WO2021176039A1 - Bacteries gram-positives de l'espece lactococcus lactis ou streptococcus thermophilus ayant une tres faible proteolyse de surface, leurs methodes d'obtention et leurs utilisations - Google Patents

Bacteries gram-positives de l'espece lactococcus lactis ou streptococcus thermophilus ayant une tres faible proteolyse de surface, leurs methodes d'obtention et leurs utilisations Download PDF

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Vincent JUILLARD
Rozenn Gardan
Mylène BOULAY
Véronique MONNET
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Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement
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Definitions

  • the present invention relates to Gram-positive bacteria of the species Lactococcus lactis or Streptococcus thermophilus exhibiting very low surface proteolysis; it also relates to the use of these bacteria, in particular for the production of proteins of interest.
  • lactis (Poquet et al., 2000); a homologue in S. thermophilus is also present. This protease hydrolyses abnormal and / or misfolded proteins and is involved in the maturation of exported proteins (Poquet et al., 2000).
  • the inventors constructed single and double mutants for PrtS and HtrA in the LMD9 strain of S. thermophilus (see Example 1) and arrived at the conclusion that the deletion of the two proteases PrtS and HtrA does not abolish surface proteolysis in S. thermophilus LMD9 since a residual proteolysis is observed (see example 2).
  • the same results were obtained for the strains MG1363 and IL1403 of L. lactis (Guillot et al., 2016) and therefore confirm that the surface proteases HtrA and PrtS / PrtP are not alone responsible for the whole of the surface proteolytic activity of these strains. Hafeez et al.
  • proteases responsible for this residual activity are present in each of the three strains. This is how they identified the protease Ster-1612 (or STER_RS07910 in the new NCBI annotation) in the wild strain LMD9 of S. thermophilus; this protease is called YwdF (or EFV54_RS 11495 in the new NCBI annotation) for the strain IL1403 of L. lactis subsp. lactis and llmg-2442 (or LLMG_RS 12255 in the new NCBI annotation) for the strain MG1363 of L. lactis subsp. cremoris (see example 3).
  • This protease belongs to the S 16 family of LonA proteases (Gottesman et al., 1978 and Charrette et al., 1981) which are serine proteases, characterized by the presence of a catalytic Serine - Lysine dyad conserved in the C- region. terminal of the protein (Botos et al., 2004).
  • the inventors then constructed strains derived from S. thermophilus LMD9 in which all or part of the three endogenous proteases PrtS, HtrA and Ster-1612 have been inactivated (see example 1); the inactivation of the three proteases leads to almost abolished surface proteolysis in this bacterium (see example 4). In addition, they constructed the strain of S.
  • thermophilus LMD9 in which the three proteases PrtS, HtrA and Ster-1612 were inactivated and produced the heterologous proteins IL-10 or elafin (see example 6) and confirmed that the inhibition of these three proteases no longer entailed degradation of heterologous proteins, thus making it possible to improve the production yield of heterologous proteins, compared with the wild parent bacterium (see example 7). These results were also observed in Lactococcus lactis (see example 11).
  • a subject of the present invention is therefore a Gram-positive bacterium of the species Lactococcus lactis or Streptococcus thermophilus, such as the endogenous surface protease homologous to the protein designated Ster-1612 in Streptococcus thermophilus LMD9 and Ywdf or llmq 2442 respectively in Lactococcus lactis.
  • IL1403 and MG1363 has decreased or abolished expression and / or activity; more particularly, it relates to a Gram-positive bacterium of the species Lactococcus lactis or Streptococcus thermophilus, such as the endogenous surface protease comprising an amino acid motif having at least 80% identity with the sequence SEQ ID N ° l, has decreased or abolished expression and / or activity, where SEQ ID N ° 1 is defined as follows:
  • XI is histidine (H) or lysine (K);
  • X2 is serine (S), alanine (A) or threonine (T);
  • X3 is isoleucine (I), leucine (L) or valine (V);
  • X4 is aspartic acid (D) or glutamine (Q);
  • X5 is alanine (A) or valine (V);
  • X6 is aspartic acid (D) or tyrosine (Y); and X7 is lysine (K) or leucine (L).
  • the endogenous surface protease is a serine protease whose enzymatic activity can be characterized by the evaluation of the degradation of a chromogenic substrate by colorimetric assay, or of a protein substrate by SDS-PAGE electrophoresis or by analysis in HPLC liquid chromatography.
  • the amino acid motif included in said protease has at least 80% identity, and in increasing order preferably at least 82%, 86%, 91%, 95% or 100% identity with the sequence of amino acids SEQ ID No. 1 when the sequences are aligned over their entire length.
  • the Gram-positive bacterium is of the species Streptococcus thermophilus and the endogenous surface protease has at least 70% identity, and in increasing order preferably at least 75%, 80%, 85%. , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, and particularly preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID No. 2 when the sequences are aligned along their entire length.
  • the endogenous surface protease is Ster-1612 of sequence SEQ ID No. 2.
  • the Gram-positive bacterium is of the species Lactococcus lactis and the endogenous surface protease has at least 70% identity, and in increasing order preferably at least 75%, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, and particularly preferably at least 80% identity with the sequence SEQ ID No. 3 or with the sequence SEQ ID No. 4 when the sequences are aligned over their entire length.
  • the Gram-positive bacterium can be Lactococcus lactis subsp. lactis and the endogenous surface protease is YwdF of sequence SEQ ID No. 3 or the Gram-positive bacteria may also be Lactococcus lactis subsp. cremoris and the endogenous surface protease is 11 mg 2442 of sequence SEQ ID No. 4.
  • identity percentages are calculated from an overall alignment of amino acid sequences performed using the “needle” algorithm (Needleman and Wunsch, 1970) using the default parameters: “Matrix”: EBLOSUM62, “Gap penalty”: 10.0 and “Extend penalty”: 0.5.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding Ster-1612 is represented by the sequence SEQ ID No. 5.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding YwdF is represented by the sequence SEQ ID No. 6.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding llmg_2442 is represented by the sequence SEQ ID No. 7.
  • the Gram-positive bacterium according to the invention can be obtained from a strain of S. thermophilus LMD9, of S. thermophilus CNRZ1066, of Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403, from Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363.
  • the bacterium according to the invention exhibits a significantly reduced surface proteolysis compared to the parent bacterium from which it is derived (see the protocol for quantifying proteolysis in Example 2).
  • the expression of an endogenous surface protease in a bacterium is reduced is meant the reduction in the amount of the protease produced by the bacterium of the invention in comparison with the parent bacterium from which it is derived and in which the expression of said protease is not reduced, whatever the cause (reduction in the level of expression of the gene encoding the protease, reduction in the number of messenger RNAs, degradation of the protease).
  • the methods used to measure the decrease in the expression of a protease in a bacterium include, for example, quantitative RT PCR to assess the level of expression of the gene encoding the protease or the assay of the protein by Elisa to quantify the protein synthesized. .
  • the activity of an endogenous surface protease in a bacterium is reduced is meant the reduction in the activity of the protease produced by the bacterium according to the invention in comparison with a parent bacterium from which it is derived and in which the activity of said protease is not reduced.
  • the methods used to measure the decrease in the activity of a protease in a bacterium include, for example, the counting of the surface peptides identified by mass spectrometry following a double chromatographic separation (Guillot et al., 2016), the evaluation of the degradation of a chromogenic substrate making it possible to easily quantify the activity by colorimetric assay, or of a protein substrate by SDS-PAGE electrophoresis or HPLC liquid chromatography analysis, etc.
  • the expression and / or an activity of an endogenous surface protease in a bacterium is abolished is meant the absence of expression and / or activity of the protease or also in the absence of expression. and / or activity of at least one of the other known proteases (HtrA and / or PrtS in Streptococcus lhennophilus, Hiv A and / or PrtP in Lactococcus lactis, as described below); this is the case when the proteolysis of the bacterium in question represents, in order of preference, less than 60%, 50%, 40%, 30% still preferably less than 10% and most preferably less than 5% of the proteolysis of the parent bacterium from which it is derived, according to the protocol for quantifying the proteolysis of Example 2.
  • Such an abolition of the expression and / or of the activity of the endogenous surface protease can be obtained by total reduction of the expression and / or activity of the protease (as defined below) or even occur when the structural gene of the protease is not naturally present in the genome of the bacterium, or present in a truncated form ( pseudogene).
  • the bacterium according to the invention having a decreased activity and / or expression of its endogenous surface protease also exhibits a decreased activity and / or a decreased expression of at least one other endogenous surface protease.
  • which can be HtrA and / or PrtS in Streptococcus thermophilus, HtrA and / or PrtP in Lactococcus lactis.
  • the bacterium of the species S. thermophilus according to the invention is also such as the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 8 (HtrA) or the surface protease endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 9 (PrtS) has decreased or abolished expression and / or activity.
  • HtrA the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 8
  • PrtS surface protease endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 9
  • the bacterium of the species L. lactis according to the invention is also such as the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 10 (HtrA) or the surface protease endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 11 (PrtP) has decreased or abolished expression and / or activity.
  • HtrA the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 10
  • PrtP surface protease endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 11
  • the surface protease in Streptococcus thermophilus, has at least 70% identity, and in increasing order of preference at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 8, when the sequences are aligned over their entire length.
  • the surface protease, called HtrA in Lactococcus lactis has at least 70% identity, and in increasing order of preference at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 10, when the sequences are aligned over their entire length.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding HtrA is represented by the sequence SEQ ID No. 12 in the case of a strain of S. thermophilus, and by the sequence SEQ ID No. 13 in the case of a strain of Lactococcus lactis.
  • the surface protease called PrtS in Streptococcus thermophilus, has at least 70% identity, and in increasing order of preference at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with the amino acid sequence SEQ ID No. 9, when the sequences are aligned over their entire length.
  • the surface protease, called PrtP in Lactococcus lactis has at least 70% identity, and in increasing order of preference at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with the amino acid sequence SEQ ID No.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding PrtS is represented by the sequence SEQ ID No. 14 in the case of a strain of S. thermophilus, by the sequence SEQ ID No. 15 in the case of a strain of Lactococcus lactis.
  • the bacterium of the species S. thermophilus according to the invention is such that the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 8 (HtrA ) and the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 9 (PrtS) have expression and / or activity reduced or abolished.
  • the bacterium of the species L. lactis according to the invention is such that the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 10 (HtrA ) and the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 11 (PrtP) have expression and / or activity reduced or abolished.
  • the decrease in the expression of each of the three endogenous surface proteases in a bacterium according to the invention is measured for example by quantitative RT PCR to evaluate the level of expression of each of the genes encoding the proteases, or by ELISA assay to quantify each of the proteins synthesized, and is compared to the expression of surface proteases of a parent bacterium from which it is derived.
  • the decrease in the overall activity of the three endogenous surface proteases in a bacterium according to the invention can be measured by counting the surface peptides identified by mass spectrometry following a double separation in liquid chromatography (HPLC) and is compared to all the activity of surface proteases of a parent bacterium from which it is derived.
  • HPLC liquid chromatography
  • the decrease in the expression and / or the activity of proteases can be total or partial.
  • the decrease in expression and / or activity is considered to be total within the meaning of the invention when it represents less than 5% of the proteolysis of the parent bacterium from which it is derived, according to the protocol for quantification of proteolysis of Example 2 and as observed with bacteria expressing none of the three endogenous surface proteases (see Example 4). It is considered partial when it is significantly less than that of the parent bacteria from which it is derived.
  • the significance of the difference is estimated by a statistical test suitable for small sample sizes (Kruskal-Wallis nonparametric test) with a probability P less than 0.05.
  • the significant decrease in this surface proteolysis observed for a bacterium according to the invention leads to a proteolysis, in order of preference, of less than 60%, 50%, 40%, 30% more preferably less than 10%, relative to the surface proteolysis of the parent bacterium from which it is derived.
  • a partial decrease in the expression and / or activity of the proteases is observed with bacteria not expressing one or two of the above three endogenous surface proteases (see Examples 2 and 4).
  • This decrease in the expression and / or activity of endogenous surface proteases can be obtained by mutagenesis of the genes encoding these proteases.
  • This mutagenesis can then take place at the level of the coding sequence or sequences for regulating the expression of these genes, in particular at the level of the promoter, leading to inhibition of transcription or translation of proteases.
  • the introduction of one or more point mutations inside the coding sequence of a gene or of its expression regulation sequences can induce, depending on the nature of the mutation, a displacement of the frame.
  • lactis the introduction of one or more point mutations within the coding sequence of a gene of G operon other than that encoding the protease can induce, depending on the nature of the mutation, a displacement of the reading frame and / or the introduction of a stop codon in the sequence and thus abolish the expression of the protease (polar mutation). The same is true for the sequence regulating the expression of the entire G operon.
  • the bacterium according to the invention can be obtained by deletion, insertion and / or substitution of one or more nucleotides, for example by deletion of all or part of the coding sequence of the gene encoding the protease or of its promoter, by the insertion of an exogenous sequence within the coding sequence of the gene encoding the protease or of its promoter, by the substitution of one or more nucleotides of the coding sequence of the gene encoding one of the amino acids of the active site of the protease or its promoter, or by introducing a polar mutation in the case of a gene organized as an operon.
  • Methods making it possible to delete, insert and / or substitute a given genetic sequence in the bacterium, in particular in S.
  • thermophilus and Lactococcus lactis are well known to those skilled in the art (Gardan et al., 2009 and Biswas et al. , 1993).
  • the insertion of an exogenous sequence within the coding sequence of the gene encoding the protease can be carried out using transposons of natural or artificial origin.
  • Mutagenesis can be carried out by inducing random mutations, for example using physical agents, such as radiation or chemicals such as EMS (Ethyl Methane Sulfonate) or in a targeted manner by transfection, transduction, natural transformation or by electroporation (Bron et al., 2019).
  • mutagenesis can be carried out by methods using nucleases (TALEN, CRISPR / Cas9, Wei et al., 2013).
  • the decrease in protease activity can be obtained by the use of specific inhibitors of serine proteases (PMSF [PhenylMethaneSulfonyl Fluoride], DFP [DiisopropylFluoroPhosphate], triterpenoid, coumarin, serpines, peptidomimetics ..., Shamsi et al. , 2016; Soualmia and El Amri, 2018).
  • PMSF PhhenylMethaneSulfonyl Fluoride
  • DFP DiisopropylFluoroPhosphate
  • triterpenoid triterpenoid
  • coumarin coumarin
  • serpines peptidomimetics ..., Shamsi et al. , 2016; Soualmia and El Amri, 2018
  • the decrease in the expression of proteases can be obtained by modifying the promoter sequence of the gene according to, for example, one of the methods used to substitute a nucleo
  • the mutated genes encoding the proteases as defined above can be identified for example by PCR using primers specific for said genes, PCR optionally followed by sequencing of the PCR fragment in the case of mutations not affecting the size of said. gene (substitutions, for example).
  • the two proteases HtrA and STER_1612 are present in all strains, and their protein sequences are very well conserved (except for one strain, N4L, whose gene encoding HtrA is a pseudogene).
  • the inventors evaluated the role of the two surface proteases HtrA and STER_1612 on the surface proteolysis of the strains of S. thermophilus of group B and showed that the residual surface proteolysis of the double mutant is comparable to that obtained with the triple mutant of the LMD9 strain (see example 5).
