KR20110129991A

KR20110129991A - 재조합 ｃｒｍ197의 고 수준 발현

Info

Publication number: KR20110129991A
Application number: KR1020100032638A
Authority: KR
Inventors: 다이안 엠 리털랙; 로렌스 츄; 홍팬 진
Original assignee: 피페넥스 인크.
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2011-12-05
Also published as: CN102858981B; KR101739128B1; AU2010201410A1; WO2011123139A1; CN102858981A; AU2010201410B2

Abstract

본 발명은 박테리아 숙주에서의 재조합 단백질 생성 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 박테리아 숙주로부터 재조합 CRM197 단백질을 고 농도로 얻기 위한 생성 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 ＣＲＭ197의 고 수준 발현{HIGH LEVEL EXPRESSION OF RECOMBINANT CRM197}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2010년 3월 30일에 제출된 미국 가명세서 특허 출원 61/319,152호를 우선권으로 주장한다.

기술분야

본 발명은 재조합 CRM197의 고 수준 발현에 관한 것이다.

디프테리아 독소(DT)는 독성발생 균주인 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)가 합성 및 분비하는 단백질계 독소이다. 독성발생 균주는 독성 유전자를 보유하는 박테리오파지 용원을 포함한다. DT는 535-아미노산 폴리펩티드로서 합성되고, 단백질분해되어 성숙 독소를 형성한다. 성숙 독소는 디설파이드 가교로 연결된 2종의 서브유닛 A 및 B를 포함한다. 온전한 DT의 C-말단 부분으로부터 형성된 B 서브유닛은 세포막을 통해 세포질로 DT가 결합하여 진입하는 것을 가능하게 한다. 세포 진입시, 온전한 DT의 N 말단 부분으로부터 형성된 효소 A 서브유닛은 신장 인자 2(EF-2)의 ADP 리보실화를 촉진한다. 그 결과, EF-2는 불활성화되고, 당백질 합성이 중단되어, 세포가 죽는다. 디프테리아 독소는 세포독성이 매우 높으며; 단일 분자도 세포에는 치명적일 수 있으며, 10 ng/kg의 용량은 동물 및 인간을 치사시킬 수 있다.

CRM197 단백질은 DT의 비독성의 면역학적 교차반응 형태이다. 이 단백질은 DT 추가접종 또는 백신 항원으로서의 잠재적 용도에 대해 연구되고 있다. CRM197은, 독성발생 코리네파지 β의 니트로소구아니딘 돌연변이유발에 의해 형성된 비독성발생 파지 β197^독소- 에 의해 감염된 C. 디프테리아가 생산한다. CRM197 단백질은 DT와 분자량은 같지만 A 서브유닛의 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌)에 차이가 있다. 단일 염기 변화는 아미노산 치환(글리신의 경우 글루탐산)을 유발하여 DT의 독성 성질을 제거한다.

캐리어 단백질로서 CRM197을 사용하는 접합 다당류 백신이 인간 사용을 위해 승인되었다. 백신은 네이세리아 멘인기티디스(Neisseria meningitidis) 서브그룹 A, C Y 및 W-135가 유발하는 침입성 수막구균 질환을 예방하기 위해 적용되는 백신인 Menveo^®(Novartis Vaccines and Diagnostics); 수막구균 그룹 C 접합체 백신인 Menjugate(Novartis Vaccines); 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 7종의 혈청형을 표적으로 하는 소아기 뉴모니아 백신인 Prevnar^®(Wyeth Pharmaceuticals, Inc.) 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형 백신인 HibTITER^®(Wyeth)를 포함한다. 또한, CRM197은 디프테리아용 추가 항원으로서 잠재적 용도를 가지며, 다른 백신에 사용하기 위한 캐리어 단백질로서 연구되고 있다.

치료 및 연구 용도로 승인된 CRM197을 높은 수준으로 발현시키는 방법은 보고된 바 없다. CRM197은, 예컨대 C. 디프테리아, B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 E. 콜라이(E. coli)에서, 수 십 mg/L 범위의 수준으로 발현된다. 1회 용량의 Prevnar 접합체 백신은 약 20 ㎍ CRM197을 포함한다. 따라서, 약 1 g/L 이상의 수준으로 CRM197을 경제적으로 생산하는 방법은 백신 연구 및 제조를 상당히 촉진할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포에서 재조합 CRM197 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 주변세포질로의 CRM197 단백질의 이동을 지시하는 분비 신호에 융합된 CRM197 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 결찰시키는 단계; 슈도모나스 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 재조합 CRM197 단백질의 발현에 적합한 배양 배지 중에서 형질전환된 슈도모나스 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 얻어진 가용성 CMR197의 수율은 리터당 약 1 내지 약 12 g인 방법에 관한 것이다.

구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 하나 이상의 프로테아제의 발현에 결함이 있거나, 또는 하나 이상의 폴딩 조절인자를 과발현한다. 일부 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 hslUV -, prc1-, degP1-, degP2-, 및 aprA-이다. 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 hslUV-, prc1-, degP1-, degP2-, 및 aprA-이며, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, 또는 PbpA20V이다. 다른 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 hslUV-, prc1-, degP1-, degP2-, 및 aprA-이고, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, PbpA20V, 또는 Pbp이다. 다른 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 세라리신(Serralysin), HslU, HslV, Prc1, DegP1, DegP2, 또는 AprA의 발현에 결함이 있거나, DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과발현한다.

특정 구체예들에서, 숙주 세포는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과발현하고 분비 리더는 Azu이다. 다른 특이적 구체예들에서, 숙주 세포는 세라리신의 발현에 결함이 있고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu이다. 일부 구체예들에서, 숙주 세포는 HslU 및 HslV의 발현에 결함이 있고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu이다. 또 다른 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 야생형이고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu이다.

구체예들에서, 분비 리더는 Azu, Pbp, IbpS31A, CupA2, 또는 PbpA20V이다. 다른 구체예들에서, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, 또는 PbpA20V이다.

구체예들에서, CRM197 뉴클레오티드 서열은 슈도모나스 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된다.

구체예들에서, 얻어진 가용성 CRM197의 수율은 약 0.5 g/L, 약 0.6 g/L, 약 0.7 g/L, 약 0.8 g/L, 약 0.9 g/L, 약 1 g/L, 약 1.5 g/L, 약 2 g/L, 약 2.5 g/L, 약 3 g/L, 약 3.5 g/L, 약 4 g/L, 약 4.5 g/L, 약 5 g/L, 약 5.5 g/L, 약 6 g/L, 약 6.5 g/L, 약 7 g/L, 약 7.5 g/L, 약 8 g/L, 약 8.5 g/L, 약 9 g/L, 약 9.5 g/L, 약 10 g/L, 약 10.5 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 3 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 1 g/L 내지 약 2 g/L, 약 1 g/L 내지 약 3 g/L, 약 1 g/L 내지 약 4 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 약 1 g/L 내지 약 6 g/L, 약 1 g/L 내지 약 7 g/L, 약 1 g/L 내지 약 8 g/L, 약 1 g/L 내지 약 9 g/L, 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 g/L 내지 약 11 g/L, 약 1 g/L 내지 약 12 g/L, 약 2 g/L 내지 약 3 g/L, 약 2 g/L 내지 약 4 g/L, 약 2 g/L 내지 약 5 g/L, 약 2 g/L 내지 약 6 g/L, 약 2 g/L 내지 약 7 g/L, 약 2 g/L 내지 약 8 g/L, 약 2 g/L 내지 약 9 g/L, 약 2 g/L 내지 약 10 g/L, 약 2 g/L 내지 약 11 g/L, 약 2 g/L 내지 약 12 g/L, 약 3 g/L 내지 약 4 g/L, 약 3 g/L 내지 약 5 g/L, 약 3 g/L 내지 약 6 g/L, 약 3 g/L 내지 약 7 g/L, 약 3 g/L 내지 약 8 g/L, 약 3 g/L 내지 약 9 g/L, 약 3 g/L 내지 약 10 g/L, 약 3 g/L 내지 약 11 g/L, 약 3 g/L 내지 약 12 g/L, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L, 약 4 g/L 내지 약 6 g/L, 약 4 g/L 내지 약 7 g/L, 약 4 g/L 내지 약 8 g/L, 약 4 g/L 내지 약 9 g/L, 약 4 g/L 내지 약 10 g/L, 약 4 g/L 내지 약 11 g/L, 약 4 g/L 내지 약 12 g/L, 약 5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 6 g/L 내지 약 7 g/L, 약 6 g/L 내지 약 8 g/L, 약 6 g/L 내지 약 9 g/L, 약 6 g/L 내지 약 10 g/L, 약 6 g/L 내지 약 11 g/L, 약 6 g/L 내지 약 12 g/L, 약 7 g/L 내지 약 8 g/L, 약 7 g/L 내지 약 9 g/L, 약 7 g/L 내지 약 10 g/L, 약 7 g/L 내지 약 11 g/L, 약 7 g/L 내지 약 12 g/L, 약 8 g/L 내지 약 9 g/L, 약 8 g/L 내지 약 10 g/L, 약 8 g/L 내지 약 11 g/L, 약 8 g/L 내지 약 12 g/L, 약 9 g/L 내지 약 10 g/L, 약 9 g/L 내지 약 11 g/L, 약 9 g/L 내지 약 12 g/L, 약 10 g/L 내지 약 11 g/L, 약 10 g/L 내지 약 12 g/L, 또는 약 11 g/L 내지 약 12 g/L이다.

