JPWO2005024428A1 - 生理活性タンパク質に対する薬剤の新規ハイスループットスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

本発明は、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を利用して、生理活性タンパク質に対する薬剤特に阻害剤の、安全にそして迅速なスクリーニング手段を提供することを課題とする。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、無細胞タンパク質合成手段のうちコムギ胚芽を利用した系で、活性を維持した生理活性タンパク質の合成系を構築し、その合成系を利用する代表例としてＳＡＲＳ ３ＣＬｐｒｏの阻害剤候補物質のスクリーニング系を構築し本発明を完成した。

Description

本発明はコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を利用する、生理活性タンパク質に対する薬剤特に阻害剤を、安全にそして迅速に探し出す方法に関する。具体的には、ウイルスを含む病原体の塩基配列情報をもとに、組換え実験の規制にもとづくバイオハザード等の制約を受けることなく、試験管内で安全、簡便かつ効率的並びに遺伝子からタンパク質を同一反応系で合成させる。さらに、ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌに生理活性タンパク質の活性を追うことが可能な無細胞タンパク質合成系を利用することにより、細胞内の環境により近い反応系において、該生理活性タンパク質の自己消化、基質認識、翻訳又はフォールディング過程の機能、構造等についての反応性を指標とした薬剤特に阻害剤をスクリーニングする方法に関するものである。

細胞内におけるタンパク質合成を試験管等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームやその他のタンパク質合成に必要な成分を生物体から抽出し（本明細書中では、これを「無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出物」と称することがある）、これらを用いた試験管内での無細胞タンパク質合成法の研究が盛んに行われている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。

無細胞タンパク質合成系は、翻訳反応の正確性や速度において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ目的とするタンパク質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため該合成系をより産業上に適用するため、合成効率の上昇のみならず、合成用コムギ胚芽抽出物含有液やレディメイド型コムギ胚芽抽出物含有液を安定的に高品質を保持して提供することが必要である。

一方、ウイルスを含む病原体により引き起こされる感染症は、化学療法の進歩などによりある程度克服できるようになったものの、毎年繰り返されるインフルエンザの流行、ＡＩＤＳ、大腸菌Ｏ１５７、ＳＡＲＳ、西ナイルウイルス、エボラ出血熱のような新顔の感染症の登場、あるいは一時克服したと思われた結核の復活を見れば、依然として人類の大きな脅威である。こうした中で、最近、ＨＩＶウイルスに対するプロテアーゼ阻害剤が抗ＡＩＤＳ薬として有効であることが実証され、実用化された。ウイルスの増殖にとって不可欠であるプロテアーゼを標的とする感染症治療薬研究は今後、その重要性を増してゆくものと考えられる。

現在、一般的に行われているプロテアーゼ阻害剤の研究は、遺伝子組換え技術により大腸菌などに生産させたプロテアーゼタンパク質を、その基質となるタンパク質、被験物質と共存させ、基質を切断する活性を指標として阻害剤として有効な物質を探索するというものである。しかしながら、病原体由来タンパク質を遺伝子組換えにより生産する場合には、Ｐ３、Ｐ４の大掛かりな実験施設が必要であり、規制も数多い。さらに、十分な施設をもってしても、研究者がこれらの病原体に感染する危険性が皆無であるとはいえない。

さらに従来法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験においてプロテアーゼの阻害活性が確認された薬剤であっても、ウイルスの増殖を抑制できない場合がある。従来法で用いられているものは、フォールディングが完了した精製品であり、両者の構造の違いが、基質特異性に影響を与えることが考えられる。

また最近問題となった感染症であるＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）は、２００３年６月末日の時点で、世界中で８，４４７人の感染および８１１人が死に至った、２００３年の初めに現われた新興感染症である。
ＳＡＲＳは高熱、倦怠、悪寒、頭痛、及び呼吸困難によって特徴づけられ、進行すると肺間質症を引き起こし、挿管および機械的な呼吸を必要とする。現在、ＳＡＲＳに感染した人の致死率は約１５％と高く、感染方法として、完全に他のルートを除外することができないが、主として直接接触により感染すると考えられている。多くの証拠から、ＳＡＲＳ感染者から新型のコロナウイルスが存在していることにより、ＳＡＲＳの原因の病原体が新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）とされている。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ自身の複製のために必須なタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）が知られており、該分解酵素はウイルスのライフサイクルでの重要な機能を示すだけでなく、ＳＡＲＳの症状を引き起こす原因となっていることも指摘されている（非特許文献２）。よって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏ）は、ＳＡＲＳ治療の有効な薬剤ターゲットと考えられており、さまざまな研究が進められている。

これまでに、いくつかのグループによって、以下のようなＳＡＲＳに対する薬剤研究が進められている。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶの主要ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅであるＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏの結晶構造の三次元構造解析分子モデルリングによるＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏの候補阻害剤の検討（非特許文献１）。
ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏとリガンドの結合メカニズムの分子モデリングによる、ＳＡＲＳに対する薬剤候補の検討（非特許文献２）。
これらは、いずれも実験的にＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏと阻害剤を検討したものではなく、阻害剤としての実用化には至っていない。

また、無細胞タンパク質合成系を用いて病原体に対する阻害剤の研究として、ウサギ網状赤血球由来無細胞タンパク質合成系でＲｈｉｎｏｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓを発現させて、自己消化を阻害する阻害剤のスクリーニング方法が提案されている。しかし、ウサギ網状赤血球由来無細胞タンパク合成系を用いて、膨大な候補薬剤をスクリーニングするには、多量の合成液を確保する必要があること、コスト面でも課題があること、さらに当該合成系でのタンパク発現量が微量であるために、スクリーニングの検出には放射性同位元素を用いたトレーサー実験を必要とするなど、実用的なスクリーニング方法とはいえなかった。（非特許文献３）。

以上のＳＡＲＳ研究の状況にかかわらず、現在、ＳＡＲＳ治療に対する有効な薬剤は利用可能ではない。これは、ＳＡＲＳの病原体であるＳＡＲＳ−ＣｏＶが特定されてから、日が浅いこと。さらには、ＳＡＲＳの病原体のような致死率の高いウイルスを研究するための、バイオハザードの制約による実験の取り扱いの困難性。さらには、解読したゲノム配列をもとにして、発現した生理活性タンパク質が、立体構造、翻訳後修飾の問題により、生理活性タンパク質の活性を維持した状態でのスクリーニングが困難と考えられていたからである。

特開平６−９８７９０号公報 特開平６−２２５７８３号公報 特開平７−１９４号公報 特開平９−２９１号公報 特開平７−１４７９９２号公報 国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２５７４２ Ａｎａｎｄ Ｋ，Ｚｉｅｂｕｈｒ Ｊ，Ｗａｄｈｗａｎｉ Ｐ，Ｍｅｓｔｅｒｓ ＪＲ，Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄ Ｒ．Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（３Ｃｌｐｒｏ）ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ＳＡＲＳ ｄｒｕｇｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３ Ｊｕｎ １３；３００（５６２６）：１７６３−７．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｍａｙ １３． Ｋｕｏ−Ｃｈｅｎ Ｃｈｏｕ，Ｄｏｎｇ−Ｑｉｎｇ Ｗｅｉ，ａｎｄ Ｗｅｉ−Ｚｈｕ Ｚｈｏｎｇ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３０８（２００３）１４８−１５１ ＢＥＶＥＲＬＹ Ａ．ＨＥＩＮＺ，ＪＯＳＥＰＨ ＴＡＮＧ，ＪＥＡＮ Ｍ．ＬＡＢＵＳ，ＦＲＥＤＥＲＩＣＫ Ｗ．ＣＨＡＤＷＥＬＬ，ＳＴＥＰＨＥＮ Ｗ．ＫＡＲＬＤＯＲ，ＡＮＤ ＭＡＲＬＹＳ ＨＡＭＭＯＮＤＳｉｍｐｌｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｔｏ Ａｎａｌｙｚｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ＰｒｏｔｅａｓｅｓＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ，Ｊａｎ．１９９６，ｐ．２６７−２７０