  • the activation of the genes encoding these two or three surface proteases respectively is sufficient to reduce the surface proteolysis of the bacteria by more than 90%.
  • An advantageous bacterium within the meaning of the present invention is a bacterium, preferably Streptococcus thermophilus, in which the expression or activity of 3 endogenous surface proteases, Ster-1612 of sequence SEQ ID No. 2, HtrA of sequence SEQ ID No. 8, and PrtS of sequence SEQ ID No. 9, of said bacterium is inhibited.
  • Another advantageous bacterium within the meaning of the present invention is a bacterium, preferably Streptococcus thermophilus, in particular a strain of Streptococcus thermophilus which does not possess PrtS, in which the expression or activity of the endogenous surface protease, Ster- 1612 of sequence SEQ ID No. 2 or in which the expression or activity of the 2 endogenous surface proteases, Ster-1612 of sequence SEQ ID No. 2 and HtrA of sequence SEQ ID No. 8 of said bacterium is inhibited.
  • Streptococcus thermophilus in particular a strain of Streptococcus thermophilus which does not possess PrtS, in which the expression or activity of the endogenous surface protease, Ster- 1612 of sequence SEQ ID No. 2 or in which the expression or activity of the 2 endogenous surface proteases, Ster-1612 of sequence SEQ ID No. 2 and HtrA of sequence SEQ ID No. 8 of said bacterium is inhibited.
  • An advantageous bacterium within the meaning of the present invention is a bacterium, preferably Lactococcus lactis, in which the expression or activity of the 3 endogenous surface proteases, YwdF or llmg2442 (or their homologues) of respective sequence SEQ ID N ° 3 or 4, HtrA of sequence SEQ ID No. 10, and PrtP of sequence SEQ ID No. 11, of said bacterium is inhibited.
  • Another advantageous bacterium within the meaning of the present invention is a bacterium, preferably Lactococcus lactis, in particular a strain of Lactococcus lactis which does not possess PrtP, in which the expression or activity of the endogenous surface protease, YwdF or llmg2442 (or their homologues) of respective sequence SEQ ID N ° 3 or 4 or in which the expression or activity of the 2 endogenous surface proteases, and YwdF or llmg2442 of respective sequence SEQ ID No. 3 or 4 and HtrA of sequence SEQ ID No. 10 of said bacterium is inhibited.
  • a bacterium preferably Lactococcus lactis, in particular a strain of Lactococcus lactis which does not possess PrtP, in which the expression or activity of the endogenous surface protease, YwdF or llmg2442 (or their homologues) of respective sequence SEQ ID N ° 3 or 4 or
  • Ster-1612 or its homologue
  • HtrA in Streptococcus thermophilus
  • Ster-1612 or its homologue
  • PrtS in Streptococcus thermophilus
  • Ywdf or llmq 2442 or its homologue
  • HtrA in Lactococcus lactis
  • Ywdf or llmq 2442 or its homologue
  • PrtP in Lactococcus lactis
  • Ster-1612 or its homologue
  • HtrA and PrtS in Streptococcus thermophilus
  • Ywdf or llmq 2442 or its homologue
  • HtrA and PrtP in Lactococcus lactis.
  • a subject of the present invention is also a bacterium as defined above, modified to express a protein of interest, for example a heterologous or recombinant protein of interest, said bacterium being transformed with an expression vector containing a DNA fragment. encoding the protein of interest, or by integration of the DNA fragment of interest into the chromosome of said bacterium.
  • heterologous protein is meant a protein which is neither produced naturally by the bacterial strain, nor necessary for its growth.
  • the present invention therefore has the advantage of the expression by the bacterium according to the present invention of proteins of industrial interest, which will be secreted into the culture medium of said bacterium and in which the proteins of interest can be easily recovered, or associated. on the bacterial surface and exerting their enzymatic activity on the external face of the bacteria.
  • protein associated with the bacterial surface is meant a protein anchored covalently to the bacterial wall via an anchoring motif specific for sortase, a protein inserted into the plasma membrane via a membrane anchor located at the N- or C end -terminal of its amino sequence, a protein covalently linked to the membrane via a lipid anchoring motif located at the N-terminus of its amino sequence or a protein having association motifs non-covalent to the wall of LysM type, for example (Cossart and Joncquiieri, 2000; Desvaux et al., 2018).
  • the present invention also relates to a process for preparing a Gram-positive bacterium of the species Lactococcus lactis or Streptococcus thermophilus weakly proteolytic, comprising the reduction or the abolition in said bacterium, of the expression and / or of the 'activity of an endogenous surface protease of said bacterium, said protease comprising an amino acid motif exhibiting at least 80%, and in increasing order preferably at least 82%, 86%, 91%, 95% or 100% identity with the sequence SEQ ID No. 1, where SEQ ID No. 1 is defined as follows:
  • XI is histidine (H) or lysine (K);
  • X2 is serine (S), alanine (A) or threonine (T);
  • X3 is isoleucine (I), leucine (L) or valine (V);
  • X4 is aspartic acid (D) or glutamine (Q);
  • X5 is alanine (A) or valine (V);
  • X6 is aspartic acid (D) or tyrosine (Y); and X7 is lysine (K) or leucine (L).
  • the endogenous surface protease in Streptococcus thermophilus has at least 70% and more preferably 90% identity with the sequence SEQ ID No. 2 and the endogenous surface protease in Lactococcus lactis has at least 70% and more preferably 80 % identity with the sequence SEQ ID No. 3 or with the sequence SEQ ID No. 4.
  • the process for preparing a weakly proteolytic Streptococcus thermophilus bacterium according to the invention further comprises the reduction or abolition in said bacterium of the expression and / or activity of the endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 8 (HtrA) and / or endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 9 (PrtS).
  • the process for preparing a weakly proteolytic Lactococcus lactis bacterium according to the invention further comprises the reduction or abolition in said bacterium of the expression and / or activity of the endogenous surface protease. having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 10 (HtrA) and / or endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 11 (PrtP).
  • weakly proteolytic bacterium is understood to mean bacterium exhibiting very low surface proteolysis compared with the parent bacterium from which it is derived, that is to say estimated at less than 10% and preferably less than 5% of the proteolysis of the parent bacteria from which it is derived.
  • a subject of the present invention is also a method for reducing or abolishing the proteolytic activity of proteases in a Gram-positive bacterium of the species Lactococcus lactis or Streptococcus thermophilus, comprising the reduction or abolition in said bacterium, of the expression and / or the activity of an endogenous surface protease of said bacterium, said protease comprising an amino acid motif exhibiting at least 80%, and in increasing order preferably at least 82%, 86%, 91%, 95% or 100% identity with the sequence SEQ ID No. 1, where SEQ ID No. 1 is defined as follows:
  • XI is histidine (H) or lysine (K);
  • X2 is serine (S), alanine (A) or threonine (T);
  • X3 is isoleucine (I), leucine (L) or valine (V);
  • X4 is aspartic acid (D) or glutamine (Q);
  • X5 is alanine (A) or valine (V);
  • X6 is aspartic acid (D) or tyrosine (Y); and X7 is lysine (K) or leucine (L).
  • the endogenous surface protease in Streptococcus thermophilus has at least 70% and more preferably 90% identity with the sequence SEQ ID No. 2 and the endogenous surface protease in Lactococcus lactis has at least 70% and more preferably 80 % identity with the sequence SEQ ID No. 3 or with the sequence SEQ ID No. 4.
  • the method for decreasing or abolishing the proteolytic activity of proteases in a Streptococcus thermophilus bacteria further comprises, decreasing or abolishing in said bacteria, the expression and / or activity of the surface protease. endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 8 (HtrA) and / or endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 9 (PrtS).
  • the method for decreasing or abolishing the proteolytic activity of proteases in a Lactococcus lactis bacteria further comprises, decreasing or abolishing in said bacteria, the expression and / or activity of the surface protease. endogenous having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 10 (HtrA) and / or endogenous surface protease having at least 70% identity with the sequence SEQ ID No. 11 (PrtP).
  • a subject of the present invention is also the use of a bacterium according to the present invention for the production of heterologous protein of interest, said bacterium being transformed with an expression vector containing a DNA fragment encoding the heterologous protein d. 'interest or by integration of the DNA fragment of interest into the chromosome of said bacterium.
  • heterologous proteins of interest mention may be made of elafine, which is an inhibitor of proteolytic activity. This activity is particularly sought after, in particular for the treatment of chronic inflammatory bowel diseases, in which the activity of human proteases must be inhibited (Bermudez-Humaran et al., 2015).
  • anti-inflammatory proteins targeting the mucosal immune system cytokines, human trefoil factor TFF-1, etc.
  • vaccine proteins fragment C of tetanus toxin, E7 antigen of the human papillomavirus,
  • antibacterial peptides targeting imbalances in the intestinal flora defensins, cathelidicins, PAP protein associated with pancreatitis
  • enzymes that compensate for deficiencies or deficiencies superoxide dismutase, phenylalanine hydroxylase, glutamate decarboxylase
  • strains of bacteria used for the production of heterologous proteins of interest there may be mentioned the strains L. lactis and S. thermophilus.
  • Lactococcus lactis is considered to be the benchmark bacterium for the production of molecules of therapeutic interest. Its use has several advantages: it is a food bacterium whose harmlessness is recognized (bacterium labeled GRAS and QPS), it can be manipulated genetically and a deletion mutant of the gene encoding the protease. HtrA is available. It was then shown that the production of elafin by this mutant was greater than that of the wild strain, and that the treatment of mice with colitis by oral administration of the mutated strain was more effective than with the wild strain (Bermudez -Humaran et al., 2015).
  • Streptococcus thermophilus according to the invention also has many advantages: it is thermophilic, its temperature optimum corresponds to the human body temperature of 37 ° C, it is easily transformable and completely devoid of surface proteolytic activity, this which prevents the degradation of the heterologous protein of interest as it is produced.
  • a particularly advantageous bacterium for the production of heterologous proteins of interest is a bacterium of S. thermophilus as defined in the present invention.
  • a subject of the present invention is also a method for producing a heterologous protein, using a bacterium of the invention, as defined above.
  • a subject of the present invention is also the use of a bacterium according to the present invention as a pre-maturation ferment for milk.
  • a bacterium according to the present invention as a pre-maturation ferment for milk makes it possible to abolish these variations.
  • the sources of non-protein nitrogen which can be used would be consumed, without surface proteases being able to hydrolyze the milk proteins and generate new sources of non-protein. protein.
  • the growth of the leaven used to ferment the milk would only be based on its ability to hydrolyze caseins, carried by the proteases PrtP and PrtS, depending on the bacterium considered. Such an operation therefore has the effect of standardizing the growth of the leaven, by abolishing the variations in growth due to variations in the composition of the milk in non-protein nitrogen.
  • a bacterium which is particularly advantageous as a pre-maturation ferment for milk is a strain of S. thermophilus as defined in the present invention.
  • Figure 1 Effect of the inactivation of the two surface proteases PrtS and HtrA on the presence in the culture medium of peptides derived from the degradation of surface proteins of S. thermophilus LMD9, present in the culture medium. Average of 3 experiments (in black), with standard deviation of the mean (in gray).
  • Figure 2 Alignment of the sequences of the three proteins STER_1612, YwdF and llmg_2442.
  • the multiple alignment was performed with MUSCLE (v3.8) available on the EMBL-EBI server (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
  • White characters on a black background indicate amino acids located inside the cell, italics correspond to the transmembrane fragment and black characters are located outside the cell (HMMTOP predictions). The amino acids potentially constituting the catalytic diad are highlighted in gray.
  • Figure 3 Growth of S. thermophilus LMD9 wild-type strain and strain mutated for the three surface proteases PrtS, HtrA and STER_1612 (triple mutant) in a chemically defined medium (CDM) containing only free amino acids as a source of amino nitrogen .
  • CDM chemically defined medium
  • Figure 4 Effect of the inactivation of the 3 surface proteases PrtS, HtrA and STER_1612 on the number of peptides resulting from the degradation of surface proteins of S. thermophilus LMD9. Average of 3 experiments (in black), with standard deviation of the mean (in gray).
  • FIG. 5 Coverage of the IL-10 and elafin proteins by the degradation fragments (peptides) identified in the corresponding culture media of S. thermophilus LMD9 (wild-type strain producing IL-10 or elafin, respectively).
  • S. thermophilus LMD9 wild-type strain producing IL-10 or elafin, respectively.
  • Cysteines (C) are shown in bold type.
  • Figure 6 Immunodetection of elafine in the culture supernatant of S. thermophilus CNRZ1066 (wild-type and double mutant strain AhtrAASTER_1612).
  • Figure 7 Effect of inactivation of surface proteolysis on elafin activity produced by S. thermophilus CNRZ1066 (wild strain in black and double mutant AhtrAASTER_1612 in gray /.
  • Figure 8 Immunodetection of elafine produced by S. thermophilus CNRZ1066 (wild-type and double-mutant AhtrAASTER_1612) and L. lactis IL1403 (wild-type and mutant AhtrA strain).
  • Figure 9 Comparison of the elafin activities produced by L. lactis IL1403Ah / rA (denoted IL1403D) and S. thermophilus CNRZl066AhtrAASTER_1612 (denoted CNRZ1066DD).
  • FIG. 10 Immunodetection of elafin produced by L. lactis IL 1403 (wild-type and double mutant strain AhtrAAywdF).
  • Figure 11 Immunodetection of elafin produced by L. lactis MG1363 (wild-type and double mutant strain AhtrAAllmg-2442).
  • EXAMPLE 1 CONSTRUCTIONS OF MUTANTS OF THE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9 BACTERIAL STRAIN AND OF THE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS CNRZ1066 BACTERIAL STRAIN
  • the single mutants AhtrA, AprtS and D STER_1612 are constructed from the wild strain S. thermophilus LMD9 by gene replacement.
  • the technique used consists in producing a PCR fragment combining three amplicons:
  • the three amplicons are produced separately and then combined via a final additional PCR. This association is made possible by the addition of extensions to the oligonucleotides used to amplify the upstream and downstream regions which allow binding to the cassette of antibiotic resistance (PCR overlap). This final PCR fragment is then introduced into the strain by natural competence (WO2010 / 125091). The homology between the upstream and downstream fragments of the gene and of the PCR fragment allows recombination at the site of the gene to be replaced. Colonies in which the targeted gene has been replaced by the resistance gene can easily be isolated on a medium containing the corresponding antibiotic.
  • a kanamycin resistance cassette is used.
  • the upstream and downstream regions of the htrA gene are amplified separately by PCR from the chromosomal DNA of S. thermophilus LMD9; the kanamycin resistance cassette is amplified from the plasmid pKa (Trieu-Cuot et al., 1983) using the pairs of oligonucleotides htrA-upstream- F / htrA-upstream-R, htrA-downstream-F / htrA-downstream-R and aphA3-F / aphA3-R, the nucleotide sequences of which are presented in Table 1.
  • a first pre-culture is carried out during the day in M17 medium with 1% lactose (M171ac) (Terzagui et al., 1975) from a frozen stock of the strain; from which a second pre-culture in chemically defined medium (MCD) (Letort et al., 2001) is carried out overnight.
  • MCD chemically defined medium
  • This second pre-culture is used to inoculate a culture in MCD at an optical density of 600 nm (OD6 00 ) of 0.05.
  • the PCR product combining the three fragments is added to an aliquot of the culture.
