour les protéases mutantes a été amplifié avec les amorces A3 et A4, et les produits de PCR purifiés et digérés par Nhel et KpnI ont été sous-clonés entre les sites Nhel et Kpnl de pKACPr

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Le plasmide pKACp5 a été construit en hybridant les deux oligonucléotides complémentaires A5 (SEQ ID NO 9) et A6 (SEQ ID NO 10) et en les sous-clonant entre les sites Nhel et Kpnl de pKACPr. Cette séquence code le polypeptide p5 qui est un des sites de clivage de la protéase du VIH.

Les plasmides pKACPr et PKACp5 ont chacun fait l'objet d'un dépôt à la CNCM le 4 Janvier 2000 sous les numéros d'ordre respectifs 1-2377 et 1-2378.

Exemple 3. Dosage de l'activité p-galactosidase.

On dose l'activité P-galactosidase par mesure de l'hydrolyse de l'orthonitrophényl-p-D-galactoside (ONPG) incolore, l'orthonitrophénol libéré étant coloré en milieu basique et absorbant à 420nm (ONP : #mM=5 à 420nm et à pH 11).

Les bactéries sont cultivées en milieu LB une nuit à 30 C. Le lendemain, la suspension est diluée 5 fois en milieu 63B1(Miller, 1972, cf. supra), la densité optique (DO) à 600nm de cette dilution est mesurée puis on ajoute, à 3ml de cette suspension, une goutte de toluène et une goutte de déoxycholate de sodium à 1%.

Les tubes sont vortexés 10 secondes et placés 30 minutes à 37 C sous agitation. Ce traitement fragilise les membranes bactériennes de façon à ce que les petites molécules (ONPG et ONP) diffusent librement.

Pour le dosage, la suspension toluénisée est diluée dans 1ml de tampon PM2 (70mM Na2HPO4.12H2O, 30mM NaHP04.H20, 1mM MgS04, 0,2mM MnS04, pH 7 et 100mM p-mercaptoéthanol ajouté extemporanément). Les tubes sont placés à 28 C et à t=0, la réaction est amorcée par addition de 0,25ml d'une solution d'ONPG (13mM dissoutes dans du tampon PM2 sans p-mercaptoéthanol). Quand la coloration est suffisante (0,250 < D0420 < 1,6), la réaction est arrêtée par addition de 0,5ml de Na2C03 1M (qui donne au milieu un pH de 11et inactive l'enzyme).

La DO à 420nm est lue contre un échantillon témoin (1ml de PM2 ayant subi le même traitement que les autres échantillons).

Une unité de p-galactosidase correspond à 1 nanomole d'ONPG hydrolysée par minute à 28 C et à pH 7. Le nombre d'unités par ml est ensuite converti en unités par mg de poids sec bactérien, grâce à la DO à 600nm, sachant que 10 cellules correspondent à 0,3 mg de poids sec bactérien.

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Exemple 4. Dosage de l'AMP cyclique
L'AMPc produit par les bactéries est mesuré par dosage immunoenzymatique ELISA ("Enzyme Linked Immunosorbant Assay") indirect, en utilisant un sérum de lapin anti-AMPc, et des anticorps de chèvre anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline. Le substrat de la phosphatase alcaline utilisé est le 5'paranitrophényl phosphate dissodique, ajouté à une concentration de 0,5mg/ml dans le tampon PA; 100mM NaCl, 5mM MgCl 2, 10mM Tris-Hcl, pH 9,5.

Après environ lh à 37 C, la lecture est faite à # = 405nm, et les concentrations d'AMPc sont calculées en comparant les DO obtenues pour les échantillons avec celles de la gamme étalon. Les concentrations (en pmol/ml) sont ensuite converties en picomoles par mg de poids sec bactérien (comme pour le dosage de l'activité p-galactosidase).