本発明は、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を利用して、生理活性タンパク質に対する薬剤特に阻害剤の、安全にそして迅速なスクリーニング手段を提供することを課題とする。並びに従前にはない、ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌに生理活性タンパク質の活性を追うことが可能なコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系の利用により、細胞内の環境により近い反応系において、生理活性タンパク質の自己消化、基質認識、翻訳又はフォールディング過程の機能、構造等についての反応性を指標とする生理活性タンパク質に対する薬剤特に阻害剤のスクリーニング手段を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、無細胞タンパク質合成手段のうちコムギ胚芽を利用した系で、生理活性を維持した生理活性タンパク質の合成系を構築し、その合成系を利用する代表例としてＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏの阻害剤の候補物質のスクリーニング系を構築し本発明を完成した。

つまり本発明は以下よりなる。
「１．以下の工程の少なくとも３）〜５）を含むコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用する生理活性タンパク質に対する薬剤探索方法。
１）生理活性タンパク質の遺伝子の塩基配列情報をもとにして、該生理活性タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を合成する工程
２）１）で合成した遺伝子からｍＲＮＡを合成する工程
３）２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として又は１）で合成された遺伝子を転写鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて生理活性タンパク質を合成する工程
４）候補薬剤をコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系に添加し、生理活性タンパク質に対する候補薬剤の反応性を確認する工程
５）該反応性を指標として、当該生理活性タンパク質に対する薬剤をスクリーニングする工程
２．生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質の自己消化反応性を指標とすることを特徴とする前項１の薬剤探索方法。
３．生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質の基質認識反応性を指標とすることを特徴とする前項１の薬剤探索方法。
４．生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質のフォールディング過程での自己消化又はフォールディングの阻害若しくは停止又はミスフォールディングの誘発を指標とすることを特徴とする前項１の薬剤探索方法。
５．生理活性タンパク質に対する候補薬剤の反応性が以下のいずれか１又は２以上から選ばれる前項１の薬剤探索方法。
１）転写過程の生理活性タンパク質ｍＲＮＡの合成を阻害又は停止する反応
２）生理活性タンパク質の１若しくは２以上の自己消化部位での自己消化を阻害及び／又は拮抗する反応
３）生理活性タンパク質の１若しくは２以上の基質認識部位での基質認識を阻害及び／又は拮抗する反応
４）翻訳過程の生理活性タンパク質の合成を阻害又は停止する反応
５）フォールディング過程の生理活性タンパク質の自己消化又はフォールディングを阻害若しくは停止する反応又はミスフォールディングを誘発する反応
６．前項１の３）〜５）又は２）〜５）の工程を、一つの反応系で行うことを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
７．コムギ胚芽抽出液が、胚乳及び低分子合成阻害物質が実質的に除去されたコムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成手段である前項１〜６のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
８．生理活性タンパク質が、病原体の増殖に関与するタンパク質であることを特徴とする前項１〜７のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
９．生理活性タンパク質が、プロテアーゼであることを特徴とする前項１〜８のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
１０．生理活性タンパク質の遺伝子が以下のいずれか１から由来する遺伝子である前項１〜９のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
１）二本鎖ＤＮＡウイルス、２）１本鎖ＤＮＡウイルス、３）プラス鎖ＲＮＡウイルス、４）マイナス鎖ＲＮＡウイルス、５）二本鎖ＲＮＡウイルス、６）レトロウイルス、７）ヘパドナウイルス
１１．生理活性タンパク質が以下のいずれか１である前項１〜１０のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
１）ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３）ｈｅｌｉｃａｓｅ、４）コートタンパク質、５）キャプシドタンパク質
１２．生理活性タンパク質の遺伝子がＳＡＲＳに由来する前項１〜１１のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
１３．前項１〜１２のいずれか１に記載の薬剤探索方法で得られる薬剤。
１４．前項１〜１２のいずれか１に記載の薬剤探索方法に使用される試薬キット。
１５．ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
１６．配列番号６〜２１に記載のいずれか１のヌクレオチドを含む前項１５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
１７．前項１５又は１６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成される、ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードするＤＮＡ。
１８．前項１７に記載のＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードする配列番号１に記載のＤＮＡ。
１９．前項１７又は１８に記載のＤＮＡを用いて、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系で合成されたＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質。
２０．前項１９に記載のプロテアーゼ活性を維持したＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質。」

本発明は、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を利用することによって、生理活性タンパク質に対する薬剤特に阻害剤を安全、迅速にスクリーニングする手段を提供した。さらに本発明は、生理活性タンパク質の自己消化、基質認識、翻訳及び／又はフォールディング過程における機能若しくは構造等についての反応性を指標とする生理活性物質タンパク質に対する薬剤特に阻害剤のスクリーニング手段を提供することに成功した。

（１）無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出物含有液の調製
本発明に用いられる無細胞タンパク質合成系は、コムギ胚芽抽出物を用いるものである。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分をコムギ胚芽から抽出し、この抽出液に転写鋳型若しくは翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明における無細胞タンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写／翻訳系のいずれをも含む。

本発明に用いられるコムギ胚芽抽出物含有液は、ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）として市販されている。
コムギ胚芽抽出液の調製法としては、コムギ胚芽の単離方法として、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）に記載の方法等が用いられ、また単離した胚芽からのコムギ胚芽抽出物含有液の抽出方法としては、例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０等に記載の方法を用いることができる。その他、特願２００２−２３１３９、特願２００２−２３１３４０に記載の方法が例示される。

本発明で好適に利用されるコムギ胚芽抽出物は、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。

上記コムギ胚芽抽出物は、コムギ胚芽抽出物含有液由来および必要に応じて別途添加されるタンパク質を含有する。その含有量は、特に限定されないが、凍結乾燥状態での保存安定性、使い易さ等の点から、凍結乾燥前の組成物において、当該組成物全体の好ましくは１〜１０重量％、より好ましくは２．５〜５重量％であり、また、凍結乾燥後の凍結乾燥組成物において、当該凍結乾燥組成物全体の好ましくは１０〜９０重量％、より好ましくは２５〜７０重量％である。なお、ここでいうタンパク質含有量は、吸光度（２６０，２８０，３２０ｎｍ）を測定することにより算出されるものである。

（２）コムギ胚芽抽出物含有液からの潮解性物質の低減化
上記コムギ胚芽抽出物含有液は、抽出溶媒、あるいは抽出した後に行うゲルろ過に用いる緩衝液などが酢酸カリウム、酢酸マグネシウムなどの潮解性物質を含んでいる。このため、該コムギ胚芽抽出物含有液を使い翻訳反応溶液を調製し、そのまま乾燥製剤とした場合、凍結乾燥工程において溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題がある。品質の低下とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下することである。そこで、該コムギ胚芽抽出物含有液に含まれる潮解性物質の濃度を、凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない程度に低減する。潮解性物質の具体的な低減方法としては、例えば、予め潮解性物質を低減、または含まない溶液で平衡化しておいたゲル担体を用いたゲルろ過法、あるいは透析法等が挙げられる。このような方法により最終的に調製される翻訳反応溶液中の潮解性物質の終濃度として６０ｍＭ以下となるまで低減する。具体的には、最終的に調製される翻訳反応溶液中に含まれる酢酸カリウムの濃度を６０ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ以下に低減する。そして、さらに凍結乾燥処理された製剤中の潮解性を示す物質（潮解性物質）の凍結乾燥状態での保存安定性を低下させない含有量とは、当該凍結乾燥製剤中に含有されるタンパク質１重量部に対して、０．０１重量部以下が好ましく、特に０．００５重量部以下が好ましい。