  • the culture aliquot is spread on plates of M171ac agar containing 1 mg / ml of kanamycin.
  • the dishes are incubated for 48 hours at 42 ° C. in an anaerobic jar.
  • Several resistant clones are verified by PCR on a colony and a clone is then verified by sequencing.
  • An erythromycin resistance cassette is used.
  • the upstream and downstream regions of the ptrS gene were amplified separately by PCR from the chromosomal DNA of S. thermophilus LMD9; the erythromycin resistance cassette is amplified from the plasmid pG + host9 (Biswas et al., 1993) using the pairs of oligonucleotides prtS-upstream- F / prtS-upstream-R, prtS-downstream- F / prtS-aval-R and erm-F / erm-R, the nucleotide sequences of which are presented in Table 2.
  • Mutant D STER_1612. A spectinomycin resistance cassette is used. The upstream and downstream regions of the STER_1612 gene are amplified separately by PCR from the chromosomal DNA of S. thermophilus LMD9; the spectinomycin resistance cassette is amplified from the plasmid pAT28 (Trieu-Cuot et al., 1990) using the pairs of oligonucleotides STER_1612-upstream-F / STER_1612-upstream-R, STER_1612-downstream-F / STER_1612-aval-R and spec-F / spec-R, the nucleotide sequences of which are presented in Table 3.
  • Fe double mutant AhtrAAprtS is constructed from the single mutant AprtS by natural transformation using chromosomal DNA from the mutant AhtrA. After breaking the cells with glass beads, the chromosomal DNA of the AhtrA mutant is extracted with phenol-chloroform and then precipitated with ethanol. Fe mutant AprtS is transformed with the chromosomal DNA purified from the mutant AhtrA, following the same transformation protocol natural as described above. The transformants are selected by plating on agar medium containing kanamycin (1 mg / ml). A few resistant clones are verified by colony PCR.
  • the double mutants AhtrA ASTER_1612, AprtS ASTER_1612 and the triple mutant AhtrAAprtSASTER_l 612 are obtained by natural transformation of the strains LMD9 AhtrA, EMD9 AprtS and LMD9 AhtrAAprtS with the PCR fragment containing the upstream and downstream regions of the STER_1612 gene fused to the resistance cassette to spectinomycin used to construct the single mutant ASTER_1612 according to the protocol described above.
  • the protocol for selecting and controlling mutants is that described for obtaining the single mutant ⁇ MD9ASTER_1612.
  • chromosomal DNA from strain CNRZ1066 is used as a template to amplify the upstream and downstream regions of the gene to be mutated.
  • strain competence is enhanced by adding ComS competence peptide (LPYFAGCL) at a concentration of ImM for 10 minutes before adding the PCR fragment to the culture.
  • LYFAGCL ComS competence peptide
  • the double mutant CNRZ1066 AhtrAASTER_l 612 is obtained by natural transformation of strain C NRZ 1066ASTER_ 1612 with chromosomal DNA of strain CNRZ1066 AhtrA. A few mutants were checked by PCR on a colony.
  • the LMD9 strain naturally produces the two surface proteases PrtS and HtrA.
  • two single mutants AprtS and AhtrA and a double-mutant AhtrAAprtS were constructed by natural transformation (WO2010 / 125091), following the protocol described in Example 1 . 1) Material and methods: Determination of the exopeptidome of the strains
  • the exopeptidome of the strains thus obtained is determined under the same experimental conditions as that of the wild strain LMD9, as described below.
  • the filtered culture supernatant is acidified with trifluoroacetic acid (TFA) to a final concentration of 0.1% (470 m ⁇ of a 10% TFA solution in 47 ml of culture supernatant), and stored overnight at 4 ° C.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptides present in the acidified supernatant are extracted by solid phase extraction (SPE) on a StrataX cartridge (Phenomenex) containing 200 mg of phase, at a flow rate of approximately 0.3 ml / min, according to the manufacturer's recommendations.
  • SPE solid phase extraction
  • the cartridge is first activated with 3 ml of methanol, then equilibrated with 6 ml of an aqueous solution containing 5% acetonitrile and 0.1% TFA. 1.75 ml of acetonitrile are added to 35 ml of acidified supernatant, so as to have a final acetonitrile concentration of 5% in the supernatant.
  • 35 ml of the supernatant thus prepared are loaded onto the activated and equilibrated cartridge, at a flow rate of 0.3 ml / min.
  • the cartridge is then washed with 5 ml of the aqueous solution containing 5% acetonitrile and 0.1% TFA, then the peptides are eluted with 1.5 ml of an aqueous solution containing 50% acetonitrile and 0, 1% TFA.
  • the eluate is dried for 16 to 18 h by evaporation under vacuum (speed vac system) then stored at -20 ° C.
  • the dried eluate containing the peptides is taken up in 350 m ⁇ of an aqueous solution containing 0.1% TFA (final concentration), which corresponds to a concentration factor of 100.
  • the solubilization of the peptides is obtained by vortexing. and passage for 5 minutes in an ultrasonic tank.
  • the concentrated solution of peptides is ultrafiltered through a membrane with a porosity of 3 kDa, by centrifugation for 1 hour at 13,000 rpm.
  • the peptides are then separated by HPLC on a reversed phase column (Kinetex 08 column (Phenomenex), porosity 100 A, particle size 2.6 ⁇ m, dimension 150 x 4.6 mm) with a linear gradient (slope 1.6%).
  • acetonitrile in ammonium formate (20 mM, pH 6.2) at a flow rate of 0.7 ml / min and at a temperature of 40 ° C.
  • the equivalent of 20 ml of culture ie 200 m ⁇ of concentrated suspension
  • the fractions eluted between 3.2% and 53.3% acetonitrile are collected and dried in a speed vac.
  • the identification of the peptides is made by mass spectrometry.
  • the dried fractions are taken up in 30m1 of an aqueous solution containing 0.1% TFA and 2% acetonitrile, and a 4m1 fraction is loaded onto a Pepmap 08 column (150 x 0.075 mm, particle size 2 mhi, porosity 100 TO).
  • the peptides are eluted with a gradient of acetonitrile in formic acid (0.1%), and analyzed online by mass spectrometry (LTQ-Orbitrap Discovery, Thermo Fisher).
  • the ionization of the peptides is done by electrospray (l, 3kV), and the analysis parameters of the ionized peptides are as follows: measurement of mass / charge ratios (m / z) from 300 to 1600 with a resolution of 15000 by l Orbitrap mass analyzer, and fragmentation of the 6 most abundant parent ions on the linear LTQ trap.
  • the doubly charged peptides are subjected to fragmentation, with an exclusion window of 40 seconds and the standard fragmentation parameters (collision energy: 35%).
  • the identification of the peptides and proteins from which they are derived is made with the X! Tandem search engine (version 2017.2.1.4) and the X! Tandem pipeline software suite (version 3.4.3, www.pappso.fr) using the protein sequence of the S. thermophilus LMD9 strain associated with a contaminant protein base suitable for the analysis activity of the analysis platform (tryptic peptides from a sample of eukaryotic proteins containing in particular human keratins, bovine proteins and murine).
  • X! Tandem pipeline's research parameters include the absence of tryptic cleavage for peptide identification, one minimum peptide per protein, identified with an E-value less than or equal to 0.01 and a mass tolerance of 10 ppm .
  • the surface proteases HtrA and PrtS alone are not responsible for all of the surface proteolytic activity of these strains.
  • 11 are predicted to be localized on the cell surface according to the LocateP database (http://www.cmbi.ru.nl/locatep-db/cgi-bin/locatepdb.py) or SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). It includes PrtS (STER_0846) (STER_RS04165) and HtrA (STER_2002) (STER_RS09790). The hypothesis pursued is that at least one of the 9 remaining proteases is involved in the surface proteolysis of S. thermophilus.
  • STER_0260 Peptides derived from the degradation of three of these 6 proteases (STER_0260, STER_1612 and STER_1741) were identified in the exopeptidome of S. thermophilus LMD9, indicating that these putative proteases were synthesized under these growth conditions.
  • STER_0260 is annotated as a D-Ala-D-Ala carboxypeptidase and STER_1741, as a signal peptide peptidase.
  • the STER_1612 protease (STER_RS07910) (annotated respectively YwdF in IL 1403 and llmg_2442 in MG 1363) therefore appears as the candidate protein to participate in the surface proteolysis of L. lactis and S. thermophilus.
  • the presence of a transmembrane fragment in the N-terminal region (www.enzim.hu/hmmtop/) is predicted for the protein of the 3 strains (FIG. 2).
  • the growth of the strain mutated for the synthesis genes of the three surface proteases is not significantly affected in the culture medium used, a chemically defined medium containing only amino acids as the source of amino nitrogen (see figure 3). , so that any differences observed between the wild-type strain and the mutants cannot be attributed to a difference in growth between the strains.
  • the double mutant CNRZ 1 Q66AhlrAAprlS is constructed by natural transformation following the experimental protocol described in Example 1.
  • the exopeptidome of the wild strain CNRZ1066 and of the mutant thus obtained are determined in the same experimental conditions than those described for the LMD9 strain and its mutants (example
  • the exopeptidome of the wild strain CNRZ1066 contains 240 spectra (peptide counts) from surface proteins. That of the double mutant only contains 15 spectra from surface proteins. On the basis of the number of spectra identified, it is possible to estimate the residual surface proteolysis of the double mutant of CNRZ1066 at 6% of that of the wild-type strain, ie a reduction comparable to that obtained with the LMD9 strain.
  • the L. lactis LL-pLB350 and LBH832 strains respectively contain the plasmids pLB350 (Hossain et al., 2012) and pLB386, which carry the genes encoding IL-10 and elafin, respectively, placed under the control of a promoter. inducible to bile salts (pGroEL).
  • the plasmids are extracted from these strains and purified using a commercial kit (Midikit, Quiagen).
  • the two plasmids pLB350 and pLB386 are then introduced into the wild strain S. thermophilus LMD9 and its triple mutant by natural competence, following the experimental protocol described in Example 1.
  • the plasmid pLB386 is introduced into the wild strain CNRZ1066 and its surface protease mutant by natural competence.
  • the transformants are selected by plating on M17 agar medium containing 5 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • the presence of the plasmid pLB350 is then verified by PCR on colonies using the two pairs of oligonucleotides pGroEL-L (ATAATGCCGACTGTACTTT of sequence SEQ ID No. 34) / IL-10-R (GGCCTTGTAGACACCTTGGTCTT of sequence SEQ ID No. 35) generating a band of 690 base pairs.
  • That of the plasmid pLB386 is with the two pairs of oligonucleotides pGroEL-L and Elafin-R (TCACTGGGGAACGAAACAGGC of sequence SEQ ID N ° 36) giving a band of 572 bp and that of the empty plasmid using the two oligonucleotides Cm-F (GTTCAACAAACGAAAATTGG of sequence SEQ ID N ° 37) and Cm-R (TT AT AAA AGCC AGT C ATT AG of sequence SEQ ID No. 38) giving a band of 807 bp.
  • EXAMPLE 7 A NON-PROTEOLYTIC BACTERIAL STRAIN IMPROVES THE PRODUCTION YIELD OF HETEROLOGICAL PROTEINS
  • IL-10 interleukin 10
  • elafine Two heterologous protein models were chosen, interleukin 10 (IL-10) and elafine. These two proteins are candidate proteins in the treatment of chronic inflammatory bowel disease (Benbouziane et al., 2013 and Bermudez-Humaran et al., 2015).
  • the plasmid carrying the gene encoding 1TL-10 is extracted from the strain of lactococcus which contained it and introduced into the strain S. thermophilus LMD9 and its triple mutant lacking surface proteolytic activity by natural transformation, according to the protocol described in the Example 6. The same operation was carried out for the plasmid encoding elafin. 4 strains are thus obtained, two wild ones producing one IL-10, the other elafin and two protease mutants producing the same two heterologous proteins.
  • the two pairs of wild-type and mutant strains carrying the plasmid pLB350 and the plasmid pLB386 respectively are cultured for 4 h in MCD at 42 ° C.
  • An equal weight mixture of cholic acid and deoxycholic acid is then added to the culture medium, at a final concentration of 150 pg / ml.
  • the purpose of this addition is to induce the expression of genes controlled by the pGroESL promoter.
  • the cells are removed by centrifugation and the peptides present in the culture supernatant are identified as indicated in Example 2.
  • the only difference consists in the modification of the interrogation bank, to which the sequence of IL-10 or elafin have been added, depending on the pair of strains considered.
  • Table 5 Number of peptides derived from the degradation of IL-10 or elafin, present in the culture medium of S. thermophilus LMD9 and its mutant of the three surface proteases PrtS, HtrA and STER_1612.
  • the plasmid encoding elafine is extracted from the lactococcal strain containing it, and introduced into the wild and mutant strains of CNRZ1066 by natural competence. To assess the stability of elafine, their degradation fragments are looked for in the culture medium after 4 h of growth, following the same approach as that developed for the LMD9 strain.
  • the culture and induction of the production of elafin by the strains carrying the plasmid pLB386 are carried out as described in Example 6. After 15 min of induction, the cells are removed by centrifugation, and the supernatant containing the. elafine is filtered through a filter with a porosity of 0.22 ⁇ m (PVDF membrane with low protein adsorption). Ten ml of supernatant are concentrated by a factor of 20 by ultrafiltration through a membrane with a cut-off threshold of 3 kDa (Amicon ultracell 3k, MerckMillipore). Five ⁇ l of retentate are deposited on polyacrylamide gel (pre-cast NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel gel, Invitrogen).
  • the proteins After migration for 1 h at 110 mA and 200 V, the proteins are transferred to a PVDF transfer membrane (Trans-Bot Turbo Mini transfer pack, Bio-Rad). Elafin, after being labeled with a mouse monoclonal anti-elafin antibody (SantaCruz Biotechnology), is detected by chemiluminescence (ECL Plus Western kit, Pierce).
  • the wild strain CNRZ166 producing elafin (well 5, denoted WT pis elafin). There are two bands, the upper one migrating to a size very slightly smaller than that of the mature form of commercial elafin. The second migrates to a significantly smaller size, and would be a truncated form of elafin in the process of degradation, The strain CNRZ1066 mutated for its surface proteases producing elafin (well 6, noted mutant pis elafin). The lower band corresponding to the truncated form of elafin is no longer detected, only the band corresponding to mature elafin is revealed.
  • the activity of elafine accumulated in the supernatants of the wild-type and mutant CNRZ1666 strains is evaluated by determining the power to inhibit the activity of a control human protease (elastase), according to the protocol described below.
  • the S. thermophilus strains carrying the plasmid pLB386 are cultured in MCD at 37 ° C. to an OD ⁇ OO of 1.0.
  • the strains of L. lactis carrying this same plasmid are cultured at 30 ° C. in a MCD specific for lactococci (Otto et al., 1983) up to an OD ⁇ OO of 1.0.
  • the cultures are centrifuged and the cells resuspended in fresh MCD at OD O OO 2.0.
  • Elafin production is obtained by induction with bile salts (15 ng / ml) and overnight incubation at 37 ° C. The cells are then centrifuged, and the elafin contained in the supernatant is concentrated by ultrafiltration by a factor of approximately 300.
  • Elafine is a protease inhibitor. It is therefore dosed according to the following principle.
