JP5770711B2 - 細胞中への免疫原性分子のデリバリーに適したCyaAポリペプチド突然変異体及びポリペプチド誘導体 - Google Patents
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Description
a)以下の突然変異が実施された、ボルデテラ・ペルツッシス、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)のアデニレートシクラーゼ(CyaA)のアミノ酸配列:
(i)グルタミン残基(E570Q)又は保存的アミノ酸残基による、570位のグルタミン酸残基の置換、及び
(ii)アルギニン残基(K860R)又は保存的アミノ酸残基による、860位のリジン残基の置換、或いは、
(b)ボルデテラ・ペルツッシス、ボルデテラ・パラペルツッシス又はボルデテラ・ヒンジイのアデニレートシクラーゼ(CyaA)の断片のアミノ酸配列であって、該断片がボルデテラ・ペルツッシスのCyaAタンパク質が標的細胞に結合する能力及びアデニレートシクラーゼ酵素のN-末端ドメイン又はその一部を標的細胞中へ移行させる能力を有し、ここで、上記断片はさらに、上記アデニレートシクラーゼの570位及び860位に位置する突然変異したアミノ酸残基:E570Q及びK860Rを含む、或いは、
(c)1つ以上のアミノ酸残基の置換及び/又は挿入により、上記a)又はb)に定義されたアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列であって、ボルデテラ・ペルツッシスのCyaAタンパク質が標的細胞に結合する能力及びそのアデニレートシクラーゼ酵素のN-末端ドメイン又はその一部を標的細胞中へ移行させる能力を有し、ここで、上記アミノ酸配列はさらに、上記アデニレートシクラーゼの570位及び860位に位置する突然変異したアミノ酸残基:E570Q及びK860Rを含む、或いは、
(d)ボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)のアデニレートシクラーゼ(CyaA)のアミノ酸配列であって、以下の突然変異が実施されたもの:
(i)グルタミン残基(E569Q)又は保存的アミノ酸残基による、569位のグルタミン酸残基の置換、及び
(ii)アルギニン残基(K859R)又は保存的アミノ酸残基による、859位のリジン残基の置換、或いは、
(e)ボルデテラ・ブロンキセプティカのアデニレートシクラーゼ(CyaA)の断片のアミノ酸配列であって、該断片がボルデテラ・ペルツッシスのCyaAタンパク質が標的細胞に結合する能力及びそのアデニレートシクラーゼ酵素のN-末端ドメイン又はその一部を標的細胞中へ移行させる能力を有し、ここで、上記断片はさらに、上記アデニレートシクラーゼの569位及び859位に位置する突然変異したアミノ酸残基:E569Q及びK859Rを含む、或いは、
(f)1つ以上のアミノ酸残基の置換及び/又は挿入により、上記d)又はe)に定義されたアミノ酸配列と異なる、アミノ酸配列であって、ボルデテラ・ペルツッシスのCyaAタンパク質が標的細胞に結合する能力及びそのアデニレートシクラーゼ酵素のN-末端ドメイン又はその一部を標的細胞中へ移行させる能力を有し、ここで、上記アミノ酸配列はさらに、上記アデニレートシクラーゼの569位及び859位に位置する突然変異したアミノ酸残基:E569Q及びK859Rを含む。
a)アミノ酸残基570をE570Qとして含み、さらに配列番号1に比較して0、1、2、3、4、又は5個の欠失、置換又は挿入を含む、配列番号1からの少なくとも100の長さの連続したアミノ酸残基に対応する、第1のアミノ酸配列、及び
b)アミノ酸残基860をK860Rとして含み、さらに配列番号1に比較して0、1、2、3、4、又は5個の欠失、置換又は挿入を含む、配列番号1からの少なくとも100の長さの連続したアミノ酸残基に対応する、第2のアミノ酸配列、及び好ましくは、
c)CD11b/CD18標的細胞との相互作用のための、CyaAタンパク質の配列番号1に示されるCyaAアミノ酸配列のアミノ酸残基1166〜1281又はアミノ酸残基1208〜1243を含む、第3のアミノ酸配列、
を含む。
a)配列番号1、7、8の570位又は配列番号9の569位のグルタミン酸残基をグルタミン残基によって又は保存的アミノ酸残基によって置換すること、
b)配列番号1、7、8の860位又は配列番号9の859位のリジン残基をアルギニン残基によって又は保存的アミノ酸残基によって置換すること、及び
c)場合により、得られたポリペプチドが、ボルデテラ・ペルツッシスのCyaAタンパク質の標的細胞への結合能力及びそのN-末端アデニレートシクラーゼ酵素ドメイン又はその一部を上記細胞中へ移行させる能力を有するという条件において、a)及びb)に記載された位置以外の位置において1つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失を実施すること。
a)上記で定義された免疫原性組成物を提供し;
b)免疫応答を促進するために、上記免疫原性組成物を好ましくは静脈内経路を介して上記宿主に投与する。
材料及び方法
CyaAタンパク質の構築、産生及び精製