（３）夾雑微生物の除去
コムギ胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を除去しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の除去手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が除去可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。

（４）コムギ胚芽抽出物含有液から低分子合成阻害物質の除去方法
以上のような操作に加えて、コムギ胚芽抽出物含有液の調製工程の何れかの段階において低分子合成阻害物質の除去工程を加えることにより、より好ましい効果を有する生理活性タンパク質の無細胞タンパク質合成を行うためのコムギ胚芽抽出物含有液とすることができる。
胚乳成分が実質的に除去され調製されたコムギ胚芽抽出物含有液は、タンパク質合成阻害活性を有する低分子の合成阻害物質（これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含んでおり、これらを取り除くことにより、タンパク質合成活性の高いコムギ胚芽抽出物含有液を取得することができる。具体的には、コムギ胚芽抽出物含有液の構成成分から、低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画除去する。低分子合成阻害物質は、コムギ胚芽抽出物含有液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子のうち最も小さいもの以下の分子量を有する分子として分画することができる。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものとして分画、除去し得る。低分子合成阻害物質のコムギ胚芽抽出物含有液からの除去方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には、透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法が、透析内液に対しての物質供給容易の点等において好ましい。

透析による低分子合成阻害物質の除去操作に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の除去分子量を有するものが挙げられる、具体的には除去分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｓａｌｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ製）や、除去分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＬＡＢＯＴＲＡＴＯＲＩＥＳ ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量のコムギ胚芽抽出物含有液等を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。

低分子合成阻害物質の除去を行う際、コムギ胚芽抽出物含有液に不溶性成分が生成される場合には、この生成を阻害する（以下、これを「コムギ胚芽抽出物含有液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られるコムギ胚芽抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液のタンパク質合成活性を高めることができる。コムギ胚芽抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液の安定化の具体的な方法としては、上述した低分子合成阻害物質の除去を行う際に、コムギ胚芽抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液として行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。

これらの成分は、予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子合成阻害物質の除去工程に供してもよいし、低分子合成阻害物質の除去に透析法を用いる場合には、透析外液にも安定化成分を添加して透析を行って低分子合成阻害物質の除去を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含むコムギ胚芽抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。

安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、コムギ胚芽抽出物含有液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分をコムギ胚芽抽出物含有液に添加し、適当な時間の後に低分子合成阻害物質の除去工程を行い、取得された処理後コムギ胚芽抽出物含有液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後コムギ胚芽抽出物含有液を用いて無細胞タンパク質合成を行い、タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上述の選択方法において、コムギ胚芽抽出物含有液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られたコムギ胚芽抽出物含有液中の不溶性成分量や、得られたコムギ胚芽抽出物含有液のタンパク質合成活性等により選択する方法も挙げられる。

このようにして選択されたコムギ胚芽抽出物含有液の安定化条件の例として、具体的には、透析法により低分子合成阻害物質の除去工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出物含有液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、コムギ胚芽抽出物含有液のタンパク質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。

また、低分子合成阻害物質の除去をコムギ胚芽抽出物含有液として調製した後に行えば、上記安定化成分をコムギ胚芽抽出物含有液にさらに添加する必要はない。

（５）コムギ胚芽抽出物含有液の還元剤濃度の低減方法
コムギ胚芽抽出物含有液に含まれる還元剤の濃度を低減させて無細胞タンパク質合成を行うことによれば、目的の生理活性タンパク質の分子内に存在するジスルフィド結合が形成された状態でタンパク質を取得することができる。コムギ胚芽抽出物含有液中の還元剤の低減方法としては、コムギ胚芽抽出物含有液を調製するに至る工程の何れかにおいて還元剤低減工程を行う方法が用いられる。還元剤は、最終的に調製されるコムギ胚芽抽出物含有液中の濃度として、該コムギ胚芽抽出物含有液を用いた翻訳反応において生理活性タンパク質が合成され得て、かつ分子内ジスルフィド結合が形成、保持され得る濃度に低減される。具体的な還元剤の濃度としては、ジチオスレイトール（以下、これを「ＤＴＴ」と称することがある）の場合、コムギ胚芽抽出物含有液から調製された最終的な翻訳反応溶液中の終濃度が、２０〜７０μＭ、好ましくは３０〜５０μＭに低減される。また、２−メルカプトエタノールの場合には、翻訳反応溶液中の最終濃度が、０．１〜０．２ｍＭに低減される。さらに、グルタチオン／酸化型グルタチオンの場合には、翻訳反応溶液中の最終の濃度が３０〜５０μＭ／１〜５μＭとなるように低減される。上述した具体的な還元剤の濃度は、これら限定されるものではなく、合成しようとするタンパク質、あるいは用いる無細胞タンパク質合成系の種類により適宜変更することができる。

還元剤の至適濃度範囲の選択法としては、特に制限はないが、例えば、ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって判断する方法を挙げることができる。具体的には、還元剤の濃度を様々にふったコムギ胚芽抽出物含有液由来翻訳反応溶液を調製し、これらにジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加して分子内にジスルフィド結合を有する生理活性タンパク質の合成を行う。また、対照実験として同様の翻訳反応溶液にジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加しないで同様のタンパク質合成を行う。ここで合成される生理活性タンパク質の可溶化成分を、例えば遠心分離等の方法により分離する。この可溶化成分が全体の５０％（可溶化率５０％）以上であり、またその可溶化成分がジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の添加により増加した反応液が、該生理活性タンパク質の分子内ジスルフィド結合を保持したまま合成する反応液として適していると判断することができる。さらには、上記のジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって選択された還元剤の濃度範囲のうち、合成される生理活性タンパク質の最も多い還元剤の濃度をさらに好ましい濃度範囲として選択することができる。

具体的な還元剤の低減方法としては、還元剤を含まないコムギ胚芽抽出物含有液を調製し、これに無細胞タンパク質合成系に必要な成分とともに、上記の濃度範囲となるように還元剤を添加する方法や、コムギ胚芽抽出物含有液由来の翻訳反応溶液から上記の濃度範囲となるように還元剤を除去する方法等が用いられる。無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出物含有液はこれを抽出する際に高度の還元条件を必要とするため、抽出後にこの溶液から還元剤を取り除く方法がより簡便である。コムギ胚芽抽出物含有液から還元剤を取り除く方法としては、ゲルろ過用担体を用いる方法等が挙げられる。具体的には、例えば、セファデックスＧ−２５カラムを予め還元剤を含まない適当な緩衝液で平衡化してから、これにコムギ胚芽抽出物含有液を通す方法等が挙げられる。

（６）翻訳反応溶液の調製
以上のように調製されたコムギ胚芽抽出物含有液は、これにタンパク質合成に必要な核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等（以下、これらを「翻訳反応溶液添加物」と称することがある）および翻訳鋳型となる目的の生理活性タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望によりイノシトール、トレハロース、マンニトールおよびスクロースーエピクロロヒドリン共重合体からなる群から選択される成分を含有する安定化剤を添加して翻訳反応溶液を調製する。各成分の添加濃度は、自体公知の配合比で達成可能である。