  • the activity of a human protease (elastase) is measured by fluorescence using a labeled substrate (EnzCheck® Elastae assay kit, Molecular Probes), in the presence and absence of a supernatant containing elafine.
  • the intensity of inhibition is measured by the difference in fluorescence between the measurement without and with elafin over time, following the protocol supplied with the assay kit (Molecular Probes).
  • EXAMPLE 8 THE PRODUCTION OF ELAFIN BY NON-PROTEOLYTIC BACTERIAL STRAINS OF THE INVENTION
  • the two strains are cultivated to an identical population level, and the induction of elafin production is carried out under optimal conditions for each of the strains (see example 7 point 3)).
  • the strains L. lactis IL1403 and L. lactis MG1363 being devoid of plasmid, they do not produce the wall protease PrtP (the gene of which is carried by a plasmid, Gasson, 1983).
  • PrtP the gene of which is carried by a plasmid, Gasson, 1983.
  • the other two surface proteases produced are therefore HtrA (Poquet et al., 2000) and YwdF in IL 1403 (or its homolog IImg-2442 in MG 1363).
  • the double mutant IL1403AhtrAAywdF devoid of the three surface protease activities PrtP, HtrA and YwdF, was constructed from the strain IL1403A / z / (Guillot et al., 2016) by double homologous recombination using the heat-sensitive plasmid pGhost9 according to the established protocol (Biswas et al., 1993).
  • the first step consisted in inactivating the htrA gene by double homologous recombination, the second in inactivating the llgm-2442 gene in the single mutant obtained beforehand MG1363AhtrA, following a strategy identical to that described above for L. lactis IL1403.
  • EXAMPLE 10 OBTAINING LACTOCOCCUS LACTIS STRAINS PRODUCING ELAFIN
  • the plasmid pLB386 was purified from the strain L. lactis LBH832, as described in Example 6. It was introduced into the strain L. lactis IL 1403, into its double mutant L. lactis IL1403 AhtrAAywdf and into the double mutant L. lactis MG1363 AhtrAAllmg-2442 by electroporation.
  • the L. lactis LBH832 strain is none other than the wild-type L. lactis MG1363 strain carrying the plasmid pLB386.
  • the plasmid pLB44 was purified from the strain L. lactis LBH68, as described in Example 6. It was introduced into the strain L. lactis IL 1403, its double mutant L. lactis IL1403 AhtrAAywdf and into the double mutant L. lactis MG1363 AhtrAAllmg-2442 by electroporation.
  • the L. lactis LBH68 strain is none other than the wild-type L. lactis MG1363 strain carrying the plasmid pLB44.
  • EXAMPLE 11 INACTIVATION OF SURFACE PROTEASES INCREASES THE AMOUNT OF HETEROLOGICAL PROTEIN PRODUCED BY LACTOCOCCUS LACTIS
  • the wild strain of L. lactis IL1403 producing elafin (FIG. 10, well 3, denoted WT pis elafin).
  • WT pis elafin The wild strain of L. lactis IL1403 producing elafin.
  • the mutated strain of L. lactis IL1403 producing elafin (FIG. 10, well 5, denoted Mutant pis elafin).
  • the lower band corresponding to the truncated form of elafin is practically no longer detectable, the band corresponding to mature elafin is revealed in the majority, with a much greater intensity than in the wild strain, which reflects a very low proteolysis of elafin in the double mutant,
  • the mutated strain of L. lactis MG1363 producing elafin (FIG. 11, well 5, denoted Mutant pis elafin).
  • Three bands are observed, one of very low intensity (6 kDa) corresponding to the truncated form of elafin also perceptible in the mutant of L. lactis IL1403.
  • the upper band (in the form of a doublet) is the same as that found in the wild strain, but with a much greater intensity, reflecting a markedly higher concentration of undegraded elaffin in the supernatant of the mutated strain.

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Abstract

La présente invention concerne une bactérie dans laquelle l'expression et/ou l'activité de protéases de surface est inhibée, son procédé de préparation ainsi que les utilisations de cette bactérie.

Description

BACTERIES GRAM-POSITIVES DE L’ESPECE LACTOCOCCUS LACTIS OU STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS AYANT UNE TRES FAIBLE PROTEOLYSE DE SURFACE, LEURS METHODES D’OBTENTION ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne des bactéries Gram-positives de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus présentant une très faible protéolyse de surface ; elle se rapporte également à G uti 1 i sation de ces bactéries, notamment pour la production de protéines d’intérêt.
Une analyse des peptides produits par la bactérie Lactococcus lactis et accumulés dans son milieu de culture a mis en évidence une forte accumulation de peptides d'origine bactérienne (Guillot et al., 2016). Cet ensemble de peptides définit le peptidome exocellulaire ou exopeptidome de la bactérie. L'analyse de ces peptides montre qu’ approximativement la moitié d’entre eux provient de la dégradation de protéines de surface qui ne sont ni cytoplasmiques ni transmembranaires.
Cette dégradation serait due à la présence de plusieurs protéases localisées en surface de la bactérie. Deux protéases ainsi localisées ont déjà été caractérisées chez les bactéries lactiques. L'une, une sérine protéase de la famille des subtilisines, appelée PrtS chez Streptococcus thermophilus (S. thermophilus ) et PrtP chez Lactococcus lactis (L. lactis), ancrée de façon covalente à la paroi est capable d’hydrolyser les caséines du lait (Fernandez- Espla et al., 2000 et Siezen et al., 1999). La seconde, également une protéase à sérine, appelée HtrA, a été caractérisée chez L. lactis (Poquet et al., 2000) ; une homologue chez S. thermophilus est également présente. Cette protéase hydrolyse des protéines anormales et/ou mal repliées et intervient dans la maturation des protéines exportées (Poquet et al., 2000).
L’un des principaux inconvénients de cette protéolyse de surface est rencontré lors de la production de protéines d’intérêt par des bactéries, notamment des bactéries Gram- positives. En effet, la protéolyse de surface entraîne une dégradation de ces protéines pendant et/ou après leur exportation, conduisant à une baisse du rendement et/ou une altération de la structure et de l’activité de la protéine d’intérêt.
Il apparaît donc souhaitable d’obtenir des souches de bactéries présentant une très faible protéolyse de surface par rapport aux souches sauvages.
Dans ce contexte, les Inventeurs ont construit des simples et doubles mutants pour PrtS et HtrA dans la souche LMD9 de S. thermophilus (voir exemple 1) et sont arrivés à la conclusion que la délétion des deux protéases PrtS et HtrA n’abolit pas la protéolyse de surface chez S. thermophilus LMD9 puisqu’une protéolyse résiduelle est observée (voir exemple 2). Les mêmes résultats ont été obtenus pour les souches MG1363 et IL1403 de L. lactis (Guillot et al., 2016) et confirment donc que les protéases de surface HtrA et PrtS/PrtP ne sont pas responsables à elles seules de l’ensemble de l’activité protéolytique de surface de ces souches. Hafeez et al. (2013 et 2015) ont créé un double mutant AprtS-AhtrA chez S. thermophilus et ont conclu à la présence possible d’exopeptidases ayant des activités carboxypeptidase, peptidyl peptidase, aminopeptidase et X-prolyl-dipeptidyl peptidase, la possible présence de telles exopeptidases n’explique toutefois pas l’activité protéasique résiduelle observée par les Inventeurs, les enzymes étant de nature différente. En effet, les exopeptidases agissent sur les extrémités de chaînes peptidiques, tandis que la protéolyse résiduelle observée résulte de clivages internes de protéines.
L’hypothèse formulée par les Inventeurs est alors qu’une ou plusieurs protéases responsables de cette activité résiduelle sont présentes chez chacune des trois souches. C’est ainsi qu’ils ont identifié la protéase Ster-1612 (ou STER_RS07910 dans la nouvelle annotation NCBI) dans la souche sauvage LMD9 de S. thermophilus ; cette protéase est dénommée YwdF (ou EFV54_RS 11495 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche IL1403 de L. lactis subsp. lactis et llmg-2442 (ou LLMG_RS 12255 dans la nouvelle annotation NCBI) pour la souche MG1363 de L. lactis subsp. cremoris (voir exemple 3). Cette protéase appartient à la famille S 16 des protéases LonA (Gottesman et al., 1978 et Charrette et al., 1981) qui sont des protéases à sérine, caractérisées par la présence d’une dyade catalytique Serine - Lysine conservée en région C-terminale de la protéine (Botos et al., 2004).
Les Inventeurs ont ensuite construit des souches dérivées de S. thermophilus LMD9 dans lesquelles tout ou partie des trois protéases endogènes PrtS, HtrA et Ster-1612 ont été inactivées (voir exemple 1) ; l’inactivation des trois protéases conduit à une protéolyse de surface quasiment abolie chez cette bactérie (voir exemple 4). En outre, ils ont construit la souche de S. thermophilus LMD9 dans laquelle les trois protéases PrtS, HtrA et Ster-1612 ont été inactivées et produisant les protéines hétérologues IL- 10 ou élafine (voir exemple 6) et ont confirmé que l’inhibition de ces trois protéases n’ entraînait plus de dégradation de protéines hétérologues permettant ainsi l’amélioration du rendement de production de protéines hétérologues, par rapport à la bactérie parente sauvage (voir exemple 7). Ces résultats ont également été observés chez Lactococcus lactis (voir exemple 11). La présente invention a donc pour objet une bactérie Gram-positive de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, telle que la protéase de surface endogène homologue à la protéine désignée Ster-1612 chez Streptococcus thermophilus LMD9 et Ywdf ou llmq 2442 respectivement chez Lactococcus lactis IL1403 et MG1363 a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie ; plus particulièrement, elle a pour objet une bactérie Gram-positive de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, telle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°l, a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie, où SEQ ID N°1 est définie comme suit :
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K avec
XI est l’histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ; et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
La protéase de surface endogène est une protéase à sérine dont l’activité enzymatique peut être caractérisée par l’évaluation de la dégradation d’un substrat chromogénique par dosage colorimétrique, ou d’un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou encore par analyse en chromatographie liquide HPLC.
De préférence, le motif d’acides aminés compris dans ladite protéase possède au moins 80% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence d’acide aminés SEQ ID N°1 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie Gram-positive est de l’espèce Streptococcus thermophilus et la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la protéase de surface endogène est Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2.
Selon encore un autre mode de réalisation, la bactérie Gram-positive est de l’espèce Lactococcus lactis et la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, et de manière particulièrement préférée au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. En particulier, la bactérie Gram-positive peut être Lactococcus lactis subsp. lactis et la protéase de surface endogène est YwdF de séquence SEQ ID N°3 ou la bactérie Gram-positive peut encore être Lactococcus lactis subsp. cremoris et la protéase de surface endogène est llmg 2442 de séquence SEQ ID N°4.
Sauf indication contraire, les pourcentages d’identité sont calculés à partir d’un alignement global des séquences d’acides aminés effectué à l’aide de l’algorithme « needle » (Needleman et Wunsch, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5.
La séquence nucléotidique du gène codant Ster-1612 est représentée par la séquence SEQ ID N°5. La séquence nucléotidique du gène codant YwdF est représentée par la séquence SEQ ID N°6. La séquence nucléotidique du gène codant llmg_2442 est représentée par la séquence SEQ ID N°7.
L’analyse de 102 génomes de la sous-espèce L. lactis subsp. lactis, a permis de définir un degré de conservation de YwdF supérieur à 80% pour 100 souches, les 2 dernières n’ayant apparemment pas le gène codant YwdF. La conservation de séquence est également forte au sein de la sous-espèce L. lactis subsp. cremoris , puisque parmi les 56 génomes analysés, 51 ont un gène codant une protéine identique à plus de 80% à la protéine llmg_2442 de L. lactis subsp. cremoris MG1363, 5 ne semblant pas posséder le gène codant cette protéine.
A titre d’illustration et sans caractère limitatif, la bactérie Gram-positive selon l’invention peut être obtenue à partir d’une souche de S. thermophilus LMD9, de S. thermophilus CNRZ1066, de Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403, de Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363.
La bactérie selon l’invention présente une protéolyse de surface significativement diminuée par rapport à la bactérie parente dont elle dérive (voir le protocole de quantification de la protéolyse dans l’exemple 2). Par « l’expression d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée », on entend la diminution de quantité de la protéase produite par la bactérie de l’invention en comparaison avec la bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l’expression de ladite protéase n’est pas diminuée, quelle qu’en soit la cause (diminution du niveau d’expression du gène codant la protéase, réduction du nombre d’ARNs messagers, dégradation de la protéase).
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’expression d’une protéase dans une bactérie comprennent par exemple la RT PCR quantitative pour évaluer le niveau d’expression du gène codant la protéase ou le dosage de la protéine par Elisa pour quantifier la protéine synthétisée.
Par « l’activité d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est diminuée », on entend la diminution de l’activité de la protéase produite par la bactérie selon l’invention en comparaison avec une bactérie parente dont elle dérive et dans laquelle l’activité de ladite protéase n’est pas diminuée.
Les méthodes utilisées pour mesurer la diminution de l’activité d’une protéase dans une bactérie comprennent par exemple le comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation chromatographique (Guillot et al., 2016), l’évaluation de la dégradation d’un substrat chromogénique permettant de quantifier aisément l’activité par dosage colorimétrique, ou d’un substrat protéique par électrophorèse SDS-PAGE ou analyse en chromatographie liquide HPLC....
Par « l’expression et/ou une activité d’une protéase de surface endogène dans une bactérie est abolie », on entend l’absence d’expression et/ou d’activité de la protéase voire également en l’absence d’expression et/ou d’activité d’au moins une des autres protéases connues (HtrA et/ou PrtS chez Streptococcus lhennophilus, Hiv A et/ou PrtP chez Lactococcus lactis, comme décrit ci-après) ; c’est le cas lorsque la protéolyse de la bactérie considérée représente, par ordre de préférence, moins de 60%, 50%, 40%, 30% encore préférentiellement moins de 10% et tout préférentiellement, moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l’exemple 2. Une telle abolition de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène peut être obtenue par diminution totale de l’expression et/ou de l’activité de la protéase (au sens défini ci-dessous) ou encore survenir lorsque le gène de structure de la protéase n’est pas naturellement présent dans le génome de la bactérie, ou présent sous une forme tronquée (pseudogène). Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention ayant une activité et/ou l’expression de sa protéase de surface endogène diminuée présente en outre une activité et/ou une expression diminuée d’au moins une autre protéase de surface endogène qui peut être HtrA et/ou PrtS chez Streptococcus thermophilus, HtrA et/ou PrtP chez Lactococcus lactis.
De préférence, la bactérie de l’espèce S. thermophilus selon l’invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 (HtrA) ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 (PrtS) a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie.
De préférence, la bactérie de l’espèce L. lactis selon l’invention est en outre telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 (HtrA) ou la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll (PrtP) a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie.
La protéase de surface, dénommée HtrA chez Streptococcus thermophilus , possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N°8, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée HtrA chez Lactococcus lactis, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N°10, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
La séquence nucléotidique du gène codant HtrA est représentée par la séquence SEQ ID N°12 dans le cas d’une souche de S. thermophilus, et par la séquence SEQ ID N°13 dans le cas d’une souche de Lactococcus lactis.