CyaA/AC-、CyaA/233OVA、CyaA/E570Q及びCyaA/K860R構築物を生じさせる修飾は先に記載され(13、20、21)、そして、個々に又は組み合わせてCyaA/233OVA/AC-中に導入した。CyaA由来タンパク質をE.coli XL-1 Blue中で産生させ、そして均一に近くなるまで先に記載したとおりに精製した(29)。疎水性クロマトグラフィーの間、毒素が結合した樹脂を60%イソプロパノールで繰り返し洗浄して(30)、CyaAサンプルのエンドドキシン含有量を、LALアッセイQCL-1000(Cambrex)で測定して100IU/mgタンパク質未満まで減少させた。
50mM Tris pH7.4、150mM NaCl及び2mM CaCl2(TNCバッファー)中、5×108個の洗浄ヒツジ赤血球を5μg/mlのCyaAタンパク質とともに37℃でインキュベートし、そして、CyaAの細胞結合、細胞侵入性AC及び溶血活性を先に詳述したとおりに測定した(13)。活性値の有意差を、ボンフェローニの方法(SigmaStat v.3.11, Systat, San Jose, CA)を用いて一要因分散分析(one-way analysis of variance(ANOVA))によって分析した。
J774.A1ネズミ単球/マクロファージ(ATCC、番号TIB-67)を、37℃において加湿した空気/CO2(19:1)大気中、10%(v/v)熱不活性化ウシ胎仔血清、ペニシリン(100IU ml-1)、ストレプトマイシン(100μg ml-1)及びアンフォテリシンB(250ng mg-1)を補充したRPMI培地中で培養した。アッセイの前に、RPMIをFCSを含まないダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)(1.9mM Ca2+)に交換し、そして細胞をDMEM中で1時間、37℃において加湿した5%CO2大気中で休ませた(8)。未結合の毒素をD−MEM中で3回洗浄することにより除去する前に、J774A.1マクロファージ(106)を、D-MEM中、2.5μg/mlのCyaA変異体とともに30分、4℃でインキュベートした。細胞結合性のAC活性の測定のために、細胞を0.1% Triton X-100で溶解した。細胞内cAMPのアッセイのためには、100μMのIBMX(3−イソブチル−1−メチルキサンチン)を含むD-MEM中で105個の細胞をCyaAとともに30分間インキュベートし、100mM HCl中、0.2% Tween 20を加えることによって反応を停止させ、サンプルを100℃で15分間煮沸し、150mMの非緩衝化イミダゾールを加えることによって中和し、そして記載のとおりにcAMPを測定した(29)。CD11b/CD18受容体をブロックするために、CyaAの添加前にCD11bを特異的ブロッキングする最終濃度10μg/mlのMAb M1/70(Exbio、チェコ共和国)とともに細胞を氷上で30分間プレインキュベーションした。J774A.1細胞の毒素により誘導された溶解を、記載されたように(8)、10μg/mlの適切なタンパク質とともに37℃で3時間、D-MEM中でインキュベーションし、105個の細胞から放出されたラクテートデヒドロゲナーゼの量として、CytoTox 96キットアッセイ(Promega)を用いて決定した。活性値の有意差を上記のとおり分析した。
HBSS(140mM NaCl, 5mM KCl、2mM CaCl2、3mM MgCl2、10mM Hepes-Na、50mM グルコース;pH7.4)中に浸したJ774A.1細胞において全細胞パッチクランプ測定を実施した。外径が約3μmの先端熱加工したガラスマイクロピペットを、125mM カリウムグルコネート、15mM KCl、0.5mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM EGTA、10mM HEPES-KOH pH7.2の溶液で満たした。得られた微小電極の抵抗は、3〜5MΩであった。細胞を−40mVでクランプし、Axopatch 200A増幅器、Digidata 1320Aデジタイザー及びPClamp-9ソフトウエアパッケージ(Axon Instruments, Foster City CA)を用いて、データを1kHzでフィルタリングし、2kHzでデジタル化した。
カバーガラス上で増殖させた細胞をHBSS中で洗浄し、そして、0.05%(w/w)プルロニックF-127(Sigma, St. Louis, MO)の存在下、暗所で、30分間、25℃で9.5μM PFBIアセトキシメチルエステル(PBFI/AM, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を加えた。DataMaxソフトウエアを搭載したFluoroMax-3分光蛍光光度計(Jobin Yvon Horriba, France)を用いてレシオメトリック測定を25℃で実施した。PBFIの蛍光強度(励起波長340、発光波長450及び510nm)を15秒ごとに記録し、そして各波長についての積分時間は3秒であった。450/510nm波長の比率を示す。1cmのキュベット中に載せたカバーガラスの観察面積は、約10mm2であり、およそ104個の細胞に相当した。較正実験を、さまざまな濃度の酢酸カリウム(10、30、60又は140mM)及び酢酸ナトリウム(135、115、85又は5mM)をそれぞれ含む、50mM HEPES、pH7.2中で、3pMのバリノマイシン又はニゲリシンによって30分間透過処理した細胞について実施した。最終的な強度比(450/510nm)をプロットの右縦軸上に示す。