Exemple 5. Inactivation en trans de l'adénylcyclase de B. pertussis par la protéase du VIH
5.a. Principe du système
Le système est basé sur la possibilité d'insérer une séquence polypeptidique dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase, sans affecter son activité enzymatique.

L'adénylcyclase de B. pertussis peut être clivée par la trypsine en deux fragments : T25 (acides aminés 1-224) et T18 (acides aminés 225-400) qui, séparément n'ont pas d'activité catalytique (Ladant, 1988, J. Biol. Chem., 263,2612- 8). En revanche, des insertions entre les acides aminés 224 et 225 n'altèrent pas sa capacité à produire de l'AMPc.

L'introduction du site spécifique de clivage d'une protéase donnée entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase n'altère donc pas son activité. Par contre, si cette protéine recombinante est coexprimée avec la protéase correspondante, elle est clivée spécifiquement pour libérer les deux domaines T25 et T18inactifs. La synthèse d'AMPc n'a donc plus lieu (Figure 2).

Pour tester l'activité fonctionnelle de l'adénylcyclase de B.pertussis, une souche E.coli déficiente en adénylcyclase endogène (cya) est utilisée. En effet, chez E.coli, l'AMPc se liant à l'activateur transcriptionnel CAP ("catabolite

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activator protein") forme un complexe qui active de nombreux gènes parmi lesquels les opérons maltose et lactose.

Ainsi, lorsque le domaine catalytique de l'adénylcyclase est exprimé dans cette souche, la production d'AMPc permet la complémentation du caractère cya et les bactéries sont alors capables de fermenter le lactose et le maltose. T25 et T18 exprimés dans cette même souche en tant qu'entités séparées ne peuvent pas produire d'AMPc et les bactéries conservent leur caractère cya.

La capacité des bactéries à fermenter les sucres peut être mise en évidence sur des milieux indicateurs (LB-X-Gal ou McConkey additionné de maltose) ou sur milieux sélectifs (milieu minimum contenant du lactose ou du maltose comme unique source de carbone).

1.b. Mise au point du système in vivo
Afin de tester ce système, une protéine recombinante selon l'invention ACp5, dans laquelle est insérée, entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase, le site de clivage p5 de la protéase du VIH, a été générée. Le plasmide exprimant cette protéine (pKACp5, Exemple 2) a été cotransformé dans une souche E.coli cya, avec un plasmide compatible portant ou non la protéase du VIH sauvage (pUCVIH ou pUC19). Le phénotype des transformants a ensuite été observé sur milieu McConkey maltose contenant ou non des inhibiteurs de la protéase.

Les résultats de ces tests phénotypiques indiquent: (i) que ACp5 est capable de restaurer le phénotype Cya+ (colonies rouges sur milieu McConkey maltose) lorsqu'elle est exprimée dans une souche E.coli cya ; l'insertion du polypeptide p5 entre les acides aminés 224 et 225 n'altère donc pas l'activité adénylcyclase ; (ii) que les bactéries DHT1 cotransformées avec pKACp5 et pUCVIH présentent un phénotype Cya- (colonies blanches sur milieu McConkey maltose) en absence d'inhibiteurs de protéase ; la protéase du virus VIH est donc bien active chez E. coli in vivo, elle clive ACp5, qui est alors inactivée et ne peut plus synthétiser d'AMPc. Le clivage de ACp5 par la protéase du VIH a également été montré in vitro ;

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(iii) que ces mêmes transformants, en présence d'inhibiteurs de la protéase, ont un phénotype Cya+ ; ACp5 n'est donc plus clivée, ce qui montre bien que la protéase est inhibée par ces produits ; (iv) enfin, pour vérifier que la protéase du VIH clive ACp5 au niveau de la séquence p5 et pas ailleurs dans la protéine, les bactéries DHT1 ont été cotransformées avec pUCVIH et pKAC (voir exemple 2, pKAC est un plasmide qui exprime l'adénylcyclase sauvage, c'est-à-dire sans la séquence p5). Le phénotype Cya+ de ces bactéries montre que la protéase du VIH n'est capable de cliver l'adénylcyclase que si celle-ci contient un site spécifique tel que p5.

