KR20230109648A - 디펩티딜펩티다제 및 류신 아미노펩티다제 폴리펩티드 변이체(dipeptidylpeptidase and leucine aminopeptidase polypeptide variants) - Google Patents

디펩티딜펩티다제 및 류신 아미노펩티다제 폴리펩티드 변이체(dipeptidylpeptidase and leucine aminopeptidase polypeptide variants) Download PDF

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Abstract

본 개시는 디펩티딜펩티다제(dipeptidylpeptidase) IV(DPPIV) 폴리펩티드 및 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase(LAP)) 폴리펩티드의 절단된 변이체인 펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 벡터와 같은 핵산, 및 본원에 기술된 핵산을 포함하고 선택적으로 본원에 기술된 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 기술된 폴리펩티드 및 핵산은 체강 질환(celiac disease(CeD)) 및 비체강 글루텐 민감성(non-celiac gluten sensitivity(NCGS))을 비롯한 글루텐 관련 장애뿐만 아니라 글루텐-프리 식단(gluten-free diet(GFD))으로부터 이익을 얻을 수 있는 기타 질환의 치료와 같은 의학적 적용에 유용하다.

Description

디펩티딜펩티다제 및 류신 아미노펩티다제 폴리펩티드 변이체(dipeptidylpeptidase and leucine aminopeptidase polypeptide variants)
본 발명은 디펩티딜펩티다제(dipeptidylpeptidase) IV(DPPIV) 폴리펩티드 및 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase(LAP)) 폴리펩티드의 절단된 변이체인 펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 벡터와 같은 핵산, 및 본원에 기술된 핵산을 포함하고 선택적으로 본원에 기술된 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 기술된 폴리펩티드 및 핵산은 체강 질환(celiac disease(CeD)) 및 비체강 글루텐 민감성(non-celiac gluten sensitivity(NCGS))을 비롯한 글루텐 관련 장애뿐만 아니라 글루텐-프리 식단(gluten-free diet(GFD))으로부터 이익을 얻을 수 있는 기타 질환의 치료와 같은 의학적 적용에 유용하다.
밀, 보리, 호밀은 역사를 통틀어 인간의 식단에서 중요한 주요 식품이지만 소화 저항성 면역원성 펩티드의 혼합물인 글루텐 성분과 인체 사이의 상호작용은 점점 더 다양한 임상적, 혈청학적 및 형태학적 증상과 자가 면역 반응의 발현을 유발한다. 글루텐은 고분자 글루테닌과 단량체 알코올 가용성 글리아딘으로 구성되며, 이들은 높은 면역원성 또는 독성 잠재력을 지니고 있다. 프롤린과 글루타민의 함량이 높고 라이신과 메티오닌의 함량이 낮기 때문에 글리아딘은 관강 내 프로테아제 및 장내 브러시-테두리 막 효소(brush-border　membrane　enzyme)에 의한 분해에 대해 주로 안정적으로 유지된다.
글리아딘과 글루테닌은 글루텐 단백질의 80~85%를 차지한다. 글리아딘은 α/β, γ- 및 ω-글리아딘으로 나뉘며, 사슬내 이황화 결합을 통해 연결된 단량체 단백질(α/β-γ-글리아딘) 또는 연결되지 않은 단량체 단백질(ω-글리아딘)이다. α-글리아딘의 N-말단 도메인은 프롤린 및 글루타민이 풍부한 헵타펩티드 PQPQPFP 및 펜타펩티드 PQQPY와 가장 특징적인 면역원성 단편을 포함한다.
글루텐 관련 장애는 세 가지 주요 인간 장애 유형인 자가면역 셀리악병(autoimmune celiac disease), 밀 알레르기(wheat allergy) 및 비셀리악 글루텐 민감성(non-celiac gluten sensitivity)을 의미한다.
체강 질환(CeD)은 환자가 글루텐 소화 중 불완전한 단백질 분해에 의해 생성되는 글루텐 면역원성 펩티드(gluten immunogenic peptide(GIP))에 의해 유발되는 특정 신경학적 증상을 포함하여 다양한 장 및 장외 증상을 나타내는 만성 자가면역 질환이다. 이러한 복잡한 GIP는 프롤린과 글루타민이 풍부하고 내인성 위, 췌장 및 장 브러시 테두리 프로테아제에 의해 잘 소화되지 않는다. GIP는 유전적으로 소인이 있는 개체(인간 백혈구 항원 HLA-DQ2 및/또는 DQ8)에서 T 세포 에피토프 역할을 하고 CD4+ T 세포 매개 면역 반응을 유발한다. 이것은 세포독성 T-세포의 생성 및 국소 및 전신 염증 반응을 야기하며, 이는 소장의 상피 내벽의 분해 및 장외 임상 증상 및 합병증을 설명한다.
환자는 설사, 구토, 팽만감, 변비, 복통, 체중 감소, 만성 피로 및 기타 다양한 증상을 보일 수 있다. 2차 합병증에는 암, 골다공증 및 골감소증, 여성의 유산 및 불임, 어린이의 성장 장애 증후군에 대한 위험 증가가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 인구의 약 40%가 CeD 발달에 필요한 유전자형 HLA-DQ2 및/또는 HLA-DQ8 일배체형을 가지고 있다. 전반적인 유병률 범위는 4.5%에서 0.75%이다.
CeD의 진단은 일반적으로 환자의 임상 병력 및 증상, 혈청 검사 및 상부 소장의 생검에서 얻은 소견의 조합을 기반으로 한다. 전형적인 증상이 있는 환자에서, 조직 트랜스글루타미나제에 대한 혈청 IgA항체(anti-tTG) 측정은 민감도와 특이도가 높은 우수한 선별검사로서, 1차 선별검사로 여겨진다. 의심되는 개인의 혈액으로는 또한 항내막세포(EMA)-IgA, 항글리아딘(AGA) 또는 탈아미드화 글리아딘 특이 항체(DGP)의 존재에 대해서 검사할 수 있다.
또 다른 글루텐 관련 합병증은 비셀리악 글루텐 민감성(NCGS)이다. NCGS는 CeD 또는 밀 알레르기(WA)의 영향을 받지 않는 대상체에서 글루텐 함유 식품 섭취와 관련된 장 및 장외 증상을 특징으로 하는 증후군이다. NCGS의 유병률은 아직 명확하게 정의되지 않았지만 연구 대상 인구에 따라 유병률이 일반 인구의 6%로 추정된다.
NCGS에서 임상 증상은 장 장애(복통, 설사, 메스꺼움, 체질량 감소, 팽만감, 고창)에서 피부(홍반, 습진), 일반적인 전신 증상(예: "혼미", 두통, 피로, 뼈 및 관절 통증), 빈혈, 행동 장애(주의력 장애, 우울증, 과잉 행동), 및 만성 궤양성 구내염이 있다. CeD와 달리 NCGS에 대한 특정 유전적 소인 인자는 지금까지 확인되지 않았으며, 셀리악 관련 항체의 결정이 NCGS에 민감하거나 특이적이지 않기 때문에 NCGS에 대한 혈청학적 바이오마커는 이용가능하지 않다.
적응 면역 체계가 활성화되는 CeD와 달리 NCGS에서는 선천 면역 체계의 반응이 상향 조절된다. NCGS 환자의 위장관 및 장 투과성은 정상이고, 십이지장 점막의 조직상의 병변은 경미하지만, NCGS 환자에서 호산구 및 호염구의 십이지장 고유판으로의 침윤 증가 및 순환 호염구의 활성화가 관찰되었다. 연구에서는 글루텐 함유 식품의 섭취와 운동 실조증, 말초 신경병증, 정신분열증, 자폐증, 우울증, 불안 및 환각(소위 글루텐 정신병)과 같은 신경 및 정신 장애/증상의 출현 사이의 관계를 조사했으며, 글루텐 관련 펩티드가 전신 순환계로 들어가 장외 증상을 유발할 수 있음이 제안되었다.
치료 전략은 질환 병인의 상이한 단계를 목표로 하거나 소장 점막에 도달하기 전에 면역원성 펩티드를 무해하게 만드는 것을 목표로 개발 중이다. 현재 CeD 및 NCGS에 대한 유일한 치료 옵션은 엄격한 GFD이다. 이 치료의 목표는 글루텐 섭취와 글루텐 관련 장애의 외부 면역 트리거인 GIP 생성을 최대한 피하는 것이다. 임상 치료 목표는 증상의 해결 및/또는 회피 및 GIP 유도 자가면역 반응의 예방뿐만 아니라 상부 위장관(GI) 관의 형태학적 및 기능적 변화, 예를 들어 융모 위축의 개선 또는 회피이다. 글루텐 프리 제품에 존재할 수 있는 아주 작은 양의 글루텐이라도 완전한 GFD 준수 부족으로 인해 면역 반응 및 임상 증상을 유발할 수 있다. GFD를 준수하기 위한 최선의 노력에도 불구하고, 식이 실수와 교차 오염으로 인해 상당수의 환자 하위 그룹이 증상을 보이며 부주의한 글루텐 섭취로 이어진다.
CeD 환자가 3~4개월 동안 글루텐을 완전하고 엄격하게 피하는 경우 임상적으로, 혈청학적으로, 형태학적으로 무증상이 된다. 이것은 GIP의 영구적이고 전체적인 효소 분해가 CeD에 대한 치료 자격이 있음을 나타낸다.
트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)(ruDPPIV)의 디펩티딜펩티다제 IV와 트리코피톤 루브룸(ruLAPII)의 류신 아미노펩티다제 II의 조합은 GIP의 완전한 분해를 유도한다.
P. pastis 발현 플랫폼에서 ruLAPII(ruLAPII short) 및 ruDPPIV(ruDPPIV short)의 짧은 변이체의 생산이 본원에 설명되어 있다. ruLAPII 및 ruDPPIV의 이러한 변이체를 정제하고 효소 활성(U/mg 정제 단백질)에 대해 이의 전체 길이 변이체와 함께 테스트했다. 정제된 짧은 변이체를 온전한 분자 질량 분광법으로 분석했다.
ruDPPIV의 짧은 변이체는 전장 변이체와 유사한 효소 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. ruLAPII의 경우 전장 변이체에 비해 약간 낮은 활성이 측정되었다:
·ruDPPIV_짧은 길이: 12.7 U/mg
·ruDPPIV 전장: 12.4 U/mg
·ruLAPII_짧은 길이: 1.1 U/mg
·ruLAPII 전장: 1.5 U/mg
가능한 분해를 평가하기 위한 질량 분광법에 의한 테스트는 다음을 밝혀냈다: 짧은 ruDPPIV의 경우, 분해 생산물만 확인될 수 있는 전장 분자 ruDPPIV와 달리, 전장 산물뿐만 아니라 분해도 발견될 수 있다. 짧은 ruLAPII의 경우 분해 산물만 확인된 전장 분자 ruLAPII와 달리 분해가 관찰되지 않았다.
제시된 결과에 기초하여, ruDPPIV 및 ruLAPII의 짧은 변이체는 질량 분광법에서 전장 분자를 확인할 수 있기 때문에 개선을 보이고(전장 분자로는 분해만 확인됨) 단축된 변이체는 여전히 유사한 효소 활성을 나타낸다 .
따라서, 본 발명은 절단된 ruDPPIV 및 ruLAPII 폴리펩티드들이 활성을 유지하고 적어도 부분적으로는 분해에 대해 저항이 있게 생산될 수 있다는 놀라운 결과에 적어도 부분적으로 기반한다.
본 발명은 디펩티딜펩티다제 IV(DPPIV), 특히 ruDPPIV 또는 류신 아미노펩티다제(LAP), 특히 ruLAPII의 절단된 변이체인 펩티다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. ruDPPIV 및 ruLAPII는 피부사상균 트리코피톤 루브룸 에서 파생된 펩티다제다.
일 측면에서, 본 발명은 절단된 디펩티딜펩티다제 IV(DPPIV) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 절단은 N-말단 및/또는 C-말단 절단이다. 일 실시양태에서, 상기 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 단편이다.
다양한 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상5 개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 이상의 아미노산이 C-말단에서 결손된다. 다양한 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산이 C-말단에서 결손되어 있다. 이들 및 다른 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1개 이상의 아미노산이 결손되어 있다. 이들 및 다른 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결손되어 있다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1개 이상의 아미노산이 결손되고 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 14개 이상의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1개 아미노산이 결손되고 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 14개 아미노산이 결손된다.
일 실시양태에서, 상기 절단된 DPPIV 폴리펩티드에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 (i) 1개 또는 2개의 아미노산이 N-말단에서 결손되고/되거나 (ii) C-말단에서 최대 15개의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 12 내지 14개의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 13개 또는 14개의 아미노산이 결손된다.
일 실시양태서, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 1-745, 1-746, 1-747, 1-748, 1-749, 1-750, 1-751, 1-752, 1-753, 1-754, 1-755, 1-756, 1-757, 1-758, 또는 1-759 으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 DPPIV 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 2-745, 2-746, 2-747, 2-748, 2-749, 2-750, 2-751, 2-752, 2-753, 2-754, 2-755, 2-756, 2-757, 2-758, 또는 2-759로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 DPPIV 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 제공한다:
(i) 서열번호 1의 잔기 1-748로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(ii) 서열번호 1의 잔기 1-747로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(iii) 서열번호 1의 잔기 1-746으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(iv) 서열번호 1의 잔기 1-745로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(v) 서열번호 1의 잔기 2-748로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(vi) 서열번호 1의 잔기 2-747로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드
(vii) 서열번호 1의 잔기 2-746으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 그리고
(viii) 서열번호 1의 잔기 2-745로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)으로부터 유래된다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드들의 N-말단 끝에서 디펩티드 모티프 NH2-X-Pro를 절단한다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된다.
다른 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 변이체를 포함하지 않으며, 바람직하게는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 절단되지 않은 서열, 예를 들어 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 특히 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 절단된 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 더 적은 정도로 절단된 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 14개의 아미노산이 결손된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드는 절단되지 않은, 즉, 야생형, DPPIV 폴리펩티드의 아미노산을 포함하지 않으며, 바람직하게는 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 예를 들어 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 13개 이하의 아미노산이 결손된다. 유사하게, 예를 들어, 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 잔기 1-746으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드는 절단되지 않은, 즉 야생형, DPPIV 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 바람직하게는 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 잔기 1-747 또는 그 이상의 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다시 말해서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에서 절단된 DPPIV 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있는 이러한 서열들은 바람직하게는 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 절단된 DPPIV 폴리펩티드에서 절단되거나 결손된 아미노산에 해당하지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 전체 길이 서열 또는 상기 절단된 DPPIV 폴리펩티드의 아미노산 서열보다 더 긴 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 전체 길이 서열의 연속적인 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
일 실시양태에서, 특정 수의 아미노산이 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 결손되는 경우, 본원에 기술된 절단형 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 결손된 아미노산으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 잔기 747-760, 748-760, 749-760, 750-760, 751-760, 752-760, 753-760, 754-760, 또는 755-760 으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 활성의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상을 유지한다.
추가 측면에서, 본 발명은 신호 펩티드, 예를 들어 피키아 파스토리스에서 분비된 발현에 유용한 신호 펩티드에 선택적으로 융합된, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 신호 펩티드는 바람직하게는 절단된 DPPIV 폴리펩티드의 N-말단과 융합된다.
일 실시양태에서, 절단된 DPPIV 폴리펩티드 및/또는 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열로 구성된다.
추가 측면에서, 본 발명은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 절단은 N-말단 및/또는 C-말단 절단이다. 일 실시양태에서, 상기 절단된 LAP 폴리펩티드는 야생형 LAP 폴리펩티드의 단편이다.
