JP2003525606A - 組換えアデニルシクラーゼおよびタンパク質分解活性を有する分子のスクリーニングのためのそれらの使用 - Google Patents

組換えアデニルシクラーゼおよびタンパク質分解活性を有する分子のスクリーニングのためのそれらの使用

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JP2003525606A JP2001564337A JP2001564337A JP2003525606A JP 2003525606 A JP2003525606 A JP 2003525606A JP 2001564337 A JP2001564337 A JP 2001564337A JP 2001564337 A JP2001564337 A JP 2001564337A JP 2003525606 A JP2003525606 A JP 2003525606A
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molecule
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activity
cyclase
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グツェル、カリモバ
ダニエル、ラダン
アニェ、ユールマン
ナサリ、ドータン
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、部位特異的タンパク質分解活性を有する少なくとも１つの分子のための１以上の切断部位を含む少なくとも１つのポリペプチド配列を含んでなる組換えアデニルシクラーゼであって、前記ポリペプチド配列がアデニルシクラーゼの触媒ドメイン中に挿入されており、かつその酵素活性が保存されていることを特徴とする、組換えアデニルシクラーゼに関する。本発明はまた、前記組換えアデニルシクラーゼを用いる、タンパク質分解活性を有する分子のスクリーニングのための方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、部位特異的タンパク質分解活性を有する少なくとも１つの分子のた
めの１以上の切断部位を含む少なくとも１つのポリペプチド配列を含んでなる組
換えアデニルシクラーゼであって、前記ポリペプチド配列がアデニルシクラーゼ
の触媒ドメイン中に挿入されており、かつその酵素活性が保存されている、組換
えアデニルシクラーゼに関する。本発明はまた、このような組換えアデニルシク
ラーゼをコードするＤＮＡ断片に関し、また、上記のように定義した生成物を用
いて、分子のタンパク質分解活性または分子のタンパク質分解活性阻害剤に対す
る耐性を検出、同定および／または定量する方法に関する。本発明はまた、これ
らの方法を実施するための検査用キットに関する。
【０００２】 真核生物においては、原核生物と同様に、プロテアーゼが多くの生物学的過程
に関与している。クロッティング（凝集）および消化に至るタンパク質分解によ
る活性化のカスケードはよく知られているが、これらの酵素が関与する新たな現
象が日常的に発見されている。いくつかの膜レセプター（プロテアーゼ活性化レ
セプター：ＰＡＲ）は、タンパク質分解によって特異的に活性化される（Coughl
in, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9200-2）。バチルス・ズブチルス
では、SpoIIGAおよびSpoIVFBプロテアーゼがpro-σEとpro-σKとを、胞子形成に
必須の転写因子である、σEとσKとに変換する（Hofmeister, et al., 1995, Ce
ll, 83, 219-26; Lu et al., 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 87, 9722-6）
。カスパーゼはプロテアーゼの別のファミリーであるが、アポトーシスに関与し
ており（Villa et al., 1997, TIBS, 22, 388-93; Steller, 1995, Science, 26 7 , 1445-9）、発生と恒常性において重要な役割を有している。プロテアーゼは
また、ある病的な状態に関与している：アルツハイマー病は、セリンプロテアー
ゼによるβ−アミロイドの異常な切断によるものと考えられている（Selkoe, 19
99, Nature, 399, 23-31）。腫瘍においては、細胞外マトリックスを分解するこ
とによって、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が細胞の転移を可能にしている（
Nagase et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21491-4）。最後に、プロテアー
ゼは、多くのウイルスの成熟に必須の要素であり、そのうちのいくつかは致死的
な感染の原因となる（Schwartz et al., 1999, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 6 , 295-305）。
【０００３】 このため、これらの酵素を同定し、研究することは、それらの生理学的な役割
をつきとめ、そして新たな治療の方法を開発する上で必須である。プロテアーゼ
の特徴付けと精製のための従来の方法は複雑であったため、大腸菌（Escherichi
a coli）または酵母の遺伝的研究系が開発された。これらの系の目的は、部位特
異的プロテアーゼを単離し、特徴づけることである。それらの原理は、研究され
たプロテアーゼに特異的な切断部位を挿入することによるレポーター酵素の不活
化、または大腸菌におけるこのプロテアーゼの毒性のいずれかに基づくものであ
る。
【０００４】 Sicesら（1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2828-33）により、λファ
ージのリプレッサーが特異的に切断され、溶原性状態から溶菌状態への移行に至
る系が記載されている。特異的切断部位はまた、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
とチミジル酸シンターゼ中、および酵母ＧＡＬ４の転写アクチベーター中に挿入
されている（Baum et. al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5573-7; K
upiec et. al., 1996, J. Boil. Chem., 271, 18465-70; Dasmahapatra et al.,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4159-62）。これらのタンパク質のタ
ンパク質分解は、その後、in vivoで観察される。Baumら（1990, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 87, 10023-7）により、ＨＩＶのプロテアーゼの過剰発現が大腸
菌BL21株（DE3）において毒性であることが示され、この性質は、このプロテア
ーゼの非毒性突然変異体の単離と研究に使用された。この毒性はまた、プロテア
ーゼ阻害剤のスクリーニングに使用された（Buttner et al., 1997, Biochem. B
iophys. Res. Commun., 233, 36-8）。しかしながら、これらの系は感度が低い
ために、それらの使用が限定されている。
【０００５】 この感度の低さは、研究されたプロテアーゼのタンパク質分解活性が弱いとき
には、標的であるレポータータンパク質のタンパク質分解が不完全であるという
事実から生じるものである。多くの場合、未切断の標的タンパク質画分の残存酵
素活性は、その後、このタンパク質の活性形と関連する表現型を付与するのに十
分である。結果として、標的レポータータンパク質を切断し、不活化できるプロ
テアーゼを発現する微生物と、この特異的なプロテアーゼを発現しないものとを
表現型で区別することは不可能である。 現在、ウイルスのプロテアーゼを研究するための試験についての研究、とりわ
け、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を惹起するウイルスであるＨＩＶのプロ
テアーゼについての研究が進められている。
【０００６】 実際に、現在ＨＩＶ感染の治療に利用可能な多くの活性分子はＨＩＶプロテア
ーゼの阻害剤であり、三重治療（triple therapy）において、逆転写酵素阻害剤
と組み合わされている。これらの分子の効力は、プロテアーゼがウイルスの複製
に必須であるという事実に基づくものである：ＨＩＶはレトロウイルスであり、
そのキャプシドはＲＮＡを含み、ひとたびＲＮＡが標的細胞中に導入されると、
ウイルスの逆転写酵素によって逆転写される。得られたＤＮＡが真核細胞のゲノ
ムと一体化され、構造タンパク質をコードしている遺伝子とウイルスの酵素をコ
ードしている遺伝子とは、その後、細胞の機構によって転写され、ポリタンパク
質に翻訳される。ウイルスのプロテアーゼの役割は、成熟した感染性のウイルス
を作り出せるように、これらの前駆体（gagおよびpol）を切断して活性なタンパ
ク質とすることである。このプロテアーゼは自己タンパク質分解によってポリタ
ンパク質から遊離し、次いで、８個の特異的部位（ｐ１からｐ８、ここでｐ５お
よびｐ６はプロテアーゼに隣接する部位である）の切断によって、他のタンパク
質を切断する。
【０００７】 逆転写過程の間に、プロテアーゼの配列中に突然変異が生じることがある。そ
れらは、通常サイレントであるかまたは致死的であるが、しばしばプロテアーゼ
阻害剤に耐性となり（Dulioust et al., 1999, J. Virol., 73, 850-4）、治療
の失敗の原因となる（Perrin et al., 1998, Science, 280, 1871-3）。この耐
性は、一般的には、酵素のタンパク質分解活性の低下と関連している。
【０００８】 このため、一般的にプロテアーゼが重要であり、とりわけＨＩＶプロテアーゼ
が重要であることから、分子、好ましくはタンパク質、のタンパク質分解活性（
これらの活性は好ましくは「部位特異的」である）を検出できるようにする方法
を決定することが必要である。
【０００９】 「部位特異的」という用語は、プロテアーゼがポリペプチドのアミノ酸の特異
的な配列を認識し、前記ポリペプチドをアミノ酸配列とプロテアーゼとに依存す
る部位で切断することを意味する。この部位は、前記特異的配列の２つのアミノ
酸の間に位置することがあるが、前記配列の上流または下流に位置することもあ
る。
【００１０】 プロテアーゼを検出するための現在の系に改良を加えることが必須である。と
りわけ、いくつかの突然変異したプロテアーゼにおける低いタンパク質分解活性
を検出できるようにするために、この系の感度を改良することが必須である。Ｈ
ＩＶの場合には、そのプロテアーゼが既に比較的低いタンパク質分解活性を有し
ていることから、この点が一層重要である。
【００１１】 さらに、臨床試験で使用することを可能にするためには、それらを容易に、比
較的廉価で行えるようにし、合理的な期間内（２〜３日以内）に結果を得られる
ようにすることが重要である。実際には、ＨＩＶプロテアーゼの研究のためには
、研究されているウイルスのプロテアーゼの遺伝子を公知の試験ウイルス中に導
入し、細胞株での前記組換えウイルスを研究するという、組換えウイルスアッセ
イ（RVA）が現在使用されている。このアッセイは、患者の体内に存在するウイ
ルスの主要な集団だけを特徴付けるものであり、結果を得るために２〜３週間を
要するという欠点がある。
【００１２】 本発明によれば、タンパク質分解活性を検出するための遺伝子系を、アデニル
シクラーゼ（またはアデニル酸シクラーゼ）、好ましくは百日咳菌（Bordetella
pertussis）のアデニルシクラーゼ、のタンパク質分解による不活化に基づいて
開発することにより、タンパク質分解活性を有する分子を検出するためのアッセ
イの開発という問題を解決する独創的な解決法が提供される。
【００１３】 アデニルシクラーゼは、ＡＴＰから環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の合成に関与する
酵素である。ｃＡＭＰは細胞内に偏在するメディエーターであるが、しかしなが
ら、少なくとも細菌においては、一定の増殖条件下では、細胞の増殖や生存に必
要であるとは思われない。このため、本発明においては、ｃＡＭＰはシグナリン
グ分子として使用される。
【００１４】 本発明においては、「アデニルシクラーゼ」または「アデニル酸シクラーゼ」
という用語は、天然の生物中に見られるアデニルシクラーゼと同じ生物学的活性
、すなわち、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する能力を有するタンパク質を意味し、言
い換えれば、国際分類EC 4.6.1.1のタンパク質、またはアデニル酸シクラーゼに
由来するのと同様の生物学的活性を有するあらゆる酵素を意味する。当業者は、
事実、ある有用な突然変異を生じさせ、もしくはアデニル酸シクラーゼを、出発
タンパク質の基質特異性によりＧＴＰ（EC 4.6.1.2）をcGMPに換えるグアニレー
トシクラーゼ、に変えることができ（Beuve and Dnachin, 1992, J. Mol. Biol.
