ES2612945T3 - Polipéptidos de CyaA mutantes y derivados polipeptídicos adecuados para el suministro de moléculas inmunogénicas en una célula - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que es un mutante de la proteína adenilato ciclasa (CyaA) de Bordetella pertussis que tiene la secuencia de aminoácidos desvelada como SEQ ID NO: 1 y que puede unirse a células y translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N terminal en dichas células, en el que dichas células expresan el receptor CD11b/CD18 y en el que la unión a dichas células se produce a través de la unión a dicho receptor CD11b/CD18, y cuyo polipéptido tiene una actividad formadora de poros que está reducida o suprimida en comparación con la de la toxina CyaA nativa, y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos desvelada como SEQ ID NO: 1 por: (i) la sustitución del resto de ácido glutámico correspondiente a la posición 570 en SEQ ID NO: 1 por un resto de glutamina o un resto conservativo seleccionado del grupo que consiste en Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile y Asp; y (ii) la sustitución del resto de lisina correspondiente a la posición 860 en SEQ ID NO: 1 por un resto de arginina o por un resto conservativo seleccionado del grupo que consiste en Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys e Ille; y (iii) opcionalmente de 1 a 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de restos de aminoácidos en localizaciones distintas de las localizaciones indicadas en (i) y (ii), teniendo dicho polipéptido obtenido una secuencia de aminoácidos que comparte al menos una identidad de 99 % con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1.

Description

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El polipéptido de acuerdo con la invención también puede definirse como un polipéptido que puede obtenerse a partir de un polipéptido de CyaA que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1, por:

(i)

sustitución del resto de ácido glutámico en la posición 570 de SEQ ID NO: 1 por un resto de glutamina o por un resto de aminoácido conservativo,

(ii)

sustitución del resto de lisina en la posición 860 de SEQ ID NO: 1 por un resto de arginina o por un resto de aminoácido conservativo, y

(iii) opcionalmente, realizando de una a 10 sustituciones, inserciones y/o deleciones de restos de aminoácidos en localizaciones distintas de las localizaciones indicadas en i) y ii), siempre que el polipéptido así obtenido tenga la capacidad de la proteína CyaA de Bordetella pertussis para unirse a una célula diana y translocar su dominio enzimático adenilato ciclasa N terminal o parte del mismo en dicha célula.

En la etapa i), el resto de ácido glutámico se sustituye por un resto de aminoácido seleccionado de Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp, más preferentemente por Gln. En la etapa ii), el resto de lisina se sustituye por un resto de aminoácido seleccionado de Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, Ile, más preferentemente por Arg.

En una realización específica, en la etapa iii), no se realizan sustituciones, inserciones y/o deleciones adicionales de restos de aminoácidos.

En particular, la etapa iii) puede comprender el truncamiento en uno de los dos lados o ambos extremos terminales. En particular, los restos en el extremo C terminal pueden delecionarse en la medida en que no afecte al sitio de reconocimiento y unión para el receptor celular CD11b/CD18. Como alternativa o además, los restos pueden delecionarse en el extremo N terminal siempre que no afecte a la capacidad de translocación del polipéptido mutante obtenido. También pueden realizarse deleciones internas de uno o más restos de la proteína CyaA nativa localizados en posiciones distintas de las indicadas en las etapas i) y ii). Como se describe en el presente documento, la etapa iii) comprende la deleción de hasta 380 o de hasta 400 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos N terminal del polipéptido CyaA, preferentemente la deleción del tramo de aminoácidos que va del aminoácido en posición 1 de SEQ ID NO: 1, 7, 8 o 9 al aminoácido en posición 72 de SEQ ID NO: 1, 7, 8 o 9.