다양한 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 또는 22개 이상의 아미노산이 C-말단에서 결손되어 있다. 다양한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 아미노산이 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 결손되어 있다. 이들 및 다른 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 아미노산이 결손되어 있다. 이들 및 다른 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산이 결손되어 있다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에서 6개 이상의 아미노산이 결손되고 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 22개 이상의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에 6개의 아미노산이 결손되고 상기 야생형 LAP 폴리펩티드에 비해 C-말단에 22개의 아미노산이 결손되어 있다
일 실시양태에서, 절단된 LAP 폴리펩티드에서 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 (i) 최대 7개의 아미노산이 N-말단에서 결손되고/되거나 (ii) 최대 23개의 아미노산이 C-말단에서 결손된다. 일 실시양태에서, 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에 4 내지 6개의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에 6개의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 20 내지 22개의 아미노산이 C-말단에서 결손된다. 일 실시양태에서, 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 8, 16, 21 또는 22개의 아미노산이 결손된다. 일 실시양태에서, 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 22개의 아미노산이 결손된다.
일 실시양태에서, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 1-456, 1-457, 1-458, 1-459, 1-460, 1-461, 1-462, 1-463, 1-464, 1-465, 1-466, 1-467, 1-468, 1-469, 1-470, 1-471, 1-472, 1-473, 1-474, 1-475, 1-476, 1-477, 또는 1-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 2-456, 2-457, 2-458, 2-459, 2-460, 2-461, 2-462, 2-463, 2-464, 2-465, 2-466, 2-467, 2-468, 2-469, 2-470, 2-471, 2-472, 2-473, 2-474, 2-475, 2-476, 2-477, 또는 2-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 3-456, 3-457, 3-458, 3-459, 3-460, 3-461, 3-462, 3-463, 3-464, 3-465, 3-466, 3-467, 3-468, 3-469, 3-470, 3-471, 3-472, 3-473, 3-474, 3-475, 3-476, 3-477, 또는 3-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 4-456, 4-457, 4-458, 4-459, 4-460, 4-461, 4-462, 4-463, 4-464, 4-465, 4-466, 4-467, 4-468, 4-469, 4-470, 4-471, 4-472, 4-473, 4-474, 4-475, 4-476, 4-477, 또는 4-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 5-456, 5-457, 5-458, 5-459, 5-460, 5-461, 5-462, 5-463, 5-464, 5-465, 5-466, 5-467, 5-468, 5-469, 5-470, 5-471, 5-472, 5-473, 5-474, 5-475, 5-476, 5-477, 또는 5-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 6-456, 6-457, 6-458, 6-459, 6-460, 6-461, 6-462, 6-463, 6-464, 6-465, 6-466, 6-467, 6-468, 6-469, 6-470, 6-471, 6-472, 6-473, 6-474, 6-475, 6-476, 6-477, 또는 6-478 로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 -456, 7-457, 7-458, 7-459, 7-460, 7-461, 7-462, 7-463, 7-464, 7-465, 7-466, 7-467, 7-468, 7-469, 7-470, 7-471, 7-472, 7-473, 7-474, 7-475, 7-476, 7-477, 또는 7-478로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기8-456, 8-457, 8-458, 8-459, 8-460, 8-461, 8-462, 8-463, 8-464, 8-465, 8-466, 8-467, 8-468, 8-469, 8-470, 8-471, 8-472, 8-473, 8-474, 8-475, 8-476, 8-477, 또는 8-478로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단형 LAP 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 제공한다:
(i) 서열번호 2의 잔기 7-471 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(ii) 서열번호 2의 잔기 7-463으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(iii) 서열번호 2의 잔기 7-458 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(iv) 서열번호 2의 잔기 7-457 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
및
(v) 서열번호 2의 잔기 7-456으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)으로부터 유래된다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 폴리펩티드들이 NH2-X-Pro 서열에서 프롤린에 연결된 경우를 제외하고는 상기 폴리펩티드들의 N-말단 끝에서 단일 아미노산을 절단한다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된다.
다른 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 또는 이의 변이체를 포함하지 않으며, 바람직하게는 이것이 유래된 야생형 LAP 폴리펩티드의 절단되지 않은 서열, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 특히 이것이 유래된 야생형 DPPIV 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 절단된 LAP 폴리펩티드와 비교하여 더 적은 정도로 절단된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 22개의 아미노산이 결손된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드는 절단되지 않은, 즉, 야생형, LAP 폴리펩티드의 아미노산을 포함하지 않으며, 바람직하게는 상기 야생형 LAP 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 예를 들어 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에서 21개 이하의 아미노산이 결손된다. 유사하게, 예를 들어, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드의 잔기 1-457로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드는 절단되지 않은, 즉 야생형, LAP 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 바람직하게는 상기 야생형 LAP 폴리펩티드의 잔기 1-458 또는 그 이상의 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 유사하게, 예를 들어, 상기 야생형 LAP 폴리펩티드의 잔기 7-457로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 상기 폴리펩티드는 절단되지 않은, 즉 야생형, LAP 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 바람직하게는 상기 야생형 LAP 폴리펩티드의 잔기6-457, 7-458, 또는 6-458 또는 그 이상의 잔기로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다시 말해서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에서 절단된 LAP 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있는 이러한 서열들은 바람직하게는 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 절단된 LAP 폴리펩티드에서 절단되거나 결손된 아미노산에 해당하지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 LAP 폴리펩티드의 전체 길이 서열 또는 상기 절단된 LAP 폴리펩티드의 아미노산 서열보다 더 긴 야생형 LAP 폴리펩티드의 전체 길이 서열의 연속적인 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
일 실시양태에서, 특정 수의 아미노산이 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단에서 결손되는 경우, 본원에 기술된 절단형 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 상기 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단에서 결손된 아미노산으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 잔기 1-6로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하지 않고 및/또는 서열번호 2의 잔기 458-479, 459-479, 460-479, 461-479, 462-479, 463-479, 464-479, 465-479, 466-479, 467-479, 468-479, 469-479, 470-479, 471-479, 472-479, 473-479, 또는 474-479로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 LAP 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 이것이 유래된 야생형 LAP 폴리펩티드의 활성의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상을 유지한다.
추가 측면에서, 본 발명은 신호 펩티드, 예를 들어 피키아 파스토리스에서 분비된 발현에 유용한 신호 펩티드에 선택적으로 융합된, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 신호 펩티드는 바람직하게는 절단된 LAP 폴리펩티드의 N-말단과 융합된다.
일 실시양태에서, 절단된 LAP 폴리펩티드 및/또는 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열로 구성된다.
추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
(ii) 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 또는
(iii) (i)와 (ii)의 조합.
추가 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 및
(ii) 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 포함한다. 일 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 70% 이상을 포함하고, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 70% 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 80% 이상을 포함하고, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 80% 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 90% 이상을 포함하고, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 90% 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 95% 이상을 포함하고, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 95% 이상을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 DPPIV 폴리펩티드의 98% 이상을 포함하고, 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드는 상기 조성물 중 상기 LAP 폴리펩티드의 98% 이상을 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 중량비는 1:20 내지 1:5, 바람직하게는 1:15 내지 1:7.5, 보다 바람직하게는 약 1:9.5이다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 예를 들어 하기 알파-글리아딘 33-mer 펩티드를 완전히 분해한다:
LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF
일 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 약제학적 조성물이다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제학적 용도를 위한 본원에 기술된 조성물을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 글루텐 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 경구용 조성물, 특히 액상 경구용 조성물이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 핵산으로 형질 감염된 세포를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 핵산으로 형질 감염된 세포를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제학적 용도를 위한 본원에 기술된 폴리펩티드 및 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 약제학적 용도는 대상체에서 글루텐 관련 장애의 치료적 또는 예방적 치료를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 글루텐 관련 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 폴리펩티드 또는 조성물에 관한 것이다.
도 1은 P. pastoris AOX1 스크리닝의 개요를 나타낸다. 포도당 방출은 다당류(EnPump200 시스템, EnPresso GmbH)의 효소 소화에 의해 수행된다. 프로모터는 메탄올 농도를 제한하여 유도된다.
도 2는 ruLAPII_short에 대한 피딩(feeding) 전략을 나타낸다.
도 3은 ruDPPIV_short에 대한 피딩 전략을 나타낸다.
도4는 LP1(pFJP6015, ruDPPIV_short) 균주 배경이 있는 클론에서 분리한 배양 상청액의 쿠마시 염색을 나타낸다. 7.5μL의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% Bis-Tris SDS 겔, 26-웰, MES 완충액에 로딩했다. A) SDS PAGE/쿠마시 염색, 검은색 화살표는 ruDPPIV 생산물의 위치를 나타내고, 파란색 화살표는 ruDPPIV의 고분자량 변이체의 위치를 나타낸다; B) 로딩 계획, 검은색: 나중에 고 세포 밀도 발효를 위해 선택된 클론, 녹색: 참조 균주.
도 5는 LP1(pFJP6014, ruLAPII_short) 균주 배경이 있는 클론에서 분리한 배양 상청액의 쿠마시 염색을 나타낸다. 7.5μL의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% Bis-Tris SDS 겔, 26-웰, MES 완충액에 로딩했다. A) SDS PAGE/쿠마시 염색, 검은색 화살표는 ruLAPII 생산물의 위치를 나타낸다. B) 로딩 계획, 검은색: 나중에 고 세포 밀도 발효를 위해 선택된 클론, 녹색: 참조 균주.
도 6은 LP1(pFJP6015, ruDPPIV_short) 균주 배경을 가진 클론의 바이오매스 생성을 나타낸다. LP1(pFJP6015.8), LP1(pFJP6015.6), LP1(pFJP6015.18), LP1(pFJP6015.12), LP1(pFJP6015.15), LP1(pCKP6003.1). A) 광학 밀도 OD600; B) 건조 중량 DCW.
도 7은 LP1(pFJP6015, ruDPPIV_short) 균주 배경이 있는 클론의 효소 활성을 나타낸다. LP1(pFJP6015.8), LP1(pFJP6015.6), LP1(pFJP6015.18), LP1(pFJP6015.12), LP1(pFJP6015.15), LP1(pCKP6003.1). 활성 측정(AMC 검증)은 AMYRA에서 제공한 SOP에 따라 수행되었다.
도 8은 LP1(pFJP6014, ruLAPII_short) 균주 배경을 사용한 클론의 바이오매스 생성을 나타낸다. LP1(pFJP6014.13), LP1(pFJP6014.20), LP1(pFJP6014.6), LP1(pFJP6014.12), LP1(pFJP6014.15), LP1(pCKP6011.4). A) 광학 밀도 OD600; B) 건조 중량 DCW.
도 9는 LP1(pFJP6014, ruLAPII_short) 균주 배경이 있는 클론의 효소 활성을 나타낸다. LP1(pFJP6014.13), LP1(pFJP6014.20), LP1(pFJP6014.6), LP1(pFJP6014.12), LP1(pFJP6014.15), LP1(pCKP6011.4). 활성 측정(AMC 검증)은 AMYRA에서 제공한 SOP에 따라 수행되었다.
도 10은 LP1(pFJP6015, ruDPPIV_short) 균주 배경을 가진 클론에서 분리된 정제의 쿠마시 염색을 나타낸다. 7.5μL의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% Bis-Tris SDS 겔, 26-웰, MES 완충액에 로딩했다. A) SDS PAGE/쿠마시 염색, 검은색 화살표는 ruDPPIV 생산물의 위치를 나타내고, 파란색 화살표는 ruDPPIV의 고분자량 변이체의 위치를 나타낸다.; B) 로딩 계획.
도 11은 LP1(pFJP6014.13, ruLAPII_short) 균주 배경이 있는 클론에서 분리된 정제의 쿠마시 염색을 나타낸다. 7.5μL의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% Bis-Tris SDS 겔, 26-웰, MES 완충액에 로딩했다. A) SDS PAGE/쿠마시 염색, 검은색 화살표는 ruLAPII 생산물의 위치를 나타내고, 파란색 화살표는 ruLAPII의 분자량 변이체의 위치를 나타낸다; B) 로딩 계획.
도 12는 ruDPPIV의 질량 분광법(Maldi-TOF)을 나타낸다. 40 μL의 PNGase 소화 용출 샘플을 Maldi-TOF를 통해 분석했다(실시예 1, 섹션 7.10 참조). A) ruDPPIV_short; 예상 질량: 84'802; B) ruDPPIV; 예상 질량: 86'486.
도 13은 ruLAPII의 질량 분광법을 나타낸다. 40 μL의 PNGase 소화 용출 샘플을 Maldi-TOF를 통해 분석했다(실시예 1, 섹션 7.10 참조). A) ruLAPII_short; 예상 질량: 48'696; B) ruLAPII; 예상 질량: 51'714. 빨간색 숫자는 ESI 데이터를 나타낸다.
도 14는 ruLAPII에 의한 33-mer의 부분 분해(A)/ ruDPPIV에 의한 33-mer의 분해 없음(B)을 나타낸다.
도 15는 ruLAPII 및 ruDPPIV의 시너지 작용 방식을 나타낸다.
본 개시가 아래에 상세히 설명되어 있지만, 본 개시는 다양할 수 있으므로 여기에 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐이며 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 개시의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 해당 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게, 본 개시에 사용된 용어들은 "A　multilingual　glossary　of　biotechnological　terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koebl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 설명된 바와 같이 정의된다.
본 개시의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 분야의 문헌에서 설명되어 있는 종래의 화학적, 생화학적, 세포 생물학적, 면역학적 방법, 및 재조합 DNA 기술의 상법을 사용할 것이다(예컨대, 참고로,　Molecular　Cloning　: A Laboratory Manual, 2nd　Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
이하, 본 개시의 요소들이 기술될 것이다. 이들 요소는 실시양태와 함께 열거되지만, 추가적인 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식으로 그리고 임의의 수로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 실시양태는 본 명세서를 명시적으로 기술된 실시양태로만 제한하도록 해석되어서는 안된다. 본 설명은 명시적으로 기술된 실시양태들을 임의 숫자의 개시된 요소들과 조합하는 실시양태들을 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 문맥상 달리 지시하지 않는 한, 모든 기술된 요소의 임의의 순열 및 조합이 본 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
"약"이라는 용어는 대략 또는 거의를 의미하며, 일 실시양태에서 여기에 기술된 수치 또는 범위의 맥락에서, 인용되거나 청구된 수치 또는 범위의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 3%를 의미한다.
본 개시를 설명하는 맥락에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 언급은, 달리 지시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 독립적인 값을 개별적으로 지칭하는 빠른 방법으로서 작용하도록 의도된다. 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공되는, 임의의 그리고 모든 예시 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "와 같은")의 사용은 오로지 본 명세서를 더 잘 기술하기 위한 것이며 청구 범위에 제한을 가하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 본 명세서의 실시에 필수적인 임의의 비-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
달리 명시되지 않는 한, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 본 문서의 맥락상 "포함하는"에 의해 도입되는 리스트의 구성원 외에 추가의 구성원이 필요에 따라 존재할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, "포함하는"이라는 용어는 어떠한 추가적인 구성원이 존재하지 않을 가능성을 포함하는 것으로, 즉 이 실시양태 "포함하는"은 "구성되는(consisting of)"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 하는 목적인, 본 명세서의 특정한 실시양태로서 고려된다.
본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 몇몇 문서가 인용되어 있다. 본 명세서에 인용된 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체 사양, 지침 등을 포함)은, 앞에서든 뒤에서든, 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 개시가 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
이하, 본 개시의 모든 측면에 적용되는 정의가 제공된다. 달리 표시되지 않는 한, 다음 용어는 다음의 의미를 갖는다. 정의되지 않은 용어는 해당 기술에서 인식되는 의미를 갖는다.