, ２２５, 933-8）、その逆にすることもできる（Beuve, 1999, Methods, 19, 5
45-50）。このため、アデニル酸シクラーゼから得られるこのような酵素は、上
記の定義に含まれる。
【００１５】 本発明において開発された系は、前記アデニルシクラーゼ（ＣＹＡ）の触媒ド
メインのタンパク質分解による不活化に基づいている。このドメインは、内因性
のアデニルシクラーゼを欠損している（cya−）細菌株もしくは真菌株（酵母を
含む）または細胞株がcya＋表現型に戻るようにこれを補足するものである。
【００１６】 前記cya＋表現型は、好ましくは、容易に検出され得る前記菌株または細胞株
の二次表現型を調べることによって検出され、これらの出現はアデニルシクラー
ゼの酵素活性に連動している。
【００１７】 従って、タンパク質分解活性を有する分子が存在し、これが活性であり、そし
てアデニルシクラーゼ中に挿入された切断部位を認識するとき、後者は切断され
、補足された株は再びcya−となる。
【００１８】 「容易に検出され得る」という用語は、表現型を検出するために特別な手段を
採用するか、または特別な装置を使用することを必要としないということを意味
する。実際、cya＋表現型を直接的に検出することはできるが、これにはELISAで
行うｃＡＭＰの生成を検出することが必要であり、ある種の機械が必要とされ、
迅速に行うことはできない。従って、「容易に検出され得る」表現型は、巨視的
に観察され得るものであることが好ましい。例えば、それは、適当な培地を入れ
たペトリ皿上で直接的に観察することができるものである。
【００１９】 「容易に検出され得る」表現型の例としては、抗生物質に対する耐性（ｃＡＭ
Ｐによって誘導されるか、または抑制される）、マルト−スやラクトース等のあ
る種の糖の異化作用、または容易に検出され得るタンパク質（例えば、β−ガラ
クトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（GFP））のｃＡＭＰ
−誘導発現が挙げられる。当業者は、同じ性質を有する他の系を選択し、定義す
ることができる。
【００２０】 従って、本発明の主題は、部位特異的タンパク質分解活性を有する少なくとも
１つの分子のための１以上の切断部位を含む少なくとも１つのポリペプチド配列
を含んでなる組換えアデニルシクラーゼであって、前記ポリペプチド配列がアデ
ニルシクラーゼの触媒ドメイン中に挿入されており、かつその酵素活性が保存さ
れていることを特徴とする、組換えアデニルシクラーゼである。
【００２１】 本発明の別の実施態様によれば、挿入されたポリペプチド配列は、タンパク質
分解活性を有する分子に対応するポリペプチド配列をも含んでなる。この場合、
プロテアーゼは自己タンパク質分解するものでなければならない。
【００２２】 従って、本発明の実施態様により、目的のプロテアーゼは、切断部位を含む配
列に関してトランスに導入される（第一の場合）か、またはシスに導入される（
第二の場合）。
【００２３】 前記ポリペプチド配列は、ウイルスプロテアーゼに特異的な少なくとも１つの
切断部位を含むことが好ましく、ウイルスプロテアーゼは、好ましくはＨＩＶプ
ロテアーゼ、特にｐ５（配列番号１）および／またはｐ６（配列番号２）である
。
【００２４】 本発明の別の実施態様によれば、その触媒ドメインに挿入されているポリペプ
チド配列を含んでなり、かつその酵素活性が保存されている組換えアデニルシク
ラーゼが提供され、前記ポリペプチド配列はウイルスプロテアーゼをも含有する
ものである。これは、ｐ５およびｐ６の切断配列で挟まれたＨＩＶプロテアーゼ
（配列番号３）であることが好ましい。
【００２５】 その酵素活性を保存したままポリペプチド配列を挿入することができる触媒部
位を有するいずれのアデニルシクラーゼも、本発明の実施に使用することができ
る。しかしながら、好ましいアデニルシクラーゼは、ボルデテラ（Bordetella）
属の細菌、特に百日咳菌（Bordetella pertussis）、のアデニルシクラーゼであ
り、百日咳菌のアデニルシクラーゼの触媒ドメイン（配列番号４）であることが
特に好ましい。
【００２６】 特に、このドメインは、いずれもこのアデニルシクラーゼの活性に必要な２つ
の断片Ｔ２５とＴ１８とからなり、これらの断片の間にかなりの挿入（２００残
基まで）をしても、その酵素活性がこの挿入に影響されることなく、許容され得
るものである；一方、２つの断片が解離すると、活性は失われる。これら２つの
断片は、アミノ酸１〜２２４（Ｔ２５）とアミノ酸２２５〜４００（Ｔ１８）と
に対応するものである。
【００２７】 従って、本発明の最も好ましい実施態様によれば、第２２４残基と第２２５残
基との間に挿入された、部位特異的タンパク質分解活性を有する少なくとも１つ
の分子のための１以上の切断部位を含むポリペプチド配列を含んでなる、百日咳
菌のアデニルシクラーゼが提供される。しかしながら、タンパク質が不活化する
ことなく外来配列の挿入を許容する別の部位を決定することが可能であるから、
本発明がこの部位に限定されないことは明らかである。例として、第１３７〜１
３８残基、第２２８〜２２９残基、第２３５〜２３６残基、第３１７〜３１８残
基、および第３８４〜３８５残基が挙げられる（Ladant et. al., 1992, J. Bio
l. Chem., 267, 2244-50）。こうした部位は、このリストに限定されるものでは
なく、本発明を実施するために他の部位を使用することもできる。
【００２８】 本明細書においては、「残基」と「アミノ酸」という用語とは、同じ意味を有
する。
【００２９】 本発明はまた、本発明によるアデニルシクラーゼをコードしていることを特徴
とするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ断片）、およびこのようなＤＮＡ断
片もしくはポリヌクレオチドを含有するベクター、または本発明によるアデニル
シクラーゼの発現を可能にするベクターに関する。
【００３０】 本発明はまた、タンパク質分解活性またはタンパク質分解活性阻害剤に対する
耐性を検出、同定および／または定量する方法において、ＤＮＡ断片、ポリヌク
レオチドもしくはベクターによって発現された本発明による組換えアデニルシク
ラーゼまたはそれ自体の使用に関する。このような方法もまた、本発明の一部で
ある。
【００３１】 従って、分子のタンパク質分解活性を検出するための本発明による方法は、下
記の工程を含んでなることを特徴とする： ａ．本発明による組換えアデニルシクラーゼにより、内因性のアデニルシクラ
ーゼを欠損しており、アデニルシクラーゼの酵素活性と連動して発現する表現型
を有している細菌株もしくは真菌株または細胞株を補足する工程、 ｂ．前記補足された菌株または細胞株と被検分子とを接触させる工程、 ｃ．アデニルシクラーゼの活性と連動する表現型を示す条件下で、前記菌株ま
たは細胞株を培養する工程、 ｄ．前記表現型の発現をモニタリングする工程。
【００３２】 内因性のアデニルシクラーゼが欠損している多くの細菌株もしく真菌株または
細胞株が存在する。とりわけ、大腸菌cya−株、サルモネラ属の細菌、サッカロ
ミセス酵母株（Matsumoto et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 23
55-9）、もしくはＧＨ１（Martin et al., 1981, J. Cell. Physiol., 109, 289
-97）またはリンパ腫由来の細胞株（Bourne et al., 1975, Science, 187, 750-
2）を例示することができる。大腸菌cya−株、とりわけ、ＤＨＴ１株（F−, gln
V44(AS), recA1, endA1, gyrA96 (Nalr), thi1, hsdR17, spoT1, rfbD1, cya-8
54, ilv-691::Tn10）を使用することが好ましい。この株、またはこの株のいず
れの変異体も、本発明の主題の１つである。
【００３３】 本発明の目的のためには、細菌株ＤＨＴ１の「変異体」という用語は、例えば
、RFLPまたはRAPD法によって決定されたときに、少なくとも90％、好ましくは95
％、98％もしくは99％の相同性（similarity index）を有し、ＤＨＴ１株と同じ
表現型、すなわち、cya−を有する細菌株を意味する。
【００３４】 用いる菌株または細胞株を補足するための好ましい方法の１つは、本発明によ
るＤＮＡ断片もしくはポリヌクレオチドの導入である。このような断片またはポ
リヌクレオチドは、本発明によるベクターによって保持されていてもよく、染色
体中に安定に組み込まれてもよい。当業者は、達成される結果に応じた１以上の
技術を選択することができるであろう。ＤＮＡ断片またはポリヌクレオチドは、
本発明によるベクター上に、エピソームのように導入されることが好ましい。
【００３５】 タンパク質分解活性を有する分子は、補足された菌株または細胞株中にタンパ
ク質分解活性を有する前記分子をコードしているＤＮＡ断片またはポリヌクレオ
チドを導入し、従って前記分子を前記菌株または細胞株中で発現させることによ
