FR3107902A1 - Bacteries gram-positives de l’espece lactococcus lactis ou streptococcus thermophilus ayant une tres faible proteolyse de surface, leurs methodes d’obtention et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une bactérie dans laquelle l’expression et/ou l’activité de protéases de surface est inhibée, son procédé de préparation ainsi que les utilisations de cette bactérie.
Description
La présente invention concerne des bactéries Gram-positives de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus présentant une très faible protéolyse de surface; elle se rapporte également à l’utilisation de ces bactéries, notamment pour la production de protéines d’intérêt.
Une analyse des peptides produits par la bactérieLactococcus lactiset accumulés dans son milieu de culture a mis en évidence une forte accumulation de peptides d'origine bactérienne (Guillotet al., 2016). Cet ensemble de peptides définit le peptidome exocellulaire ou exopeptidome de la bactérie. L'analyse de ces peptides montre qu’approximativement la moitié d’entre eux provient de la dégradation de protéines de surface qui ne sont ni cytoplasmiques ni transmembranaires.
Cette dégradation serait due à la présence de plusieurs protéases localisées en surface de la bactérie. Deux protéases ainsi localisées ont déjà été caractérisées chez les bactéries lactiques. L'une, une sérine protéase de la famille des subtilisines, appelée PrtS chezStreptococcus thermophilus(S. thermophilus) et PrtP chezLactococcus lactis(L. lactis), ancrée de façon covalente à la paroi est capable d’hydrolyser les caséines du lait (Fernandez-Esplaet al., 2000 et Siezenet al., 1999). La seconde, également une protéase à sérine, appelée HtrA, a été caractérisée chezL.lactis(Poquetet al., 2000); une homologue chezS.thermophilusest également présente. Cette protéase hydrolyse des protéines anormales et/ou mal repliées et intervient dans la maturation des protéines exportées (Poquetet al., 2000).
L’un des principaux inconvénients de cette protéolyse de surface est rencontré lors de la production de protéines d’intérêt par des bactéries, notamment des bactéries Gram-positives. En effet, la protéolyse de surface entraîne une dégradation de ces protéines pendant et/ou après leur exportation, conduisant à une baisse du rendement et/ou une altération de la structure et de l’activité de la protéine d’intérêt.
Il apparaît donc souhaitable d’obtenir des souches de bactéries présentant une très faible protéolyse de surface par rapport aux souches sauvages.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont construit des simples et doubles mutants pour PrtS et HtrA dans la souche LMD9 deS.thermophilus(voir exemple 1) et sont arrivés à la conclusion que la délétion des deux protéases PrtS et HtrA n’abolit pas la protéolyse de surface chezS.thermophilusLMD9 puisqu’une protéolyse résiduelle est observée (voir exemple 2). Les mêmes résultats ont été obtenus pour les souches MG1363 et IL1403 deL. lacti s(Guillotet al., 2016) et confirment donc que les protéases de surface HtrA et PrtS/PrtP ne sont pas responsables à elles seules de l’ensemble de l’activité protéolytique de surface de ces souches.
L’hypothèse formulée par les Inventeurs est alors qu’une ou plusieurs protéases responsables de cette activité résiduelle sont présentes chez chacune des trois souches. C’est ainsi qu’ils ont identifié la protéase Ster-1612 (ou STER_RS07910 dans la nouvelle annotation NCBI) dans la souche sauvage LMD9 deS . thermophilus; cette protéase est dénommée YwdF (ou EFV54_RS11495 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche IL1403 deL . lactissubsp. lactiset llmg-2442 (ou LLMG_RS12255 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche MG1363 deL . lactissubsp. cremoris(voir exemple 3). Cette protéase appartient à la famille S16 des protéases LonA (Gottesmanet al., 1978 et Charretteet al., 1981) qui sont des protéases à sérine, caractérisées par la présence d’une dyade catalytique Serine – Lysine conservée en région C-terminale de la protéine (Botoset al., 2004).
Les Inventeurs ont ensuite construit des souches dérivées deS. thermophilusLMD9 dans lesquelles tout ou partie des trois protéases PrtS, HtrA et Ster-1612 ont été inactivées (voir exemple 1) ; l’inactivation des trois protéases conduit à une protéolyse de surface quasiment abolie chez cette bactérie (voir exemple 4). En outre, ils ont construit la souche deS.thermophilusLMD9 dans laquelle les trois protéases PrtS, HtrA et Ster-1612 ont été inactivées et produisant les protéines hétérologues IL-10 ou élafine (voir exemple 6) et ont confirmé que l’inhibition de ces trois protéases n’entrainait plus de dégradation de protéines hétérologues permettant ainsi l’amélioration du rendement de production de protéines hétérologues, par rapport à la bactérie parente sauvage (voir exemple 7).
La présente invention a donc pour objet une bactérie Gram-positive de l’espèceLactococcus lactisouStreptococcus thermophilus, telle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1, a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie,
où SEQ ID N°1 est définie comme suit:
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K
avec
X1 est l’histidine (H) ou la lysine (K);
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T);
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V);
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q);
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V);
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y);
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
La protéase de surface endogène est une protéase à sérine dont l’activité enzymatique peut être caractérisée par l’évaluation de la dégradation d’un substrat chromogénique par dosage colorimétrique, ou d’un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou encore par analyse en chromatographie liquide HPLC.
De préférence, le motif d’acides aminés compris dans ladite protéase possède au moins 80% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence d’acide aminés SEQ ID N°1 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie Gram-positive est de l’espèceStreptococcus thermophiluset la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la protéase de surface endogène est Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2.
Selon encore un autre mode de réalisation, la bactérie Gram-positive est de l’espèceLactococcus lactiset la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la bactérie Gram-positive peut êtreLactococcus lactis subsp. lactiset la protéase de surface endogène est YwdF de séquence SEQ ID N°3 ou la bactérie Gram-positive peut encore êtreLactococcus lactis subsp. cremoriset la protéase de surface endogène est llmg2442 de séquence SEQ ID N°4.
Sauf indication contraire, les pourcentages d’identité sont calculés à partir d’un alignement global des séquences d’acides aminés effectué à l’aide de l’algorithme «needle» (Needleman et Wunsch, 1970) en utilisant les paramètres par défaut: «Matrix»: EBLOSUM62, «Gap penalty»: 10,0 et «Extend penalty»: 0,5.
La séquence nucléotidique du gène codant Ster-1612 est représentée par la séquence SEQ ID N°5. La séquence nucléotidique du gène codant YwdF est représentée par la séquence SEQ ID N°6. La séquence nucléotidique du gène codant llmg_2442 est représentée par la séquence SEQ ID N°7.
L’analyse de 102 génomes de la sous-espèceL. lactissubsp.lactis,a permis de définir un degré de conservation de YwdF supérieur à 80% pour 100 souches, les 2 dernières n’ayant apparemment pas le gène codant YwdF. La conservation de séquence est également forte au sein de la sous-espèceL. lactissubsp.cremoris, puisque parmi les 56 génomes analysés, 51 ont un gène codant une protéine identique à plus de 80% à la protéine llmg_2442 deL.lactissubsp.cremorisMG1363, 5 ne semblant pas posséder le gène codant cette protéine.
A titre d’illustration et sans caractère limitatif, la bactérie Gram-positive selon l’invention peut être obtenue à partir d’une souche deS. thermophilusLMD9, deS. thermophilusCNRZ1066, deLactococcus lactissubsp.lactisIL1403, deLactococcus lactissubsp.cremorisMG1363.