La protéase de surface, dénommée PrtS chez Streptococcus thermophilus, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N°9, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La protéase de surface, dénommée PrtP chez Lactococcus lactis, possède au moins 70% d’identité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence d’acides aminés SEQ ID N°ll, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur. La séquence nucléotidique du gène codant PrtS est représentée par la séquence SEQ ID N°14 dans le cas d’une souche de S. thermophilus, par la séquence SEQ ID N°15 dans le cas d’une souche de Lactococcus lactis.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’espèce S. thermophilus selon l’invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 (HtrA) et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 (PrtS) ont une expression et/ou une activité diminuée ou abolie.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la bactérie de l’espèce L. lactis selon l’invention est telle que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 (HtrA) et la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll (PrtP) ont une expression et/ou une activité diminuée ou abolie.
Dans le cas présent, la diminution de l’expression de chacune des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l’invention est mesurée par exemple par RT PCR quantitative pour évaluer le niveau d’expression de chacun des gènes codant les protéases, ou par dosage ELISA pour quantifier chacune des protéines synthétisées, et est comparée à l’expression des protéases de surface d’une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’ensemble de l’activité des trois protéases de surface endogènes dans une bactérie selon l’invention peut être mesurée par comptage des peptides de surface identifiés par spectrométrie de masse suivant une double séparation en chromatographie liquide (HPLC) et est comparée à l’ensemble de l’activité des protéases de surface d’une bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité des protéases peut être totale ou partielle. La diminution de l’expression et/ou de l’activité est considérée comme totale au sens de l’invention lorsqu’elle représente moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive, selon le protocole de quantification de la protéolyse de l’exemple 2 et comme cela est observé avec les bactéries n’exprimant aucune des trois protéases de surface endogènes (voir l’exemple 4). Elle est considérée comme partielle lorsqu’elle est significativement inférieure à celle de la bactérie parente dont elle dérive. La significativité de la différence est estimée par un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) avec une probabilité P inférieure à 0.05. La diminution significative de cette protéolyse de surface observée pour une bactérie selon l’invention conduit à une protéolyse, par ordre de préférence, de moins de 60%, 50%, 40%, 30% encore préférentiellement moins de 10%, par rapport à la protéolyse de surface de la bactérie parente dont elle dérive. Une diminution partielle de l’expression et/ou de l’activité des protéases est observée avec des bactéries n’exprimant pas une ou deux des trois protéases de surface endogènes précitées (voir les exemples 2 et 4).
La diminution de l’expression et/ou de l’activité de protéases de surface endogènes telles que définies ci-dessus dans une bactérie, peut être obtenue de différentes manières détaillées ci-après.
Cette diminution de l’expression et/ou de l’activité de protéases de surface endogènes peut être obtenue par mutagenèse des gènes codant ces protéases. Cette mutagénèse peut alors intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l’expression de ces gènes, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction des protéases. Par exemple, l’introduction d’une ou plusieurs mutations ponctuelles à l’intérieur de la séquence codante d’un gène ou de ses séquences de régulation d’expression peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l’introduction d’un codon stop dans la séquence et/ou l’inhibition de la transcription ou de la traduction des gènes codant ces 3 protéases et/ou une substitution d’un des acides aminés du site actif de l’enzyme et conduire à l’expression d’une protéase inactive, ou d’une protéase avec une activité diminuée. Enfin, lorsque le gène codant l’une des protéases de surface est organisé en opéron (cas de ster-1612 chez S. thermophilus, et probablement de YwdF et llmg2442 chez L. lactis), l’introduction d’une ou plusieurs mutations ponctuelles à l’intérieur de la séquence codante d’un gène de G opéron autre que celui codant la protéase peut induire, en fonction de la nature de la mutation, un déplacement du cadre de lecture et/ou l’introduction d’un codon stop dans la séquence et ainsi abolir l’expression de la protéase (mutation polaire). Il en va de même pour la séquence régulant l’expression de l’ensemble de G opéron.
La bactérie selon l’invention peut être obtenue par délétion, insertion et/ou substitution d’un ou de plusieurs nucléotides, par exemple par délétion de tout ou partie de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase ou de son promoteur, par la substitution d’un ou plusieurs nucléotides de la séquence codante du gène codant un des acides aminés du site actif de la protéase ou de son promoteur, ou par introduction d’une mutation polaire dans le cas d’un gène organisé en opéron. Des méthodes permettant de déléter, d’insérer et/ou substituer une séquence génétique donnée chez la bactérie, en particulier chez S. thermophilus et Lactococcus lactis, sont bien connues de l’homme du métier (Gardan et al., 2009 et Biswas et al., 1993). Par exemple, l’insertion d’une séquence exogène à l’intérieur de la séquence codante du gène codant la protéase peut être réalisée en utilisant des transposons d’origine naturelle ou artificielle.
La mutagénèse peut être mise en œuvre par l’induction de mutations aléatoires, par exemple en utilisant des agents physiques, tels que les radiations ou chimiques tels que l’EMS (Ethyl Methane Sulfonate) ou de manière ciblée par transfection, transduction, transformation naturelle ou par électroporation (Bron et al., 2019). Alternativement, la mutagénèse peut être mise en œuvre par des méthodes utilisant des nucléases (TALEN, CRISPR/Cas9, Wei et al., 2013).
La diminution de l’activité des protéases peut être obtenue par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine (PMSF [PhenylMethaneSulfonyl Fluoride], DFP [DiisopropylFluoroPhosphate], triterpenoïde, coumarine, serpines, peptidomimetics..., Shamsi et al., 2016 ; Soualmia et El Amri, 2018). Enfin, la diminution de l’expression des protéases peut être obtenue par modification de la séquence promotrice du gène selon par exemple l’une des méthodes utilisées pour substituer une séquences nucléotidique citées ci- dessus, ou par une technique d’interférence ARN (RNAi), par expression d’un ARN antisense ou encore par des aptamères.
Les gènes mutés codant les protéases telles que définies précédemment peuvent être identifiés par exemple par PCR à l’aide d’amorces spécifiques desdits gènes, PCR éventuellement suivie d’un séquençage du fragment PCR dans le cas de mutations n’affectant pas la taille dudit gène (substitutions, par exemple).
Les Inventeurs ont recherché la présence des gènes codant ces trois protéases de surface, STER_1612, HtrA et PrtS, dans 61 génomes de S. thermophilus, et la conservation des séquences protéiques correspondantes a été analysée. La variabilité de la présence de la protéase PrtS au sein de l’espèce S. thermophilus était déjà connue (Delorme et al., 2010). A l’inverse, les deux protéases HtrA et STER_1612 sont présentes chez toutes les souches, et leurs séquences protéiques sont très bien conservées (hormis une souche, N4L, dont le gène codant HtrA serait un pseudogène).
Ainsi, on peut distinguer deux groupes de souches de S. thermophilus sur la base de leur équipement en protéases de surface : un groupe A de 24 souches qui possèdent les trois protéases PrtS, HtrA et STER_1612, auquel appartient la souche LMD9 et un groupe B de 37 souches qui possède les deux protéases HtrA et STER_1612 et ne possède pas la protéase PrtS, auquel appartient la souche CNRZ1066.
Les Inventeurs ont évalué le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER_1612 sur la protéolyse de surface des souches de S. thermophilus du groupe B et ont montré que la protéolyse de surface résiduelle du double mutant est comparable à celle obtenue avec le triple mutant de la souche LMD9 (voir exemple 5).
Que la souche S. thermophilus possède deux ou trois protéases de surface, l’inactivation des gènes codant respectivement pour ces deux ou trois protéases de surface suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.
Une bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Streptococcus thermophilus , dans laquelle l’expression ou l’activité des 3 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2, HtrA de séquence SEQ ID N°8, et PrtS de séquence SEQ ID N°9, de ladite bactérie est inhibée.
Une autre bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Streptococcus thermophilus, en particulier une souche de Streptococcus thermophilus qui ne posséderait pas PrtS, dans laquelle l’expression ou l’activité de la protéase de surface endogène, Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2 ou dans laquelle l’expression ou l’activité des 2 protéases de surface endogènes, Ster-1612 de séquence SEQ ID N°2 et HtrA de séquence SEQ ID N°8 de ladite bactérie est inhibée.
De façon similaire, certaines souches de L. lactis n’expriment naturellement pas la protéase PrtP. Là encore, les Inventeurs ont pu montrer que de telles souches modifiées pour que les deux protéases de surface endogènes YwdF ou llmg2442 (ou leurs homologues) et HtrA aient une activité ou une expression réduite présentent une très faible protéolyse de surface (voir exemple 9).
Une bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Lactococcus lactis, dans laquelle l’expression ou l’activité des 3 protéases de surface endogènes, YwdF ou llmg2442 (ou leurs homologues) de séquence respective SEQ ID N°3 ou 4, HtrA de séquence SEQ ID N°10, et PrtP de séquence SEQ ID N°ll, de ladite bactérie est inhibée.
Une autre bactérie avantageuse au sens de la présente invention est une bactérie, de préférence Lactococcus lactis, en particulier une souche de Lactococcus lactis qui ne posséderait pas PrtP, dans laquelle l’expression ou l’activité de la protéase de surface endogène, YwdF ou llmg2442 (ou leurs homologues) de séquence respective SEQ ID N°3 ou 4 ou dans laquelle l’expression ou l’activité des 2 protéases de surface endogènes, et YwdF ou llmg2442 de séquence respective SEQ ID N°3 ou 4 et HtrA de séquence SEQ ID N°10 de ladite bactérie est inhibée.
Ainsi la présente invention se rapporte à :
- des bactéries n’exprimant pas la protéase de surface endogène définie par son identité avec la SEQ. ID. N°1 ; c’est-à-dire Ster-1612 (ou son homologue) chez Streptococcus thermophilus et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) chez Lactococcus lactis ;
- des bactéries n’exprimant pas deux protéases de surface endogènes : Ster-1612 (ou son homologue) et HtrA chez Streptococcus thermophilus ; Ster-1612 (ou son homologue) et PrtS chez Streptococcus thermophilus ; Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) et HtrA chez Lactococcus lactis ; et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue) et PrtP chez Lactococcus lactis ; et
- des bactéries n’exprimant pas trois protéases de surface endogènes : Ster-1612 (ou son homologue), HtrA et PrtS chez Streptococcus thermophilus ; et Ywdf ou llmq 2442 (ou son homologue), HtrA et PrtP chez Lactococcus lactis.
La présente invention a également pour objet une bactérie telle que définie précédemment, modifiée pour exprimer une protéine d’intérêt, par exemple une protéine hétérologue ou recombinante d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant pour la protéine d’intérêt, ou par intégration du fragment d’ADN d’intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Par protéine hétérologue, on entend une protéine qui n’est ni produite naturellement par la souche bactérienne, ni nécessaire à sa croissance.
La présente invention présente donc comme avantage l’expression par la bactérie selon la présente invention de protéines présentant un intérêt industriel, qui seront secrétées dans le milieu de culture de ladite bactérie et dans lequel les protéines d’intérêt pourront être facilement récupérées, ou associées à la surface bactérienne et exerçant leur activité enzymatique sur la face externe de la bactérie. Par protéine associée à la surface bactérienne, on entend une protéine ancrée de façon covalente à la paroi bactérienne via un motif d’ancrage spécifique de la sortase, une protéine insérée la membrane plasmique via une ancre membranaire localisée à l’extrémité N- ou C-terminale de sa séquence aminée, une protéine liée de façon covalent à la membrane via un motif d’ancrage lipidique situé à l’extrémité N- terminale de sa séquence aminée ou une protéine possédant des motifs d’association non covalents à la paroi de type LysM, par exemple (Cossart et Joncquières, 2000 ; Desvaux et al., 2018).
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d’une bactérie Gram-positive de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus faiblement protéolytique, comprenant la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité d’une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID N°l, où SEQ ID N°1 est définie comme suit :
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K avec
XI est l’histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ; et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chez Streptococcus thermophilus a au moins 70% et encore préférentiellement 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 et la protéase de surface endogène chez Lactococcus lactis a au moins 70% et encore préférentiellement 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4.
De préférence, le procédé de préparation d’une bactérie Streptococcus thermophilus faiblement protéolytique selon l’invention comprend en outre la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 (PrtS).
De préférence, le procédé de préparation d’une bactérie Lactococcus lactis faiblement protéolytique selon l’invention comprend en outre la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll (PrtP).
Par « bactérie faiblement protéolytique », on entend bactérie présentant une très faible protéolyse de surface par rapport à la bactérie parente dont elle dérive, c’est-à-dire estimée à moins de 10% et préférentiellement moins de 5% de la protéolyse de la bactérie parente dont elle dérive.
La diminution de l’expression et/ou de l’activité de ces protéases peut être réalisée comme décrit ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérie Gram-positive de l’espèce Lactococcus lactis ou Streptococcus thermophilus, comprenant la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité d’une protéase de surface endogène de ladite bactérie, ladite protéase comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80%, et par ordre croissant de préférence au moins 82%, 86%, 91%, 95% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID N°l, où SEQ ID N°1 est définie comme suit :
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K avec
XI est l’histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ; et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
De préférence, la protéase de surface endogène chez Streptococcus thermophilus a au moins 70% et encore préférentiellement 90% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 et la protéase de surface endogène chez Lactococcus lactis a au moins 70% et encore préférentiellement 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 ou avec la séquence SEQ ID N°4.
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérie Streptococcus thermophilus comprend en outre, la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 (PrtS).
De préférence, le procédé pour diminuer ou abolir l’activité protéolytique de protéases dans une bactérie Lactococcus lactis comprend en outre, la diminution ou l’abolition dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 (HtrA) et/ou de la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll (PrtP).
La présente invention a également pour objet l’utilisation d’une bactérie selon la présente invention pour la production de protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant pour la protéine hétérologue d’intérêt ou par intégration du fragment d’ADN d’intérêt dans le chromosome de ladite bactérie.
Parmi les protéines hétérologues d’intérêt, on peut citer l’élafine qui est un inhibiteur d’activité protéolytique. Cette activité est particulièrement recherchée, notamment pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, dans lequel l’activité de protéases humaines doit être inhibée (Bermudez-Humaran et al., 2015). Plus généralement, on peut citer des protéines anti-inflammatoires ciblant le système immunitaire mucosal (cytokines, facteur trefoil humain TFF- 1... ), des protéines vaccinales (fragment C de la toxine tétanique, antigène E7 du papillomavirus humain, ), des peptides antibactériens ciblant des déséquilibres de la flore intestinale (défensines, cathelidicines, protéine PAP associée aux pancréatites), des enzymes palliant des déficiences ou des carences (superoxyde dismutase, phénylalanine hydroxylase, glutamate décarboxylase), etc (Neirynck et Steidler, 2006 ; Bermudez-Humaran et al., 2013, Bermudez-Humaran et Langella, 2018). On peut également envisager des protéines ayant un intérêt en santé animale (protéines vaccinales antivirales, par exemple) ou des protéines d’intérêt technologique (estérase, aminotransférase...).
Parmi les souches de bactéries utilisées pour la production de protéines hétérologues d’intérêt, on peut citer les souches L. lactis et S. thermophilus.