って、接触させることが好ましい。
【００３６】 アデニルシクラーゼの活性に連動する、容易に検出できる表現型は、すでに例
示した。大腸菌においては、好ましくは、マルトースまたはラクトースなどの糖
の発酵能が選択される。
【００３７】 タンパク質分解活性を有する分子の、タンパク質分解活性の阻害剤に対する耐
性に関する能力を決定するためには、上述のような方法が実施され、さらにｂ工
程において前記分子を前記阻害剤と接触させる。
【００３８】 阻害剤に対する耐性のレベルもまた、観察された表現型の発現を定量すること
によって測定することができる。こうして、調べる表現型によって、当業者は、
β−ガラクトシダーゼの活性（天然においては、その発現はｃＡＭＰによって制
御される）をアッセイすることができる。当業者はまた、ルシフェラーゼ（この
場合には、cya−株がｃＡＭＰ／CAP−依存性プロモーターの制御下で、遺伝子と
ともに使用される）などの他のタンパク質の活性をアッセイするか、または与え
られた抗生物質に対する耐性を測定するか、またはGFPが用いられた場合には放
出される他の蛍光を測定することができるであろう。生成されたｃＡＭＰをアッ
セイすることも可能であり、これにより、宿主細胞におけるアデニルシクラーゼ
の活性を正確に測定することが可能となる。
【００３９】 本発明による方法は、ＨＩＶプロテアーゼの、タンパク質分解活性および／ま
たは阻害剤に対する耐性を検出するために使用することが好ましい。
【００４０】 従って、本発明による方法は、ＨＩＶ感染の研究、とりわけ、新規なＨＩＶプ
ロテアーゼ阻害分子を定義するため、研究中の阻害剤の効力を試験するため、ま
たは新規変異体の決定のための実験室での研究を行う上で非常に貴重なツールで
あり、このような研究により、ウイルスの耐性機構の理解が深まる。
【００４１】 本発明の主題はまた、タンパク質分解活性を有する分子の活性または阻害剤に
対するそれらの耐性を検出するための検査用キットを製造するための、本発明に
よるアデニルシクラーゼ、ＤＮＡ断片またはベクターの使用である。これらの分
子は、患者の血清または細胞中に存在しているウイルスによりコードされるもの
である。
【００４２】 本発明による化合物を、患者における、［阻害剤への耐性を有する、タンパク
質分解活性を有する分子］／［前記阻害剤への耐性を有さない、タンパク質分解
活性を有する分子］の比を定量するための検査用キットを製造するために使用す
ることもできる。ここで、タンパク質分解活性を有する前記分子は、前記患者の
血清または細胞中に存在するウイルスによりコードされているものである。
【００４３】 このような検査キットは、とりわけ、 ａ．内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細菌株もしくは真菌株または
細胞株と、 ｂ．タンパク質分解活性を有する分子に対応する１以上の切断部位がその触媒
部位に挿入されている組換えアデニルシクラーゼをコードする、本発明によるＤ
ＮＡ断片、精製されたポリヌクレオチドまたはベクターと、 を含有する。
【００４４】 これらのキットはまた、場合により、 ｃ．場合により自己タンパク質分解配列が隣接している、目的のタンパク質
分解分子をコードするＤＮＡを増幅するための特異的プライマー、および／また
は ｄ．ｃ．のプライマーを用いて増幅された目的のタンパク質分解活性分子を
コードするＤＮＡをその中に挿入することを可能とする立体配置のベクター、お
よび／または ｅ．ｄ．のベクターと同じ基本構造を有し、陽性対照とするための活性なタ
ンパク質分解分子をコードしているベクター、および／または ｆ．ａ．の細菌株もしくは真菌株または細胞株の増殖と、ｃＡＭＰ生成と関
連する表現型の検出を可能とする培養培地、および／または ｇ．使用された菌株または細胞株におけるｃＡＭＰの生成を定量するための
試薬、および／または ｈ．レポータータンパク質の発現を定量するための試薬 を含有してもよい。
【００４５】 このような検査用キットにより、トランスに挿入されたプロテアーゼを研究す
ることが可能になる。これは、本発明によるアデニルシクラーゼをコードしてい
るもの以外のベクター上にこのプロテアーゼがその後に導入されることによる。
このため、アデニルシクラーゼをコードするベクターが、欠損株中にエピソーム
の形、またはゲノムに組み込まれる形のいずれで導入されたかを知ることができ
る。本発明によるアデニルシクラーゼ（ｂ）で安定に補足された、アデニルシク
ラーゼを元来欠損している株（ａ）が提供される限り、後者の場合が特に好まし
い。選択を行うために抗生物質を使用することは必要ではなく、本発明による方
法の実施は変わらない。
【００４６】 別の態様によれば、ベクターと株が別個に供給され、アデニルシクラーゼの活
性を復帰させるためには、ユーザーが株を形質転換させなければならない。
【００４７】 本発明はまた、 ａ．内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細菌株もしくは真菌株または
細胞株と、 ｂ．場合により自己タンパク質分解配列が隣接している、目的のタンパク質分
解分子をコードする遺伝子を、その酵素活性を保存したままアデニルシクラーゼ
の触媒ドメイン中に挿入することを可能とする立体配置を有する、アデニルシク
ラーゼをコードする、本発明によるＤＮＡ断片、精製されたポリヌクレオチドま
たはベクターと、 ｃ．ｂ．のＤＮＡ断片中に挿入するために、場合により自己タンパク質分解配
列が隣接している、目的のタンパク質分解分子をコードするＤＮＡを増幅するた
めの特異的プライマーと、 を含有する検査用キットをも包含する。
【００４８】 これらのキットはまた、場合により、 ｄ．ｂ．のベクターと同じ基本構造を有し、アデニルシクラーゼをコードす
るベクターであって、その触媒部位中に、場合によりタンパク質分解配列が隣接
する、陽性対照とするための活性なタンパク質分解分子が挿入されているベクタ
ー、および／または ｅ．ａ．の細菌株もしくは真菌株または細胞株の増殖と、ｃＡＭＰ生成と関
連する表現型の検出を可能とする培養培地、および／または ｆ．使用された菌株または細胞株におけるｃＡＭＰの生成を定量するための
試薬、および／または ｇ．レポータータンパク質の発現を定量するための試薬 を含有してもよい。
【００４９】 このような検査用キットにより、シスのプロテアーゼの作用を研究することが
可能となり、とりわけ、実施例で示すような阻害剤に対する耐性を検出するため
に特に有利である。
【００５０】 これらの検査用キットは、ウイルスのプロテアーゼ、とりわけ、ＨＩＶプロテ
アーゼの研究を可能にするものであることが好ましい。この場合には、このプロ
テアーゼをコードするＤＮＡとｐ５およびｐ６隣接領域とを増殖させる特異的プ
ライマー、とりわけ、配列番号７および配列番号８のプライマーが選択される。
【００５１】 これらの検査用ツールにより、AIDSに罹患している患者の血清を用いて、プロ
テアーゼ阻害剤への耐性を有する変異体を早期に同定することが可能となる。こ
のようして、患者が保有しているウイルスの集団に基づいて、その患者に適した
治療を選択でき、治療の失敗を最小限に留めることができるものと期待される。
【００５２】 事実、この系は簡易で迅速である（患者の血清におけるＰＣＲ、好ましくはｐ
ＵＣに由来する、プラスミド中へのサブクローニング、およびＤＨＴ１などの細
菌における形質転換）。従って、RVAが２〜３週間を要するのに対し、結果をわ
ずか２〜３日で得られると期待できる。
【００５３】 さらに、この試験では、ＨＩＶプロテアーゼをコードするプロウイルスのＤＮ
Ａ断片の取り扱いが制限的であるため、RVAアッセイとは異なり、いかなる汚染
の危険性もなくＰ３実験室を必要とすることもなく、試験を行うことができる。
【００５４】 さらに、実施例で実証されるように、本発明は非常に高い感度で検出を行うこ
とを可能にする。特に、アデニルシクラーゼ（ＡＣ）は、半減期のきわめて短い
タンパク質である。さらに、百日咳菌のＡＣの第２２４残基と第２２５残基を含
有するペプチドは、アデニルシクラーゼが比較的フレキシブルなタンパク質であ
る限り、外側のタンパク質に容易に接近することができる。このため、第２２４
残基と第２２５残基との間にタンパク質分解部位をうまく導入すると、目的のプ
ロテアーゼに対してこれらの部位をしっかりと接触させることができる。このた
め、これによって感度を高めることが可能になる。プロテアーゼがシスに挿入さ
れ、自己タンパク質分解が起こる系を使用したときでさえも、より高い感度が得
られる。なぜなら、この場合には、切断過程は分子内で生じ、補足された菌株ま
たは細胞株、例えば大腸菌、の他のタンパク質との競合は生じないからである。
【００５５】 この遺伝子系はまた、特異的配列の切断に反応するプロテアーゼを検索するた
め、または与えられたプロテアーゼについて標的配列を検索するための大規模ス
クリーニングを行うために使用することもできる。
【００５６】 従って、本発明はまた、分子ライブラリーにおいて、部位特異的タンパク質分
解活性を有する分子を同定する方法であって、ライブラリーの種々の分子につい