La bactérie selon l’invention présente une très faible protéolyse de surface par rapport à la bactérie parente dont elle dérive; cette protéolyse est estimée à moins de 10% et préférentiellement moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive (voir le protocole de quantification de la protéolyse dans l’exemple 2).
Par «l’expression d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée», on entend la diminution de quantité de la protéase produite par la bactérie de l’invention en comparaison avec la bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l’expression de ladite protéase n’est pas diminuée, quelle qu’en soit la cause (diminution du niveau d’expression du gène codant la protéase, réduction du nombre d’ARNs messagers, dégradation de la protéase).
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’expression d’une protéase dans une bactérie comprennent par exemple la RT PCR quantitative pour évaluer le niveau d’expression du gène codant la protéase ou le dosage de la protéine par Elisa pour quantifier la protéine synthétisée.
Par «l’activité d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée», on entend la diminution de l’activité de la protéase produite par la bactérie selon l’invention en comparaison avec une bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l’activité de ladite protéase n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’activité d’une protéase dans une bactérie comprennent par exemple le comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation chromatographique (Guillotet al., 2016), l’évaluation de la dégradation d’un substrat chromogénique permettant de quantifier aisément l’activité par dosage colorimétrique, ou d’un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou analyse en chromatographie liquide HPLC….
Par «l’expression et/ou une activité d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est abolie», on entend l’absence d’expression et/ou d’activité de la protéase; c’est le cas lorsque la protéolyse de la bactérie considérée représente moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l’exemple 2. Une telle abolition de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène peut être obtenue par diminution totale de l’expression et/ou de l’activité de la protéase (au sens défini ci-dessous) ou encore survenir lorsque le gène de structure de la protéase n’est pas naturellement présent dans le génome de la bactérie, ou présent sous une forme tronquée (pseudogène).
De préférence, la bactérie de l’espèceS. thermophilusselon l’invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie.
De préférence, la bactérie de l’espèceL. lactisselon l’invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie.
La protéase de surface, dénommée HtrA chezStreptococcus thermophilus, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQIDN°8, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée HtrA chezLactococcus lactis, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQID N°10, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
La séquence nucléotidique du gène codant HtrA est représentée par la séquence SEQ ID N°12 dans le cas d’une souche deS. thermophilus, et par la séquence SEQ ID N°13 dans le cas d’une souche deLactococcus lactis.
La protéase de surface, dénommée PrtS chezStreptococcus thermophilus, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQID N°9, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée PrtP chezLactococcus lactis, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQID N°11, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
La séquence nucléotidique du gène codant PrtS est représentée par la séquence SEQ ID N°14 dans le cas d’une souche deS. thermophilus, par la séquence SEQ ID N°15 dans le cas d’une souche deLactococcus lactis.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’espèceS. thermophilusselon l’invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 ont une expression et/ou une activité diminuée ou abolie.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’espèceL. lactisselon l’invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11 ont une expression et/ou une activité diminuée ou abolie.
Dans le cas présent, la diminution de l’expression de chacune des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l’invention est mesurée par exemple par RT PCR quantitative pour évaluer le niveau d’expression de chacun des gènes codant les protéases, ou par dosage ELISA pour quantifier chacune des protéines synthétisées, et est comparée à l’expression des protéases de surface d’une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’ensemble de l’activité des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l’invention peut être mesurée par comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation en chromatographie liquide (HPLC) et est comparée à l’ensemble de l’activité des protéases de surface d’une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéases peut être totale ou partielle. La diminution de l’expression et/ou de l’activité est considérée comme totale au sens de l’invention lorsqu’elle représente moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l’exemple 2. Elle est considérée comme partielle lorsqu’elle est significativement inférieure à celle de la bactérie parente dont elle dérive. La significativité de la différence est estimée par un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) avec une probabilitéPinférieure à 0.05.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité de protéases de surface endogènes telles que définies ci-dessus dans une bactérie, peut être obtenue de différentes manières détaillées ci-après.
Cette diminution de l’expression et/ou de l’activité de protéases de surface endogènes peut être obtenue par mutagenèse des gènes codant ces protéases. Cette mutagénèse peut alors intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l’expression de ces gènes, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction des protéases. Par exemple, l’introduction d’une ou plusieurs mutations ponctuelles à l’intérieur de la séquence codante d’un gène ou de ses séquences de régulation d’expression peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l’introduction d’un codon stop dans la séquence et/ou l’inhibition de la transcription ou de la traduction des gènes codant ces 3 protéases et/ou une substitution d’un des acides aminés du site actif de l’enzyme et conduire à l’expression d’une protéase inactive, ou d’une protéase avec une activité diminuée. Enfin, lorsque le gène codant l’une des protéases de surface est organisé en opéron (cas de ster-1612 chezS. thermophilus, et probablement de YwdF et llmg2442 chezL. lactis), l’introduction d’une ou plusieurs mutations ponctuelles à l’intérieur de la séquence codante d’un gène de l’opéron autre que celui codant la protéase peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l’introduction d’un codon stop dans la séquence et ainsi abolir l’expression de la protéase (mutation polaire). Il en va de même pour la séquence régulant l’expression de l’ensemble de l’opéron.
La bactérie selon l’invention peut être obtenue par délétion, insertion et/ou substitution d’un ou de plusieurs nucléotides, par exemple par délétion de tout ou partie de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par la substitution d’un ou plusieurs nucléotides de la séquence codante du gène codant un des acides aminés du site actif de la protéase ou de son promoteur, ou par introduction d’une mutation polaire dans le cas d’un gène organisé en opéron. Des méthodes permettant de déléter, d’insérer et/ou substituer une séquence génétique donnée chez la bactérie, en particulier chezS. thermophilus et Lactococcus lactis, sont bien connues de l’homme du métier (Gardanet al., 2009 et Biswaset al., 1993). Par exemple, l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase peut être réalisée en utilisant des transposons d’origine naturelle ou artificielle.
La mutagénèse peut être mise en œuvre par l’induction de mutations aléatoires, par exemple en utilisant des agents physiques, tels que les radiations ou chimiques tels que l’EMS (Ethyl Methane Sulfonate) ou de manière ciblée par transfection, transduction, transformation naturelle ou par électroporation (Bronet al., 2019). Alternativement, la mutagénèse peut être mise en œuvre par des méthodes utilisant des nucléases (TALEN, CRISPR/Cas9, Weiet al., 2013).
La diminution de l’activité des protéases peut être obtenue par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine (PMSF [PhenylMethaneSulfonyl Fluoride], DFP [DiisopropylFluoroPhosphate], triterpenoïde, coumarine, serpines, peptidomimetics…, Shamsiet al., 2016; Soualmia et El Amri, 2018). Enfin, la diminution de l’expression des protéases peut être obtenue par modification de la séquence promotrice du gène selon par exemple l’une des méthodes utilisées pour substituer une séquences nucléotidique citées ci-dessus, ou par une technique d’interférence ARN (RNAi), par expression d’un ARN antisense ou encore par des aptamères.
Les gènes mutés codant les protéases telles que définies précédemment peuvent être identifiés par exemple par PCR à l’aide d’amorces spécifiques desdits gènes, PCR éventuellement suivie d’un séquençage du fragment PCR dans le cas de mutations n’affectant pas la taille dudit gène (substitutions, par exemple).