Afin de mettre en évidence l'effet de la concentration en inhibiteurs sur l'activité adénylcyclase, l'activité P-galactosidase des cultures en milieu liquide de ces cellules en fonction de la concentration d'inhibiteurs dans le milieu a été dosée (Figure 3).

Dans le cas des bactéries DHT1 transformées avec pKACp5 et pUC19, l'activité ss-galactosidase est élevée et constante quelle que soit la quantité d'inhibiteurs dans le milieu. Les bactéries cotransformées avec pKT25 et pUC19 ont, quant à elles, une activité P-galactosidase correspondant au niveau de base de la souche qui exprime le seul fragment T25 (pKT25). Pour les E.coli DHTI transformées avec pKACp5 et pUCVIH, l'augmentation de l'activité P-galactosidase est fonction de la quantité d'inhibiteurs dans le milieu ce qui traduit l'inhibition progressive de la protéase dans les cellules.

De la même façon, la quantité d'AMPc produit par les DHT1 transformées avec pKACPr et pUCVIH augmente avec la concentration en inhibiteurs dans le milieu (Figure 4) alors que pour le témoin positif et le témoin négatif (respectivement pKACp5 + pUC19 et pKT25 + pUC19), le niveau d'AMPc est constant.

Ces résultats montrent que ce système génétique est assez sensible pour permettre de visualiser l'activité de la protéase du VIH sauvage et pour mettre en évidence l'inhibition de cette activité par des composés spécifiques.

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5.c. Détection de protéases du VIH résistantes à l'Indinavir et au Saquinavir dans le système in vivo
Afin de déterminer si le procédé selon l'invention est suffisamment sensible pour détecter des activités plus faibles, des mutants résistants aux inhibiteurs de la protéase ont été étudiés.

Quatre isolats cliniques (deux virus résistants aux inhibiteurs de protéase (B3 et V2), et deux virus mutants ne présentant pas de résistance aux inhibiteurs de protéase (B1et VI)) ont été analysés. Les caractéristiques génotypiques et phénotypiques de ces quatre mutants sont présentées dans le tableau 1.

<tb>
<tb>

Protéases <SEP> Mutations <SEP> Résistance <SEP> au <SEP> Résistance <SEP> à
<tb> altérées <SEP> Saquinavir <SEP> l'Indinavir
<tb> B1 <SEP> V77I <SEP> 1 <SEP> X <SEP> 1 <SEP> X
<tb> B3 <SEP> M46I, <SEP> V77I, <SEP> V82T <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 13 <SEP> X
<tb> VI <SEP> L63P <SEP> I <SEP> X <SEP> 1 <SEP> X
<tb> V2 <SEP> LIOI, <SEP> L63P, <SEP> L90M <SEP> 53 <SEP> X <SEP> 4 <SEP> X <SEP>
<tb>
Tableau 1 : Caractéristiquesgénotypiques et phénotypiques des mutants de la protéase du VIH.

Les mutations sont décrites par rapport à la séquence en acides aminés (1- 99) de la protéase du virus de référence (V: Val ; I:Ile; M : Met ; T : Thr ; L : Leu et P: Pro). Le niveau de résistance des mutants correspond à l'augmentation relative (par rapport à la protéase sauvage) de la concentration en inhibiteurs nécessaire pour inhiber 50% de la réplication virale. Ces données ont été obtenues dans des tests in vitro ("Recombinant Virus Assay").

L'ADN codant pour les protéases modifiées a été cloné dans le vecteur pUC19 (Exemple 2) et les plasmides obtenus ont été cotransformés avec pKACp5 dans la souche DHT1. Le phénotype des bactéries transformées est observé sur milieu McConkey maltose contenant ou non des inhibiteurs de protéase.