본 발명은 슈도모나스 숙주 세포에서 재조합 CRM197 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 주변세포질로의 CRM197 단백질의 이동을 지시하는 분비 신호에 융합된 CRM197 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 결찰시키는 단계; 슈도모나스 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 및 재조합 CRM197 단백질의 발현에 적합한 배양 배지 중에서 형질전환된 슈도모나스 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 얻어진 가용성 CMR197의 수율은 리터당 약 1 내지 약 12 g이며, 활성 분석에서 재조합 CRM197 단백질의 활성을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 이 때 생성된 가용성 CRM197 단백질의 약 40∼약 100%는 활성인 것으로 측정되는 방법에 관한 것이다. 관련 구체예들에서, 활성 분석은 면역학적 분석 또는 수용체 결합 분석이다.

구체예들에서, 발현 벡터는 단백질 코딩 서열에 작동적으로 연결된 lac 유도체 프로모터를 포함하며, 배양 단계는 약 0.02 내지 약 1.0 mM의 농도의 IPTG를 사용한 프로모터의 유도를 포함하며, 유도시 세포 밀도는 약 40 내지 약 200 흡광 단위(AU)의 광학 밀도이며, 배양물의 pH는 약 6 내지 약 7.5이고, 배양 온도는 약 20 내지 약 35 ℃이다.

특정 구체예들에서, 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)이다.

포함된 참고 문헌

본 명세서 중에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은, 각 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되었다고 제시된 것과 동일한 범위로 본 명세서 중에 참고로 포함된다.

본 발명에 따르면, 재조합 CRM197을 고 수준으로 발현할 수 있다.

본 발명의 신규한 특징은 하기 특허청구범위 중에 구체적으로 설명된다. 본 발명의 원리를 이용한 예시적 구체예를 설명한 하기 상세한 설명과 첨부된 도면을 참고하면 본 발명의 특징 및 장점을 더욱 명확하게 이해할 수 있다.
도 1. 예시적인 최적화 CRM197 유전자의 아미노산 및 DNA 서열. A. 아미노산 서열(서열 번호 1). B. DNA 서열(서열 번호 2)
도 2. CRM197의 고처리량 발현 분석. 도 1B에 도시된 DNA 서열을 사용하여 발현된 CRM197 단백질을 모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)을 이용하여 분석하였다. 시험된 40종의 CRM197 발현 균주의 가용성 분획은 SDS-CGE 데이타로부터 형성된 겔-유사 이미지로 제시되어 있다. 표 6에 개시된 바와 같은 균주명을 각 레인 위에 열거하였다. P. 플루오레센스-발현 CRM197은 SDS-CGE에서 ~58 kDa의 단일 밴드로서 이동하였다(화살표).

발명의 상세한 설명

CRM197

교차 반응 물질 197(CRM197)은 미스센스 돌연변이를 가지는 DT 유전자로부터 생성된 디프테리아 독소 변이체이다. CRM197은 ADP-리보실트랜스퍼라제(ADPRT) 활성이 결여되어 있으며, 따라서 비독성이다. CRM197에 대한 유전자는 단일 염기 치환되어, 잔기 52에서 글리신 대신에 글루탐산이 도입되어 있다. (예컨대, Bishai, et al., 1987, "High-Level Expression of a Proteolytically Sensitive Diphtheria Toxin Fragment in Escherichia coli" J. Bact. 169(11):5140-51, Giannini, et al., 1984, "The Amino-Acid Sequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin: CRM45 and CRM197", Nucleic Acids Research 12(10): 4063-9, and GenBank Acc. No. 1007216A, (모든 본 명세서 중에 참고로 포함됨) 참조)

CRM197 단백질은 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 C. 디프테리아 또는 다른 미생물의 발현에 의해 낮은 수준으로 제조될 수 있다. 천연 발생 또는 야생형 디프테리아 독소는 미국 미생물 보존 센터(ATCC)를 비롯한 각종 공개적 공급원으로부터 입수가능한 독소 생산 균주로부터 얻을 수 있다. C. 디프테리아에서 CRM197 단백질의 제조를 위한 플라스미드 시스템은, 예컨대 본 명세서 중에 그 전문이 참고로 인용된 미국 특허 5,614,382호, "Plasmid for Production of CRM Protein and Diphtheria Toxin" 에 개시되어 있다.

코리네박테리오파지 β가 보유한 디프테리아 독소에 대한 야생형 구조 유전자의 기지 DT 뉴클레오티드 서열에 기초하여, (예컨대, Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989에 개시된 바와 같이) 재조합 DNA 방법의 기술을 이용하고 부위 지정 돌연변이유발법에 의해 뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있다. (예컨대, 본 명세서 중에 참고로 포함된 Greenfield, et al., 1993, "Nucleotide Sequence of the Structural Gene for Diphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage 18", Proc Nat Acad Sci 80:6953-7 참조). 뉴클레오티드 서열은 본 명세서의 다른 부분에 개시된 바와 같이 최적화할 수 있다.

코돈 최적화

이종성 발현계에서, 최적화 단계는 외래 단백질을 제조하는 숙주의 능력을 향상시킬 수 있다. 단백질 발현은, 전사, mRNA 프로세싱 및 번역의 안정성 및 개시에 영향을 주는 인자들을 포함하는 숙주의 인자들에 의해 지배를 받는다. 폴리뉴클레오티드 최적화 단계는 외래 단백질을 생성하는 숙주의 능력을 향상시키는 단계뿐 아니라 발현 구성체를 효과적으로 디자인하는데 있어서 연구진들을 보조하는 단계를 포함할 수 있다. 최적화 방법은, 예를 들어 번역 개시 영역의 변형, mRNA 구조 성분의 변경 및 상이한 코돈 편중의 이용을 포함할 수 있다. 박테리아 숙주에서 이종성 단백질의 발현을 향상시키기 위한 핵산 서열의 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 슈도모나스 숙주 종의 발현을 위한 코돈 최적화는, 예컨대 그 전문이 참고 인용된 미국 특허 출원 2007/0292918호, "Codon Optimization Method"에 개시되어 있다.

따라서, 최적화는 이종성 유전자의 다수의 서열 특징 중 임의의 것에 초점을 맞출 수 있다. 구체적인 예로서, 희귀 코돈 유도성 번역 중단은 이종성 단백질 발현 감소를 초래할 수 있다. 희귀 코돈 유도성 번역 중단은, 이용가능한 tRNA 푸울에서의 이의 결핍으로 인하여 단백질 번역에 부정적인 영향을 줄 수 있는, 숙주 유기체에서 드물게 사용되는 해당 폴리뉴클레오티드의 코돈의 존재를 포함한다. 숙주 유기체에서 최적 번역을 향상시키는 한가지 방법은 합성 폴리뉴클레오티드 서열로부터 희귀 숙주 코돈을 제거할 수 있는 코돈 최적화를 수행하는 것을 포함한다.

대안적인 번역 개시는 또한 이종성 단백질 발현의 감소를 초래할 수 있다. 대안적인 번역 개시는 리보솜 결합 부위(RBS)로 기능할 수 있는 모티프를 우연히 함유하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 부위는 유전자 내부 부위로부터 절두형 단백질의 번역 개시를 유발할 수 있다. 정제 과정에서는 제거하기 곤란할 수 있는 절두형 단백질의 생성 가능성을 줄이는 한 가지 방법은 최적화 폴리뉴클레오티드 서열로부터 추정 내부 RBS 서열을 제거하는 것을 포함한다.

반복부 유도성 폴리머라제 저하는 이종성 단백질 발현 감소를 유도할 수 있다. 반복부 유도성 폴리머라제 저하는 프레임이동 돌연변이를 초래할 수 있는 DNA 폴리머라제의 저하 또는 장애(stuttering)를 유발하는 것으로 확인된 뉴클레오티드 서열 반복부를 포함한다. 그러한 반복부는 또한 RNA 폴리머라제 저하를 유발할 수 있다. 고 G + C 함량 편중된 유기체에서는, G 또는 C 뉴클레오티드 반복부를 포함하는 고도의 반복부가 존재할 수 있다. 따라서, RNA 폴리머라제 저하를 유도하는 능력을 감소시키는 한 방법은 G 또는 C 뉴클레오티드의 연장 반복부를 변경시키는 것을 포함한다.

또한, 2차 간섭 구조는 이종성 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 2차 구조는 RBS 서열 또는 개시 코돈을 격리시킬 수 있으며, 단백질 발현 감소와 관련이 있다. 또한, 스템-루프 구조는 전사 중단 및 약화와 관련이 있을 수 있다. 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 전사 및 번역을 향상시키는 뉴클레오티드 서열의 유전자 코딩 영역과 RBS 내의 최소 2차 구조물을 함유할 수 있다.

이종성 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 특징은 제한 부위의 존재이다. 전사 단위의 숙주 발현 벡터로의 후속 서브클로닝을 저해하는 제한 부위를 제거함으로써, 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화할 수 있다.