翻訳反応溶液添加物として、具体的には、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が挙げられる。また、それぞれ濃度は、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ含まれるように添加することが好ましい。これらは、翻訳反応系に応じて適宜選択して組み合わせて用いることができる。具体的には、コムギ胚芽抽出物含有液としてコムギ胚芽抽出液を用いた場合には、２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テスク社製）、各０．３ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１０００Ｕ／ｍｌＲｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、４００μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を加え、十分溶解した後に、目的の生理活性タンパク質をコードするｍＲＮＡを担持する翻訳鋳型ｍＲＮＡを入れたもの等が例示される。

ここで、目的の生理活性タンパク質をコードするｍＲＮＡは、コムギ胚芽からなる無細胞タンパク質合成系において合成され得る生理活性タンパク質をコードするものが、適当なＲＮＡポリメラーゼが認識する配列と、さらに翻訳を活性化する機能を有する配列の下流に連結された構造を有している。ＲＮＡポリメラーゼが認識する配列とは、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等が挙げられる。また、無細胞タンパク質合成系において、翻訳活性を高める配列としてΩ配列又はＳｐ６等をコーディング配列の５’上流側に連結させた構造を有するものが好ましく用いられる。

（７）生理活性タンパク質
本発明に係る生理活性タンパク質とは、生物の遺伝子の塩基配列をもとに、合成された生物由来の特有の機能を有するタンパク質のことを言う。また、生理活性タンパク質を構成する塩基配列は、必ずしも生物の塩基配列と同一である必要はなく、特有の機能を有するタンパク質であれば、塩基配列に、適宜、欠失、置換、付加、挿入などの変異を導入した塩基配列であってもよい。具体例としては、ウイルスを含む病原体の遺伝子の塩基配列をもとにして、合成させた該病原体由来の特有の機能を有するタンパク質である。ウイルスを含む病原体の種類としては、二本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス等が挙げられるが限定はされない。また、生理活性タンパク質の特有の機能としては、病原体の増殖に関与するタンパク質、詳しくはプロテアーゼ、ヘリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等並びにウイルスの構造形成に関与するコートタンパク質、キャプシドタンパク質が挙げられるが限定はされない。

本発明にあっては、生理活性タンパク質をコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞合成系で転写／翻訳すれば、立体構造をネイテイブに近い状態でかつ活性を維持した生理活性タンパク質を容易に合成でき、さらに該合成系での反応と同時に候補薬剤を添加することによって、容易に自己消化、基質認識、翻訳又はフォールディング過程の反応をターゲットとした有用な候補薬剤をスクリーニング可能である。
実施例では、すでに公開されているＳＡＲＳ−ＣｏＶの主要タンパク質分解酵素であるＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏのアミノ酸配列（ＧｅｎＢＡＮＫのアクセッションナンバーＡＹ２７４１１９）をもとに合成した。すなわち、アミノ酸配列から各アミノ酸のコドンを検討し、プライマーのアニーリングサイトが短くなるように、ＧＣリッチなコドンを選択してプライマーをデザインした。このプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより全遺伝子を合成した。この遺伝子からｍＲＮＡを得て、該ｍＲＮＡを鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞合成で翻訳してＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏを合成した。さらに、得られたＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏがプロテアーゼ活性を維持していることを示したことによりＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏを用いた薬剤スクリーニング系を構築した。しかし、これは好適な例として開示したにすぎず、決して限定されるものではない。実施例で示されたＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏのアミノ酸配列は配列番号（３２）に示されている。

（８）無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いたタンパク質の合成方法
上記で調製された無細胞タンパク質合成用細胞抽出液であるコムギ胚芽抽出液は、前記で低減した潮解性物質及び水をタンパク質合成反応に適した濃度になるように添加した溶解液で溶解し、それぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入してタンパク質合成を行うことができる。タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を溶解した翻訳反応溶液を適当な温度に保って行う方法や、無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を含む溶液を翻訳反応溶液上に重層する方法（重層法：Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，５１４，１０２−１０５（２００２））等が挙げられる。

ここで、還元剤濃度を低減した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を用いた場合には、無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を供給する溶液についても同様の還元剤の濃度に調製する。さらに、翻訳反応でジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の存在下で行えば、分子内のジスルフィド結合が保持された生理活性タンパク質を高効率で合成することができる。ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素としては、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の上記無細胞翻訳系への添加量は、酵素の種類によって適宜選択することができる。具体的には、コムギ胚芽から抽出した無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出物含有液であって、還元剤としてＤＴＴを２０〜７０、好ましくは３０〜５０μＭ含有する翻訳反応溶液にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを添加する場合、翻訳反応溶液としての最終濃度で０．０１〜１０μＭの範囲、好ましくは０．５μＭとなるように添加する。また、添加の時期はジスルフィド結合が形成される効率から翻訳反応開始前に添加しておくことが好ましい。

（９）スクリーニング方法
本発明に係るコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系でのスクリーニング方法は、従前にはない以下に示す１）〜５）の工程の少なくとも３）〜５）を含む候補薬剤のスクリーニング方法である。従前の候補薬剤のスクリーニング方法は、主に成熟したタンパク質の活性若しくは構造等を対象としたスクリーニング方法であった。本発明のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系により下記記載＜１＞、＜３＞〜＜５＞のような状態の生理活性タンパク質に対する薬剤についてもスクリーニング対象とすることが可能となった。さらに、指標の対象を組み合わせることにより、薬理作用の機構が異なる薬剤や複合的な作用をもった薬剤をスクリーニングすることが可能となり、病原体に対してのカクテル療法に適した薬剤のスクリーニングも可能である。

本発明に係るコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用する生理活性タンパク質に対する薬剤探索方法は以下の工程１）〜５）である。
１）生理活性タンパク質の遺伝子の塩基配列情報をもとにして、該生理活性タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を合成する工程
生理活性タンパク質の遺伝子に、ＧＦＰ，ＧＵＳ，ＧＳＴ等の標識塩基配列、さらに生理活性タンパク質の認識配列を加えた生理活性タンパク質遺伝子の塩基配列とすることもできる。
２）１）で合成した遺伝子からｍＲＮＡを合成する工程
転写過程は、従来既知の方法でも可能である。
３）２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として又１）で合成された遺伝子を転写鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて生理活性タンパク質を合成する工程
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液をピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに、該ウェルの容量に適した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を添加する。続いて、タンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型若しくは転写鋳型及び安定化剤を含む溶液を各ウェルにピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより必要量添加して、生理活性タンパク質を合成する。
４）候補薬剤を無細胞タンパク質合成系に添加し、生理活性タンパク質又は生理活性タンパク質ｍＲＮＡに対する候補薬剤の反応性を確認する工程
候補薬剤の添加時期は、生理活性タンパク質合成系の転写工程、翻訳工程、自己消化過程、基質認識工程、フォールディング工程が起こるとされるいずれの時期でも良い。しかし、従来にはない新しい系でのスクリーニング手段として、翻訳工程と同時に添加することにより、生理活性タンパク質のフォールディング工程もしくはフォールディングの変化等をターゲットとしたスクリーニングも可能となる。
５）該反応性を指標として、当該生理活性タンパク質に対する薬剤をスクリーニングする工程
生理活性タンパク質に対する候補薬剤の反応性を質的又は量的に判定する方法としては、生理活性タンパク質についての反応性を検出できる方法であれば特に限定されない。具体的には、生理活性タンパク質の基質認識部位の標識化又は無細胞タンパク質合成系で合成される生理活性タンパク質に標識化を行い、該標識をマーカーにして、生理活性タンパク質に対する反応性を質的・量的に追跡してもよい。この場合の標識化手段としては、重水素、放射性同位元素、蛍光物質、色源体物質等一般的な手段が例示される。さらに、生理活性タンパク質の翻訳鋳型に対する反応性を指標とする候補薬剤については、無細胞タンパク質合成系で合成する生理活性タンパク質の発現量又は標識化した特定タンパク質の発現の有無から、生理活性タンパク質のｍＲＮＡに対する反応性についての質的・量的な判定もできる。
また、本発明に係るコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段は、生理活性を維持した状態で生理活性タンパク質を合成できる。よって、合成された生理活性タンパク質は、精製工程を得ることなく候補薬剤とのスクリーニングを可能としているので、上記３）〜５）又は２）〜５）の工程を一つの反応系で行うこともできる。