Les Inventeurs ont recherché la présence des gènes codant ces trois protéases de surface, STER_1612, HtrA et PrtS, dans 61 génomes deS. thermophilus, et la conservation des séquences protéiques correspondantes a été analysée. La variabilité de la présence de la protéase PrtS au sein de l’espèceS. thermophilusétait déjà connue (Delormeet al., 2010). A l’inverse, les deux protéases HtrA et STER_1612 sont présentes chez toutes les souches, et leurs séquences protéiques sont très bien conservées (hormis une souche, N4L, dont le gène codant HtrA serait un pseudogène).
Ainsi, on peut distinguer deux groupes de souches deS. thermophilussur la base de leur équipement en protéases de surface: un groupe A de 24 souches qui possèdent les trois protéases PrtS, HtrA et STER_1612, auquel appartient la souche LMD9 et un groupe B de 37 souches qui possède les deux protéases HtrA et STER_1612 et ne possède pas la protéase PrtS, auquel appartient la souche CNRZ1066.
Les Inventeurs ont évalué le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER_1612 sur la protéolyse de surface des souches deS. thermophilusdu groupe B et ont montré que la protéolyse de surface résiduelle du double mutant est comparable à celle obtenue avec le triple mutant de la souche LMD9 (voir exemple 5).
Que la soucheS. thermophiluspossède deux ou trois protéases de surface, l’inactivation des gènes codant respectivement pour ces deux ou trois protéases de surface suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.
Une bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférenceStreptococcus thermophilus, dans laquelle l’expression ou l’activité des 3 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2, HtrA de séquence SEQ ID N°8, et PrtS de séquence SEQ ID N°9, de ladite bactérie est inhibée.
Une autre bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférenceStreptococcus thermophilus, en particulier une souche deStreptococcus thermophilusqui ne possèderait pas PrtS, dans laquelle l’expression ou l’activité des 2 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2 et HtrA de séquence SEQ ID N°8 de ladite bactérie est inhibée.
La présente invention a également pour objet une bactérie telle que définie précédemment, modifiée pour exprimer une protéine d’intérêt, par exemple une protéine hétérologue ou recombinante d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant pour la protéine d’intérêt, ou par intégration du fragment d’ADN d’intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Par protéine hétérologue, on entend une protéine qui n’est ni produite naturellement par la souche bactérienne, ni nécessaire à sa croissance.
La présente invention présente donc comme avantage l’expression par la bactérie selon la présente invention de protéines présentant un intérêt industriel, qui seront secrétées dans le milieu de culture de ladite bactérie et dans lequel les protéines d’intérêt pourront être facilement récupérées, ou associées à la surface bactérienne et exerçant leur activité enzymatique sur la face externe de la bactérie. Par protéine associée à la surface bactérienne, on entend une protéine ancrée de façon covalente à la paroi bactérienne via un motif d’ancrage spécifique de la sortase, une protéine insérée la membrane plasmique via une ancre membranaire localisée à l’extrémité N- ou C-terminale de sa séquence aminée, une protéine liée de façon covalent à la membrane via un motif d’ancrage lipidique situé à l’extrémité N-terminale de sa séquence aminée ou une protéine possédant des motifs d’association non covalents à la paroi de type LysM, par exemple (Cossart et Joncquières, 2000; Desvaux etal., 2018).
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d’une bactérie Gram-positive de l’espèceLactococcus lactisouStreptococcus thermophilus faiblement protéolytique, comprenant la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité d’une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1,
où SEQ ID N°1 est définie comme suit:
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K
avec
X1 est l’histidine (H) ou la lysine (K);
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T);
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V);
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q);
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V);
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y);
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chezStreptococcus thermophilusa au moins 70% et encore préférentiellement 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 et la protéase de surface endogène chezLactococcus lactisa au moins 70% et encore préférentiellement 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4.
De préférence, le procédé de préparation d’une bactérieStreptococcus thermophilusfaiblement protéolytique selon l’invention comprend en outre la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9.
De préférence, le procédé de préparation d’une bactérieLactococcus lactisfaiblement protéolytique selon l’invention comprend en outre la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11.
Par «bactérie faiblement protéolytique», on entend bactérie présentant une très faible protéolyse de surface par rapport à la bactérie parente dont elle dérive, c’est-à-dire estimée à moins de 10% et préférentiellement moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité de ces protéases peut être réalisée comme décrit ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérie Gram-positive de l’espèceLactococcus lactisouStreptococcus thermophilus, comprenant la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité d’une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1,
où SEQ ID N°1 est définie comme suit:
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K
avec
X1 est l’histidine (H) ou la lysine (K);
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T);
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V);
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q);
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V);
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y);
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chezStreptococcus thermophilusa au moins 70% et encore préférentiellement 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 et la protéase de surface endogène chezLactococcus lactisa au moins 70% et encore préférentiellement 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4.
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérieStreptococcus thermophiluscomprend en outre, la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9.
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérieLactococcus lactiscomprend en outre, la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11.
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon la présente invention pour la production de protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant pour la protéine hétérologue d’intérêt ou par intégration du fragment d’ADN d’intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Parmi les protéines hétérologues d’intérêt, on peut citer l’élafine qui est un inhibiteur d’activité protéolytique. Cette activité est particulièrement recherchée, notamment pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, dans lequel l’activité de protéases humaines doit être inhibée (Bermudez-Humaranet al., 2015). Plus généralement, on peut citer des protéines anti-inflammatoires ciblant le système immunitaire mucosal (cytokines, facteur trefoil humain TFF-1…), des protéines vaccinales (fragment C de la toxine tétanique, antigène E7 du papillomavirus humain, ), des peptides antibactériens ciblant des déséquilibres de la flore intestinale (défensines, cathelidicines, protéine PAP associée aux pancréatites), des enzymes palliant des déficiences ou des carences (superoxyde dismutase, phénylalanine hydroxylase, glutamate décarboxylase), etc (Neirynck et Steidler, 2006; Bermudez-Humaranet al., 2013, Bermudez-Humaran et Langella, 2018). On peut également envisager des protéines ayant un intérêt en santé animale (protéines vaccinales antivirales, par exemple) ou des protéines d’intérêt technologique (estérase, aminotransférase…).
Parmi les souches de bactéries utilisées pour la production de protéines hétérologues d’intérêt, on peut citer les souchesL. lactisetS. thermophilus.
Lactococcus lactisest considérée comme la bactérie de référence pour la production de molécules d'intérêt thérapeutique. Son utilisation présente plusieurs avantages: il s’agit d’une bactérie alimentaire dont l'innocuité est reconnue (bactérie labellisée GRAS et QPS), elle est manipulable génétiquement et un mutant de délétion du gène codant la protéase HtrA est disponible. Il a alors été démontré que la production d'élafine par ce mutant était supérieure à celle de la souche sauvage, et que le traitement de souris présentant une colite par administration orale de la souche mutée était plus efficace qu'avec la souche sauvage (Bermudez-Humaranet al., 2015).
Par ailleurs,Streptococcus thermophil u sselon l’invention présente également de nombreux avantages: elle est thermophile, son optimum de température correspond à la température du corps humain de 37°C, elle est facilement transformable et totalement dépourvue d’activité protéolytique de surface, ce qui évite la dégradation de la protéine hétérologue d’intérêt au fur et à mesure de sa production.
Une bactérie particulièrement avantageuse pour la production de protéines hétérologues d’intérêt est une bactérie deS. thermophilustelle que définie dans la présente invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d’une protéine hétérologue, mettant en œuvre une bactérie de l’invention, telle que définie précédemment.