て上述の方法を実施することを特徴とし、細菌株もしくは真菌株または細胞株を
補足するアデニルシクラーゼが、検索の対象とするタンパク質分解活性を有する
分子のための特異的標的アミノ酸配列を含んでなるものである方法に関する。
【００５７】 同様に、本発明は、タンパク質分解活性を有する分子のための標的配列を同定
する方法であって、細菌株もしくは真菌株または細胞株のライブラリーについて
上述の方法を実施することを特徴とし、それぞれの細菌株もしくは真菌株または
細胞株が、ある配列がタンパク質分解活性を有する分子のための切断部位からな
るものであるかどうかを決定するために、異なるアミノ酸配列を含む請求項１〜
７のいずれか一項に記載のアデニルシクラーゼで補足されているものである方法
に関する。
【００５８】 下記の実施例により、ある好適な実施態様を展開することによって、本発明を
詳細に説明する。
【００５９】 とりわけ、これらの実施例により、本発明の多くの利点、とりわけ、本発明の
方法の感度の高さ、および本発明の各系の利点（タンパク質分解活性を有する分
子のシスまたはトランスでの導入）が実証される。
【００６０】 これらの実施例に基づいて、当業者は、あるパラメーターを改良することが可
能となるだろう。とりわけ、実施例で与えられたすべての数値は例示であって、
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】実施例１．菌株と培地 遺伝子構築物は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（endA1, hsdR17, supE44, thi1,
λ-, recA1, gyrA96, relA1, Δ(ｌａｃ-proB)/F-, proAB, ｌａｃ19ZΔM15、Tn
10(tetr)）（とりわけ、Stratagene社から市販されているもの）で調製し、プラ
スミドで発現されたタンパク質の活性は大腸菌ＤＨＴ１株（F-, gln V44( AS),
recA1, endA1, gyrA96(Nalr), thi1, hsdR17, spoT1, rfbD1, cya-854, ilv-691
::Tn10）でアッセイした。この株は、２０００年１月４日にＣＮＣＭに寄託され
、受託番号Ｉ−２３７５が付与されている。
【００６２】 細菌を、ルリア−ベルターニ（Luria-Bertani、ＬＢ）液体培地または寒天培
地（寒天15ｇ／ｌ）で培養した。それらの糖の発酵能は、１％のマルトースを含
むマッコーンキー（MacConkey）寒天培地上で試験した（Miller, 1972, Experim
ents in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring H
arbor, NY）。抗生物質は以下の濃度で使用した：アンピシリン：100μｇ／ｍＬ
およびカナマイシン：50μｇ／ｍＬ。プロテアーゼ阻害剤、インディナビアー（
indinavir）（Crixivan、 Merck社）およびサキナビアー（saquinavir）（Invira
se、 Roche社）は、それぞれエタノールおよび水に溶解し（最終濃度20ｍＭ）、
示された濃度になるように培地で希釈した。
【００６３】実施例２．プラスミド構築物 すべてのプラスミドを、Sambrookらによって記載された標準的な手順に従って
構築した（1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harb
or Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY）。プラスミドＤＮＡを「Qiagen Kit
」（Qiagen GmbH, ドイツ）を用いて精製し、提供者（New England Biolabs社ま
たはFermentas社）の指示に従って適当な制限酵素で加水分解した。ＰＣＲ（ポ
リメラーゼ連鎖反応）条件は、プライマーのプリンおよびピリミジン塩基組成の
性質により決定した（Saiki et al., 1988, Science, 239, 487-91）。
【００６４】 プラスミドｐＵＣＶＩＨはプラスミドｐＵＣ１９の誘導体であり（Sambrookら
、1989）、ｌａｃプロモーターの制御下で、ＨＩＶの野生型のプロテアーゼを発
現する。それを構築するために、マトリックスとして、ＨＩＶウイルスのプロウ
イルスＤＮＡを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＡ1（配列番号５）
およびＡ2（配列番号６）を使用して、ＰＣＲを行った。
【００６５】 得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、BamHI酵素とSalI酵素とで
消化し、ｐＵＣ１９のBamHI部位とSalI部位との間にサブクローニングした。
【００６６】 プラスミドｐＵＣＶＩＨは、２０００年１月４日にＣＮＣＭに寄託され、受託
番号Ｉ−２３７６が付与されている。
【００６７】 プラスミドｐＵＣＢ１、ｐＵＣＢ３、ｐＵＣＶ１およびｐＵＣＶ２は、ｐＵＣ
１９の誘導体であり、各々は変異したＨＩＶプロテアーゼを発現する。これらの
プロテアーゼをコードしているＤＮＡを患者の血清から増幅させ、マトリックス
として使用し、プライマーＡ１とＡ２を用いたＰＣＲを行った。その後、精製し
、BamHIとSalIとで消化したＰＣＲ断片をｐＵＣ１９にサブクローニングして、
プラスミドを構築した。
【００６８】 プラスミドｐＫＴ２５は、ｌａｃプロモーターの制御下でアデニルシクラーゼ
の不活性なＴ２５断片だけを発現する、プラスミドｐＳＵ（Bartolome et al.,
1991, Gene, 102, 75-8）（ｐＵＣプラスミドおよびそれらの誘導体と適合性が
ある）の誘導体である。
【００６９】 プラスミドｐＫＡＣは、アデニルシクラーゼの触媒ドメイン全体を発現する。
これは、ｐＣｍＡＨＬ１（Karimova et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 95, 5752-6）のAatII-EcoRI断片を、ｐＫＴ２５中にサブクローニングして構
築した。
【００７０】 プラスミドｐＫＡＣＰｒは、ｐＳＵの誘導体であり、ｌａｃプロモーターの制
御下で、組換えタンパク質ＡＣp（アデニルシクラーゼの触媒ドメインのアミノ
酸２２４とアミノ酸２２５との間に挿入された、ＨＩＶプロテアーゼおよびその
２つの隣接配列ｐ５とｐ６）を発現する（図１）。これは、プライマーＡ３（配
列番号７）とＡ４（配列番号８）を用いて、ＨＩＶウイルスのプロウイルスＤＮ
Ａ上でＰＣＲを行って構築した。その後、精製し、消化したＰＣＲ産物を、pACM
224p815A（Karimova et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-6
）のNheIとKpnI部位との間にサブクローニングした。その後、得られたプラスミ
ド、ｐＡＣＰをAatIIとEcoRIとで消化し、消化産物をｐＫＴ２５中にサブクロー
ニングした。
【００７１】 ＨＩＶの野生型のプロテアーゼが修飾されたプロテアーゼで置換されているｐ
ＫＡＣＰｒの変異種（ｐＫＡＣＢ１, ｐＫＡＣＢ３, ｐＫＡＣＶ１, ｐＫＡＣＶ
２）を構築した。このために、突然変異体プロテアーゼをコードするＤＮＡをプ
ライマーＡ３とＡ４とで増幅させ、ＰＣＲ産物を精製し、NheIとKpnIとで消化し
、ｐＫＡＣＰｒのNheI部位とKpnI部位との間にサブクローニングした。
【００７２】 プラスミドｐＫＡＣｐ５は、相補的なオリゴヌクレオチドＡ５（配列番号９）
とＡ６（配列番号１０）とをハイブリダイズさせ、それらをｐＫＡＣＰｒのNheI
とKpnIとの間にサブクローニングして構築した。この配列は、ＨＩＶプロテアー
ゼの切断部位の１つであるｐ５ポリペプチドをコードしている。
【００７３】 プラスミドｐＫＡＣＰｒとｐＫＡＣｐ５は、それぞれ２０００年１月４日にＣ
ＮＣＭに寄託され、受託番号Ｉ−２３７７およびＩ−２３７８が付与されている
。
【００７４】実施例３．β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ β−ガラクトシダーゼ活性は、無色のオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トシド（ＯＮＰＧ）の加水分解を測定することによりアッセイする。遊離するオ
ルトニトロフェニルは基本培地中で呈色し、４２０ｎｍにおける吸収を示す（Ｏ
ＮＰ:４２０ｎｍ、ｐＨ１１でεｍＭ＝５）。
【００７５】 細菌をＬＢ培地中で、終夜、30℃で培養した。翌日、懸濁液を６３Ｂ１培地で
５倍に希釈し（Miller et al., 上記を参照されたい）、この希釈液の６００ｎ
ｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定し、その後、トルエン１滴と１％デオキシコ
ール酸ナトリウム１滴とを３ｍLのこの懸濁液に加えた。チューブを１０秒間ボ
ルテックスにかけ、３０分間、３７℃で振盪した。この処理によって、細菌の膜