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Dans ces conditions, les protéases Blet V1 se comportent comme la protéase sauvage (colonies blanches en absence d'inhibiteurs et rouges avec) ce qui est attendu car d'après leurs caractéristiques génotypiques et phénotypiques (tableau 1), elles ne présentent pas de résistance aux inhibiteurs de protéase.

Dans le cas du mutant V2, en présence d'Indinavir, le phénotype est le même que pour la protéase sauvage (Cya+ à partir de 50 M d'Indinavir). En présence de Saquinavir, il faut une concentration plus forte (20uM au lieu de 10 M) pour que les bactéries deviennent Cya+. Le mutant V2 présente donc une résistance au Saquinavir (ce qui confirme les données du tableau 1).

Enfin, dans le cas du mutant B3, le phénotype des bactéries est toujours Cya+, y compris lorsqu'il n'y a pas d'inhibiteurs dans le milieu. Ceci peut s'expliquer par le fait que ce mutant a une activité protéolytique plus faible que la protéase sauvage et que, même si elle clive une fraction des molécules d'adénylcyclase, il en reste suffisamment pour activer la cascade de régulation aboutissant au phénotype Cya+.

Le système est donc assez sensible pour détecter l'activité de la protéase sauvage et des mutants B1, VIet V2, mais pas suffisamment pour détecter des mutants moins actifs tels que B3. Ce manque de sensibilité du système peut être dû au fait que le clivage est la conséquence d'un processus bimoléculaire : en effet la protéase, une fois synthétisée, doit dans un premier temps se dimériser et dans un deuxième temps interagir avec son substrat. Pendant ce laps de temps les molécules d'adénylcyclase non clivées synthétisent de l'AMPc qui active les opérons cataboliques.

Afin d'améliorer la sensibilité du système, une autre approche, dans laquelle la réaction est plus directe, a été menée : la protéase entière a été insérée dans l'adénylcyclase, de façon à étudier l'autoprotéolyse de cette molécule chimérique.

Exemple 6. Inactivation en cis de l'adénylcyclase de B. pertussis. Autoprotéolyse de la protéase du VIH insérée dans l'adénylcyclase
6. a. Principe
Ce système exploite les propriétés particulières de la protéase du VIH d'une part et de l'adénylcyclase de B. pertussis d'autre part. Les enzymes et les protéines

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de structure du VIH sont synthétisées sous forme de polyprotéines. La maturation de ces polyprotéines est réalisée par la protéase qui peut cliver des séquences en amont puis en aval de sa propre séquence (sites p5 et p6). Par ailleurs, l'adénylcyclase tolère des insertions importantes (jusqu'à 200 résidus) entre les fragments T25 et T18sans que cela n'affecte son activité enzymatique.

Une protéine chimérique (ACPr) a donc été construite (exemple 2), dans laquelle est insérée, entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase, la protéase du VIH (99 résidus) et ses deux séquences de coupure p5 et p6 (8 acides aminés chacune). Dans ce cas, la protéase sauvage s'autoprotéolyse en libérant T25 et T18 qui, séparés, sont inactifs. A l'opposé, si la protéase est inactive ou en présence d'inhibiteurs, son autoclivage ne se fait pas, et l'adénylcyclase conserve son activité de synthèse d'AMPc et peut complémenter les E. coli cya qui ont alors un phénotype Cya+ (Figure 5).

6. b. Étude de laprotéase sauvage dans le système in vivo
Le phénotype des bactéries DHT1 transformées avec pKACPr ou bien pKT25 (témoin négatif) ou bien pKACp5 ou pKAC (contrôles positifs) a été observé.

Les bactéries transformées avec pKACp5 ou pKAC conservent leur phénotype Cya+ (colonies rouges sur McConkey maltose) quelles que soient les conditions, car la protéase est absente. A l'opposé, les bactéries exprimant T25 seul (DHT1 + pKT25), sont toujours Cya- (colonies blanches) car ce fragment est inactif.