예를 들어, 숙주에 의해 이종성으로 발현되는 목적하는 아미노산 서열을 확인함으로써 최적화 과정을 개시할 수 있다. 아미노산 서열로부터 해당 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 서열을 디자인할 수 있다. 합성 DNA 서열의 디자인 과정에서, 코돈 사용의 빈도를 숙주 발현 유기체의 코돈 사용과 비교할 수 있으며, 희귀 숙주 코돈을 합성 서열로부터 제거할 수 있다. 또한, 합성 후보 DNA 서열을 변형시켜 바람직하지 않은 효소 제한 부위를 제거하고, 임의의 목적하는 신호 서열, 링커 또는 비번역된 영역을 부가 또는 제거할 수 있다. 번역 과정을 저해할 수 있는 2차 구조, 예컨대 G/C 반복부 및 스텝-루프 구조의 존재에 대해 합성 DNA 서열을 분석할 수 있다. 후보 DNA 서열을 합성하기 전에, 최적화 서열 디자인을 검사하여 서열이 목적하는 아미노산 서열을 바르게 코딩하는지를 확인할 수 있다. 마지막으로, DNA 합성 기술, 예컨대 당업계에 공지된 기술을 이용하여 후보 DNA 서열을 합성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 숙주 유기체, 예컨대 P.플루오레센스에서의 일반적 코돈 사용을 이용하여 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 최적화할 수 있다. 좀처럼 숙주 발현계에서 특정 아미노산을 선호하지 않는 것으로 간주되는 코돈의 비율 및 분포를 평가할 수 있다. 5% 및 10% 사용 값을 희귀 코돈 결정을 위한 컷오프 값으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 표 1에 제시된 코돈은 P.플루오레센스 MB214 게놈에서 5% 미만의 발생 계산값을 가지며, P. 플루오레센스 숙주에서 발현되는 최적화된 유전자에서는 일반적으로 회피된다.

본 발명은 사용되는 슈도모나스 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화한 임의의 서열을 포함하는 임의의 CRM197 코딩 서열의 사용을 포함한다. 사용이 고려되어지는 서열은, 비제한적인 예로서 슈도모나스 숙주 세포에서 5% 미만의 발생 코돈, 슈도모나스 숙주 세포에서 10% 미만의 발생 코돈, 희귀 코돈 유도성 번역 중단, 추정 내부 RBS 서열, G 또는 C 뉴클레오티드의 확장 반복부, 간섭 2차 구조, 제한 부위, 또는 이의 조합을 제거하는 최적화를 비롯하여, 목적하는 바와 같은 임의의 정도로 최적화할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 임의의 분비 리더의 아미노산 서열은 임의의 적절한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.

발현계

슈도모나스 숙주 세포뿐 아니라 본 발명의 방법에 유용한 숙주 세포에서 유용한 조절 서열(예컨대, 프로모터, 분비 리더 및 리보솜 결합 부위)을 비롯한 이종성 단백질 발현 방법은, 예컨대 발명의 명칭이 각각 "Method for Rapidly Screening Microbial Hosts to Identify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expression of Heterologous Proteins"인 미국 특허 출원 2008/0269070호 및 미국 특허 출원 12/610,207호, 발명의 명칭이 "Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluroescens"인 미국 특허 공개공보 2006/0040352호, 발명의 명칭이 "Process for Improved Protein Expression by Strain Engineering"인 미국 특허 공개공보 2006/0110747호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본 명세서 중에 참고로 포함된다. 이들 공개문헌은 또한 본 발명의 방법을 실시하는데 유용하며, 폴딩 조절인자를 과발현하도록 조작하거나, 또는 결실을 포함한 프로테아제 돌연변이를 도입하여 이종성 단백질 발현을 증가시킬 수 있는 박테리아 숙주 균주를 개시하고 있다.

리더

서열 리더는 발명의 명칭이 모두 "Bacterial Leader Sequences for Increased Expression"인 미국 특허 출원 공개공보 2008/0193974호 및 2010/0048864호와, 발명의 명칭이 "Expression systems with Sec-secretion"인 미국 특허 출원 공개공보 2006/0008877호[이들 문헌은 그 전문이 본 명세서 중에 참고로 포함됨] 및 미국 특허 출원 공개공보 2008/0269070 및 미국 특허 출원 12/610,207호에 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 방법에 유용한 분비 리더는 표 2에 개시된 것에 한정되지 않음을 이해해야 한다.

구체예에서, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, 또는 PbpA20V이다. 다른 구체예에서, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, PbpA20V, 또는 Pbp이다.

천연 CRM197은 분비 리더를 통해 C. 디프테리아(C. diptheriae)로부터 세포외 공간으로 수송되고 분해되어, GADD(서열 번호 21)의 아미노 말단 서열을 남긴다. P. 플루오레센스에서의 발현 후에 CRM197의 천연 아미노 말단을 보존하고 디설파이드 결합을 형성하기 위해서, 단백질을 주변세포질 공간으로 표적화한다.

프로모터

본 발명에 따라 사용된 프로모터는 구성 프로모터 또는 조절 프로모터일 수 있다. 유용한 조절 프로모터의 일반적인 예는 lac 프로모터(즉, lacZ 프로모터)로부터 유도된 패밀리의 것, 특히 DeBoer의 미국 특허 4,551,433호에 개시된 tac 및 trc 프로모터와, Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5, 및 T7lac 프로모터를 포함한다. 일 구체예에서, 프로모터는 숙주 세포 유기체로부터 유도되지 않는다. 특정 구체예에서, 프로모터는 E. 콜라이 유기체로부터 유도된다.

유도성 프로모터 서열을 이용하여 본 발명의 방법에 따른 CRM197의 발현을 조절할 수 있다. 구체예들에서, 본 발명의 방법에 유용한 유도성 프로모터는 lac 프로모터(즉, lacZ 프로모터)로부터 유도된 패밀리의 것들, 특히 DeBoer의 미국 특허 4,551,433호에 개시된 tac 및 trc 프로모터와 Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5, 및 T7lac 프로모터를 포함한다. 일 구체예에서, 프로모터는 숙주 세포 유기체로부터 유도되지 않는다. 특정 구체예에서, 프로모터는 E. 콜라이 유기체로부터 유도된다.

본 발명에 따른 발현계에 유용한 비-lac-유형의 프로모터의 일반적인 예는, 예컨대 표 3에 제시된 것들을 포함한다.

예컨대, 문헌[J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445; and R. Slater & R. Williams (2000 Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp. 125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK))] 참조. 선택된 박테리아 숙주 세포에 대해 천연인 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터를 이용하여 표적 폴리펩티드, 예컨대 슈도모나스 안트라닐레이트 또는 벤조에이트 오페론 프로모터(Pant, Pben)를 코딩하는 이식유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 서열이 동일하든 또는 상이하든, 예컨대 Pant-Pben 텐덤 프로모터(프로모터간 하이브리드) 또는 Plac-Plac 텐덤 프로모터, 또는 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유도된 것이든 상관 없이 1 초과의 프로모터가 상호 공유 결합된 텐덤 프로모터를 이용할 수 있다

조절된 프로모터는 프로모터가 일부인 유전자의 전사를 제어하기 위해서 프로모터 조절 단백질을 이용한다. 본 명세서 중에 조절된 프로모터가 이용되는 경우, 상응하는 프로모터 조절 단백질은 본 발명에 따른 발현계의 일부일 것이다. 프로모터 조절 단백질의 예는 활성화인자 단백질, 예컨대 E.콜라이 이화산물 활성화인자 단백질, MalT 단백질; AraC 패밀리 전사 활성화인자; 억제 단백질, 예컨대 E. 콜라이 LacI 단백질; 및 이중 기능 조절 단백질, 예컨대 E. 콜라이 NagC 단백질을 포함한다. 다수의 조절된-프로모터/프로모터-조절-단백질 쌍이 당업계에 공지되어 있다. 일 구체예에서, 관심의 이종성 단백질 및 표적 단백질(들)에 대한 발현 구성체는 동일한 조절 성분의 제어 하에 있다.

프로모터 조절 단백질은 효과기(effector) 화합물, 즉, 단백질을 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 1 이상의 DNA 전사 조절 영역으로 방출시키거나 또는 상기 영역에 결합시키는 조절 단백질과 가역적으로 또는 비가역적으로 회합하는 화합물과 상호작용하여, 유전자의 전사를 개시하는 전사 효소를 작용시키거나 또는 상기 전사 효소의 작용을 차단한다. 효과기 화합물은 유도인자 또는 보조 억제인자로서 분류되며, 이들 화합물은 천연 효과기 화합물 및 무상 유도인자 화합물을 포함한다. 조절된-프로모터/프로모터-조절-단백질/효과기-화합물의 3개조 다수가 당업계에 공지되어 있다. 세포 배양 또는 발효를 통해 효과기 화합물을 사용할 수 있지만, 조절 프로모터가 사용되는 바람직한 구체예에서, 숙주 세포 생물량을 목적하는 양 또는 밀도로 배양시킨 후에, 적절한 효과기 화합물을 배양물에 첨가하여 직접 또는 간접적으로 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 목적하는 유전자(들)를 발현시킨다.

lac 패밀리 프로모터를 이용하는 구체예에서, lacI 유전자가 시스템 내에 존재할 수 있다. lacI 유전자는 보통 항시적으로 발현되는 유전자로서, lac 패밀리 프로모터의 lac 오퍼레이터에 결합하는 Lac 억제인자 단백질 LacI 단백질을 코딩한다. 따라서, lac 패밀리 프로모터를 이용하는 경우, lacI 유전자가 발현계에 포함되어 발현될 수 있다.

슈도모나스에 유용한 프로모터 시스템은 문헌, 예컨대 상기 언급된 미국 특허 출원 공개공보 2008/0269070호에 개시되어 있다.

기타 조절 성분

구체예들에서, 생성 과정에서 세포의 주변세포질 또는 세포질에 가용성 단백질이 존재한다. 단백질 표적화에 유용한 선별 리더는 본 명세서와, 미국 특허 출원 공개공보 2008/0193974호, 미국 특허 출원 공개공보 2006/0008877호, 및 미국 출원 번호 12/610,207호에 개시되어 있다.