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré-maturation du lait.
Un des problèmes qui se pose en technologie laitière est la variation de la composition des laits en azote non protéique (acides aminés libres et peptides). Ceci est particulièrement marqué lors des changements de régime alimentaire des animaux, aboutissant aux laits d’été et d’hiver de compositions très différentes. Ces variations de composition en azote non protéique sont à l’origine de variations de croissance des bactéries lactiques dans le lait, cette croissance étant étroitement dépendante de l’utilisation de ces sources azotées non protéiques. Ces variations de croissance aboutissent à un défaut de reproductibilité des temps de fermentation, ce qui constitue une difficulté pour les industries laitières.
L’utilisation d’une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré-maturation du lait permet d’abolir ces variations. En effet, dans un premier temps qui correspond à l’étape de pré-maturation, les sources d’azote non protéique utilisables seraient consommées, sans que des protéases de surface puissent hydrolyser les protéines du lait et générer de nouvelles sources d’azote non protéiques. Dans un second temps, la croissance du levain servant à fermenter le lait ne reposerait plus que sur son aptitude à hydrolyser les caséines, portée par les protéases PrtP et PrtS, selon la bactérie considérée. Une telle opération a donc pour effet de standardiser la croissance du levain, en abolissant les variations de croissance dues aux variations de composition du lait en azote non protéique.
Une bactérie particulièrement avantageuse en tant que ferment de pré-maturation du lait est une souche deS. thermophilustelle que définie dans la présente invention.
La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux exemples non-limitatifs illustrant la très faible activité protéolytique de surface d’une bactérie selon l’invention dans laquelle les 2 (souche CNRZ1066∆htrA∆ster_ 1612) ou 3 protéases (souche LMD9∆htrA∆prtS∆ster_ 1612) telles que définies dans l’invention est inhibée, par rapport à la souche de bactérie parente dont elle dérive (souche CNRZ1066 ou souche LMD9), ainsi que des figures annexées:
EXEMPLE1: CONSTRUCTIONS DES MUTANTS DE LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9 ET DE LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS CNRZ1066
1) Construction des simples mutants∆ htrA ,∆ prtS et∆ STER_1612 de la souche S. thermophilus LMD9
Principe général
Les mutants simples ∆htrA, ∆prtSet ∆STER_1612 sont construits à partir de la souche sauvageS.thermophilusLMD9 par remplacement de gène. La technique utilisée consiste à produire un fragment PCR associant trois amplicons :
un amplicon amont correspondant à une région située au début du gène à remplacer,
une cassette de résistance à un antibiotique et
un amplicon aval correspondant à une région située en fin du gène à remplacer.
Les trois amplicons sont produits séparément puis associés via une PCR supplémentaire finale. Cette association est rendue possible grâce à l'ajout d'extensions aux oligonucléotides utilisés pour amplifier les régions amont et aval qui permettent une liaison à la cassette de résistance à l'antibiotique (PCR overlap). Ce fragment PCR final est ensuite introduit dans la souche par compétence naturelle (WO2010/125091). L'homologie entre les fragments amont et aval du gène et du fragment PCR permet la recombinaison au site du gène à remplacer. Les colonies dont le gène ciblé a été remplacé par le gène de résistance peuvent facilement être isolées sur un milieu contenant l'antibiotique correspondant.
MutantΔhtrA
Une cassette de résistance à la kanamycine est utilisée. Les régions amont et aval du gènehtrAsont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique deS.thermophilusLMD9; la cassette de résistance à la kanamycine est amplifiée à partir du plasmide pKa (Trieu-Cuotet al., 1983) à l'aide des couples d'oligonucléotides htrA-amont-F/htrA-amont-R, htrA-aval-F/htrA-aval-R et aphA3-F/aphA3-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 1.
| Oligonucléotides | Séquence | SEQ ID N° |
| htrA-amont-F | GTA ATC ACG GTC ACC AAC C | 16 |
| htrA-amont-R | GAC ATC TAA TCT TTT CTG AAG TAC ATC CGC AAC AGT AAA CCA CCT AGT AAG CC | 17 |
| htrA-aval-F | ATA ATC TTA CCT ATC ACC TCA AAT GGT TCG CTG GGT AGT GTT CAG AAA GGT ATG CC | 18 |
| htrA-aval-R | GGA TTG AGA TTT GAT CGT TG | 19 |
| aphA3-R | GTT GCG GAT GTA CTT CAG | 20 |
| aphA3-F | CCA GCG AAC CAT TTG AG | 21 |
Tableau 1
Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne avec le kit PCR Clean-Up (Promega) et les tailles attendues (480 pb, 580 pb et 1350 pb) sont vérifiées par électrophorèse sur gel d'agarose. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides htrA-amont-F et htrA-aval-R pour obtenir un fragment de 2410 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole de transformation naturelle suivant. Une première pré-culture est réalisée pendant la journée en milieu M17 avec 1% de lactose (M17lac) (Terzaguiet al., 1975) à partir d'un stock congelé de la souche; à partir de laquelle une deuxième pré-culture en milieu chimiquement défini (MCD) (Letortet al., 2001) est réalisée pendant la nuit. Cette deuxième pré-culture est utilisée pour ensemencer une culture en MCD à une densité optique à 600 nm (DO600) de 0,05. Après 1h d'incubation à 42°C, le produit PCR associant les trois fragments est ajouté à un aliquot de la culture. Après incubation à 42°C, l'aliquot de culture est étalé sur boites de M17lac gélosé contenant 1mg/ml de kanamycine. Les boites sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
MutantΔprtS
Une cassette de résistance à l'érythromycine est utilisée. Les régions amont et aval du gèneptrSont été amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique deS.thermophilusLMD9; la cassette de résistance à l'érythromycine est amplifiée à partir du plasmide pG+host9 (Biswaset al., 1993) à l'aide des couples d'oligonucléotides prtS-amont-F/prtS-amont-R, prtS-aval-F/prtS-aval-R et erm-F/erm-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 2.
| Oligonucléotides | Séquence | SEQ ID N° |
| prtS-amont-F | TGG TAA GCA CGT AGA CC | 22 |
| prtS-amont-R | CTA CTG ACA GCT TCC AAG GAG CTA AAG AGG TCC CAG GCT TGT CAA TTC ATC TG | 23 |
| prtS-aval-F | GCA AGT CAG CAC GAA CAC GAA CCG TCT TAT CTC CGA AAG CCA ACT TAG ATG G | 24 |
| prtS-aval-R | CGT ATG CTT ACC AAC AGA G | 25 |
| erm-F | GGG ACC TCT TTA GCT CCT TGG | 26 |
| erm-R | GGA GAT AAG ACG GTT CGT GTT CG | 27 |
Tableau 2
Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues (660 pb, 650 pb et 1060 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides prtS-amont-F et prtS-aval-R pour obtenir un fragment de 2370 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M17lac gélosé contenant de l'érythromycine (5µg/ml) qui sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
Mutant ∆STER_1612.