Preferentemente, después de realizar la etapa iii), el polipéptido obtenido abarca toda o parte de la parte C terminal de la proteína nativa que en parte es responsable de la unión del polipéptido de la invención con la membrana de la célula diana y/o receptor CD11b/CD18, y del suministro posterior del dominio N terminal del polipéptido en el citosol celular. En una realización particular, en la etapa iii), los restos de aminoácidos 373 a 1706 de SEQ ID NO: 1 no están delecionados. En una realización preferida, en la etapa iii), los restos de aminoácidos 1208 a 1243 de SEQ ID NO: 1 no están delecionados.

En una realización preferida, en la etapa iii) comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos que suprimen total o parcialmente la actividad enzimática adenil ciclasa de la proteína CyaA. Dicha supresión parcial

o total puede obtenerse por la introducción de una secuencia de aminoácidos corta, que comprende de uno a diez aminoácidos, en particular un dipéptido en un sitio localizado dentro de los primeros 400 aminoácidos (dominio AC) de SEQ ID NO: 1 o por deleción o sustitución de una parte de la secuencia de aminoácidos de CyaA como se expone en SEQ ID NO: 1 que es esencial para la actividad enzimática. En una realización preferida, la supresión total o parcial de la actividad enzimática CyaA se obtiene por inserción de un dipéptido, por ejemplo, un dipéptido “LQ” o “GS”, entre los aminoácidos en las posiciones 188 y 189 de la secuencia CyaA como se expone en SEQ ID NO: 1. Como alternativa, la supresión total o parcial de la actividad enzimática también puede obtenerse por mutagénesis dirigida, por ejemplo, reemplazando el resto de lisina en la posición 58 o 65 de la proteína CyaA de Bordetellea pertussis (Glaser et al., 1898) por un resto de Gln.

Preferentemente, en la etapa iii) el resto de lisina en la posición 983 de la secuencia de aminoácidos CyaA como se expone en SEQ ID NO: 1 no está sustituido ni delecionado. En una realización, este resto de lisina está acilado, en particular está palmitoilado o palmitoleilado. Como alternativa, este resto de lisina no está acilado.

Preferentemente, después de realizar la etapa iii), el polipéptido obtenido tiene la secuencia de aminoácidos que comparte al menos una identidad de 99 % con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1.

Aun preferentemente, después de realizar la etapa iii), el polipéptido obtenido tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 por las sustituciones de restos de aminoácido resultantes de las etapas i) y ii) y por de 1 a 10 o de a 1 a 5 sustituciones, deleciones y/o inserciones de restos de aminoácidos adicionales. En una realización particular, después de realizar la etapa iii), el polipéptido obtenido difiere de la secuencia de aminoácidos de CyaA como se expone en SEQ ID NO: 1 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones y/o inserciones de restos de aminoácidos además de las sustituciones realizadas en las etapas i) y ii).

La invención también se refiere a un derivado polipeptídico que comprende o que consiste en el polipéptido mutante de acuerdo con la invención que se combina adicionalmente con una o más moléculas de interés. En una realización preferida, una molécula de interés es una molécula biológicamente activa ya sea en solitario o combinada con el

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polipéptido de la invención. Dichas moléculas pueden ser especialmente de valor profiláctico o terapéutico, es decir, pueden tener una actividad profiláctica o terapéutica, o pueden potenciar una actividad profiláctica o terapéutica.

En realizaciones específicas, las moléculas de interés se seleccionan del grupo que comprende: péptidos, glucopéptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos y compuestos químicos.

En una realización específica, la una o más moléculas de interés son moléculas polipeptídicas o contienen moléculas polipeptídicas. Su secuencia de aminoácidos puede comprender de 2 a 1000, preferentemente de 5 a 800, de 5 a 500, de 5 a 200, de 5 a 100, de 8 a 50, de 5 a 25, de 5 a 20 o de 8 a 16 o de 300 a 600, de 400 a 500, restos de aminoácidos.