본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 발현 구성체는, 단백질 코딩 서열 외에도, 여기에 작동가능하게 연결된 하기의 조절 성분을 포함할 수 있다: 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 전사 종결인자 및 전사 개시 및 정지 신호. 유용한 RBS는, 예컨대 미국 특허 출원 공개공보 2008/0269070호 및 미국 특허 출원 12/610,207호에 따른 발현계에서 숙주 세포로서 유용한 임의의 종으로부터 얻을 수 있다. 다수의 특이적인 각종 공통 RBS가 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[D. Frishman et al., Gene 234(2):257-65 (8 Jul. 1999); and B. E. Suzek et al., Bioinformatics 17(12):1123-30 (December 2001)]에 개시되고 참조되어 있는 것들이 있다. 또한, 천연 또는 합성 RBS, 예컨대 문헌[EP 0207459호(합성 RBS); O. Ikehata et al., Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)(AAGGAAG의 천연 RBS 서열)]에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 방법, 벡터와, 번역 및 전사 성분 및 기타 성분들의 추가 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 참고로 본 명세서 중에 포함되는 미국 특허 5,055,294호(Gilroy) 및 미국 특허 5,128,130호(Gilroy 등); 미국 특허 5,281,532호(Rammler 등); 미국 특허 4,695,455호 및 4,861,595호(Barnes 등); 미국 특허 4,755,465호(Gray 등); 및 미국 특허 5,169,760호(Wilcox)와 본 명세서 중에 참고로 포함된 다른 다수의 공개문헌들에 개시되어 있다.

숙주 균주

슈도모나스를 비롯한 박테리아 숙주 및 밀접하게 관련된 박테리아 유기체가 본 발명의 방법의 실시를 위해 고려된다. 특정 구체예에서, 슈도모나스 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스이다. 숙주 세포는 또한 E. 콜라이 세포일 수도 있다.

슈도모나스 및 밀접하게 관련된 박테리아는 일반적으로 "그람(-) 프로테오박테리아 서브그룹 1" 또는 "그람 음성 호기성 간균 및 구균" (Buchanan and Gibbons (eds.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289)으로 정의되는 그룹의 일부이다. 슈도모나스 숙주 균주는 문헌, 예컨대 상기 인용한 미국 특허 출원 공개공보 2006/0040352호에 개시되어 있다.

예를 들어, 슈도모나스 숙주는, 각각 알터로모나스 할로플란크티스(Alteromonas haloplanktis), 알터로모나스 니그리페이시언스(Alteromonas nigrifaciens) 및 알터모나스 푸트리페이시언스(Alteromonas putrefaciens)로서 재분류되는, 슈도모나스속, 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia)(ATCC 14393), 슈도모나스 니그리페이시언시(Pseudomonas nigrifaciensi)(ATCC 19375), 및 슈도모나스 푸트리페이시언스(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)로부터의 세포를 포함할 수 있다. 유사하게, 예컨대 슈도모나스 애시도보란스(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)는 각각 코마모나스 애시도보란스(Comamonas acidovorans) 및 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)로 재분류되고; 슈도모나스 니그리페이시언스(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375) 및 슈도모나스 피시시다(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)는 각각 슈도알터로모나스 니그리페이시언스(Pseudoalteromonas nigrifaciens) 및 슈도알터로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida)로 재분류된다.

숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 서브그룹 16"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 서브그룹 16"은 하기 슈도모나스종(괄호 안에 제시된 예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호가 함께 기재됨)의 프로테오박테리아 그룹으로 정의된다: 슈도모나스 아비에트아니필라(Pseudomonas abietaniphila)(ATCC 700689); 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145); 슈도모나스 알칼리제네스(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909); 슈도모나스 앤귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica)(ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis)(ATCC 13674); 슈도모나스 플라베슨스(Pseudomonas flavescens)(ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina)(ATCC 25411); 슈도모나스 니트로리듀센스(Pseudomonas nitroreducens)(ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)(ATCC 8062); 슈도모나스 슈도알칼리제네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(ATCC 17440); 슈도모나스 레지노보란스(Pseudomonas resinovorans)(ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea)(ATCC 33636); 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora); 슈도모나스 앤더소니(Pseudomonas andersonii); 슈도모나스 아스플레니(Pseudomonas asplenii)(ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica)(ATCC 27162); 슈도모나스 베이어인키(Pseudomonas beyerinckii)(ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis); 슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomonas boreopolis)(ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카세아룸(Pseudomonas brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(Pseudomonas butanovora)(ATCC 43655); 슈도모나스 셀룰루로사(Pseudomonas cellulosa)(ATCC 55703); 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca)(ATCC 33663); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라지(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(Pseudomonas lundensis)(ATCC 49968); 슈도모나스 태트로렌스(Pseudomonas taetrolens)(ATCC 4683); 슈도모나스 시시콜라(Pseudomonas cissicola)(ATCC 33616); 슈도모나스 코로나페이시언스(Pseudomonas coronafaciens); 슈도모나스 디터페니필라(Pseudomonas diterpeniphila); 슈도모나스 엘롱가타(Pseudomonas elongata)(ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(Pseudomonas flectens)(ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브레네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata)(ATCC 29736); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858); 슈도모나스 게사르디(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리(Pseudomonas mandelii)(ATCC 700871); 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844); 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 뮤시도렌스(Pseudomonas mucidolens)(ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시아에(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신크산타(Pseudomonas synxantha)(ATCC 9890); 슈도모나스 톨라아시(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618); 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474); 슈도모나스 프레데릭스베르젠시스(Pseudomonas frederiksbergensis); 슈도모나스 제니쿨라타(Pseudomonas geniculata)(ATCC 19374); 슈도모나스 진저리(Pseudomonas gingeri); 슈도모나스 그라미니스(Pseudomonas graminis); 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila); 슈도모나스 히비스키콜라(Pseudomonas hibiscicola)(ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(Pseudomonas huttiensis)(ATCC 14670); 슈도모나스 히드로제노보라(Pseudomonas hydrogenovora); 슈도모나스 예세니(Pseudomonas jessenii)(ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis); 슈도모나스 란세오라타(Pseudomonas lanceolata)(ATCC 14669); 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini); 슈도모나스 마르기나타(Pseudomonas marginata)(ATCC 25417); 슈도모나스 메피티카(Pseudomonas mephitica)(ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans)(ATCC 19244); 슈도모나스 퍼투시노제나(Pseudomonas pertucinogena)(ATCC 190); 슈도모나스 픽토룸(Pseudomonas pictorum)(ATCC 23328); 슈도모나스 사이크로필라(Pseudomonas psychrophila); 슈도모나스 필바(Pseudomonas filva)(ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리(Pseudomonas monteilii)(ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리이(Pseudomonas mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans)(ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida)(ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(ATCC 12633); 슈도모나스 리액탄스(Pseudomonas reactans); 슈도모나스 스피노사(Pseudomonas spinosa)(ATCC 14606); 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica); 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola)(ATCC 43273);. 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(Pseudomonas amygdali)(ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라나에(Pseudomonas avellanae)(ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파야에(Pseudomonas caricapapayae)(ATCC 33615); 슈도모나스 시코리이(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉타에(Pseudomonas ficuserectae)(ATCC 35104); 슈도모나스 푸스코바기나에(Pseudomonas fuscovaginae); 슈도모나스 멜리아에(Pseudomonas meliae)(ATCC 33050); 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava)(ATCC 13223); 슈도모나스 써모카르복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans)(ATCC 35961); 슈도모나스 써모톨러란스(Pseudomonas thermotolerans); 슈도모나스 티버발렌시스(Pseudomonas thivervalensis); 슈도모나스 뱅쿠버렌시스(Pseudomonas vancouverensis)(ATCC 700688); 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis); 및 슈도모나스 크시암에네시스(Pseudomonas xiamenensis).

상기 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 서브그룹 17"로부터 선택할 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 서브그룹 17"은, 예를 들어 하기 슈도모나스 종에 속하는 것들을 비롯하여 "형광성 슈도모나드"로 당업계에 알려져 있는 프로테오박테이라 그룹으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브레너리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata); 슈도모나스 엑트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 슈도모나스 게사르디(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii); 슈도모나스 마르기날리스(Pseudomonas marginalis); 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 뮤시돌런스(Pseudomonas mucidolens); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시아에(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신크산타(Pseudomonas synxantha); 슈도모나스 톨라시이(Pseudomonas tolaasii); 및 슈도모나스 베로니이(Pseudomonas veronii).