Une cassette de résistance à à la spectinomycine est utilisée. Les régions amont et aval du gèneSTER_1612sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique deS.thermophilusLMD9; la cassette de résistance à la spectinomycine est amplifiée à partir du plasmide pAT28 (Trieu-Cuotet al., 1990) à l'aide des couples d'oligonucléotides STER_1612-amont-F/STER_1612-amont-R, STER_1612-aval-F/ STER_1612-aval-R et spec-F/spec-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 3.
| Oligonucléotides | Séquence | SEQ ID N° |
| STER_1612-amont-F | CCC AAC AAC ACC AGG CTC ATT | 28 |
| STER_1612-amont-R | GAA AAA TTC TAT AGA AAC TTC TCT CAA TTA GGC TAA GGC TGA TCC GGA TGC CAA | 29 |
| STER_1612-aval-F | TAC AGA TTA ATA ATT ATT CTT TAT TAT ACA GAT CCA GAG TAA TTT CCA GTT GCC | 30 |
| STER_1612-aval-R | TTC GAG GCC TAC GCA ATG CG | 31 |
| spec-F | GAT CTG TAT AAT AAA GAA TA | 32 |
| spec-R | AGC CTA ATT GAG AGA AGT TTC | 33 |
Tableau 3
Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues (596 pb, 957 pb et 566 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides STER_1612-amont-F et STER_1612-aval-R pour obtenir un fragment de 2050 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M17lac gélosé contenant de la spectinomycine (150µg/ml) qui sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
2) Construction du double mutant∆ htrA ∆ prtS de la souche S. thermophilus LMD9
Le double mutant ∆htrA∆prtSest construit à partir du mutant simple ∆prtSpar transformation naturelle à l’aide d'ADN chromosomique du mutant ∆htrA. Après cassage des cellules aux billes de verre, l'ADN chromosomique du mutant ∆htrAest extrait au phénol-chloroforme, puis précipité à l'éthanol. Le mutant ∆prtSest transformé avec l'ADN chromosomique purifié du mutant ∆htrA, suivant le même protocole de transformation naturelle que décrit précédemment. Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu gélosé contenant de la kanamycine (1 mg/ml). Quelques clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie.
3) Construction des doubles mutants∆ htrA ∆ STER_1612, ∆ prtS ∆ STER_1612 et du triple mutant∆ htrA ∆ prtS ∆ STER_1612 de la souche S. thermophilus LMD9
Les doubles mutants ∆htrA∆STER_1612,∆prtS∆STER_1612et le triple mutant ∆htrA∆prtS∆STER_1612sont obtenus par transformation naturelle des souches LMD9∆htrA, LMD9∆prtSet LMD9∆htrA∆prtSavec le fragment PCR contenant les régions amont et aval du gène STER_1612 fusionnées à la cassette de résistance à la spectinomycine utilisé pour construire le simple mutant ∆STER_1612suivant le protocole décrit ci-dessus. Le protocole de sélection et de contrôle des mutants est celui décrit pour l'obtention du simple mutant LMD9∆STER_1612.
4)
Construction
des mutants de la souche
S. thermophilus
CNRZ1066
Le principe général de la construction des différents mutants est identique à celui décrit ci-dessus, de même que le protocole utilisé. Seules les différences sont indiquées ci-après.
Dans le cas des mutants simples, de l’ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 est utilisé comme matrice pour amplifier les régions amont et aval du gène à muter. Lors de la transformation naturelle de la souche CNRZ1066, la compétence de la souche est stimulée en ajoutant du peptide de compétence ComS (LPYFAGCL) à une concentration de 1µM pendant 10 minutes avant l’ajout du fragment PCR dans la culture.
Le double mutant CNRZ1066 ∆htrA∆STER_1612est obtenu par transformation naturelle de la souche CNRZ1066∆STER_1612avec de l’ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 ∆htrA .Quelques mutants ont été contrôlés par PCR sur colonie.
EXEMPLE2: LA DELETION DES DEUX PROTEASES P
RT
S ET H
TR
A N’ABOLIT PAS LA PROTEOLYSE DE SURFACE CHEZ LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9
La souche LMD9 produit naturellement les deux protéases de surface PrtS et HtrA. Pour évaluer leur rôle respectif dans la formation de l’exopeptidome de la souche LMD9, deux mutants simples ΔprtSet ΔhtrAet un double-mutant ΔhtrAΔprtSont été construits par transformation naturelle (WO2010/125091), suivant le protocole décrit dans l’exemple 1.
1)
Matériel et méthodes
: Détermination de l’exopeptidome des souches
L’exopeptidome des souches ainsi obtenues est déterminé dans les mêmes conditions expérimentales que celui de la souche sauvage LMD9, tel que décrit ci-après.
Culture de la souche
50 ml de MCD dont la concentration en acides aminés aromatiques (Phenylalanine, Tryptophane et Tyrosine) a été réduite d'un facteur 10 sont ensemencés avec 500 µl de préculture de nuit en MCD standard et incubés à 42°C jusqu’à DO600= 1,0. Les cellules sont alors éliminées par centrifugation (5000 rpm, 4°C; 10 minutes), le surnageant est filtré sur membrane PVDF de porosité 0,22 µm.
Isolement et concentration des peptides
Le surnageant de culture filtré est acidifié avec de l'acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration de 0,1% finale (470 µl d'une solution de TFA à 10% dans 47 ml de surnageant de culture), et conservé une nuit à 4°C.
Les peptides présents dans le surnageant acidifié sont extraits par extraction en phase solide (SPE) sur cartouche StrataX (Phenomenex) contenant 200mg de phase, à un débit d'environ 0,3 ml /min, suivant les préconisations du fabriquant. La cartouche est tout d'abord activée avec 3 ml de méthanol, puis équilibrée avec 6ml d'une solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. 1,75 ml d'acétonitrile sont ajoutés à 35 ml de surnageant acidifié, de façon à avoir une concentration finale d'acétonitrile de 5% dans le surnageant. 35 ml du surnageant ainsi préparé sont chargés sur la cartouche activée et équilibrée, à un débit de 0,3 ml/min. La cartouche est ensuite lavée avec 5 ml de la solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA, puis les peptides sont élués avec 1,5 ml d'une solution aqueuse contenant 50% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. L'éluat est séché pendant 16 à 18h par évaporation sous vide (système speed vac) puis conservé à -20°C.
L'éluat séché contenant les peptides est repris avec 350 µl d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA (concentration finale), ce qui correspond à un facteur de concentration de 100. La solubilisation des peptides est obtenue par agitation au vortex et passage 5 minutes dans une cuve à ultrasons. La solution concentrée de peptides est ultrafiltrée à travers une membrane de porosité 3kDa, par centrifugation 1h à 13000 rpm.
Les peptides sont alors séparés par HPLC sur une colonne de phase inverse (colonne Kinetex C18 (Phenomenex), porosité 100 Å, granulométrie 2,6 µm, dimension 150 x 4,6 mm) avec un gradient linéaire (pente 1,6%) d'acétonitrile dans du formate d'ammonium (20 mM, pH 6,2) à un débit de 0,7 ml/min et à une température de 40°C. L'équivalent de 20 ml de culture (soit 200 µl de suspension concentrée) est injecté sur la colonne. Les fractions éluées entre 3,2% et 53,3% d'acétonitrile sont collectées et séchées au speed vac.
Identification des peptides
L'identification des peptides est faite par spectrométrie de masse. Les fractions séchées sont reprises dans 30µl d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA et 2% d'acétonitrile, et une fraction de 4µl est chargée sur une colonne Pepmap C18 (150 x 0.075 mm, granulométrie 2 µm, porosité 100 Å). Les peptides sont élués avec un gradient d'acétonitrile dans de l'acide formique (0,1%), et analysés en ligne par spectrométrie de masse (LTQ-Orbitrap Discovery, Thermo Fisher). L'ionisation des peptides est faite par électrospray (1,3kV), et les paramètres d'analyse des peptides ionisés sont les suivants : mesure des rapports masse/charge (m/z) de 300 à 1600 avec une résolution de 15000 sur l'analyseur de masse Orbitrap, et fragmentation des 6 ions parents les plus abondants sur la trappe linéaire LTQ. Les peptides doublement chargés sont soumis à fragmentation, avec une fenêtre d'exclusion de 40 secondes et les paramètres classiques de fragmentation (énergie de collision : 35%).
