JP2004521627A - 細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するヒトタンパク質、およびCGDDを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、CGDDの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明はまた、これらの配列を利用した癌を含む細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、生殖疾患および自己免疫/炎症性疾患の診断・治療・予防に関する。 本発明はさらに、細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの成長および発達には細胞分化、細胞増殖およびアポトーシスの位置的および経時的調節が必要とされる。これらのプロセスによって生殖、加齢、胚形成、形態形成、器官形成および組織の修復と維持が調和して調節される。細胞レベルでは、成長と発達〈発育〉は、細胞が細胞分裂周期への出入りを決定することによって、また細胞の最終分化状態へのコミットメントによって支配される。これらの決定は細胞が受ける細胞外シグナルや他の環境的きっかけに応答して細胞によって行われる。以下に、細胞分裂、胚形成、細胞分化と増殖、およびアポトーシス並びに、これらの機序の破壊から生じ得る癌のような病態における分子機構に焦点をあてて述べる。
【０００３】
細胞周期
細胞分裂は、すべての生物の成長および増殖にとって基本的なプロセスである。酵母菌や細菌などの単細胞生物では、各細胞分裂により生命体の数が２倍となる。多細胞種では、消耗あるいはプログラムされた細胞死によって失われた細胞を取り替えるため、または新たな組織や器官を作る細胞分化のために細胞分裂が多数回必要とされる。細胞周期の進行は、タンパク質複合体の複雑な相互作用によって支配される。この調節は、細胞外シグナル(例えば、成長因子や他の分裂促進因子)の細胞外信号、および細胞内の合図(例えば、DNA損傷または栄養飢餓)に応答して細胞周期の進行を制御するタンパク質の適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接、間接的に調節する分子は、サイクリン、サイクリン依存性プロテインキナーゼ、成長因子とその受容体、二次メッセンジャー、シグナル伝達タンパク質、腫瘍遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質等の複数のカテゴリーに分類される。
【０００４】
細胞分裂周期の詳細は様々であるが、基本的なプロセスは３つの主要な現象からなる。最初の現象である間期には、細胞分裂、DNAの複製、本質的なタンパク質の作製が含まれる。２番目の現象である有糸分裂では、核物質が分裂して細胞の両側に分離する。最終の現象である細胞質分裂は、細胞質の分裂と核分裂である。細胞周期移行の順序およびタイミングは、種々のチェックポイントで正または負の調節回路によるプロセスを制御する細胞周期調節システムの制御下にある。
【０００５】
有糸分裂は間期の終了のマークを付け、細胞質分裂を開始することで終了される。有糸分裂には４つの段階があり、次の順番で発生する。：前期、中期、後期、終期。前期には双極性紡錘体の形成が含まれる。微小管とダイニンなどの関連するタンパク質から構成されており、極性有糸分裂中心から始まる。中期の間、核物質は凝集し、紡錘体への物理的な付着を助ける動原体線維を発達させる。核物質は紡錘体に沿って反対側の極へ続いて移動するが、それは後期に発生する。終期には、紡錘体と動原体線維が核物質から消滅することが含まれる。有糸分裂は、多数のタンパク質の相互作用に依存する。例えば、CENPA、B、C等の動原体関連のタンパク質は動原体形成及び組み立てにおいて構造的役割を果たしている(Saffery 他(2000) Human Mol. Gen. 9: 175185)。
【０００６】
真核生物細胞周期のM期では、構造的再編成によって娘細胞間で細胞成分の適切な分布が確保される。一般に、間期構造は小さいサブユニットに分解される。核膜が破れて小胞になり、核ラミンは分解される。その後、これらのラミンのリン酸化が生じ、終期まで維持される。終期では核薄膜構造が再構成される。M期のリン酸化(MPP)をコードするのに関与するcDNA群は、U3核小体のリボ核タンパク質(snoRNP)の成分であり、また有糸分裂が完了したら核小体に再限局化する(Westendorf, J.M. 他 (1998) J. Biol. Chem. 9:437-449)。U3 snoRNPはRNAプロセッシングの本質的媒介物である。
【０００７】
有糸分裂のような細胞プロセスの調節に関与するタンパク質にはセロトニン/トレオニンプロテインホスファターゼI型(PP-1)がある。PP-1 は中期から後期への移行に関与する重要なタンパク質の脱リン酸化によって作用する。遺伝子PP1R7 は調節性ポリペプチドのsds22をコードし、少なくとも6個のスプライス変異体を有する(Ceulemans, H. 他 (1999) Eur. J. Biochem. 262:36-42)。Sds22 はPP-1の触媒的サブユニットの活性を調節し、分裂基質のPP-1依存型脱リン酸化を亢進する。
【０００８】
細胞周期調節性タンパク質は細胞増殖および癌において重要な役割を果たす。例えば、細胞周期現象が適切な時期に適切に行われないと、染色体分離不全を起こすことになり、その結果、異数性または倍数性が生じる。このゲノムの不安定性が形質転換細胞の特徴である(Luca, F.C. および Winey, M. (1998) Mol. Biol. Cell. 9:29-46)。最近同定されたタンパク質のmMOB1は酵母MOB1の哺乳動物相同体であり、MOB1は、有糸分裂の完了と倍数性の維持のために必要な必須酵母遺伝子である。哺乳類mMOB1はタンパク質ホスファターゼ2A (PP2A)を含むタンパク質複合体のメンバーであり、そのリン酸化はPP2Aによって調節されると思われる(Moreno, C.S. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:24253-24260)。PP2A は肺癌、大腸癌および白血病を含むヒトの癌の発生に関連している。
【０００９】
細胞周期調節には順に相互作用する多くのタンパク質が関与する。真核生物の細胞周期はいくつかの高度に制御された事象からなり、その事象が正確な順序で起こることによって、正常なDNA複製や細胞分裂が確保される。細胞は後期の事象を初期の事象の正常な完了に依存させることによってこれらの事象の秩序を維持している。この依存性は細胞のチェックポイントと呼ばれる機構によって行われる。更なる細胞周期調節タンパク質の例には、ヒストンジアセチラーゼ(HDAC)がある。HDACは細胞周期調節に関与しており、クロマチン構造を調節する。ヒトHDAC1 はin vitro でヒトHus1 遺伝子産物と相互作用することが発見されており、この遺伝子産物の分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe） 相同体はG2/M チェックポイント制御に関連している(Cai, R.L. 他 (2000) J. Biol. Chem. 275:27909-27916)。
【００１０】
DNA損傷 (G2) とDNA 複製(S期)のチェックポイントではG2/M 移行時に真核生物細胞を停止させる。この停止期に、有糸分裂に入る前のDNAの修復または複製が行われる時間が与えられる。従って、G2/M チェックポイントによって、DNA複製が完了し、また染色体の損傷がない場合にのみ、有糸分裂が発生することが確保される。Schizosaccharomyces pombe のHus1 遺伝子は細胞周期チェックポイント遺伝子であるが、遺伝子のradファミリ(例えば、rad1 とrad9)も細胞周期チェックポイント遺伝子である(Volkmer, E. and Karnitz, L.M. (1999) J. Biol. Chem. 274:567-570; Kostrub C.F. et al. (1998) EMBO J. 17:2055-2066)。これらの遺伝子は有糸分裂のチェックポイントに関与しており、DNAの損傷した時とか、あるいは、複製の妨害物によって誘発される。DNAの損傷または複製妨害が誘発されると、Hus1 遺伝子の機能喪失が生じて、その後細胞死に至る。大部分のrad 遺伝子のヒト相同体が同定されており、これらにはrad3pの相同体であるATM と ATR が含まれる。ATM 遺伝子における突然変異は、重症の先天性疾患の血管拡張性失調症に関連している(Savitsky, K. 他(1995) Science 268:1749-1753)。ヒトHus1タンパク質は rad9と相互作用するrad1タンパク質との複合体で作用し、これをヒト細胞のDNA損傷応答タンパク質複合体の中心的構成成分にする(Volkmer, E. 及び Karnitz, L.M. (1999) J. Biol. Chem. 274:567-570)。
【００１１】
細胞の有糸分裂への出入りは、サイクリンと呼ばれる活性化タンパク質ファミリーが合成されたり、分解されることによって制御される。サイクリンはサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)群への結合と活性化により作用する。それによって、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質がリン酸化され活性化される。サイクリンは長さが約180アミノ酸であり、また「サイクリンボックス」と呼ばれる共有相同性の広い領域により特徴付けられる。(Chapman, D.L及びWolgemuth, D.J. (1993) Development 118:229-40)。さらにサイクリンは、「destruction box〈破壊ボックス〉」と呼ばれる分子のN末端領域で保存された９アミノ酸配列を含む。この配列は、サイクリンＢのユビキチン媒介分解を誘発する認識コードと思われる(Hunt, T. (1991) Nature 349:100-101)。複数のタイプのサイクリンが存在する(Ciechanover, A. (1994) Cell 79:1321)。G1期からS期までの行程はG1サイクリンとその触媒的サブユニット(Cdk2サイクリン A、 Cdk2サイクリンE、Cdk4サイクリンD およびCdk6サイクリンD) によって進められる。G2期からM期までの移行行程は有糸分裂CDK-サイクリン複合体(Cdc2サイクリンA, Cdc2サイクリンB1 およびCdc2サイクリンB2 複合体など) の活性化によって進められる(Yang, J. および Kornbluth, S. (1999) Trends in Cell Biology 9:207210に概説されている)。
【００１２】
サイクリンは、真核細胞とある種の細菌の細胞タンパク質の分解の主な経路であるユビキチン抱合系（ubiquitin conjugation system:UCS）によって分解される。UCSは異常タンパク質の除去を媒介する。また遺伝子の転写と細胞周期の進行等の細胞過程を制御する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。UCSは、有糸分裂サイクリンキナーゼ、腫瘍性タンパク質、癌抑制遺伝子（p53）、ウイルスタンパク質、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写調節因子、および変異タンパク質または損傷タンパク質の分解に関与している（Ciechanover, 前出）。
【００１３】
ユビキチン抱合とタンパク質分解のプロセスは５つの主要なステップで発生する(Jentsch, S. (1992) Annu. Rev. Genet. 26:179-207)。第１番目にATP依存性反応によって、小さな耐熱性タンパク質であるユビキチン(Ub)をユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化する。そしてＥ1の内部のシステイン残基のチオール基にUbのＣ末端を結合する。２番目に、活性化したUbをUb抱合酵素（Ｅ2）のうちの１つに移す。異なるユビキチン依存性タンパク分解経路において、特定の分解シグナルを輸送するタンパク質に誘導する認識サブユニットと関連する構造的に類似しているが異なるユビキチン抱合酵素が利用される。３番目にE2は、C末端グリシンによりユビキチン-タンパク質リガーゼファミリー、Ｅ３のメンバーにUb分子を移す。４番目に、Ｅ３はUb分子を標的タンパク質に移す。さらに、Ub分子を多重Ub鎖構造を形成する標的タンパク質に追加することができる。５番目に、次にユビキチン結合したタンパク質が、大きな多サブユニットタンパク質分解酵素複合体であるプロテアソームによって認識され分解される。そしてUbが放出され再利用される。
【００１４】
Ubは活性化される前に通常、N末端ユビキチンとC末端伸長タンパク質(CEP)からなる融合タンパク質として発現するか、あるいは、頭と尾がくっついたUb単量体を持つポリユビキチンタンパク質として発現する。CEPは多様な調節性タンパク質の特徴を有しており、大部分は高度に塩基性であり、最大３０％のリジンとアルギニン残基を含んでおり、また核酸結合ドメインを持つ(Monia, B.P. 他 (1989) J. Biol. Chem. 264:40934103)。その融合タンパク質は、細胞の翻訳活性とタンパク質分解活性の同時調節、並びに不活性酵素の特定の細胞部位への局在化を媒介すると考えられる重要な中間体である。一旦運ばれると、融合タンパク質はC末端加水分解酵素によって切断され、機能性Ubを放出する(前出のMonia 他)。
【００１５】
Ub抱合酵素（Ｅ2）は、異なるUCS経路の基質特異性に重要である。すべてのＥ２は、UBCドメインと呼ばれるおよそ16kDaの保存されたドメインを有する。このドメインはすべてのＥ２において少なくとも３５%の同一性があり、ユビキチン-酵素チオールエステル形成に必要な中心に位置するシステイン残基を含む(Jentsch、前出)。良く保存されたプロリンリッチエレメントは活性システイン残基のN末端にある。この保存されたドメインを超える構造的変異を用いて、E2酵素を分類する。クラスIのE2は、ほとんどが、保存されたUBCドメインのみから成る。クラスIIのE2には、基質特異性および細胞局在に寄与する多様な関連のないC末端伸長がある。クラスIIIのE2には、酵素調節または基質特異性に関与していると思われる特有のN末端伸長がある。
【００１６】
有糸分裂サイクリン特異性E2 (E2-C)は、保存されたUBCドメイン、他のE2に存在しない30アミノ酸のN末端伸長、およびこの伸長に隣接する７アミノ酸の特有の配列を有すること特徴とする。サイクリンのE2-Cの高親和性と共にこれらの特徴によって、これはE2の新しいクラスとして同定される(Aristarkhov, A. 他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:4294-99)。
【００１７】
ユビキチン-タンパク質リガーゼ(E3)はユビキチン抱合プロセスの最終ステップ、ユビキチンの基質との共有結合に触媒作用を及ぼす。E3はプロセスの特異性の決定に重要な役割を果たす。今までのところ同定されているＥ３はわずかである。E3リガーゼの１つのタイプは、HECT(E6APC末端に相同的)ドメインタンパク質ファミリである。ファミリの１つのメンバ−であるE6AP (E6関連タンパク質)は、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV) E6 腫瘍性タンパク質と共に、p53のユビキチン結合および分解に必要とされる(Scheffner 他(1993) Cell 75:495505)。HECTタンパク質のＣ末端ドメインには、高度に保存されたユビキチン-結合システイン残基が含まれている。様々なHECTタンパク質のＮ末端領域は多様であり、特異的基質認識に関与すると思われる(Huibregtse, J.M 他 (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:36563661)。SCF (Skp1-Cdc53/Cullin-F ボックス受容体) ファミリのタンパク質はユビキチンリガーゼの他のグループを含む(Deshaies, R. (1999) Annu. Rev. Dev. Biol. 15:435-467)。Skp1、 cullinおよびF ボックスドメイン含有タンパク質などの多数のタンパク質は、 SCF複合体に動員される。Fボックスタンパク質はユビキチン化反応の基質と結合し、基質特異性および反応の基質の配向性の決定において役割を果たし得る。Skp1 はFボックスタンパク質とcullin の両方と相互作用し、複合体においてE2酵素からタンパク質基質へのユビキチンの転移のためのFボックスタンパク質とcullinの位置ぎめに関与し得る。SCFリガーゼの基質にはCDK 活性、転写活性、シグナル伝達、動原体の構築およびDNA複製の調節に関与するタンパク質が含まれる。
【００１８】
Sgt1は、Skp1 における突然変異によって生じる動原体機能における欠損を抑制する酵母の遺伝子のスクリーニングで同定された(Kitagawa, K. 他(1999) Mol. Cell 4:21-33)。Sgt1 はSkp1 と相互作用し、またSCF ユビキチンリガーゼと会合する。Sgt1 における欠損によって、細胞周期のG1期か、またはG２期のいずれかで細胞の静止が生じる。酵母Sgt1 ヌル型突然変異体はヒトSgt1によってレスキューされ得ることから、Sgt1機能 が、種の違いを超えて保存されることが示される。Sgt1 は酵母における動原体複合体の構築に必要である。
【００１９】
UCS の異常活性は多数の疾患および障害に関連している。これらには、例えば、悪液質(Llovera, M. 他 (1995) Int. J. Cancer 61: 138141)、癌抑制タンパク質p53の分解（Ciechanover、前出）、およびアルツハイマー病に見られるような神経変性が含まれる(Gregori, L. 他(1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 17311738)。ユビキチン抱合は抗原提示における律速段階であるため、ユビキチン分解経路もまた、免疫応答において決定的な役割を有している(Grant E.P.他 (1995) J. Immunol. 155: 37503758)。
【００２０】
特定の細胞増殖障害は、細胞周期時の進行を通常は制御するタンパク質複合体の変化により同定され得る。主要な治療ストラテジーには、細胞周期調節に関与するタンパク質の操作により細胞周期進行への制御を再確立することが含まれる(Nigg, E.A. (1995) BioEssays 17:471480)。
【００２１】
胚形成
哺乳動物の胚形成は受胎後の発生の最初の二、三週間にわたる過程である。この期間に、胚形成は1個の受精卵から三つの胚性組織に進み、次に、大部分の臓器と外部特徴のすべてを持つ胚形成に進行する。
【００２２】
哺乳動物の胚形成の正常な過程は多数の遺伝子と組織の経時的および位置的調節が正しく行われるかどうかに左右される。これらの調節過程についてマウスを用いて徹底的な研究が行われている。まだ十分に理解されていない重要な過程は、受精後の胚性ゲノムの活性化である。マウスの卵母細胞は成長するにつれて、転写物を蓄積する。この転写物は直接タンパク質に翻訳されるか、あるいは、調節されたポリアデニル化によって後の活性化のために保存される。引き続く減数分裂成熟中と排卵中は母性ゲノムは転写的に不活性であり、大部分の母性転写物は脱アデニル化され、および/あるいは2細胞期にて接合体遺伝子の活性化に先立って、または活性化と共に分解される(Stutz, A. 他 (1998) Genes Dev. 12:2535-2548)。母性から胚性への移行には、胚性ゲノムの活性化である接合子的転写の分解ではなく、卵母細胞の分解が関与し、また初期発生に適応させるための細胞周期の進行の誘発が関与する。
【００２３】
MATER (胚が必要とする母性抗原)は最初は卵巣免疫を有するマウスからの抗体の標的として同定された(Tong, Z-B., 及び Nelson, L.M. (1999) Endocrinology 140:3720-3726)。MATER をコードする遺伝子の発現は卵母細胞に限られており、哺乳動物における既知の限定数の母性作用遺伝子の一つである(Tong, Z-B., 他(2000) Mamm. Genome 11:281-287).。この遺伝子が不活性化されたマウスの予備実験の結果に基づくと、２細胞期より先の胚性発達にMATER タンパク質が必要とされる。1111アミノ酸長のMATER タンパク質はアミノ末端の親水性リピート領域とカルボキシル末端に14ロイシンリッチリピートを含む領域とを含んでいる。これらのリピートはブタリボヌクレアーゼインヒビターに存在する配列に似ており、タンパク質間相互作用に重要である。
【００２４】
減数成熟中および排卵期中の母性転写の分解は排卵直前のリボヌクレアーゼの活性化に関与する。したがって、MATER の機能は母性リボヌクレアーゼに結合して、接合子転写の分解を防ぐことであり得る(Tong (2000) 前出)。卵母細胞の発生と胚形成におけるこの役割に加えて、MATER は自己免疫性卵巣炎マウスの自己抗体の標的となるため、卵巣免疫の病因にも関連し得る(Tong (1999) 前出)。
【００２５】
母性mRNA D7 はアフリカツメガエルにおいて中程度に豊富な転写物である。その発現は卵形成期と早期胚形成期に最も高度であり、おそらく、それらの時期に限られている。D7 タンパク質は卵母細胞には存在せず、最初に卵細胞成熟時に蓄積され始める。そのレベルは胚発生の第1日目に最も高く、その後減少する。D7タンパク質の喪失はそれ自体、成熟過程に影響を与え、卵割胞崩壊の時間経過を大きく遅らせる。このように、D7は、新規に記載された卵母細胞の成熟に関与するタンパク質である(Smith R.C., 他(1988) Genes Dev. 2(10):1296306.)。
【００２６】
多くの他の遺伝子は胚形成のその後の段階に関与している。受精後、卵母細胞は各卵管の遠位末端にある采によって卵管の中、卵管を通過して子宮へと導かれる。子宮内膜に変化が生じて、組織が受精卵の着床および胚発生を助けるように準備される。分裂のいくつかの段階が卵子の分裂の前に発生し、およそ１００個の細胞を有する胚盤胞が子宮に入る。子宮に到達すると、発生中の胚盤胞は通常、子宮の内層である子宮内膜に着床する前に、子宮腔にさらに２日〜４日間留まる。着床は胚盤胞の表面に発生する栄養芽細胞の作用によって生じる。これらの細胞は子宮内膜の細胞を消化し、溶かすタンパク質分解酵素を分泌する。この浸潤性のプロセスはFisher およびDamsky (1993; Semin Cell Biol 4:183188) と、Graham および Lala (1992; Biochem Cell Biol 70:867874)の論文に概説されている。一旦、着床されると、栄養芽細胞や他の下部に存在する細胞は迅速に増殖し、胎盤および妊娠の種々の膜を形成する(See Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, 第８版. W.B. Saunders Company, Philadelphia 915-919ページ)。
【００２７】
胎盤は発育しつつある胎児の保護および胎児に栄養を与える上で重要な役割を有する。大部分の種において、栄養膜合胞体層は胎児と母性の界面にて胎盤の外部に存在する。これは構成要素の栄養芽細胞の融合によって形成された一つの細胞深さの連続的構造である。この栄養膜合胞体層は母性と胎児の交換、胎児発育時の組織再構成、および母性免疫応答から発育中の胎児を保護する上で重要な役割を果たす(Stoye, J.P. 及び Coffin, J.M. (2000) Nature 403:715-717)。
【００２８】
シンシチン と呼ばれる遺伝子はヒト内因性欠損プロウイルスのエンベロープ遺伝子である。シンシチン（syncytin） は胎盤で高度に発現され、精巣ではその発現は比較的弱く、他のどの組織にも検出されない(Mi, S. 他 (2000) Nature 403:785-789)。胎盤においては、シンシチン の発現は栄養膜合胞体層に限られる。レトロウイルスのenv タンパク質はしばしば、細胞融合の促進に関与しているので、シンシチン は栄養芽細胞の栄養膜合胞体層への融合の調節に関与しているかもしれないと考えられていた。実験によって、シンシチンはin vitroで細胞融合を媒介すること、および抗シンシチン抗体が胎盤栄養膜細胞層の融合を阻害できることが実証された(Mi、前出).。さらに、レトロウイルスエンベロープタンパク質内に存在し、またアミノ酸残基373-397でのシンシチンに見られる保存された免疫抑制ドメインは、発育中の胚に対する母性免疫応答の防御に関与している可能性がある。
【００２９】
シンシチンはまた、栄養芽細胞融合と末期的分化を誘発することによって栄養芽細胞の侵襲性の調節に関与している(Mi、前出)。子宮壁への栄養芽細胞の浸潤が不十分な場合、子癇前症、または妊娠性高血圧症のような胎盤障害が生じるが、他方、絨毛癌や他の妊娠性栄養膜疾患においては栄養芽細胞の浸潤の制御が見られない。したがって、シンシチンの機能はこれらの疾患に関与し得る。
【００３０】
細胞分化
他細胞生物は、各細胞はその先天的資質において他の細胞の様であるという事実にもかかわらず構造や機能において劇的に異なる多様な細胞タイプから構成されている。細胞分化は細胞がその構造や生理学的機能において異なってくる過程である。多細胞生物の細胞はすべて、1個の単細胞化した接合子の有糸分裂から生じる。接合子は分化全能性であり、これは、成人体のすべてのタイプの細胞になる能力を有すると言う意味である。発生時に接合子の細胞性子孫はその分化全能性を失い、決定されてくる。一旦、その予想される運命が達成されると、細胞は分化したと言える。この細胞のすべての子孫は同じタイプである。
【００３１】
ヒトの成長および発達には、細胞増殖と調節された細胞死とともに細胞分化の位置的また経時的調節が必要とされる。これらのプロセスによって、生殖、加齢、胚形成、形態形成、器官形成および組織の修復と維持が調和して制御される。細胞分化に関与するプロセスもまた、癌のような病態に関連している。癌の場合は、正常な細胞分化を調節する因子が変化し、癌細胞が低分化または未分化状態で増殖する。
【００３２】
分化の機構には転写および翻訳の細胞特異的調節が関与し、したがって、異なった遺伝子が異なった細胞において異なった時間に選択的に発現される。ショウジョウバエのキイロショウジョウバエを用いた遺伝的実験によって、発生および分化の際にパターン形成を調節する転写因子の制御されたカスケードが同定された。これらにはホメオティック遺伝子があり、これはホメオボックスモチーフを含む転写因子をコードする。ホメオティック遺伝子の産物は、昆虫の成虫原基が未分化細胞の塊からどのようにして複雑な臓器を有する特異的区分に発達するかを決定する。ショウジョウバエの細胞分化および発達に関与することがわかっている多くの遺伝子は哺乳動物の相同体を有する。いくつかのヒト遺伝子はショウジョウバエ相同体と同等の発生的役割を有している。ショウジョバエのeyes absent（eya）遺伝子のヒトの相同体は、鰓弓耳腎（branchio-oto renal）症候群（眼と腎臓に影響する発達異常）の根底にある（Abdelhak, S. 他 (1997) Nat. Genet. 15:157-164）。ショウジョウバエのスリット遺伝子は正中グリア細胞によって発現され、また、正常な神経の発達に必要な分泌性ロイシンリッチリピート含有タンパク質をコードする。
【００３３】
細胞レベルでは、成長および発達は、細胞が細胞周期に入るか、または出るかを決めることによって、また細胞の末期的分化状態へのコミットメントによって左右される。細胞内での示差的遺伝子発現は細胞外シグナルや他の環境的合図に応答して誘発される。このようなシグナルには成長因子や他の分裂促進因子(レチノイン酸のような)、細胞間および細胞と基質間の接触、また栄養的シグナル、毒性物質や熱ショックのような環境因子が含まれる。in vitroで細胞分化を誘発した時の発現パターンの変化によって分化に関与する候補遺伝子を同定できる。