Enfin, les bactéries transformées par le plasmide pKACPr sont Cya- en absence d'inhibiteur et Cya+ en présence de Saquinavir ou d'Indinavir. Ces résultats montrent que la protéase est toujours active lorsqu'elle est insérée dans l'adénylcyclase et qu'elle peut être inhibée par les inhibiteurs de protéase.

Ces résultats qualitatifs sont confirmés par les données quantitatives obtenues par dosage de l'AMPc et de l'activité P-galactosidase dans des cultures liquides de ces cellules (Figures 6 et 7).

Ces données indiquent que, dans le cas de la protéase sauvage, ce système en "cis" est au moins aussi sensible que celui en "trans" : il permet de mettre en

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évidence l'autoprotéolyse spécifique de la protéine chimérique AC/protéase-VIH et son inhibition par les inhibiteurs de protéase.

La sensibilité de ce procédé a ensuite été étudiée, afin de déterminer s'il permet la détection de protéases dont l'activité est réduite, comme c'est le cas des mutants résistants aux inhibiteurs, en particulier le variant B3.

6. c. Détection de protéases du VIH résistantes aux inhibiteurs dans le système en "cis "
Pour cette étude, les protéases B1, B3, VIet V2 sont insérées entre les acides aminés 224 et 225 de l'adénylcyclase et les protéines chimériques obtenues sont exprimées dans la souche DHT1 (plasmides pKACBl, pKACB3, pKACVl et pKACV2).

Comme attendu, B1et VIse comportent comme la protéase sauvage (phénotype Cya- en absence d'inhibiteur et Cya+ avec). Le mutant B3 (pKACB3) confère, en absence d'inhibiteurs, un phénotype Cya- aux bactéries. En présence d'Indinavir, les bactéries transformées avec pKACB3 ont un phénotype Cya- jusqu'à une concentration de 100 M, (contre 50 M pour celles transformées avec pKACPr) ce qui montre que cette protéase porte une mutation qui la rend résistante à l'Indinavir. En présence de Saquinavir, les bactéries DHT1 transformées avec pKACB3 ont un phénotype Cya- à 10 M alors que celles transformées avec pKACPr (protéase sauvage) sont rouges sur ce milieu. La protéase mutante B3 est donc également résistante au Saquinavir.

Dans le cas de la protéase mutante V2, le système permet de mettre en évidence la diminution de sa sensibilité au Saquinavir et à l'Indinavir : les bactéries transformées avec pKACV2 sont Cya- sur milieu contenant lOOuM Indinavir ou 20 M de Saquinavir alors que sur ces mêmes milieux, les bactéries -transformées avec pKACPr donnent des colonies rouges.

Le système en "cis " est donc beaucoup plus sensible que celui dans lequel la protéase est apportée sur un plasmide indépendant ; en effet, il détecte des activités protéolytiques très faibles comme celle de la protéase B3 et permet de distinguer des augmentations limitées de résistance (4X).

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Exemple 7. Détection d'une population minoritaire de protéases du VIH résistantes aux inhibiteurs
Cet exemple montre que l'invention permet, à partir d'un test phénotypique, de détecter dans une population majoritairement sensible, une minorité de virus VIH exprimant des protéases résistantes aux inhibiteurs. Ce procédé, qui peut être appliqué en routine sur le sérum de malades, permet de détecter l'émergence de résistance au stade précoce du traitement et éventuellement d'adapter le traitement en conséquence.

Pour cela, on a réalisé des mélanges contenant pKACV2 et pKACPr en quantités variables (1/1,1/10 et 1/100), puis chacun de ces mélanges a été transformé dans la souche DHT1. Le phénotype des transformants est observé sur milieu McConkey maltose contenant 20 M de Saquinavir car cette concentration permet de discriminer aisément la protéase sauvage sensible de la protéase résistante au Saquinavir (V2).