が壊れ、小さな分子（ＯＮＰＧおよびＯＮＰ）が自由に拡散する。
【００７６】 このアッセイについて、トルエンを加えた懸濁液を１ｍLのＰＭ２緩衝液（７
０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３０ｍＭ ＮａＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７、およびその場で添加した１００ｍＭ β−メルカプト
エタノール）で希釈した。チューブを２８℃に保ち、ｔ＝０で０．２５ｍＬのＯ
ＮＰＧ溶液（１３ｍＭをβ−メルカプトエタノールを含まないＰＭ２緩衝液に溶
解したもの）を加えて反応を開始させた。十分に着色したときに（０．２５０＜
ＯＤ４２０＜１．６）、０．５ｍＬの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（これは、培地のｐＨ
を１１にし、酵素を不活化する）を加えて反応を停止させる。
【００７７】 ４２０ｎｍでのＯＤを対照試料（他の試料と同じ処理をした１ｍＬのＰＭ２）
に対して読み取った。
【００７８】 １ユニットのβ−ガラクトシダーゼは、ｐＨ７、２８℃で１分間当たりに加水
分解された１ナノモルのＯＮＰＧに相当する。その後、１０９個の細胞が細菌の
乾燥重量０．３ｍｇに相当することに基づいて、６００ｎｍでのＯＤ値を用いて
、１ｍＬ当たりのユニット数を細菌の乾燥重量１ｍｇ当たりのユニット数に換算
した。
【００７９】実施例４．環状ＡＭＰアッセイ 細菌によって生成されたｃＡＭＰを、ウサギ抗−ｃＡＭＰ血清、およびアルカ
リホスファターゼと結合させたヤギ抗−ウサギ抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡ（固
相酵素免疫検定法）免疫アッセイによって測定した。使用したアルカリホスファ
ターゼの基質は、ＰＡ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１
０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ９．５）中に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した５’
−パラニトロフェニルリン酸二ナトリウムである。
【００８０】 ３７℃で約１時間置いた後、λ＝４０５ｎｍで読み取りを行い、ｃＡＭＰ濃度
を、キャリブレーションの範囲内にある試料について得られたＯＤと比較して計
算した。その後、濃度（ｐｍｏｌ／ｍＬ）を細菌の乾燥重量１mg当たりのピコモ
ルに変換した（β−ガラクトシダーゼ活性アッセイに関して）。
【００８１】実施例５．ＨＩＶプロテアーゼによる、百日咳菌のアデニルシクラーゼのトラン スにおける不活化 ５．ａ．系の原理 この系はアデニルシクラーゼの酵素活性に影響することなく、アデニルシクラ
ーゼの触媒ドメイン中にポリペプチド配列を挿入する蓋然性に基くものである。
【００８２】 百日咳菌のアデニルシクラーゼは、トリプシンによって２つの断片Ｔ２５（ア
ミノ酸１〜２２４）とＴ１８（アミノ酸の２２５〜４００）に切断され、これら
は個々には触媒活性を有さない（Ladant, 1988, J. Biol. Chem., 263, 2612-8
）。他方で、アミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間での挿入は、ｃＡＭＰの生
産能を低下させるものではない。
【００８３】 このため、与えられたプロテアーゼの特異的切断部位を、アデニルシクラーゼ
のアミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間に導入しても、その活性が低下するこ
とはない。他方、この組換えタンパク質が対応するプロテアーゼと同時発現され
る場合には、２つの不活性なドメインＴ２５およびＴ１８が遊離するように、特
異的に切断される。このため、ｃＡＭＰ合成は生じない（図２）。
【００８４】 百日咳菌のアデニルシクラーゼの機能的な活性を試験するために、内因性のア
デニルシクラーゼ（cya）欠損株を使用した。特に、大腸菌においては、転写ア
クチベーターＣＡＰ（カタボライトアクチベータータンパク質）に結合している
ｃＡＭＰは、多くの遺伝子を活性化する複合体を形成しており、その中にマルト
ースオペロンとラクトースオペロンとが存在する。
【００８５】 こうして、アデニルシクラーゼの触媒ドメインをこの株で発現させたときに、
ｃＡＭＰの生成によりcyaの特徴が補足され、その後、この細菌はラクトースと
マルトースの発酵能を有することとなる。この同じ株で別のものとして発現され
たＴ２５およびＴ１８は、ｃＡＭＰを生成することができず、この菌はそれらの
cyaの特徴を保存する。
【００８６】 細菌の糖発酵能は、指示培地（ＬＢ−Ｘ−Ｇａｌまたはマルトースを添加した
マッコンキー）、または選択培地（炭素源としてラクトースまたはマルトースの
みを含有する最少培地）上で見ることができる。
【００８７】 １．ｂ．in vivoにおける系の開発 この系を試験するために、本発明による組換えタンパク質である、ＡＣｐ５の
中に、アデニルシクラーゼのアミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間に、ＨＩＶ
プロテアーゼのｐ５切断部位を導入したものを作製した。このタンパク質（ｐＫ
ＡＣｐ５、実施例２）を発現するプラスミドと、野生型のＨＩＶプロテアーゼ（
ｐＵＣＶＩＨまたはｐＵＣ１９）を含有するか、または含有しない適合性のある
プラスミドとで、大腸菌cya株を同時に形質転換した。その後、形質転換体の表
現型を、プロテアーゼ阻害剤を含有するマッコンキー−マルトース培地、または
プロテアーゼ阻害剤を含有しないマッコンキー−マルトース培地上で観察した。
【００８８】 これらの表現型の試験結果から、以下のことが示された： （ｉ）ＡＣｐ５が大腸菌cya株中で発現されると、ＡＣｐ５によってCya＋表現型
に復帰し得る；このため、アミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間のｐ５ポリペ
プチドは、アデニルシクラーゼの活性を低下させない；
【００８９】 （ii）ｐＫＡＣｐ５とｐＵＣＶＩＨとで同時形質転換されたＤＨＴ１株はプロテ
アーゼ阻害剤の不存在下でCya−表現型を示す；このため、ＨＩＶのウイルスプ
ロテアーゼは、大腸菌中、in vivoで明らかに活性がある；このプロテアーゼは
、ＡＣｐ５を切断し、その後ＡＣｐ５が不活化されると、ｃＡＭＰはもはや合成
されない。ＨＩＶプロテアーゼによるＡＣｐ５の切断は、in vitroでも見られる
。
【００９０】 （iii）これら同じ形質転換体は、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、Cya＋表現型
となる；このため、ＡＣｐ５はもはや切断されず、プロテアーゼがこれらの生成
物によって阻害されることが明確に示される；
【００９１】 （iv）最後に、ＨＩＶプロテアーゼがＡＣｐ５をｐ５配列で切断し、タンパク質
内の他の場所では切断しないことを証明するために、ＤＨＴ１株を、ｐＵＣＶＩ
ＨとｐＫＡＣとで同時形質転換した（実施例２を参照されたい。ｐＫＡＣは、野
生型、すなわち、ｐ５配列のないアデニルシクラーゼを発現するプラスミドであ
る）。これらの株のCya＋表現型は、後者がｐ５のような特異的部位を含む場合
には、ＨＩＶプロテアーゼだけがアデニルシクラーゼを切断することができると
いうことを示す。
【００９２】 アデニルシクラーゼ活性に対する阻害剤の濃度の影響を調べるために、これら
の細胞を培養した液体培地中のβ−ガラクトシダーゼ活性を、培地中における阻
害剤の濃度の関数としてアッセイした（図３）。
【００９３】 ｐＫＡＣｐ５とｐＵＣ１９とで同時に形質転換したＤＨＴ１株の場合には、β
−ガラクトシダーゼ活性が高く、培地中の阻害剤の量とは関わりなく一定であっ
た。ｐＫＴ２５とｐＵＣ１９とで同時形質転換された菌に関しては、Ｔ２５断片
のみを発現する菌の基本的レベルに対応するβ−ガラクトシダーゼ活性を有して
いた。ｐＫＡＣｐ５とｐＵＣＶＩＨとで同時に形質転換された大腸菌ＤＨＴ１に
ついては、β−ガラクトシダーゼ活性は培地中の阻害剤の量に依存し、細胞中の
プロテアーゼが徐々に阻害されることを反映していた。
【００９４】 同様に、ｐＫＡＣＰｒとｐＵＣＶＩＨとで同時に形質転換されたＤＨＴ１によ
って生成されるｃＡＭＰの量は、倍地中の阻害剤の濃度とともに上昇するが、陽
性対照および陰性対照（各々、ｐＫＡＣｐ５＋ｐＵＣ１９とｐＫＴ２５＋ｐＵＣ
１９）ではｃＡＭＰレベルは一定であった。
【００９５】 こうした結果から、この遺伝子系が野生型のＨＩＶプロテアーゼの活性を可視
化し、特異的な化合物によるこの活性の阻害を実証するのに十分な感度があるこ
とが示された。
【００９６】 ５．ｃ．in vivoの系におけるインディナビアーとサキナビアーとに耐性なＨ
ＩＶプロテアーゼの検出 本発明の方法が低い活性を検出するために十分な感度を有しているかどうかを
決定するために、プロテアーゼ阻害剤に耐性である突然変異体を研究した。