Charles River Laboratoriesから購入した雌性C57BL/6マウスを特定の病原体フリーの条件下で飼育し、研究所のガイドラインにしたがって操作した。CTLL-2細胞をATCCから入手した。B3Z、Kb拘束性OVA(SIINFEKL)エピトープに特異的なCD8+特異的T細胞ハイブリドーマをN. Shastri(University of California, Berkeley)が提供し、10%の熱により不活性化されたFCS、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び5×10-5Mの2−MEを含む完全RPMI1640培地(Invitrogen Life Technologies)中で、1mg/mlのG418及び400μg/mlのヒグロマイシンBの存在下、維持した。
APCとして使用した骨髄樹状細胞(BMDC、3×105/ウエル)を、OVA(SIINFEKL)エピトープ又は擬似CyaA/AC-を担持するさまざまな濃度(0〜60nM)の組換えCyaA/OVA/AC-の存在下でインキュベートし、OVA SIINFEKL/H-2Kb MHCクラスI複合体を選択的に認識するB3Z T細胞(ウエルあたり1×105)とともに24時間共培養した。18時間の培養後、上清を−80℃で少なくとも2時間凍結した。そして、刺激されたB3Z細胞により産生されたIL-2の量を、CTLL増殖法によって決定した。すなわち、ウエルあたり104個のIL-2依存性CTLL菌株の細胞を100μlの上清とともに200μlの最終体積で培養した。24時間後、[3H]−チミジン(50μCi/ウエル)を添加し、そして6時間後に自動化セルハーベスターにより細胞を採取した。取り込まれた[3H]−チミジンを、シンチレーションカウンティングにより検出した。各ポイントを二連で行い、実験は5回繰り返した。結果は、[3H]チミジンの取り込みのΔcpm(トキソイド存在下でのcpm−トキソイド不存在下でのcpm)として表した。
CTLの初回刺激のために、OVA(SIINFEKL)エピトープ又は擬似CyaA/AC-を担持する50μgの組換えCyaA/OVA/AC-のi.v.注射によりマウスを免疫化した。免疫化の7日後、未感作の同質遺伝子的(syngenic)脾細胞をOVA(SIINFEKL)ペプチド(10μg/ml)でパルシングし(30分、37℃)、さらに洗浄し、そして高濃度(1.25μM)のカルボキシフルオレッセインサクシニミジルエステル(CFSE; Molecular Probes, Eugene, OR)で標識した。パルシングされない対照集団を、低濃度(0.125μM)のCFSEで標識した。CFSEhigh−及びCFSElow−標識された細胞を、1:1の比で混合し(各集団、5×106細胞)、そして、マウスにi.v.注射した。脾細胞を20時間後に収集し、洗浄し、FACSバッファー(1%のBSA及び0.1%のNaN3を補充したPBS)中に再懸濁した。20時間後に脾臓中に残っているCFSE-陽性細胞の数をFACSにより決定した。特異的な溶解のパーセンテージを以下のように計算した:特異的な溶解のパーセント=100−[100×(CFSEhighで免疫化されたマウスの%/CFSElowで免疫化されたマウスの%)/(CFSEhigh未感作のマウスの%/CFSElow未感作のマウスの%)]。
値の有意差をボンフェローニの方法(SigmaStat v.3.11, Systat, San Jose, CA)を用いて一要因分散分析(one-way analysis of variance(ANOVA))によって分析した。
陰性荷電したグルタミン酸570及びアシル化リジン860の組み合わせの除去がCyaAの細胞透過性付与能を失わせる。
CyaA作用のワーキングモデルは、CyaAが修飾されて、その膜孔形成(溶血)活性を失う一方、標的細胞の細胞質中へACドメインをデリバリーする能力を保存することを予測する。この仮説を試験するために、発明者らは、CyaA/AC-トキソイドの細胞溶解能が、膜孔形成ドメイン内の置換によって高められ又は低下させられるように修飾可能であるという先の観察(8、12〜14、18)を基に、可能な限り低い溶血及び細胞溶解活性を示すCyaA構築物を作り出すことを試みた。CyaA/AC-トキソイドについても標的細胞の透過の評価を可能とするために、発明者らは、かかる突然変異体を、先にオボアルブミン由来のSIINFEKLペプチド(OVA)の挿入によりタギングされたCyaA/233OVA毒素から得た。このCyaA変異体は、レポーターKb-拘束性CD8+ T細胞エピトープの残基233における挿入が、AC活性に影響せずかつOVA/AC酵素の細胞中への移行を細胞質cAMPの上昇として定量することを可能とするために選ばれた。より重要なことは、OVAエピトープの存在が酵素的に不活性なCyaA/233OVA/AC-トキソイドがそれらのOVA/AC-ドメインをCD11b+抗原提示細胞(APC)の細胞質中へデリバリーする能力も評価することを可能とすることであり、これは、プロテアソームによるプロセシング、及びインビトロ及びインビボの両方におけるOVA-特異的CD8+ T細胞の刺激として測定されることができる、MHCクラスI糖タンパク質上のOVAエピトープの細胞表面提示を可能とするからである(20)。
−aヒツジ赤血球の溶解は、2mMのCa2+の存在下で、5μg/mlの所与のタンパク質とともに5×108個のRBCを37℃でインキュベーションすることにより放出されたヘモグロビンの量として、4.5時間後に決定した(31)。CyaA/AC-の溶血活性を100%の活性とした。結果は、2つの異なるタンパク質調製物を用いて二連で実施した4つの独立した実験において得られた値の平均±S.D.を表す。