여기서 사용되는 "감소하다", "줄어들다", "억제하다", 또는 "악화하다"와 같은 용어는, 그 수준에 있어서 바람직하게 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 50% 이상, 또는 약 75% 이상의 총 감소 또는 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 이들 용어는 완전한 또는 본질적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 감소 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가하다", "향상되다", 또는 "초과되다"와 같은 용어는 바람직하게는 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 80% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상 또는 그 이상으로의 증가 또는 향상에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티다제", "프로테아제", "단백질 분해 효소" 및 "펩티드 가수분해 효소"는 동의어이며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 펩티다제는 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합(CO-NH)의 절단을 촉매하여, 이러한 단백질 또는 펩티드를 펩티드 또는 유리 아미노산으로 분해하는 모든 효소를 포함한다. 엑소펩티다제는 아미노(N)- 또는 카르복시(C)-말단에 있는 폴리펩티드 사슬의 단말 근처에서 작용한다. 유리 N-말단에서 작용하는 것들은 단일 아미노산 잔기를 유리시키고 아미노펩티다제라고 한다.
디펩티딜펩티다제 IV 또는 디펩티딜펩티다제 4(약어: DPPIV 또는 DPP4)는 폴리펩티드의 N-말단에서 X-프롤린 또는 X-알라닌 디펩티드를 절단하는 세린 엑소펩티다제이다.
류신 아미노펩티다제(약어: LAP)는 펩티드 및 단백질의 N-말단에 있는 류신 잔기의 가수분해를 우선적으로 촉매하는 효소이다. 그러나 다른 N-말단 잔기도 절단될 수 있다.
트리코피톤 루브룸(ruDPPIV)의 디펩티딜펩티다제 IV 및 트리코피톤 루브룸(ruLAPII)의 류신 아미노펩티다제 II는 각각 DPPIV 및 LAP 폴리펩티드의 바람직한 실시양태이다. 류신 아미노펩티다제인 ruLAPII는 NH2-X-Pro 서열에서 프롤린에 연결된 경우를 제외하고 폴리펩티드의 N-말단 끝에서 단일 아미노산을 절단한다. 디펩티딜 펩티다제인 ruDPPIV는 폴리펩티드의 N-말단 끝에서 디펩티드 모티프 NH2-X-Pro를 선택적으로 절단한다. 따라서 두 효소를 동시에 적용하면 프롤린이 풍부하고 소화 저항성(digestion-resistant)이 있는 GIP를 분해하는 데 사용할 수 있다.
ruDPPIV 및 ruLAPII 둘 다는 그 자체로는, 잘 기술된 면역반응성 GIP를 나타내고 허용된 모델 펩티드로서 기능하는 글루텐 유래의 고도의 면역원성 펩티드인, α-글리아딘 33-mer를 완전히 분해할 수 없다. α-글리아딘 33-mer는 가장 강력한 셀리악병 관련 T 세포 에피토프 중 2개를 다수의 카피로 포함하며 고도로 분해 저항성이 있는 것으로 기술된다. ruLAPII는 N-말단에서 처음 3개의 아미노산을 제거할 수 있지만, 다음에 오는 QP-모티프로 인해 그 지점을 넘어 분해가 진행될 수 없다(도 14A 참조). 반면에 ruDPPIV는 효소가 X-Pro 디펩티드 모티프를 특이적으로 절단하지만 33-mer의 N-말단에 존재하는 아미노산은 절단하지 않기 때문에 33-mer에 영향을 미치지 않는다(도 14B 참조). 그러나 ruDPPIV 및 ruLAPII가 조합되어 존재할 때 글리아딘 33-mer를 완전히 분해할 수 있다(도 15). 완전한 분해를 위해서는 ruDPPIV와 ruLAPII가 상승적으로 작용해야 한다.
ruDPPIV 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 또는 80% 이상의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
ruLAPII 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 또는 80% 이상의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드는 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 디펩티딜펩티다제 IV(DPPIV) 폴리펩티드 또는 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드를 포함한다. 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드 또는 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드는 키메라 또는 융합 단백질의 일부일 수 있다.
"키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 절단된 DPPIV 폴리펩티드, 예컨대 절단된 ruDPPIV 또는 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드, 예컨대 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 다른 아미노산 서열에 연결된 절단된 ruLAPII를 포함한다.
절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드의 경우에, 용어 "하나 이상의 다른 아미노산 서열"은 ruDPPIV와 같은 DPPIV 폴리펩티드에 실질적으로 상동이 아닌 단백질에 상응하는 아미노산 서열(들)을 지칭한다. 융합 단백질 내에서, 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드 및 하나 이상의 다른 아미노산 서열이 서로 융합된다. 하나 이상의 다른 아미노산 서열은 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다. 그러나, 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 다른 아미노산 서열의 융합은, 완전한, 즉, ruDPPIV와 같은 절단되지 않은 DPPIV 폴리펩티드에 존재하는 절단된 ruDPPIV와 같은 절단된 DPPIV 폴리펩티드에 아미노산 서열을 추가하지 않는다.
절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드의 경우, 용어 "하나 이상의 다른 아미노산 서열"은 ruLAPII 와 같은 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드에 실질적으로 상동이 아닌 단백질에 상응하는 아미노산 서열(들)을 지칭한다. 융합 단백질 내에서, 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드 및 하나 이상의 다른 아미노산 서열이 서로 융합된다. 하나 이상의 다른 아미노산 서열은 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다. 그러나, 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 다른 아미노산 서열의 융합은, 완전한, 즉, ruLAPII와 같은 절단되지 않은 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드에 존재하는 절단된 ruLAPII와 같은 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드에 아미노산 서열을 추가하지 않는다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 다른 아미노산 서열은 절단된 폴리펩티드, 예를 들어 절단된 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 서열, 예를 들어 이종 신호 서열을 포함한다.
본 개시에 따르면, 용어 "펩티드"는 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하며, 펩티드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상에서 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개를 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 큰 펩티드, 특히 약 150개 이상의 아미노산으로 된 펩티드를 지칭하며, 용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 통상적으로 동의어로 사용된다.
아미노산 서열(펩티드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된 아미노산 서열을 나타내는 서열에 관한 것이다. C-말단에서 단축된 단편(N-말단 단편)은 예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 3'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. N-말단에서 단축된 단편(C-말단 단편)은 예를 들어, 절단된 오픈 리딩 프레임이 번역을 개시하는 역할을 하는 개시코돈을 포함하는 한, 오픈 리딩 프레임의 5'-말단이 결여된 절단된 오픈 리딩 프레임의 번역에 의해 수득 가능한 것이다. 아미노산 서열의 단편은 예를 들어, 아미노산 서열로부터 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 바람직하게는 아미노산 서열로부터 6개 이상, 특히 8개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 포함한다.
본원에서 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 변형으로 인해 모 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 의미한다. 모(parent) 아미노산 서열은 자연 생성 또는 야생형(WT) 아미노산 서열일 수 있거나, 또는 야생형 폴리펩티드의 변형된 버전일 수 있다. 바람직하게는, 변이체 아미노산 서열은 모 아미노산 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 모 아미노산 서열과 비교해 1개 내지 약 20개의 아미노산 변형, 바람직하게는 1개 내지 약 10개 또는 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 가진다.
본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연(native)"는 대립유전자 변형을 비롯하여, 자연계에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 아미노산 서열, 펩티드 또는 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열을 가진다.
본 개시의 목적에서, 아미노산 서열(펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 스플라이스 변이체, 번역후 변형된 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 대립형질 변이체, 종 변이체, 및 종 상동체, 특히 자연적으로 발생하는 것을 모두 포함한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열에서 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기를 삽입한다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 된 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 서열에서 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의 위치에 존재할 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단형 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩티드들 간에 비-보존된 아미노산 서열 위치에 변형이 존재하거나, 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 펩티드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적인 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전 또는 비-하전된 아미노산의 치환이다. 보존적인 아미노산 변화는 측쇄가 비슷한 하나의 아미노산 계열에서의 치환을 수반한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 아미노산(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산(알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 같이 분류된다. 일 실시양태에서, 보존적인 아미노산 치환은 다음과 같은 그룹 안에서의 치환을 포함한다:
글리신, 알라닌;
발린, 이소루신, 루신;
아스파르트산, 글루탐산;
아스파라긴, 글루타민;
세린, 트레오닌;
라이신, 아르기닌; 및
페닐알라닌, 티로신.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과, 주어진 아미노산 서열의 변이체의 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 100%의 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 아미노산 200개로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 아미노산, 일부 실시양태에서는 연속적인 아미노산 약 20개 이상, 약 40개 이상, 약 60개 이상, 약 80개 이상, 약 100개 이상, 약 120개 이상, 약 140개 이상, 약 160개 이상, 약 180개 이상 또는 약 200개들에 대해 주어진다. 일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 연장 (Gap Extend) 0.5 하에 수행할 수 있다.
"서열 유사성"은 보존적인 아미노산 치환이거나 또는 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 아미노산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 2개의 핵산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 뉴클레오티드의 %를 나타낸다.
용어 "동일성(identical) %", "동일성(identity) %", 또는 유사한 용어는 특히 비교될 서열 사이의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 %를 나타내는 것으로 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 2개의 서열 사이의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 2개의 서열 간의 비교는 통상적으로 상응하는 서열의 국소 영역을 확인하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색 방법을 이용하거나, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하여, 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 서열 간의 동일성 %는 미국 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI) 웹사이트에서 이용가능한　BLASTN　또는　BLASTP　알고리즘을 이용해 결정된다 (예를 들어, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq). 일부 실시양태에서, NCBI 웹사이트에서　BLASTN　알고리즘에 적용되는 알고리즘 매개변수는 (i) 예상 역치 10; (ii) 문자 크기 28; (iii) 질의 범위에서 최대 매칭 0; (iv) 매치/미스매치 스코어 1, -2; (v) 갭 코스트 선형 (Linear); 및 (vi) 저 복잡성 영역에 대한 필터 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, NCBI 웹사이트에서　BLASTP　알고리즘에 적용되는 알고리즘 매개변수는 (i) 예상 역치 10; (ii) 문자 크기 3; (iii) 질의 범위에서 최대 매칭 0; (iv) 매트릭스 BLOSUM62; (v) 갭 코스트 존재: 11 연장: 1; 및 (vi) 조건부 조합 점수 매트릭스 조정을 포함한다.
동일성 %는 비교 서열이 대응되는 동일 위치의 개수를 비교한 위치의 총수 (예를 들어 기준 서열에서의 위치 총수)로 나눈 후 여기에 100을 곱하여 구한다.
일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 서열의 전장에 대해 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 100%인 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 핵산 서열이 뉴클레오티드 200개로 이루어진다면, 동일성 정도는, 일부 실시양태에서, 연속적인 뉴클레오티드 약 100개 이상, 약 120개 이상, 약 140개 이상, 약 160개 이상, 약 180개 이상 또는 약 200개에 대해 주어진다. 일부 실시양태에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 서열의 전장에 대해 주어진된다.
동종 아미노산 서열은 본 개시에 따라 아미노산 잔기의 40% 이상, 특히 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 바람직하게는 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 보여준다.
본 발명에 따르면, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "절단된(truncated)"은 야생형 펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 모 펩티드 또는 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 아미노산 서열의 절단된 형태 또는 변이체는 상기 아미노산 서열의 단편이다.
본원에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩티드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 방법은 예를 들어 Sambrook et al. (1989)에 상세하게 기술되어 있다. 또한, 본원에 기술된 펩티드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같은, 공지된 펩티드 합성 기법의 도움을 받아 쉽게 제조할 수 있다.
일 실시양태에서, 아미노산 서열(펩티드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이것이 유래되는 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한가지 이상의 기능적 특성을 발휘하는 임의의 단편 또는 변이체를 의미하며, 즉 기능적 등가체이다. DPPIV 또는 LAP와 같은 펩티다제의 서열과 관련하여, 하나의 특정 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 표시되는 하나 이상의 펩티다제 활성이다. 본원에서, 용어 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"는, 특히, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산이 변형된 아미노산 서열을 포함하지만 모 분자 또는 서열의 한가지 이상의 기능성을 여전히 충족할 수 있는, 예를 들어 펩티다제 활성을 의미한다. 일 실시양태에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열내 변형은 분자 또는 서열의 결합 특징을 현저하게 변형시키지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 다른 실시양태들에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 기능이 저하될 순 있지만, 여전히 현저한 수준이며, 예를 들어, 기능성 변이체의 펩티다제 합성은 모 분자 또는 서열의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서는, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 펩티다제는 모 분자 또는 서열과 비교해 강화될 수도 있다.
지정된 아미노산 서열(펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)"로부터 유래되는" 아미노산 서열(펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)은 제1 아미노산 서열의 기원을 참조한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분양의 당업자라면, 본원에서 이용하기 적합한 서열이, 이것이 유래된 자연 생성 또는 본래의 서열과 서열상 차이는 있지만 본래의 서열의 바람직한 활성은 유지하도록 변형될 수 있는 것임을, 이해할 것이다.
본원에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 알리기 위해 이용할 수 있는 "설명 자료" 또는 "설명서"는 출판물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 설명 자료는, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 수용된 용기에 부착되거나 또는 조성물이 수용된 용기와 함께 운송될 수 있다. 대안적으로, 설명 자료는 설명 자료와 조성물을 수신자가 함께 이용하고자 하는 의도로 용기와 별도로 운송될 수 있다.
본원에서, 용어 폴리펩티드 및 핵산은 단리된 및/또는 재조합 분자일 수 있다.
"단리된(isolated)"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 중에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니고, 그의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드가 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포 중에 존재할 수 있다.
본 발명의 문맥상 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조됨"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 재조합 핵산과 같은 "재조합 물체"는 자연적으로 발생하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "자연 발생"(naturally occuring)은 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 자연계 원천으로부터 분리할 수 있고 인간에 의해 실험실에서 인위적으로 변형된 바 없는 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적이다.
"유전적 변형" 또는 간단히 "변형"이라는 용어는 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 용어 "형질감염(transfection)"은 핵산의 세포 내로의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 목적 상, 용어 "형질감염"은 또한 핵산의 세포 내로의 도입 또는 그러한 세포에 의한 핵산의 흡수를 또한 포함한다. 본 발명에 따라, 본원에 기술된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 시험관 내에 존재할 수 있다. 본 발명에 따라, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 형질감염의 몇 가지 적용예에서, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로 발현되기만 해도 충분하다. RNA는 코딩된 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 세포에 형질감염될 수 있다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 대개 핵 게놈 내로 통합되지 않으므로, 외래 핵산은 세포유사분열을 통해 희석되거나 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허여하는 세포들은 희석비율을 크게 감소시킨다. 만일 형질감염된 핵산이 세포 및 그의 딸 세포들의 게놈 내에 실제로 남아있는 것이 요구될 경우, 안정한 형질감염이 일어나야 한다. 이러한 안정적인 형질감염은 형질감염을 위해 바이러스 기반 시스템 또는 트랜스포존 기반 시스템을 사용하여 달성할 수 있다.
핵산
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 제조되고 화학적으로 합성된 분자를 포함하는 것을 의도한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 변형 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
핵산은 벡터 내에 포함될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 예컨대 λ파지와 같은 파지 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 배큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 P1 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 통상의 기술자에게 잘 알려진 여하한 벡터를 모두 포함한다. 상기 벡터에는 클로닝 벡터와 같은 발현 벡터도 포함된다. 발현 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하며 일반적으로 특정 숙주 생명체(예컨대 세균, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 소망되는 코딩 서열 및 적절한 DNA 서열들을 일반적으로 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 어떤 소망되는 DNA 단편을 조작 및 증폭하는데 사용되며 소망되는 DNA 단편의 발현에 요구되는 기능적 서열들을 결여할 수 있다.