【００９７】 ４種類の臨床分離株（プロテアーゼ阻害剤に対して耐性を示す２種のウイルス
（Ｂ３およびＶ２）、およびプロテアーゼ阻害剤に対して耐性を示さない２種の
ウイルス（Ｂ１およびＶ１））を分析した。これら４株の遺伝子型および表現型
の特徴づけを、表１に示した。
【００９８】
【表１】
【００９９】 変異は、対照のウイルスプロテアーゼのアミノ酸配列（１〜99）に関して記載
されている（Ｖ：Val、Ｉ：Ile、Ｍ：Met、Ｔ：Thr、Ｌ：Leu、およびＰ：Pro）
。突然変異体の耐性のレベルは、ウイルスの複製を50％阻害するのに必要な阻害
剤の濃度における、（野生型のプロテアーゼと比較した）相対的な増加に対応す
る。これらのデータは、in vitroのアッセイ（組換えウイルスアッセイ）で得ら
れた。
【０１００】 修飾されたプロテアーゼをコードするＤＮＡをベクターｐＵＣ１９中にクロー
ニングし、得られたプラスミドとｐＫＡＣｐ５とで、ＤＨＴ１株を同時に形質転
換した。形質転換された菌の表現型を、プロテアーゼ阻害剤を含むか、または含
まないマッコンキー・マルトース培地上で観察した。
【０１０１】 こうした条件の下で、Ｂ１プロテアーゼおよびＶ１プロテアーゼは野生型のプ
ロテアーゼのような挙動を示し（阻害剤の非存在下においては白色のコロニー、
阻害剤の存在下においては赤色のコロニー）、それらの遺伝子型および表現型の
特徴付け（表１）から、それらはプロテアーゼ阻害剤に対して耐性を示さないこ
とが期待された。
【０１０２】 突然変異体Ｖ２の場合には、インディナビアーの存在下では、表現型は野生型
のプロテアーゼと同じである（５０μＭのインディナビアーを用いるとCya＋）
。サキナビアーの存在下では、この菌がCya＋になるためにはより高い濃度を要
した（１０μＭに代えて２０μＭ）。このため、突然変異体Ｖ２はサキナビアー
に対して耐性を示した（これは、表１のデータを確認するものである）。
【０１０３】 最後に、突然変異体Ｂ３の場合には、培地中に阻害剤がない場合をも含めて、
菌の表現型は常にCya＋である。このことは、この突然変異体のタンパク質分解
活性が野生型のそれよりも低く、アデニルシクラーゼ分子の画分を切断する場合
でさえも、Cya＋表現型を生じさせる調節カスケードを活性化するのに十分な量
が残っているという事実によって説明さすることができる。
【０１０４】 このため、この系は、野生型のプロテアーゼおよび突然変異体Ｂ１、Ｖ１およ
びＶ２の活性を検出するためには感度は十分であるが、Ｂ３のようなより活性の
低い突然変異体を検出するためには感度が不十分である。この系の感度の不足は
、切断が、生物分子の過程：とりわけ、プロテアーゼが一旦合成されると、最初
に二量化されなければならず、第二にその基質と相互作用しなければならないと
いう過程の結果としてなされるものであるという事実に起因するものであるのか
もしれない。この期間中、切断されていないアデニルシクラーゼ分子はｃＡＭＰ
を合成し、ｃＡＭＰはカタボリック（catabolic）オペロンを活性化する。
【０１０５】 この系の感度を向上させるために、反応がより直接的である他の手段を採用し
た：プロテアーゼ全体をアデニルシクラーゼ中に挿入し、このキメラ分子の自己
タンパク質分解を研究した。
【０１０６】実施例６．百日咳菌のアデニルシクラーゼのシスにおける不活化。アデニルシク ラーゼ中に挿入されたＨＩＶプロテアーゼの自己タンパク質分解。 ６．ａ．原理 この系は、第一にＨＩＶプロテアーゼの、第二に百日咳菌のアデニルシクラー
ゼの特定の性質を利用するものである。ＨＩＶの酵素と構造タンパク質は、ポリ
タンパク質の形で合成される。これらのポリタンパク質の突然変異体はプロテア
ーゼの影響を受け、プロテアーゼはそれ自身の配列の上流および下流（ｐ５部位
およびｐ６部位）で配列を切断する。さらに、アデニルシクラーゼは、その酵素
活性に影響を与えることなく、Ｔ２５およびＴ１８断片の間に、かなりの大きさ
の挿入物（２００残基まで）を受け入れる。
【０１０７】 このため、キメラタンパク質（ＡＣＰｒ）が構築され（実施例２）、アデニル
シクラーゼのアミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間に、ＨＩＶプロテアーゼ（
99残基）ならびにその２つの切断配列ｐ５およびｐ６（いずれも８アミノ酸）が
挿入される。この場合、野生型のプロテアーゼは不活性なＴ２５およびＴ１８を
別々に遊離しながら、自己タンパク質分解を行う。対照的に、プロテアーゼが不
活性な場合、または阻害剤が存在する場合には、それらの自己タンパク質分解は
起こらず、アデニルシクラーゼはそのｃＡＭＰ合成活性を保存し、大腸菌cyaを
補足することができ、その後、この大腸菌はCya＋表現型を有するようになる（
図５）。
【０１０８】 ６．ｂ．in vivo系における野生型のプロテアーゼの研究 ｐＫＡＣＰｒもしくは他のｐＫＴ２５（陰性対照）または他のｐＫＡＣｐ５も
しくは他のｐＫＡＣ（陽性対照）で形質転換したＤＨＴ１株の表現型を観察した
。
【０１０９】 ｐＫＡＣｐ５またはｐＫＡＣで形質転換した細菌は、プロテアーゼがないため
に、条件にかかわらず、それらのCya＋表現型（マッコンキー マルトース上で
赤色コロニー）が保存された。対照的に、Ｔ２５のみを発現している菌（ＤＨＴ
１＋ｐＫＴ２５）は、この断片が不活性であることから、常にCya−（白色コロ
ニー）である。
【０１１０】 最後に、プラスミドｐＫＡＣＰｒで形質転換した菌は、阻害剤の非存在下では
Cya−であり、サキナビアーまたはインディナビアーの存在下ではCya＋である。
これらの結果から、プロテアーゼがアデニルシクラーゼ中に挿入されたときは、
このプロテアーゼはまだ活性であり、プロテアーゼ阻害剤を阻害できることが示
された。
【０１１１】 こうした定性的な結果が、これらの細胞を液体培養したときの培養液中のｃＡ
ＭＰとβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイすることによって得られた定量的な
データによって確認された（図６および７）。
【０１１２】 これらのデータから、野生ガラクトシダーゼのプロテアーゼの場合には、「シ
ス」におけるこの系は、少なくとも「トランス」における場合と同程度の感度で
あることが示唆された：プロテアーゼによる、キメラタンパク質ＡＣ/ＨＩＶ-プ
ロテアーゼの特異的な自己タンパク質分解とそれらの阻害とを証明することを可
能にした。
【０１１３】 その後、突然変異体が阻害剤に対して耐性であるとき、とりわけ変異種B3であ
る場合に、活性の低いプロテアーゼを検出できるかどうかを決定するために、こ
の方法の感度を研究した。
【０１１４】 ６．ｃ．「シス」における系での阻害剤に耐性のＨＩＶプロテアーゼの検出 この研究においては、Ｂ１、Ｂ３、Ｖ１およびＶ２のプロテアーゼをアデニル
シクラーゼのアミノ酸２２４とアミノ酸２２５との間に挿入し、得られたキメラ
タンパク質をＤＨＴ１株中で発現させた（プラスミドｐＫＡＣＢ１、ｐＫＡＣＢ
３、ｐＫＡＣＶ１およびｐＫＡＣＶ２）。
【０１１５】 予想したとおり、Ｂ１とＶ１とは野生型のプロテアーゼのような挙動をした（
阻害剤の非存在下においてはCya−表現型、存在下においてはCya＋表現型）。突
然変異体Ｂ３（ｐＫＡＣＢ３）は、阻害剤の非存在下において、菌にCya−表現
型を付与する。インディナビアーの存在下においては、ｐＫＡＣＢ３で形質転換
した菌は、濃度が１００μＭまではCya−表現型であり（ｐＫＡＣＰｒで形質転
換した菌については５０μＭであるのに対し）、このことはこのプロテアーゼが
インディナビアーに耐性となる変異を有することを示している。サキナビアーの
存在下においては、ｐＫＡＣＢ３で形質転換したＤＨＴ１株は１０μＭではCya
−であるのに対し、ｐＫＡＣＰｒ（野生型のプロテアーゼ）で形質転換したもの
はこの培地上では赤くなっていた。このため、突然変異プロテアーゼＢ３もまた
、サキナビアーに対して耐性を示す。
【０１１６】 変異型プロテアーゼＶ２の場合には、この系により、サキナビアーとインディ
ナビアーに対する感度が低下していることを実証することが可能となる：ｐＫＡ
ＣＶ２で形質転換した細菌は、１００μＭのインディナビアーまたは２０μＭの
サキナビアーを含む培地上ではCya−であったが、同じ培地上で、ｐＫＡＣＰｒ
で形質転換した菌は赤色コロニーを形成した。
【０１１７】 このため、「シス」のおける系は、プロテアーゼが独立したプラスミドから供
給される系よりも、非常に高感度である；特に、Ｂ３プロテアーゼのように、非
常にタンパク質分解活性が低い場合でも活性を検出し、耐性の限定的な増加（４
×）を識別することを可能にする。
【０１１８】実施例７．阻害剤に耐性のＨＩＶプロテアーゼの少数集団の検出 本実施例では、表現型アッセイを用いて、主に感受性の集団の中で、阻害剤に
耐性のプロテアーゼを発現しているＨＩＶウイルスの少数集団を、本発明により
検出できることを示す。この方法は、患者の血清に対して日常的に使用すること
ができるが、初期段階の治療における耐性の出現の検出を可能にし、そして、任
意に、結果として治療を適正なものとすることを可能にする。