En una realización preferida, la una o más moléculas de interés son secuencias de aminoácidos heterólogas adecuadas para provocar una respuesta inmunitaria (también mencionadas como “antígenos heterólogos”), en particular secuencias de aminoácidos que comprenden o consisten en un epítopo, incluyendo antígenos. Como se usa en el presente documento, el término “heterólogo” se refiere a un antígeno diferente al polipéptido mutante que se usa en el propio vector. Como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una molécula heteróloga y especialmente a un péptido heterólogo que puede provocar una respuesta inmunitaria cuando se presenta al sistema inmunitario de un hospedador. En particular, dicho un epítopo puede comprender o consistir en un tramo de 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15 o 16 restos de aminoácidos. Como alternativa puede consistir en un antígeno de longitud completa o consistir en un fragmento o fragmentos antigénicos

En una realización específica, un derivado polipeptídico de acuerdo con la invención puede estar codificado por un plásmido que corresponde con el plásmido OVA-QR-AC depositado con el número de registro CNCM I-4137 (figura 12) en el que la secuencia de ADN que codifica la secuencia antigénica “OVA” está reemplazada por una secuencia de ADN que codifica una secuencia antigénica que comprende uno o más epítopos.

La molécula polipeptídica adecuada para provocar una respuesta inmunitaria es especialmente una que provoca una respuesta inmunitaria de linfocitos T, incluyendo, como ejemplo, una respuesta CTL. La molécula polipeptídica adecuada para provocar una respuesta inmunitaria también puede ser una que provoque una respuesta inmunitaria de linfocitos B.

En realizaciones específicas, el antígeno heterólogo se selecciona del grupo que consiste en un antígeno de un patógeno bacteriano, un antígeno de una célula tumoral, un antígeno de virus, un antígeno de retrovirus, un antígeno fúngico o un antígeno de célula parasitaria.

Una molécula de interés puede ser especialmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: un antígeno de Chlamidia, un antígeno de Mycoplasma, un antígeno del virus de la hepatitis, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la gripe, un antígeno de virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o una parte de cualquiera de estos antígenos que comprenda al menos un epítopo.

En una realización preferida del derivado polipeptídico de la invención, la secuencia de aminoácidos de cada una de dichas moléculas adecuadas para provocar una respuesta inmunitaria comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de un antígeno de Chlamidia, un antígeno de Mycoplasma, un antígeno de virus de la hepatitis, un antígeno de poliovirus, un antígeno de virus VIH, un antígeno de virus de la gripe, un secuencia del virus de la coriomeningitis, un antígeno tumoral, o comprende o consiste en un parte de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de estos antígenos que comprende al menos un epítopo.

En una realización particularmente preferida, la molécula de interés es un antígeno asociado a tumor (AAT). Los antígenos asociados a tumor se han caracterizado para diversos tumores, tales como, por ejemplo: melanoma, especialmente melanoma metastásico; carcinoma de pulmón; carcinoma de cabeza y cuello; carcinoma de cuello uterino, carcinoma esofágico; carcinoma de vejiga, especialmente carcinoma de vejiga infiltrante; carcinoma de próstata; carcinoma de mama; carcinoma colorrectal; carcinoma de células renales; sarcoma; leucemia; mieloma. Para estos diversos tipos histológicos de cáncer, se ha demostrado que los péptidos antigénicos se expresan especificamente en muestras de tumor y se reconocen por linfocitos T, especialmente por linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+.

Se realizó una revisión de péptidos descubiertos como antígenos asociados a tumor en estos tipos de tumores en Van der Bruggen P. et al. (Immunological Reviews, 2002, vol 188: 51-64). Especialmente, la divulgación de los péptidos contenidos en la tabla 3 de dicha revisión se remite en el presente documento para ofrecer ejemplos de dichos antígenos asociados a tumor y dicha tabla 3 se incorpora por referencia en la presente solicitud.