Lactococcus lactis est considérée comme la bactérie de référence pour la production de molécules d'intérêt thérapeutique. Son utilisation présente plusieurs avantages: il s’agit d’une bactérie alimentaire dont l'innocuité est reconnue (bactérie labellisée GRAS et QPS), elle est manipulable génétiquement et un mutant de délétion du gène codant la protéase HtrA est disponible. Il a alors été démontré que la production d'élafine par ce mutant était supérieure à celle de la souche sauvage, et que le traitement de souris présentant une colite par administration orale de la souche mutée était plus efficace qu'avec la souche sauvage (Bermudez-Humaran et al., 2015).
Par ailleurs, Streptococcus thermophilus selon l’invention présente également de nombreux avantages : elle est thermophile, son optimum de température correspond à la température du corps humain de 37°C, elle est facilement transformable et totalement dépourvue d’activité protéolytique de surface, ce qui évite la dégradation de la protéine hétérologue d’intérêt au fur et à mesure de sa production.
Une bactérie particulièrement avantageuse pour la production de protéines hétérologues d’intérêt est une bactérie de S. thermophilus telle que définie dans la présente invention.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d’une protéine hétérologue, mettant en œuvre une bactérie de l’invention, telle que définie précédemment.
La présente invention a également pour objet G utilisation d’une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré-maturation du lait.
Un des problèmes qui se pose en technologie laitière est la variation de la composition des laits en azote non protéique (acides aminés libres et peptides). Ceci est particulièrement marqué lors des changements de régime alimentaire des animaux, aboutissant aux laits d’été et d’hiver de compositions très différentes. Ces variations de composition en azote non protéique sont à l’origine de variations de croissance des bactéries lactiques dans le lait, cette croissance étant étroitement dépendante de l’utilisation de ces sources azotées non protéiques. Ces variations de croissance aboutissent à un défaut de reproductibilité des temps de fermentation, ce qui constitue une difficulté pour les industries laitières.
L’utilisation d’une bactérie selon la présente invention comme ferment de pré maturation du lait permet d’abolir ces variations. En effet, dans un premier temps qui correspond à l’étape de pré-maturation, les sources d’azote non protéique utilisables seraient consommées, sans que des protéases de surface puissent hydrolyser les protéines du lait et générer de nouvelles sources d’azote non protéiques. Dans un second temps, la croissance du levain servant à fermenter le lait ne reposerait plus que sur son aptitude à hydrolyser les caséines, portée par les protéases PrtP et PrtS, selon la bactérie considérée. Une telle opération a donc pour effet de standardiser la croissance du levain, en abolissant les variations de croissance dues aux variations de composition du lait en azote non protéique.
Une bactérie particulièrement avantageuse en tant que ferment de pré-maturation du lait est une souche de S. thermophilus telle que définie dans la présente invention.
La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux exemples non-limitatifs illustrant la très faible activité protéolytique de surface d’une bactérie selon l’invention dans laquelle les 2 (souche CNRZl066AhtrAAster_1612) ou 3 protéases (souche L M D 9 D/z / r A Aprt S Ast e r_ 1612) telles que définies dans l’invention est inhibée, par rapport à la souche de bactérie parente dont elle dérive (souche CNRZ1066 ou souche LMD9), ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : Effet de l’inactivation des deux protéases de surface PrtS et HtrA sur la présence dans le milieu de culture de peptides issus de la dégradation de protéines de surface de S. thermophilus LMD9, présents dans le milieu de culture. Moyenne de 3 expériences (en noir), avec écart-type de la moyenne (en gris).
Figure 2 : Alignement des séquences des trois protéines STER_1612, YwdF et llmg_2442. L'alignement multiple a été réalisé avec MUSCLE (v3.8) disponible sur le serveur de l'EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Les caractères blancs sur fond noir indiquent les acides aminés localisés à l'intérieur de la cellule, les caractères italiques correspondent au fragment transmembranaire et les noirs sont localisés à l'extérieur de la cellule (prédictions HMMTOP). Les acides aminés constituant potentiellement la diade catalytique sont surlignés en gris.
Figure 3 : Croissance de S. thermophilus LMD9 souche sauvage et souche mutée pour les trois protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612 (triple mutant) dans un milieu chimiquement défini (MCD) ne contenant que des acides aminés libres comme source d’azote aminé.
Figure 4 : Effet de l’inactivation des 3 protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612 sur le nombre de peptides issus de la dégradation de protéines de surface de S. thermophilus LMD9. Moyenne de 3 expériences (en noir), avec écart- type de la moyenne (en gris).
Figure 5 : Couverture des protéines IL- 10 et élafine par les fragments de dégradation (peptides) identifiés dans les milieux de culture correspondants de S. thermophilus LMD9 (Souche sauvage produisant respectivement l’IL-10 ou l’élafine). En fond grisé, figurent les régions des protéines IL- 10 et élafine correspondant aux peptides identifiés dans les milieux de culture de S. thermophilus LMD9. Ces régions regroupent l’ensemble des peptides identifiés. Les cystéines (C) sont indiquées en caractères gras.
Figure 6 : Immunodétection de l’élafine dans le surnageant de culture de S. thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage et double mutant AhtrAASTER_1612).
Figure 7 : Effet de l’inactivation de la protéolyse de surface sur l’activité élafine produite par S. thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage en noir et double mutant AhtrAASTER_1612 en gris/.
Figure 8 : Immunodétection de l’élafine produite par S. thermophilus CNRZ1066 (souche sauvage et double mutant AhtrAASTER_1612) et L. lactis IL1403 (souche sauvage et mutant AhtrA).
Figure 9 : Comparaison des activités élafine produites par L. lactis IL1403Ah/rA (notée IL1403D) et S. thermophilus CNRZl066AhtrAASTER_1612 (notée CNRZ1066DD).
Figure 10 : Immunodétection de l'élafine produite par L. lactis IL 1403 (souche sauvage et double mutant AhtrAAywdF).
Figure 11 : Immunodétection de l'élafine produite par L. lactis MG1363 (souche sauvage et double mutant AhtrAAllmg-2442).
EXEMPLE 1 : CONSTRUCTIONS DES MUTANTS DE LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9 ET DE LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS CNRZ1066
1) Construction des simples mutants AhtrA, AprtS et D STER_1612 de la souche S. thermophilus LMD9
Principe général
Les mutants simples AhtrA, AprtS et D STER_1612 sont construits à partir de la souche sauvage S. thermophilus LMD9 par remplacement de gène. La technique utilisée consiste à produire un fragment PCR associant trois amplicons :
- un amplicon amont correspondant à une région située au début du gène à remplacer,
- une cassette de résistance à un antibiotique et
- un amplicon aval correspondant à une région située en fin du gène à remplacer.
Les trois amplicons sont produits séparément puis associés via une PCR supplémentaire finale. Cette association est rendue possible grâce à l'ajout d'extensions aux oligonucléotides utilisés pour amplifier les régions amont et aval qui permettent une liaison à la cassette de résistance à l'antibiotique (PCR overlap). Ce fragment PCR final est ensuite introduit dans la souche par compétence naturelle (W02010/125091). L'homologie entre les fragments amont et aval du gène et du fragment PCR permet la recombinaison au site du gène à remplacer. Les colonies dont le gène ciblé a été remplacé par le gène de résistance peuvent facilement être isolées sur un milieu contenant l'antibiotique correspondant.
Mutant AhtrA
Une cassette de résistance à la kanamycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène htrA sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique de S. thermophilus LMD9; la cassette de résistance à la kanamycine est amplifiée à partir du plasmide pKa (Trieu-Cuot et al., 1983) à l'aide des couples d'oligonucléotides htrA-amont- F/htrA-amont-R, htrA-aval-F/htrA-aval-R et aphA3-F/aphA3-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 1.
[Table 1]
Figure imgf000019_0001
Tableau 1 Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne avec le kit PCR Clean-Up
(Promega) et les tailles attendues (480 pb, 580 pb et 1350 pb) sont vérifiées par électrophorèse sur gel d'agarose. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides htrA-amont-F et htrA-aval-R pour obtenir un fragment de 2410 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole de transformation naturelle suivant. Une première pré-culture est réalisée pendant la journée en milieu M17 avec 1% de lactose (M171ac) (Terzagui et al., 1975) à partir d'un stock congelé de la souche; à partir de laquelle une deuxième pré-culture en milieu chimiquement défini (MCD) (Letort et al., 2001) est réalisée pendant la nuit. Cette deuxième pré-culture est utilisée pour ensemencer une culture en MCD à une densité optique à 600 nm (DO600) de 0,05. Après lh d'incubation à 42°C, le produit PCR associant les trois fragments est ajouté à un aliquot de la culture. Après incubation à 42°C, l'aliquot de culture est étalé sur boites de M171ac gélosé contenant lmg/ml de kanamycine. Les boites sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
Mutant prlS
Une cassette de résistance à l'érythromycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène ptrS ont été amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique de S. thermophilus LMD9; la cassette de résistance à l'érythromycine est amplifiée à partir du plasmide pG+host9 (Biswas et al., 1993) à l'aide des couples d'oligonucléotides prtS-amont- F/prtS-amont-R, prtS-aval-F/prtS-aval-R et erm-F/erm-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 2.
[Table 2]
Figure imgf000020_0001
Tableau 2 Les trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues
(660 pb, 650 pb et 1060 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides prtS-amont-F et prtS-aval- R pour obtenir un fragment de 2370 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche LMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M171ac gélosé contenant de l'érythromycine (5 pg/ml) qui sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
Mutant D STER_1612. Une cassette de résistance à à la spectinomycine est utilisée. Les régions amont et aval du gène STER_1612 sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN chromosomique de S. thermophilus LMD9; la cassette de résistance à la spectinomycine est amplifiée à partir du plasmide pAT28 (Trieu-Cuot et al., 1990) à l'aide des couples d'oligonucléotides STER_1612-amont-F/STER_1612-amont-R, STER_1612-aval-F/ STER_1612-aval-R et spec-F/spec-R, dont les séquences nucléotidiques sont présentées dans le tableau 3.
[Table 3]
Figure imgf000021_0001
Tableau 3 Fes trois fragments sont amplifiés, purifiés sur colonne et les tailles attendues
(596 pb, 957 pb et 566 pb) vérifiées. Une PCR supplémentaire associant les 3 fragments est réalisée à partir des trois fragments obtenus et des oligonucléotides STER_1612-amont-F et STER_1612-aval-R pour obtenir un fragment de 2050 pb qui est purifié sur colonne et utilisé pour transformer la souche FMD-9 selon le protocole décrit ci-dessus. Cette culture est ensuite étalée sur boîtes de M171ac gélosé contenant de la spectinomycine (150 pg/ml) qui sont incubées 48h à 42°C en jarre d'anaérobiose. Plusieurs clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie et un clone est ensuite vérifié par séquençage.
2) Construction du double mutant AhtrA AprtS de la souche 5. thermophilus LMD9
Fe double mutant AhtrAAprtS est construit à partir du mutant simple AprtS par transformation naturelle à l’aide d'ADN chromosomique du mutant AhtrA. Après cassage des cellules aux billes de verre, l'ADN chromosomique du mutant AhtrA est extrait au phénol- chloroforme, puis précipité à l'éthanol. Fe mutant AprtS est transformé avec l'ADN chromosomique purifié du mutant AhtrA, suivant le même protocole de transformation naturelle que décrit précédemment. Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu gélosé contenant de la kanamycine (1 mg/ml). Quelques clones résistants sont vérifiés par PCR sur colonie.
3) Construction des doubles mutants AhtrA ASTER_1612, AprtS ASTER_1612 et du triple mutant AhtrAAprtSASTER_1612 de la souche S. thermophilus LMD9
Les doubles mutants AhtrA ASTER_1612, AprtS ASTER_1612 et le triple mutant AhtrAAprtSASTER_l 612 sont obtenus par transformation naturelle des souches LMD9 AhtrA, EMD9 AprtS et LMD9 AhtrAAprtS avec le fragment PCR contenant les régions amont et aval du gène STER_1612 fusionnées à la cassette de résistance à la spectinomycine utilisé pour construire le simple mutant ASTER_1612 suivant le protocole décrit ci-dessus. Le protocole de sélection et de contrôle des mutants est celui décrit pour l'obtention du simple mutant \MD9ASTER_1612.
4) Construction des mutants de la souche S. thermophilus CNRZ1066
Le principe général de la construction des différents mutants est identique à celui décrit ci-dessus, de même que le protocole utilisé. Seules les différences sont indiquées ci- après.
Dans le cas des mutants simples, de l’ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 est utilisé comme matrice pour amplifier les régions amont et aval du gène à muter. Lors de la transformation naturelle de la souche CNRZ1066, la compétence de la souche est stimulée en ajoutant du peptide de compétence ComS (LPYFAGCL) à une concentration de ImM pendant 10 minutes avant l’ajout du fragment PCR dans la culture.
Le double mutant CNRZ1066 AhtrAASTER_l 612 est obtenu par transformation naturelle de la souche C NRZ 1066ASTER_ 1612 avec de l’ADN chromosomique de la souche CNRZ1066 AhtrA. Quelques mutants ont été contrôlés par PCR sur colonie.
EXEMPLE 2 : LA DELETION DES DEUX PROTEASES PRTS ET HTRA N’ABOLIT PAS LA PROTEOLYSE DE SURFACE CHEZ LA SOUCHE DE BACTERIE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9
La souche LMD9 produit naturellement les deux protéases de surface PrtS et HtrA. Pour évaluer leur rôle respectif dans la formation de l’exopeptidome de la souche LMD9, deux mutants simples AprtS et AhtrA et un double-mutant AhtrAAprtS ont été construits par transformation naturelle (WO2010/125091), suivant le protocole décrit dans l’exemple 1. 1) Matériel et méthodes : Détermination de l’exopeptidome des souches
L’exopeptidome des souches ainsi obtenues est déterminé dans les mêmes conditions expérimentales que celui de la souche sauvage LMD9, tel que décrit ci-après.
Culture de la souche
50 ml de MCD dont la concentration en acides aminés aromatiques (Phenylalanine, Tryptophane et Tyrosine) a été réduite d'un facteur 10 sont ensemencés avec 500 pl de préculture de nuit en MCD standard et incubés à 42°C jusqu’à DOÔOO = 1,0. Les cellules sont alors éliminées par centrifugation (5 000 rpm, 4°C; 10 minutes), le surnageant est filtré sur membrane PVDF de porosité 0,22 pm.
Isolement et concentration des peptides
Le surnageant de culture filtré est acidifié avec de l'acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration de 0,1% finale (470 mΐ d'une solution de TFA à 10% dans 47 ml de surnageant de culture), et conservé une nuit à 4°C.
Les peptides présents dans le surnageant acidifié sont extraits par extraction en phase solide (SPE) sur cartouche StrataX (Phenomenex) contenant 200mg de phase, à un débit d'environ 0,3 ml /min, suivant les préconisations du fabriquant. La cartouche est tout d'abord activée avec 3 ml de méthanol, puis équilibrée avec 6ml d'une solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. 1,75 ml d'acétonitrile sont ajoutés à 35 ml de surnageant acidifié, de façon à avoir une concentration finale d'acétonitrile de 5% dans le surnageant. 35 ml du surnageant ainsi préparé sont chargés sur la cartouche activée et équilibrée, à un débit de 0,3 ml/min. La cartouche est ensuite lavée avec 5 ml de la solution aqueuse contenant 5% d'acétonitrile et 0,1% de TFA, puis les peptides sont élués avec 1,5 ml d'une solution aqueuse contenant 50% d'acétonitrile et 0,1% de TFA. L'éluat est séché pendant 16 à 18h par évaporation sous vide (système speed vac) puis conservé à -20°C.