L'identification des peptides et des protéines desquels ils dérivent est faite avec le moteur de recherche X!Tandem (version 2017.2.1.4) et la suite logicielle X!Tandem pipeline (version 3.4.3, www.pappso.fr) en utilisant la séquence protéique de la soucheS. thermophilusLMD9 associée à une base protéique de contaminants adaptée à l'activité d'analyse de la plateforme d'analyses (peptides trypsiques d'un échantillon de protéines eucaryotes contenant en particulier les kératines humaines, des protéines bovines et murines). Les paramètres de recherche de X!Tandem pipeline incluent l'absence de clivage trypsique pour l'identification des peptides, un peptide minimum par protéine, identifié avec une E-value inférieure ou égale à 0,01 et une tolérance de masse de 10 ppm.
Pour chaque contexte bactérien (souche sauvage, mutants simples et double), l'ensemble des peptides identifiés comme peptides de surface (c'est-à-dire, peptide issu de la dégradation d'une protéine de surface) est comptabilisé. Lorsqu'un peptide est identifié plusieurs fois (redondance d'identification), chaque identification est considérée (comptage des spectres). Ainsi un peptide identifié une fois aura un compte de 1, un peptide identifié trois fois un compte de trois. L'ensemble du nombre de peptides de surface est totalisé. Ces peptides étant issus des protéines de surface, ils résultent de l'activité protéolytique de surface de la souche. Le nombre de peptides comptabilisés est donc un indicateur de l'intensité de protéolyse de surface : plus le décompte est élevé, plus l'activité de dégradation, donc la protéolyse de surface, est importante.
2) Résultats
Les résultats montrent que les deux protéases HtrA et PrtS interviennent dans la formation de l’exopeptidome deS. thermophilusLMD9. Chez le double mutant, une réduction de plus de moitié du nombre de peptides issus de l'hydrolyse de protéines de surface est observée (Figure 1). Un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) indique que cette diminution est statistiquement significative (P= 0.049).
3) Conclusion
Les protéases de surface HtrA et PrtS ne sont pas responsables à elles seules de l’ensemble de l’activité protéolytique de surface de ces souches.
EXEMPLE3: IDENTIFICATION D’UNE NOUVELLE PROTEASE DE SURFACE CHEZ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9
D'après la base de données spécifique des protéases et peptidases MEROPS, le génome deS.thermophilusLMD9 contiendrait 45 enzymes protéolytiques (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/speccards?sp=sp000991;type=peptidase;strain=498). L'analyse de l'annotation du génome de cette souche (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/420?) suggère la présence de protéases supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 52 protéines qui pourraient contenir un domaine protéolytique.
Parmi celles-ci, 11 sont prédites comme étant localisées à la surface de la cellule d'après la base de données LocateP (http://www.cmbi.ru.nl/locatep-db/cgi-bin/locatepdb.py) ou SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). Y figurent PrtS (STER_0846) (STER_RS04165) et HtrA (STER_2002) (STER_RS09790). L'hypothèse poursuivie est que l'une au moins des 9 protéases restantes est impliquée dans la protéolyse de surface deS. thermophilus.
Parmi ces neuf protéases, six sont présentes chezL. lactissubsp.lactisIL1403 etL. lactissubsp.cremorisMG1363 (Tableau 4).
| LMD9 | IL1403 | MG1363 | |||||
| Protéine | Taille (AAs) | Protéine | Taille | % Identité | Protéine | Taille | % Identité |
| STER_0113 | 415 | DacA | 435 | 181/432 (42%) | DacA | 434 | 159/402 (39%) |
| STER_0159 | 265 | DacB | 248 | 132/246 (54%) | DacB | 248 | 122/232 (52%) |
| STER_0260 | 775 | Pbp2A | 743 | 359/628 (57%) | Pbp2A | 743 | 260/472 (55%) |
| STER_1255 | 762 | SrtA | 287 | 134/255 (53%) | SrtA | 250 | 114/214 (53%) |
| STER_1612 | 345 | YwdF | 342 | 169/338 (50%) | Llmg_2442 | 343 | 147/318 (46%) |
| STER_1741 | 207 | SipL | 208 | 109/206 (53%) | SipL | 208 | 99/206 (48%) |
Tableau 4
Des peptides issus de la dégradation de trois de ces 6 protéases (STER_0260, STER_1612 et STER_1741) ont été identifiés dans l’exopeptidome deS. thermophilusLMD9, indiquant que ces protéases putatives ont été synthétisées dans ces conditions de croissance. Parmi ces trois protéines, STER_0260 est annotée comme une D-Ala-D-Ala carboxypeptidase et STER_1741, comme signal peptide peptidase.
La protéase STER_1612 (STER_RS07910) (annotée respectivement YwdF chez IL1403 et llmg_2442 chez MG1363) apparaît donc comme la protéine candidate pour participer à la protéolyse de surface deL.lactisetS.thermophilus. La présence d'un fragment transmembranaire en région N-terminale (www.enzim.hu/hmmtop/) est prédite pour la protéine des 3 souches (Figure 2).
La synthèse de ces prédictions aboutit à l'hypothèse que la protéine STER_1612 serait une protéase ancrée à la membrane cytoplasmique dont le site actif serait orienté vers la face externe de la membrane.
EXEMPLE4: LA DELETION DES TROIS PROTEASES PRTS, HTRA ET STER_1612 ABOLIT LA DEGRADATION DES PROTEINES DE SURFACE ENDOGENES
Les Inventeurs ont émis l’hypothèse que la protéase STER_1612 dans la souche deS. thermophilusLMD9 et ses homologues dans les souches deL. lactis, IL1403 et MG1363, étaient impliquées dans la formation de l’exopeptidome deS. thermophilusetL. lactis.
1) Matériels et Méthodes
La validation de cette hypothèse a été entreprise dans la souche LMD9, en construisant l’ensemble des mutants simples, doubles et triple par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l’exemple 1.
Dans les souches LMD9 sauvage, LMD9∆HtrA, LMD9∆PrtS et LMD9∆HtrA∆PrtS déjà construites, le gènester _1612a été remplacé par une cassette de résistance à la spectinomycine.
2) Résultats
La croissance de la souche mutée pour les gènes de synthèse des trois protéases de surface n’est pas significativement affectée dans le milieu de culture utilisé, un milieu chimiquement défini ne contenant que des acides aminés comme source d’azote aminé (voir figure 3), de sorte que d'éventuelles différences observées entre la souche sauvage et les mutants ne pourront être imputées à une différence de croissance entre les souches.
L’inactivation d’une seule des trois protéases de surface réduit d’un facteur 2 environ le nombre de peptides issus de la protéolyse des protéines de surface accumulés dans le milieu de culture (peptides de surface de l’exopeptidome). Lorsque les trois protéases sont inactivées, cette réduction atteint un facteur 25, avec seulement 24 peptides accumulés (moyenne de trois expériences indépendantes; voir figure 4). Si on compare le nombre de peptides accumulés par le double mutant htrA_prtS et par le triple mutant prtS_htrA_ster_1216, l’inactivation supplémentaire de la protéase STER_1612 le réduit d’un facteur 9.