Los siguientes antígenos se citan como ejemplos de antígenos asociados a tumor reconocidos por linfocitos T, de acuerdo con la publicación de Kawakami Y. et al (Cancer Sci, octubre 2004, vol. 95, nº. 10, Págs. 784-791) que también proporciona métodos de exploración de estos antígenos o adicionalmente uno: antígenos compartidos por diversos cánceres, incluyendo MAGE (especialmente en melanoma), NY-ESO-1, Her2/neu, WT1, Survivina, hTERT, CEA, AFP, SART3, GnT-V, antígenos específicos para algunos cánceres particulares tales como beta-catenina,

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CyaA, especialmente sin afectar sustancialmente al direccionamiento celular, particularmente el direccionamiento a células presentadoras de antígeno (APC) por CyaA, incluyendo sin afectar sustancialmente a la unión específica al receptor CD11b/CD18 y ventajosamente sin afectar sustancialmente a los dominios de la proteína implicados en el proceso de translocación del dominio N terminal de CyaA al interior de una célula diana.

Por ejemplo, en el documento WO93/21324, en Landal et al., 1992 y en Osicka et al., 2000 (Infection and Immunity, 2000, 68(1):247-256) se presentan métodos para seleccionar sitios permisivos. En particular, una metodología que usa una doble selección (resistencia a antibiótico y ensayo colorimétrico en placas por -complementación) permite identificar fácilmente inserciones de oligonucleótidos (que conservan la fase de lectura) en la parte del gen que codifica el dominio catalítico N terminal de la toxina. Las consecuencias funcionales de estas mutaciones sobre la actividad catalítica de la toxina pueden analizarse fácilmente, tanto genéticamente (complementación funcional de una cepa de E. coli cya-) como bioquímicamente (caracterización de la estabilidad de las adenilciclasas modificadas, de su actividad enzimática, de su interacción con cAM, etc.). Esta metodología ha permitido explorar una gran cantidad de mutaciones para identificar los sitios que son posiblemente ventajosos para la inserción de determinantes antigénicos.

Los sitios permisivos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis que permiten la translocación del dominio catalítico de CyaA y por tanto la translocación de secuencias de aminoácidos insertadas en dichos sitios permisivos incluyen, pero sin limitación, los restos 137-138 (Val-Ala), los restos 224-225 (Arg-Ala), los restos 228-229 (Glu-Ala), los restos 235-236 (Arg-Glu) y los restos 317-318 (Ser-Ala) (Sebo et al., 1995). Los siguientes sitios permisivos adicionales también se incluyen en realizaciones de la invención: los restos 107-108 (Gly-His), los restos 132-133 (Met-Ala), los restos 232-233 (Gly-Leu) y los restos 335-336 (Gly-Gln) y 336-337. Sin embargo, pueden usarse otros sitios permisivos en la presente invención, que pueden identificarse, por ejemplo, usando la metodología indicada anteriormente, especialmente sitios entre los restos 400 y 1700 de la proteína CyaA.

Para otras especies de Bordetella los sitios permisivos correspondientes pueden definirse por comparación de secuencias y determinación de los restos correspondientes.

De acuerdo con otra realización, el uno o más polipéptidos de secuencias de aminoácidos también pueden, o alternativamente insertarse en uno y/o los otros extremos (finales) del polipéptido de la invención, preferentemente en el extremo N terminal de polipéptido CyaA mutante que carece de todo o de parte del dominio catalítico N terminal de la proteína CyaA de Bordetella pertussis, y más particularmente que carece de los restos 1-373.

De acuerdo con una realización específica, la una o más secuencias de aminoácidos adecuadas para provocar una respuesta inmunitaria, se injertan en un resto de aminoácido de dicho polipéptido.