"플라스미드"는 추가 DNA 세그먼트가 라이케이팅될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. "바이러스 벡터"는 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이팅될 수 있는 벡터이다.
특정 벡터는 이 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 오리진을 보유한 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입된 후에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.　
"발현 벡터"들은 작용적으로 결합되는 유전자의 발현을 조종할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로 혼용하여 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 다른 형태의 발현 벡터들, 예컨대 바이러스 벡터(예를 들어 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함시키고자 하며, 이들은 동등하게 작용한다.
기능성 단백질의 생산은 단백질을 생산하는 생물체의 세포 기구와 밀접한 관련이 있다. E.coli는 일반적으로 게놈이 완전히 매핑되어 있고 그 생물체를 다루기 쉬우며; 빠르게 성장하고; 성장에 저렴하고 제조하기 쉬운 배지가 요구되며; 그리고 단백질의 회수가 용이한 배지로 단백질을 분비하기 때문에 많은 단백질 발현을 위한 선택된 "공장"이었다. 그러나 E.coli는 원핵생물이며 진핵생물에 존재하는 소포체 및 골지체와 같은 세포내 소기관이 부족하며, 생성되는 단백질을 변형시키는 효소를 포함한다. 많은 진핵 단백질이 E.coli에서 생산될 수 있지만 글리코실화 또는 번역 후 변형이 발생하지 않기 때문에 비기능적 미완성 형태로 생산될 수 있다.
따라서 진핵 효모, 포유류 및 식물 발현 시스템이 단백질 생산에 자주 사용된다. 예를 들어, 메탄올자화 효모(methanoltrophic yeast) P. pastoris는 단백질의 이종 발현을 위한 강력한 숙주가 되었으며 고처리량 기술로 인간 단백질 발현을 위한 대체 진핵 숙주로 확립되었다.
또 다른 예로서, 식물은 단백질의 대규모 이종 발현을 위한 발현 숙주로 사용되고 있으며 전통적인 발현 시스템에 비해 비용 효율성, 확장성 및 안전성의 잠재적 이점을 제공한다. 현재 일시적 발현, 식물 세포 현탁 배양, 재조합 식물 바이러스 및 엽록체 트랜스제닉 시스템을 비롯한 다양한 식물 이종 발현 시스템이 있다. 식물에서 발현되는 단백질은 포유류 단백질과 약간의 차이가 있지만(예: 글리코실화) 이러한 차이가 인간 환자에서 부작용을 초래한다는 증거는 현재 없다.
또 다른 적합한 이종 발현 시스템은 종종 배큘로바이러스 발현 벡터와 함께 곤충 세포를 사용한다. 배큘로바이러스 벡터는 배양된 곤충 세포에서 단백질을 발현하는 데 사용할 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드의 생산을 위한 특히 바람직한 발현 시스템 중 하나는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 시스템이다. P. Pastoris는 알코올 옥시다제 프로모터를 단리하여 클로닝한 이후 외래 단백질 생산에 탁월한 숙주로 개발되었다. 다른 진핵 발현 시스템에 비해 Pichia는 박테리아와 관련된 내독소 문제나 동물 세포 배양에서 생산된 단백질의 바이러스 오염 문제가 없기 때문에 많은 이점을 제공한다. 또한 P. pastoris는 포도당이 없는 상태에서 탄소원으로 메탄올을 사용할 수 있다. P. pastis 발현 시스템은 메탄올 대사의 첫 번째 단계를 촉매하는 효소인 알코올 산화 효소의 발현을 코딩하는 유전자를 제어하는 메탄올 유도 알코올 산화 효소(AOX1) 프로모터를 사용한다. 이 프로모터는 특성화되었으며 일련의 P. pastoris 발현 벡터에 통합되어 있다. P. pastis에서 생성된 단백질은 전형적으로 정확히 폴딩되고 배지 내로 분비되기 때문에 유전공학적으로 조작된 P. pastis의 발효는 E.coli 발현 시스템에 대한 탁월한 대안을 제공한다. 또한, P. Pastoris는 발현된 단백질을 자발적으로 글리코실화하는 능력이 있으며, 이는 E.coli에 비해 이점이기도 하다. 이 시스템을 사용하여 　파상풍 독소 단편, 보르다텔라 페르투시스 퍼택틴(Bordatella pertussis　pertactin), 인간 혈청 알부민 및 라이소자임을 비롯한 다수의 단백질을 이 시스템을 사용하여 제조하였다.
본 발명의 내용에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, RNA는 모든 또는 대부분의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 본원에서 사용되는, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드를 의미한다. RNA는, 비-제한적으로, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 일부 정제된 RNA와 같이 단리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 제조된 RNA뿐 아니라 자연 발생 RNA와 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손, 치환 및/또는 변형에 의해 차별적인 변형된 RNA를 포괄한다. 이러한 변형은 내부 RNA 뉴클레오티드에 또는 RNA 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 의미할 수 있다 또한, 본원에서, RNA의 뉴클레오티드는 화학 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드일 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시에서, 이들 변형된 RNA는 자연 발생 RNA의 유사체로 간주된다.
본 개시의 특정 실시양태에서, RNA는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 RNA 전사체를 의미하는 메신저 RNA(mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비-번역 영역(5'-UTR), 펩티드 코딩 영역 및 3' 비-번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 일 실시양태에서, mRNA는 DNA 주형을 이용한 시험관내 전사를 통해 제조되며, 여기서 DNA는 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한 핵산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 구조를 말하며 일반적으로 5' ->　5' 트리포스페이트 결합을 통해　mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다.　 일 실시양태에서, 이 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. RNA에　5'-캡 또는　5'-캡 유사체의 부가는,　5'-캡이 RNA 가닥으로 공동-전사에 의해 발현되는 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 번역 후에 RNA에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역(untranslated region)" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되진 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서 대응되는 영역을 지칭한다. 비-번역 영역(UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)에 존재할 수 있거나 (5'-UTR), 및/또는 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)에 존재할 수 있다 (3'-UTR). 5'-UTR은, 존재할 경우, 5' 말단, 단백질-암호화 영역의 개시 코돈의 상류에 위치한다. 5'-UTR은 (존재할 경우) 5'-캡의 하류이며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접하게 존재한다. 3'-UTR은, 존재할 경우, 3' 말단, 즉 단백질-암호화 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리 (A) 서열을 포함하진 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재할 경우) 폴리 (A) 서열의 상류이며, 예를 들어 폴리 (A) 서열에 바로 인접하게 존재한다.
본원에서, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리-A　꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치한 아데닐레이트 잔기들의 서열을 지칭한다. 폴리(A) 서열은 당해 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있으며, 본원에 기술된 RNA에서 3' UTR 다음에 위치할 수 있다.
본 발명의 모든 측면의 일 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 암호화된 폴리펩티드를 제공하기 위해 핵산으로 형질감염된 세포에서 발현된다. 일 실시양태에서, 발현이 세포외 공간으로 이루어진다, 즉 암호화된 폴리펩티드가 분비된다.
"암호화(encoding)"는 규정된 서열의 뉴클레오티드 서열들 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열들 및 이로부터 초래되는 생물학적 성질을 갖는 생물학적 프로세스 내의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 특정 서열의 고유의 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자에 의해 생산된 mRNA의 전사 및 번역으로 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질이 생산된다면, 유전자가 이러한 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에서 대개 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 스트랜드(strand)와 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 템플릿으로 사용되는 비-코딩 스트랜드 모두는 단백질 또는 유전자 또는 cDNA의 다른 생산물을 암호화하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는,　DNA　서열의 유전자 코드가　RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 이어서,　RNA는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사(in vitro transcription)"를 포함하고, 여기서 용어 "시험관내 전사"는,　RNA, 특히 mRNA가 무세포 (cell-free) 시스템 내에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는, 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체 생성에 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 칭해되며 본 발명에 따라 용어 "벡터"에 포함된다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의　RNA　폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다.　 RNA　폴리머라제의 특정 예는 T7, T3 및 SP6　RNA　폴리머라제이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 조절된다. 시험관내 전사를 위한　DNA　주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 그것을 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 얻을 수 있다. cDNA는　RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 그에 의하여 mRNA 가닥이 펩티드 또는 단백질을 만들기 위한 아미노산 서열의 조립을 지시하는 세포의 리보솜에서의 과정에 관한 것이다.
본원에 사용된 "내인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 임의의 물질 또는 이의 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입된 임의의 물질 또는 이의 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 2가지 이상의 요소 또는 구성성분 또는 도메인이 서로 연결되는 것을 의미한다.
약제학적 조성물
본 발명의 모든 측면의 일 실시양태에서, 폴리펩티드와 같은 본원에 기술된 성분은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있고 선택적으로 안정화제 등을 포함할 수 있는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 약제학적 조성물은 치료 또는 예방, 예를 들어, 글루텐 관련 장애를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 것이다.
용어 "약제학적 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제형을 지칭한다. 이러한 약제학적 조성물은, 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 예방하거나 또는 치료하기 위해 사용가능하다. 약제학적 조성물은 또한 약제학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 개시에 따른 약제학적 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 의미한다.
용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진척 속도를 늦추는 것을 포함하며, 구체적으로 질환의 진척을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 이러한 질환 또는 장애의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중 등의 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 조성믈의 투여 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이 보다 고 용량(또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.
본 개시의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 개시의 약제학적 조성물에 사용하기 적합한 보존제로는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살이 있다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 개시의 약제학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분은 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제 등이 있다.
용어 "희석제"는 희석하는 물질 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 있다.
용어 "담체"는 약제학적 조성물의 투여를 쉽게 만들거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기성일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에서, 담체는, 대상체에게 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히, 생체적합한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머 등이 있다. 일 실시양태에서, 본 개시의 약제학적 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.
치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제들은 약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.
약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약제학 실무에 따라 선택할 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 투여용으로 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여, 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에서, "비경구 투여"는 정맥내 주사 등의 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 약제학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다.
본원에서, 용어 "공동-투여"는 여러가지 화합물 또는 조성물을 동일 환자에게 투여하는 공정을 의미한다. 여러가지 화합물 또는 조성물을 동시에, 본질적으로 동일 시간에 또는 연속적으로 투여할 수 있다.
치료
본 발명은 글루텐 관련 장애(셀리악병 및 비셀리악 글루텐 민감성 포함), 소화관 흡수 장애, 스프루, 알레르기 반응 및 효소 결핍과 같은 대상체의 병리학적 상태를 치료하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 예를 들어, 알레르기 반응은 글루텐에 대한 반응일 수 있다. 특히, 본 발명은 셀리악병(CeD) 및 비셀리악 글루텐 민감성을 치료하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 본원에 기재된 방법은 유효량의 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
ruLAPII 및 ruDPPIV의 칵테일은 글루텐-면역원성 펩티드(GIP)를 인-시츄로 분해하는데, 이들이 글루텐 소화시에 몇 분 만에 비면역성 단일 아미노산 및 디펩티드로 생성되므로, 면역 반응을 방지하고 글루텐 관련 장애의 후속 증상을 예방한다. 본원에 기술된 절단된 폴리펩티드 변이체는 생물학적 활성을 유지하기 때문에 이들은 유래된 모 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 유용성을 갖는다.
본 발명의 치료 화합물 또는 조성물은 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발생의 위험이 있는(또는 발생한 것으로 의심되는) 대상체에게 예방적으로(즉, 질환 또는 장애를 예방하기 위하여) 또는 치료적으로(즉, 질환 또는 장애를 치료하기 위하여) 투여될 수 있다. 그러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질환의 명백한 임상 증상이 나타나기 전에 발생하여, 질환 또는 장애가 예방되거나 또는 대안으로 그것의 진행이 지연된다. 의학 분야의 맥락에서, 용어 "예방"은 질환으로부터의 사망률 또는 이환율의 부담을 감소시키는 임의의 활동을 포함한다.　예방은 일차, 이차 및 삼차 예방 수준에서 발생할 수 있다.　 일차 예방이 질환의 발생을 피하는 것인 한편, 이차 및 삼차 수준의 예방은 질환의 진행 및 증상의 출현을 방지하는 것뿐만 아니라 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 기능을 복원시키고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 감소시키는 것을 목적으로 하는 활동을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제제 또는 조성물의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나 다회 투여에 의해 촉진될 수 있다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 신호와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 더 넒은 의미에서 개체와 접촉시 병에 걸린 개체에게 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 광의의 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 독립된 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구별할 수 있는 범주로 간주될 수 있다. 질환은, 다수 질환으로 인한 위축 및 생활이 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 감정적으로도 영향을 미친다.
"글루텐 관련 장애"라는 용어는 밀 기반 식품과 같은 글루텐 함유 식품 섭취로 인해 발생하는 상태 및 질환에 관한 것이다. 이 용어에는 체강 질환(CeD), 밀 알레르기(WA) 및 비체강 글루텐 민감성(NCGS)뿐만 아니라 글루텐 프리 식단(GFD)으로 이익을 얻을 수 있는 기타 질환이 포함된다.
셀리악병(CeD)은 유전적 소인이 있는 개체에서 글루텐-면역성 펩티드(GIP)에 의해 유발되는 만성 면역 매개성 장질환이다. GIP는 글루텐 소화물에서 생성되며 질환 병리학에서 중심적인 역할을 하며; HLA-DQ2 및 HLA-DQ8 양성 환자에서 T 세포 에피토프 역할을 하는 소화 저항성 프롤린이 풍부한 펩티드로 구성됨으로서, CD4+ T 세포는 HLA 분자와 결합하여 전형적인 자가 면역 병증을 시작하며, 이는 임상 증상 및 장기 합병증을 설명한다. 현재 진단은 장자병증(enteropathy), 융모 위축(villous atrophy), 선와 증식(crypt hyperplasia) 및 상피내 림프구증가증(intraepithelial lymphocytosis)의 임상 증상의 존재, 및 조직 트랜스글루타미나제(tTG)), 탈아미드화 글리아딘 펩티드(DGP) 및 내막세포(EMA)에 대한 순환 CeD 특이 항체의 존재를 기반으로 한다.
비셀리악 글루텐 민감성은 글루텐 섭취와 관련된 글루텐 관련 장애이다. CeD와 달리 NCGS에 대한 특정 유전적 소인 인자는 지금까지 확인되지 않았으며 셀리악 관련 항체의 결정이 NCGS에 민감하거나 특이적이지 않기 때문에 NCGS에 대한 혈청학적 바이오마커로 사용할 수 없다. NCGS 환자의 위장관 및 장 투과성은 정상이고 십이지장 점막의 조직상의 병변은 경미하지만, 증후군 관련 증상의 원인이 될 수 있는 NCGS 환자에서 호산구 및 호염구의 십이지장 고유판으로의 침윤 증가 및 순환 호염구의 활성화가 관찰되었다.
글루텐 유래 GIP는 글루텐 관련 장애의 원인 유발자이기 때문에 평생 엄격한 글루텐 프리 식단이 치료의 중심이 되어 왔다. 그러나 글루텐 프리 식단은 일상 생활에서 달성하기가 매우 어렵다.
본 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 장애를 퇴치할 목적으로 대상체를 관리 및 케어하는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연시키거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하거나, 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 제거하거나 아울러 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 화합물의 투여 등의, 병에 걸린 대상체로부터 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포괄하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질환, 병태 또는 장애를 퇴치하기 위한 목적으로 개체를 관리 및 케어하는 것으로서 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하거나 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)하는 모든 치료를 의미한다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 예전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.
용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환 발생을 방지하기 위해 의도되는 모든 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "개체(individual)" 및 "대상체(subject)"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수의 실시양태들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개체" 및 "대상체"는 특정 연령을 나타내는 것은 아니며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 발명의 실시양태에서, "개체" 또는 "대상체"는 "환자"이다.