3) Conclusion
La protéolyse de surface est quasiment abolie chez le triple mutant deS. thermophilus, ne représentant plus que 5% de celle de la souche sauvage, sur la base du nombre de peptides présents dans l’exopeptidome.
EXEMPLE5: EXTENSION AUX AUTRES SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS NE POSSEDANT PAS LA PROTEASE PRTS
1) Matériels et Méthodes
Le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER_1612 sur la protéolyse de surface des souches deS. thermophilusne possédant pas la protéase PrtS a été évalué en utilisant la souche CNRZ1066 comme représentant.
Le double mutant CNRZ1066∆htrA∆prtSest construit par transformation naturelle en suivant le protocole expérimental décrit dans l’exemple 1. L’exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 et du mutant ainsi obtenu sont déterminés dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites pour la souche LMD9 et ses mutants (exemple 2).
2) Résultats
L’exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 contient 240 spectres (décomptes de peptides) issus de protéines de surface. Celui du double mutant ne contient plus que 15 spectres provenant de protéines de surface. Sur cette base du nombre de spectres identifiés, on peut estimer la protéolyse de surface résiduelle du double mutant de CNRZ1066 à 6% de celle de la souche sauvage, soit une réduction comparable à celle obtenue avec la souche LMD9.
3) Conclusion
Même si la souche ne possède que les deux protéases de surface HtrA et STER_1612, l’inactivation des gènes codant ces deux protéases suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.
EXEMPLE6: OBTENTION DE SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS PRODUISANT UNE PROTEINE HETEROLOGUE
1)
Obtention des souches de
S. thermophilus
produisant l’IL-10 et l’élafine
Les souchesL. lactisLL-pLB350 et LBH832 contiennent respectivement les plasmides pLB350 (Hossainet al., 2012) et pLB386, qui portent les gènes codant respectivement l'IL-10 et l’élafine, placés sous le contrôle d'un promoteur inductible aux sels biliaires (pGroEL). Les plasmides sont extraits de ces souches et purifiés en utilisant un kit commercial (Midikit, Quiagen).
Les deux plasmides pLB350 et pLB386 sont ensuite introduits chez la souche sauvageS. thermophilusLMD9 et son triple mutant par compétence naturelle, en suivant le protocole expérimental décrit dans l’exemple 1.
Le plasmide pLB386 est introduit dans la souche sauvage CNRZ1066 et son mutant de protéases de surface par compétence naturelle.
Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu M17 gélosé contenant 5µg/ml de chloramphénicol.
La présence du plasmide pLB350 est alors vérifiée par PCR sur colonies en utilisant les deux couples d'oligonucléotides pGroEL-F (ATAATGCCGACTGTACTTT de séquence SEQ ID N°34) / IL-10-R (GGCCTTGTAGACACCTTGGTCTT de séquence SEQ ID N°35) générant une bande de 690 paires de bases. Celle du plasmide pLB386 l’est avec les deux couples d’oligonucléotides pGroEL-F et Elafin-R (TCACTGGGGAACGAAACAGGC de séquence SEQ ID N°36) donnant une bande de 572bp et celle du plasmide vide en utilisant les deux oligonucléotides Cm-F (GTTCAACAAACGAAAATTGG de séquence SEQ ID N°37) et Cm-R (TTATAAAAGCCAGTCATTAG de séquence SEQ ID N°38) donnant une bande de 807bp.
EXEMPLE7: UNE SOUCHE DE BACTERIE NON-PROTEOLYTIQUE AMELIORE LE RENDEMENT DE PRODUCTION DES PROTEINES HETEROLOGUES
1)
L’inactivation des protéases de surface réduit la dégradation des protéines hétérologues
* Souche LMD9
Matériels et Méthodes
Deux modèles de protéines hétérologues ont été choisis, l’interleukine 10 (IL-10) et l’élafine. Ces deux protéines sont des protéines candidates dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (Benbouzianeet al., 2013 et Bermudez-Humaranet al., 2015). Le plasmide portant le gène codant l'IL-10 est extrait de la souche de lactocoque qui le contenait et introduit dans la soucheS.thermophilusLMD9 et son triple mutant dépourvu d'activité protéolytique de surface par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l’exemple 6. La même opération a été réalisée pour le plasmide codant l’élafine. Sont ainsi obtenues 4 souches, deux sauvages produisant l’une l’IL-10, l’autre l’élafine et deux mutants de protéases produisant les deux mêmes protéines hétérologues.
Pour évaluer la stabilité de l'IL-10 et de l’élafine, les deux couples de souches sauvage et mutante portant respectivement le plasmide pLB350 et le plasmide pLB386 sont cultivées 4h dans du MCD à 42°C. Un mélange équipondéral d'acide cholique et d'acide désoxycholique est alors ajouté au milieu de culture, à une concentration finale de 150µg/ml. Cet ajout a pour objectif d'induire l'expression des gènes contrôlés par le promoteur pGroESL. Après 15 minutes d'induction à 42°C, les cellules sont éliminées par centrifugation et les peptides présents dans le surnageant de culture sont identifiés comme indiqué dans l’exemple 2. La seule différence consiste en la modification de la banque d'interrogation, à laquelle la séquence de l'IL-10 ou de l’élafine ont été ajoutées, selon le couple de souches considéré.
Résultats
Plusieurs fragments de dégradation des protéines hétérologues sont détectés dans le milieu de culture des souches sauvages, recouvrant au total plus de 30% de leur séquence respective (voir tableau 5 et figure 5). Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment n'est détecté chez les triples mutants. Donc, l'inactivation des trois protéases de surface abolit la dégradation des deux protéines hétérologues chezS.thermophilus LMD9.
| Souche | Sauvage | Triple mutant protéase |
| Nombre de peptides issus de IL-10 | 9 | 0 |
| Nombre de peptides issus de l’élafine | 43 | 0 |
Tableau 5: Nombre de peptides issus de la dégradation de l'IL-10 ou de l’élafine, présents dans le milieu de culture deS.thermophilusLMD9 et de son mutant des trois protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612.
Les résultats obtenus avec les deux modèles protéiques étant de même nature, la suite des travaux n’a porté que sur un seul modèle, l’élafine.
* Souche CNRZ1066
Les mêmes expériences ont été conduites sur la souche CNRZ1066.
Matériels et Méthodes
Le plasmide codant l’élafine est extrait de la souche de lactocoque le contenant, et introduit dans les souches sauvage et mutante de CNRZ1066 par compétence naturelle. Pour évaluer la stabilité de l’élafine, leurs fragments de dégradation sont recherchés dans le milieu de culture après 4 h de croissance, en suivant la même approche que celle développée pour la souche LMD9.
Résultats
Trente-six spectres provenant de l’élafine sont identifiés dans le surnageant de la souche sauvage. La région de l’élafine couverte par les produits de dégradation est la même que dans le cas de la souche LMD9, et représente 40% de la séquence totale (voir figure 5). Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment de dégradation de l’élafine n'est détecté chez le double mutant.
Conclusion
Aucun fragment de dégradation de protéine hétérologue n’est retrouvé dans le surnageant d’une souche deS. thermophilusmutée pour ses protéases de surface, que cette souche possède ou pas la protéase PrtS.