본 발명의 방법의 실시에 유용한 숙주 세포 및 구성체는 당업계에 공지되어 있고, 그 전문이 본 명세서 중에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개공보 2009/0325230호("Protein Expression Systems")에 개시된 시약 및 방법을 이용하여 제조 또는 동정할 수 있다. 상기 공개문헌은 염색체 lacI 유전자 삽입체를 포함하는 영양요구성 슈도모나스 플루오레센스로 핵산 구성체를 도입하여 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법을 개시한다. 핵산 구성체는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 또한 영양요구성 선별 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 영양요구성 선별 마커는 영양요구성 숙주 세포의 기본영양(prototrophy)을 회복시키는 폴리펩티드이다. 구체예들에서, 세포는 프롤린, 우라실 또는 이의 조합에 대해 영양요구성이다. 구체예들에서, 숙주 세포는 MB101(ATCC 기탁번호 PTA-7841)로부터 유도된 것이다. 모두 본 명세서 중에 그 전문이 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개공보 2009/0325230호, "Protein Expression Systems" 및 문헌[Schneider, et al., 2005, "Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation," Biotechnol. Progress 21(2): 343-8]은 균주 MB101의 pyrF 유전자를 결실시켜 구성한 우라실에 대해 영양요구성인 숙주 균주의 생성을 개시한다. pyrF 유전자는 균주 MB214(ATCC 기탁번호 PTA-7840)로부터 클로닝하여 기본영양을 회복시키는 pyrF 결실을 보완할 수 있는 플라스미드를 형성하였다. 특정 구체예에서, P. 플루오레센스 숙주 세포 내의 이중 pyrF-proC 이중 영양요구성 선별 마커 시스템을 사용한다. 개시된 바와 같은 pyrF 생산 숙주 균주는, 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 것으로 본 명세서에 개시된 변화들을 비롯하여 다른 목적하는 게놈 변화를 도입하기 위한 기초로서 사용할 수 있다.

구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 HslU, HslV, Prc1, DegP1, DegP2, AprA, 또는 이의 조합의 발현에 결함이 있다. 구체예들에서, 숙주 세포는 프로테아제 HslU, HslV, Prc1, DegP1, DegP2, 및 AprA에 결함이 있다. 그러한 균주의 예는 DC1100으로 본 명세서 중에 개시되어 있다. 이들 프로테아제는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 출원 공개공보 2006/0110747호에 개시되어 있다. 세포외 세라리신(serralysin)형 메탈로프로테아제 메탈로프로테인아제인 AprA는, 예컨대 본 명세서 중에 참고로 포함된 문헌[Maunsell, et al., 2006, "Complex regulation of AprA metalloprotease in Pseudomonas fluorescens M114: evidence for the involvement of iron, the ECF sigma factor, PbrA and pseudobactin M114 siderophore, Microbiology 152(Pt 1):29-42] 및 미국 특허 출원 공개공보 2008/0193974호 및 2010/0048864호에 개시되어 있다.

다른 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과발현한다. DsbA, B, C, 및 D는 디설파이드 결합 이소머라제로서, 예컨대 미국 특허 출원 공개공보 2008/0269070호 및 미국 특허 출원 12/610,207호에 개시되어 있다.

다른 구체예들에서, 슈도모나스 숙주 세포는 야생형이다. 즉 프로테아제 발현 결함이 없고 임의의 폴딩 조절인자를 과발현하지 않는다.

프로테아제 발현에 결함이 있는 숙주 세포는 야생형 숙주에 비해 프로테아제의 정상적인 활성 또는 발현 수준의 감소를 초래하는 임의의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미스센스 또는 넌센스 돌연변이는 활성이 아닌 단백질의 발현을 유도할 수 있으며, 유전자 결실은 전혀 단백질을 발현시키지 않을 수 있다. 유전자의 상류 조절 영역의 변화는 단백질 발현을 감소시키거나 또는 단백질을 발현시키지 않을 수 있다. 다른 유전자 결함은 단백질 번역에 영향을 줄 수 있다. 프로테아제 프로세싱에 필요한 단백질의 활성에 결함이 있는 경우에는 프로테아제 발현에 결함이 있을 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 프로테아제 및 폴딩 조절인자의 예는 각각 표 4 및 5에 제시되어 있다. RXF 번호는 오픈 리딩 프레임을 의미한다. (예컨대 미국 특허 출원 공개공보 2008/0269070호 및 미국 특허 출원 12/610,207호 참조).

[표 4a]

[표 4b]

[표 4c]

[표 4d]

[표 4e]

일부 프로테아제는 프로테아제 및 샤페론 유사 활성을 모두 가질 수 있다. 이들 프로테아제가 단백질 수율 및/또는 품질에 부정적인 영향을 미치는 경우, 이들을 제거하는 것이 유용할 수 있으며, 이들의 샤페론 활성이 단백질 수율 및/또는 품질에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 경우에는 이들을 과발현시킬 수 있다. 이들 프로테아제는, 비제한적인 예로서 Hsp100(Clp/Hsl) 패밀리 구성원 RXF04587.1(clpA), RXF08347.1, RXF04654.2(clpX), RXF04663.1, RXF01957.2(hslU), RXF01961.2(hslV); 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 패밀리 구성원 RXF05345.2(ppiB); 메탈로펩티다제 M20 패밀리 구성원 RXF04892.1(아미노히드롤라제); 메탈로펩티다제 M24 패밀리 구성원 RXF04693.1(메티오닌 아미노펩티다제) 및 RXF03364.1(메티오닌 아미노펩티다제); 및 세린 펩티다제 S26 신호 펩티다제 I 패밀리 구성원 RXF01181.1(신호 펩티다제)를 포함한다.

[표 5a]

[표 5b]

[표 5c]

발효 방식

본 발명에 따른 발현계를 임의의 발효 방식으로 배양할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 회분식, 공급형 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 방법을 사용할 수 있다.

구체예들에서, 발효 배지는 부영양 배지(rich media), 최소영양 배지 및 미네랄염 배지로부터 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 최소영양 배지 또는 미네랄염 배지를 선택한다. 일부 구체예에서, 미네랄염 배지를 선택한다.

미네랄염 배지는 미네랄염과 탄소원, 예컨대 글루코스, 수크로스 또는 글리세롤과 같은 탄소원으로 이루어진다. 미네랄염 배지의 예는, 예컨대 M9 배지, 슈도모나스 배지(ATCC 179)와, Davis 및 Mingioli 배지를 포함한다(B D Davis & E S Mingioli (1950) J. Bact. 60:17-28 참조). 미네랄염 배지를 제조하는데 사용된 미네랄염은, 예컨대 인산칼륨, 황산암모늄 또는 염화암모늄, 황산마그네슘 또는 염화마그네슘, 및 미량 미네랄, 예컨대 칼슘 염화물, 붕소화물 및 철, 구리, 망간 및 아연의 황산염으로부터 선택된 것들을 포함한다. 통상적으로, 펩톤, 트립톤, 아미노산 또는 효모 추출물과 같은 유기 질소원은 미네랄염 배지 중에 포함되지 않는다. 대신에, 무기 질소원을 사용하며, 이는 예컨대 암모늄염, 수성 암모니아 및 기상 암모니아로부터 선택될 수 있다. 미네랄염 배지는 통상적으로 글루코스 또는 글리세롤을 탄소원으로서 함유한다. 미네랄염 배지와 비교하여, 최소영양 배지는 또한 미네랄염과 탄소원을 포함할 수 있으나, 예컨대 낮은 농도의 아미노산, 비타민, 펩톤 또는 다른 성분들로 보충될 수는 있지만, 이들은 매우 최소의 농도로 첨가된다. 당업계에 개시된 방법, 예컨대 상기한 본 명세서 중에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개공보 2006/0040352호에 개시된 방법을 사용하여 배지를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 배양 절차 및 미네랄염 배지의 상세한 설명은 문헌[Riesenberg, D et al., 1991, "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate," J. Biotechnol. 20 (1):17-27]에 개시되어 있다.

구체예들에서, 생물반응기 배양으로 제조할 수 있다. 예컨대, 미네랄염 배지를 함유하는 최대 2리터 생물반응기에서 배양물을 배양하고 암모니아를 첨가하여 32℃ 및 pH6.5에서 유지할 수 있다. 용존 산소는 발효기 내의 살포 공기와 산소의 흐름 및 교반 증가를 통해 과량으로 유지할 수 있다. 과량의 수준을 유지하기 위해 발효 과정 동안 글리세롤을 배양물에 전달할 수 있다. 구체예들에서, 유도를 위한 표적 배양물 세포 밀도, 예컨대 575 nm에서의 광학 밀도(A₅₇₅)에 도달할 때까지 이들 조건을 유지하고, 이 때 IPTG를 첨가하여 표적 단백질 생성을 개시한다. 유도시 세포 밀도, IPTG 농도, pH 및 온도 각각을 다양하게 하여 최적 발현 조건을 결정할 수 있음이 이해된다. 구체예들에서, 유도시 세포 밀도는 A₅₇₅ 40∼200 흡광 단위(AU)로 다양할 수 있다. IPTG 농도는 0.02∼1.0 mM 범위에서, pH는 6∼7.5 범위에서, 온도는 20∼35℃ 범위에서 다양할 수 있다. 16∼24 시간 후에, 각 생물반응기로부터의 배양물을 원심분리로 수거하고, -80℃에서 세포 펠릿을 냉동시킬 수 있다. 이어서, 예컨대 SDS-CGE에 의해 생성물 형성에 대해 샘플을 분석할 수 있다.

발효는 어떤 규모로도 실시할 수 있다. 본 발명에 따른 발현계는 임의의 규모의 재조합 단백질 발현에 유용하다. 따라서, 예를 들어, 마이크로리터 규모, 밀리리터 규모, 센티리터 규모 및 데시리터 규모의 발효 부피를 사용할 수 있으며, 1 리터 이상의 발효 부피도 사용가능하다.