以下に本発明での候補薬剤の生理活性タンパク質に対する反応性の指標の検出（判定）方法について説明するが、これらは代表的なものであって特には限定されない。
＜１＞生理活性タンパク質のｍＲＮＡの翻訳反応
生理活性タンパク質のｍＲＮＡの翻訳過程において、候補薬剤を添加することによって、合成された生理活性タンパク質の量によって検出する。
生理活性タンパク質の塩基配列にマーカー配列を組み込むことによって、該マーカーの検出量によって検出する。さらには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用し、候補薬剤の存在の有無による合成された生理活性タンパク質のバンドの有無又は位置の変化を検出する。
＜２＞成熟した生理活性タンパク質
プロテアーゼ：プロテアーゼの切断認識部位を含む標識化物質とプロテアーゼ及び候補薬剤を接触させ、標識化物質を検出する、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥし、プロテアーゼによって切断されたペプチドのバンドの有無及び位置を検出する。
ＲＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡもしくはＲＮＡを鋳型に、放射線もしくは蛍光ラベルされたリボヌクレオチド及び候補薬剤を反応させて新規ＲＮＡが合成されないことを、ＰＡＧＥやキャピラリーで分離後、放射線ならオートラジオグラムで検出する、又は蛍光ならレーザーもしくは水銀ランプで励起し偏光フィルターで目的の波長を検出する。
ＤＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡもしくはＲＮＡを鋳型に、ＤＮＡもしくはＲＮＡのプライマー、放射線もしくは蛍光ラベルされたデオキシリボヌクレオチド及び候補薬剤を反応させて新規ＤＮＡが合成されないことをＰＡＧＥやキャピラリーで分離後、放射線ならオートラジオグラムで検出する、又は蛍光ならレーザーもしくは水銀ランプで励起し偏光フィルターで目的の波長を検出する。
ヘリカーゼ：放射線もしくは蛍光ラベルされた２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを鋳型に、一本鎖特異的核酸分解酵素及び候補薬剤を反応させて、鋳型が短くなったかどうかをＰＡＧＥやキャピラリーで分離後、放射線ならオートラジオグラムで検出する、又は蛍光ならレーザーもしくは水銀ランプで励起し偏光フィルターで目的の波長を検出する。
＜３＞生理活性タンパク質の自己消化反応
生理活性タンパク質の自己切断認識部位を含む標識化物質と生理活性タンパク質及び候補薬剤を接触させ、標識化物質を検出する、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥし，プロテアーゼによって切断されたペプチドのバンドの有無及び位置を検出する。また、標識化物質と生理活性タンパク質間のリンカーに自己切断認識部位配列を含んだタンパク質を合成し、標識化物質を検出する。
＜４＞生理活性タンパク質の基質認識反応
標識化物質を含む基質認識配列を含む物質、生理活性タンパク質、及び候補薬剤を接触させて蛍光強度の変化を検出する。またはＳＤＳ−ＰＡＧＥし、基質認識した生理活性タンパク質のバンドの濃淡（バンドの有無も含む）及び位置を検出する。
＜５＞生理活性タンパク質のフォールディング反応
標識化した生理活性タンパク質が候補薬剤との反応により、フォールディングの停止又はミスフォールディングが誘発されたことを、ＮＭＲやＣＤ等を使い、立体構造の変化を検出する。または、モノクローナル抗体や単鎖抗体との反応性でも確認することができる。

ＳＡＲＳプロテアーゼ活性に対する阻害剤候補物質のスクリーニングを行う場合には、ＳＡＲＳプロテアーゼ（ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ）を本発明のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用してプロテアーゼ活性を維持した状態で合成する。そして、標識化物質ＧＦＰを含む切断部位配列ＲＳを含む物質（ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ）、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ及び阻害剤候補物質を接触させてＧＦＰ蛍光強度の変化検出又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵ若しくはＧＦＰバンドの有無及び位置を検出する。これにより、
ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳのＲＳ切断が阻害されることによるＧＦＰ蛍光強度の減少又は
ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵ若しくはＧＦＰバンドの濃淡の変化（バンドの有無も含む）若しくは位置変化を指標として阻害剤を検索できる。

本発明に係る候補薬剤は、自体公知のさまざまな化合物ライブラリーを選択することができる。コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系では、大腸菌等を用いた生細胞系でのスクリーニング系ではないので、細胞の増殖に影響の与える候補薬剤や細胞に取り込まれにくい候補薬剤だけではなく、有機溶媒存在下でもタンパク質を合成できるため水に溶解しにくい候補薬剤も使用可能である。具体的には、市販の低分子化合物ライブリー等が挙げられる。

また、本発明に係るコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用する生理活性タンパク質に対する薬剤探索方法に使用される試薬キットは少なくとも無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を含んで構成されている。また、該試薬を用いて、複数の領域に区画された容器で生理活性タンパク質を合成すれば、候補薬剤のハイスループットスクリーニングが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

ＳＡＲＳ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅの活性検出
（１）ＳＡＲＳ ３ＣＬ Ｐｒｏｔｅａｓｅ遺伝子ＤＮＡのクローニング
ＳＡＲＳ ３ＣＬプロテアーゼ遺伝子のアミノ酸配列情報からデザインした合成ＤＮＡをプライマーとし、ｐＢＳＩＩＫＳ＋を鋳型として、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、ＳＡＲＳ ３ＣＬプロテアーゼ遺伝子を作製した。すなわち、ｐＢＳＩＩＫＳ＋のＨｉｎｄＩＩＩサイトをまたいで、センスプライマーＳ１（配列番号６）、アンチセンスプライマーＡ１（配列番号１４）を用いて、ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行った後、エクソヌクレアーゼＩ処理により未反応のプライマーを除去した。得られたＰＣＲ産物を鋳型として、Ｓ１プライマー、Ａ１プライマーの末端とそれぞれ１５ｍｅｒ重なるＳ２プライマー（配列番号７）、Ａ２プライマー（配列番号１５）を用いてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行った。この得られたＰＣＲ産物を鋳型として、Ｓ２プライマー、Ａ２プライマーとそれぞれ１５ｍｅｒ重なるＳ３プライマー（配列番号８）、Ａ３プライマー（配列番号１６）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。続いて同様に１５ｍｅｒ重なるようにデザインされたＳ３、Ａ３、Ｓ４（配列番号９）、Ａ４（配列番号１７）、Ｓ５（配列番号１０）、Ａ５（配列番号１８）、Ｓ６（配列番号１１）、Ａ６（配列番号１９）、Ｓ７（配列番号１２）、Ａ７（配列番号２０）、Ｓ８（配列番号１３）、Ａ８（配列番号２１）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを繰り返すことによってＤＮＡを増幅した。このプラスミドをフェノール／クロロホルム抽出し、制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ社製）によって切断し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によって精製を行った。この精製された制限酵素断片をセルフライゲーションによって環状化した。この環状化したプラスミドをＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした後アンピシリン（１００ｐｐｍ）を含んだＬＢ培地にプレーティングし、３７℃で一晩培養した。ＰＣＲ法により得られたコロニーから目的のＤＮＡ断片長をもつコロニーを選抜し、最終的に，シークエンスにより配列を確認した。目的のＤＮＡ断片をもつコロニーをＳｍａｌｌ Ｓｃａｌｅし、このプラスミドを大腸菌内で増幅した。この後プラスミドのみを得るためＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて精製した。この得られたベクター（ｐＢＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ）を制限酵素であるＸｈｏ１、ＢａｍＨ１（ＮＥＢ社製）で切断し、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳベクターを同様に、Ｘｈｏ１、ＢａｍＨ１で切断してＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）で精製した後、ライゲーションし同様にプラスミドを得た｛ｐＥＵ−Ｅ０１−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（配列番号１）｝。このプラスミドをＳＰｕプライマー（配列番号２２）、ＡＯＤＡ２３０３プライマー（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行い、転写・翻訳用の鋳型を得た。
また、ＳＡＲＳ ３ＣＬプロテアーゼ活性の中心と推定されている１４５番目のシステインをアラニンに変換した変異体ｐＥＵ−Ｅ０１−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）（配列番号３）も上記と同様な方法で構築した。