L'éluat séché contenant les peptides est repris avec 350 mΐ d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA (concentration finale), ce qui correspond à un facteur de concentration de 100. La solubilisation des peptides est obtenue par agitation au vortex et passage 5 minutes dans une cuve à ultrasons. La solution concentrée de peptides est ultrafiltrée à travers une membrane de porosité 3kDa, par centrifugation lh à 13000 rpm.
Les peptides sont alors séparés par HPLC sur une colonne de phase inverse (colonne Kinetex 08 (Phenomenex), porosité 100 A, granulométrie 2,6 pm, dimension 150 x 4,6 mm) avec un gradient linéaire (pente 1,6%) d'acétonitrile dans du formate d'ammonium (20 mM, pH 6,2) à un débit de 0,7 ml/min et à une température de 40°C. L'équivalent de 20 ml de culture (soit 200 mΐ de suspension concentrée) est injecté sur la colonne. Les fractions éluées entre 3,2% et 53,3% d'acétonitrile sont collectées et séchées au speed vac.
Identification des peptides
L'identification des peptides est faite par spectrométrie de masse. Les fractions séchées sont reprises dans 30m1 d'une solution aqueuse contenant 0,1% de TFA et 2% d'acétonitrile, et une fraction de 4m1 est chargée sur une colonne Pepmap 08 (150 x 0.075 mm, granulométrie 2 mhi, porosité 100 A). Les peptides sont élués avec un gradient d'acétonitrile dans de l'acide formique (0,1%), et analysés en ligne par spectrométrie de masse (LTQ-Orbitrap Discovery, Thermo Fisher). L'ionisation des peptides est faite par électrospray (l,3kV), et les paramètres d'analyse des peptides ionisés sont les suivants : mesure des rapports masse/charge (m/z) de 300 à 1600 avec une résolution de 15000 sur l'analyseur de masse Orbitrap, et fragmentation des 6 ions parents les plus abondants sur la trappe linéaire LTQ. Les peptides doublement chargés sont soumis à fragmentation, avec une fenêtre d'exclusion de 40 secondes et les paramètres classiques de fragmentation (énergie de collision : 35%).
L'identification des peptides et des protéines desquels ils dérivent est faite avec le moteur de recherche X!Tandem (version 2017.2.1.4) et la suite logicielle X!Tandem pipeline (version 3.4.3, www.pappso.fr) en utilisant la séquence protéique de la souche S. thermophilus LMD9 associée à une base protéique de contaminants adaptée à l'activité d'analyse de la plateforme d'analyses (peptides trypsiques d'un échantillon de protéines eucaryotes contenant en particulier les kératines humaines, des protéines bovines et murines). Les paramètres de recherche de X!Tandem pipeline incluent l'absence de clivage trypsique pour l'identification des peptides, un peptide minimum par protéine, identifié avec une E-value inférieure ou égale à 0,01 et une tolérance de masse de 10 ppm.
Pour chaque contexte bactérien (souche sauvage, mutants simples et double), l'ensemble des peptides identifiés comme peptides de surface (c'est-à-dire, peptide issu de la dégradation d'une protéine de surface) est comptabilisé. Lorsqu'un peptide est identifié plusieurs fois (redondance d'identification), chaque identification est considérée (comptage des spectres). Ainsi un peptide identifié une fois aura un compte de 1, un peptide identifié trois fois un compte de trois. L'ensemble du nombre de peptides de surface est totalisé. Ces peptides étant issus des protéines de surface, ils résultent de l'activité protéolytique de surface de la souche. Le nombre de peptides comptabilisés est donc un indicateur de l'intensité de protéolyse de surface : plus le décompte est élevé, plus l'activité de dégradation, donc la protéolyse de surface, est importante.
2) Résultats
Les résultats montrent que les deux protéases HtrA et PrtS interviennent dans la formation de l’exopeptidome de S. thermophilus LMD9. Chez le double mutant, une réduction de plus de moitié du nombre de peptides issus de l'hydrolyse de protéines de surface est observée (Figure 1). Un test statistique adapté aux échantillons de petits effectifs (test non paramétrique de Kruskal-Wallis) indique que cette diminution est statistiquement significative (P = 0.049).
3) Conclusion
Les protéases de surface HtrA et PrtS ne sont pas responsables à elles seules de l’ensemble de l’activité protéolytique de surface de ces souches.
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION D’UNE NOUVELLE PROTEASE DE SURFACE CHEZ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS LMD9
D'après la base de données spécifique des protéases et peptidases MEROPS, le génome de S. thermophilus LMD9 contiendrait 45 enzymes protéolytiques (http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/speccards?sp=sp000991;type=peptidase;strain=498). L'analyse de l'annotation du génome de cette souche (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/420?) suggère la présence de protéases supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 52 protéines qui pourraient contenir un domaine protéolytique.
Parmi celles-ci, 11 sont prédites comme étant localisées à la surface de la cellule d'après la base de données LocateP (http://www.cmbi.ru.nl/locatep-db/cgi-bin/locatepdb.py) ou SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). Y figurent PrtS (STER_0846) (STER_RS04165) et HtrA (STER_2002) (STER_RS09790). L'hypothèse poursuivie est que l'une au moins des 9 protéases restantes est impliquée dans la protéolyse de surface de S. thermophilus.
Parmi ces neuf protéases, six sont présentes chez L. lactis subsp. lactis IL1403 et L. lactis subsp. cremoris MG1363 (Tableau 4).
[Table 4]
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Tableau ^
Des peptides issus de la dégradation de trois de ces 6 protéases (STER_0260, STER_1612 et STER_1741) ont été identifiés dans l’exopeptidome de S. thermophilus LMD9, indiquant que ces protéases putatives ont été synthétisées dans ces conditions de croissance. Parmi ces trois protéines, STER_0260 est annotée comme une D-Ala-D-Ala carboxypeptidase et STER_1741, comme signal peptide peptidase.
La protéase STER_1612 (STER_RS07910) (annotée respectivement YwdF chez IL 1403 et llmg_2442 chez MG 1363) apparaît donc comme la protéine candidate pour participer à la protéolyse de surface de L. lactis et S. thermophilus. La présence d'un fragment transmembranaire en région N-terminale (www.enzim.hu/hmmtop/) est prédite pour la protéine des 3 souches (Figure 2).
La synthèse de ces prédictions aboutit à l'hypothèse que la protéine STER_1612 serait une protéase ancrée à la membrane cytoplasmique dont le site actif serait orienté vers la face externe de la membrane. EXEMPLE 4 : LA DELETION DES TROIS PROTEASES PRTS, HTRA ET STER_1612 ABOLIT LA DEGRADATION DES PROTEINES DE SURFACE ENDOGENES
Les Inventeurs ont émis l’hypothèse que la protéase STER_1612 dans la souche de S. thermophilus LMD9 et ses homologues dans les souches de L. lactis, IL1403 et MG1363, étaient impliquées dans la formation de l’exopeptidome de S. thermophilus et L. lactis.
1) Matériels et Méthodes La validation de cette hypothèse a été entreprise dans la souche LMD9, en construisant l’ensemble des mutants simples, doubles et triple par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l’exemple 1.
Dans les souches LMD9 sauvage, LMD9AHtrA, LMD9APrtS et LMD9AHtrAAPrtS déjà construites, le gène ster_1612 a été remplacé par une cassette de résistance à la spectinomycine.
2) Résultats
La croissance de la souche mutée pour les gènes de synthèse des trois protéases de surface n’est pas significativement affectée dans le milieu de culture utilisé, un milieu chimiquement défini ne contenant que des acides aminés comme source d’azote aminé (voir figure 3), de sorte que d'éventuelles différences observées entre la souche sauvage et les mutants ne pourront être imputées à une différence de croissance entre les souches.
L’inactivation d’une seule des trois protéases de surface réduit d’un facteur 2 environ le nombre de peptides issus de la protéolyse des protéines de surface accumulés dans le milieu de culture (peptides de surface de l’exopeptidome). Lorsque les trois protéases sont inactivées, cette réduction atteint un facteur 25, avec seulement 24 peptides accumulés (moyenne de trois expériences indépendantes; voir figure 4). Si on compare le nombre de peptides accumulés par le double mutant htrA_prtS et par le triple mutant prtS_htrA_ster_1216, l’inactivation supplémentaire de la protéase STER_1612 le réduit d’un facteur 9.
3) Conclusion
La protéolyse de surface est quasiment abolie chez le triple mutant de S. thermophilus, ne représentant plus que 5% de celle de la souche sauvage, sur la base du nombre de peptides présents dans l’exopeptidome.
EXEMPLE 5 : EXTENSION AUX AUTRES SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS NE POSSEDANT PAS LA PROTEASE PRTS 1) Matériels et Méthodes
Le rôle des deux protéases de surface HtrA et STER_1612 sur la protéolyse de surface des souches de S. thermophilus ne possédant pas la protéase PrtS a été évalué en utilisant la souche CNRZ1066 comme représentant.
Le double mutant CNRZ 1 Q66AhlrAAprlS est construit par transformation naturelle en suivant le protocole expérimental décrit dans l’exemple 1. L’exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 et du mutant ainsi obtenu sont déterminés dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites pour la souche LMD9 et ses mutants (exemple
2).
2) Résultats
L’exopeptidome de la souche sauvage CNRZ1066 contient 240 spectres (décomptes de peptides) issus de protéines de surface. Celui du double mutant ne contient plus que 15 spectres provenant de protéines de surface. Sur cette base du nombre de spectres identifiés, on peut estimer la protéolyse de surface résiduelle du double mutant de CNRZ1066 à 6% de celle de la souche sauvage, soit une réduction comparable à celle obtenue avec la souche LMD9.
3) Conclusion
Même si la souche ne possède que les deux protéases de surface HtrA et STER_1612, l’inactivation des gènes codant ces deux protéases suffit à réduire de plus de 90% la protéolyse de surface de la bactérie.
EXEMPLE 6 : OBTENTION DE SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS PRODUISANT UNE PROTEINE HETEROLOGUE 1) Obtention des souches de S. thermophilus produisant l’IL-10 et l’élafine
Les souches L. lactis LL-pLB350 et LBH832 contiennent respectivement les plasmides pLB350 (Hossain et al., 2012) et pLB386, qui portent les gènes codant respectivement l'IL-10 et l’élafine, placés sous le contrôle d'un promoteur inductible aux sels biliaires (pGroEL). Les plasmides sont extraits de ces souches et purifiés en utilisant un kit commercial (Midikit, Quiagen).
Les deux plasmides pLB350 et pLB386 sont ensuite introduits chez la souche sauvage S. thermophilus LMD9 et son triple mutant par compétence naturelle, en suivant le protocole expérimental décrit dans l’exemple 1.
Le plasmide pLB386 est introduit dans la souche sauvage CNRZ1066 et son mutant de protéases de surface par compétence naturelle.
Les transformants sont sélectionnés par étalement sur milieu M17 gélosé contenant 5 pg/ml de chloramphénicol.
La présence du plasmide pLB350 est alors vérifiée par PCR sur colonies en utilisant les deux couples d'oligonucléotides pGroEL-L (ATAATGCCGACTGTACTTT de séquence SEQ ID N°34) / IL-10-R (GGCCTTGTAGACACCTTGGTCTT de séquence SEQ ID N°35) générant une bande de 690 paires de bases. Celle du plasmide pLB386 l’est avec les deux couples d’oligonucléotides pGroEL-L et Elafin-R (TCACTGGGGAACGAAACAGGC de séquence SEQ ID N°36) donnant une bande de 572 bp et celle du plasmide vide en utilisant les deux oligonucléotides Cm-F (GTTCAACAAACGAAAATTGG de séquence SEQ ID N°37) et Cm-R (TT AT A A A AGCC AGT C ATT AG de séquence SEQ ID N°38) donnant une bande de 807 bp.
EXEMPLE 7 : UNE SOUCHE DE BACTERIE NON-PROTEOLYTIQUE AMELIORE LE RENDEMENT DE PRODUCTION DES PROTEINES HETEROLOGUES
1) L’inactivation des protéases de surface réduit la dégradation des protéines hétérologues * Souche LMD9
Matériels et Méthodes
Deux modèles de protéines hétérologues ont été choisis, l’interleukine 10 (IL- 10) et l’élafine. Ces deux protéines sont des protéines candidates dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (Benbouziane et al., 2013 et Bermudez-Humaran et al., 2015). Le plasmide portant le gène codant 1TL-10 est extrait de la souche de lactocoque qui le contenait et introduit dans la souche S. thermophilus LMD9 et son triple mutant dépourvu d'activité protéolytique de surface par transformation naturelle, suivant le protocole décrit dans l’exemple 6. La même opération a été réalisée pour le plasmide codant l’élafine. Sont ainsi obtenues 4 souches, deux sauvages produisant Tune l’IL-10, l’autre l’élafine et deux mutants de protéases produisant les deux mêmes protéines hétérologues.
Pour évaluer la stabilité de 1TL-10 et de l’élafine, les deux couples de souches sauvage et mutante portant respectivement le plasmide pLB350 et le plasmide pLB386 sont cultivées 4h dans du MCD à 42°C. Un mélange équipondéral d'acide cholique et d'acide désoxycholique est alors ajouté au milieu de culture, à une concentration finale de 150 pg/ml. Cet ajout a pour objectif d'induire l'expression des gènes contrôlés par le promoteur pGroESL. Après 15 minutes d'induction à 42°C, les cellules sont éliminées par centrifugation et les peptides présents dans le surnageant de culture sont identifiés comme indiqué dans l’exemple 2. La seule différence consiste en la modification de la banque d'interrogation, à laquelle la séquence de l'IL-10 ou de l’élafine ont été ajoutées, selon le couple de souches considéré.
Résultats
Plusieurs fragments de dégradation des protéines hétérologues sont détectés dans le milieu de culture des souches sauvages, recouvrant au total plus de 30% de leur séquence respective (voir tableau 5 et figure 5). Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment n'est détecté chez les triples mutants. Donc, l'inactivation des trois protéases de surface abolit la dégradation des deux protéines hétérologues chez S. thermophilus LMD9. [Table 5]
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Tableau 5 : Nombre de peptides issus de la dégradation de l'IL-10 ou de l’élafine, présents dans le milieu de culture de S. thermophilus LMD9 et de son mutant des trois protéases de surface PrtS, HtrA et STER_1612.
Les résultats obtenus avec les deux modèles protéiques étant de même nature, la suite des travaux n’a porté que sur un seul modèle, l’élafine.
* Souche CNRZ1066
Les mêmes expériences ont été conduites sur la souche CNRZ1066.
Matériels et Méthodes
Le plasmide codant l’élafine est extrait de la souche de lactocoque le contenant, et introduit dans les souches sauvage et mutante de CNRZ1066 par compétence naturelle. Pour évaluer la stabilité de l’élafine, leurs fragments de dégradation sont recherchés dans le milieu de culture après 4 h de croissance, en suivant la même approche que celle développée pour la souche LMD9.
Résultats
Trente-six spectres provenant de l’élafine sont identifiés dans le surnageant de la souche sauvage. La région de l’élafine couverte par les produits de dégradation est la même que dans le cas de la souche LMD9, et représente 40% de la séquence totale (voir figure 5). Dans les mêmes conditions expérimentales, aucun fragment de dégradation de l’élafine n'est détecté chez le double mutant.