2)
La réduction de dégradation des protéines hétérologues est corrélée à une augmentation de la production de la protéine intacte
Puisque les résultats sont comparables que la souche deS. thermophiluspossède deux ou trois protéases de surface, la suite des travaux ne porte que sur une seule souche, CNRZ1066. Puisque plus aucun fragment de dégradation de l’élafine n’est détecté dans le surnageant du double mutant, il convient de s’assurer que la protéine est bien produite dans cette souche, et à un niveau plus important que chez la souche sauvage.
Matériels et Méthodes
Cette vérification a été effectuée par immunodétection de l’élafine entière dans le surnageant (puisque la protéine est sécrétée dans le milieu extérieur par la souche de streptocoque), en suivant le protocole expérimental suivant.
La culture et l’induction de la production de l’élafine par les souches portant le plasmide pLB386 sont réalisées comme décrit dans l’exemple 6. Après 15 min d’induction, les cellules sont éliminées par centrifugation, et le surnageant contenant l’élafine est filtré sur filtre de porosité 0,22 µm (membrane PVDF à faible adsorption protéique). Dix ml de surnageant sont concentrés d’un facteur 20 par ultrafiltration sur membrane de seuil de coupure de 3 kDa (Amicon ultracell 3k, MerckMillipore). Cinq µl de rétentat sont déposés sur gel de polyacrylamide (gel pré-coulé NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Invitrogen). Après migration pendant 1h à 110 mA et 200V, les protéines sont transférées sur une membrane de transfert en PVDF (Trans-Bot Turbo Mini transfert pack, Bio-Rad). L’élafine, après avoir été marquée par un anticorps anti-élafine monoclonal de souris (SantaCruz Biotechnology), est détectée par chimioluminescence (kit ECL Plus Western, Pierce).
Résultats
Plusieurs souches sont utilisées dans ces expériences, réalisées à plusieurs reprises et donnent systématiquement les mêmes résultats; illustrés pour l’un d’entre eux dans la figure 6:
Les souches sauvage et mutée deS. thermophilusCNRZ1066 ne produisant pas l’élafine (puits 3 et 4, notés pls vide). On n’observe aucune bande, signe qu’aucune des souches ne produit l’élafine (ni de protéine présentant une réaction croisée avec l’anticorps dirigé contre l’élafine),
La souche CNRZ166 sauvage produisant l’élafine (puits 5, noté WT pls élafine). On observe deux bandes, dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l’élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure, et serait une forme tronquée de l’élafine en cours de dégradation,
La souche CNRZ1066 mutée pour ses protéases de surface produisant l’élafine (puits 6, noté mutant pls élafine). La bande inférieure correspondant à la forme tronquée de l’élafine n’est plus détectée, seule la bande correspondant à l’élafine mature est révélée.
Conclusion
L'inactivation de la protéolyse de surface abolit la dégradation de l’élafine chezS.thermophilus.
3) L’inactivation des protéases de surface induit une augmentation de l’activité enzymatique portée par l’élafineMatériels et Méthodes
L’activité de l’élafine accumulée dans les surnageants des souches CNRZ1666 sauvage et mutant est évaluée en déterminant le pouvoir d’inhibition de l’activité d’une protéase humaine témoin (l’élastase), suivant le protocole décrit ci-dessous.
Les souches deS. thermophilusportant le plasmide pLB386 sont cultivées en MCD à 37°C jusqu’à une DO600de 1.0.
Les souches deL. lactisportant ce même plasmide sont cultivées à 30 °C dans un MCD spécifique des lactocoques (Ottoet al., 1983) jusqu’à une DO600de 1.0.
A ce stade de croissance, les cultures sont centrifugées, et les cellules resuspendues dans du MCD frais à une DO600de 2.0.
La production d’élafine est obtenue par induction aux sels biliaires (15 ng/ml) et incubation sur la nuit à 37°C. Les cellules sont alors centrifugées, et l’élafine contenue dans le surnageant est concentrée par d’ultrafiltration d’un facteur 300 environ.
L’élafine est un inhibiteur de protéase. Elle est donc dosée selon le principe suivant. L’activité d’une protéase humaine (élastase) est mesurée par fluorescence en utilisant un substrat marqué (kit EnzCheck® Elastae assay, Molecular Probes), en présence et en absence de surnageant contenant l’élafine. L’intensité d’inhibition (reflétant la concentration d’élastase) est mesurée par la différence de fluorescence entre la mesure sans et avec élafine au cours du temps en suivant le protocole livré avec le kit de dosage (Molecular Probes).
Résultats
L’activité élafine produite par la souche dépourvue d’activité protéolytique augmente approximativement deux fois plus vite que celle produite par la souche sauvage (figure 7).
Conclusion
L'inactivation de la protéolyse de surface induit un doublement de l’activité élafine produite par la souche.
EXEMPLE8: LA PRODUCTION D’ELAFINE PAR DES SOUCHES DE BACTERIE NON-PROTEOLYTIQUE DE L’INVENTION
La production d’élafine est évaluée pour la soucheL. lactisIL1403∆HtrA et la soucheS. thermophilusCNRZ1066∆HtrA∆ster_1612.
Matériels et Méthodes
Les deux souches sont cultivées jusqu’à un niveau de population identique, et l’induction de la production d’élafine est réalisée dans les conditions optimales pour chacune des souches (voir exemple 7 point 3)).
Résultats
Les résultats obtenus par immunodétection de l’élafine produite par chacune de ces souches montrent pour la souche CNRZ1066, la présence d’une bande correspondant à la protéine intacte détectée chez le mutant de protéases et la souche sauvage, et une forme tronquée détectée chez la souche sauvage uniquement. Pour la souche IL1403, on observe toujours des formes tronquées de l’élafine chez le simple mutant ∆HtrA (figure 8).
Donc, l’absence de dégradation de l’élafine n’est constatée que chezS. thermophilus∆HtrA∆Ster_1612.
Par ailleurs, les résultats relatifs à l’activité élafine produite par chacune de ces souches montrent que cette activité élafine est 5 à 10 fois plus importante chezS. thermophilusCNRZ1066∆HtrA∆ster_1612 que chezL. lactisIL1403∆HtrA (figure 9).
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Claims (11)
- Bactérie Gram-positive de l’espèceStreptococcus thermophilusouLactococcus lactistelle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d’acides aminés et présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1, a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée,
où la SEQ ID N°1 est définie comme suit:
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-Kavec
X1 est l’histidine (H) ou la lysine (K);
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T);
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V);
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q);
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V);
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y);
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L). - Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie Gram-positive est unStreptococcus thermophiluset la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
- Bactérie selon la revendication 2, telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
- Bactérie selon la revendication 3, telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
- Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie Gram-positive est unLactococcus lactiset la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
- Bactérie selon la revendication 5, telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
- Bactérie selon la revendication 6, telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°11 a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
- Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, modifiée pour exprimer une protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt ou par un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt inséré dans son chromosome.
- Procédé de préparation d’une bactérie faiblement protéolytique, comprenant une étape de mutagénèse ou d’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou d’utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée pour l’abolition ou la diminution dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène de ladite bactérie comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1;
où la SEQ ID N°1 est définie comme suit:
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K
avec
X1 est l’histidine (H) ou la lysine (K);
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T);
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V);
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q);
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V);
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y);
et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L). - Utilisation d’une bactérie telle que définie dans la revendication 8, pour la production de protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt ou par un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt inséré dans son chromosome.
- Utilisation d’une bactérie telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 7, comme ferment de pré-maturation du lait.
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