（２）基質ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ遺伝子ＤＮＡのクローニング
ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＵＳベクターをＥ０１配列とＸｈｏ１配列を含んだアンチセンスプライマー（配列番号２４）とＰｓｔ１配列とＧＵＳの開始コドンを含んだセンスプライマー（配列番号２５）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行ったものと，ＰＥＵ３−ＧＦＰベクターをＸｈｏ１配列とＧＦＰの開始コドンを含んだセンスプライマー（配列番号２６）とＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの切断部位の配列（ＲＳ）とＧＦＰの一部の配列を含んだプライマー（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出し，Ｘｈｏ１，Ｐｓｔ１（ＮＥＢ社製）を用いてＤＮＡを切断した。この切断されたＤＮＡをＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によって精製し，ライゲーションによってプラスミドを環状化、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、（１）と同様に目的のコロニーを選抜後Ｓｍａｌｌ Ｓｃａｌｅし、このプラスミド｛ｐＥＵ−ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ（配列番号２）｝を大腸菌内で増幅した。この後、プラスミドのみを得るためＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて精製した。この得られたｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＵＳベクターをＳＰｕプライマー，ＡＯＤＡ２３０３プライマーを用いてＰＣＲを行った。

（３）ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏおよびＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）融合遺伝子のクローニング
ｐＢＳ−ＳＡ３Ｌ^ｐｒｏプラスミドを鋳型にＰｓｔ１サイト、ＲＳ配列の一部を含むセンスプライマーであるＲＳ−ＳＡ３Ｌ^ｐｒｏ−Ｓ１（配列番号２８）とＭ１３プライマー（配列番号２９）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出し、制限酵素であるＰｓｔ１（ＮＥＢ社製）、ＢａｍＨ１（ＮＥＢ社製）によって切断した。また、ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳプラスミドを同様にＰｓｔ１（ＮＥＢ社製）、ＢａｍＨ１（ＮＥＢ社製）によって切断した。この２種の切断されたＤＮＡをＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ２Ｋｉｔ（フナコシ社製）によって精製し、ライゲーションによってプラスミドを環状化、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、（１）と同様に目的のコロニーを選抜後、Ｓｍａｌｌ Ｓｃａｌｅし、このプラスミドを大腸菌内で増幅した。この後、プラスミド｛ｐＥＵ−ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（配列番号５）｝のみを得るためにＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉｐｒｅＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて精製した。この得られたＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏベクターをＳＰｕプライマー、ＡＯＤＡ２３０３プライマーを用いてＰＣＲを行った。
また、同様にＳＡＲＳ ３ＣＬプロテアーゼ活性の中心と推定されている１４５番目のシステインをアラニンに変換した変異体ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）を組み込んだ、ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）を構築した。

（４）ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ融合遺伝子のクローニング
ｐＥＵ−Ｅ０１−ＧＳＴＮ２プラスミドを鋳型にＸｈｏ１サイトとＧＳＴの開始コドンを含んだセンスプライマーＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３Ｌ^ｐｒｏｓｅｎ（配列番号３０）とＰｓｔ１サイトとＧＳＴの配列の一部を含んだアンチセンスプライマーＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３Ｌ^ｐｒｏａｎｔｉ（配列番号３１）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出し、制限酵素であるＸｈｏ１（ＮＥＢ社製）、Ｐｓｔ１（ＮＥＢ社製）によって切断した。また、ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳプラスミドを同様にＰｓｔ１（ＮＥＢ社製）、ＢａｍＨ１（ＮＥＢ社製）によって切断した。この２種のＤＮＡをＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ２Ｋｉｔ（フナコシ社製）によって精製し、ライゲーションによってプラスミドを環状化、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎし、（１）と同様に目的のコロニーを選抜後、Ｓｍａｌｌ Ｓｃａｌｅし、このプラスミド｛ｐＥＵ−ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（配列番号４）｝を大腸菌内で増幅した。この後、プラスミドのみを得るためにＧｅｎＥｌｕｔｅ^ＴＭＰｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉｐｒｅＫｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて精製した。この得られたＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏベクターをＳｐｕプライマー、ＡＯＤＡ２３０３プライマーを用いてＰＣＲを行った。

（５）コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産チホコムギ種子及び／又は愛媛県産チクゴイズミコムギ種子を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製：Ｒｏｔｏｒ Ｓｐｅｅｄ Ｍｉｌｌ ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ１４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に粉砕した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。この粗胚芽画分から目視によってコムギ胚芽を判別し、タケ串を用いて選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ：ナカライ・テクトニクス社製）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得た。
コムギ胚芽抽出物含有液の調製は常法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に準じた。以下の操作は４℃で行った。まず液体窒素で凍結したコムギ胚芽を乳鉢中で微粉砕した。得られた粉体１ｇ当たり１ｍｌのＰａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した抽出溶媒（それぞれ）最終濃度として、８０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭ塩化カルシウム、各０．６ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、８ｍＭスレイトール）を加えて、泡が発生しないように注意しながら攪拌した。３０，０００×ｇ、１５分間の遠心によって得られる上清を胚芽抽出液として回収し、予め溶液（それぞれ）最終濃度として４０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐ）７．６）、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、各０．３ｍＭのＬ型アミノ酸２０種類、４ｍＭスレイトールで平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（Ａｍｅｒｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でゲル濾過を行った。このようにして得られたコムギ胚芽抽出物含有液の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が１７０−２５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように調製した。

（６）翻訳鋳型の作成
（１），（２），（３），（４）でクローニングしたＰＣＲ産物をそれぞれ転写鋳型とし，ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った。転写は、それぞれ最終濃度として８０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ，１６ｍＭ酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製），１０ｍＭＤＴＴ，３ｍＭＮＴＰ（和光純薬社製），１Ｕ／μｌ ＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１Ｕ／μｌ Ｒｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ社製），１０％ＰＣＲ産物となるように反応系２５μｌを調製した。この反応液を３７℃で３時間インキュベートし、エタノール沈殿によりｍＲＮＡ｛ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ），ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ，ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ｝を精製した。