구체예들에서, 발효 부피는 약 1 리터 또는 그 이상이다. 구체예들에서, 발효 부피는 약 1 리터 내지 약 100 리터이다. 구체예들에서, 발효 부피는 약 1 리터, 약 2 리터, 약 3 리터, 약 4 리터, 약 5 리터, 약 6 리터, 약 7 리터, 약 8 리터, 약 9 리터, 또는 약 10 리터이다. 구체예들에서, 발효 부피는 약 1 리터 내지 약 5 리터, 약 1 리터 내지 약 10 리터, 약 1 리터 내지 약 25 리터, 약 1 리터 내지 약 50 리터, 약 1 리터 내지 약 75 리터, 약 10 리터 내지 약 25 리터, 약 25 리터 내지 약 50 리터, 또는 약 50 리터 내지 약 100 리터이다. 다른 구체예들에서, 발효 부피는 5 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 50 리터, 75 리터, 100 리터, 200 리터, 500 리터, 1,000 리터, 2,000 리터, 5,000 리터, 10,000 리터, 또는 50,000 리터이거나, 또는 그 이상이다.

생성물 평가

단백질 특성규명을 위한 여러가지 분석법이 당업계에 공지되어 있다. 재조합 CRM197의 수율 또는 품질의 특성을 규명하는 임의의 적절한 방법의 사용도 본 명세서에 포함된다.

단백질 수율

본 명세서 중에 개시된 바와 같은 임의의 정제 분획의 단백질 수율은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 모세관 겔 전기영동(CGE) 및 웨스턴 블롯 분석으로 결정할 수 있다. 본 명세서에 개시되어 있고 당업계에 공지된 바와 같은 활성 분석은 또한 단백질 수율에 관한 정보를 제공할 수 있다.

단백질 수율의 유용한 척도는, 예컨대 배양물 부피당 재조합 단백질의 양(예, 배양물 리터당 단백질의 그램 또는 밀리그램), 세포 용해 후에 얻은 불용성 펠릿 중에서 측정되는 재조합 단백질의 백분율 또는 분율(예, 추출 상청액 중 재조합 단백질의 양/불용성 분획 중 단백질의 양), 활성 단백질의 백분율 또는 분율(예, 활성 단백질의 양/분석에 사용된 단백질의 양), 총 세포 단백질(tcp)의 백분율 또는 분율, 단백질/세포의 양, 및 건조 생물량의 백분율 또는 비율을 포함한다.

수율이 배양물 부피로 표시되는 구체예에서, 특히 상이한 배양물 간의 수율을 비교하는 경우에는 배양물의 세포 밀도를 고려할 수 있다.

구체예들에서, 본 발명의 방법은 약 1 그램/리터 내지 약 12 그램/리터의 재조합 CRM197 단백질 수율을 얻는데 사용될 수 있다. 구체예들에서, 수율은 약 0.5 그램/리터 내지 약 12 그램/리터이다. 특정 구체예들에서, 재조합 단백질 수율은 약 0.5 g/L, 약 0.6 g/L, 약 0.7 g/L, 약 0.8 g/L, 약 0.9 g/L, 약 1 g/L, 약 1.5 g/L, 약 2 g/L, 약 2.5 g/L, 약 3 g/L, 약 3.5 g/L, 약 4 g/L, 약 4.5 g/L, 약 5 g/L, 약 5.5 g/L, 약 6 g/L, 약 6.5 g/L, 약 7 g/L, 약 7.5 g/L, 약 8 g/L, 약 8.5 g/L, 약 9 g/L, 약 9.5 g/L, 약 10 g/L, 약 10.5 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 3 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 1 g/L 내지 약 2 g/L, 약 1 g/L 내지 약 3 g/L, 약 1 g/L 내지 약 4 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 약 1 g/L 내지 약 6 g/L, 약 1 g/L 내지 약 7 g/L, 약 1 g/L 내지 약 8 g/L, 약 1 g/L 내지 약 9 g/L, 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 g/L 내지 약 11 g/L, 약 1 g/L 내지 약 12 g/L, 약 2 g/L 내지 약 3 g/L, 약 2 g/L 내지 약 4 g/L, 약 2 g/L 내지 약 5 g/L, 약 2 g/L 내지 약 6 g/L, 약 2 g/L 내지 약 7 g/L, 약 2 g/L 내지 약 8 g/L, 약 2 g/L 내지 약 9 g/L, 약 2 g/L 내지 약 10 g/L, 약 2 g/L 내지 약 11 g/L, 약 2 g/L 내지 약 12 g/L, 약 3 g/L 내지 약 4 g/L, 약 3 g/L 내지 약 5 g/L, 약 3 g/L 내지 약 6 g/L, 약 3 g/L 내지 약 7 g/L, 약 3 g/L 내지 약 8 g/L, 약 3 g/L 내지 약 9 g/L, 약 3 g/L 내지 약 10 g/L, 약 3 g/L 내지 약 11 g/L, 약 3 g/L 내지 약 12 g/L, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L, 약 4 g/L 내지 약 6 g/L, 약 4 g/L 내지 약 7 g/L, 약 4 g/L 내지 약 8 g/L, 약 4 g/L 내지 약 9 g/L, 약 4 g/L 내지 약 10 g/L, 약 4 g/L 내지 약 11 g/L, 약 4 g/L 내지 약 12 g/L, 약 5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 6 g/L 내지 약 7 g/L, 약 6 g/L 내지 약 8 g/L, 약 6 g/L 내지 약 9 g/L, 약 6 g/L 내지 약 10 g/L, 약 6 g/L 내지 약 11 g/L, 약 6 g/L 내지 약 12 g/L, 약 7 g/L 내지 약 8 g/L, 약 7 g/L 내지 약 9 g/L, 약 7 g/L 내지 약 10 g/L, 약 7 g/L 내지 약 11 g/L, 약 7 g/L 내지 약 12 g/L, 약 8 g/L 내지 약 9 g/L, 약 8 g/L 내지 약 10 g/L, 약 8 g/L 내지 약 11 g/L, 약 8 g/L 내지 약 12 g/L, 약 9 g/L 내지 약 10 g/L, 약 9 g/L 내지 약 11 g/L, 약 9 g/L 내지 약 12 g/L, 약 10 g/L 내지 약 11 g/L, 약 10 g/L 내지 약 12 g/L, 또는 약 11 g/L 내지 약 12 g/L이다.

구체예들에서, 생성된 재조합 CRM197 단백질의 양은 총 세포 단백질의 약 1% 내지 75%이다. 특정 구체예들에서, 생성된 CRM197의 양은 총 세포 단백질의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5 %, 약 10%, 약 15 %, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 75%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 75%, 약 3% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 30%, 약 3% 내지 약 40%, 약 3% 내지 약 50%, 약 3% 내지 약 60%, 약 3% 내지 약 75%, 약 4% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 30%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 50%, 약 4% 내지 약 60%, 약 4% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 75%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 75%, 또는 약 70% 내지 약 75%이다.

활성

단백질의 "가용성" 및 "활성"은, 관련된 성질이긴 하지만, 일반적으로 상이한 방법으로 측정한다. 단백질, 특히 소수성 단백질의 가용성은 전형적으로 단백질의 폴딩과 관련이 있으며; 불용성은 소수성 아미노산 잔기가 폴딩된 단백질 외부에 부적절하게 위치함을 나타내는 것이다. 단백질 활성은, 예컨대 하기 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이는 적당한 단백질 구조의 또 다른 지시자이다. 본 명세서에 사용된 "가용성, 활성 또는 둘다"는 당업자에게 공지된 방법으로 가용성, 활성 또는 가용성이면서 활성인 것으로 확인되는 단백질을 의미한다. 소정의 단백질의 "활성"은, 예컨대 수용체, 특이적 항체 또는 또 다른 기지의 물질에의 결합에 의해 나타나거나, 또는 관련된 경우 효소 활성에 의해 나타나는 결합 활성을 포함할 수 있다. 활성 수준은, 예컨대 표준 또는 대조 샘플이나, 또는 참고로서 사용되는 임의의 샘플의 활성과 비교하였을 때 상대값으로 또는 절대값으로 나타낼 수 있다.

CRM197을 평가하는 활성 분석은 당업계에 공지되어 있고, 문헌에 개시되어 있다. 활성 분석은 면역학적 분석, 예컨대 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA와 수용체 결합 분석, 예컨대 디프테리아 독소 수용체(proHB-EGF) 결합을 포함한다. 따라서, 활성 척도는, 예컨대 항체 또는 수용체 결합능을 나타낼 수 있다.

구체예들에서, 활성은 분석된 총량과 비교하여 추출물 상청액 중 활성 재조합 CRM197 단백질의 %로 나타낸다. 이것은 분석에 사용된 재조합 CRM197 단백질의 총량과 비교하여 분석에 의해 활성인 것으로 측정된 재조합 CMR197의 양에 기초한다. 다른 구체예들에서, 활성은 표준물, 예컨대 천연 단백질과 비교하여 단백질의 활성 수준(%)으로 표시된다. 이는 표준 샘플 중 활성 단백질의 양에 대한 상청액 추출물 샘플 중 활성 재조합 CRM197 단백질의 양에 기초한 것이다(각 샘플로부터 동량의 단백질을 분석에 사용함).

구체예들에서, CRM197 단백질의 약 40% 내지 약 100%는 활성인 것으로 측정된다. 구체예들에서, 재조합 CRM197 단백질의 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%는 활성인 것으로 측정된다. 구체예들에서, 재조합 CRM197 단백질의 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 또는 약 70% 내지 약 100%는 활성인 것으로 측정된다.

다른 구체예들에서, 재조합 CRM197 단백질의 약 75% 내지 약 100%는 활성인 것으로 측정된다. 구체예들에서, 재조합 CRM197 단백질의 약 75% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 85%, 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 85%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100%는 활성인 것으로 측정된다.