【００３４】
細胞分化の最終段階では、筋肉細胞の収縮性タンパク質、肝細胞の血清タンパク質および赤血球細胞前駆体のグロビンのような特定のタンパク質を産生することを特徴とする特定化を生じる。これらの特定化されたタンパク質の発現は少なくとも一部は細胞特異的転写因子に左右される。例えば、ホモボックス含有転写因子PAX-6 は脊椎動物における早期の眼の決定、眼組織の特定化および正常な眼の発達に必須である。
【００３５】
上皮性分化の場合、成長停止と共に、あるいは成長停止後に分化特異的遺伝子が誘発されるが、これは、不可逆性成長停止を制御する分子的現象に関連すると考えられる。不可逆性成長停止は、細胞が皮膚の基底層から深奥の上基底層に移行し、扁平上皮特異的遺伝子を発現しはじめる時に発生する早期の現象である。これらの遺伝子にはトランスグルタミナーゼIとIII、インボルクリン（involucrin）、loricinおよび小プロリンリッチリピート(SPRR)タンパク質のようなクロスリンクされたエンベロープの形成に関与する遺伝子が含まれる。SPRR タンパク質は分子量が8〜10 キロダルトンのプロリン、グルタミンおよびシステインが豊富なタンパク質であり、類似の反復する配列エレメントを含む。SPRR タンパク質は強い二次構造またはメタロチオネインのような金属結合性タンパク質を有する構造性タンパク質であり得る (Jetten, A. M. 及び Harvat, B. L. (1997) J. Dermatol. 24:711-725; PRINTS Entry PR00021 PRORICH Small proline-rich protein signature.)。
【００３６】
分泌性シグナル伝達分子のWnt 遺伝子ファミリは真核生物細胞全体において高度に保存されている。Wnt ファミリのメンバーは軟骨テンプレート内で軟骨細胞分化の調節に関与している。Wnt5a、Wnt5b および Wnt4 遺伝子はニワトリの肢の軟骨形成領域で発現され、Wnt5a は軟骨膜に発現される(間葉細胞が直に早期軟骨テンプレートを包囲する)。Wnt5a の異常発現によって軟骨細胞の成熟とニワトリの肢の骨の環形成の開始が遅延する(Hartmann, C. 及びTabin, C.J. (2000) Development 127:31413159)。
【００３７】
Glypicans (グリピカン)は細胞増殖の制御と分化において重要な役割を果たす細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンの一つのファミリである。神経系に発現されるヘパラン硫酸プロテオグリカンであるセレブログリカンは発達しつつある神経細胞の運動性態様に関与している (Stipp, C.S. 他 (1994) J. Cell Biol. 124:149-160)。
【００３８】
ノッチはグリア細胞の分化に活性的役割を果たし、また神経細胞のプロセスの長さと組織化に影響する (概説としてはFrisen, J. 及び Lendahl, U. (2001) Bioessays 23:3-7を参照のこと)。ノッチ受容体シグナル伝達経路は多細胞種の多くの臓器や組織の形態形成および発達に重要である。ショウジョウバエフリンジタンパク質は羽成虫原基の背側と腹側の境界でノッチシグナル伝達の活性化を調節する。哺乳動物のフリンジ関連ファミリのメンバーは分節化中に境界の決定に関与する(Johnston, S.H. 他 (1997) Development 124:2245-2254)。
【００３９】
最近、いくつかのタンパク質がLIM ドメインと呼ばれる約６０のアミノ酸残基の保存されたシステインリッチドメインを含むことがわかった(Freyd G. 他 (1990) Nature 344:876879; BaltzR. et al. (1992) Plant Cell 4:14651466)。LIM ドメインには、７つの保存されたシステイン残基と１つのヒスチジンがある。LIM ドメインは二つの亜鉛イオンを結合する (Michelsen J.W. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:44044408)LIM はDNAを結合しないで、むしろ、タンパク質間の相互作用の界面として作用するように考えられる。
【００４０】
アポトーシス
アポトーシスは、不必要な細胞、あるいは欠陥細胞がプログラムされた細胞死を起こすような、遺伝的に制御された過程である。細胞の選択的排除は、形態形成と組織再造形にとって細胞増殖および細胞分化と同様に重要である。アポトーシスが無いと、過形成や、細胞増殖の亢進に関連する他の疾患を生じる。アポトーシスはまた、免疫応答の重要な要素でもある。細胞傷害T細胞やナチュラルキラー細胞のような免疫細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞においてアポトーシスを誘発することによって疾患の蔓延を防ぐ。さらに、自己分子と外来分子を区別できない免疫細胞は自己免疫反応を避けるためにアポトーシスによって排除される必要がある。
【００４１】
アポトーシス細胞は特有の形態学的変化を受ける。アポトーシスの特徴には、細胞収縮、核と細胞質の凝縮および原形質膜トポロジーの変化が含まれる。アポトーシスを起こす細胞は、細胞内カルシウム濃度増加、染色体DNAの断片化、新しい細胞表面成分の発現によって生化学的に特徴づけられる。
【００４２】
アポトーシスの分子機構は高度に保存されており、また主要タンパク質制御因子とアポトーシスの作動体の多くは同定されている。一般に、アポトーシスは細胞内に伝達されるシグナルに応答して進行し、遺伝子発現およびタンパク質活性化のパターンが変わる。ホルモンやサイトカインのようなシグナル伝達分子は細胞表面受容体と相互作用してアポトーシスを刺激したり、抑制したりすることがわかっている。転写因子はまたアポトーシスの開始において重要な役割を果たしている。多くの下流作動体分子、特にプロテアーゼは細胞成分の分解や他のアポトーシス作動体のタンパク質分解活性に関連している。
【００４３】
タンパク質のBcl-2 ファミリーおよび他の細胞質タンパク質はアポトーシスの重要な制御因子である。
３つのサブファミリの中に少なくとも１５個のBcl-2 ファミリメンバーがある。これらのタンパク質は哺乳動物細胞およびウイルスで同定されており、各々が高度に保存されている、四個のBcl-2 相同性ドメイン(BH1 〜BH4)のうち、少なくとも一個を有している。Bcl-2 ファミリタンパク質は、プロ生存サブファミリのメンバーに存在するBH1 ドメインと BH2 ドメインを含んでいる。一方、Bcl-2 に最もよく似ているこれらのタンパク質はすべて四つの保存されたドメインを持っており、多様な細胞傷害的攻撃の後に起こるアポトーシスを抑制することができる。プロ生存（pro-survival）サブファミリのメンバーの例として、哺乳類ではBcl-2、Bcl-xL、 Bcl-w、 Mcl-1および A1 、NF-13(ニワトリ) 、CED-9 (線虫)、またウイルスタンパク質のBHRF1、 LMW5-HL、 ORF16 KS-Bcl-2およびE1B-19Kがある。BH3 ドメインはプロアポトーシスサブファミリタンパク質の機能にとって必須である。2つのプロアポトーシスサブファミリのBax とBH3のうち、Baxには、Bax、 Bakおよび Bok (Mtdとも呼ばれる)が含まれ、BH3にはBik、 Blk、 Hrk、 BNIP3、 BimL、 Bad、 Bid、 および Egl-1 (線虫)が含まれる。Bax サブファミリのメンバーにはBH1, BH2, およびBH3 ドメインが含まれており、Bcl-2 にかなりよく似ている。反対に、BH3 サブファミリのメンバーは9〜16 残基のBH3ドメインのみを持ち、その他の点では、既知のどのタンパク質とも関連しておらず、Bik とBlk のみが配列類似性を共有する。2つのプロアポトーシスサブファミリのタンパク質はプロ生存サブファミリタンパク質のアンタゴニストであり得る。これは線虫で例証され、アポトーシスに必要なEgl-1がCED-9 に結合し、またCED-9 を介して作用する(概説はAdams, J.M. 及びS. Cory (1998) Science 281:1322-1326を参照のこと)。
【００４４】
プロアポトーシスサブファミリタンパク質と抗アポトーシスサブファミリタンパク質との間のヘテロ二量体化は、これらのタンパク質サブファミリの機能に対して力価的効果（titrating effect）があると思われる。これは各々のサブファミリのメンバーの相対的濃度がアポトーシスの制御に作用することを示唆している。ヘテロニ量体化はプロ生存タンパク質に必要ではないが、BH3 サブファミリにおいては重要であり、Baxサブファミリにおいてはそれほど重要でない。
【００４５】
Bcl-2 タンパク質は2つのアイソフォーム、αとβを有しており、選択的スプライシングによって形成される。これはホモ2量体を形成し、またBax およびBak タンパク質とBcl-X アイソフォームBcl-xSと共にヘテロ二量体を形成する。Bax とのヘテロ二量体は完全なBH1 ドメインとBH2 ドメインが必要であり、ヘテロ二量体化がプロ生存活性に必要である。BH4ドメインはプロ生存活性にも関与していると考えられる。Bcl-2 はミトコンドリア膜の内外に存在し、また、核膜内および小胞体内にも存在し、様々な組織において発現する。その濾胞性リンパ腫(II型慢性リンパ性白血球)へのその関与は染色体転座T(14;18) (q32;q21) において見られ、また免疫グロブリン遺伝子領域にも関与する。
【００４６】
Bcl-x タンパク質はアポトーシス細胞死の優性な制御因子である。選択的スプライシングによって、三つのアイソフォーム、Bcl-xB、長いアイソフォームおよび短いアイソフォームが生じる。長いアイソフォームは細胞死抑制体活性を示し、他方、短いアイソフォームはアポトーシスを促進する。Bax とのヘテロ二量体化はプロ生存(抗アポトーシス)活性には必要であるとは思えないが、Bcl-xL はBax と Bakとヘテロ二量体を形成する。Bcl-xS はBcl-2とヘテロ二量体を形成する。Bcl-x はミトコンドリ膜および核周囲膜に存在する。Bcl-xS は分化中のリンパ球や、高い率のターンオーバーを受ける他の細胞において高度に発現される。Bcl-xL は成人脳および他の組織の長く生存した有糸分裂後細胞に存在する。Bcl-2と同様に、BH1ドメイン、 BH2ドメインおよびBH4 ドメインはプロ生存活性化に関与する。
【００４７】
Bcl-w タンパク質は殆どすべての骨髄球性細胞系の細胞質内、多くの組織内に存在しており、脳、大腸および唾液腺において高度に発現する。精巣、肝臓、心臓、胃、骨格筋、および胎盤並びに少しのリンパ球系でのこのタンパク質の発現レベルは低い。Bcl-w はBH1、 BH2および BH4 ドメインを含み、これらのすべてが細胞のプロ生存活性に必要である。Bcl-w 遺伝子機能が相同的組換えによって破壊されたマウスは生存可能で、健常かつ、外見は正常であり、また、成人雌の生殖機能は正常であるが、成人雄は生殖不能である。これらの雄において精子形成の最初の思春期前段階ではあまり影響されず、精巣は正常に発達した。しかし、精細管は無秩序で、多くのアポトーシス細胞が含まれ、成熟精子の産生が不可能であった。このマウスのモデルはヒト男性の生殖不能のいくつかの症例に応用することが可能であり、また、精巣におけるプログラム細胞死の改変が生殖不能の調節に役立ち得ることを示唆する(Print, C.G. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431)。
【００４８】
ラット虚血性脳における研究によって、Bcl-w が非虚血性脳における正常な低い恒常的レベルの発現に比べて過剰発現されていることがわかった。さらに、Bcl-w の作用機序を調べるin vitro 研究によって、単離されたラット脳ミトコンドリアは、Bcl-w が存在する時に、組換えBax を加えることに、あるいは高濃度のカルシウムに応答できないことがわかった。正常応答はミトコンドリアからのチトクロームの遊離であろう。さらに、組換えBcl-w タンパク質は、透過性の変化を示すミトコンドリア膜電位のカルシウム誘発性喪失を抑制することがわかった。これらの発見はともに、Bcl-w は虚血性神経細胞死に対して神経保護剤であり、この保護はミトコンドリア死制御経路を介して行われることを示している(Yan, C. 他(2000) J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:620-630)。
【００４９】
Bcl-2 ファミリの別のメンバーにbfl-1 遺伝子があり、これもまた、アポトーシスのサプレッサー〈抑制因子〉である。Bfl-1 タンパク質は175アミノ酸を有しており、Bcl-2 ファミリメンバー中に存在するBH1、BH2およびBH3 の保存されたドメインを含む。これもまた、グルタミンリッチなNH2末端領域を有しており、他の Bcl-2 ファミリメンバーと異なり、NHドメイン1を欠いている。マウスA1タンパク質はBfl-1 と高い配列相同性を共有し、Bfl-1に存在する３個の保存されたドメインを有する。p53 腫瘍抑制因子タンパク質によって誘発されるアポトーシスはBcl-2、Bcl-xLおよび EBV-BHRF1 作用に似たように、Bfl-1によって抑制される(D'Sa-Eipper, C. 他(1996) Cancer Res. 56:3879-3882)。Bfl-1 は細胞内に存在し、造血部分、つまり、血液、脾臓および骨髄においても最も高度に発現し、肺、小腸および精巣において中等度に発現し、その他の組織においては最も少ない発現が見られる。これはまた、血管平滑筋細胞や造血性悪性腫瘍にも見られる。bfl-1 の発現レベルと胃癌の発症の間の相関関係が注目され、Bfl-1 タンパク質が癌細胞生存促進か、または癌において胃癌の発症に関与することが示唆されている(Choi, S.S. 他 (1995) Oncogene 11:1693-1698)。
【００５０】
癌は持続的あるいは、制御されない細胞増殖を特徴とする。癌によっては、正常のアポトーシス細胞死の抑制と関連している。治療方法には、細胞周期進行における調節の再確立か、または癌細胞におけるアポトーシスの選択的刺激があり得る。癌に対する免疫学的防衛には、腫瘍抑制因子による突然変異細胞におけるアポトーシスの誘発およびT リンパ球による腫瘍抗原の認識がある。分裂促進的ストレスへの応答はしばしば、転写のレベルで制御され、種々の転写因子によって調整される。例えば、脊椎動物の転写因子のRel/NF-カッパ B ファミリは放射線に対する炎症および免疫応答において中心的役割を果たす。NF-カッパBファミリにはp50、 p52、 RelA、 RelB、 cRelおよびその他のDNA結合タンパク質が含まれる。p52 タンパク質はアポトーシスを誘発し、転写因子のc-Junを上方制御し、c-Jun N末端キナーゼ1(JNK1) を活性化する (Sun, L. 他 (1998) Gene 208:157-166)。大部分のNFカッパBタンパク質はDNA結合性のホモ二量体、またはヘテロ二量体を形成する。多くの転写因子の二量体化はbZIP ドメインとして知られている保存された配列によって媒介される。このbZIP ドメインは塩基領域とその後のロイシンジッパーによって特徴付けられる。
【００５１】
Fas/Apo-1 受容体(FAS)は腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリのメンバーである。そのリガンド(Fas リガンド) に結合すると、膜貫通FASは、死シグナルを伝達するいくつかの細胞質タンパク質を補充することによってアポトーシスを誘発する。FAS-結合タンパク質因子１(FAS-associated protein factor 1：FAF1)と呼ぶ、一つのこのようなタンパク質はマウスから単離され、L細胞でのFAF1の発現がFAS誘発性アポトーシスを可能にしたことが実証された(Chu, K. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11894-11898)。引き続いて、FAS結合因子は多数の他の種(ショウジョウバエやウズラ等)から単離された(Frohlich, T. 他(1998) J. Cell Sci. 111:2353-2363)Fasからの死シグナルの伝達において作用する他の細胞質タンパク質はFas結合死ドメインタンパク質であり、これはまたFADD（Fas-associated death domain）とも呼ばれる。FADD は、FAS媒介アポトーシス経路とTNA受容体媒介アポトーシス経路の両方において、カスパーゼ-8を活性化することによって死シグナルを伝達する。
【００５２】
染色体DNAの断片化はアポトーシスの特徴の一つである。DNA断片化因子(DFF)は二つのサブユニットからなるタンパク質であり、これらは、40キロダルトンのDFF40/CADと呼ばれるカスパーゼ活性化ヌクレアーゼとその阻害剤、DFF45/ICAD(45キロダルトン)である。CIDE-A および CIDE-Bと呼ばれる、DFF45/ICADの二つのマウス相同体が最近記述された(Inohara, N. 他 (1998) EMBO J. 17:2526-2533).。CIDE-A だけの発現によってDNA断片化が誘発されるが、哺乳類細胞ではCIDE-A と CIDE-B の発現によって、アポトーシスが活性化される。さらに、FAS媒介によるアポトーシスはCIDE-A と CIDE-Bによって強められ、さらに、これらのタンパク質がアポトーシスを媒介する作動体であることを意味する。
【００５３】
転写因子はアポトーシスの開始において重要な役割を果たしている。多くの下方制御作動体分子、特に、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼのような蛋白分解酵素はアポトーシスの開始および実行段階に関連している。カスパーゼの活性化は、プロ生存関連蛋白質とプロアポトーシスBcl-2関連タンパク質の競合作用によって生じる(Print, C.G. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431)。プロアポトーシスシグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的な細胞のアポトーシス死に導く。2つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機構に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの1つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。
【００５４】
カスパーゼは、不活性酵素前駆体として合成され、この不活性酵素前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される1つの大きな（p20）サブユニットと1つの小さな（p10）サブユニット、および、可変N末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスを高めたりまたは低めたりして影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルは、特異的なアスパラギン酸残基（カスパーゼ1の番号付け規則ではD297）での自己タンパク質分解切断、およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、p10/p20ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーのうちの2つは、その小さなサブユニットを介して相互作用し、触媒の面で活性化した四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。カスパーゼによっては、そのプロドメイン「デスエフェクタードメイン」を含んでいるものもあり、それによって、他のカスパーゼおよび死の受容体（death receptor）に結合するFADDタンパク質あるいはTNF受容体複合体とともに、自己活性化複合体にカスパーゼを補充できる。さらに、異なるカスパーゼファミリーのメンバーからの2つの二量体が結合して、結果として得られる四量体の基質特異性を変えることができる。
【００５５】
腫瘍壊死因子(TNF)と関連するサイトカインはリンパ細胞においてアポトーシスを誘発する(Nagata, S. (1997) Cell 88:355-365に概説されている)。TNFのその受容体への結合によって、シグナル伝達が誘発され、これによってタンパク質分解カスパーゼのカスケード の活性化が生じる。このようなカスパーゼの1つであるICE(インターロイキン-1β変換酵素)は、ICEの自己切断によって生成された2つの大サブユニットと2つの小サブユニットから構成されるシステインプロテアーゼである(Dinarello, C. A. (1994) FASEB J. 8:1314-1325)。ICE は単球において主に発現される。ICEはサイトカイン前駆体であるインターロイキン-1βをその活性形態にし、この活性型は急性・慢性炎症、骨再吸収、骨髄性白血病および他の病理的過程において中心的な役割を果たす。ICEとその関連カスパーゼは、形質移入された細胞系において過剰発現されるとアポトーシスを生じる。
【００５６】
カスパーゼリクルート(動員)ドメイン(CARD)はいくつかのApical カスパーゼのプロドメイン内に存在し、Apaf-2、RAIDDおよびアポトーシスタンパク質(IAP) の細胞阻害剤のようないくつかのアポトーシス調節分子内に保存されている (Hofmann, K. 他(1997) Trends Biochem. Sci. 22:155-157)。アポトーシスのCARDの調節的役割は、Apaf-1 のようなタンパク質がカスパーゼ-9との会合を可能にすることである (Li, P. 他 (1997) Cell 91:479-489)。CARD(ARC)を有するアポトーシスレプレッサーは骨格筋と心筋の両方に発現されるが、それをコードするヒトcDNAが同定され、特徴づけられている。ARCはアポトーシスの阻害剤として作用し、カスパーゼと選択的に相互作用する(Koseki, T. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5156-5160)。これらの相互作用のすべては、アポトーシスの調節に明らかに影響する（Chan および Mattson、前出; Salveson, G.S. および V.M. Dixit (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10964-10967の概説を参照）。
【００５７】
ES18 はマウスT細胞のアポトーシスの潜在的調節因子として同定された(Park, E.J. 他(1999) Nuc. Acid. Res. 27:1524-1530)。ES18 は長さ428のアミノ酸であり、N末端プロリンリッチ領域、酸性グルタミン酸リッチドメインおよび推定LXXLL 核受容体結合モチーフを含んでいる。このタンパク質はリンパ節や胸腺で優先的に発現される。アポトーシスを誘発するデキサメサゾン、スタウロスポリン、またはC2セラミドでの治療に応答して、ES１８の発現レベルはT細胞胸腺腫S49.1において増加する。ES18はT細胞でのアポトーシス細胞死の刺激に関与し得る。
【００５８】
ラットの前立腺腹葉(RVP)はホルモン調節アポトーシスの研究用モデル系である。 RVP 上皮細胞はアンドロゲン欠乏に応答してアポトーシスを起こす。アポトーシスRVPにおいて上方制御されるメッセンジャーRNA(mRNA) 転写物が同定されている(Briehl, M. M. 及びMiesfeld, R. L. (1991) Mol. Endocrinol. 5:1381-1388)。このような転写物の一つは、アポトーシスにおいてその明確な役割がまだ決定されていないRVP.1をコードする。RVP.1のヒト相同体（hRVP1）はラットタンパク質に８９％同一である (Katahira, J. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:26652-26658)。hRVP1 は長さ220のアミノ酸であり、4つの膜貫通ドメインを含む。hRVP1 は肺、腸、および肝臓において高度に発現する。興味深い事に、hRVP1 はヒトや他の動物において下痢の原因物質であるウエルシュ菌(Clostridium perfringens )のエンテロトキシンの低親和性受容体として働く。
【００５９】
サイトカイン媒介アポトーシスは造血および免疫反応において重要な役割を果たす。マクロファージ、好中球、赤血球、およびその他の血液細胞の幹細胞前駆体である骨髄細胞は、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF) とインターロイキン-3(IL-3)のような特定のサイトカインに応答して増殖する。GM-CSF またはIL-3を取り除くと、骨髄細胞はアポトーシスを生じる。マウスのrequiem (req) 遺伝子は、骨髄細胞系FDCP-1 においてこのアポトーシス応答に必要な推定転写因子をコードする(Gabig, T. G. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:29515-29519)。Req タンパク質は長さ371のアミノ酸であり、核局在シグナル、単一Kruppel型亜鉛フィンガーモチーフ、酸性度メインおよび金属結合に関与するシステインとヒスチジン残基に豊富な４つの固有の亜鉛フィンガーモチーフのクラスターを含んでいる。req の発現は骨髄特異的、あるいはアポトーシス特異的ではなく、これは、追加の因子が骨髄細胞アポトーシスにおいてReｑ活性を制御することを示唆する。
【００６０】
アポトーシスの調節不全は多くのヒト疾患の病因における重要因子として最近認識されてきた。例えば、アポトーシスの減少によって生じた細胞の過剰生存は、細胞増殖や免疫反応に関連する疾患に寄与し得る。このような疾患には癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症および炎症が含まれる。反対に、アポトーシスの亢進によって細胞死が過剰になると、エイズ、神経変性疾患および脊髄形成異常症候群のような変性疾患や免疫不全疾患に至ることがある(Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462.)。
【００６１】
アポトーシスの調節障害はまた、アルツハイマー病における神経細胞の喪失とも関連する。アルツハイマー病は老人斑の形成およびアミロイドβペプチドを含む神経原線維変化を特徴とする進行性神経変性疾患である。これらの老人斑は脳の辺縁皮質および連合皮質に見られ、これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核および青斑核が含まれる。B-アミロイドペプチドはアポトーシスを誘発し、神経細胞死を生じるシグナル伝達経路に関与する(Kajkowski, C. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:18748-18756)。アルツハイマー病の早期に、生理学的変化が帯状皮質に見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病患者において、蓄積した斑は辺縁領域の神経細胞構造に損傷を与え、ついには記憶処理を悪化させる。
【００６２】
癌
癌は一般の大きな健康問題であり、現行の予防方法および治療は大部分の患者のニーズに答えていない。癌は持続的あるいは、制御されない細胞増殖を特徴とする。いくつかの癌は、正常のアポトーシス細胞死の抑制と関連している。予知および診断的に重要な分子マーカーの同定は新生物のプロセスの理解に役立つことができる。癌は正常細胞を悪性細胞に形質転換できる腫瘍性タンパク質に関連している。腫瘍性タンパク質の中には正常タンパク質の突然変異アイソフォームのものもあるが、他のものは発現の部位またはレベルに関して異常に発現されるのものである。正常細胞増殖は成長因子が細胞膜のその受容体に結合することから始まり、その結果、シグナル系が活性化され、これによって、核調節因子が活性化されてDNA転写が開始され、引き続き細胞分裂を生じる。細胞周期制御に影響することが知られている腫瘍性タンパク質のクラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナルトランスデューサ、核転写因子および細胞周期制御タンパク質が含まれる。腫瘍抗原および腫瘍サプレッサーのような癌特異的遺伝子マーカーのいくつかのタイプもまた同定されている。