−bJ774A.1細胞の溶解を、10μg/mlの適切なタンパク質とともにD−MEM中、37℃で3時間、細胞をインキュベーションすることにより105個の細胞から放出されたラクテートデヒドロゲナーゼの量として決定した。CyaA/AC-によるJ774A.1細胞の溶解を100%とした。結果は、2つの異なるタンパク質調製物を用いて二連で実施した4つの別個の実験において得られた値の平均±S.D.を表す(*、p<0.05;**、p<0.001)。
赤血球に対する毒素の活性に及ぼすK860R置換の影響とは対照的に、E570Q及びK860R置換は両方ともCD11b/CD18受容体を発現するJ774A.1単球に結合しそして透過するCyaAの能力に何の効果も与えないことが先に発見されている(4、8)。さらに、図2に記録されているとおり、2つの置換が同じ毒素分子中で組み合わされた場合、CyaA/OVA/E570Q+K860R構築物はJ774A.1細胞に結合し(図2A)、そして無傷のCyaAがそうであったように、J774A.1細胞の細胞質中にACドメインをデリバリーして細胞内cAMP濃度を上昇させる(図2B)等しい能力を示した。しかしながら、同時に、二重に突然変異したE570Q+K860Rトキソイドは、これらの細胞に対して約7分の1に低下した(14±7%)相対的細胞溶解能を示した(表1を参照)。図2Cに示すように、無傷のCyaAと比較した場合、単一の突然変異を有するE570Q及び二重に突然変異したE570Q+K860R構築物は、毒素処理されたJ771A.1細胞中のカリウムイオンの細胞内濃度([K+]i)の減少を誘発する能力が大きく障害されていた。ラクテートデヒドロゲナーゼの放出についてのアッセイにより20分にわたって細胞溶解が検出されなかった一方、3μg ml-1の無傷のCyaAに曝露されたJ774A.1細胞の[K+]iは、毒素添加の10分後にすでに140mMから30mM未満にまで低下した。同様に、同じ量(3μg ml-1)のER570QiK860R構築物を使用した場合、細胞中の[K+]iレベルは100mM未満には減少しなかった(図2C)。実際に、細胞からのカリウムの流出は、細胞膜へのCyaA膜孔前駆体の挿入の特徴であることが先に示されている(32)。これは、E570QとK860R置換の組み合わせがJ774A.1細胞を透過性とするトキソイドの能力のみを選択的に障害し、細胞膜を横切ってACドメインを移行させるその能力は障害しなかったことを示唆した。
細胞質cAMPについてのアッセイがAC-トキソイドの細胞透過能の評価に使用できないため、レポーターOVAエピトープをMHCクラスI抗原提示経路の細胞質プロセシング部位へデリバリーするそれらの能力についての代替アッセイを使用した(7、24)。これが終わりに近づいたころ、発明者らはトキソイドを負荷したC57BL/6マウス骨髄由来樹状細胞(BMDCs)の、APC上のSIINFEKL(OVA)ペプチドとKbMHCクラスI分子の複合体を選択的に認識するB3Z T細胞によるIL-2放出を刺激する能力を決定した。実際、CyaA/AC-トキソイドが細胞膜を横切ってBMDCの細胞質中にACドメインを移行させる能力が、H-2Kb MHCクラスI分子と複合化したデリバリーされたOVAエピトープの提示を促進するトキソイドの能力にとって必須であることは先に示されていた。これは、同様に、細胞障害性T細胞の特異的なインビトロでの刺激が起こるために必須である(29)。それにもかかわらず、プロテアソームプロセシング及びその後の提示のためのOVAエピトープのデリバリーがBMDCの細胞質へのその細胞膜を横切るACドメインの移行によるものであり、そして、流体相への取り込みによる添加された抗原のサンプリング又はエンドサイトーシスによるものでなかったことを確認することは重要であった。この目的のために、CyaAの膜貫通ドメイン中のグルタミン酸570及び581の電荷逆転性かつヘリックス破壊性の置換の組み合わせを有する二重に突然変異した非移行性OVA/E570K+E581P/AC‐トキソイド変異体を使用した(33)。この構築物は、標的細胞の膜を横切ってACドメインを移行させるその能力がE570K及びE581P置換の組み合わせにより除去された一方(図2B参照)、CD11b/CD18発現細胞に結合する完全な能力を示す(図2A参照)ことが先に示された。
発明者らはここに、CyaAのACドメインのCD11b/CD18受容体発現性骨髄標的細胞の膜を横切る移行が、毒素の膜孔形成能及び細胞膜透過性付与能に依存しないことを実証した。
Claims (25)
- (1)配列番号1、7又は8に記載のアデニレートシクラーゼ(CyaA)配列において、(a)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置570に対応するグルタミン酸残基が、グルタミン残基又はAsn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、Ile及びAspからなる群より選択される保存残基で置換され、(b)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置860に相当するリシン残基が、アルギニン残基又はAsn、Gln、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys及びIleからなる群より選択される保存残基で置換され、更に(c)0、1、又は複数個の置換、欠失及び/又は挿入を有し、配列番号1、7又は8に記載の配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、或いは、