Les bactéries DHT1 transformées avec pKACPr ou pKACV2 sont blanches en absence d'inhibiteurs. Quand ces mêmes DHT1 sont transformées avec un mélange des deux plasmides, on observe qu'en présence de 20 M de Saquinavir, les colonies sur les boîtes sont hétérogènes : on distingue des colonies blanches et des colonies rouges.

De plus, le rapport entre le nombre de colonies rouges et le nombre de colonies blanches sur ces boîtes correspond aux quantités relatives de pKACPr et pKACV2 transformés dans la souche DHT1. Afin de vérifier que les colonies blanches hébergent pKACV2 et les rouges pKACPr, les plasmides sont purifiés à partir de 4 colonies rouges et de 4 colonies blanches, puis digérés par EcoRI et KpnI.

Les plasmides purifiés à partir des colonies rouges ont le même profil de digestion que pKACPr (deux fragments de 3852 pb et 710 pb) tandis que les plasmides issus des colonies blanches ont le même profil de digestion que pKACV2 (ils ne sont digérés que par Kpnl car ils n'ont pas de sites EcoRI, celui-ci ayant été éliminé à dessein pour faciliter la distinction entre les deux plasmides).

Les colonies rouges correspondent donc bien à des bactéries transformées par pKACPr, alors que les colonies blanches hébergent pKACV2. Le procédé décrit dans la présente invention permet donc de distinguer phénotypiquement des

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protéases résistantes à un inhibiteur donné dans une population qui contient majoritairement des protéases sensibles à cet inhibiteur.

Dépôt de matériel biologique
Les organismes suivants ont été déposés le 04 Janvier 2000 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.

- Souche DHT1 Numéro d'ordre 1-2375 - Souche XLl/pUCVIH Numéro d'ordre 1-2376 - Souche XLl/pKACPr Numéro d'ordre 1-2377 - Souche XLl/pKACp5 Numéro d'ordre 1-2378

Claims (29)

1. Revendications 1. Adénylcyclase recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence polypeptidique incluant un ou plusieurs sites de clivage d'au moins une molécule à activité protéolytique site-spécifique, ladite séquence polypeptidique étant insérée dans le domaine catalytique d'une adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique.
2. 2. Adénylcyclase selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée comprend en outre une séquence polypeptidique correspondant à une molécule à activité protéolytique.
3. 3. Adénylcyclase selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée contient au moins un site de clivage spécifique de la protéase du VIH.
4. 4. Adénylcyclase selon la revendication 3, caractérisée en ce que le site de clivage spécifique de la protéase du VIH est le site p5, comprenant l'enchaînement d'acides aminés correspondant à SEQ ID NO 1.
5. 5. Adénylcyclase selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique insérée contient la protéase du VIH encadrée des séquences de clivage p5 et p6 correspondant à la séquence SEQ ID NO 3.
6. 6. Adénylcyclase selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'adénylcyclase est l'adénylcyclase de Bordetella pertussis.
7. 7. Adénylcyclase selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence polypeptidique est insérée entre les acides aminés 224 et 225 de la séquence

   SEQ ID NO 4.
8. 8. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour une adénylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. 9. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon la revendication

   8, ou qu'il est capable d'exprimer une adénylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10. 10. Vecteur selon la revendication 9, capable d'exprimer une adénylcyclase selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pKACp5 déposé le 4

    Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2378.

    <Desc/Clms Page number 28>
11. 11. Vecteur selon la revendication 9, capable d'exprimer une adénylcyclase selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pKACPr déposé le 4

    Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2377.
12. 12. Procédé pour la détection de l'activité protéolytique d'une molécule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a. complémenter une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène par une adénylcyclase recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ladite souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire possédant un phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase ; b. mettre ladite molécule à tester au contact de ladite souche ou lignée complémentée ; c. cultiver ladite souche ou lignée dans des conditions permettant la mise en évidence du phénotype lié à l'activité de l'adénylcyclase ; d. contrôler l'expression dudit phénotype.
13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la souche bactérienne, fongique ou lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène est complémentée par introduction d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11.
14. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que la souche bactérienne déficiente en adénylcyclase endogène est Escherichia coli.
15. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à fermenter le lactose ou le maltose.
16. 16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à résister à un antibiotique.
17. 17. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que le phénotype dont l'expression est liée à l'activité enzymatique de l'adénylcyclase est la capacité à exprimer une protéine aisément détectable, en particulier la luciférase, ou la GFP.