용어 "환자"는 치료가 필요한 개체 또는 대상체, 구체적으로 질환에 걸린 개체 또는 대상체를 의미한다.
본원에 참조된 문헌 및 연구에 대한 언급이 전술한 임의의 내용이 선행 기술에 해당한다는 인정을 의도하는 것을 아니다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원에 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관해 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.
후술하는 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 실시양태들을 구성 및 이용할 수 있도록 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본원에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 실시양태들의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용할 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태들은 본원에 기술된 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합되는 것으로 의도된다.
실시예
이하의 실시예들은 Lonza의 P. pastoris 발현 플랫폼에서 ruLAPII(ruLAPII_short) 및 ruDPPIV(ruDPPIV_short)의 짧은 변이체 생산을 테스트하기 위해 수행된 스크리닝 작업을 설명한다. ruLAPII 및 ruDPPIV의 이러한 변이체를 정제하고 전장 변이체와 함께 효소 활성(U/mg 정제 단백질)에 대해 테스트했다. 정제된 단축 변이체를 온전한 분자 질량 분광법으로 분석했다.
ruDPPIV_short
균주 배경 LP1에서 23개의 PAOX1 클론을 SDS PAGE/쿠마시 염색 및 효소 활성(AMC 검증; Amyra에서 제공하는 SOP)을 사용하여 배양 배지로의 ruDPPIV_short 분비에 대해 분석했다. 몇 가지 유망한 클론이 최대 2'032 U/L[참조 균주 LP1(pCKP6003.1) = 4'325 U/L]의 효소 활성과 참조 균주보다 낮은 제품 역가를 가진 것으로 확인되었다. 고밀도 세포 발효(Ambr250)에서 참조 균주와 함께 5개 클론을 테스트했다. 효소 활성은 최대 9'056 U/L[참조 균주 LP1(pCKP6003.1) = 21'586 U/L]였으며 참조 균주보다 제품 역가가 낮았다. 생산물 ruDPPIV[균주 LP1(pCKP6003.1)에서 발현됨] 및 ruDPPIV_short[균주 LP1(pFJP6015.6)에서 발현됨]을 배양 상청액으로부터 정제하고 활성을 측정하였다. 유사한 특정 생산성이 측정되었다.
·ruDPPIV_short: 12.7 U/mg
·ruDPPIV 전장: 12.4 U/mg
정제된 ruDPPIV 및 ruDPPIV_short를 탈당화하고 질량 분광법을 통해 가능한 분해에 대해 분석했다.
·ruDPPIV_short: 전장 산물 및 분해 산물이 관찰됨
·ruDPPIV 전장: 분해 산물만 관찰됨
ruLAPII_short
균주 배경 LP1에서 23개의 PAOX1 클론을 SDS PAGE/쿠마시 염색 및 효소 활성(AMC 검정; Amyra에 의해 제공되는 SOP)을 사용하여 배양 배지로의 ruLAPII_short의 분비에 대해 분석하였다. 최대 26 U/L[참조 균주 LP1(pCKP6011.4) = 174 U/L]의 효소 활성 및 참조 균주보다 낮은 생산물 역가를 갖는 몇몇 유망한 클론이 확인되었다. 고밀도 세포 발효(Ambr250)에서 참조 균주와 함께 5개 클론을 테스트했다. 효소 활성은 최대 371 U/L였다[참조 균주 LP1(pCKP6011.4) = 1'212 U/L]. 생산물 ruLAPII[균주 LP1(pCKP6011.4)에서 발현됨] 및 ruLAPII_short[균주 LP1(pFJP6014.13)에서 발현됨]을 배양 상등액으로부터 정제하고 활성을 측정하였다. 짧은 변이체의 비활성은 야생형 ruLAPII의 비활성보다 약간 낮았다.
·ruLAPII_short: 1.1 U/mg
·ruLAPII 전장: 1.5 U/mg
정제된 ruLAPII 및 ruLAPII_short를 탈당화하고 질량 분광법을 통해 가능한 분해에 대해 분석했다.
·ruLAPII_short: 오직 전장 산물만 관찰되고 분해산물은 관찰되지 않음
·ruLAPII 전장: 분해 산물만 관찰됨
실시예 1: 물질 및 방법
1. 균주 및 플라스미드
1.1 대장균 균주
DH10B(Invitrogen, Cat. No. 18297-00)를 모든 클로닝 단계에서 사용했다.
1.2 피키아 파스토리스 균주
모든 P. pastis 발현 연구는 균주 LP1로 수행되었다. 유전자형 설명은 요청 시 공유할 수 있다.
1.3 플라스미드
PAOX1 플라스미드 pFJP6014는 pXSP603 벡터의 선형 ~3085 bp SbfI/SfiI 단편과 ATUM400860의 선형 1480 bp SbfI/SfiI 소화 단편(짧은 ruLAPII 변이체 포함)의 라이게이션에 의해 구성되었다.
PAOX1 플라스미드 pFJP6015는 pXSP603 벡터의 선형 ~3085 bp SbfI/SfiI 단편과 ATUM400861의 선형 2314 bp SbfI/SfiI 소화 단편(짧은 ruDPPIV 변이체 포함)의 라이게이션에 의해 구성되었다.
이어서, 화학적으로 적격인 DH10B 세포를 라이게이션 믹스로 형질전환시켰다. 제한 분해(digest) 분석 후, 새로 생성된 플라스미드의 관심 유전자를 시퀀싱으로 확인하고 후속 다중 복제 스크리닝을 위해 균주 LP1을 플라스미드 pFJP6014 및 pFJP6015로 형질전환했다.
플라스미드 ID 프로모터 신호 펩티드 산물
pFJP6014 PAOX1 SP_long ruLAPII_short
pFJP6015 PAOX1 SP_short ruDPPIV_short
상기 표 1은 P. Pastoris 플라스미드의 개요로서, 모든 플라스미드는 동일한 벡터 백본과 Zeocin™ 저항 마커를 포함한다.
2. 유전자
5' 및 3' 측의 누락된 코돈을 제외하고 원 ruLAPII 서열(즉, 플라스미드 pCKP6011)에서 파생된 ruLAPII_short 산물의 DNA 서열(섹션 3.1 및 3.2 참조).
5' 및 3' 측에서 누락된 코돈을 제외하고 원 ruDPPIV 서열(즉, 플라스미드 pCKP6003)에서 파생된 ruDPPIV_short 산물의 DNA 서열(섹션 3.3 및 3.4 참조).
3. 단백질 서열
3.1 ruLAPII
이탤릭체는 해당 짧은 변형체에서 누락된 아미노산을 나타낸다.
HPVVGQEPFGWPFKPMVTQDDLQNKIKLKDIMAGVEKLQSFSDAHPEKNRVFGGNGHKDTVEWIYNEIKATGYYDVKKQEQVHLWSHAEAALNANGKDLKASAMSYSPPASKIMAELVVAKNNGCNATDYPANTQGKIVLVERGVCSFGEKSAQAGDAKAAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDKRHVPTAGLSQEDGKNLATLVASGKIDVTMNVISLFENRTTWNVIAETKGGDHNNVIMLGAHSDSVDAGPGINDNGSGSIGIMTVAKALTNFKLNNAVRFAWWTAEEFGLLGSTFYVNSLDDRELHKVKLYLNFDMIGSPNFANQIYDGDGSAYNMTGPAGSAEIEYLFEKFFDDQGIPHQPTAFTGRSDYSAFIKRNVPAGGLFTGAEVVKTPEQVKLFGGEAGVAYDKNYHRKGDTVANINKGAIFLNTRAIAYAIAEYARSLKGFPTRPKTGKRDVNPQYSKMPGGGCGHHTVFM
이론적 분자량: 51843.34 이론적 pI: 6.73
3.2 ruLAPII 짧은 변이체
EPFGWPFKPMVTQDDLQNKIKLKDIMAGVEKLQSFSDAHPEKNRVFGGNGHKDTVEWIYNEIKATGYYDVKKQEQVHLWSHAEAALNANGKDLKASAMSYSPPASKIMAELVVAKNNGCNATDYPANTQGKIVLVERGVCSFGEKSAQAGDAKAAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDKRHVPTAGLSQEDGKNLATLVASGKIDVTMNVISLFENRTTWNVIAETKGGDHNNVIMLGAHSDSVDAGPGINDNGSGSIGIMTVAKALTNFKLNNAVRFAWWTAEEFGLLGSTFYVNSLDDRELHKVKLYLNFDMIGSPNFANQIYDGDGSAYNMTGPAGSAEIEYLFEKFFDDQGIPHQPTAFTGRSDYSAFIKRNVPAGGLFTGAEVVKTPEQVKLFGGEAGVAYDKNYHRKGDTVANINKGAIFLNTRAIAYAIAEYARSLKGFPTRPKTGK
이론적 분자량: 48695.79 이론적 pI: 6.62
3.3 ruDPPIV
이탤릭체는 해당 짧은 변형체에서 누락된 아미노산을 나타낸다.
IVPPREPRSPTGGGNKLLTYKECVPRATISPRSTSLAWINSEEDGRYISQSDDGALILQNIVTNTNKTLVAADKVPKGYYDYWFKPDLSAVLWATNYTKQYRHSYFANYFILDIKKGSLTPLAQDQAGDIQYAQWSPMNNSIAYVRGNDLYIWNNGKTKRITENGGPDIFNGVPDWVYEEEIFGDRFALWFSPDGEYLAYLRFNETGVPTYTIPYYKNKQKIAPAYPRELEIRYPKVSAKNPTVQFHLLNIASSQETTIPVTAFPENDLVIGEVAWLSSGHDSVAYRAFNRVQDREKIVSVKVESKESKVIRERDGTDGWIDNLLSMSYIGNVNGKEYYVDISDASGWAHIYLYPVDGGKEIALTKGEWEVVAILKVDTKKKLIYFTSTKYHSTTRHVYSVSYDTKVMTPLVNDKEAAYYTASFSAKGGYYILSYQGPNVPYQELYSTKDSKKPLKTITSNDALLEKLKEYKLPKVSFFEIKLPSGETLNVKQRLPPNFNPHKKYPVLFTPYGGPGAQEVSQAWNSLDFKSYITSDPELEYVTWTVDNRGTGYKGRKFRSAVAKRLGFLEAQDQVFAAKEVLKNRWADKDHIGIWGWSYGGFLTAKTLETDSGVFTFGISTAPVSDFRLYDSMYTERYMKTVELNADGYSETAVHKVDGFKNLKGHYLIQHGTGDDNVHFQNAAVLSNTLMNGGVTADKLTTQWFTDSDHGIRYDMDSTYQYKQLSKMVYDQKQRRPESPPMHQWSKRVLAALFGERAEE
이론적 분자량: 86486.34 이론적 pI: 8.05
3.4 ruDPPIV short variant
VPPREPRSPTGGGNKLLTYKECVPRATISPRSTSLAWINSEEDGRYISQSDDGALILQNIVTNTNKTLVAADKVPKGYYDYWFKPDLSAVLWATNYTKQYRHSYFANYFILDIKKGSLTPLAQDQAGDIQYAQWSPMNNSIAYVRGNDLYIWNNGKTKRITENGGPDIFNGVPDWVYEEEIFGDRFALWFSPDGEYLAYLRFNETGVPTYTIPYYKNKQKIAPAYPRELEIRYPKVSAKNPTVQFHLLNIASSQETTIPVTAFPENDLVIGEVAWLSSGHDSVAYRAFNRVQDREKIVSVKVESKESKVIRERDGTDGWIDNLLSMSYIGNVNGKEYYVDISDASGWAHIYLYPVDGGKEIALTKGEWEVVAILKVDTKKKLIYFTSTKYHSTTRHVYSVSYDTKVMTPLVNDKEAAYYTASFSAKGGYYILSYQGPNVPYQELYSTKDSKKPLKTITSNDALLEKLKEYKLPKVSFFEIKLPSGETLNVKQRLPPNFNPHKKYPVLFTPYGGPGAQEVSQAWNSLDFKSYITSDPELEYVTWTVDNRGTGYKGRKFRSAVAKRLGFLEAQDQVFAAKEVLKNRWADKDHIGIWGWSYGGFLTAKTLETDSGVFTFGISTAPVSDFRLYDSMYTERYMKTVELNADGYSETAVHKVDGFKNLKGHYLIQHGTGDDNVHFQNAAVLSNTLMNGGVTADKLTTQWFTDSDHGIRYDMDSTYQYKQLSKMVYDQKQRRPESPPMHQWS
이론적 분자량: 84931.48 이론적 pI: 7.77
4. 1차 스크리닝
4.1 다중 복사 스크리닝
DraI로 플라스미드를 선형화한 후, 균주 LP1을 플라스미드 pFJP6014(ruLAPII_short) 및 pFJP6015(ruDPPIV_short)로 형질전환하고 다양한 농도의 Zeocin™(Invitrogen, Cat. No. ant-zn-1) (500 및 1000μg/mL)을 함유하는 아가 플레이트에 도말했다. 30°C에서 48시간 동안 배양한 후, 숙주/플라스미드 통합당 23개의 클론을 선택하고 마스터 플레이트(100μg/mL Zeocin™ 함유)에 스트리킹하고 24웰 플레이트에서 후속 발현 스크리닝을 했다.
4.2 24웰 플레이트에서의 발현
농축 다당류(50g/L, EnPump200, EnPresso, 독일) 및 14 U/L 농축 효소 혼합물(EnPump200, EnPresso, 독일)가 보충된 YPC(효모 추출물, 펩톤, 100mM 구연산나트륨, pH 6.0) 배지가 포함된 24개의 웰 플레이트(GE Healthcare Life sciences; Cat. No. 7701-5102)에서 발현 실험을 수행했다. 본 배양액(2mL)을 YPG(Yeast Peptone Glycerol)에서 30°C에서 성장한 오버나이트 배양액으로 출발 OD600를 2로 하여 접종했다. 이어서, 배양물을 25°C에서 접종하고 260rpm 진탕하여 72시간 동안 12시간마다 반복된 메탄올 샷(1%)에 의한 유도를 행했다.
5. 고 세포 밀도 발효
배지는 Gasser(Gasser et al. 2013; Future Microbiol., 8(2): 191-208) 및 Prielhofer(Prielhofer et al. 2013, Microbial Cell Factories 12:5)에서 변형된 배지를 기반으로 하며, 3g kg-1 펩톤(Biokar, Cat.No. A1601)을 함유한다. 시약 및 용액은 어두운 조건에서 4°C에 보관된 PTM1, -4°C에 보관된 비오틴, 4°C에 보관된 비오틴 용액을 제외하고 실온에서 보관된다. 달리 명시되지 않는 한 시약은 Merck(Darmstadt, Germany)에서 공급되었다.
5.1 사전 배양
본 발효를 위한 접종물을 생산하기 위해 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 각 균주에 대해 100mL의 사전 배양 배지를 500mL 배플 진탕 플라스크에 채우고 1mL의 -80°C 글리세롤 스톡 배양액을 접종했다. 진탕 플라스크를 오비탈 진탕기(K
Figure pct00001
hner ISF-1-W)에서 170rpm(Ψ 25mm) 및 30°C에서 21시간(±2시간) 동안 배양했다. 접종물을 생물반응기로 옮기기 직전에 현미경(Nikon Eclipse)으로 배양물의 무균 상태를 확인하였다. 본 발효는 초기 광학 밀도 1로 발효기에 접종하여 상기 사전 배양에서부터 시작되었다.