유도된 단백질의 정체를 확인하는 수단도 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 펩티드 맵핑, N-말단 서열 분석 또는 MALDI-TOF 질량 분광분석을 이용한 펩티드 질량 핑거프린트로 단백질을 분석할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예를 본 명세서에 제시하고 개시하였지만, 그러한 구체예들은 단지 예시를 위해 제공된 것임이 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당업자들은 다수의 변형, 변화 및 치환을 실시할 수 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 구체예들의 각종 대안을 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있음을 이해해야 한다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범위를 규정하며, 이들 특허청구범위 및 이의 등가범위 내의 방법 및 구성은 본 명세서에 의해 포괄된다.

실시예

실시예 1: 재조합 CRM197 단백질의 고처리량 발현

CRM197 발현 균주를 구성하고, 균주에서 생산되는 가용성 CRM197 단백질의 양은 모세관 겔 전기영동(SDS-CGE)을 사용하여 분석하였다. 결과 데이타에 기초하여, 대규모 발현에 사용할 일부 균주를 선별하였다.

CRM197 발현 균주의 구성 및 배양

CRM197 아미노산 서열을 코딩하는 P. 플루오레센스의 선호 코돈을 사용하여 CRM197 코딩 서열을 구성하였다. 도 1은 발현된 합성 CRM197 유전자의 아미노산 및 DNA 서열을 도시한다.

숙주 균주 및 분리 리더의 표준 패널을 이용하였다. 표 6에 도시된 바와 같은 10개의 P. 플루오레센스 분비 리더에 융합된 코돈 최적화된 CRM197 서열을 보유하는 플라스미드를 구성하였다. 적당한 폴딩 및 활성 형태의 회수를 위해 주변세포질로 단백질을 표적화시키는 분비 리더를 포함시켰다.

재조합 CRM197 단백질에 융합된 10개의 분비 리더를 함유하는 구성체를 P.플루오레센스 숙주에서 시험하였다. 표 7에 열거된 4종의 숙주를 각 리더와 함께 테스트하였다. 숙주 세포를 제시된 플라스미드로 일렉트로포레이션하고, 미량의 미네랄 및 5% 글리세롤을 포함하는 HTP 배양 배지에 재현탁시킨 다음, 400 ㎕ M9 염 1% 글루코스 배지 및 미량의 성분을 함유하는 96웰 딥 웰 플레이트로 옮겼다. 96웰 플레이트를 48 시간 동안 진탕하면서 30℃에서 항온처리하였다. 40 접종 배양물 각각의 10 ㎕를 삼중 96 웰 딥-웰 플레이트로 옮겼으며, 각 웰은 미량의 원소 및 5% 글리세롤이 보충된 HTP 배지 500 ㎕를 함유하며, 24 시간 동안 이전과 같이 항온처리하였다.

이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도가 0.3 mM이 되도록 각 웰에 첨가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 만니톨(시그마, M1902)을 최종 농도가 1%가 되도록 각 웰에 첨가하여 폴딩 조절인자 과발현 균주에서 폴딩 조절인자의 발현을 유도하였으며, 온도를 25℃로 낮추었다. 유도 24 시간 후에, 400 ㎕ 부피의 PBS를 사용하여 세포를 OD₆₀₀ = 15로 정규화하였다. 가용성 및 불용성 분획을 형성하기 위해 초음파 처리 및 원심분리에 의한 추후 프로세싱을 위해 샘플을 동결시켰다.

샘플 조제 및 SDS-CGE 분석

OD-정규화된 배양물의 초음파처리 이후 원심분리로 가용성 및 불용성 세포 분획을 제조하였다. 냉동된 정규화 배양물 브로스(400 μL)를 해동하고 3.5분 동안 초음파처리하였다. 용해물을 20,000 x g에서 20분(4℃)동안 원심분리하고, 수동 또는 자동화된 액상 취급기(가용성 분획)를 이용하여 상청액을 제거하였다. 펠릿(불용성 분획)을 냉동한 후 20,080 x g에서 20분 동안 4℃에서 재원심분리를 위해 해동시켜 잔류 상청액을 제거하였다. 그 다음 펠릿을 400 μL의 1X 인산염 완충 염수(PBS), pH 7.4에 재현탁시켰다. SDS-CGE 분석을 위한 가용성 및 불용성 샘플의 추가 희석을 1X 인산염 완충 염수(PBS), pH 7.4에서 수행하였다. 디티오트레이톨(DTT)의 존재 하에 SDS 모세관 겔 전기영동(CGE)(Caliper Life Sciences, Protein Express LabChip Kit, Part 760301)을 위한 가용성 및 불용성 샘플을 제조하였다.

표적 단백질을 발현하는 각 균주로부터의 가용성 분획은 환원성 SDS-CGE 분석으로 분석하였다. 대표적인 겔 유사 이미지는 도 2에 도시되어 있다. 표 8은 구성된 CRM197 발현 균주 각각에 대한 가용성 CRM197 평균 수율 및 3 복제물의 표준 편차를 제시한다. 각 균주에 대해 스크리닝된 숙주 균주 및 분비 리더도 제시되어 있다.

리더 및 숙주 균주는 모두 CRM197 발현에 유의적인 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 발현 범위는 0.5 ㎖ 규모에서 검출가능하지 않은 수율 내지 1.2 g/L 이상이며, 최대 발현 수준은 DC1100 숙주 배경에서 관찰되었다. CS538-746에서 관찰되는 수율은 1263 mg/L이며, CS538-742에서 관찰되는 수율은 1241 mg/L이며, 둘다 평균 수율이 340 mg/L 이상이다. 사용된 리더에 따라서 동일한 숙주 균주에서도 높은 수율과 낮은 수율이 모두 관찰되었으며, 상이한 숙주 균주에서 동일한 리더 서열을 사용해도 높은 수율 및 낮은 수율이 모두 관찰되었다.

대규모 발효를 위해 CS538-742, CS538-743, CS538-746, CS538-748, CS538-752를 선택하였다.

실시예 2: 재조합 CRM197 단백질의 대규모 발현

재조합 CRM197 단백질은 2 리터 발효기에서 슈도모나스 플루오레센스 Pfenex Expression Technology^TM 균주 CS538-742, CS538-743, CS538-746, CS538-748, CS538-752에서 제조하였다.

본 명세서에 개시된 바와 같고, 예컨대 문헌[Riesenberg, D., et al., 1991]에 개시된 바와 같은 미네랄 염 배지를 함유하는 2 리터 발효기에서 배양물을 배양하고, 암모니아를 첨가하여 pH6.5 및 32℃에서 유지하였다. 발효기에서 살포 공기 및 산소의 흐름 및 교반을 증가시켜 용존 산소를 과량으로 유지한다. 발효 과정 중에 글리세롤을 배양물에 전달하여 과량 수준을 유지한다. 유도를 위한 표적 배양물의 세포 밀도(575nm (A₅₇₅)에서의 광학 밀도)에 도달할 때까지 상기 조건을 유지하며, 이 때 IPTG를 첨가하여 표적 단백질 생성을 개시한다. IPTG를 0.5 mM의 농도로 첨가하여 CRM197 생성을 개시한다 16∼24 시간 후에, 각 생물반응기에서 얻은 배양물을 원심분리로 수거하고, -80℃에서 세포 펠릿을 냉동시켰다. 샘플을, 생성물 발효에 대해서 SDS-CGE로 분석하였으며, 그 활성은 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

대규모 발효 배양물(예, 약 1 리터 이상)로부터 얻은 수율은 통상적으로 소규모 HTP 배양물에서 얻은 것보다 높다. 상기 HTP 발현 데이타를 기초로 하여, 대규모 발효 수율은 약 0.5 내지 10 g/L 이상일 것으로 예측된다.