【０１１９】 これについては、種々の割合でｐＫＡＣＶ２とｐＫＡＣＰｒとを含む混合物（
１／１、１／１０、および１／１００）を調製し、その後、これらの混合物各々
でＤＨＴ１株を形質転換した。形質転換体の表現型を、野生型のプロテアーゼを
サキナビアー耐性プロテアーゼ（Ｖ２）と容易に見分けることができる、２０μ
Ｍのサキナビアーを含むマッコンキー・マルトース培地上で観察した。
【０１２０】 ｐＫＡＣＰｒまたはｐＫＡＣＶ２で形質転換されたＤＨＴ１は、阻害剤の非存
在下では白色である。これらと同一のＤＨＴ１を２つのプラスミドの混合物で形
質転換すると、２０μＭのサキナビアーの存在下では、ディッシュ上のコロニー
は不均一であり：白色のコロニーと赤色のコロニーとが見分けられた。
【０１２１】 さらに、ディッシュ上での白色コロニーの数に対する、赤色コロニーの数の割
合は、ＤＨＴ１の形質転換に使用したｐＫＡＣＰｒとｐＫＡＣＶ２の相対的な量
に対応していた。白色コロニーがｐＫＡＣＶ２に由来するものであり、赤色コロ
ニーがｐＫＡＣＰｒに由来するものであることを証明するために、４個の赤色コ
ロニーと４個の白色コロニーとからプラスミドを精製し、その後EcoRIとKpnIと
で消化した。
【０１２２】 赤色コロニーから精製したプラスミドは、ｐＫＡＣＰｒと同じ消化プロファイ
ルを有していたのに対し（３８５２ｂｐと７１０ｂｐの２つの断片）、白色コロ
ニーに由来するプラスミドはｐＫＡＣＶ２と同じ消化プロファイルを有していた
（これらは、２つのプラスミドの区別を容易にするためにEcoRI部位を除くよう
にデザインされており、EcoRI部位を有さないため、KpnIのみで消化される）。
【０１２３】 このため、赤色コロニーはｐＫＡＣＰｒで形質転換された菌に正確に対応する
のに対し、白色コロニーはｐＫＡＣＶ２に由来していた。このため、本発明に記
載された方法により、与えられた阻害剤に感受性のプロテアーゼを主に含む集団
の中から、この阻害剤に耐性のプロテアーゼを表現型で識別することが可能にな
った。
【０１２４】生物材料の寄託 下記の微生物を、ブダペスト条約の条文に従って、２０００年１月４日にNati
onale de Cultures de Microorganism (CNCM)〔National Collection of Microo
rganism Cultures〕、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France
に寄託した。
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一つの実施態様において使用したプラスミドを表した図。ｐｌａｃ：
ラクトースオペロンプロモーター；Ｔ２５およびＴ１８：それぞれ百日咳菌のア
デニルシクラーゼのＴ２５およびＴ１８断片をコードする配列；ｐ５およびｐ６
：ＨＩＶプロテアーゼの切断部位をコードしている配列；ｋａｎｒ：カナマイシ
ン耐性遺伝子；ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子。ｐＫＴ２５プラスミドおよ
びその誘導体は、P15A型の複製開始点を有し、このため、ｐＵＣＶＩＨプラスミ
ドおよびその誘導体と適合性がある（複製開始点：ＣｏｌＥ１）。
【図２】 ＨＩＶウイルスプロテアーゼによるトランスのアデニルシクラーゼの不活化。
Ｔ２５およびＴ１８は、それぞれ、ＡＣのアミノ酸配列１−２２４および２２５
−４００に対応する。ｐ５は、ＨＩＶプロテアーゼの特異的切断部位の一つ（プ
ロテアーゼ配列の上流側）である。Ａにおいては、大腸菌で発現される組換えタ
ンパク質ＡＣｐ５は、カルモジュリン非依存性であり、ｃＡＭＰを合成し、ラク
トースオペロンおよびマルトースオペロンの活性化に至る基本的な活性を有する
。Ｂにおいては、ＡＣｐ５で同時発現されるＨＩＶプロテアーゼは、不活性なＴ
２５断片およびＴ１８断片から遊離するタンパク質を切断する：ここではｃＡＭ
Ｐは合成されない。Ｃにおいては、特異的に阻害されたプロテアーゼがＡＣｐ５
を不活化できず、このため、ｃＡＭＰが合成される。
【図３】 ｐＫＡＣｐ５とｐＵＣ１９、ｐＫＡＣｐ５とｐＵＣＶＩＨまたは他のｐＫＴ２
５とｐＵＣ１９で形質転換された細菌ＤＨＴ１のβ−ガラクトシダーゼ活性。形
質転換された細菌を、示された濃度でプロテアーゼ阻害剤を加えたＬＢ培地＋カ
ナマイシン＋アンピシリンで、終夜、３０℃で培養した。その後、実施例３に示
すようにアッセイを行った。
【図４】 培地中におけるプロテアーゼ阻害剤の濃度の関数としての細胞中でのｃＡＭＰ
合成。大腸菌ＤＨＴ１を示したプラスミドで形質転換し、その後、示された濃度
でプロテアーゼ阻害剤を加えたＬＢ培地＋カナマイシン＋アンピシリンで、終夜
、３０℃で培養した。その後、実施例４に示すようにアッセイを行った。
【図５】 アデニルシクラーゼ中に挿入されたＨＩＶプロテアーゼの自己タンパク質分解
。Ｔ２５およびＴ１８は、それぞれ、百日咳菌のアデニルシクラーゼのアミノ酸
１−２２４およびアミノ酸２２５−４００を表し、ｐ５およびｐ６はＨＩＶプロ
テアーゼの特異的切断部位である。Ａにおいては、プロテアーゼが自己タンパク
質分解して２つの不活性な断片Ｔ２５とＴ１８とを生じる；細菌はCya−のまま
である。Ｂにおいては、プロテアーゼ阻害剤がプロテアーゼを不活化し、もはや
自己タンパク質分解は起こらなくなる；その後、アデニルシクラーゼがｃＡＭＰ
を合成し、Cya＋表現型に復帰する。
【図６】 培地中におけるプロテアーゼ阻害剤濃度の関数としての、ｐＫＡＣｐ５、ｐＫ
ＡＣＰｒおよびｐＫＴ２５で形質転換された細菌ＤＨＴ１のβ−ガラクトシダー
ゼ活性。形質転換された細菌を、示された濃度でプロテアーゼ阻害剤を加えたＬ
Ｂ培地＋カナマイシンで、終夜、３０℃で培養した。その後、実施例３に示すよ
うにアッセイを行った。
【図７】 培地中におけるプロテアーゼ阻害剤濃度の関数としての、ｐＫＡＣｐ５、ｐＫ
ＡＣＰｒおよびｐＫＴ２５で形質転換された細菌ＤＨＴ１におけるｃＡＭＰ合成
。形質転換された細菌を、示された濃度でプロテアーゼ阻害剤を加えたＬＢ培地
＋カナマイシンで、終夜、３０℃で培養した。その後、実施例４に示すようにア
ッセイを行った。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年３月１８日（２００２．３．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダニエル、ラダン フランス国カシャン、リュ、ド、ランス、 ３ (72)発明者 アニェ、ユールマン フランス国パリ、リュ、ポール、デュペ イ、３ (72)発明者 ナサリ、ドータン フランス国パンフ、リュ、ド、ロクセロ ワ、21 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA14 BA07 BA14 CA04 DA06 DA11 EA04 GA11 HA08 4B050 CC05 DD02 DD20 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ95 QR16 QR18 QR75 QR90 QS03 QS36 QS39 QX02 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA01 BA02 CA29 CA33 CA44

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 部位特異的タンパク質分解活性を有する少なくとも１つの分子のための１以上
    の切断部位を含む少なくとも１つのポリペプチド配列を含んでなる組換えアデニ
    ルシクラーゼであって、前記ポリペプチド配列がアデニルシクラーゼの触媒ドメ
    イン中に挿入されており、かつその酵素活性が保存されていることを特徴とする
    、組換えアデニルシクラーゼ。
  2. 【請求項２】 挿入されたポリペプチド配列が、タンパク質分解活性を有する分子に対応する
    ポリペプチド配列をも含んでなることを特徴とする、請求項１に記載のアデニル
    シクラーゼ。
  3. 【請求項３】 挿入されたポリペプチド配列が、ＨＩＶプロテアーゼに特異的な少なくとも１
    つの切断部位を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載のアデニル
    シクラーゼ。
  4. 【請求項４】 ＨＩＶプロテアーゼに特異的な切断部位が、配列番号１に対応する一連のアミ
    ノ酸を含んでなる、ｐ５部位であることを特徴とする、請求項３に記載のアデニ
    ルシクラーゼ。
  5. 【請求項５】 挿入されたポリペプチド配列が、配列番号３に対応する、ｐ５およびｐ６切断
    配列によって挟まれたＨＩＶプロテアーゼを含有することを特徴とする、請求項
    ３に記載のアデニルシクラーゼ。
  6. 【請求項６】 前記アデニルシクラーゼが百日咳菌（Bordetella pertussis）のアデニルシク
    ラーゼであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデニル
    シクラーゼ。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチド配列が、配列番号４のアミノ酸２２４とアミノ酸２２５との
    間に挿入されていることを特徴とする、請求項６に記載のアデニルシクラーゼ。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデニルシクラーゼをコードするポリヌ
    クレオチド。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含有するか、または請求項１〜７のいず
    れか一項に記載のアデニルシクラーゼを発現しうる、ベクター。
  10. 【請求項１０】 ２０００年１月４日に受託番号Ｉ−２３７８としてＣＮＣＭに寄託されたベク
    ターｐＫＡＣｐ５であることを特徴とする、請求項４に記載のアデニルシクラー
    ゼを発現しうる、請求項９に記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 ２０００年１月４日に受託番号Ｉ−２３７７としてＣＮＣＭに寄託されたベク
    ターｐＫＡＣＰｒであることを特徴とする、請求項５に記載のアデニルシクラー
    ゼを発現しうる、請求項９に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 分子のタンパク質分解活性を検出する方法であって、 ａ．請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えアデニルシクラーゼにより、
    内因性のアデニルシクラーゼを欠損しており、アデニルシクラーゼの酵素活性と
    連動して発現する表現型を有している細菌株もしくは真菌株または細胞株を補足
    する工程と、 ｂ．前記補足された菌株または細胞株と被検分子とを接触させる工程と、 ｃ．アデニルシクラーゼの活性と連動する表現型を示す条件下で、前記菌株ま
    たは細胞株を培養する工程と、 ｄ．前記表現型の発現をモニタリングする工程と を含んでなる、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項８に記載のポリヌクレオチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に
    記載のベクターの導入によって、内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細
    菌株もしくは真菌株または細胞株を補足することを特徴とする、請求項１２に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細菌株が大腸菌（Escherichia co
    li）であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 アデニルシクラーゼの酵素活性に連動して発現する表現型が、ラクトースまた
    はマルトースの発酵能であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一
    項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 アデニルシクラーゼの酵素活性に連動して発現する表現型が、抗生物質に対し
    て耐性を示す能力であることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 アデニルシクラーゼの酵素活性に連動して発現する表現型が、容易に検出でき
    るタンパク質、特にルシフェラーゼまたはＧＦＰを発現する能力であることを特
    徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 タンパク質分解活性を有する分子の阻害剤に対する耐性を検出する方法であっ
    て、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、ｂ工程で前記
    分子と阻害剤とを接触させることを特徴とする、方法。
  19. 【請求項１９】 前記耐性のレベルが、対象とする表現型の発現を定量することによって測定さ
    れることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 タンパク質分解活性を有する分子がＨＩＶプロテアーゼであることを特徴とす
    る、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 タンパク質分解活性を有する分子を検出するための検査用キットであって、 ａ．内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細菌株もしくは真菌株または
    細胞株と、 ｂ．タンパク質分解活性を有する分子に対応する１以上の切断部位がその触媒
    部位に挿入されている組換えアデニルシクラーゼをコードするＤＮＡ断片、精製
    されたポリヌクレオチドまたはベクターと、 を含有することを特徴とする、キット。
  22. 【請求項２２】 タンパク質分解活性を有する分子を検出するための検査用キットであって、 ａ．内因性のアデニルシクラーゼを欠損している細菌株もしくは真菌株または
    細胞株と、 ｂ．場合により自己タンパク質分解配列が隣接している、目的のタンパク質分
    解分子をコードする遺伝子を、その酵素活性を保存したままアデニルシクラーゼ
    の触媒ドメイン中に挿入することを可能とする立体配置を有する、アデニルシク
    ラーゼをコードするＤＮＡ断片、精製されたポリヌクレオチドまたはベクターと
    、 ｃ．ｂ．のＤＮＡ断片中に挿入するために、場合により自己タンパク質分解配
    列が隣接している、目的のタンパク質分解分子をコードするＤＮＡを増幅するた
    めの特異的プライマーと、 を含有することを特徴とする、キット。
  23. 【請求項２３】 患者の血清または細胞中に存在するウイルスによってコードされる、タンパク
    質分解活性を有する分子の活性を検出するための検査用キット、またはそれらの
    阻害剤に対する耐性を検出するための検査用キットを製造するための、請求項１
    〜７のいずれか一項に記載のアデニルシクラーゼ、請求項８に記載のポリヌクレ
    オチド、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  24. 【請求項２４】 患者における、患者の血清または細胞中に存在するタンパク質分解活性を有す
    る分子のうちの、［阻害剤への耐性を有する、タンパク質分解活性を有する分子
    ］／［前記阻害剤への耐性を有さない、タンパク質分解活性を有する分子］の比
    を定量するための検査用キットを製造するための、請求項１〜７のいずれか一項
    に記載のアデニルシクラーゼ、請求項８に記載のポリヌクレオチド、または請求
    項９〜１１のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  25. 【請求項２５】 タンパク質分解活性を有する分子がＨＩＶプロテアーゼであることを特徴とす
    る、請求項２３または２４に記載の使用。
  26. 【請求項２６】 分子ライブラリーにおいて、部位特異的タンパク質分解活性を有する分子を同
    定する方法であって、ライブラリーの種々の分子について請求項１２〜１７のい
    ずれか一項に記載の方法を実施することを特徴とし、細菌株を補足するアデニル
    シクラーゼが、検索の対象とするタンパク質分解活性を有する分子のための特異
    的標的アミノ酸配列を含んでなるものである、方法。
  27. 【請求項２７】 タンパク質分解活性を有する分子のための標的配列を同定する方法であって、
    細菌株もしくは真菌株または細胞株のライブラリーについて、請求項１２〜１７
    のいずれか一項に記載の方法を実施することを特徴とし、それぞれの細菌株もし
    くは真菌株または細胞株が、ある配列がタンパク質分解活性を有する分子のため
    の切断部位からなるものであるかどうかを決定するために、異なるアミノ酸配列
    を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデニルシクラーゼで補足されてい
    るものである、方法。
  28. 【請求項２８】 ２０００年１月４日に受託番号Ｉ−２３７５としてＣＮＣＭに寄託されたＤＨ
    Ｔ１株であることを特徴とする、内因性のアデニルシクラーゼを欠損している大
    腸菌（Escherichia coli）株またはその変異体。
  29. 【請求項２９】 ２０００年１月４日に受託番号Ｉ−２３７６としてＣＮＣＭに寄託されたベク
    ターｐＵＣＶＩＨであることを特徴とする、ＨＩＶプロテアーゼをコードするベ
    クター。
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