5.2 본 발효
주변부, 배지 및 용액을 준비한 후, 생물반응기를 배치 배지 90mL로 채우고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브한 다음 Ambr250 스테이션에 설치했다. 탄소 기질 및 염기의 첨가를 위한 공급 시스템을 70% 에탄올, 2M 수산화나트륨 및 탈염수로 각각 30분 동안 헹구어 세척했다. PAOX1 균주의 pH 조절을 위해 산(인산)과 염기(암모니아)를 사용하였다. 공기와 산소를 사용한 교반 및 통기에 대한 설정값은 용존 산소 값이 25%에서 40% 사이로 유지되는 방식으로 작동하는 캐스케이드 제어기에 의해 결정된다.
5.3 발효의 설정 및 전략
~1의 초기 광학 밀도와 글리세롤 농도는 배치 단계의 지속 시간(배치 단계의 길이)을 미리 결정한다.
ruLAPII_short
발효는 Lonza SOP143961-2 및 리포트 2014.157(S. Bieli 및 N. Krumov, 2014)에 따라 수행되었다.
배치 단계 후 본 발효는 바이오매스 생성 단계와 표적 단백질 생산 단계로 나뉜다(도 2 참조). 5시간 동안 12 mL·L-1 BV h-1 의 일정한 글리세롤 공급(45%)이 유가식(fed-batch) 단계 1 동안 수행된다. 이 단계 다음에는, 한편으로는 완전한 글리세롤 고갈을 목표로 하고 다른 한편으로는 보류 중인 메탄올 공급을 위한 세포 대사의 적응을 목표로 해서, 발효기에 피딩되지 않는 약 30분의 짧은 기아 기간이 뒤따른다. 이 생산 단계는 30 °C에서 26 °C로 온도가 이동하고 5 mL·L-1 BV h-1의 일정한 메탄올 공급이 시작되면서 시작된다.
ruDPPIV_short
발효는 Lonza SOP143601-2 및 리포트 2014.157(S. Bieli 및 N. Krumov, 2014)에 따라 수행되었다.
배치 단계(pH 5.2) 후 본 발효는 바이오매스 생성 단계와 표적 단백질 생산 단계로 나뉜다(도 3 참조). 6시간 동안 12 mL·L-1 BV h-1의 일정한 글리세롤 공급(45%)이 유가식 단계 1 동안 수행된다. 이 단계 다음에는, 한편으로는 완전한 글리세롤 고갈을 목표로 하고 다른 한편으로는 보류 중인 메탄올 공급을 위한 세포 대사의 적응을 목표로 해서, 발효기에 피딩이 되지 않는 약 30분의 짧은 기아 기간이 뒤따른다. 이 생산 단계는 온도가 30 °C에서 24.2 °C로 바뀌고 6.5 mL·L-1 BV h-1의 공급 속도에 도달할 때까지 기하급수적 메탄올 공급이 시작되고 발효가 끝날 때까지 계속된다.
Ambr250 시스템을 사용한 발효는 다양한 공급의 자동 시작(배치 단계 끝에서 DO-스파이크 감지) 및 다양한 공급 단계의 프로그래밍된 지속 시간을 허용하는 맞춤형 프로그래밍 스크립트를 사용하여 실행되었다. 발효 매개변수는 IRIS 공정 제어 시스템에 의해 제어되고 기록되었다.
6. 다운스트림 정제
정제는 "GLH-003:DPP4 및 LAP2 단계 용리 타당성" 프레젠테이션(프레젠테이션; A. Zurbriggen et al., 2016) 및 데모 실행의 블록 흐름도를 기반으로 단순화된 배치 모드를 사용하여 수행되었다.
ruLAPII_short
정제는 "LAP2_BFD_Demonstration Runs_01"(A. Zurbriggen, 2016)에 따라 배치 모드에 맞게 조정되었다. 4000rpm, 4°C에서 45분 동안 배양액을 발효 및 원심분리한 후, 100μL Halt 프로테아제 저해제 - 1회 사용 칵테일(100x)(Thermo Scientific, Cat.No. 78430)을 12mL EoF 배양 상층액에 첨가했다.
수지 준비
1mL SP Sepharose® XL(GE Healthcare, Cat.No. GE17-5073-01, 결합 용량 5-10mg/mL)을 15mL Falcon 튜브에 첨가하고 혼합했다. 이어서, Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 수지 세척액을 10mL MQ 물로 세척하고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하고 평형화를 위해 pH 5.0의 50mM 아세트산 나트륨 10mL를 첨가하였다. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 피펫팅을 통해 수지의 상청액을 제거하고 수지를 50mM 아세트산 나트륨(pH 5.0) 10mL로 다시 세척하였다.
샘플 배양
1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 수지의 상층액을 피펫팅으로 제거하고 수지를 12mL EoF 배양 상층액과 함께 실온에서 30분 동안 락킹 쉐이커에서 배양했다. 상기 배양 후, Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거했다.
세척
수지를 20mM 인산나트륨(pH 6.0) 10mL로 세척하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하였다. 세척 후 Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거했다.
용출
20mM 인산나트륨 2mL, pH 6.0, 130mM NaCl을 수지에 첨가하고 10분 동안 실온에서 락킹 쉐이커에서 배양했다. 이어서 Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 후속 분석을 위해 -20°C에 보관했다.
ruDPPIV_short
정제는 " DPP4_BFD_Demonstration Runs_01"(A. Zurbriggen, 2016)에 따라 배치 모드에 맞게 조정되었다. 4000rpm, 4°C에서 45분 동안 배양액을 발효 및 원심분리한 후, 100μL Halt 프로테아제 저해제 - 1회 사용 칵테일(100x)(Thermo Scientific, Cat.No. 78430)을 12mL EoF 배양 상층액에 첨가했다.
수지 준비
1mL SP Sepharose® XL(GE Healthcare, Cat.No. GE17-5073-01, 결합 용량 5-10mg/mL)을 15mL Falcon 튜브에 첨가하고 혼합했다. 이어서, Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 수지 세척액을 10mL MQ 물로 세척하고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하고 평형화를 위해 pH 7.2의 25mM Tris 10mL를 첨가하였다. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 피펫팅을 통해 수지의 상청액을 제거하고 수지를 25mM Tris (pH 7.2) 10mL로 다시 세척하였다.
샘플 배양
1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 수지의 상층액을 피펫팅으로 제거하고 수지를 12mL EoF 배양 상층액과 함께 실온에서 30분 동안 락킹 쉐이커에서 배양했다. 상기 배양 후, Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거했다.
세척
수지를 10mL 25mM Tris, pH 7.2, 20mM NaCl로 세척하고, 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하였다. 세척 후 Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거했다.
용출
2mL 25mM Tris, pH 7.2, 130mM NaCl을 수지에 첨가하고 락킹 쉐이커에서 실온에서 10분 동안 배양했다. 이어서 Falcon 튜브를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 분리하여 후속 분석을 위해 -20°C에 보관했다.
7. 분석 방법
7.1 샘플 처리
(1mL 샘플)를 4°C에서 5분 동안 6000g에서 원심분리하여 제거하고 상청액을 회수했다. 샘플을 직접 분석하거나 나중에 테스트하기 위해 -80°C에 보관했다.
7.2 균체 중량
균체 중량을 측정하기 위해 발효 현탁액 1mL를 미리 칭량한 튜브에 옮겼다. 샘플을 15분 동안 15,000g에서 원심분리하고 상청액을 분리했다. 그 후, 튜브의 무게를 측정하고 균체 중량을(g L-1)(현재 발효 부피당 바이오매스)을 계산했다.
7.3 건조 중량
건조 중량 측정을 위해 1mL 샘플을 17,000g(4°C)에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 버리고 생성된 펠릿을 100 °C에서 48시간 동안 건조시켰다. 생성된 건조 중량(g L-1)(현재 발효 부피당 바이오매스)을 계산했다.
7.4 광학 밀도
바이오매스 농도는 광 분광계의 선형 범위(OD600 = 0.05와 OD = 0.5 사이)내의 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 결정되었다. 요약하면, 배양액 10μL를 96웰 플레이트(VWR, Cat. No 732-2746)에 첨가하고 Starlet 액체 핸들러(해밀턴, Bonaduz, 스위스)를 사용하여 PBS(190μL)로 희석했다(희석 계수 1:20). 이어서, 600nm에서의 광학 밀도를 Tecan Infinite 판독기로 측정했다. 블랭크(blank)로서 200μL YPC 배지를 사용했다.
7.5 SDS PAGE / 쿠마시 염색에 의한 생산물 검출
SDS-PAGE는 환원 조건에서 실행되었다. 사전 캐스팅 기준 12% Bis-Tris SDS 겔(Bio-Rad, Cat. No. 567-1124)을 MES 버퍼(Bio-Rad, Cat. No. 161-0796)와 함께 사용했다. 샘플을 NuPAGE 4x LDS 로딩 버퍼(Invitrogen, Cat. No. NP0007)와 혼합하고 95°C에서 5분 동안 배양했다. 레인당 7.5μL 샘플(10μL 배양 상청액 + 5μL 4x LDS 로딩 버퍼)을 로딩했다. 분자량 표준으로 Mark12(Invitrogen, Cat. No. LC5677)를 로딩했다. 참조로서, 1 μg 재조합 ruLAPII(Biomeva LAP-2 100.6 mg/ml)이 로딩되었다. 전기영동은 200V에서 약 80분 동안 수행되었다. 분리된 단백질은 GelCode Blue Stain Reagent(Thermo Scientific, Cat. No. 24592)로 1-2시간 동안 염색하여 시각화하고 밤새 물로 탈색했다.
7.6 AMC 활성 검증
활성 테스트는 96웰 플레이트(GreinerOne, Cat.No. 655900)에서 수행되었다. 기질로는 ruDPPIV의 경우 10mM Gly-Pro-AMC(Bachem, Cat.No. I1225) 또는 ruLAPII의 경우 10mM Leu-AMC 염산염(Bachem, Cat.No. I1245)을 사용하였다. 반응 완충액은 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5, 1mM CoCl2; 1% BSA)을 사용하였다. 표준으로서, 1mM AMC(EtOH에 가용화됨, Bachem, Cat.No. Q-1025)는 반응 완충액에 희석된 0nM 내지 10,000nM의 최종 농도로 사용되었다. 형광이 AMC 표준 곡선 내에 있도록 샘플(무세포 배지)를 1/400에서 1/2500 사이로 희석했다. 간략하게, 10μL 샘플을 10μL 기질(최종 농도: 1mM)과 함께 90μL 반응 완충액에 첨가하였다. 측정은 다음 설정으로 수행되었다:
온도: 25 °C
여기: 370 nm
방출: 460 nm
반응 지속시간: 30 분
측정 간격: 30 초
7.7 BCA 검증(단백질 농도)
단백질 측정은 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 적합한 제조업체(Pierce BCA 단백질 검증 키트, Cat.No. 23227)에 따라 수행되었다.
7.8 PNGase 분해(digest)(탈당화)
제조업체(NEB Rapid PNGase F; Cat.No. P0710S)에 따라 탈당화를 수행했다. 간략하게, 용출 샘플 15μL를 5μL Rapid PNGase F 완충액(5X)에 첨가하고 80°C에서 2분 동안 배양했다. 식힌 후, 1 μL Rapid PNGase F를 첨가하고 50 °C에서 10분 동안 배양했다.
7.9 샘플 탈염
간략하게, Amicon Ultra -0.5mL, 30K에 대해 제조업체(Merck, Cat.No. UFC503096)에 따라 탈염을 수행했다. 간략하게, 5개의 PNGase F 분해 샘플을 풀링하고(총 100μL) 25mM Tris, pH 7.2로 최대 500μL를 채웠다. 그 후, 튜브를 4°C에서 10분 동안 14,000g에서 원심분리했다. 상청액을 분리하였다. 그런 다음, 20 μL 25mM Tris, pH 7.2를 필터에 첨가하고 4°C에서 10분 동안 14,000g에서 원심분리했다. 두 샘플 모두 후속 분석을 위해 풀링되었다.
7.10 질량 분광법
분석은 B-Fabric(Functional Genomics Center Zurich)에서 수행되었다. 간략하게, 이전 ESI-MS 분석에서는 샘플을 C4 Zip Tips(Millipore, USA)을 사용하여 탈염하고 MeOH:2-PrOH:0.2% FA(30:20:50)에서 분석했다. 용액을 1 μL/min의 유속으로 용융 실리카 모세관(ID75 μm)을 통해 주입하고 PicoTips(ID30 μm)를 통해 분무했다. 마지막은 New Objective (Woburn, MA)에서 얻었다. 샘플의 나노 ESI-MS 분석은 Synapt G2_Si 질량 분석기에서 수행되었으며 데이터는 MassLynx 4.2 소프트웨어(모두 Waters, UK)로 기록되었다. 질량 스펙트럼은 1초의 스캔 기간과 0.1초의 스캔 간 지연으로 100~5000da의 m/z 범위를 스캔하여 양이온 모드에서 획득했다. 스프레이 전압은 3kV, 콘 전압은 50V, 소스 온도는 80°C로 설정되었다. 4개의 샘플 모두 추가 샘플 준비 없이, 즉, 단순히 스틸 타킷에 적용되는 것으로, MALDI-MS에 의해 분석되었다.
7.11 글리세롤 스톡 배양
2차 스크리닝 실험에 사용된 -80°C 스톡 배양액은 다음 프로토콜에 따라 준비되었다:
본 배양균의 접종:
·20mL YPD 배지를 100mL 진탕 플라스크로 옮김
·20 μL Zeocin™(InvivoGen; Cat No. ant-zn-1)(100 mg/mL)을 추가함; 최종 농도: 100㎍/mL
·플레이트에서 콜로니 루프로 접종
· 약 20시간 동안 30°C, 200rpm에서 배양함
-80°C에서 보관하기 위한 본 배양 준비:
·광학 밀도(OD600)를 측정함, 예상 OD600은 40 - 50임
·850μL 배양액을 150μL 글리세롤(100%)을 함유하는 Nunc 1.8mL Cryo 튜브에 추가함
·반전하여 혼합
·-80°C에서 보관
실시예 2: 1차 스크리닝
선형화된 플라스미드 pFJP6015(ruDPPIV_short) 및 pFJP6014(ruLAPII_short)로 P. pastoris 균주를 형질전환한 후, 콜로니를 선택하고 2mL YPC 배지를 포함하는 24웰 플레이트에 접종했다. 명확하게 분리된 콜로니만을 취하였다. 총 46개 클론(생산물당 23개 클론)을 25°C, 260rpm에서 배양하고 pH 6.0에서 성장시키고 72시간 동안 12시간마다 메탄올(1%)의 반복 샷으로 유도했다. 참고로, 전구체 균주 LP1(pCKP6003.1, ruDPPIV) 및 LP1(pCKP6011.4, ruLAPII)이 포함되었다.
이어서, 클론의 배양 상등액을 SDS PAGE/쿠마시 염색 및 효소 활성(AMC 검증)을 통해 분석하였다.
1. ruDPPIV_short variant
pH 6.0에서 성장한 모든 LP1(pCKP6015) 클론의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% SDS PAGE 겔에 로딩하였다. 참조로서, 참조 균주 LP1(pCKP6003.1, ruDPPIV)의 배양 상청액을 로딩하였다(도 4, 레인 26).
도 4A에 나타낸 바와 같이, 여러 클론의 배양 상청액은 참조 균주 LP1(pCKP6003.1)과 동일한 높이에서 밴드를 나타냈다(도 4, 레인 26). 강력한 ruDPPIV_short 생산물은 클론 LP1(pCKP6015.8)(도 4, 레인 6), LP1(pCKP6015.6)(도 4, 레인 13), LP1(pCKP6015.12)(도 4, 레인 14), LP1(pCKP6015.15)(도 4, 레인 19) 및 LP1(pCKP6015.18)(도 4, 레인 25)의 배양 상청액에서 발견될 수 있었다. 가장 강한 생산물 밴드를 가진 클론의 경우, 참조 균주 LP1(pCKP6003.1)에서 발견된 결과와 유사하게 응집체 형성이 관찰되었으며(도 4, 레인 6, 13, 14, 19 및 25를 레인 26과 비교), 이는 짧은 변이체가 전장 ruDPPIV와 유사한 응집체(대부분 ruDPPIV 이량체)를 형성할 수 있음을 나타낸다. 가장 강한 생산물 양은 참조 균주 LP1(pCKP6003.1)에서 발견된 생산물 양의 대략 절반인 것으로 시각적으로 결정된 클론 LP1(pFJP6015.8)에서 발견되었다.