    <Desc/Clms Page number 29>
18. 18. Procédé pour la détection de la résistance à un inhibiteur d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, et qu'il comprend en outre la mise de ladite molécule au contact dudit inhibiteur dans l'étape b.
19. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le niveau de ladite résistance est en outre mesuré par quantification de l'expression du phénotype étudié.
20. 20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que ladite molécule à activité protéolytique est la protéase du VIH.
21. 21. Trousse de diagnostic pour la détection de molécules à activité protéolytique, caractérisée en ce qu'elle contient : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adénylcyclase recombinante, dans le site catalytique de laquelle sont insérés un ou plusieurs site (s) clivage correspondant à la molécule à activité protéolytique.
22. 22. Trousse de diagnostic pour la détection de molécules à activité protéolytique, caractérisée en ce qu'elle contient : a. une souche bactérienne, fongique ou une lignée cellulaire déficiente en adénylcyclase endogène, b. un fragment d'ADN, un polynucléotide purifié ou un vecteur codant pour une adénylcyclase, configuré pour pouvoir insérer le gène codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences autoprotéolytiques dans le domaine catalytique de l'adénylcyclase tout en conservant son activité enzymatique, c. des amorces spécifiques permettant d'amplifier l'ADN codant pour la molécule protéolytique d'intérêt éventuellement flanquée de séquences auto-protéolytiques, afin de l'insérer dans le fragment d'ADN de b.
23. 23. Utilisation d'une adénylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la détection de l'activité de molécules à activité protéolytique ou leur résistance

    <Desc/Clms Page number 30>

    à un inhibiteur, ces molécules étant codées par des virus présents dans le sérum ou les cellules d'un patient.
24. 24. Utilisation d'une adénylcyclase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un polynucléotide selon la revendication 8, ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11pour la fabrication d'une trousse de diagnostic permettant la quantification du rapport (molécules à activité protéolytique résistantes à un inhibiteur/ molécules à activité protéolytique non résistantes audit inhibiteur) chez un patient, lesdites molécules à activité protéolytique étant présentes dans le sérum ou les cellules dudit patient.
25. 25. Utilisation selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisée en ce que la molécule à activité protéolytique est la protéase du VIH.
26. 26. Procédé pour l'identification de molécules à activité protéolytique site- spécifique dans une banque de molécules, caractérisé par la mise en #uvre un procédé selon l'une des revendications 12 à 17 sur les différentes molécules de la banque, l'adénylcyclase complémentant la souche bactérienne comprenant la séquence cible spécifique d'acides aminés pour laquelle on recherche les éventuelles molécules à activité protéolytique.
27. 27. Procédé pour l'identification des séquences cibles d'une molécule à activité protéolytique, caractérisé par la mise en #uvre d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 17 sur une banque de souches bactériennes, fongiques ou des lignées cellulaires, chacune étant complémentée par une adénylcyclase selon l'une des revendications 1 à 7 comprenant une séquence différente d'acides aminés afin de déterminer si cette séquence consiste en un site de clivage de ladite molécule à activité protéolytique.
28. 28. Souche bactérienne d'Escherichia coli déficiente en adénylcyclase endogène, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche DHT1 déposée le 4 Janvier 2000 à la

    CNCM sous le numéro d'ordre 1-2375 ou d'un mutant de cette souche.
29. 29. Vecteur codant pour la protéase du VIH caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pUCVIH déposé le 4 Janvier 2000 à la CNCM sous le numéro d'ordre 1-2376.