(2)配列番号9に記載のCyaA配列において、(a)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置569に対応するグルタミン酸残基が、グルタミン残基又はAsn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、Ile及びAspからなる群より選択される保存残基で置換され、(b)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置859に対応するリシン残基が、アルギニン残基又はAsn、Gln、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys及びIleからなる群より選択される保存残基で置換され、更に(c)0、1、又は複数個の置換、欠失及び/又は挿入を有し、配列番号9に記載の配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
を有するポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、ボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)、ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)又はボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)のCyaAタンパク質による、CD11b/CD18受容体発現細胞のCD11b/CD18受容体への結合能を有し、N末端アデニレートシクラーゼ酵素ドメイン又はその一部をCD11b/CD18発現細胞内に転位させる能力を有し、且つ、天然のCyaA毒素と比較して低減又は抑制された膜孔形成活性を有する、ポリペプチド。 - (i)配列番号1、7若しくは8に記載の配列の位置570、又は、配列番号9に記載の配列の位置569に対応するグルタミン酸残基が、グルタミン残基で置換されるとともに、(ii)配列番号1、7若しくは8に記載の配列の位置860、又は、配列番号9に記載の配列の位置859に対応するリシン残基が、アルギニン残基で置換されてなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
(1)配列番号1、7又は8に記載の配列において、(a)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置570に対応するグルタミン酸残基の、グルタミン残基又はAsn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、Ile及びAspからなる群より選択される保存残基による置換、及び、(b)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置860に対応するリシン残基の、アルギニン残基又はAsn、Gln、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys及びIleからなる群より選択される保存残基による置換、が導入された配列、並びに、
(2)配列番号9に記載の配列において、(a)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置569に対応するグルタミン酸残基の、グルタミン残基又はAsn、Met、Thr、Ser、Gly、Arg、Lys、Val、Leu、Cys、Ile及びAspからなる群より選択される保存残基による置換、及び、(b)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置859に対応するリシン残基の、アルギニン残基又はAsn、Gln、Met、Thr、Ser、Gly、Val、Leu、Cys及びIleからなる群より選択される保存残基による置換、が導入された配列
からなる群より選択される、請求項1又は2に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
(1)配列番号1、7又は8に記載の配列において、(a)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置570に対応するグルタミン酸残基のグルタミン残基による置換、及び、(b)配列番号1、7又は8にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)又はボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)の天然CyaA配列の位置860に対応するリシン残基のアルギニン残基による置換、が導入された配列、並びに、
(2)配列番号9に記載の配列において、(a)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置569に対応するグルタミン酸残基の、グルタミン残基による置換、及び、(b)配列番号9に記載のボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)の天然CyaA配列の位置859に対応するリシン残基の、アルギニン残基による置換、が導入された配列