（７）コムギ胚芽抽出液による無細胞タンパク質合成系（重層法）によるタンパク質合成
重層法を用いてタンパク質（ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ，ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ）の合成を行った。まず透析外液（それぞれ最終濃度で、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．２５ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、２．５ｍＭスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製））１２５μｌをマイクロタイタープレートへ入れ、該溶液下に、上記（５）で調製されたコムギ胚芽抽出物含有液を最終的な光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が６０になるように加えたタンパク質合成用反応液（それぞれ最終濃度で、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．２５ｍＭＬ型アミノ酸２０種類、２．５ｍＭスレイトール、１．２ｍＭＡＴＰ、０．２５ｍＭＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、４００μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製））２５μｌにて、上記（６）で調製したｍＲＮＡ（ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ，ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ）を懸濁させ、タンパク質合成反応液の界面を乱さないように重層し、２６℃で１８時間インキュベートしタンパク質合成を行った。

（８）コムギ胚芽抽出液による無細胞タンパク質合成系（透析法）によるタンパク質合成
透析法を用いてタンパク質｛ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）｝の合成を行った。透析カップＭＷＣＯ １２０００（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ社製）に（５）で用いたコムギ胚芽抽出物含有液，５０μｌ，マルエム容器に透析外液７００μｌを入れ（コムギ胚芽抽出物含有液、透析外液共に最終濃度は（７）と同等である）タンパク質の基質、エネルギー源となるアミノ酸、ＡＴＰなどを供給しながら２６℃で１日インキュベートしタンパク質合成を行った。

（９）ＳＡＲＳ ３ＣＬ ＰｒｏｔｅａｓｅによるＲＳ配列の切断と活性検出
透析法（８）によって合成したＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）、また、重層法（７）によって^１４Ｃ−ＬｅｕでラベルされたＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ（^１４Ｃ−Ｌｅｕの最終濃度は２０μＣｉ／μｌ）のタンパク質を等量混合し，３７℃で２時間インキュベートした（図１Ａ）。その後，この混合溶液にＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（それぞれ最終濃度で、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１％βメルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．２％ＢＰＢ（ナカライ・テクトニクス社製））を加え、９８℃で５分間熱した後、氷水により急冷した。このサンプルに１２．５％ＳＤＳゲルを用いて２５ｍＡで８０分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＲＩ標識されたタンパク質はイメージングプレート及びＢＡＳ−２５００（フジフィルム社製）により検出を行った（図１Ｂ）。
また、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳを透析法でタンパク質合成した後，等量ずつ混合しＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行い，ダークリーダー（ビーエム機器株式会社製）で蛍光を検出した（図２）。

図１Ｂより、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏは、ＧＦＰとＧＵＳ間のリンカーのｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ｛ＲＳ（ＰＰＱＴＳＩＴＳＡＶＬＱ↓ＳＧＦＲＫＭＡＦＰＳＧＫＶ）｝内で切断したが、ｍｕｔａｎｔであるＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）は切断しなかった。また、蛍光物質であるＧＦＰは切断されると蛍光強度が飛躍的に上昇するという性質があることがわかった。
図２より、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの濃度を上昇させると、ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳの切断された量を示すＧＦＰ蛍光強度が高まることを示した。
これは、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの活性は、ＧＦＰ蛍光強度に比例するので、生理活性タンパク質の活性を阻害する候補薬剤の阻害効果を蛍光強度で測定できることがわかった。

（１０）ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏによるオートリシス活性検出重層法（７）によって^１４Ｃ−ＬｅｕでラベルされたＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ，ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（^１４Ｃ−Ｌｅｕの最終濃度は１２μＣｉ／μｌ）のこれらの合成液１０μｌに３ｘＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを５μｌ混合し（図３Ａ，図４Ａ）、（９）で記載したようにＲＩで標識されたタンパク質の検出（図３Ｂ，図４Ｂ）を行った。ＧＳＴ−ＲＳ−３ＣＬ^ｐｒｏの検出方法として、ＧＳＴ−ＲＳ−３ＣＬ^ｐｒｏは合成開始と共に、時間（分）ごとにサンプリングされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、オートラジオグラフィーをした。また、ＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの検出方法として、２０時間反応後サンプリングされ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，オートラジオグラフィーをした（図４Ｂ）。
重層法によりＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ、およびＧＦＰ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）を合成し，Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥを行い，ダークリーダー（ビーエム機器株式会社製）で蛍光を検出した（図５）。

図３Ｂより、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏが自身のＮ末端に融合されたＧＳＴとのリンカー部分にデザインされたｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ（ＲＳ）で自己切断がおこっていることがわかった。さらに、ＧＳＴ−ＲＳ−ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの合成開始から３０分以内に、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏがＧＳＴとの間にあるＲＳを切断していることがわかる。これは、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏが完全に成熟したタンパク質（ｆｏｌｄｉｎｇの終了）になる前の段階であるフォールディング過程においても、タンパク質の自己消化が起こっていることがわかる。
図４Ｂより、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏが自身のＮ末端に融合されたＧＦＰとのリンカー部分デザインされたｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ（ＲＳ）で自己切断しているだけでなく、本来のｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ（ＲＳ）以外で切断された産物も検出されていることがわかった（図中の矢印）。
図５より、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏは、自身とＧＦＰ間のリンカーのｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ（ＲＳ）内で切断したが、ｍｕｔａｎｔであるＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）は切断しなかった。これは、図１Ｂの結果と併せて、本発明によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系では、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのような生理活性タンパク質をｎａｔｉｖｅかつ活性を維持したまま合成できるがわかった。また，図２と同様に切断されることによりＧＦＰ蛍光強度が高まるため、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの活性は、ＧＦＰ蛍光強度に比例するので、生理活性タンパク質の活性を阻害する候補薬剤の阻害効果を蛍光強度で測定できることがわかった。

上記結果により、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのプロテアーゼ活性のｓｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙがフォールディング過程とフォールディング終了後では異なることがわかった。すなわち、無細胞合成系でのタンパク質合成は、合成が開始されると、フォールディング途中のタンパク質も含まれており、フォールディングが不完全でもプロテアーゼとしての活性を持つが、本来のｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ以外の位置を切断していると考えられる。
すなわち、実際の細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、不完全なフォールディング状態でも正常な切断部位と異なるプロテアーゼ活性を持つ生理活性タンパク質が存在していると考えられている。

ＳＡＲＳプロテアーゼ阻害剤候補物質のスクリーニング
（１）ＳＡＲＳプロテアーゼ及び基質タンパク質の重層法による合成
実施例１（６）に記載したＳＡＲＳプロテアーゼ（ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ）及びその変異体（ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ））、基質ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳの翻訳鋳型を用いて、実施例１（７）に記載した方法に従い、タンパク質合成を行った。ここではコムギ胚芽抽出物含有液の最終的な光学密度（ＯＤ２６０）を１２０、クレアチンキナーゼの終濃度を４０ｎｇ／μｌとした。また、反応液量を上層２０６μｌ、下層２０μｌとし、２６℃で２０時間、合成反応を行なった。