De acuerdo con la invención, la “combinación” (o inserción) de una secuencia de aminoácidos con el polipéptido mutante CyaA para proporcionar un denominado derivado polipeptídico, también mencionada como “proteína recombinante” o una “proteína híbrida”, abarca la inserción genética especialmente por tecnología de ADN disponible. Como alternativa, “combinación” también abarca inserción no genética, incluyendo, por ejemplo, inserción química, por ejemplo, acoplamiento covalente realizado especialmente en un extremo de la secuencia de aminoácidos, o acoplamiento no covalente. La inserción no genética puede ser especialmente de interés cuando la secuencia de aminoácidos a insertar es sintética o es semisintética. En la técnica se conocen bien métodos para el acoplamiento de un fármaco a un polipéptido y comprenden, por ejemplo, enlace disulfuro usando sulfhidrilo activado por N-piridil sulfonilo.

En particular, es posible injertar moléculas a los polipéptidos de la invención mediante enlace químico o mediante inserción genética para el direccionamiento in vivo a células diana de CyaA, tales como CPA, por ejemplo, células CD11b/CD18 positivas y particularmente al citosol dichas células. De hecho, cuando se acopla una molécula correspondiente a un epítopo de linfocito T CD8+ dado al dominio catalítico de CyaA destoxificada, mediante un enlace disulfuro o por inserción genética, se ha descubierto que la molécula modificada por ingeniería puede provocar una respuesta CTL específica in vivo, mostrando de este modo que dicho epítopo de linfocito T CD8+ se transloca al citosol de células que expresan CD11b.

En una realización preferida de la invención, el polipéptido CyaA mutante se usa en la fabricación de un vector proteico o en la preparación de una composición diseñada específicamente para sensibilizar una respuesta de linfocito T citotóxicas CD8+ (respuesta CTL) en el dicha respuesta sigue al direccionamiento del polipéptido CyaA mutante modificado (especialmente recombinado o conjugado) con una molécula de interés a células que expresan CD11b, seguido de la translocación de la molécula de interés al citosol de dichas células que expresan CD11b, y en particular a células dendríticas mieloides. En este contexto, la molécula de interés es o comprende preferentemente un epítopo o un antígeno.

En otra realización preferida de la invención, el polipéptido CyaA mutante se usa en la fabricación del vector proteico

o en la preparación de una composición diseñada específicamente para sensibilizar una respuesta de células CD4+ cuando dicha respuesta sigue al direccionamiento de la adenilciclasa modificada (especialmente recombinada o conjugada) con una molécula de interés a células que expresan CD11b, en particular células dendríticas mieloides.

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sarcoma; leucemia; mieloma. Para estos diversos tipos de cánceres histológicos, se ha observado que los péptidos antigénicos se expresan específicamente en muestras de tumor y están reconocidos por linfocitos T, especialmente por linfocitos T CD8+ o linfocitos T CD4+.

Adicionalmente la invención se refiere al uso de un derivado polipeptídico de acuerdo con la invención, para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de neoplasia, cánceres y enfermedades infecciosas seleccionadas de enfermedades inducidas por virus o retrovirus.

En una realización preferida, el polipéptido derivado polipeptídico de acuerdo con la invención puede administrarse a un paciente en combinación con un adyuvante y/o en combinación con otra molécula o agente terapéuticamente activo.

En el contexto de la presente invención dicha “otra molécula o agente terapéuticamente activo” es uno que puede ser beneficioso para la afección de un paciente al cual se administra. Es especialmente un principio activo adecuado para su uso en la preparación de un fármaco. Puede ser un compuesto adecuado para potenciar, aumentar o modular el efecto de un principio terapéuticamente activo.

El polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico del mismo pueden administrarse con una molécula o un agente terapéuticamente activo, en particular uno adecuado para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente.

En particular, el polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico del mismo pueden administrarse con un agente terapéuticamente activo adecuado para modular una respuesta celular en un paciente, en particular para reducir o bloquear la capacidad inmunosupresora de linfocitos T reguladores.