Conclusion
Aucun fragment de dégradation de protéine hétérologue n’est retrouvé dans le surnageant d’une souche de S. thermophilus mutée pour ses protéases de surface, que cette souche possède ou pas la protéase PrtS.
2) La réduction de dégradation des protéines hétérologues est corrélée à une augmentation de la production de la protéine intacte Puisque les résultats sont comparables que la souche de S. thermophilus possède deux ou trois protéases de surface, la suite des travaux ne porte que sur une seule souche, CNRZ1066. Puisque plus aucun fragment de dégradation de l’élafine n’est détecté dans le surnageant du double mutant, il convient de s’assurer que la protéine est bien produite dans cette souche, et à un niveau plus important que chez la souche sauvage.
Matériels et Méthodes
Cette vérification a été effectuée par immunodétection de l’élafine entière dans le surnageant (puisque la protéine est sécrétée dans le milieu extérieur par la souche de streptocoque), en suivant le protocole expérimental suivant.
La culture et l’induction de la production de l’élafine par les souches portant le plasmide pLB386 sont réalisées comme décrit dans l’exemple 6. Après 15 min d’induction, les cellules sont éliminées par centrifugation, et le surnageant contenant l’élafine est filtré sur filtre de porosité 0,22 pm (membrane PVDF à faible adsorption protéique). Dix ml de surnageant sont concentrés d’un facteur 20 par ultrafiltration sur membrane de seuil de coupure de 3 kDa (Amicon ultracell 3k, MerckMillipore). Cinq pl de rétentat sont déposés sur gel de polyacrylamide (gel pré-coulé NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Invitrogen). Après migration pendant lh à 110 mA et 200V, les protéines sont transférées sur une membrane de transfert en PVDF (Trans-Bot Turbo Mini transfert pack, Bio-Rad). L’élafine, après avoir été marquée par un anticorps anti-élafine monoclonal de souris (SantaCruz Biotechnology), est détectée par chimioluminescence (kit ECL Plus Western, Pierce).
Résultats
Plusieurs souches sont utilisées dans ces expériences, réalisées à plusieurs reprises et donnent systématiquement les mêmes résultats ; illustrés pour l’un d’entre eux dans la figure 6 :
Les souches sauvage et mutée de S. thermophilus CNRZ1066 ne produisant pas l’élafine (puits 3 et 4, notés pis vide). On n’observe aucune bande, signe qu’aucune des souches ne produit l’élafine (ni de protéine présentant une réaction croisée avec l’anticorps dirigé contre l’élafine),
La souche CNRZ166 sauvage produisant l’élafine (puits 5, noté WT pis élafine). On observe deux bandes, dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l’élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure, et serait une forme tronquée de l’élafine en cours de dégradation, La souche CNRZ1066 mutée pour ses protéases de surface produisant l’élafine (puits 6, noté mutant pis élafine). La bande inférieure correspondant à la forme tronquée de l’élafine n’est plus détectée, seule la bande correspondant à l’élafine mature est révélée.
Conclusion
L'inactivation de la protéolyse de surface abolit la dégradation de l’élafine chez S. thermophilus .
3) L’inactivation des protéases de surface induit une augmentation de l’activité enzymatique portée par G élafine
Matériels et Méthodes
L’activité de l’élafine accumulée dans les surnageants des souches CNRZ1666 sauvage et mutant est évaluée en déterminant le pouvoir d’inhibition de l’activité d’une protéase humaine témoin (l’élastase), suivant le protocole décrit ci-dessous.
Les souches de S. thermophilus portant le plasmide pLB386 sont cultivées en MCD à 37°C jusqu’à une DOÔOO de 1.0.
Les souches de L. lactis portant ce même plasmide sont cultivées à 30 °C dans un MCD spécifique des lactocoques (Otto et al., 1983) jusqu’à une DOÔOO de 1.0.
A ce stade de croissance, les cultures sont centrifugées, et les cellules resuspendues dans du MCD frais à une DOÔOO de 2.0.
La production d’ élafine est obtenue par induction aux sels biliaires (15 ng/ml) et incubation sur la nuit à 37°C. Les cellules sont alors centrifugées, et l’élafine contenue dans le surnageant est concentrée par d’ultrafiltration d’un facteur 300 environ.
L’élafine est un inhibiteur de protéase. Elle est donc dosée selon le principe suivant. L’activité d’une protéase humaine (élastase) est mesurée par fluorescence en utilisant un substrat marqué (kit EnzCheck® Elastae assay, Molecular Probes), en présence et en absence de surnageant contenant l’élafine. L’intensité d’inhibition (reflétant la concentration d’élastase) est mesurée par la différence de fluorescence entre la mesure sans et avec élafine au cours du temps en suivant le protocole livré avec le kit de dosage (Molecular Probes).
Résultats
L’activité élafine produite par la souche dépourvue d’activité protéolytique augmente approximativement deux fois plus vite que celle produite par la souche sauvage (figure 7).
Conclusion L'inactivation de la protéolyse de surface induit un doublement de l’activité élafine produite par la souche.
EXEMPLE 8 : LA PRODUCTION D’ELAFINE PAR DES SOUCHES DE BACTERIE NON-PROTEOLYTIQUE DE L’INVENTION
La production d’élafine est évaluée pour la souche L. lactis IL1403AHtrA et la souche S. thermophilus CNRZ1066AHtrAAster_1612.
Matériels et Méthodes
Les deux souches sont cultivées jusqu’à un niveau de population identique, et l’induction de la production d’élafine est réalisée dans les conditions optimales pour chacune des souches (voir exemple 7 point 3)).
Résultats
Les résultats obtenus par immunodétection de G élafine produite par chacune de ces souches montrent pour la souche CNRZ1066, la présence d’une bande correspondant à la protéine intacte détectée chez le mutant de protéases et la souche sauvage, et une forme tronquée détectée chez la souche sauvage uniquement. Pour la souche IL1403, on observe toujours des formes tronquées de G élafine chez le simple mutant AHtrA (figure 8).
Donc, l’absence de dégradation de l’élafine n’est constatée que chez S. thermophilus AHtrAASter_1612.
Par ailleurs, les résultats relatifs à l’activité élafine produite par chacune de ces souches montrent que cette activité élafine est 5 à 10 fois plus importante chez S. thermophilus CNRZ1066AHtrAAster_1612 que chez L. lactis IL1403AHtrA (figure 9).
EXEMPLE 9 : CONSTRUCTIONS DES MUTANTS DE LA SOUCHE DE BACTERIE LACTOCOCCUS LACTIS
Les souches L. lactis IL1403 et L. lactis MG1363 étant dépourvues de plasmide, elles ne produisent pas la protéase de paroi PrtP (dont le gène est porté par un plasmide, Gasson, 1983). Les deux autres protéases de surface produites sont donc HtrA (Poquet et al., 2000) et YwdF chez IL 1403 (ou son homologue llmg-2442 chez MG 1363). Le double mutant ILl403AhtrAAywdF, dépourvu des trois activités protéasiques de surface PrtP, HtrA et YwdF, a été construit à partir de la souche IL1403A/z/ (Guillot et al., 2016) par double recombinaison homologue en utilisant le plasmide thermosensible pGhost9 selon le protocole établi (Biswas et al., 1993). Le double mutant L. lactis MG1363 AhtrAAllmg-2442, dépourvu des trois activités protéasiques de surface PrtP, HtrA et llgm-2442, a été construit en deux étapes à partir de la souche sauvage L. lactis MG1363. La première étape a consisté à inactiver le gène htrA par double recombinaison homologue, la seconde à inactiver le gène llgm-2442 chez le simple mutant préalablement obtenu MG1363AhtrA, en suivant une stratégie identique à celle décrite ci-dessus pour L. lactis IL1403.
EXEMPLE 10 : OBTENTION DE SOUCHES DE LACTOCOCCUS LACTIS PRODUISANT L’ELAFINE
Le plasmide pLB386 a été purifié à partir de la souche L. lactis LBH832, comme décrit dans l'exemple 6. Il a été introduit dans la souche L. lactis IL 1403, dans son double mutant L. lactis IL1403 AhtrAAywdf et dans le double mutant L. lactis MG1363 AhtrAAllmg-2442 par électroporation. La souche L. lactis LBH832 n'est autre que la souche sauvage L. lactis MG1363 portant le plasmide pLB386.
La sélection des transformants et la présence du plasmide pLB386 ont été réalisées comme décrit dans l'exemple 6.
En parallèle, des souches contrôles portant un plasmide sans elafine dit plasmide vide (pLB44) ont été construites.
Le plasmide pLB44 a été purifié à partir de la souche L. lactis LBH68, comme décrit dans l'exemple 6. Il a été introduit dans la souche L. lactis IL 1403, son double mutant L. lactis IL1403 AhtrAAywdf et dans le double mutant L. lactis MG1363 AhtrAAllmg-2442 par électroporation. La souche L. lactis LBH68 n'est autre que la souche sauvage L. lactis MG1363 portant le plasmide pLB44.
EXEMPLE 11 : L'INACTIVATION DES PROTEASES DE SURFACE AUGMENTE LA QUANTITE DE PROTEINE HETEROLOGUE PRODUITE PAR LACTOCOCCUS LACTIS
Matériels et Méthodes
La vérification que l'inactivation des protéases de surface de L. lactis se traduit par une augmentation de la quantité de protéine hétérologue produite a été faite par immunodétection de l'élafine entière. Les deux couples de souches sauvage et mutant (donc ne synthétisant ni PrtP, ni HtrA, ni YwdF/llmg-2442) portant le plasmide pLB386 ou pLB44 sont cultivées à 30°C dans du milieu chimiquement défini (Otto et al., 1983). L'induction de la production d'élafine et son immunodétection ont été réalisées comme décrit dans l'exemple 7. Il convient de préciser que les mêmes quantités de surnageant sont déposées pour chaque souche, de sorte que des différences d'intensité de bande révéleront des différences de concentration de protéine dans le surnageant de culture.
Résultats
Plusieurs souches sont utilisées dans ces expériences, réalisées à deux reprises et donnant systématiquement les mêmes résultats, illustrés respectivement pour L. lactis IL1403 et L. lactis MG1363 par les figures 10 et 11:
Les souches sauvages et mutées de L. lactis IL1403 et MG1363 ne produisant pas l'élafine (puits 4 et 6, notés respectivement WT pis vide et Mutant pis vide). On n'observe aucune bande, signe qu'aucune des souches ne produit d'élafine (ni de protéine présentant une réaction croisée avec l'anticorps dirigé contre l'élafine),
La souche sauvage de L. lactis IL1403 produisant l'élafine (Figure 10, puits 3, noté WT pis élafine). On observe deux bandes de faible intensité dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l’élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure (6 kDa), et serait une forme tronquée de l’élafine en cours de dégradation,
La souche sauvage de L. lactis MG13633 produisant l'élafine (Figure 11, puits 3, noté WT pis élafine). On devine deux bandes de très faible intensité dont la supérieure migre à une taille très légèrement inférieure à celle de la forme mature de l’élafine commerciale. La seconde migre à une taille sensiblement inférieure (10 kDa), et serait une forme tronquée de l’élafine en cours de dégradation. La faible intensité des bandes reflète une forte activité de dégradation de l'élafine,
La souche mutée de L. lactis IL1403 produisant l'élafine (Figure 10, puits 5, noté Mutant pis élafine). La bande inférieure correspondant à la forme tronquée de l’élafine n’est pratiquement plus détectable, la bande correspondant à l’élafine mature est révélée de façon majoritaire, avec une intensité beaucoup plus importante que chez la souche sauvage, ce qui traduit une très faible protéolyse de l'élafine chez le double mutant,
La souche mutée de L. lactis MG1363 produisant l'élafine (Figure 11, puits 5, noté Mutant pis élafine). On observe trois bandes, dont l'une de très faible intensité (6 kDa) correspondant à la forme tronquée de l'élafine également perceptible chez le mutant de L. lactis IL1403. La bande supérieure (sous forme de doublet) est la même que celle retrouvée chez la souche sauvage, mais avec une intensité beaucoup plus importante, traduisant une concentration nettement plus forte de l'élafine non dégradée dans le surnageant de la souche mutée. Conclusion L'inactivation de la protéolyse de surface réduit fortement la dégradation de l'élafine, ce qui a pour conséquence une plus forte concentration de la forme intacte de l'élafine dans le surnageant d'une souche de L. lactis ne produisant pas de protéase de surface que dans celui d'une souche sauvage de L. lactis.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Bactérie Gram-positive de l’espèce Streptococcus thermophilus ou Lactococcus lactis telle que la protéase de surface endogène comprenant un motif d’acides aminés et présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°l, a une expression et/ou une activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée, où la SEQ ID N°1 est définie comme suit :
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K avec
XI est l’histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ;
X5 est l’alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ; et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie Gram-positive est un Streptococcus thermophilus et la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°2 de Ster_1612 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
3. Bactérie selon la revendication 2, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 de HtrA ou en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 de PrtS a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
4. Bactérie selon la revendication 2, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°8 de HtrA et en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°9 de PrtS a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
5. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en outre en ce que la bactérie Gram-positive est un Lactococcus lactis et la protéase de surface endogène possède au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°3 de Ywdf ou avec la séquence SEQ ID N°4 de llmq 2442 lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
6. Bactérie selon la revendication 5, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 de HtrA ou en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll de PrtP a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
7. Bactérie selon la revendication 5, caractérisée en outre en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°10 de HtrA et en ce que la protéase de surface endogène ayant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID N°ll de PrtP a une expression et/ou l’activité diminuée ou abolie par mutagénèse ou par utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou par utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée.
8. Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, modifiée pour exprimer une protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie contenant un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt ou par un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt inséré dans son chromosome.
9. Procédé de préparation d’une bactérie faiblement protéolytique, comprenant une étape de mutagénèse ou d’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de protéases à sérine ou d’utilisation d’une souche telle que le gène codant ladite protéase est absent ou présent sous une forme tronquée pour l’abolition ou la diminution dans ladite bactérie, de l’expression et/ou de l’activité de la protéase de surface endogène de ladite bactérie comprenant un motif d’acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID N°1 ; où la SEQ ID N°1 est définie comme suit :
I-A-G-T-G-T-I-E-X1-D-G-X2-X3-G-X4-I-G-G-X5-X6-X7-K avec
XI est l’histidine (H) ou la lysine (K) ;
X2 est la sérine (S), l’alanine (A) ou la thréonine (T) ;
X3 est l’isoleucine (I), la leucine (L) ou la valine (V) ;
X4 est l’acide aspartique (D) ou la glutamine (Q) ; X5 est l’alanine (A) ou la valine (V) ;
X6 est l’acide aspartique (D) ou la tyrosine (Y) ; et X7 est la lysine (K) ou la leucine (L).
10. Utilisation d’une bactérie telle que définie dans la revendication 8, pour la production de protéine hétérologue d’intérêt, ladite bactérie étant transformée par un vecteur d’expression contenant un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt ou par un fragment d’ADN codant la protéine hétérologue d’intérêt inséré dans son chromosome.
11. Utilisation d’une bactérie telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 7, comme ferment de pré-maturation du lait.
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