모든 클론의 배양 상청액을 AMC 검증을 사용하여 효소 활성에 대해 분석하였다(실시예 1, 섹션 7.6 참조). 예상한 바와 같이, 가장 높은 생산물 역가를 나타내는 클론의 배양 상등액은 또한 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. 가장 높은 활성은 클론 LP1(pFJP6015.8)의 배양 상청액(2032 U/L)에서 발견되었으며, 이는 참조 균주 LP1(pCKP6003.1)에서 측정된 활성(4325 U/L)의 대략 절반이었다. 참조 클론 LP1(pCKP6003.1)은 초기 스크리닝(3977 U/L, ResRep 2014.111)에서와 같이 재현 가능한 활성을 보였다. 요약하면, 데이터는 ruDPPIV의 짧은 변이체가 여전히 효소적으로 활성임을 시사했다.
2. ruLAPII_short variant
pH 6.0에서 성장한 모든 LP1(pCKP6014) 클론의 배양 상청액을 환원 조건 하에서 12% SDS PAGE 겔에 로딩하였다. 참고로, 참조 균주 LP1(pCKP6011.4, ruLAPII)(도 5, 레인 26) 및 정제된 ruLAPII(Biomeva LAP-2 100.6 mg/mL)의 배양 상청액을 로딩하였다.
ruDPPIV를 생성하는 클론과 대조적으로, ruLAPII를 생성하는 클론의 배양 상청액에서는 생산물 양이 없거나 매우 적었다(도 5A), 이는 ruLAPII의 강력한 글리코실화(즉, 날카로운 밴드가 아니라 흐릿한 밴드)로 인해 정량화하기 어렵기 때문으로 설명될 수 있다. 이렇게 높은 생산자를 식별하기 어려움에도 불구하고 여러 클론이 유망한 결과를 보였다: LP1 (pFJP6014.6) (도 5, lane 13), LP1 (pFJP6014.12) (도 5, 레인 14), LP1 (pFJP6014.13) (도 5, 레인 15), LP1 (pFJP6014.20) (도 5, 레인 18) and LP1 (pFJP6014.15) (도 5, 레인 19). 전반적으로, ruLAPII_short 클론에 의해 분비된 생산물의 양은 참조 균주 LP1(pCKP6011.4)에 비해 상당히 낮았다.
모든 클론의 배양 상청액을 AMC 검정을 사용하여 효소 활성에 대해 분석하였다(실시예 1, 섹션 7.6 참조). 예상한 바와 같이, 가장 높은 생산물 역가를 나타내는 클론의 배양 상등액은 또한 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. 가장 높은 활성은 클론 LP1(pFJP6014.13)의 배양 상청액(26.1 U/L)에서 발견되었으며, 이는 참조 균주 LP1(pCKP6011.4)에서 측정된 활성의 약 15%(173.8 U/L)였다. 참조 클론은 초기 스크리닝에서와 유사한 활성을 보였다(158.4 U/L; ResRep 2014.111). 요약하면, 데이터는 짧은 변이체가 여전히 효소적으로 활성화되어 있음을 시사했다.
실시예 3: 2차 스크리닝
AOX1 프로모터를 사용한 발현은 제한된 메탄올 공급에 의해 유도된다. 약 24 - 28시간의 회분식 단계(pO2 스파이크로 표시됨) 다음에는 바이오매스를 증가시키기 위한 글리세롤 유가식 단계가 이어진다. 글리세롤 공급 12시간 후, ruDPPIV 또는 ruLAPII에 대한 발효 프로토콜에 따라 메탄올 공급이 시작된다. ruDPPIV 또는 ruLAPII의 짧은 변이체 중 하나의 5개 클론 외에, 직접 비교를 위해 참조 균주가 포함되었다.
Ambr250 발효를 위한 매개변수 설정
균주 생산물 1차 스크리닝 효소 활성 [U/L]
LP1 (pFJP6015.8) ruDPPIV_short 2032
LP1 (pFJP6015.6) ruDPPIV_short 1898
LP1 (pFJP6015.18) ruDPPIV_short 1614
LP1 (pFJP6015.12) ruDPPIV_short 1394
LP1 (pFJP6015.15) ruDPPIV_short 1353
LP1 (pCKP6003.1) ruDPPIV 4325
LP1 (pFJP6014.13) ruLAPII_short 26.1
LP1 (pFJP6014.20) ruLAPII_short 19.3
LP1 (pFJP6014.6) ruLAPII_short 11.6
LP1 (pFJP6014.12) ruLAPII_short 14.1
LP1 (pFJP6014.15) ruLAPII_short 7.1
LP1 (pCKP6011.4) ruLAPII 173.8
1. ruDPPIV_short
1.1 바이오매스 생성
모든 발효 작업의 세포 밀도와 건조 중량을 서로 비교했다. 모든 발효에 대한 배치 단계의 기간은 45g L-1 글리세롤의 초기 글리세롤 농도 및 모든 균주에 대한 1의 시작 OD600에 의해 미리 결정되었으며, 배치 단계는 18시간에서 20시간 사이에 종료되었다(pO2 스파이크로 표시됨). 이어서, 글리세롤 공급이 12시간 동안 시작되었고, 이어서 메탄올 공급이 이어졌다. 전체 발효 시간은 78시간이었다.
바이오매스의 유의한 차이(중앙 WCW로부터 10% 미만의 편차 및 중앙 DCW로부터 1% 미만의 편차)는 발효 말기에 관찰되지 않았다. 이는 해당 균주가 ruDPPIV의 짧은 변이체에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 광학 밀도에서 약간의 차이가 관찰되었지만 배양의 높은 세포 밀도로 인해 분석 오류일 가능성이 가장 높았다(도 6).
1.2 P생산물 생성
ruDPPIV_short 생산물 증가를 조사하고 각각 가장 유망한 균주를 확인하기 위해 발효 작업을 따라 여러 샘플을 채취했다. 세포를 원심분리하고 배양 상청액을 분리하였다. 이어서 대표 샘플을 SDS PAGE/쿠마시 염색을 통해 분석했다.
1차 스크리닝 데이터에서 예상한 바와 같이, ruDPPIV_short의 생산물 역가는 전체 길이 제품 ruDPPIV에 비해 현저히 감소했다(도 7, 녹색 라인을 다른 라인과 비교). 가장 우수한 생산을 보이는 ruDPPIV_short 클론[클론 LP1(pFJP6015.15)이 없음]의 배양 상청액을 서로 비교했을 때 활성에서 유의한 차이는 관찰되지 않았으며; 즉, 효소 활동 범위는 7'276.6 U/L과 9'055.6 U/L 사이였다. 야생형 균주 LP1(pCKP6003.1)과 비교할 때, 가장 잘 생산하는 ruDPPIV_short 클론의 활성은 참조 균주 LP1(pCKP6003.1)(21'586 U/L)의 약 50%였다(도 7). 참조 클론 LP1(pCKP6003.1)의 활성은 이전 데이터(25'000 U/L; 10 L Infors, 리포터 2014.157)와 일치했다.
2. ruLAPII_short
2.1 바이오매스 생성
모든 발효 작업의 세포 밀도와 건조 중량을 서로 비교했다. 모든 발효에 대한 배치 단계의 기간은 45g L-1 글리세롤의 초기 글리세롤 농도 및 모든 균주에 대한 1의 시작 OD600에 의해 미리 결정되었으며, 배치 단계는 18시간에서 20시간 사이에 종료되었다(pO2 스파이크로 표시됨). 이어서, 글리세롤 공급이 12시간 동안 시작되었고, 이어서 메탄올 공급이 이어졌다. 전체 발효 시간은 78시간이었다.
바이오매스의 유의한 차이(중앙 WCW로부터 10% 미만의 편차 및 중앙 DCW로부터 1% 미만의 편차)는 발효 말기에 관찰되지 않았다. 이는 짧은 변이체를 생성하는 클론이 전장 ruLAPII를 생성하는 클론과 유사하게 성장함을 나타낸다. 광학 밀도에서 약간의 차이가 관찰되었지만 배양 배지의 높은 세포 밀도로 인해 분석 오류일 가능성이 가장 높았다(도 8).
2.2 생산물 생성
ruLAPII_short 생산물 증가를 조사하고 각각 가장 유망한 균주를 확인하기 위해 발효 작업을 따라 여러 샘플을 채취했다. 세포를 원심분리하고 배양 상청액을 분리하였다. 이어서 대표 샘플을 SDS PAGE/쿠마시 염색 및 AMC 검증을 통해 분석했다.
ruDPPIV_short와 유사하고 1차 스크리닝 데이터에서 예상한 대로 ruLAPII_short의 생산물 역가는 전장 ruLAPII에 비해 크게 감소했다(도 9, 녹색 라인을 다른 라인과 비교). 균주 순위는 1차 스크리닝에서 관찰된 것과 동일하였다. 가장 우수한 생산을 보이는 두 개의 ruLAPII_short 클론의 배양 상청액을 서로 비교했을 때 활성에서 큰 차이가 관찰되지 않았으며; 즉, 효소 활동 범위는 320 U/L에서 371.2 U/L 사이였다. 야생형 균주 LP1(pCKP6011.4)과 비교할 때, 가장 잘 생산하는 ruLAPII_short 클론의 활성은 참조 균주 LP1(pCKP6011.4)(1'212.3 U/L)의 약 30%였다(도 9). 참조 클론 LP1(pCKP6011.4)의 활성은 이전 데이터(1'500 U/L; 10 L Infors, 리포터 2014.157)와 일치했다.
실시예 4: 비활성
실시예 2 및 3에 나타낸 바와 같이, ruDPPIV 또는 ruLAPII의 짧은 변이체의 체적 활성(U/L)이 상당히 감소하였다. 생산물의 양도 상당히 감소하였기 때문에 감소된 활성이 낮은 비활성 때문인지 또는 배양 상청액의 생산물 양의 감소로 인한 것인지가 명확하지 않았다. 따라서 비활성을 평가하기 위해 단백질을 정제하고 비활성(즉, U/mg)을 평가하기로 결정했다. 이를 위해 "GLH-003:DPP4 및 LAP2 단계 용출 가능성"(프리젠테이션; A. Zurbriggen et al., 2016)의 정제 전략을 배치 모드에서 사용하도록 조정했다.
1. ruDPPIV_short
LP1(pFJP6015.6; ruDPPI_short; 9'056 U/L) 및 LP1(pCKP6003.1; ruDPPIV; 21'586 U/L)의 배양 상청액 12mL를 SP Sepharose XL(GE Healthcare) 2mL에 넣었다. 이어서 10mL 25mM Tris, pH 7.2, 20mM NaCl로 2회 세척한 후 2mL 25mM Tris, pH 7.2, 130mM NaCl에서 용출하였다. 정제 샘플(로딩, 흘림 및 용출)에서 AMC 검증(활성 분석) 및 BCA 검증(단백질 농도)을 수행했다. 3번의 실험이 이루어졌다: 첫 번째 정제 실험에서 기술적인 문제가 발생하여 데이터를 신뢰할 수 없었다. 세 번째 실험에서 목표는 후속 질량 분광법을 위해 더 정제된 물질을 생성하는 것이었다. 샘플 부피와 수지가 증가했음에도 불구하고 결합 용량이 이미 도달했으며 물질 공급이 개선되지 않았다. 편의상 두 번째 정제 실험의 데이터가 제시된다.
정제 후 샘플을 SDS-PAGE/쿠마시 염색에 로딩하고 AMC 검증과 함께 BCA 검증을 수행했다(도 10).
ruDPPIV_short와 ruDPPIV 간의 큰 비활성(12U/mg) 차이는 발견되지 않았다. 비교를 위해 독소 물질 생성의 ruDPPIV 정제 물질(Report ResRep2014.165)은 19.6 U/mg 및 20 U/mg의 비활성을 나타냈다. 데모 실행으로 18.3 U/mg 및 17.9 U/mg의 활성을 나타내었다. 여기에 제시된 데이터와 물질 생성 리포터 사이의 ruDPPIV의 차이는 상이한 수지 모드(배치 모드 대 컬럼 모드)에 기인할 가능성이 크다.
2. ruLAPII_short
LP1(pFJP6014.13; ruLAPII_short; 371 U/L) 및 LP1(pCKP6011.4; ruLAPII; 1'212 U/L)의 배양 상청액 12mL를 2mL SP Sepharose XL(GE Healthcare)에 로딩한 다음, 10mL 20mM 인산나트륨, pH 6.0으로 2회 세척한 후, 2mL 20mM 인산나트륨, pH 6.0, 130mM NaCl에서 용출하였다. 정제 샘플(로딩, 흘림 및 용출)에서 AMC 검증(활성 분석) 및 BCA 검증(단백질 농도)을 수행했다. 3번의 실험이 이루어졌다: 첫 번째 정제 실험에서 기술적인 문제가 발생하여 데이터를 신뢰할 수 없었다. 세 번째 실험에서 목표는 후속 질량 분광법을 위해 더 정제된 물질을 생성하는 것이었다. ruDPPIV_short 정제 결합 용량과 유사하게 결합 용량이 이미 도달했으며 물질 공급이 개선되지 않았다. 편의상 두 번째 정제 실험의 데이터가 제시된다.
정제 후 샘플을 SDS-PAGE/쿠마시 염색에 로딩하고 AMC 검증과 함께 BCA 검증을 수행했다(도 11).
ruLAPII_short의 정제된 샘플에서 약간 더 낮은 비활성이 발견되었으며 이는 전장 ruLAPII보다 약 26% 더 낮았다(즉, 1.1 U/mg 대 1.5 U/mg). 쿠마시 염색된 SDS 겔에서 샘플들을 비교했을 때, 예상 위치에서 더 적은 변형이 발견되었다(도 11, 레인 3&6 또는 레인 4&7 비교; 파란색 화살표). ruLAPII의 비활성(1.5U/mg)은 독소 물질 생성(1.7U/mg 및, Report ResRep2014.165) 및 Demo Run(1.9U/mg 및 2U/mg) 동안 관찰된 것보다 약간 낮았다. ruDPPIV 정제와 유사하게 이러한 차이점은 약간 상이한 정제 전략(즉, 배치 모드 대 컬럼 모드)을 사용하여 설명할 수 있다.
실시예 4: 생산물 분해
이 연구의 목적은 ruDPPIV 및 ruLAPII의 짧은 변이체가 전장 분자에서 관찰된 바와 같이 더 이상 분해되지 않는다는 것을 확인하는 것이었다. 이를 위해 질량 분광법(ESI-MS 및 Maldi-TOF)을 수행했다. 간단히 말해서, 정제 후, 용출 샘플을 PNGase F로 추가 처리하여 글리칸 구조(이는 질량 분광법을 방해함)를 절단하고 Amicon 탈염으로 유리 글리칸을 제거했다.
1. ruDPPIV_short
먼저 ESI-MS와 Maldi-TOF는 B-Fabric로 수행했다. ESI-MS의 경우 신호 강도가 매우 낮거나 단백질 유사 종을 전혀 감지할 수 없었다. PNGaseF(34'874 Da 및 34'887 Da)의 흔적이 감지되었다.