De acuerdo con una realización particular de la invención, dicho efecto sobre una respuesta celular reguladora puede obtenerse con un agente que modula un linfocito T regulador y/o que modula otra respuesta supresora celular, tal como la respuesta celular supresora mieloide, dirigiendo dicho agente a dichas células reguladoras, especialmente linfocitos T, agotando o inactivando estas células (tal como con anticuerpo CD25 específico, o ciclofosfamida), alterando el tránsito de dichas células, especialmente linfocitos T reguladores (tal como anticuerpo CCL22 específico) o alterando la diferenciación y señalización de dichas células (tal como bloqueando la señal FOXP3 (forkhead box P3)).

De acuerdo con una realización particular de la invención, el agente modulador de una respuesta celular reguladora dirige moléculas supresoras, especialmente dichas moléculas presentes en CPA (tales como B7-H1, B7-H4, IDO (indolamina, 2,3-dioxigenasa) o arginasa) o en linfocitos T (tales como CTLA4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) o PD1 (muerte celular programada 1)), o dirige moléculas inmunosupresoras solubles (tales como TGF beta (factor de crecimiento transformante), IL-10, VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), COX2 (ciclooxigenasa 2)).

Como ejemplos de agentes que tienen un efecto sobre una respuesta celular reguladora, se proponen agentes citotóxicos, que puede eliminar linfocitos T reguladores u otras células inmunosupresoras, o que pueden bloquear su actividad y/o desarrollo y/o acumulación.

En una realización particular de la invención, el agente que modula la respuesta celular reguladora, especialmente una respuesta de linfocitos T reguladores, es un agente quimioterapéutico. Especialmente se selecciona entre agentes quimioterapéuticos conocidos como agentes antineoplásicos y usados en quimioterapia. Dichos agentes incluyen aquellos que ayudan a reducir la carga tumoral, aquellos que actúan aumentando la sensibilidad de las células tumorales al tratamiento o aquellos que posibilitan la eliminación o inactivación de células reguladoras inmunitarias. Por lo tanto, los agentes quimioterapéuticos que se utilizan dentro del marco de la invención potencian la inmunidad antitumoral.

En una realización particular de la invención, el agente quimioterapéutico es un agente alquilante. Especialmente, es ciclofosfamida (CTX) (Sigma, Steinheim, Alemania). La ciclofosfamida tiene la capacidad de agotar o inactivar linfocitos T reguladores.

En otra realización particular de la invención, el agente quimioterapéutico es un agente intercalante.

En una realización particular, el agente quimioterapéutico es doxorrubicina (DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, EEUU).

El agente quimioterapéutico se administra ventajosamente a dosis bajas.

El polipéptido CyaA mutante o el derivado polipeptídico del mismo también pueden administrarse con un componente adyuvante, adecuado para activar la respuesta inmunitaria innata sensibilizada por un tumor en un paciente.

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documento.

En otra realización específica, la composición farmacéutica o inmunogénica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el derivado polipeptídico CyaA recombinante que comprende un polipéptido mutante de CyaA como se define en el presente documento acoplado a una molécula de interés.

Adicionalmente, la invención también se refiere al uso de la composición inmunogénica definida anteriormente para la preparación de una vacuna o una composición inmunoterapéutica, para su administración a un hospedador animal

o humano.

Como se usa en el presente documento, la expresión “composición inmunoterapéutica” se refiere a una composición que conduce a una respuesta inmunológica y que está asociada a tratamientos terapéuticos, tales como tratamiento contra neoplasia, cánceres, infecciones por virus, infecciones fúngicas, infecciones por parásitos o infecciones bacterianas.

La divulgación describe un método para inmunizar a un hospedador animal o humano, en el que dicho método comprende las etapas de:

a) proporcionar una composición inmunogénica como se define anteriormente;

b) administrar a dicho hospedador, dicha composición inmunogénica, preferentemente mediante vía intravenosa, para promover una respuesta inmunitaria.

En particular, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden inducir o estimular, in vivo o in vivo una respuesta celular inmunitaria que implique específicamente células dendríticas. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse en particular para vacunación preventiva o terapéutica de un paciente.