からなる群より選択される、請求項3に記載のポリペプチド。 - アデニレートシクラーゼトキソイドの突然変異体であって、細胞内におけるアデニレートシクラーゼ活性が、ボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)、ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)又はボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)CyaA毒素と比べて、部分的に又は完全に抑制されてなる、請求項1〜4の何れか一項に記載のポリペプチド。
- アデニレートシクラーゼ活性の部分的又は完全な抑制が、配列番号1、7、8又は9にそれぞれ記載のボルデテラ・ペルツッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)、ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)又はボルデテラ・ブロンキセプティカ(Bordetella bronchiseptica)のアデニレートシクラーゼの位置188及び189に対応するアミノ酸残基間へのジペプチド挿入により達成される、請求項5に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載のポリペプチドが、1又は2以上の別の分子と結合されてなる組換ポリペプチド。
- 前記1又は2以上の分子の各々が、免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、5〜800のアミノ酸残基からなる、請求項8に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、300〜600のアミノ酸残基からなる、請求項9に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、400〜500のアミノ酸残基からなる、請求項10に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、ポリオウイルス抗原、HIVウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルス配列、及び腫瘍抗原からなる群より選択される抗原のアミノ酸配列、又は当該抗原のアミノ酸配列の少なくとも1つエピトープを含む部分配列を含む、請求項8〜11の何れか一項に記載の組換ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が前記ポリペプチドの許容し得る部位内に挿入された組換ポリペプチドであるとともに、前記ポリペプチドのN末端アデニレートシクラーゼ酵素ドメインをCD11b/CD18発現細胞に転位する能力が保存されてなる、請求項8〜12の何れか一項に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、前記ポリペプチドのアミノ酸残基にグラフトされてなる、請求項8〜11の何れか一項に記載の組換ポリペプチド。
- 前記免疫応答を誘発し得るアミノ酸配列が、前記ポリペプチドのアミノ酸残基に科学的にグラフトされてなる、請求項14に記載の組換ポリペプチド。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項7〜15の何れか一項に記載の組換ポリペプチドの、医薬の製造における使用。
- 当該医薬が、宿主においてT細胞及び/又はB細胞の免疫応答を誘発するための医薬である、請求項16に記載の使用。
- 当該医薬が、新生物、癌、及び、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性、寄生生物性又は真菌性疾患から選択される感染性疾患の予防又は治療のための医薬である、請求項16に記載の使用。
- 前記医薬が、アジュバントと共に、及び/又は、治療活性を有する他の分子との組み合わせで投与される、請求項16〜18の何れか一項に記載の使用。
- 前記医薬が、アジュバントとの組み合わせでは投与されない、請求項16〜18の何れか一項に記載の使用。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項7〜15の何れか一項に記載の組換ポリペプチドを含む医薬組成物。
- 医薬的に許容可能な担体と、任意によりアジュバント及び/又は治療活性を有する分子とを更に含む、請求項21に記載の医薬組成物。
- 新生物、癌、及び、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性、寄生生物性又は真菌性疾患から選択される感染性疾患の予防又は治療のための、請求項21又は22に記載の医薬組成物。
- CD11b/CD18発現細胞に分子を送達するためのタンパク質ベクターを調製する方法であって、前記分子を請求項1〜6の何れか一項に記載のポリペプチドに結合させることを含む方法。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載のポリペプチド、又は、請求項7〜15の何れか一項に記載のポリペプチド誘導体をコードするDNA分子。
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