【００６３】
癌遺伝子
腫瘍タンパク質は癌遺伝子と呼ばれる遺伝子によってコードされ、癌遺伝子は、通常は細胞成長や発達を制御する遺伝子から由来する。多くの癌遺伝子が同定され特徴化されている。これらには成長因子(sis等)、受容体(erbA、 erbB、 neuおよび ros等)、細胞内受容体(src、 yes、fps、 abl およびmet等)、タンパク質-セリン/トレオニンキナーゼ(mos と raf等)、 核転写因子(jun, fos, myc, N-myc, myb, ski, および rel等)、細胞周期制御タンパク質(RB および p53等)、変異癌抑制遺伝子( mdm2, Cip1, p16, および cyclin D, ras, set, can, sec, 並びに gag R10等)が含まれる。
【００６４】
ウイルス性癌遺伝子は特定のウイルスによってヒト細胞に感染後ヒトゲノムに組み込まれる。ウイルス癌遺伝子の例にはv-src、v-ablおよび v-fpsがある。正常遺伝子の癌遺伝子への形質転換はまた、染色体の転座によっても生じ得る。慢性骨髄白血病の特徴であるフィラデルフィア染色体と急性リンパ芽球性白血病のサブセットは9番染色体と２２番染色体の間の相互転座から生じ、これは、プロトオンコジーンの切れた部分c-abl が22番染色体上の切断部（Breakpoint）クラスター領域(bcr)に移動する。このハイブリッドc-abl-bcr 遺伝子はチロシンキナーゼ活性を有するキメラタンパク質をコードする。慢性骨髄白血病において、キメラタンパク質は分子量が210ｋｄであるが、急性白血病ではより活性のある180kdのチロシンキナーゼが形成される(Robbins, S.L. 他(1994) Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA)。
【００６５】
低分子量GTP加水分解酵素のRasスーパファミリは広範囲の細胞シグナル伝達経路の調節に関与している。Rasファミリタンパク質はGTPを GDPに加水分解してGTPとGDPを結合する分子切り替えとして作用する膜結合タンパク質である。Ras (RasGAP) のGTP加水分解酵素活性化タンパク質はGTP活性化ファミリのタンパク質(GAP)によって活性化される。中央の保存されたGAP関連ドメインとC末端のプレクストリン相同(PH)ドメインは、RasGAP タンパク質のGAPIサブファミリの特徴である(Allen, M. 他 (1998) Gene 218:17-25)。活性のGTPが結合された状態においてRas ファミリタンパク質は種々の細胞標的と相互作用して下流のシグナル伝達経路を活性化する。例えば、Ras サブファミリのメンバーは受容体チロシンキナーゼ(RTKs)から細胞増殖および分化を制御する一連のセリン/トレオニンキナーゼにシグナルを伝達する上で必須である。活性化されたRas遺伝子は最初にヒト癌において発見され、その後の研究によって細胞が引き続き増殖するか、または最終的に分化されるかが決定される上でRas機能が重要であることが確認された。細胞受容体の刺激によってRasが活性化され、次にRasによって細胞質キナーゼが活性化される。このキナーゼは核に移動し、遺伝子の発現およびタンパク質合成を制御する重要な転写因子を活性化する (Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827, Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-98).GTPに結合するが、GTPを加水分解できない変異体Ras タンパク質は永久的に活性化され、連続的細胞増殖を生じるか、または癌を引き起こす。
【００６６】
結合GDPの解離を触媒し、引き続きGTPの結合を触媒するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によってRas ファミリタンパク質の活性化は触媒される。’最近、発見されたRalGEF様タンパク質はRas とその関連タンパク質Ritの両方と相互作用する。Ritは最もよく知られたRas作動体タンパク質と相互作用できないため、新規の細胞標的はRitの形質転換活性に関わることになるが、Ras同様に恒常的に活性なRitは発癌性形質転換を誘発することができる。RGL3 はRas とRitとの両方と相互作用する、したがって、これらのタンパク質の下流作動体として作用し得る(Shao, H. 及び Andres, D.A. (2000) J. Biol. Chem. 275:26914-26924)。
【００６７】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は表面分子であり、腫瘍細胞では非腫瘍組織と比べて異なる発現をする。腫瘍抗原は正常細胞と免疫学的に異なった腫瘍細胞を作り、ヒト癌の診断に使用できる可能性がある。T細胞急性リンパ芽球性白血病および神経芽細胞腫のような癌細胞に特異的に反応するいくつかのモノクローナル抗体が同定されている(Minegishi 他(1989) Leukemia Res. 13:43-51; Takagi et al. (1995) Int. J. Cancer 61:706-715).。さらに、乳癌でのHER2 遺伝子の高度発現の発見が、治療方法の開発の原因となった(Liu 他 (1992) Oncogene 7: 1027-1032; Kern (1993) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:448-454).腫瘍抗原は細胞表面上で発見され、膜タンパク質あるいは糖タンパク質として特徴付けられている。例えば、MAGE 遺伝子は自己細胞溶解性Tリンパ球によってメラノーマ細胞表面上に認識される腫瘍抗原のファミリをコードする。単離された１２のヒトMAGE 遺伝子のうち、６つは種々の組織学的タイプの腫瘍に異なって発現される(De Plaen 他 (1994) Immunogenetics 40:360-369)。１２のMAGE遺伝子のいづれも精巣と胎盤以外の健全な組織には発現しない。
【００６８】
正常ラット肝臓に比べてラット肝細胞腫細胞で発現が増加することに基づいてTA1（ある腫瘍関連遺伝子）が同定され、クローンされた (Sang, J. 他 (1995) Cancer Res. 55:1152-1159).。導き出されたアミノ酸配列は多数回膜貫通ドメインを含む膜内在性タンパク質をコードする。TA1 は肝臓において胎児性癌発現のパターンを示す。TA1 の転写物はラット胎児肝臓と肝細胞腫に存在するが、正常成人ラット肝臓には存在しない。正常成人ラットにおいてTA1 は、精巣と脳に中等度から高度に発現し、また卵巣、脾臓、乳腺および子宮に低度に発現する。TA1の発現は胎盤に最も多く、これはこの分子の発達的役割を示す(Sang 他、前出)。
【００６９】
ヒト末梢血液リンパ球からクローンされたE16 遺伝子は予測された複数回膜貫通ドメインを有する２４１アミノ酸膜内在性タンパク質をコードする (Gaugitsch, H.W. 他 (1992) J. Biol. Chem. 267:1126773 )。E16 遺伝子の発現は細胞内活性化と分裂に密接に関連している。骨髄系細胞およびリンパ系細胞において、E１６転写物が急速に誘発され、また刺激の後急速に分解される。発現のこのパターンはT細胞系のプロト癌遺伝子とリンホカインに見られる動態と似ている (Gaugitsch 他、前出)。E16の発現は成人脳、肺、肝臓、大腸、食道、胃または腎臓のような正常(非癌性)ヒト組織にも、四ヶ月の胎児脳、肺、肝臓または腎臓にも検出されなかった(Wolf, D.A.他 (1996) Cancer Res. 56:5012-5022; Gaugitsch 他、 前出)。E１６は検査したすべての細胞系において検出された(Gaugitsch 他、 前出）。これが迅速に分裂する細胞系に存在し、増殖力の低いヒト組織に存在しないことはE16 タンパク質が細胞分裂に直接関与していることを示唆する(Gaugitsch 他、 前出)。
【００７０】
ラット TA1とヒト E16 遺伝子によってコードされるタンパク質は95％のアミノ酸配列同一性を共有する (Wolf他、前出)。ヌクレオチドプローブとTA1 および E16の相同的領域に特異的な抗体を種々のヒト癌においてTA1/E16 発現を検出するために作製した。これらのプローブを用いて、大腸、胃および乳房の腺癌とリンパ腫でのTA1/E16 の発現レベルの上昇が検出された。E16はもともとGaugitsch 他(前出)によってリンパ球活性化マーカとして述べられていたが、活性潰瘍性大腸炎（ulerative colitis）およびクローン病患者の組織において有意なレベルのTA1/E16 メッセージは検出されなかった(Wolf 他、前出)。
【００７１】
TA1 と E16タンパク質は 蠕虫のマンソン住血吸虫からの推定アミノ酸透過酵素に有意な相同性を示す(GenBank 407047; 未発表)これらの配列類似性は、腫瘍細胞で上方制御されるアミノ酸または栄養分の取り込みにおけるTA1 とE16 タンパク質の潜在的役割を示唆する（Wolf、他、前出）。
【００７２】
腫瘍サプレッサー
腫瘍サプレッサー遺伝子は、その欠損または不活性化によって細胞増殖の調節解除や、癌の病因や進行に影響を与える遺伝的要素として定義されている。腫瘍サプレッサー遺伝子は通常、ストレスに応答して細胞増殖を制御または阻害するように作用し、また細胞の増殖性寿命を制限するように働く。網膜芽細胞腫(Rb) タンパク質のp53をコードする遺伝子と、乳癌１および２タンパク質 (BRCA1 と BRCA2)を含むいくつかの癌抑制遺伝子が同定されている。これらの遺伝子の突然変異は特定の癌の発症に対する後天性および先天性遺伝的素因と関連している。
【００７３】
p53 の癌の病因における役割は詳しく研究されている(Aggarwal, M. L. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:1-4; Levine, A. (1997) Cell 88:323-331の概説を参照)。ヒトの癌全体の約５０％に p53 遺伝子の突然変異が含まれている。これらの突然変異によって機能的なp53が欠損するか、あるいはより一般的には、p53 の欠陥のある型が過剰発現される。p53はDNA結合に必要な中核ドメインが含まれている転写因子である。ほとんどの癌に関連するp53の突然変異はこのドメインに局在している。正常増殖細胞においては、p53の発現レベルは低く、また、急速に分解される。p53 の発現および活性は、DNAの破損、中途で停止した有糸分裂およびその他のストレス性の刺激に応答して誘発される。これらの場合、ストレスが除去されるまで、p53はアポトーシスか、または細胞増殖停止を誘発する。p53 活性の下流作動体は、アポトーシス特異的タンパク質と細胞周期調節性タンパク質を含んでおり、細胞周期調節性タンパク質にはRb、発癌遺伝子産物、サイクリンおよび細胞周期依存性キナーゼが含まれる。
【００７４】
潜在的癌サプレッサータンパク質をコードする新規な遺伝子のING1がクローンされている(Garkavtsev, I. 他(1996) Nat. Genet. 14:415-420) 。正常細胞系および形質転換細胞系におけるING1 の過剰発現によってin vitroでの成長は阻害される。さらに、アンチセンスING1 の発現は培養細胞の腫瘍性形質転換を促進し、これは軟寒天で増殖できることによって、また免疫不全マウスに注入すると腫瘍を誘発できることから実証される。ING1によってコードされるタンパク質であるp33は核に局在し、また網膜芽細胞腫結合タンパク質2 (RbBP2) および亜鉛フィンガーモチーフに類似性を有する。ある乳癌細胞系においてp33 の発現の減少が観察され、p33のトランケート型が神経芽細胞腫細胞系において高度に発現される。トランケートされたP３３はING1 遺伝子坐のゲノムの再配列から生じる。さらに、若い増殖細胞での発現レベルに比べて、老化した、非増殖細胞である老化細胞では、ING1 RNAとタンパク質のレベルは約10倍増加する(Garkavtsev, I. 及びRiabowol, K. (1997) Mol. Cell Biol. 17:2014-2019.)。これらの観察からp33 が通常は、細胞増殖を阻害し、細胞の寿命を制限するように働くことがわかる。
【００７５】
最近の研究ではp33 は細胞増殖の負の調節においてp53と協力することが示されている。(Garkavtsev, I. 他(1998) Nature 391:295-298.)p53 とp33の機能は 相互依存であり、またP33はP53依存性転写活性を直接調節する。p33 とp53 の間の直接的物理的会合は、P33が細胞周期制御、老化およびアポトーシスにおいてP53の活性に影響を与え得ることを示す同時免疫沈降によって実証されている。
【００７６】
転移抑制遺伝子KAI1 (CD82) が腫瘍抑制遺伝子 p53と関連していることが報告されている。KAI1は、発現が減少している場合、ヒト前立腺癌の進行に関与し、また肺癌および乳癌にも関与している可能性がある。KAI1 は白血球表面糖タンパク質の構造的に固有のファミリのメンバーをコードする。このファミリのメンバーは原形質膜を4回貫通するので、このファミリは４回膜貫通タンパク質ファミリか、または膜貫通４スーパファミリ(TM4SF)のどちらかとして知られている。このファミリは、N末端の膜アンカードメインを有する膜内在性タンパク質から構成されており、N末端の膜アンカードメインは、膜アンカーとタンパク質の生合成時の移動シグナルの両方の機能を果たす。N末端膜アンカードメインは生合成時に切断されない。TM4SFタンパク質は更に三個の膜貫通領域と7個以上の保存されたシステイン残基を有し、サイズが似ており(218 〜 284 残基)、また、すべてが、三つの潜在的N-グリコシル化部位を持つ大きい細胞外親水性ドメインを有する。プロモータ領域には、5個のAP2部位および9個のSpI部位など、 種々の転写因子のための多くの推定結合モチーフが含まれている。KAI1 とTM4SFの7つの他のメンバーとの遺伝子構造の比較では、予測タンパク質の異なった構造のドメインに比べてスプライシング部位は保存されていることが示された。これは、これらの遺伝子が進化的に関連しており、遺伝子複製と分岐進化によって生じたことを示唆している(Levy, S. 他 (1991) J. Biol. Chem. 266:14597-14602; Dong, J.T. 他 (1995) Science 268:884-886; Dong, J.T. 他, (1997) Genomics 41:25-32)。
【００７７】
ロイシンリッチ遺伝子神経膠腫不活性化(LGI1) タンパク質は、受容体および接着タンパク質として機能するいくつかの膜貫通タンパク質および細胞外タンパク質と相同性を共有する。LGI1は LLR (ロイシンリッチ、リピート含有)遺伝子によってコードされ、10q24にマッピングされる。LGI1は、システインリッチ領域と一つの膜貫通ドメインが隣接する4個のLLRを有する（Somerville, R.P., 他 (2000) Mamm. Genome 11:622-627）。LGI1 の発現は主に、神経組織、特に脳に見られる。悪性神経膠腫における軽度から重症度への腫瘍の移行時に生じるLGI1タンパク質の不活性化において、腫瘍サプレッサー活性の喪失が見られる。軽度の脳腫瘍におけるLGI1発現の減少と、悪性神経膠腫におけるLGI1発現の有意な減少または発現の不在は、LGI1がグリア腫瘍進行の診断に用いることができることを示す(Chernova, O.B., 他(1998) Oncogene 17:2873-2881)。
【００７８】
ST13腫瘍サプレッサーは正常粘膜組織のｃDNAと結腸直腸癌組織のmRNA との間のサブトラクティブハイブリダイゼーションによる、結腸直腸癌に関連する因子のスクリーンにおいて同定された (Cao, J. 他 (1997) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123:447-451).。ST13 はヒト結腸直腸癌において下方制御される。 von Hippel-Lindau (VHL) 腫瘍サプレッサー遺伝子での突然変異は網膜と中枢神経系血管芽細胞腫、澄明細胞腎癌およびクロム親和細胞腫に関連している(Hoffman, M. 他 (2001) Hum. Mol. Genet. 10:1019-1027; Kamada, M. (2001) Cancer Res. 61:4184-4189)。腫瘍の進行はVHL 遺伝子の欠損または不活性化に関連している。VHL はトランスフォーミング成長因子α、GLUT-1 グルコース輸送体と血管内皮成長因子の発現を制御する。VHL タンパク質はelongin B、elongin C、Cul2 および Rbx1 と会合して、転写活性化因子低酸素誘発因子(HIF)を制御する複合体を形成する。HIF は血管内皮成長因子や血小板由来成長因子Bのような血管形成に関与する遺伝子を誘発する。VHL の欠損によってHIF 制御が失われると、血管原性ペプチドの過剰産生を生じる。VHL は血管形成の阻害、細胞周期制御、フィブロネクチン基質構築、細胞接着およびタンパク質分解に関与し得る。
【００７９】
腫瘍抑制遺伝子の突然変異は多くの癌における共通の特徴であり、しばしば、腫瘍の病因および進行の重要な段階に影響すると考えられる。したがって、Chang, F. 他(1995; J. Clin. Oncol. 13: 1009-1022) は、この遺伝子または発現されたタンパク質に対する抗体の何れかを、1)癌のリスクの高い患者のスクリーニング、2)従来の方法によって行われる診断を補助するため、3)個々の癌患者の予後の評価に用いることが可能であることを示唆する。さらに、Hamada K 他(1996; Cancer Res. 56:3047-3054) は、子宮頚癌の実験的療法としてアデノウィルスベクターを介する子宮頚癌細胞へのp53の導入の研究を行っている。
【００８０】
PRドメイン遺伝子は最近、ヒト腫瘍形成に関与することが認められている。PRドメイン遺伝子は通常、2つのタンパク質産物、つまり、PRドメインを持つPRプラス産物とPRドメインを持たないPRマイナス産物を産生する。癌細胞において、PRプラス産物は破壊されるか、または過剰発現され、他方、PRマイナス産物は存在するか、または過剰発現される。これらの二つのタンパク質量の不均衡は、悪性腫瘍の重要な原因となると考えられる(Jiang, G.L. 及び Huang, S. (2000) Histol. Histopathol. 15:109-117)。
【００８１】
ヒトにおける腫瘍疾患の多くは、不適切な遺伝子転写によって起こり得る。悪性腫瘍の細胞成長は、腫瘍促進遺伝子の過剰な発現又は腫瘍抑制遺伝子の不十分な発現によって起こり得る（Cleary, M. L. (1992) Cancer Surv. 15 : 89-104）。染色体転座によって、或る遺伝子のコード配列を別の関連のない遺伝子の調節領域と融合させるキメラ座（chimeric loci）が作製され得る。転写調節因子の重要なクラスに亜鉛フィンガータンパク質がある。
Znフィンガーモチーフは亜鉛イオンに結合する。このモチーフは一般に、周期的に配置されたシステイン残基とヒスチジン残基からなる約３０アミノ酸のタンデムリピート群を持つ。この配列パターンの例としては、C2H2タイプ、C4タイプおよびC３H4タイプZnフィンガー、およびPHDドメインが挙げられる (Lewin, 前出; Aasland, R., 他 (1995) Trends Biochem. Sci. 20:56-59)。臨床的に意義のあるZnフィンガータンパク質の一つがWT1であるが、これはウィリムス腫を持つ子供において不活性化されている腫瘍抑制タンパク質である。大細胞リンパ腫で重要な役割を果たすオンコジーンbcl-6もZnフィンガータンパク質である(Papavassiliou, A.G. (1995) N. Engl. J. Med. 332:45-47)。
【００８２】
腫瘍応答性タンパク質
異常増殖とも呼ばれる癌は持続的あるいは、制御されない細胞増殖を特徴とする。癌は三つのカテゴリー、つまり、癌、肉腫および白血病に分けられる。癌は周囲組織に浸透し、転移性腫瘍を生じる軟らかい上皮細胞の悪性の増殖である。肉腫は上皮を起点とするか、または結合組織から生じ得る。白血病は白血球やその前駆体の増殖を特徴とする血液形成組織の進行性悪性腫瘍であり、骨髄性(顆粒球由来または単球由来)、あるいはリンパ性(リンパ球由来)に分類され得る。腫瘍形成はその発端から腫瘍の成長の進行に関わる。悪性細胞は起源となる組織内の正常細胞とよく似ているか、または未分化型(低分化)であり得る。腫瘍細胞はあまり核を有さないか、または一つの大きい多形核を有する。低分化細胞は血管新生化の悪い、組織化の悪い塊内に成長する。分化型新生物細胞は起源の組織と同じタンパク質を分泌し得る。癌は体腔または体表面の直接播種によって、リンパ系伝播、または血行性伝播によって周囲組織に成長、侵潤、侵入し、また破壊する。癌は、公衆の大きな健康問題であり、現行の予防方法および治療は大部分の患者のニーズを満たしていない。腫瘍形成の新生プロセスの理解に、予知および診断的に重要な分子マーカーの同定が役立てられ得る。
【００８３】
現在の癌治療方法に免疫抑制剤の使用がある(Morisaki, T. 他 (2000) Anticancer Res. 20: 3363-3373; Geoerger, B. 他(2001) Cancer Res. 61: 1527-1532)。細胞シグナル伝達に関与するタンパク質、および免疫抑制剤の受容体として作用する特異的タンパク質の同定によって抗癌剤の開発は促進され得る。例えば、イムノフィリンは様々の特異性レベルで免疫抑制薬に結合する、原核生物と真核生物の両方に存在する保存されたタンパク質のファミリである。イムノフィリンタンパク質のこのようなグループの一つはペプチジル-プロリルシス−トランスイソメラーゼ(EC 5.2.1.8) ファミリ(PPIase、rotamase)である。最初にブタの腎皮質から単離されたこれらの酵素は、オリゴペプチドにおけるプロリンイミドペプチド結合のシス-トランス異性化を触媒することによってタンパク質の折り畳みを促進する(Fischer, G. および Schmid, F.X. (1990) Biochemistry 29: 2205-2212)。イムノフィリンファミリに含まれるものはサイクロフィリン(例、ペプチジル-プロリルイソメラーゼA（PPIA）)とFK結合タンパク質(例、FKBP)サブファミリである。サイクロフィリンは、シクロスポリン(サイクロスポリン)によって媒介されるものを含むシグナル伝達活性に関与する多機能性受容体タンパク質である。各ファミリのPPIaseドメインは種と種の間で高度に保存されている。これらの多機能性受容体タンパク質は構造的には異なるけれども、多くのシグナル伝達経路に関与しており、また折り畳みや、情報交換〈輸送〉現象に関与している。
【００８４】
イムノフィリンタンパク質のサイクロフィリンは免疫抑制剤シクロスポリンAに結合する。他のイムノフィリンのFKBPはFK506 (またはラパマイシン)に結合する。ラパマイシンはアポトーシスを誘発する成長のG1 期で細胞停止を生じる免疫抑制剤である。サイクロフィリンのように、このマクロライド抗生物質(放線菌（Streptomyces tsukubaensis）によって産生される)は偏在性の主に細胞質ゾルのイムノフィリン受容体に結合して作用する。これらのイムノフィリン/免疫抑制薬複合体(例えば、サイクロフィリンA/シクロスポリンA(CypA/CsA) およびFKBP12/FK506)はホスファターゼカルシニュリンの阻害によって治療効果を達成するが、ホスファターゼカルシニュリンはＴ細胞活性化に関与するカルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼである(Hamilton, G.S. および Steiner, J.P. (1998) J. Med. Chem. 41: 5119-5143)。マウスfkbp51 遺伝子は胸腺およびＴリンパ球を含む免疫組織において豊富に発現する(Baughman, G. et al. (1995) Molec. Cell. Biol. 15: 4395-4402)。FKBP12/ラパマイシンに誘導された免疫抑制は、正常細胞の成長パターンの維持に必要なラパマイシンのキナーゼ標的であるTOR (酵母) または FRAP (哺乳動物細胞のFKBP12- ラパマイシン結合タンパク質)への結合によって生じる。機能障害性TOR シグナル伝達は様々なヒト疾患に関連しているがこれには癌（Metcalfe, S.M. 他(1997) Oncogene 15: 1635-1642; Emami, S. 他 (2001) FASEB J. 15: 351-361）および自己免疫（Damoiseaux, J.G. 他 (1996) Transplantation 62: 994-1001）が含まれる。
【００８５】
いくつかのサイクロフィリンアイソザイムが同定されており、これにはサイクロフィリンＢ、サイクロフィリンＣ、ミトコンドリア基質サイクロフィリン、細菌細胞質ゾル性およびペリプラズム性PPIaseおよびサイクロフィリン型PPIase ドメインを有するナチュラルキラー細胞サイクロフィリン関連タンパク質(ナチュラルキラー (NK) 細胞の機能に関与する推定腫瘍認識複合体)が同定されている。これらの細胞はウイルス感染細胞または形質転換細胞を溶解することによって生得的細胞免疫応答に関与する。NK細胞は主要な組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスI遺伝子の発現を喪失した細胞(腫瘍形成時に一般的)を特異的に標的とし、これらに腫瘍の成長を弱化する能力を与える。150キロダルトンの分子が、サイクロフィリン/ペプチジル-プロリルシストランスイソメラーゼに高い相同性を有するドメインを持つヒトNK細胞の表面に同定された。このサイクロフィリン型タンパク質はNK腫瘍認識配列(NK-TR) である推定腫瘍認識複合体の構成成分であり得る(Anderson, S.K. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 542-546)。NKTR腫瘍認識配列は、腫瘍細胞と大顆粒状リンパ球( (LGL)との間の認識を媒介する。大顆粒状リンパ球は腫瘍標的の破壊能力を持つ白血球の(活性化細胞毒性Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞で構成される)亜集団であるNKTR遺伝子のタンパク質産物はＬＧＬの表面に存在し、腫瘍標的への結合を促進する。さらに、最近、マウスNktr 遺伝子とプロモータ領域が９番染色体にあることが解った。この遺伝子はNK細胞特異的150キロダルトンタンパク質(NK-TR) をコードする。NK-TRはサイクロフィリンおよびその他の腫瘍応答性タンパク質に相同性を有する(Simons-Evelyn, M. 他(1997) Genomics 40: 94-100)。
【００８６】
腫瘍化組織と相互作用する他のタンパク質には腫瘍壊死因子(TNF)のようなサイトカインが含まれる。サイトカインのTNFファミリはリンパ球やマクロファージによって産生され、形質転換(腫瘍)内皮細胞の溶解を引き起こし得る。内皮タンパク質1 (Edp1) は内皮細胞のTNF-αによって転写的に活性化されたヒト遺伝子として同定されており、TNF-α誘発性Edp1遺伝子がマウスで同定されている(Swift, S. 他 (1998) Biochim. Biophys. Acta 1442: 394-398)。
【００８７】
発現プロファイリング