（２）阻害剤候補物質のアッセイ
各阻害剤候補物質Ａ、Ｂは１０％ＤＭＳＯに溶解した。ここで、阻害剤候補物質Ａは、Ａｓｉｎｅｘ社市販の化合物ライブラリーのアクセッションＮｏ．ＡＳＴ６７４８４１５である。阻害剤候補物質Ｂは、低分子化合物である。前項（１）に記載したＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ合成反応液１μｌ、翻訳バッファー（実施例１参照）３μｌ、各候補物質Ａ、Ｂの１０％ＤＭＳＯ溶液（レーン３、レーン４）（コントロールとして１０％ＤＭＳＯ溶液のみ：レーン２）１μｌを混合した。またネガティブコントロールとして、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの替わりにＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）合成反応液１μｌに翻訳反応液３μｌ、１０％ＤＭＳＯ溶液１μｌを混合したもの（レーン５）を用いた。これらを３７℃、１０分間プレインキュベートした後、前項（１）に記載したＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ合成反応液５μｌを添加し、３７℃、１時間反応させた。各反応液を１２．５％ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで解析し、モレキュラーイメージャーＦＸＰｒｏ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＧＦＰの蛍光強度を検出した。

阻害剤候補物質のアッセイ結果を図６に示した。コントロール（レーン２）では、ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳのバンドと共に、ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのプロテアーゼ活性により生じたＧＦＰのバンドが検出された。ネガティブコントロール（レーン５）で用いたプロテアーゼ活性中心部の変異体ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏ（Ｃ１４５Ａ）は、プロテアーゼ活性が低下しているためＧＦＰの生成が著しく低減した。阻害剤候補物質Ａを添加した場合（レーン３）は、ポジティブコントロール（レーン２）と同程度のＧＵＳ、ＧＦＰの生成が認められたことから、この化合物にはＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのプロテアーゼ活性に対する阻害活性がないものと考えられる。阻害剤候補物質Ｂを添加した場合（レーン４）は、ＧＦＰのバンドがポジティブコントロール（レーン２）に比べて薄くなったことから、この化合物がＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏのプロテアーゼ活性に対する阻害活性を有することが示された。なお、レーン１は、ＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳのみの画分である。

上記結果により、本発明のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用する生理活性タンパク質に対する薬剤探索方法によれば、ＳＡＲＳプロテアーゼ活性に対する阻害剤候補物質のスクリーニングを行うことができた。

従来のスクリーニング系では、主にフォールディング終了後の成熟タンパク質を対象としていた系であった。しかし、本発明に係るフォールディング過程のプロテアーゼに対する候補薬剤のスクリーニング系は、従来のスクリーニングでは対象としていなかった系であるので新規かつ有用と考えられる。
さらに、本発明に係るスクリーニング系では、従来の成熟したタンパク質だけでなく、翻訳過程のタンパク質、自己消化反応過程のタンパク質、基質認識反応過程のタンパク質、フォールディング反応過程のタンパク質の構造若しくは機能等についての反応性を候補薬剤としたスクリーニング手段も可能である。

本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号２００３−３１６０８１からの優先権を請求する。

Ａ：ＳＡＲＳプロテアーゼ（３ＣＬ^ｐｒｏ）がＧＦＰ−ＲＳ−ＧＵＳ（基質）を切断する模式図 Ｂ：ＳＡ３ＣＬ^ｐｒｏの活性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図 ＧＦＰ−ＧＵＳの切断前後の蛍光強度の違いを示すＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥの図 Ａ：ＳＡＲＳプロテアーゼ（３ＣＬ^ｐｒｏ）が自身のＮ末端に融合されたＧＳＴとのつなぎ目にデザインされた切断サイトを自己切断する模式図 Ｂ：ＧＳＴ−３ＣＬ^ｐｒｏの合成と共に切断される断片を示すオートラジオグラムの図 Ａ：ＳＡＲＳプロテアーゼ（３ＣＬ^ｐｒｏ）が自身のＮ末端に融合されたＧＦＰを切断する模式図 Ｂ：ＧＦＰ−３ＣＬ^ｐｒｏの合成と共に切断される断片を示すオートラジオグラムの図 自己分解活性阻害による蛍光強度の変化を示す図 阻害剤候補物質による蛍光強度の変化を示す図

Claims (20)

1. 以下の工程の少なくとも３）〜５）を含むコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成手段を使用する生理活性タンパク質に対する薬剤探索方法。
   １）生理活性タンパク質の遺伝子の塩基配列情報をもとにして、該生理活性タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を合成する工程
   ２）１）で合成した遺伝子からｍＲＮＡを合成する工程
   ３）２）で合成されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として又は１）で合成された遺伝子を転写鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて生理活性タンパク質を合成する工程
   ４）候補薬剤をコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系に添加し、生理活性タンパク質に対する候補薬剤の反応性を確認する工程
   ５）該反応性を指標として、当該生理活性タンパク質に対する薬剤をスクリーニングする工程
2. 生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質の自己消化反応性を指標とすることを特徴とする請求項１の薬剤探索方法。
3. 生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質の基質認識反応性を指標とすることを特徴とする請求項１の薬剤探索方法。
4. 生理活性タンパク質に対する反応性の指標が、生理活性タンパク質のフォールディング過程での自己消化又はフォールディングの阻害若しくは停止又はミスフォールディングの誘発を指標とすることを特徴とする請求項１の薬剤探索方法。
5. 生理活性タンパク質に対する候補薬剤の反応性が以下のいずれか１又は２以上から選ばれる請求項１の薬剤探索方法。
   １）転写過程の生理活性タンパク質ｍＲＮＡの合成を阻害又は停止する反応
   ２）生理活性タンパク質の１若しくは２以上の自己消化部位での自己消化を阻害及び／又は拮抗する反応
   ３）生理活性タンパク質の１若しくは２以上の基質認識部位での基質認識を阻害及び／又は拮抗する反応
   ４）翻訳過程の生理活性タンパク質の合成を阻害又は停止する反応
   ５）フォールディング過程の生理活性タンパク質の自己消化又はフォールディングを阻害若しくは停止する反応又はミスフォールディングを誘発する反応
6. 請求項１の３）〜５）又は２）〜５）の工程を、一つの反応系で行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
7. コムギ胚芽抽出液が、胚乳及び低分子合成阻害物質が実質的に除去されたコムギ胚芽抽出物による無細胞タンパク質合成手段である請求項１〜６のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
8. 生理活性タンパク質が、病原体の増殖に関与するタンパク質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
9. 生理活性タンパク質が、プロテアーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
10. 生理活性タンパク質の遺伝子が以下のいずれか１から由来する遺伝子である請求項１〜９のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
    １）二本鎖ＤＮＡウイルス、２）１本鎖ＤＮＡウイルス、３）プラス鎖ＲＮＡウイルス、４）マイナス鎖ＲＮＡウイルス、５）二本鎖ＲＮＡウイルス、６）レトロウイルス、７）ヘパドナウイルス
11. 生理活性タンパク質が以下のいずれか１である請求項１〜１０のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
    １）ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３）ｈｅｌｉｃａｓｅ、４）コートタンパク質、５）キャプシドタンパク質
12. 生理活性タンパク質の遺伝子がＳＡＲＳに由来する請求項１〜１１のいずれか１に記載の薬剤探索方法。
13. 請求項１〜１２のいずれか１に記載の薬剤探索方法で得られる薬剤。
14. 請求項１〜１２のいずれか１に記載の薬剤探索方法に使用される試薬キット。
15. ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
16. 配列番号６〜２１に記載のいずれか１のヌクレオチドを含む請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
17. 請求項１５又は１６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成される、ＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードするＤＮＡ。
18. 請求項１７に記載のＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質をコードする配列番号１に記載のＤＮＡ。
19. 請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを用いて、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞系で合成されたＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質。
20. 請求項１９に記載のプロテアーゼ活性を維持したＳＡＲＳ ３ＣＬ^ｐｒｏタンパク質。

Images