Como consecuencia, en una realización específica, la composición inmunogénica o farmacéutica está ventajosamente desprovista de adyuvantes sensibilizadores habitualmente usados en la técnica, tales como hidróxido de aluminio.

La invención también se refiere a un método para la preparación de un vector proteico adecuado para el suministro de una molécula de interés a una célula que comprende la unión de la molécula de interés a un polipéptido CyaA mutante definido en el presente documento.

La divulgación describe moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ADN o ARN, que codifican un polipéptido o derivado polipeptídico definido anteriormente.

La divulgación describe células eucariotas o procariotas que comprenden las moléculas de ácido nucleico definidas anteriormente.

La divulgación describe células eucariotas, preferentemente células de mamífero, que comprenden un polipéptido CyaA mutante o derivado polipeptídico definido anteriormente. Como se describe en el presente documento, las células son células humanas.

La divulgación describe células eucariotas, preferentemente células de mamífero, transformadas con el vector proteico definido anteriormente.

Figuras

Fig. 1. Las sustituciones en los dominios de formación de poros y de acilación sinergizan en la disminución de la actividad hemolítica específica de CyaA. (A) Se incubaron eritrocitos de oveja (5x108/ml) en tampón TNC con 5 g/ml de proteínas CyaA enzimáticamente activas a 37 ºC. Después de 30 min, las alícuotas de las suspensiones celulares se lavaron repetidamente para retirar la CyaA no unida y se usaron para determinar la cantidad de actividad AC asociada a células e invasiva de células. La actividad hemolítica se midió después de 5 horas de incubación como la cantidad de la hemoglobina liberada por determinación fotométrica (A541). La actividad de CyaA intacta se tomó como el 100 %. (B) Se incubaron eritrocitos como se ha indicado anteriormente con las concentraciones indicadas de las proteínas derivadas de CyaA enzimáticamente activas durante 30 min, se lavaron, y se determinó la cantidad de actividad enzimática AC asociada a célula. (C) La actividad de unión celular reducida de las proteínas con la sustitución K860R se compensó aumentando su concentración de 5 g/ml a 25 g/ml. Las actividades de CyaA/233OVA (CyaA/OVA) en presencia se tomaron como el valor del 100 %. Los resultados representan valores promedio de al menos tres experimentos independientes realizados por duplicado. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (**, p< 0,001) de actividades de CyaA (Fig. 1A) o CyaA/OVA (Fig. 1C).

Fig. 2. CyaA/OVA/E570Q+K860R se une y se transloca al interior de monocitos CD11b+. (A) Células J774A.1

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Fig. 11. Secuencia de ADN del plásmido QR-AC-que codifica el mutante CyaA/E570Q+K860R/AC-(SEQ ID NO: 5)

Fig. 12. Plásmido que codifica el mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R/AC-(OVA-QR-AC-).

Fig. 13. Secuencia de ADN del plásmido OVA-QR-AC-que codifica el mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R/AC(SEQ ID NO: 6)

Fig. 14. Secuencia de aminoácidos de la toxina CyaA de Bordetella parapertussis (número de registro CAB76450, SEQ ID NO: 7)

Fig. 15. Secuencia de aminoácidos de la toxina CyaA de Bordetella hinzii (número de registro AAY57201, SEQ ID N°8)

Fig. 16. Secuencia de aminoácidos de la toxina CyaA de Bordetella bronchiseptica (número de registro CAA85481, SEQ ID NO: 9)

Ejemplos

La toxina adenilato ciclasa se transloca a través de la membrana de la célula diana sin formación de un poro

Materiales y métodos

Construcción, producción y purificación de proteínas CyaA. Las modificaciones que producen las construcciones CyaA/AC-, CyaA/233OVA, CyaA/E570Q y CyaA/K860R se han descrito anteriormente (13, 20, 21) y se introdujeron en CyaA/233OVA/AC-individualmente o en combinación. Se produjeron proteínas derivadas de CyaA en E. coli XL-1 Blue y se purificaron cerca de homogeneidad como se ha descrito anteriormente (29). Durante la cromatografía hidrófoba, la resina con la toxina unidad se lavó repetidamente con isopropanol al 60 % (30) para reducir el contenido de endotoxinas de las muestras de CyaA por debajo de 100 UI/mg de proteína, determinado por el ensayo LAL QCL-1000 (Cambrex).