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロフィールを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロフィールを調べると、組織特異的である遺伝子、毒性試験でテストする物質によって影響される遺伝子、シグナル伝達カスケードの一部である遺伝子、管理的な機能を実行する遺伝子、または特定の遺伝的素因、状態、疾患または障害に特異的に関連する遺伝子を同定するためのプラットホームをアレイは提供する。
【００８８】
新規の、細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質、またそれをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、癌を含む細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、生殖系疾患および自己免疫/炎症性疾患の診断・予防・治療において有用であり、また細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００８９】
本発明は、総称して「CGDD」、個別にはそれぞれ「CGDD-1」、「CGDD-2」、「CGDD-3」「CGDD-4」、「CGDD-5」と「CGDD-6」、「CGDD-7」、「CGDD-8」「CGDD-9」、「CGDD-10」、「CGDD-11」、および「CGDD-12」と呼ぶ精製されたポリペプチドである細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質を提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一性のある天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1-12のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００９０】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:13-24からなる群から選択される。
【００９１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体を提供する。
【００９２】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-12とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００９３】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００９４】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００９５】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００９６】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一の天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００９７】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施例で、組成物は、SEQ ID NO:1-12からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、この組成物を、機能的CGDDの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を要する患者に投与する方法を提供する。
【００９８】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1−12からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−12からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1−12を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1−12からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的CGDDの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００９９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、このような治療を必要とする患者へのこの組成物の投与を含む、機能的CGDDの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１００】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一の天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【０１０１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-12からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【０１０２】
更に本発明は、SEQ ID NO:13-24からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１０３】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（i）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程を含む、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:13-24からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【０１０４】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１０５】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【０１０６】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１０７】
（定義）
用語「CGDD」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたCGDDのアミノ酸配列を指す。
【０１０８】
用語「アゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、CGDD に直接相互作用するか、或いはCGDD が関与する生物学的経路の成分と作用して、CGDD の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１０９】
用語「対立遺伝子変異配列」は、CGDDをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。 また、変異mRNAまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変異することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１１０】
CGDD をコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失、挿入または置換する核酸配列を有し、CGDD と同一またはCGDD の機能的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義には、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCGDDをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なCGDDとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCGDD の活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【０１１１】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【０１１２】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【０１１３】
用語「アンタゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、CGDD に直接相互作用するか、或いはCGDD が関与する生物学的経路の成分と作用して、CGDD の活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１１４】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。CGDD ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【０１１５】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１１６】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroの進化過程（例えば米国特許番号第5,270,163号に記載されたSELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの2'-OH基が2'-Fまたは2'-NH2で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命などの望ましい性質に改善し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照。）
【０１１７】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウィルスに基づくＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡ アプタマーを高レベルで発現させるために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【０１１８】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性のヌクレオチドを含むアプタマーは右旋性ヌクレオチドに作用する天然の酵素による分解に対して耐性がある。
【０１１９】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１２０】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のCGDD、合成のCGDDまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１２１】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」に結合する。
【０１２２】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範囲の任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。CGDD 若しくはCGDD の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることも可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１２３】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）か、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１２４】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
Figure 2004521627
【０１２５】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【０１２６】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１２７】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１２８】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１２９】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１３０】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンがコードされたタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１３１】
用語「断片」は、CGDD またはCGDD をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１３２】
SEQ ID NO:13−24の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:13−24を特定に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:13-24のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:13-24を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:13-24の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:13-24の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１３３】
SEQ ID NO:1-12 のある断片は、SEQ ID NO:13-24のある断片によってコードされる。 SEQ ID NO:1-12 の断片には、SEQ ID NO:1-12を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ ID NO:1-12 の断片は、SEQ ID NO:1-12を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 SEQ ID NO:1-12 の断片及び断片に対応するSEQ ID NO:1-12 の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１３４】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３５】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【０１３６】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１３７】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153及びHiggins, D.G.他 (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されている。ポリヌクレオチド配列のペアワイズアラインメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１３８】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１３９】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４０】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１４１】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１４２】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０１４３】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr-21-2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１４４】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、限定された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４５】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１４６】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１４７】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定できる。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１４８】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１４９】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの高い条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。
或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。特に高ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションでは、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１５０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１５１】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１５２】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１５３】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすCGDD のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なCGDD のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１５４】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１５５】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１５６】
用語「調節」は、CGDDの活性の変化を指す。調節することによって例えば、CGDDのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【０１５７】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１５８】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１５９】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１６０】
CGDD の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CGDDの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１６１】
「プローブ」とは、同一配列、対立遺伝子核酸配列、或いは関連する核酸配列の検出に用いる、CGDDやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１６２】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１６３】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１６４】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１６５】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１６６】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御的免疫応答を誘発するように使用することができる。
【０１６７】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１６８】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１６９】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１７０】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CGDD、CGDDをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１７１】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１７２】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合する他の構成要素の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が無いものを指す。
【０１７３】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１７４】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウエル(穴)、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７５】
「転写イメージ」または「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１７６】
「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自己複製プラスミドとして、或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する、一過性に形質転換された細胞も含まれる。
【０１７７】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物であり、限定するものではないが動植物を含み、生物の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの感染によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro 受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989) 等の参考文献に与えられている。
【０１７８】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と記述され得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１７９】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１８０】
（発明）
本発明は、細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連する新規なヒトタンパク質 (CGDD)と(CGDD)をコードするポリヌクレオチドの発見、また、癌を含む細胞増殖異常、発達疾患、神経疾患、生殖器疾患および自己免疫/炎症性疾患の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１８１】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１８２】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号（GenBank ID NO :）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１８３】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１８４】
表２及び表３は共に、本発明のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質であることを確立している。例えば、SEQ ID NO:3 は、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で決定されるように、残基M1より残基I454まで、ラットRINGフィンガータンパク質terf（GenBank ID g5114353）と45％の同一性がある（表2参照）。BLAST確率スコアは2.2e-102であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3はまた、SPRY、Znフィンガー(C3HC4タイプ、RINGフィンガー）、Bボックス亜鉛フィンガードメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS解析およびPROFILESCAN 解析よりのデータは、SEQ ID NO:3 がRING フィンガー蛋白質である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１８５】
別の例において、SEQ ID NO:5 は ヒトnGAP (GenBank ID g4105589) に残基E14から残基S1159まで59%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:5はまた、Ras様GTP加水分解酵素のGTP加水分解酵素活性化因子タンパク質を有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された(表3参照)。PROFILESCAN 分析からのデータはSEQ ID NO:5 がRas特異的GTP加水分解酵素活性タンパク質であることをさらに実証する証拠を提供する。
【０１８６】
また他の例として、SEQ ID NO:7はラットのセレブログリカン(GenBank ID g440127) と残基Ｍ１から残基R579まで８２％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.4e-260であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:7はまた、１つのグリピカン(glypican)ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）BLIMPS及びMOTIFS 解析よりのデータは、SEQ ID NO:7がグリピカン(glypican)であることをさらに確証する証拠を提供する。
【０１８７】