SEQUENCE LISTING <110> PFENEX, INC. <120> HIGH LEVEL EXPRESSION OF RECOMBINANT CRM197 <130> 38194-734.771 <140> <141> <150> 61/319,152 <151> 2010-03-30 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser 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Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 2 <211> 1605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 ggggcggacg atgtggtgga ttcctccaag tcgtttgtca tggaaaattt ctcgtcgtac 60 catggcacta agccaggcta cgtggatagc attcaaaagg gcatccagaa gcccaagagc 120 ggtactcagg ggaactatga cgacgactgg aaggaatttt acagcaccga caataagtac 180 gatgctgcgg gctatagcgt ggacaacgaa aacccattgt cgggcaaggc cggtggcgtg 240 gtgaaggtga cctatcctgg tctgacgaaa gttctggcgt tgaaagtgga caacgccgag 300 actatcaaga aagaattggg cttgagtttg accgagccgc tgatggaaca ggtgggtacc 360 gaagaattca ttaaacgttt tggggacggc gcgtcgcgcg tggtcctgtc gttgccgttc 420 gccgaagggt cgtcgtcggt ggaatatatc aacaactggg aacaggccaa ggcgctgtcg 480 gtggaactgg aaattaactt cgaaacgcgg ggcaaacggg gccaggacgc catgtacgaa 540 tacatggcgc aggcgtgcgc cgggaaccgg gtgcggcgca gcgtgggcag ttccttgagt 600 tgcatcaatc tggactggga cgtcatccgc gataagacga agacgaaaat cgagtcgctc 660 aaagagcacg gcccgatcaa aaacaaaatg agcgagtcgc cgaataaaac ggtgtccgag 720 gagaaggcga agcaatacct ggaggaattc caccagacgg ctctggagca cccggagctg 780 agcgaactca aaaccgttac cggtacgaac ccggtgtttg ccggggcaaa ctatgcagct 840 tgggccgtca acgtggccca agtgatcgac tccgaaacgg ccgacaacct ggaaaagact 900 accgccgcgt tgtcgatcct cccgggcatc gggagcgtca tgggtattgc cgatggtgcg 960 gtgcatcaca acaccgaaga gatcgtcgcg cagtcgatcg cattgtcctc cctgatggtc 1020 gcccaagcta tcccgctggt cggcgagctg gtcgatatcg gctttgccgc ttataacttt 1080 gttgaatcga tcattaacct gttccaggtg gtgcataaca gctacaaccg gccagcgtac 1140 tcgcccggtc acaagaccca gccctttctc cacgacggct atgccgtgtc gtggaacacc 1200 gtggaggaca gcatcatccg caccggtttc cagggcgaga gcggccatga catcaaaatt 1260 accgcggaaa acacgccctt gccgatcgct ggcgtgttgc tcccgacgat cccgggtaag 1320 ctcgacgtca acaagtccaa gacccatatc agcgtcaatg gccgcaagat ccgcatgcgc 1380 tgtcgggcca ttgatggcga cgtcacgttt tgccggccga agagtcccgt ctatgtcggg 1440 aacggtgtcc atgccaacct gcacgtcgca ttccaccgga gcagctcgga aaagatccac 1500 agcaatgaga tcagcagcga cagcatcggc gtgctggggt atcaaaagac ggtcgatcac 1560 accaaggtga acagtaaact gagcttgttc tttgaaatca agtcg 1605 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: DsbA secretion leader sequence <400> 3 Met Arg Asn Leu Ile Leu Ser Ala Ala Leu Val Thr Ala Ser Leu Phe 1 5 10 15 Gly Met Thr Ala Gln Ala 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Azu secretion leader sequence <400> 4 Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Leu Leu Ala 20 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Ibp-S31A secretion leader sequence <400> 5 Met Ile Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ala 20 25 30 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Tpr secretion leader sequence <400> 6 Met Asn Arg Ser Ser Ala Leu Leu Leu Ala Phe Val Phe Leu Ser Gly 1 5 10 15 Cys Gln Ala Met Ala 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: CupB2 secretion leader sequence <400> 7 Met Leu Phe Arg Thr Leu Leu Ala Ser Leu Thr Phe Ala Val Ile Ala 1 5 10 15 Gly Leu 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TolB secretion leader sequence <400> 12 Met Arg Asn Leu Leu Arg Gly Met Leu Val Val Ile Cys Cys Met Ala 1 5 10 15 Gly Ile Ala Ala Ala 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Pbp secretion leader sequence <400> 13 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Lao secretion leader sequence <400> 14 Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala 1 5 10 15 Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: CupC2 secretion leader sequence <400> 15 Met Pro Pro Arg Ser Ile Ala Ala Cys Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Met Ala Thr Gln Ala Ala Ala 20 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: PorE secretion leader sequence <400> 16 Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Gly Ala Asp Asp 1

Claims

슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포에서 재조합 CRM197 단백질을 생성하는 방법으로서,
CRM197 단백질의 주변세포질로의 이동을 지시하는 분비 신호에 융합된 CRM197 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 결찰시키는 단계;
슈도모나스 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; 및
재조합 CRM197 단백질의 발현에 적합한 배양 배지 중에서 형질전환된 슈도모나스 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
얻어진 가용성 CMR197의 수율은 약 0.5 g/리터 내지 약 12 g/리터인 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 숙주 세포는 하나 이상의 프로테아제의 발현에 결함이 있거나, 또는 상기 슈도모나스 숙주 세포는 하나 이상의 폴딩 조절인자를 과발현하는 생성 방법.
제2항에 있어서, 상기 슈도모나스 숙주 세포는 hslUV-, prc1-, degP1-, degP2-, 및 aprA-인 생성 방법.
제3항에 있어서, 분비 리더는 Azu, IbpS31A, CupA2, PbpA20V, 또는 Pbp인 생성 방법.
제2항에 있어서, 상기 슈도모나스 숙주 세포는 세라리신(Serralysin), HslU, HslV, Prc1, DegP1, DegP2, 또는 AprA의 발현에 결함이 있거나, 또는 슈도모나스 숙주 세포는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과발현하는 생성 방법.
제5항에 있어서, 상기 숙주 세포는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 과발현하고, 분비 리더는 Azu인 생성 방법.
제5항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세라리신의 발현에 결함이 있고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu인 생성 방법.
제5항에 있어서, 상기 숙주 세포는 HslU 및 HslV의 발현에 결함이 있고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu인 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 숙주 세포는 야생형이고, 분비 리더는 Pbp 또는 Azu인 생성 방법.
제1항에 있어서, 분비 리더는 Azu, Pbp, IbpS31A, CupA2, 또는 PbpA20V인 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 CRM197 뉴클레오티드 서열은 슈도모나스 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 것인 생성 방법.
제1항에 있어서, 얻어진 가용성 CRM197의 수율은 약 0.5 g/L, 약 0.6 g/L, 약 0.7 g/L, 약 0.8 g/L, 약 0.9 g/L, 약 1 g/L, 약 1.5 g/L, 약 2 g/L, 약 2.5 g/L, 약 3 g/L, 약 3.5 g/L, 약 4 g/L, 약 4.5 g/L, 약 5 g/L, 약 5.5 g/L, 약 6 g/L, 약 6.5 g/L, 약 7 g/L, 약 7.5 g/L, 약 8 g/L, 약 8.5 g/L, 약 9 g/L, 약 9.5 g/L, 약 10 g/L, 약 10.5 g/L, 약 11 g/L, 약 12 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 3 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 1 g/L 내지 약 2 g/L, 약 1 g/L 내지 약 3 g/L, 약 1 g/L 내지 약 4 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 약 1 g/L 내지 약 6 g/L, 약 1 g/L 내지 약 7 g/L, 약 1 g/L 내지 약 8 g/L, 약 1 g/L 내지 약 9 g/L, 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 g/L 내지 약 11 g/L, 약 1 g/L 내지 약 12 g/L, 약 2 g/L 내지 약 3 g/L, 약 2 g/L 내지 약 4 g/L, 약 2 g/L 내지 약 5 g/L, 약 2 g/L 내지 약 6 g/L, 약 2 g/L 내지 약 7 g/L, 약 2 g/L 내지 약 8 g/L, 약 2 g/L 내지 약 9 g/L, 약 2 g/L 내지 약 10 g/L, 약 2 g/L 내지 약 11 g/L, 약 2 g/L 내지 약 12 g/L, 약 3 g/L 내지 약 4 g/L, 약 3 g/L 내지 약 5 g/L, 약 3 g/L 내지 약 6 g/L, 약 3 g/L 내지 약 7 g/L, 약 3 g/L 내지 약 8 g/L, 약 3 g/L 내지 약 9 g/L, 약 3 g/L 내지 약 10 g/L, 약 3 g/L 내지 약 11 g/L, 약 3 g/L 내지 약 12 g/L, 약 4 g/L 내지 약 5 g/L, 약 4 g/L 내지 약 6 g/L, 약 4 g/L 내지 약 7 g/L, 약 4 g/L 내지 약 8 g/L, 약 4 g/L 내지 약 9 g/L, 약 4 g/L 내지 약 10 g/L, 약 4 g/L 내지 약 11 g/L, 약 4 g/L 내지 약 12 g/L, 약 5 g/L 내지 약 6 g/L, 약 5 g/L 내지 약 7 g/L, 약 5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 5 g/L 내지 약 9 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 g/L 내지 약 11 g/L, 약 5 g/L 내지 약 12 g/L, 약 6 g/L 내지 약 7 g/L, 약 6 g/L 내지 약 8 g/L, 약 6 g/L 내지 약 9 g/L, 약 6 g/L 내지 약 10 g/L, 약 6 g/L 내지 약 11 g/L, 약 6 g/L 내지 약 12 g/L, 약 7 g/L 내지 약 8 g/L, 약 7 g/L 내지 약 9 g/L, 약 7 g/L 내지 약 10 g/L, 약 7 g/L 내지 약 11 g/L, 약 7 g/L 내지 약 12 g/L, 약 8 g/L 내지 약 9 g/L, 약 8 g/L 내지 약 10 g/L, 약 8 g/L 내지 약 11 g/L, 약 8 g/L 내지 약 12 g/L, 약 9 g/L 내지 약 10 g/L, 약 9 g/L 내지 약 11 g/L, 약 9 g/L 내지 약 12 g/L, 약 10 g/L 내지 약 11 g/L, 약 10 g/L 내지 약 12 g/L, 또는 약 11 g/L 내지 약 12 g/L인 생성 방법.
제1항에 있어서, 활성 분석에서 재조합 CRM197 단백질의 활성을 측정하는 단계를 더 포함하고, 생성된 가용성 CRM197의 약 40% 내지 약 100%가 활성인 것으로 측정되는 것인 생성 방법.
제13항에 있어서, 상기 활성 분석은 면역학적 분석 또는 수용체-결합 분석인 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 lac 유도체 프로모터를 포함하고, 상기 배양 단계는 약 0.02 내지 약 1.0 mM 농도의 IPTG를 사용한 프로모터의 유도를 포함하며, 유도시 세포 밀도는 약 40 내지 약 200 흡광 단위(AU)의 광학 밀도이며, 배양물의 pH는 약 6 내지 약 7.5이며, 배양 온도는 약 20 내지 약 35℃인 생성 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)인 생성 방법.