Una cepa de Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene), que contenía el plásmido QR-AC-(figura 10), que codifica el mutante CyaA/E570Q+K860R/AC-, se depositó el 18 de marzo de 2009 en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Francia) con el número de registro CNCM I-4136 (figura 10). La secuencia de ADN del plásmido QR-AC-(SEQ ID NO: 5) se desvela en la figura 11.

Una cepa de Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene), que contenía el plásmido OVA-QR-AC-(figura 12), que codifica el mutante CyaA/233OVA/E570Q+K860R/AC-, se depositó el 18 de marzo de 2009 en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Francia) con el número de registro CNCM I-4137 (figura 10). La secuencia de ADN del plásmido OVA-QR-AC-(SEQ ID NO: 6) se desvela en la figura 13.

Unión a las células y actividades hemolíticas en eritrocitos de oveja. Se incubaron 5x108 eritrocitos de oveja lavados en Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y CaCl2 2 mM (tampón TNC) a 37 ºC con 5 g/ml de proteínas CyaA y se determinó la unión a las células, la AC invasiva de células y las actividades hemolíticas de CyaA como se describe con detalle anteriormente (13). La significancia de diferencias en valores de actividad se analizó usando un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) con el post-ensayo de Bonferroni (SigmaStat v. 3.11, Systat, San José, CA).

Unión a macrófagos, elevación de AMPc y capacidades de lisis celular de CyaA. Se cultivaron monocitos/macrófagos murinos J774.AI (ATCC, número TIB-67) a 37 ºC en una atmósfera con aire humidificado/CP2 (19:1), en medio RPMI complementado con suero bovino fetal termoinactivado al 10 % (v/v), penicilina (100 UI ml-1), estreptomicina (100 g ml-1) y anfotericina B (250 ng ml-1). Antes de realizar los ensayos, el RPMI se reemplazó con medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) (Ca2+ 1,9 mM) sin FCS y se dejó que las células reposaran en DMEM durante 1 h a 37 ºC en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 % (8). Los macrófagos J774A.1 (106) se incubaron en D-MEM con 2,5 g/ml de variantes de CyaA durante 30 min a 4 ºC, antes de retirar la toxina no unida mediante tres lavados en D-MEM. Las células se lisaron con Triton X-100 al 0,1 % para la determinación de la actividad AC unida a las células. Para los ensayos de AMPC intracelular, 105 células se incubaron con CyaA durante 30 minutos en D-MEM con IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) 100 M, la reacción se detuvo por la adición de Tween20 al 0,2 % en HCL 100 mM, las muestras se hirvieron durante 15 min a 100 ºC, se neutralizaron con la adición de imidazol no tamponado 150 mM y el AMPc se midió como se ha descrito (29). Para bloquear el receptor CD11b/CD18, las células se preincubaron durante 30 min en hielo con el anticuerpo monoclonal (AcM) M1/70 bloqueante específico de CD11b (Exbio, República Checa) a una concentración final de 10 g/ml antes de la adición de CyaA. La lisis inducida por toxina de las células J774A.1 se determinó usando el kit de ensayo CytoTox 96 (Promega) como la cantidad de lactato deshidrogenasa liberada de 105 células en 3 horas de incubación con 10 g/ml de la proteína apropiada a 37 ºC en D-MEM como se describe (8). La significancia de las diferencias en los valores de actividad se analizó como se ha indicado anteriormente.

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Claims (1)

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