例えば、SEQ ID NO:9 は、残基M1より残基D448まで、ヒトTRPM-2 遺伝子産物 (GenBank ID g339973) と99％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)で確認された（表２参照）。BLAST確率スコアは3.9e-244であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:9はまた、clusterin ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:9 がclusterinであるという、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:10-12は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:1-12の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１８８】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列、またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列の構築、並びに、例えば、SEQ ID NO:13-24 を同定するか、あるいはSEQ ID NO:13-24 と関連するポリヌクレオチド配列を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片のcDNA配列および/またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１８９】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列2の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である( 実施例５参照 )。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号である。（実施例５を参照。）RefSeq 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、RefSeq 識別子(「NM 」、「NP」または「 NT」と表示された)はGenBank 識別子(すなわち、gBBBBB)の代わりに使われる場合もある。
【０１９０】
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
Figure 2004521627
【０１９１】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１９２】
表５はIncyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列の代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１９３】
本発明はまた、CGDD の変異体も含む。好適なCGDD の変異体は、CGDD の機能的或いは構造的特徴の少なくとも一つを有し、かつCGDD アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１９４】
本発明はまた、CGDDをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、CGDDをコードするSEQ ID NO:13−24からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。配列表に示したSEQ ID NO:13−24のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。
【０１９５】
本発明はまた、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:13−24からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:13−24からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、CGDDの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１９６】
さらに、あるいは別方法において、本発明のポリヌクレオチド変異体はCGDDをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列に有意の配列同一性を有する部分を有し得るが、mRNA プロセッシング時にエキソンの選択的スプライシングから生じた配列ブロックの付加または欠失によりポリヌクレオチドの数はより多くなるか、またはより少なくなる。スプライス変異体は、その全長についてCGDDをコードするポリヌクレオチド配列とのポリヌクレオチド配列相同性が約７０％以下、あるいは約６０％、あるいは約５０％以下であり得るが、そのスプライス変異体のある部分はCGDDをコードするポリヌクレオチド配列のある部分とのポリヌクレオチド配列相同性が少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは１００％になっている。例えば、SEQ ID NO:23 の配列を有するポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:17 の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体であり、またSEQ ID NO:24 の配列を有するポリヌクレオチドはSEQ ID NO:21の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記のスプライス変異体のうち何れかが、CGDDの少なくとも一つの機能的または構造的特徴を含むアミノ酸配列をコードできる。
【０１９７】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の多くに、遺伝暗号の縮重の結果、自然発生する既知の任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のCGDDのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されているとみなす。
【０１９８】
CGDD をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、一般に、適切に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のCGDD のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するCGDD 或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされるアミノ酸配列を変えないで、CGDD 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する他の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期などより好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１９９】
本発明はまた、CGDD 及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。 更に、合成化学を用いてCGDD またはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０２００】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:13-24 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２０１】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。 結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。 （Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０２０２】
部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野に周知のPCR法をベースにした種々の方法でCGDD をコードする核酸配列を伸長してプロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照）。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186。)第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０２０３】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含むランダムプライマーのライブラリは、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２０４】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２０５】
本発明の別の実施例では、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCGDD、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が作られ、またCGDDの発現に利用可能である。
【０２０６】
種々の目的でCGDDをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０２０７】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797、Christians, F.C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術の対象となり、CGDDの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異配列をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指示された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２０８】
別の実施例によれば、CGDD をコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてCGDD 自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ、Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202-204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にCGDDのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを、または、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０２０９】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421などを参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０２１０】
生物学的に活性なCGDDを発現させるために、CGDDをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びCGDDをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメント群は、特長および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、CGDDをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。CGDD をコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【０２１１】
当業者に周知の方法を用いて、CGDDをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, および１6-17章; およびAusubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章、13章および16章を参照)。
【０２１２】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CGDDをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２１３】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（GIBCO BRL）などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。ベクターのマルチクローニング部位にCGDD をコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のCGDDが必要な場合は、CGDDの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０２１４】
酵母の発現系を使用してCGDDを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ） またはピキア酵母（Pichia pastoris ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現されたタンパク質の分泌か、あるいは細胞内での保持かのどちらかを誘導するものであり、宿主ゲノムの中に外来配列群を組み込んで、安定増殖を可能にする(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.を参照)。
【０２１５】
植物系を使用してCGDDを発現することも可能である。CGDD をコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3 : 1671-1680 ; Broglie, R. 他 (1984) Science 224 : 838-843 ; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０２１６】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCGDDをコードする配列を結合し得る。非必須のE1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でCGDDを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:36553659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２１７】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:345-355.を参照)。
【０２１８】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のCGDDの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクター群を用いて、CGDDをコードする配列群を株化細胞群に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、複製エレメントおよび／または内因性の発現エレメントの、ウイルス性のいくつかの起源や、或る選択可能マーカー遺伝子を、同じベクターあるいは別のベクターの上に有し得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２１９】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; ColbereGarapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:114 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(例えば、 Hartman, S.C. 及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:80478051参照。)可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121131等を参照)。
【０２２０】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CGDD をコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CGDD をコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCGDDをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２２１】
一般に、CGDDをコードする核酸配列を含み、CGDDを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。 これらの方法には、DNA−DNAあるいはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸あるいはタンパク質の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２２】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてCGDDの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。CGDD上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０２２３】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CGDD をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、CGDDをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２２４】
CGDD をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。CGDDをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCGDDの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２２５】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択し得る。
【０２２６】
本発明の別の実施例では、CGDDをコードする天然の核酸配列、変更された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識され得る異種部分を含むキメラCGDD タンパク質によって、CGDD 活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを容易に行える。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、CGDDをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、CGDD が精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２２７】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCGDD の合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２２８】
本発明のCGDDまたはその断片を用いて、CGDDに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、CGDDへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２２９】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのCGDDの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、化合物は、CGDD が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてCGDDを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。次に、CGDDを発現する細胞またはCGDDを含む細胞膜分画を試験化合物と接触させ、CGDDまたは化合物の何れかの結合、または活性の刺激または阻害を分析する。
【０２３０】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたCGDDと混合させるステップと、CGDDとこの化合物との結合を検出するステップを含む場合がある。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２３１】
本発明のCGDDまたはその断片を用いて、CGDDの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。ある実施態様では、CGDDの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をCGDDと混合し、試験化合物の存在下でCGDDの活性を試験化合物不在下でのCGDDの活性と比較する。試験化合物の存在下でのCGDDの活性の変化は、CGDDの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をCGDDの活性に適した条件下でCGDDを含むin vitroまたは無細胞再構成系と混合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、CGDD の活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２３２】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、CGDDまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊された目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２３３】
CGDD をコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０２３４】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、CGDDをコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばCGDDを乳汁内に分泌するなどCGDDを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２３５】
（治療）
CGDDの領域と細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質の領域との間に、化学的類似性と、配列及びモチーフ等の構造的類似性が存在する。また、CGDD を発現する組織の数例は、表６を見られたい。このように、CGDD は、癌を含む細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、生殖疾患および自己免疫/炎症性疾患において或る役割を果たすと考えられる。CGDDの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を低下させることが望ましい。CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２３６】
従って、或る実施例において、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCGDDまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann -Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangio -blastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症が含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromo -cytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ、また自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。
【０２３７】
別の実施例では、CGDDまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCGDDの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３８】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたCGDDを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２３９】
更に別の実施例では、CGDDの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCGDDの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２４０】
更なる実施例では、CGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCGDDのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した癌を含む細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、生殖疾患および自己免疫/炎症性疾患が含まれる。一実施態様では、CGDD と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはCGDD を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２４１】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CGDDをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２４２】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２４３】
CGDD のアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたCGDD を用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、CGDD と特異結合するものを同定することが可能である。CGDDの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体(例えば、ラクダまたはラマ)は有力な酵素阻害剤であり、またペプチドミメティックの設計および免疫吸着剤やバイオセンサーの開発に利点があるであろう(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２４４】
抗体の産生の場合は、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、CGDD または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２４５】
CGDD に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。CGDD アミノ酸の短い区間は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２４６】