두 변이체 모두에서, Maldi-TOF에서 분해가 관찰되었다. 전장 ruDPPIV와 대조적으로, 전장 ruDPPIV_short 분자는 아세틸화 변형(+42)으로 발견될 가능성이 가장 높았다(도 12).
2. ruLAPII_short
먼저 ESI-MS와 Maldi-TOF는 B-Fabric로 수행했다. ESI-MS의 경우, 전장 분자 ruLAPII의 샘플만 발견되었다. PNGaseF(34'869 Da 및 34'863 Da)의 흔적이 감지되었다.
Maldi-TOF를 사용하면 ruLAPII short에 대해 전장 분자만 검출되었다. 전장 ruLAPII 분자의 경우, 분해만 확인할 수 있었다. 전장 ruLAPII의 경우, 주요 절단은 Val4 및 Lys457(48'884 da) 후에 발생했으며 Val4(51'284 da) 후에나 Biomeva에서 제공한 이전 데이터와 일치했다(도 13).
<110> AMYRA Biotech AG <120> DIPEPTIDYLPEPTIDASE AND LEUCINE AMINOPEPTIDASE POLYPEPTIDE VARIANTS <130> IPC230541EP <150> PCT/EP2020/080170 <151> 2020-10-27 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dipeptidylpeptidase <400> 1 Ile Val Pro Pro Arg Glu Pro Arg Ser Pro Thr Gly Gly Gly Asn Lys 1 5 10 15 Leu Leu Thr Tyr Lys Glu Cys Val Pro Arg Ala Thr Ile Ser Pro Arg 20 25 30 Ser Thr Ser Leu Ala Trp Ile Asn Ser Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ile 35 40 45 Ser Gln Ser Asp Asp Gly Ala Leu Ile Leu Gln Asn Ile Val Thr Asn 50 55 60 Thr Asn Lys Thr Leu Val Ala Ala Asp Lys Val Pro Lys Gly Tyr Tyr 65 70 75 80 Asp Tyr Trp Phe Lys Pro Asp Leu Ser Ala Val Leu Trp Ala Thr Asn 85 90 95 Tyr Thr Lys Gln Tyr Arg His Ser Tyr Phe Ala Asn Tyr Phe Ile Leu 100 105 110 Asp Ile Lys Lys Gly Ser Leu Thr Pro Leu Ala Gln Asp Gln Ala Gly 115 120 125 Asp Ile Gln Tyr Ala Gln Trp Ser Pro Met Asn Asn Ser Ile Ala Tyr 130 135 140 Val Arg Gly Asn Asp Leu Tyr Ile Trp Asn Asn 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aminopeptidase <400> 2 His Pro Val Val Gly Gln Glu Pro Phe Gly Trp Pro Phe Lys Pro Met 1 5 10 15 Val Thr Gln Asp Asp Leu Gln Asn Lys Ile Lys Leu Lys Asp Ile Met 20 25 30 Ala Gly Val Glu Lys Leu Gln Ser Phe Ser Asp Ala His Pro Glu Lys 35 40 45 Asn Arg Val Phe Gly Gly Asn Gly His Lys Asp Thr Val Glu Trp Ile 50 55 60 Tyr Asn Glu Ile Lys Ala Thr Gly Tyr Tyr Asp Val Lys Lys Gln Glu 65 70 75 80 Gln Val His Leu Trp Ser His Ala Glu Ala Ala Leu Asn Ala Asn Gly 85 90 95 Lys Asp Leu Lys Ala Ser Ala Met Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Ser Lys 100 105 110 Ile Met Ala Glu Leu Val Val Ala Lys Asn Asn Gly Cys Asn Ala Thr 115 120 125 Asp Tyr Pro Ala Asn Thr Gln Gly Lys Ile Val Leu Val Glu Arg Gly 130 135 140 Val Cys Ser Phe Gly Glu Lys Ser Ala Gln Ala Gly Asp Ala Lys Ala 145 150 155 160 Ala Gly Ala Ile Val Tyr Asn Asn Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Thr 165 170 175 Leu Gly Gly Leu Asp Lys Arg His Val Pro Thr Ala Gly Leu Ser Gln 180 185 190 Glu Asp Gly Lys Asn Leu Ala Thr Leu Val Ala Ser Gly Lys Ile Asp 195 200 205 Val Thr Met Asn Val Ile Ser Leu Phe Glu Asn Arg Thr Thr Trp Asn 210 215 220 Val Ile Ala Glu Thr Lys Gly Gly Asp His Asn Asn Val Ile Met Leu 225 230 235 240 Gly Ala His Ser Asp Ser Val Asp Ala Gly Pro Gly Ile Asn Asp Asn 245 250 255 Gly Ser Gly Ser Ile Gly Ile Met Thr Val Ala Lys Ala Leu Thr Asn 260 265 270 Phe Lys Leu Asn Asn Ala Val Arg Phe Ala Trp Trp Thr Ala Glu Glu 275 280 285 Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Phe Tyr Val Asn Ser Leu Asp Asp Arg 290 295 300 Glu Leu His Lys Val Lys Leu Tyr Leu Asn Phe Asp Met Ile Gly Ser 305 310 315 320 Pro Asn Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Asn 325 330 335 Met Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Phe Glu Lys 340 345 350 Phe Phe Asp Asp Gln Gly Ile Pro His Gln Pro Thr Ala Phe Thr Gly 355 360 365 Arg Ser Asp Tyr Ser Ala Phe Ile Lys Arg Asn Val Pro Ala Gly Gly 370 375 380 Leu Phe Thr Gly Ala Glu Val Val Lys Thr Pro Glu Gln Val Lys Leu 385 390 395 400 Phe Gly Gly Glu Ala Gly Val Ala Tyr Asp Lys Asn Tyr His Arg Lys 405 410 415 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Asp Ile Ser Asp Ala Ser Gly Trp Ala His Ile Tyr Leu 340 345 350 Tyr Pro Val Asp Gly Gly Lys Glu Ile Ala Leu Thr Lys Gly Glu Trp 355 360 365 Glu Val Val Ala Ile Leu Lys Val Asp Thr Lys Lys Lys Leu Ile Tyr 370 375 380 Phe Thr Ser Thr Lys Tyr His Ser Thr Thr Arg His Val Tyr Ser Val 385 390 395 400 Ser Tyr Asp Thr Lys Val Met Thr Pro Leu Val Asn Asp Lys Glu Ala 405 410 415 Ala Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Ala Lys Gly Gly Tyr Tyr Ile Leu 420 425 430 Ser Tyr Gln Gly Pro Asn Val Pro Tyr Gln Glu Leu Tyr Ser Thr Lys 435 440 445 Asp Ser Lys Lys Pro Leu Lys Thr Ile Thr Ser Asn Asp Ala Leu Leu 450 455 460 Glu Lys Leu Lys Glu Tyr Lys Leu Pro Lys Val Ser Phe Phe Glu Ile 465 470 475 480 Lys Leu Pro Ser Gly Glu Thr Leu Asn Val Lys Gln Arg Leu Pro Pro 485 490 495 Asn Phe Asn Pro His Lys Lys Tyr Pro Val Leu Phe Thr Pro Tyr Gly 500 505 510 Gly Pro Gly Ala Gln Glu Val Ser Gln Ala Trp Asn Ser Leu Asp Phe 515 520 525 Lys Ser Tyr Ile Thr Ser Asp Pro Glu Leu Glu Tyr Val Thr Trp Thr 530 535 540 Val Asp Asn Arg Gly Thr Gly Tyr Lys Gly Arg Lys Phe Arg Ser Ala 545 550 555 560 Val Ala Lys Arg Leu Gly Phe Leu Glu Ala Gln Asp Gln Val Phe Ala 565 570 575 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asn Arg Trp Ala Asp Lys Asp His Ile Gly 580 585 590 Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Thr Ala Lys Thr Leu Glu 595 600 605 Thr Asp Ser Gly Val Phe Thr Phe Gly Ile Ser Thr Ala Pro Val Ser 610 615 620 Asp Phe Arg Leu Tyr Asp Ser Met Tyr Thr Glu Arg Tyr Met Lys Thr 625 630 635 640 Val Glu Leu Asn Ala Asp Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Val His Lys Val 645 650 655 Asp Gly Phe Lys Asn Leu Lys Gly His Tyr Leu Ile Gln His Gly Thr 660 665 670 Gly Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ala Ala Val Leu Ser Asn Thr 675 680 685 Leu Met Asn Gly Gly Val Thr Ala Asp Lys Leu Thr Thr Gln Trp Phe 690 695 700 Thr Asp Ser Asp His Gly Ile Arg Tyr Asp Met Asp Ser Thr Tyr Gln 705 710 715 720 Tyr Lys Gln Leu Ser Lys Met Val Tyr Asp Gln Lys Gln Arg Arg Pro 725 730 735 Glu Ser Pro Pro Met His Gln Trp Ser 740 745 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leucine aminopeptidase <400> 4 Glu Pro Phe Gly Trp Pro Phe Lys Pro Met Val Thr Gln Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Asn Lys Ile Lys Leu Lys Asp Ile Met Ala Gly Val Glu Lys Leu 20 25 30 Gln Ser Phe Ser Asp Ala His Pro Glu Lys Asn Arg Val Phe Gly Gly 35 40 45 Asn Gly His Lys Asp Thr Val Glu Trp Ile Tyr Asn Glu Ile Lys Ala 50 55 60 Thr Gly Tyr Tyr Asp Val Lys Lys Gln Glu Gln Val His Leu Trp Ser 65 70 75 80 His Ala Glu Ala Ala Leu Asn Ala Asn Gly Lys Asp Leu Lys Ala Ser 85 90 95 Ala Met Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Ser Lys Ile Met Ala Glu Leu Val 100 105 110 Val Ala Lys Asn Asn Gly Cys Asn Ala Thr Asp Tyr Pro Ala Asn Thr 115 120 125 Gln Gly Lys Ile Val Leu Val Glu Arg Gly Val Cys Ser Phe Gly Glu 130 135 140 Lys Ser Ala Gln Ala Gly Asp Ala Lys Ala Ala Gly Ala Ile Val Tyr 145 150 155 160 Asn Asn Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Thr Leu Gly Gly Leu Asp Lys 165 170 175 Arg His Val Pro Thr Ala Gly Leu Ser Gln Glu Asp Gly Lys Asn Leu 180 185 190 Ala Thr Leu Val Ala Ser Gly Lys Ile Asp Val Thr Met Asn Val Ile 195 200 205 Ser Leu Phe Glu Asn Arg Thr Thr Trp Asn Val Ile Ala Glu Thr Lys 210 215 220 Gly Gly Asp His Asn Asn Val Ile Met Leu Gly Ala His Ser Asp Ser 225 230 235 240 Val Asp Ala Gly Pro Gly Ile Asn Asp Asn Gly Ser Gly Ser Ile Gly 245 250 255 Ile Met Thr Val Ala Lys Ala Leu Thr Asn Phe Lys Leu Asn Asn Ala 260 265 270 Val Arg Phe Ala Trp Trp Thr Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser 275 280 285 Thr Phe Tyr Val Asn Ser Leu Asp Asp Arg Glu Leu His Lys Val Lys 290 295 300 Leu Tyr Leu Asn Phe Asp Met Ile Gly Ser Pro Asn Phe Ala Asn Gln 305 310 315 320 Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Asn Met Thr Gly Pro Ala Gly 325 330 335 Ser Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Phe Glu Lys Phe Phe Asp Asp Gln Gly 340 345 350 Ile Pro His Gln Pro Thr Ala Phe Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Ser Ala 355 360 365 Phe Ile Lys Arg Asn Val Pro Ala Gly Gly Leu Phe Thr Gly Ala Glu 370 375 380 Val Val Lys Thr Pro Glu Gln Val Lys Leu Phe Gly Gly Glu Ala Gly 385 390 395 400 Val Ala Tyr Asp Lys Asn Tyr His Arg Lys Gly Asp Thr Val Ala Asn 405 410 415 Ile Asn Lys Gly Ala Ile Phe Leu Asn Thr Arg Ala Ile Ala Tyr Ala 420 425 430 Ile Ala Glu Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Gly Phe Pro Thr Arg Pro Lys 435 440 445 Thr Gly Lys 450 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 5 Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 6 Pro Gln Gln Pro Tyr 1 5 <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 7 Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro 1 5 10 15 Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro 20 25 30 Phe

Claims (32)

  1. 절단된 디펩티딜펩티다제 IV(DPPIV) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 절단된 DPPIV 폴리펩티드에서, 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 (i) 1개 또는 2개의 아미노산이 N-말단에서 결손되고/되거나 (ii) C-말단에서 최대 15개의 아미노산이 결손된, 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 상기 C-말단에서 12 내지 14개의 아미노산이 결손된, DPPIV 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 야생형 DPPIV 폴리펩티드와 비교하여 상기 C-말단에서 13 또는 14개의 아미노산이 결손된, DPPIV 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 야생형 DPPIV 폴리펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  6. 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 1의 잔기 1-748로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) 서열번호 1의 잔기 1-747로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (iii) 서열번호 1의 잔기 1-746으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (iv) 서열번호 1의 잔기 1-745로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (v) 서열번호 1의 잔기 2-748로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (vi) 서열번호 1의 잔기 2-747로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드
    (vii) 서열번호 1의 잔기 2-746으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 및
    (viii) 서열번호 1의 잔기 2-745로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 절단된 DPPIV 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)으로부터 유래된, 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 폴리펩티드들의 N-말단 끝에서 디펩티드 모티프 NH2-X-Pro를 절단한, 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 파키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된,
    폴리펩티드.
  10. 절단된 류신 아미노펩티다제(LAP) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 절단된 LAP 폴리펩티드에서 야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 (i) 최대 7개의 아미노산이 N-말단에서 결손되고/되거나 (ii) 최대 23개의 아미노산이 C-말단에서 결손된, 폴리펩티드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에 4 내지 6개의 아미노산이 결손된,
    폴리펩티드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 N-말단에 6개의 아미노산이 결손된, 폴리펩티드.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에 20 내지 22개의 아미노산이 결손된, 폴리펩티드.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에 8, 16, 21, 또는 22개의 아미노산이 결손된, 폴리펩티드.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 LAP 폴리펩티드와 비교하여 C-말단에 22개의 아미노산이 결손된. 폴리펩티드.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 야생형 LAP 폴리펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  18. 하기로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 2의 잔기 7-471 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) 서열번호 2의 잔기 7-463으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (iii) 서열번호 2의 잔기 7-458 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드;
    (iv) 서열번호 2의 잔기 7-457 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드; 및
    (v) 서열번호 2의 잔기 7-456으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 절단된 LAP 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)으로부터 유래된, 폴리펩티드.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는, 폴리펩티드들이 NH2-X-Pro 서열에서 프롤린에 연결된 경우를 제외하고는, 상기 폴리펩티드들의 N-말단 끝에서 단일 아미노산을 절단하는, 폴리펩티드.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산되는 폴리펩티드.
  22. (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드;
    (ii) 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드; 또는
    (iii) 상기 (i)와 상기 (ii)의 조합을 포함하는, 조성물.
  23. (i) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드; 및
    (ii) 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를
    포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 중량비는 1:20 내지 1:5, 바람직하게는 1:15 내지 1:7.5, 보다 바람직하게는 약 1:9.5인, 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 33-mer 펩티드를 완전히 분해하는 조성물:
    LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF.
  26. 약제학적 용도를 위한 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  27. 체강 질환(CD)의 치료에 사용하기 위한 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 경구용 조성물, 특히 액상 경구용 조성물인, 조성물.
  29. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  30. 제29항의 핵산으로 형질 감염된 세포.
  31. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  32. 제31항의 핵산으로 형질 감염된 세포.
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