CGDDに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他. (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２４７】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:68516855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、CGDD特異的一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２４８】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２４９】
CGDDのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２５０】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、CGDD とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性CGDDエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２５１】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、CGDDに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でCGDD抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のCGDDエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、CGDDに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のCGDDエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、CGDD抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、CGDDが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０２５２】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CGDD抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２５３】
本発明の別の実施例では、CGDDをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、CGDDをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、CGDDをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。(Agrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照。)
【０２５４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296.等を参照）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照）。
【０２５５】
本発明の別の実施例では、CGDDをコードするポリヌクレオチドを体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. ら (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. ら (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. ら (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosomacruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。CGDDの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCGDDを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２５６】
本発明の更なる実施例では、CGDDの欠損による疾患や異常症を、CGDDをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってCGDD欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A. および W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. および H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。
【０２５７】
CGDDの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。CGDDを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するCGDDをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２５８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２５９】
本発明の別の実施例では、CGDDの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でCGDD をコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２６０】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDD の発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にCGDD をコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２６１】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDD の発現に関連する１つあるいは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にCGDD をコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターの使用は、HSV親和性の中枢神経細胞にCGDDを導入する際に特に有用である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27、およびICP22を欠失した組換えHSV系統の、作製および使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２６２】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてCGDD をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは、完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、CGDDをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCGDDをコードするRNAが産生され、高いレベルでCGDDが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にCGDDを導入することできる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２６３】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177頁等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２６４】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、CGDDをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２６５】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２６６】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、CGDDをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２６７】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を加えることでできる。
【０２６８】
本発明の更なる実施例は、CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、CGDDの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６９】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。CGDDをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、CGDDをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe ）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２７０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466.等を参照）。
【０２７１】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２７２】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、CGDD、CGDDの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはCGDDのインヒビターなどからなる。
【０２７３】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２７４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２７５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２７６】
CGDD またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。或いは、CGDDまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系で、脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２７７】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２７８】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（たとえばCGDDまたはその断片、CGDDの抗体、CGDDのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）量を意味する。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２７９】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２８０】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２８１】
（診断）
別の実施例では、CGDD に特異的に結合する抗体が、CGDD の発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはCGDD やCGDD のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。CGDD の診断アッセイには、抗体および標識を用いてヒトの体液あるいは細胞や組織から採取されたものからCGDD を検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２８２】
CGDDを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCGDDの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なCGDD の発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とCGDD に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのCGDDの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２８３】
本発明の別の実施例によれば、CGDDをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るCGDD を発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、CGDD の存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のCGDD 値の調節を監視する。
【０２８４】
一実施形態では、CGDD または近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、CGDD をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、そのプローブがCGDDをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列をコードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２８５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CGDD をコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:13−24の配列、或いはCGDD遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２８６】
CGDD をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、CGDD 及びCGDD 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２８７】
CGDD をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CGDD の発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、神経系疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症が含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ、また自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。CGDDをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ELISA式アッセイ、及び変異CGDD の発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２８８】
ある実施態様では、CGDDをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CGDD をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCGDDをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２８９】
+CGDDの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、CGDDをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２９０】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２９１】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２９２】
CGDD をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはCGDDをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCGDDをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２９３】
或る実施態様において、CGDD をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。SSCPでは、CGDD をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２９４】
SNPはヒト疾患の遺伝的根拠の研究に用いられ得る。例えば、少なくとも16個の一般のSNPは非インスリン依存型真性糖尿病に関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌形赤血球貧血または慢性肉芽腫症のような一遺伝子性疾患における疾患の現れ方の相違を調べるために有用である。例えば、マンノース結合レクチン（MBL2）での変異体は、嚢胞性線維症の肺での有害な現れ方と相関することがわかっている。SNPにはまた薬理ゲノミックスで有用性がある。薬理ゲノミックスは、生命にかかわる毒性のように、ある薬剤への患者の応答に影響する遺伝的変異体を同定する。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の発生率が高くなるが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換え体や選択および集団や遊走の起源の追跡について調べるために有用である。(Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. and Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641.)
【０２９５】
CGDDの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）及び標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229236を参照。)目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２９６】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２９７】
別の実施例では、CGDD、CGDDの断片、CGDDに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２９８】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Seilhamer 他、米国特許第5,840,484号の「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。これらを引用することを以って本明細書の一部とする）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２９９】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３００】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを示す、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化することに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０３０１】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０３０２】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理された、または未処理の生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３０３】
プロテオームのプロファイルは、CGDD に特異的な抗体を用いてCGDD発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３０４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０３０５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３０６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３０７】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays:A Practical Approach, M. Schena, 編集 (1999) Oxford University Press, Londonに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０３０８】
本発明の別の実施例ではまた、CGDDをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(例えば、 Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149154を参照。)一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関するような遺伝子連鎖地図を作製できる。(例えば、 Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照。)
【０３０９】
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のHeinz-Ulrich, 他 (1995) in Meyers, 965-968頁等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のCGDDをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３１０】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニング、またはその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０３１１】
本発明の別の実施例では、CGDD、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。CGDDと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３１２】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照。)この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、CGDD、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したCGDD を検出する。 精製したCGDD はまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３１３】
別の実施例では、CGDD と特異結合可能な中和抗体がCGDD との結合について試験用化合物競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、CGDDと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３１４】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、CGDDをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０３１５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３１６】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第60/268.111号、同第60/271.175号、同第60/274.552号、および同第60/274.503号に言及することをもって本明細書の一部とする。
【実施例】
【０３１７】
１ cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Life Technologies）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３１８】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３１９】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズの選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に結合させた。 好適なプラスミドは例えば、PBLUESCRIPT プラスミド (Stratagene)、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド(Stratagene)、 PCR2-TOPOTA (Invitrogen)、 PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)または pINCY (Incyte Genomics)、あるいはその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０３２０】
２ cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３２１】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３２２】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３２３】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMARTのようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースに対して問い合わせた(Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)。（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。Eddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照。）問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いて構築し、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基のいづれかで開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース、およびSMARTのようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、並べた配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０３２４】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０３２５】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群との構築と分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:13-24のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３２６】
４ ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
推定上の細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定した。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. および S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94 及びBurge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の中で、どの配列が細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質について問合せて解析した。また、潜在的な細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質も、細胞増殖、細胞分化および細胞死に関連するタンパク質として注釈が付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列を構築して得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３２７】
5 cDNA 配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（ Stiched Sequence ）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と変異配列群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０３２８】
ストレッチ配列（ Stretched Sequence ）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３２９】
６ CGDD をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:13-24を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:13-24と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続的配列およびオーバーラップした配列のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前にマッピングされていたかを確認した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３３０】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する。）cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３３１】
この方法で、SEQ ID NO:15は、242.50〜258.70センチモルガンの間隔内で1番染色体にマッピングされた。SEQ ID NO:20 は、180.8センチモルガンからq末端までの間以内で７番染色体にマッピングされた。
【０３３２】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０３３３】
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３３４】
【数１】
Figure 2004521627
【０３３５】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の正規化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３３６】
或いは、CGDD をコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いて構築される（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリーすなわち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、CGDDをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３３７】
８ CGDD をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３３８】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３３９】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２ +と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。 ステップ6: 68℃、5 分、ステップ7: 4℃で保存する。
【０３４０】
各ウェルのDNA濃度は、１× TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するためにプレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３４１】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。+ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。T4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いて伸長させたクローンをpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３４２】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。 ステップ6: 72℃, 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３４３】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５'調節配列を得る。
【０３４４】
９ CGDD がコードするポリヌクレオチドの SNP( 一塩基多型 ) の識別
一塩基多型(SNP)として知られる一般のDNA配列変異体をLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:13-24 で同定した。実施例３に述べるように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにして構築し、これによって遺伝子のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。予備フィルターによって大部分のベースコールエラーが除去され、最小限のPhred クオリティスコア15を要求することにより、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍に最初のクロマトグラムファイルが解析された。クローンのエラーフィルタは統計的に作成されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。エラーフィルターのクラスター化では、統計的に作成されたアルゴリズムを用いて近接の相同体または偽遺伝子のクラスター化、または非ヒト配列による汚染により生じたエラーを同定した。最後のフィルターによって複製と、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在するSNPが除去された。
【０３４５】
高速処理MASSARRAY システム(Sequenom, Inc.) を用いて質量分析によってさらに特徴付けるために特定のSNPを選択して、四つの異なったヒト母集団中のSNP部位における対立遺伝子発生頻度を分析した。白人母集団は、ユタ州から83人、フランス人4人、ベネズエラ３人およびアーミッシュ派の人２人を含む92人で構成された。アフリカ人母集団はすべてアメリカ黒人である194人( 男性97人、 女性97人)からなる。ラテンアメリカ人母集団はすべてメキシコ系ラテンアメリカ人である324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア人母集団は126人(男性64人、女性62人)からなり、その内訳は中国人43%、日本人31%、韓国人13%、ベトナム人5%およびその他のアジア人8%と報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質変化を示さなかったSNPは他の三つの母集団においてはさらに検査しなかった。
【０３４６】
１０ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ ID NO:13-24から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新技術のソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Pharmacia Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のエンドヌクレアーゼのいずれか１つで消化したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３４７】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３４８】
１１ マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に既知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. 他 (1995) Science 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照）。
【０３４９】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザ脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調整および使用について、以下に詳述する。
【０３５０】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1X 第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害剤、５００μMのdATP、５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、２００ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３５１】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群により、ベクター含有細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製する。
【０３５２】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、０.１％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理中および処理後に多量の蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３５３】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許を引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３５４】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３５５】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100％に保持する。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３５６】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起用には４８８nm、Cy５の励起用には６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ（Coherent, Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３５７】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３５８】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３５９】
光電子増倍管の出力は、IBM互換性PCコンピュータにインストールされた１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲への直線的２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３６０】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３６１】
１２ 相補的ポリヌクレオチド
CGDDをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のCGDDの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びCGDDのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCGDDをコードする転写物に結合するのを阻害する。
１３ CGDD の発現
CGDD の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でCGDD が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしてはlacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCGDD を発現する。真核細胞でのCGDD の発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、CGDD をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力な多角体プロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスに更に遺伝的な修飾を加える必要がある。（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３６２】
殆どの発現系では、CGDD が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26キロダルトンの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でCGDD からタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したCGDD を直接用いて以下の実施例１７、及び１８のアッセイを行うことができる。
【０３６３】
１４ 機能的アッセイ
CGDD 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルのCGDD をコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを高度に発現させる強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択ベクターには、PCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象には、プロピジウムヨウ化物を用いたDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内タンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３６４】
遺伝子発現におけるCGDD の影響は、CGDD をコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかまたはCD64(DYNAL. Lake Success. NY)に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて効率的に分離することができる。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。CGDD および目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３６５】
１５ CGDD 特異的抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたCGDD を用いて、標準的なプロトコルで動物(例えば、ウサギ、マウス等)を免疫化して抗体を作り出す。
【０３６６】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてCGDD アミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者に周知の方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択方法については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章等を参照）。
【０３６７】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、FMOC ケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。例えば、ペプチドまたはCGDD を基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させて、得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗CGDD 活性を検査する。
【０３６８】
１６ 特異的抗体を用いた天然 CGDD の精製
天然CGDD 或いは組換えCGDD を、CGDD に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマトグラフィー用レジンに抗CGDD 抗体を共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３６９】
CGDD を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CGDD を優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とDMEとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、DMEを回収する。
【０３７０】
１７ CGDD と相互作用する分子の同定
CGDDまたは生物学的に活性であるCGDD断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えば Bolton A.E.およびW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。マルチウェルプレートのウエルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCGDDと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたCGDD複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なCGDD 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したCGDD の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３７１】
別法では、CGDD と相互作用する分子を、Fields, S.およびO. Song（1989, Nature 340:245-246）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）やMATCHMAKERシステム（Clontech）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３７２】
CGDD はまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３７３】
１８ CGDD 活性の実証
CGDD活性は、CGDDが哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルで発現する場合の最終分化、アポトーシス、または細胞周期の進行の誘発を測定することによって実証される。 ｃDNAを高度に発現させる強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにｃDNAをサブクローニングする。選り抜きのベクターには、pCMV SPORT（Life Technologies, Gaithersburg, MD）及びpCR 3.1（Invitrogen, Carlsbad CA）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μgの組換えベクターをヒト細胞株、好ましくは内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が得られる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。選り抜きの標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech, Palo Alto CA）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞の生理的状態を評価する。FCMは、細胞周期進行、細胞死または最終分化に先行して、或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して定量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物を用いたDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の上方または下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３７４】
あるいは、CGDD 活性のin vitro 試験では、アンチセンスCGDD RNAを過剰発現している正常ヒト線維芽細胞の形質転換を測定する。(Garkavtsev, I. 及びRiabowol, K. (1997) Mol. Cell Biol. 17:2014-2019)アンチセンスCGDD RNAを発現させるために、CGDDをコードするcDNA をPLNCX レトロウイスルベクターにサブクローンする。結果として得た構成物を、エコトロピックBOSC23 ウイルスパケージング細胞系に形質移入する。BOSC23培養上澄に含まれるウイルスを用いてアンホトロピック(両栄養性性)CAK8 ウイルスパッケージング細胞系に感染させる。CAK8 培養上澄に含まれるウイルスを用いて正常ヒト線維芽細胞(Hs68) を感染させる。感染細胞を次の形質転換細胞の定量化できる特徴的性質について評価する。すなわち、免疫不全マウスに注入された場合の接触阻害の喪失に関連する培養中の高密度増殖、懸濁液中または軟寒天での増殖、コロニーまたは集塊の形成、血清必要条件の低下、および腫瘍誘発能について評価する。CGDDの活性はHs68 細胞の形質転換の程度に比例する。
【０３７５】
あるいは、CGDDをコードする真核生物発現ベクターで細胞を形質転換することによって、CGDDは哺乳動物細胞系において発現される。真核生物発現ベクターは市販されており、細胞にそれらを導入する技術は当業者に周知である。CGDDの細胞内局在化を試験するには、細胞をJiang H. P. 他が記載しているように分画する(1992; Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7856-7860)。つまり、低速度遠心分離によってペレットにされた細胞をバッファー(10 mM TRIS-塩酸（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、5 mM EDTA (10 ug/ml アプロチニン含有)、 10 ug/ml ロイペプチン、10 ug/ml ペプスタチンA、 0.2 mM フェニルメチルスルホニルフルオライド) に再懸濁して、ホモジナイズする。ホモジネートを600 × g で5分間遠心分離する。上澄を100,000 × g で60分間の超遠心分離にかけて粒状物と細胞質ゾル分画とを分離する。 600 × g ペレットをスクロース溶液(0.25 M スクロース、10 mM TRIS-HCl（pH 7.4）、2 mM MgCl2)に再懸濁して、核分画を得て、600 × gで遠心分離する。各分画の等量のタンパク質をSDS/10% ポリアクリルアミドゲルにかけて、膜にブロットする。CGDD 抗血清を用いてウエスターンブロット分析を行う。CGDDの局在化は他の分画での強度と比較した核分画の対応するバンドの強度によって算定する。あるいは、CGDDに特異的な蛍光抗体を用いて蛍光顕微鏡によって細胞分画内でのCGDDの存在を調べる。
【０３７６】
あるいは、CGDD活性はin vitro 結合アッセイにおいて、CGDD の会合したRasスーパファミリタンパク質との相互作用する能力として実証され得る。候補Rasスーパファミリタンパク質はグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-セファロース上にアフィニティ・クロマトグラフィによって精製される。Rasスーパファミリタンパク質は、20 mMの Tris バッファー（pH8.0）(100 mM NaCl、2 mM EDTA、 5 mM MgCl2、 0.2 mM DTT、 100 μM AMP-PNP および10 μM GDP を含む)で30℃にて20分間インキュベートして、GDPとともに負荷する。CGDDはバキュロウイルス系のFLAG融合タンパク質として発現される。CGDD-FLAG 融合タンパク質を含むこれらのバキュロウイルス細胞の抽出物はGSTビーズで前処理し、次にGST-Rasスーパファミリ融合タンパク質と共にインキュベートする。形成された複合体をグルタチオン-セファロースによって沈澱させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。この分離されたタンパク質をニトロセルロース膜にブロットし、市販の抗FLAG抗体でプローブする。CGDD活性は複合体中に検出されたCGDD-FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０３７７】
あるいは、Li および Cohen (Li, L. and S.N. Cohen (1995) Cell 85:319-329)が実証したように、CGDDの腫瘍形成抑制能は、遺伝子の5' 末端に対するアンチセンス配列を設計し、この配列を転写するベクターでNIH 3T3 細胞を形質移入することによって測定できる。内因性遺伝子を抑制すると、形質転換線維芽細胞は、ヌードマウスに導入された場合に、転移性腫瘍形成能のある細胞の塊を産生することができるであろう。
【０３７８】
あるいは、CGDD活性の試験は母性転写の分解に対する注入されたCGDDの効果を測定する。スイス白子マウスからの卵母細胞採取、注入、および培養の方法はStutz(前出)の記述のとおりである。対照の卵母細胞に比べると母性RNAの分解における減少はCGDD活性を示している。別法においては、CGDD活性は、実施例１７に述べるアッセイによって測定されるように、精製CGDDのRNAseへの結合能として測定される。
【０３７９】
あるいは、CGDD活性試験ではMi〈前出〉にて記述されている二つの成分融合アッセイを用いて、CGDD発現プラスミドで形質移入されたCOS細胞における合胞体形成を測定する。このアッセイはヒトインターロイキン12 (IL-12) が分子量35 kD (p35) と40 kD (p40)のサブユニットからなるヘテロ二量体であることを利用する。p35 の遺伝子を保有する発現プラスミドで形質移入されたCOS細胞は、p40 遺伝子とCGDD遺伝子を保有する発現プラスミドで同時形質移入されたCOS細胞と混合される。生じた条件の培養液におけるIL-12 活性度はこの試験法におけるCGDDの活性に相当する。融合細胞形成はまた、光学顕微鏡によって測定され得る(前出のMi 、他 )。
【０３８０】
CGDD 活性試験の別のアッセイでは、スイスマウスの3T3細胞における新規に開始されたDNA合成の量として細胞増殖を測定する。当分野で公知の方法を用いて、CGDD をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3培養細胞に形質移入する。一過性に形質移入された細胞を、次に、[3H]チミジンまたは[α32P]ATPのような放射性DNA前駆体の存在下でインキュベートする。適用可能な場合には、様々な量のCGDD リガンドが形質移入された細胞に加えられる。酸沈澱性DNAへの［3H］チミジンの取り込みを、適切な時間間隔で測定する。また、その取り込み量は新規に合成されたDNAの量とCGDD 活性に直接比例する。
【０３８１】
あるいは、CGDD 活性をサイクリンユビキチンライゲーションアッセイにより測定する(Townsley, F. M. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:23622367)。反応生成物は、10 μlの容量中に、40 mMのTris HCl (pH 7.6)、5 mMのMg Cl2、0.5 mMのATP、10 mMのホスホクレアチン、50 μgのクレアチン・ホスホキナーゼ／ｍｌ、1 mg 還元したカルボキシメチル化ウシ血清アルブミン/ml、50 μM ユビキチン、1 μMのユビキチンアルデヒド、1〜2 pmol 125I-標識化サイクリンB、1 pmol E1、1 μMのオカダ酸、M相画分のタンパク質1Aの10 μg (活性E3-Cを含み、本質的にE2-Cを含まない)と異なった量のCGDDを含む。反応液を18℃で６０分間インキュベートする。次にSDSポリアクリルアミドゲル上で 電気泳動法によりサンプルを分離する。形成された125I-サイクリンーユビキチンの量をPhosphorImager 分析によって定量する。サイクリンーユビキチン形成の量は反応物中のCGDD の量に比例する。
【０３８２】
あるいは、CGDD活性試験ではDNA合成時の放射標識の取り込み量、またはアポトーシスを伴うDNAの断片化を測定するために、[α32P]ATPのような放射標識ヌクレオチドを使う。哺乳動物細胞は当分野で周知の方法によってCGDDをコードするｃDNAを含むプラスミドで形質移入される。次に、細胞は種々の時間で放射標識したヌクレオチドとインキュベートする。染色体DNAを回収し、シンチレーションカウンターを用いて放射活性を検出する。染色体DNAに取り込まれる放射標識の量は細胞周期の刺激度に比例する。CGDDがアポトーシスを促進しているかどうかを決定するために、上記のとおり染色体DNAを回収して、当分野に周知の方法によってポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した。DNAの断片化が、形質移入されていない対照細胞と比較して定量化される。DNAの断片化は、CGDDのアポトーシス活性に比例する。
【０３８３】
あるいは、CGDDのサイクロフィリン活性はシスからトランスへの相互変換率を測定するキモトリプシン結合アッセイを用いて測定される(Fischer, G.、Bang, H. 及びMech, C. (1984) Biomed. Biochim. Acta 43: 1101-1111)。キモトリプシンを用いてXaa-Pro ペプチド結合でのトランス基質切断活性を見積もる。この場合、シスからトランスへの異性化の速度定数が反応の遅い相での基質加水分解の速度定数を測定することによって得られる。サンプルは免疫抑制剤CsA またはFK506の存在下または不在下でインキュベートされ、キモトリプシンの添加によって反応が開始し、その蛍光反応が測定される。酵素的速度定数は一次反応動態が表示されるkapp = kH20 + kenzから計算される。PPIase 活性の一単位はkenz (s-1)と定義する。
【０３８４】
あるいは、CGDDのサイクロフィリン活性は免疫抑制剤シクロスポリンに対する立体特異的結合の親和性を測定する定量的イムノアッセイによってモニターされる(Quesniaux, V.F. 他(1987) Eur. J. Immunol. 17: 1359-1365)。このアッセイにおいて、サイクロフィリン-シクロスポリン複合体は抗グロブリン酵素共役体によって亢進される抗サイクロフィリン兎抗血清を用いて検出される結合によって固体相に被覆される。
【０３８５】
あるいは、CGDDの活性はエレクトロスプレイイオン化質量分析を用いてガス相においてFKBPと免疫抑制剤との間の非共有結合を測定するために作られた結合アッセイによってモニターされる。エレクトロスプレイイオン化において、イオンは強力な電界の存在で高度に電荷された液滴の微細なスプレーを作ることによって作製される。液滴のサイズが小さくなるにつれて、表面の電荷密度が増加する。イオンは静電気的に質量分析器に誘導され、そこで反対の電荷イオンが空間的に分かれたソースに作製され、次に毛細管入口に掃引され、そこで流れは合流し、反応が生じる。結合したCGDD/免疫抑制剤複合体と未結合のCGDD/免疫抑制剤複合体の荷電状態を比較して、相関的結合親和性が確立され、in vitro 結合および免疫抑制活性と相関し得る。
【０３８６】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明に記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３８７】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３８８】
表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３８９】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３９０】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA断片やゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３９１】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３９２】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３９３】
表7は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３９４】
【表１】
Figure 2004521627
【０３９５】
【表２】
Figure 2004521627
【０３９６】
【表３−１】
Figure 2004521627
【０３９７】
【表３−２】
Figure 2004521627
【０３９８】
【表３−３】
Figure 2004521627
【０３９９】
【表３−４】
Figure 2004521627
【０４００】
【表３−５】
Figure 2004521627
【０４０１】
【表３−６】
Figure 2004521627
【０４０２】
【表３−７】
Figure 2004521627
【０４０３】
【表３−８】
Figure 2004521627
【０４０４】
【表３−９】
Figure 2004521627
【０４０５】
【表３−１０】
Figure 2004521627
【０４０６】
【表４−１】
Figure 2004521627
【０４０７】
【表４−２】
Figure 2004521627
【０４０８】
【表４−３】
Figure 2004521627
【０４０９】
【表４−４】
Figure 2004521627
【０４１０】
【表４−５】
Figure 2004521627
【０４１１】
【表４−６】
Figure 2004521627
【０４１２】
【表４−７】
Figure 2004521627
【０４１３】
【表４−８】
Figure 2004521627
【０４１４】
【表４−９】
Figure 2004521627
【０４１５】
【表４−１０】
Figure 2004521627
【０４１６】
【表５】
Figure 2004521627
【０４１７】
【表６−１】
Figure 2004521627
【０４１８】
【表６−２】
Figure 2004521627
【０４１９】
【表７−１】
Figure 2004521627
【０４２０】
【表７−２】
Figure 2004521627

Claims (79)

  1. 以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
    （ａ） SEQ ID NO:1-12（配列番号１乃至１2）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｂ） SEQ ID NO：1-10およびSEQ ID NO:12からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
    （ｃ） SEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％が同一であるような天然アミノ酸配列を持つポリペプチド
    （ｄ） SEQ ID NO：1-12を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
    （ｅ） SEQ ID NO:1-12を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
  2. SEQ ID NO:1−1２を有する群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  3. 請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  4. 請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  5. SEQ ID NO:13-24（配列番号1３乃至２４）を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
  8. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
  9. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
    （ａ） 前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
    （ｂ） そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
  10. 前記ポリペプチドがSEQ ID NO：１−１２からなる群から選択したアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項9に記載の方法。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
  12. 以下の（ａ）乃至（g）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
    （ａ） SEQ ID NO：13-24からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    （ｂ） SEQ ID NO:13-23を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
    （ｃ） SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９６％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
    （ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    (ｇ)（ａ）〜（ｆ）のRNA等価物
  13. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
  14. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ） 前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
    （ｂ） 前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
  15. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
  16. 請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ） ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
    （ｂ） 前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
  17. 請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
  18. 前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1−1２からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項17の組成物。
  19. 機能的なCGDDの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法
  20. 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ） 前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  21. 請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
  22. 機能的なCGDDの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
  23. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ） 前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  24. 請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
  25. 機能的なCGDDの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
  26. 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
    （ｂ） 請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
  27. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
    （ｂ） 請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
    （ｃ） 試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
  28. 請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
    （ｂ） 前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
    （ｃ） 可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
  29. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
    （ａ） 核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
    （ｂ） 処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
    （ｃ） ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
    （ｄ） 前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
  30. 生物学的サンプル中のCGDD の発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
    （ａ） 前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
    （ｂ） 前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
  31. 前記抗体が、
    （ａ） キメラ抗体
    （ｂ） 単鎖抗体
    （ｃ） Fab断片
    （ｄ） F（ab'）2 断片
    （ｅ） ヒト化抗体、のいずれかである抗体。
  32. 請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
  33. 被検者のCGDD の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  34. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
  35. 被検者のCGDD の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
  36. 請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
    （ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ） 前記動物から抗体を単離する過程と、
    （ｃ） 前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
  37. 請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
  38. 請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
  39. 請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
    （ａ） 抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ） 前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
    （ｃ） 前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル 抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
    （ｄ） 前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
    （ｅ） SEQ ID NO：1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
  40. 請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
  41. 請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
  42. Fab発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
  43. 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
  44. SEQ ID NO:1-1２を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中で検出する方法であって、
    （ａ） 請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
    （ｂ） 特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-１２からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
  45. SEQ ID NO:1-12 からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ） 請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
    （ｂ） 前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-12からなる群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
  46. マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
  47. ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作成する方法であって、
    （ａ） サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
    （ｂ） ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
    （ｃ） サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
  48. 固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
  49. 請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  50. 請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  51. 請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
  52. 請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
  53. 請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
  54. 請求項48に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
  55. 請求項48に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
  56. SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  57. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  58. SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  59. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  60. SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  61. SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  62. SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  63. SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  64. SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  65. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  66. SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  67. SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
  68. SEQ ID NO:13のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  69. SEQ ID NO:14のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  70. SEQ ID NO:15のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  71. SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  72. SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  73. SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  74. SEQ ID NO:19のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  75. SEQ ID NO:20のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  76. SEQ ID NO:21のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  77. SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  78. SEQ ID NO:23のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
  79. SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
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